Preparacin, Esterilizacin y Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton

Mndez, Helena Palacios, Hasleidy

Universidad de Boyac Facultad Ciencias de la Salud Bacteriologa y Laboratorio
Clnico

RESUMEN

En condiciones de laboratorio se realiz la preparacin de Agar Mueller Hinton como

medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparacin dadas por
la casa comercial. Basados en esta informacin se realizaron los clculos
adecuados para la preparacin de 20ml de Agar Mueller Hinton, que serian
distribuidos en dos cajas de petri pequeas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del
agar (en polvo) incluido el peso del papel, necesarios para la preparacin del medio
de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de
precipitado que contena 20 ml de agua destilada, y se calent a 250C hasta que
hirviera; una vez obtenida la preparacin, se llevo a esterilizar en autoclave durante
15 minutos a 121C. Luego se procedi a distribuir en las dos cajas de petri el
medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cmara de flujo
laminar, para evitar la contaminacin de este. Finalmente se realizo la prueba de
esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una
temperatura de 37C. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido
para la incubacin del medio de cultivo, arrojaron resultados negativos para el
crecimiento de colonias, indicando que el mtodo de esterilizacin empleado es
efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de
diferentes microorganismos.

PALABRAS CLAVE: Agar Mueller Hinton, esterilizacin, medios de cultivo, prueba

de esterilidad.

INTRODUCCIN

Fue en 1876 cuando Koch fue capaz carne e infusiones, a fin de

de propagar una bacteria patgena
(Bacillus anthracis) en cultivo puro,
fuera del cuerpo que la portaba; en
1881, utilizando un medio liquido, lo
solidifico con gelatina y desarrollo los
mtodos de rayado y siembra en placa
para aislamiento de bacterias. El
siguiente paso lo dio Hesse, en 1891,
al utilizar como agente solidificante un
producto denominado agar, extrado
de las algas rojas. El agar era muy
superior a la gelatina, ya que era
resistente a la digestin microbiana y a
la licuefaccin. Se enriqueci la
composicin de los cultivos
solidificados utilizando extractos de
equipararlos con el tejido infectado
portador (1).
Para el aislamiento, estudio y
clasificacin de los microorganismos,
es necesario utilizar un medio de
cultivo en el que se dispongan de las
sustancias orgnicas e inorgnicas
necesarias e indispensables para el
normal desarrollo de su metabolismo.
En estos medios, los microorganismos
adems de poder multiplicarse,
pueden manifestar caractersticas de
crecimiento y propiedades
bioqumicas, aspectos de gran
importancia para su clasificacin. (2).
Estos preparado, poseen
caractersticas especificas por menor que en los medios de cultivo
ejemplo: contener sustancias nutritivas slidos.
como protenas, azucares, minerales y - lquidos: no contiene ningn agente
vitaminas; tener un pH adecuado; solidificante
estar protegidos de posibles
contaminaciones; y estar esterilizados. Segn se Composicin:
(2). - empricos: en su composicin
aparecen sustancias orgnicas.
Ventajas al Utilizar los Medios de - sintticos: en su composicin
Cultivo. aparecen sustancias qumicas
permite el aislamiento de un definidas.
microorganismo a partir de un sustrato - semisintticos: en su composicin
natural (suelo, agua, plantas, aire, aparecen molculas naturales
excrementos, pus, etc.). hidrolizadas.
permite la identificacin del
microorganismo, segn las Segn el uso a que se destinen:
caractersticas de crecimiento, - medios enriquecidos: suelen ser
morfologa celular, propiedades medios con un nutriente simple que
tintoriales y reacciones bioqumicas. presentan enriquecedores, tales como
Conservacin durante meses y la sangre de carnero. Son medios
aos de las cepas identificadas. destinados a desarrollar
Obtencin de clulas de microorganismos muy exigentes.
microorganismos patgenos o de sus - Medios diferenciales: contienen
toxinas para la elaboracin de colorantes, azucares e indicadores,
productos biolgicos (vacunas, concebidos para provocar una
antitoxinas, etc.) (2). respuesta bioqumica conocida,
generalmente el color.
El tipo de medio que utiliza un - Medios selectivos: adems de
microbilogo depende del contar en su composicin con los
microorganismo que esta cultivando y mismos productos que los medios
el porque de dicho cultivo. Los diferenciales, presentan una serie de
microorganismos presentan una agentes que sirven para inhibir la flora
enorme variedad de requerimientos acompaante de la muestra a
nutricionales. Se utiliza un medio estudiar, y aislar, de esta forma, el
mnimo para determinar los microorganismo que se busca.
requerimientos nutricionales de un - Medios de uso general: son medios
organismo y un medio rico si se desea que soportan el crecimiento de una
obtener masa celular de una forma amplia variedad de microorganismos
rpida (3). fastidiosos, sin exigencias nutritivas
especiales (1).
Clasificacin de los Medios de
Cultivo Preparacin del Agar Mueller Hinton

Segn se Estado Fsico:

- Slidos: presentan en su 1. se disuelven 38g en un litro de agua
composicin una agente solidificante, destilada, calentndolo y agitndolo
el agar, en una proporcin de 12 a 15 al mismo tiempo, hasta su completa
gramos por litro. disolucin. El matraz se cierra con
- semislidos: presentan agar en su doble capa de papel aluminio.
composicin pero en una proporcin
2. se esteriliza en autoclave, a 121C RESULTADOS
durante 15 minutos.
3. se dosifica en placa de petri a un Clculos Necesarios para Preparar la
volumen de 20ml (1). Cantidad de Medio de Cultivo
Deseado
Se deben preparar dos cajas de petri
pequeas con agar Mueller Hinton.
MATERIALES Y MTODOS
20ml para cajas grandes
Para la preparacin del medio de
cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton 15ml para cajas medianas
y se tomaron en cuenta las 10ml para cajas pequeas
especificaciones de preparacin
dadas por la casa comercial.
Inicialmente se realizo el clculo de la
cantidad de agar necesario para la
preparacin del medio de cultivo, o
sea se tomo 1.86gr de agar (incluido
el peso del papel: 1.1gr), el cual se
adicion en una vaso de precipitado
que contena 20ml de agua destilada
que se uso como diluyente del agar.
Seguidamente se calent a 250C
hasta que iniciara a hervir.

Despus de obtenida la solucin de

agar, se realizo proceso de
esterilizacin con autoclave durante
15 minutos a una temperatura de
121C. Finalizado este proceso se
procedi a dispensar el medio,
realizando inicialmente limpieza con
alcohol alrededor del vaso de
precipitado para evitar contaminacin
del medio de cultivo, luego se adiciono
en dos cajas de petri pequeas
aproximadamente 10ml de la
preparacin, esto en condiciones
estriles en cmara de flujo laminar, a
la cual se le realizo limpieza previa
con alcohol al 70% y se puso a
funcionar el aire estril de la cmara
durante 30 minutos.

Una vez dispensado el medio de Despus de realizado el proceso de

cultivo en las cajas de petri, estas se
sellaron con cinta de enmascarar y se
colocaron a incubar a 37C durante 24
horas para verificacin de prueba de
esterilidad.
esterilizacin en el autoclave se
observo en el vaso de precipitado la
formacin del agar con textura
semilquida y de color amarillo muy
claro, como se observa en la figura #1.

Figura #1 agar Mueller Hinton despus
de proceso de esterilizacin.
Los resultados obtenidos en las cajas
de petri luego de la prueba de
esterilidad, permitieron observar que el
medio de cultivo con agar Mueller
Hinton continuaba de color amarillo
claro, sin observarse crecimiento
sobre la superficie de ninguna
poblacin bacteriana, indicando ser un
medio de cultivo viable para su uso.
Figura #2.
Figura #2 agar Mueller Hinton despus
de prueba de esterilidad.
ANLISIS Y DISCUSIN DE
RESULTADOS
Como se menciono anteriormente, se
utilizo agar Mueller Hinton de la casa
comercial OXOID, (cdigo CM 337)
para la preparacin del medio de
cultivo.
El agar Mueller Hinton se utiliza en la
comprobacin de la susceptibilidad de
microorganismos a antibiticos.
Es un medio simple, transparente y sin
materiales termolabiles (1) como se
observa en la figura #1.
Dentro de su composicin en un litro
encontramos:
- Infusin de carne . ...2g
- cidos de casamino.......17.5g
- Almidn......... 1.5g
- Agar ... 17g
Estando con pH de 7.3 y una T
entre 0.1 a 25C.
El almidn contribuye al fomento en el
crecimiento, as como la infusin de
carne y los cidos de casamino, que
sirven de nutrientes al medio
(seleccionados estos para dar la
mayor transparencia posible al
medio). La tcnica de trabajo con este
medio consiste en depositar, en la
superficie, discos de papel
impregnados de antibitico a probar,
una vez sembrada la placa, para
poder ver el halo que se forma
alrededor del disco, y constatar as la
inhibicin de los distintos discos en
sus distintas concentraciones de
antibitico (1)
El agar es un elemento solidificante
muy empleado para la preparacin de
medios de cultivo. Se licua
completamente a la temperatura del
agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados, lo cual se
observo durante la preparacin del
medio de cultivo (2).
La cantidad de agar encontrada en la
composicin qumica (17g), indica que
corresponde a un medio de cultivo
solid, y debido a componentes como
la infusin de carne y los cidos de
casamino, se observa de color amarillo
claro. Figura #2.
Referente a la esterilizacin del medio
de cultivo, debe ponerse mucha
atencin en el tiempo de esterilizacin,
porque si el proceso no dura el tiempo
preciso, el medio puede presentar
problemas de esterilidad, y si
excediera el tiempo preciso, el medio
se sobrecalentara y afectara a las
cualidades del medio y su pH (1).
Las tcnicas de esterilizacin han de
destruir todos los tipos de vida
microbiana (4). El vapor a presin
(autoclave) es el mtodo ms eficaz y
practico para esterilizar con calor. La
exposicin al vapor en un autoclave, a
15 libras de presin (121C) y durante
20 minutos, matara todas las formas
de vida. El vapor a presin penetra
mucho y es particularmente eficaz ya
que se condensa sobre un objeto fri
para liberar 596 cal por g (calor de
condensacin). La condensacin
permite que mas vapor entre en
contacto con los objetos que se estn
esterilizando (4).
Antes de proceder a realizar un cultivo
se microorganismos se debe
considerar como evitar los
contaminantes. Los microorganismos
se encuentran en todas partes y,
debido a su pequeo tamao, se
dispersan fcilmente por el aire y las
superficies. Por consiguiente se debe
esterilizar el medio de cultivo
inmediatamente despus de su
preparacin para eliminar los
microorganismos que lo contaminan,
esto se hace normalmente por calor.
Pero es tambin importante tomar las
debidas precauciones durante el
manejo posterior de un medio de
cultivo estril para lograr excluir de el
todos los microorganismos (5).
CONCLUSIONES
Se aprendi y manejo la tcnica
empleada para la preparacin de
medios de cultivo.
Se aplico la tcnica de esterilizacin
de vapor a presin (autoclave), para
medios de cultivo en agar y caldo
nutritivo.
Se conoci el mtodo de prueba de
esterilidad para verificar viabilidad de
los medios de cultivo.
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