BIOQUMICA BSICA

1 CUATRIMESTRE 2 GRADO EN FARMACIA

TEMA 4: MTODOS Y TCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS PROTENAS

1. Homogeneizacin y fraccionamiento celular.

2. Precipitacin con sales.
3. Ensayos biolgicos y actividad especfica.
4. Dilisis.
5. Cromatografa: de Exclusin molecular o filtracin en gel.- de Intercambio Inico.- de
Afinidad.
6. Electroforesis en gel de poliacrilamida (con y sin SDS).
7. Enfoque isoelctrico.
8. Centrifugacin en gradiente de densidad.
9. Determinacin de la secuencia de una protena.
10. Hidrlisis qumica y enzimtica.
11. Determinacin del amino terminal: Reactivo de Sanger.
12. Degradacin de Edman.
13. Determinacin de la estructura cuaternaria.

El conocimiento del bioqumica sobre la estructura y funcin de las protenas procede del estudio de
muchas protenas individuales. Para estudiar una protena en detalle es necesario separarla del resto de
protenas y disponer de tcnicas que permitan determinar sus propiedades. Los mtodos necesarios
provienen de la qumica de las protenas, disciplina tan antigua como la bioqumica y que mantiene una
posicin central en la investigacin bioqumica.

1. Homogeneizacin y fraccionamiento celular.

Una preparacin pura de una protena es esencial para poder determinar sus propiedades y su actividad.
Puesto que las clulas contienen miles de tipos diferentes de protenas Cmo puede purificarse una
protena? Los mtodos clsicos de separacin de protenas aprovechan propiedades que varan de una
protena a otra, entre las que se incluye el tamao, la carga y las propiedades de unin. Algunos mtodos
modernos adicionales, tales como el clonaje de ADN y la secuenciacin de genomas, pueden simplificar el
proceso de purificacin de protenas.
Para su purificacin, las protenas deben liberarse de la clula. Elegido el ensayo y escogida una fuente de
protenas, debemos fraccionar la clula en sus componentes y precisar qu componente est enriquecido
en la protena que nos interesa. Estos esquemas de fraccionamiento se desarrollan por el mtodo de
ensayo-error, basndose en experiencias anteriores. En un primer paso, de forma un homogenado por
ruptura de la membrana celular, fraccionndose la clula por centrifugacin y dando lugar a un precipitado
de material pesado en el fondo del tubo de centrifuga y un sobrenadante ms ligero encima. El
sobrenadante se centrifuga de nuevo con una fuerza centrfuga mayor obteniendo un nuevo precipitado y
otro sobrenadante. El procedimiento, llamando centrifugacin diferencial, produce varias fracciones de
densidad decreciente, cada una de ellas consistente en varios cientos de protenas distintas, que se
ensayan posteriormente para obtener la actividad que se purifica. Normalmente, una fraccin estar
enriquecida en actividad, que ser la fuente de material en la que se aplicarn tcnicas de purificacin ms
discriminatorias.
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2. Precipitacin con sales.

Se han purificado varios miles de protenas en forma activa en base a caractersticas como solubilidad,
tamao, carga y afinidad especfica de unin. El mecanismo habitual consiste en que la mezcla de
protenas se somete a diferentes separaciones, basada cada una de ellas en propiedades diferentes, para
obtener la protena pura. En cada paso de purificacin, se ensaya la actividad de la protena deseada y se
determina la concentracin proteica. Existe una batera importante de tcnicas de purificacin aplicables.

La mayora de las protenas son menos solubles a concentraciones elevadas de sal, un efecto llamado
precipitacin salina. Las concentraciones de sal en las que precipita una protena varan de una protena a
otra. Por ejemplo, el sulfato amnico 0,8 M precipita el fibringeno, una protena de la coagulacin
sangunea, mientras que se necesita una concentracin 2,4 M para precipitar la albmina del suero. La
precipitacin salina adems es til para concentrar disoluciones diluidas de protenas, incluyendo las
fracciones activas obtenidas en otros pasos de la purificacin. Para eliminar la sal, cuando sea necesario,
se puede utilizar la dilisis.

3. Ensayos biolgicos y actividad especfica.

A fin de purificar una protena es esencial disponer de un mtodo para detectar y cuantificar dicha protena
en presencia de muchas protenas ms en cada etapa del proceso. A menudo la purificacin debe
realizarse en ausencia de cualquier informacin sobre el tamao y las propiedades fsicas de la protena, o
sobre la fraccin que representa sobre la masa total de protena en el extracto. En el caso de protenas
enzimticas, se puede determinar la cantidad de enzima en una disolucin o extracto de tejido
determinados en funcin del efecto cataltico que produce el enzima, es decir, el incremento de la
velocidad a la cual su sustrato se convierte en productos de la reaccin cuando est presente el enzima.
Con este fin deben conocerse la ecuacin global de la reaccin catalizada, un procedimiento analtico para
determinar la desaparicin del sustrato o la aparicin de un producto de la reaccin, si el enzima requiere
cofactores tales como iones metlicos o coenzimas, la dependencia de la actividad enzimtica con
respecto de la concentracin de sustrato, el pH ptimo y una zona de temperatura en la cual el enzima sea
estable y tenga una actividad elevada. Los enzimas se ensayan normalmente en su pH ptimo y a una
temperatura conveniente dentro del intervalo de 25 a 38 C. Tambin se requieren generalmente elevadas
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concentraciones de sustrato de modo que la velocidad inicial de reaccin, que se mide experimentalmente,
sea proporcional a la concentracin de enzima. Por acuerdo institucional, se define 1,0 unidad de actividad
enzimtica como la cantidad de enzima que produce la transformacin de 1,0 mol de sustrato por minuto
a 25C en condiciones ptimas de medida. El trmino actividad se refiere a las unidades totales de enzima
en una solucin. La actividad especfica es el nmero de unidades enzimticas por miligramo de protena.

La actividad enzimtica constituye una medida de la pureza enzimtica: aumenta durante la purificacin de
una enzima, y llega a ser mxima y constante cuando el enzima es puro. Despus de cada purificacin, se
determina la actividad de la preparacin (en unidades de actividad enzimtica), se determina
independientemente la cantidad total de protena y se calcula el cociente de los dos valores da la actividad
especfica. La actividad y la protena total generalmente disminuyen en cada paso. La actividad disminuye
porque siempre se produce alguna prdida debido a inactivacin o a interacciones no ptimas con los
materiales cromatogrficos o con otras molculas de la disolucin. La protena total disminuye porque el
objetivo es eliminar tanta protena no deseada o no especfica como sea posible. En un paso de
purificacin exitoso, la prdida de protena no especfica es mucho mayor que la prdida de actividad; por
tanto, aun cuando la actividad total disminuye, la actividad especfica aumenta. Los datos se recogen
finalmente en una tabla de purificacin similar a la tabla 3-5. Generalmente se considera que una protena
es pura cuando pasos adicionales de purificacin no consiguen aumentar su actividad especfica y cuando
solo se puede detectar una especie proteica ( mediante electroforesis, por ejemplo). En el caso de
protenas que no sean enzimas se requieren otros mtodos de cuantificacin. Las protenas de transporte
pueden determinarse por su unin a la molcula que transportan, y las hormonas y las toxinas por los
efectos biolgicos que producen; por ejemplo, las hormonas de crecimiento estimulan el crecimiento de
ciertas clulas cultivadas. Algunas protenas estructurales representan una fraccin tan grande de la masa
tisular que pueden extraerse y purificarse fcilmente sin necesidad de un ensayo funcional. Los mtodos
son tan variados como las propias protenas.

4. Dilisis
Las protenas se pueden separar de molculas pequeas mediante la dilisis a travs de una membrana
semipermable, como puede serlo una membrana porosa de celulosa. Las molculas de dimensiones
significativamente mayores que el dimetro del poro se retienen dentro de la bolsa de dilisis, mientras
que las molculas ms pequeas y los iones atraviesan los poros de esta membrana y aparecen en el
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dializado, fuera de la bolsa. Esta tcnica es til para retirar las sales y otras molculas pequeas, pero no
discriminar de forma efectiva entra las protenas.

5. Cromatografa: de Exclusin molecular o filtracin en gel.- de Intercambio Inico.- de

Afinidad.
Cromatografa de filtracin en gel: se pueden conseguir separaciones ms discriminatorias, basadas en el
tamao, por medio de la tcnica de cromatografa de filtracin en gel, tambin conocida como
cromatografa de exclusin molecular. La muestra se coloca en lo alto de una columna rellena de bolitas
porosas compuestas por un polmero insoluble, pero altamente hidratado, como son el dextrano o la
agarosa (carbohidratos) o la poliacrilamida, Sephadex, Sepharosa y Biogel son preparaciones comerciales
de estas bolitas usadas normalmente, que tienen un tamao de unos 100m de dimetro. Las molculas
pequeas pueden entrar en estas bolitas, pero no las grandes. El resultado es que las molculas
pequeas se distribuyen tanto en el interior de las bolitas como entre ellas, mientras que las molculas
grandes se localizan solamente en la disolucin entre las bolitas. As, las molculas grandes fluyen ms
rpidamente a travs de esta columna y aparecen antes porque tienen accesible un volumen de lquido
ms pequeo. Las molculas que son de un tamao intermedio y que pueden penetrar en las bolitas
parcialmente fluirn de la columna en una posicin intermedia, mientras que las molculas pequeas, que
siguen un camino ms largo y tortuoso, sern las ltimas en salir.
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Cromatografa de intercambio inico : las protenas se pueden separar en base a su carga neta por
cromatografa de intercambio inico. Si una protena tiene una carga neta positiva a pH 7, se unir
normalmente a una columna de bolitas que contengan grupos carboxilato, mientras que una protena con
carga neta negativa no lo har. Una protena carga positivamente unida a esta columna puede eluirse
(liberarse) incrementando la concentracin de cloruro sdico u otra sal en el amortiguador de elucin
porque los iones de sodio compiten con los grupos de la protena cargados positivamente para unirse a la
columna. Las protenas con una densidad baja de cargas positivas netas tendern a aparecer primero,
seguidas por las que tienen una densidad de carga mayor. Las protenas cargadas positivamente (
protenas catinicas) se pueden separar en columnas de carboximetil-celulosa (CM-celulosa) cargadas
negativamente. A su vez, las protenas cargadas negativamente ( protenas aninicas) se pueden separar
por cromatografa en columnas de dietilaminoetil-celulosa (DEAE-celulosa) cargadas positivamente.

Cromatografa de afinidad: es otro procedimiento poderoso y normalmente aplicable para purificar

protenas. Esta tcnica se aprovecha de la alta afinidad de muchas protenas por grupos qumicos
especficos. Por ejemplo, la protena vegetal concanavalina A se puede purificar pasando un extracto
crudo a travs de una columna de bolitas que contienen residuos de glucosa unidos covalentemente. La
concanavalina A se une a esta columna debido a su afinidad por la glucosa, que no tienen otras protenas.
La concanavalina A unida se libera posteriormente de la columna si se aade una disolucin concentrada
de glucosa. La glucosa en disolucin desplaza la concanavalina A de los centros de unin de los resiudos
de glucosa fijados en la columna. La cromatografa de afinidad es un potente sistema para aislar factores
de transcripcin, las protenas que regulan la expresin gentica mediante la unin a secuencias de DNA
especficas . Una mezcla proteica se eluye a travs de una columna que contiene secuencias especficas
de DNA unidas a una matriz; las protenas con mayor afinidad por la secuencia se unirn y quedarn
retenidas. En este momento, el factor de transcripcin se libera lavando con una disolucin que contiene
una alta concentracin de sal. En general, la cromatografa de afinidad se puede utilizar de modo efectivo
en el aislamiento de una protena que reconoce a determinados grupos X por la unin covalente de X o un
derivado suyo a una columna, adicin de una mezcla de protenas a esta columna, que luego se lava con
amortiguador para eliminar las protenas no unidas, y elucin de la protena deseada aadiendo una
concentracin elevada de una forma soluble de X o cambio de las condiciones para alterar la afinidad de la
unin. La cromatografa de afinidad es ms efectiva cuando la interaccin de la protena y la molcula que
se usa como atrayente es muy especfica. El proceso estndar de uso de la cromatografa afinidad se
puede invertir para asilar protenas expresadas de clones genticos. En este caso, el gen que codifica la
protena se modifica. Se codifican aminocidos extras en el gen, que cuando se expresa sirven como
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etiquetas de afinidad que se pueden atrapar fcilmente. Por ejemplo una serie de residuos de histidina
(conocidos como etiqueta His) se pueden aadir al extremo amino o carboxilo terminal de una protena
expresada. La protena etiquetada se pasa a travs de una columna de bolitas que contienen unido de
forma covalente nquel (II) u otros iones metlicos que se unen a la protena deseada mientras que las
otras protenas atraviesan la columna. Posteriormente, se pueden eluir las protenas de la columna
aadiendo imidazol u otros compuestos qumicos que se unen a los iones metlicos y desplazan la
protena.

6. Electroforesis en gel de poliacrilamida (con y sin SDS).

Una forma es asegurar que la actividad especfica crece con cada paso de purificacin. Otra es visualizar
esta eficacia mostrando las protenas presentes en cada caso. La tcnica de electroforesis hace posible
este ltimo mtodo.
Electroforesis en gel: una molcula con carga elctrica neta se desplazar en un campo elctrico. Este
fenmeno, conocido como electroforesis ofrece un procedimiento potente para separar protenas y otras
macromolculas como DNA y RNA. La velocidad de migracin (V) de una protena o cualquier otra
molcula en un campo elctrico depende de la fuerza de ese campo elctrico (E), la carga neta de la
protena (z), y el coeficiente de friccin (f).

La fuerza elctrica Ez que arrastra a la molcula cargada hacia el electrodo de carga opuesta, sufre la
resistencia fv, debida a la friccin viscosa entre la molcula que se desplaza y el medio en el que lo hace.
El coeficiente de friccin f depende tanto de la masa como de la forma de la molcula que migra como de
la viscosidad del medio (). Para un esfera de radio r.
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Las separaciones electroforticas se realizan casi siempre sobre geles ( o sobre soportes slidos como el
papel ) porque el gel sirve como un tamiz molecular que potencia la separacin. Las molculas ms
pequeas que los poros del gel se desplazan fcilmente a su travs, mientras que las molculas mucho
mayores que los poros permanecen casi inmviles. Las molculas de tamao intermedio se desplazan a
travs de gel con diversos grados de dificultad. La direccin del flujo es vertical descendente. La
electroforesis se lleva a cabo en un bloque delgado, vertical, de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida,
formados por la polimerizacin de la acrilamida entrecruzada por metilenbisacrilamida, son el soporte
preferido para la electroforesis porque son inertes qumicamente y se forman con facilidad. La
electroforesis es lo opuesto a la filtracin en gel que todas las molculas, independientemente de su
tamao, estn impelidas a moverse a travs de la misma matriz.

Las protenas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares, utilizando electroforesis en gel
de poliacrilamida, en condiciones desnaturalizantes. La mezcla de protenas se disuelve primero en un
medio con dodecilsulfato sdico (SDS), un detergente aninico que rompe casi todas las interacciones no
covalentes en las protenas nativas. Tambin se aade mercaptoetanol (2-tioetanol) o ditiotreitol para
reducir los puentes disulfuro. Los aniones del SDS se unen a la cadena principal a razn de un anin SDS
por cada dos residuos de aminocido. Este complejo de SDS con una protena desnaturalizada tiene una
gran carga negativa, que es aproximadamente proporcional a la masa de la protena. La carga negativa
conseguida por la unin de SDS es normalmente mucho mayor que la carga de la protena nativa, por lo
que esta se considera no significativa. Los complejos SDS-protena se someten entonces a electroforesis.
Despus de la electroforesis, las protenas se pueden visualizar en el gel tindolas con plata o con un
colorante como el azul de Coomassie, que revelan una serie de bandas. Los marcajes radiactivos, si se
han incorporado a la protena, se pueden detectar mediante una hoja de pelcula de rayos X colocada
sobre el gel , un procedimiento conocido como autorradiografa.
Las protenas pequeas se desplazan rpidamente a travs del gel , mientras que las grandes se quedan
arriba , junto al lugar de aplicacin de la muestra. El desplazamiento en estas condiciones de la mayor
parte de los polipptidos es linealmente proporcional al logaritmo de su masa. Sin embargo, algunas
protenas ricas en carbohidratos y las protenas de membrana no cumplen esta relacin emprica. La
electroforesis sobre gel de pliacrilamida en SDS es rpida, sensible y capaz de un alto grado de
resolucin. Se puede distinguir entre protenas que difieren entre s en un 2% de su masa.
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7. Enfoque isoelctrico.
Las protenas tambin pueden separarse electroforticamente en base a sus contenidos relativos de
aminocidos cidos o bsicos. El punto isoelctrico (pI) de una protena es el pH en el que su carga netra
es cero. En este pH, su movilidad electrofortica es cero porque en la ecuacin 1, z es igual a cero. Por
ejemplo, el pI del citocromo C, una protena de transporte electrnico muy bsica, es 10,6 , mientras que el
de la albmina de suero, una protena sangunea cida, es 4,8. Supongamos que una mezcla de protenas
se somete a electroforesis en gradiente de pH en un gel y en ausencia de SDS. Cada protena se
desplazar hasta que alcance una posicin en el gel en la que el pH es igual al pI de la protena. Este
mtodo para separar protenas de acuerdo a su punto isoelctrico se conoce como isoelectroenfoque. El
gradiente de pH en el gel se consigue somentiendo a electroforesis previa una mezcla de polianfolitos
(polmeros pequeos con mltiple carga) con diferentes valores de pI. El isoelectroenfoque permite
distinguir protenas que difieren en sus pI tan poco como 0,01, lo que significa que se pueden separar
protenas que difieran en una sola carga neta

Electroforesis bidimensional: el isoelectroenfoque se puede combinar con SDS-PAGE para obtener

separaciones con una resolucin muy elevada. Una muestra nica se somete primero a isoelectroenfoque.
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Este gel de calle nica se coloca horizontalmente en la parte superior de un gel de SDS-poliacrilamida.
As, las protenas quedan distribuidas en la parte superior del gel de acuerdo con su movilidad durante el
electroenfoque. A continuacin se someten de nuevo a electroforesis en direccin perpendicular
(verticalmente) para obtener una distribucin bidimensional de las manchas. En este gel, las protenas se
han separado en direccin horizontal de acuerdo con su punto isoelctrico y en direccin vertical segn
sus masas moleculares. Es sorprendente que si se aplica este sistema bidimensional a la bacteria
Escherichia coli se pueden resolver por electroforesis bidimensional ms de mil protenas diferentes en un
nico experimento.

Aunque muchas de las protenas que se observan en los geles bidimensionales no estn identificadas,
actualmente es posible identificarlas acoplando la electroforesis en gel bidimensional con tcnicas de
espectrometra de masas. Estas tcnicas tan poderosas se tratarn ms adelante.
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8. Centrifugacin en gradiente de densidad.

Hemos visto ya que la centrifugacin es un mtodo poderoso y en general eficaz para separar una mezcla
compleja de componentes celulares, pero tambin es til para separar y analizar las propias biomolculas.
Con esta tcnica , podemos determinar parmetros tales como la masa y la densidad, conocer algo sobre
la forma de la molcula e investigar las interacciones entre molculas. Para deducir estas propiedades a
partir de los datos de centrifugacin, necesitamos una descripcin matemtica de cmo se comporta una
partcula en una fuerza centrfuga. Una partcula se desplazar en un medio lquido cuando se someta a
una fuerza centrfuga. Un medio conveniente para valorar numricamente la velocidad de movimiento es
calcular el coeficiente de sedimentacin, s, de una partcula utilizando la siguiente ecuacin:

Se puede usar una tcnica que se conoce como zonal, en bandas , o ms comnmente centrifugacin en
gradiente para separar protenas con diferentes coeficientes de sedimentacin. El primer paso es formar
un gradiente de densidad ( tal como sacarosa al 5 %) y otra de alta densidad (tal como sacarosa al 20%)
se mezclan para crear un gradiente lineal de concentraciones de sacarosa que van desde el 20% en el
fondo del tubo hasta el 5 % en la parte superior. El papel del gradiente es evitar un flujo de conveccin. La
mezcla con la protena a separar se coloca en un pequeo volumen en la parte superior del gradiente de
densidad. Cuando el rotor gira, las protenas se mueven a travs del gradiente y se separan de acuerdo a
sus coeficientes de sedimentacin. El tiempo y la velocidad de la centrifugacin se determinan
empricamente. Las bandas separadas, o zonas, de la protena se pueden recolectar perforando el fondo
del tubo y recogiendo las gotas. Las gotas se pueden ensayar para ver el contenido en protenas y la
actividad cataltica u otras propiedades funcionales. Esta tcnica de velocidad de sedimentacin separa
fcilmente protenas que difieren en coeficientes de sedimentacin por un factor de dos o bien mayor.
La masa de una protena (peso molecular) se puede determinar directamente por equilibrio de
sedimentacin, donde una muestra se centrifuga a velocidades relativamente bajas en las que la
sedimentacin est equilibrada por la difusin. La tcnica de equilibrio de sedimentacin para determinar
la masa molecular es muy precisa y se puede aplicar en condiciones no-desnaturalizantes en las que la
estructura cuaternaria de las protenas multimricas se mantiene. Por el contrario, la electroforesis, con
SDS-gel de poliacrilamida nos da una estimacin del peso molecular de las cadenas polipeptdicas en
condiciones desnaturalizantes.
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9. Determinacin de la secuencia de una protena. 10. Hidrlisis qumica y enzimtica.

Habiendo purificado la protena de inters y determinado su masa, el siguiente anlisis a realizar suele ser
normalmente el establecer su secuencia de aminocidos, o estructura primaria. Examinemos primero
cmo se puede secuenciar un pptido simple, tal como:

El primer paso sera determinar la composicin de aminocidos del pptido. El pptido se debe hidrolizar
en sus aminocidos constituyentes calentndolo en HCl 6 M a 110C, durante 24 horas. Los aminocidos
del hidrolizado se pueden separar por cromatografa de intercambio inico. La identidad de los
aminocidos se manifiesta por su volumen de elucin, que es el volumen de amortiguador utilizado para
eluir el aminocido de la columna, y se cuantifica por su reaccin con ninhidrina. Los aminocidos tratados
con ninhidrina dan un color azul intenso, excepto la prolina, que da un color amarillo porque tiene un grupo
amino secundario. La concentracin de un aminocido en disolucin, tras su calentamiento con ninhidrina
es proporcional a la absorbancia ptica de la disolucin. Esta tcnica puede detectar un microgramo (10
nmol) de un aminocido, que es aproximadamente la cantidad presente en una huella dactilar. Se puede
detectar tan poco como un nanogramo de un aminocido sustituyendo la ninhidrina con fluoroescamina,
que reacciona con el grupo -amino para formar un producto altamente fluorescente. Una comparacin de
los modelos cromatogrficos de hidrolizado de nuestra muestra con una mezcla estndar de aminocidos
nos demostrara que la composicin en aminocidos del pptido es:

11. Determinacin del amino terminal: Reactivo de Sanger.

Para analizar la estructura primaria de una protena se utilizan diversos procedimientos. Para empezar, se
dispone de diversos protocolos para marcar e identificar el residuo amino-terminal. Sanger desarroll el
reactivo 1-fluoro-2,4- dinitrobenceno (FDNB) con este fin; otros reactivos utilizados son el cloruro de
dansilo y el cloruro de dabsilo, que generan derivados ms fcilmente detectables que los derivados
dinitrofenilados. Una vez que se ha marcado el residuo amino-terminal con uno de estos reactivos, se
hidroliza el polipptido (en HCl 6M) para obtener sus aminocidos constituyentes y se identifica el
aminocido marcado. Dado que la etapa de hidrlisis destruye el polipptido, este procedimiento no puede
utilizarse para secuenciar un polipptido ms all de su residuo amino-terminal. Sin embargo, puede
ayudar a determinar el nmero de polipptidos qumicamente diferentes en una protena, siempre que
cada uno tenga un residuo amino-terminal diferente. Por ejemplo, si la insulina se somete a este
procedimiento se marcaran dos residuos, Phe y Gly:
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12. Degradacin de Edman.

Para secuenciar un polipptido completo se utiliza normalmente un mtodo qumico diseado por Pehr
Edman. El procedimiento de la degradacin de Edman, marca y elimina slo el residuo amino-terminal de
un pptido, dejando el resto de enlaces peptdicos intactos. Se hace reaccionar el pptido con
fenilisotiocianato en condiciones alcalinas suaves, lo que convierte el aminocido amino-terminal en un
aducto feniltiocarbamilo (PTC). El enlace peptdico contiguo al aducto de PTC se rompe a continuacin
mediante reaccin en cido trifluoroactico anhdrido, que conlleva la eliminacin del aminocido amino-
terminal en forma de anilinotiazolina. El aminocido modificado se extrae con disolventes orgnicos, se
convierte en un derivado ms estable, feniltiohidantona, mediante tratamiento con cido en disolucin
acuosa y finalmente se identifica. El uso de reacciones secuenciales llevadas a cabo primero en
condiciones bsicas y a continuacin en condiciones acdicas proporciona un control adecuado sobre todo
el proceso. Cada una de las reacciones del aminocido amino terminal puede completarse prcticamente
en su totalidad sin afectar a ninguno de los dems enlaces del pptido. Despus de la eliminacin e
identificacin del residuo amino-terminal, el nuevo residuo amino-terminal puede ser marcado, eliminado e
identificado a travs de la misma serie de reacciones. Este procedimiento se repite hasta que se ha
determinado toda la secuencia. La degradacin de Edman se realiza en un instrumento llamado
secuenciador que mezcla los reactivos en las proporciones adecuadas, separa los productos, los identifica
y registra los resultados. Estos mtodos son extraordinariamente sensibles. A menudo puede determinarse
la secuencia aminocida completa a partir de unos pocos microgramos de protena. La longitud del
polipptido que puede secuenciarse con precisin mediante la degradacin de Edman depende de la
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eficiencia de los pasos qumicos individuales. Consideremos un pptido que empiece con la secuencia
Gly-Pro-Lys- en su extremo amino. Si la glicina se eliminara con una eficiencia del 97%, el 3% de las
molculas del polipptido en la solucin mantendran un residuo de Gly en su extremo aminon. En el
segundo ciclo de Edman, el 94% de los aminocidos liberados sera prolina (se eliminara el 97% de
residuos de Pro del 97% de molculas terminadas en Pro) y el 2,9% glicina (se eliminara el 97% de los
residuos de Gly del 3% de molculas que mantendran su extremo terminal de Gly), mientras que un 3%
de molculas del polipptido mantendran residuos de Gly (0,1%) o Pro (2,9%) en su extremo amino. En
cada ciclo , los pptidos que no han reaccionado en los ciclos anteriores aportarn aminocidos a un fondo
que crece continuamente , haciendo finalmente imposible determinar cul es el siguiente aminocido en la
secuencia peptdica original. Los secuenciadores modernos alcanzan eficiencias superiores al 99% por
ciclo, permitiendo secuenciar ms de 50 residuos aminocidos contiguos de un polipptido. La estructura
primaria de la insulina, resuelta por Sanger y colaboradores a lo largo de un periodo de 10 aos, podra ser
ahora determinada por completo en un da o dos mediante secuenciacin directa en un secuenciador.
13. Determinacin de la estructura cuaternaria.
Para determinar si existe la estructura cuaternaria, primero podramos determinar el peso molecular de la
protena nativa, a continuacin cambiaramos las condiciones del solvente para desnaturalizarla (Aadir
rea, cloruro de guanidina, SDS, mercaptoetanol), y determinar el nuevo peso molecular y compararlo
con el de la protena nueva. Podramos tambin hacer el mecanismo de Edman, mtodo basado en el
genoma: si conocemos la secuencia del gen, podremos mediante el uso del cdigo gentico, asignar cada
triplete a un aminocido especfico y conocer, aproximadamente, la secuencia de la protena.