Cromatografa de Lquidos de Alta

Resolucin
Introduccin
La cromatografa de lquidos es un mtodo de separacin fsica basado en la
distribucin de los componentes de una mezcla entre una fase estacionaria y
una fase mvil que en este caso es un lquido.

La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna

generalmente de vidrio, la cual est rellena con la fase estacionaria.

Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a

travs de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones el tamao de las

partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones lo
cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que la fase
mvil fluya a velocidades razonables.

De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin

(HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las
altas presiones requeridas.

Dependiendo del tipo de fase estacionaria y del tipo de fenmeno fsico que
provoca la separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede
clasificarse en:

1. Cromatografa de adsorcin: La fase estacionaria es un slido y se utiliza

casi exclusivamente slice (slica) y en casos discretos almina.

2. Cromatografa de reparto o particin. Actualmente se utiliza como fase

estacionaria compuestos ligados qumicamente a un soporte slido de slice.

Se puede subdividir en cromatografa en fase normal y en fase inversa

(usualmente mal llamada reversa por traduccin de reversed).
En la cromatografa en fase normal la fase estacionaria es polar (como por
ejemplo slice) y la fase mvil es poco polar (hexano, diclorometano,
cloroformo).

En esta modalidad los compuestos ms polares quedan ms retenidos mientras

que los menos polares eluyen primero.

En la cromatografa en fase inversa, el compuesto unido qumicamente es no

polar, frecuentemente hidrocarburo aliftico, y se emplean las fases mviles
son solventes polares (agua, metanol, acetonitrilo).

En este caso, las sustancias ms polares eluyen primero y las hidrofbicas

quedan ms retenidas.

3. Cromatografa de iones.: Se utilizan columnas rellenas con fases

estacionarias con una determinada carga que retienen iones de carga opuesta.

Las fases estacionarias para la modalidad clsica de esta cromatografa son las
resinas de intercambio inico.

4. Cromatografa de exclusin por tamao: La fase estacionaria est

formada por partculas de porosidad definida y uniforme.

Las molculas de mayor tamao tienen menor capacidad para acceder a los
poros y por mantenerse excluidas eluyen ms rpido, mientras que las de
menor tamao que pueden penetrar en los poros y permanecer all ms tiempo
eluyen en ltimo lugar.
Instrumental
Un equipo para cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) puede
representarse por el siguiente esquema:

La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes
de diferentes botellas en una proporcin determinada y realice la mezcla en
una cmara de mezclado.

Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre el mismo solvente, se

denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar gradientes de
composicin de solvente para aumentar el rango de polaridades de sustancias
a separar acortando el tiempo total de anlisis.

Estos gradientes de solvente tambin son realizados en forma automtica por

las bombas. La bomba enva al solvente hacia la vlvula inyectora a travs de
tuberas de dimetro pequeo, de acero inoxidable o de plsticos especiales.
La vlvula inyectora suele ser una vlvula de seis vas cuyo esquema se
muestra en la figura:

El objeto de utilizar este tipo de vlvulas es de no interrumpir el flujo de fase

mvil a travs de la columna e introducir en el flujo de la misma un volumen
de muestra que estar contenida en un tramo de tubera de volumen fijo (loop).

Luego de que se produce la separacin en la columna, los componentes de la

mezcla pasan por el detector que genera una seal elctrica ante el pasaje de
los analitos proporcional a la cantidad de sustancia.

Esa seal es enviada al registrador o a la PC en donde queda registrado el

cromatgrama. En el caso ideal los picos Cromatogrfico son gaussianos y
cada pico corresponde a un componente de la muestra original.

El integrador puede calcular adems el rea correspondiente a cada pico, la

cual es proporcional a la cantidad de sustancia. Dado que los detectores de
HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos que salen de l.

De esta manera, dependiendo del tamao del loop de inyeccin y de la

columna, y del tipo de bomba, es posible realizar adems de separaciones
analticas, cromatografas preparativas.
Parmetros Relevantes
Los parmetros tericos que caracterizan las separaciones Cromatogrficas
por HPLC son idnticos a los descriptos en cromatografa gaseosa.

En HPLC, en lugar de variar la temperatura de la columna para mejorar la

resolucin del cromatgrama, se cambia la composicin de la fase mvil a lo
largo de la separacin utilizando mezclas de entre dos a cuatro solventes.

Etapas del Anlisis de una Muestra

Son idnticas a las puntualizadas para cromatografa gaseosa. En lo que
respecta a la optimizacin de las condiciones experimentales, en este caso es
posible realizar ensayos preliminares orientativos utilizando cromatografa en
capa delgada con la misma fase estacionaria que contiene la columna.

Por otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas
presiones, es imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan
obstruir las tuberas y la formacin de burbujas que puedan deteriorar el
relleno de las columnas y producir inestabilidad en la seal del detector.

Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran
con membranas de 0,45 a 0,22 m.

Para evitar la formacin de burbujas, los equipos de HPLC cuentan con

desgasificadores de solvente por vaco o por burbujeo con He y, en el caso de
no contar con los mismos, se deben desgasificar los solventes por medio de
ultrasonido o agitacin bajo vaco antes de utilizarlos como fase mvil.

Parte Experimental
Objetivos
Realizar curvas de calibracin para distintos analitos.

Cuantificar el contenido de los mismos en muestras sintticas y comerciales.

Materiales a emplear

Equipo para HPLC marca Agilent, Serie 1200. Los mdulos con los que
cuenta son un desgasificador en lnea; una bomba binaria; una vlvula
inyectora Rheodyne con un loop de inyeccin de 5 l; un detector de ndice de
Refraccin ( RID ); y una PC con el programa de adquisicin Chemstation. La
columna a utilizar ser una XXXXXXXXXX de L=15cm, dimetro 3mm y
dimetro de partcula 3micras.

Solucin tampn fosfato acuoso 0,025M pH=3 calidad HPLC.

Metanol calidad HPLC.

Patrones de xxxxxxxxxxx acuoso de diferentes concentraciones.

Muestras que contengan uno o varios de los analitos mencionados.

Microjeringa de 25 l.

Jeringa de 5 ml con soporte para membranas de 0,45 0,22 micrones y

filtros de nylon de 0.45 0.22 micrones.

Procedimiento
Cuando se desarrolla una tcnica analtica por HPLC, normalmente se elige,
en primer lugar, una fase estacionaria adecuada.

Luego se selecciona una fase mvil, tipo de solvente y composicin, de

manera tal que disuelva los componentes a analizar y que permita una buena
separacin.

Luego se optimizan las condiciones de flujo de solvente, cantidad de muestra

a inyectar.

Una vez elegidas las condiciones, se realizar la curva de calibracin para

cada analito inyectando 20 l de cada solucin patrn de modo de enjuagar y
llenar el loop del inyector.

Graficar el rea de pico en funcin de la concentracin y verificar que se est

trabajando dentro de la zona lineal. Idealmente cada punto de la curva de
calibracin se realiza por triplicado. Realizar el anlisis Cromatogrfico de las
muestras filtradas.

El filtrado se lleva a cabo con una jeringa de 5 ml unida a un soporte

conteniendo un filtro de nylon de 0,45 0,22 micrones; se descarta el primer
ml de filtrado y luego se recoge el lquido en un recipiente limpio.

Si fuera necesario, diluir la muestra para obtener valores dentro del intervalo
de calibracin.

Para el caso de muestras slidas, preparar soluciones de concentracin

adecuada y verificar que el material se disuelva por completo.

Anlisis de los resultados

- Una vez obtenidas las curvas de calibracin, comparar la sensibilidad del
mtodo para la determinacin de cada compuesto en las condiciones de
trabajo.

- Informar las concentraciones de las muestras-problema con su error.

- Proponer un mtodo para evaluar el lmite de deteccin.

- Discutir la necesidad de utilizar otros mtodos (estndar interno, agregado

patrn) para realizar la cuantificacin.