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Ribeiro Preto - SP
2012
MARINA RIBEIRO BATISTUTI
rea de Concentrao:
Fsica aplicada Medicina e Biologia.
Orientador:
Luciano Bachmann.
Verso corrigida
Verso original disponvel na FFCLRP-
Ribeiro Preto - SP
2012
ii
FICHA CATALOGRFICA
Aprovado em: / / .
Banca Examinadora
Julgamento: Assinatura:
Julgamento: Assinatura:
Julgamento: Assinatura:
Agradecimentos
Aos meus pais Paschoal e Cristina pela educao, incentivo, apoio e amor
incondicional. Vocs foram e sempre sero a minha base, os que me ensinaram o
Caminho que devo andar. Obrigada Pai pela inspirao e direcionamento, mesmo
que sem essa inteno, na carreira docente. Obrigada por ser como pai e como
professor um exemplo para mim. Obrigada Me por tudo que voc representa para
mim, todo exemplo, todo consolo, todo carinho, toda pacincia e todo o amor.
Aos meus irmos Guilherme e Ncolas obrigada por todo companherismo,
toda amizade e todas as briguinhas aos finais de semana. Amo vocs!
Ao meu amor David por me acompanhar nessa caminhada, pela apoio,
compreenso e imensa pacincia em todos os momentos. Obrigada por me ouvir,
me entender e me dar nimo para continuar. Obrigada pela ajuda durante a escrita
e formatao deste trabalho, pois sua ajuda foi fundamental. Obrigada por todo
amor e carinho!
Ao Prof. Dr. Luciano Bachmann agradeo imensamente por ter me
aceito tanto como aluna de mestrado como ter me orientado durante todos os anos
de iniciao cientfica. Obrigada por todo conhecimento transmitido, por todas as
oportunidades oferecidas, pela constante pacincia, pelas crticas que me fizeram
crescer, pela confiana depositada que me fez ter responsabilidade pelo trabalho e
pelas decises tomadas. Obrigada pela amizade, pelos cafs e por todas conversas
que me fizeram crescer profissionalmente. voc, sempre serei grata e sei que
sempre poderei contar!
Aos alunos e professores do grupo de Fotobiofsica, muito obrigada! Em
especial, Leila pela sua amizade e parceria. Por toda pacincia e ajuda, por todos
conselhos e desabafos, por todo conhecimento dividido! Ao Fabrcio pela parceria
dia-a-dia, pela correes feitas nesse trabalho, pelas dicas e crticas, pela amizade e
iv
v
por sempre poder contar com sua ajuda! Ao Neto, meu irmo, por estar sempre
presente me alegrando. Obrigada por poder dividir com voc no s o conhecimento
cientfico, mas dia-a-dia todas as risadas, momentos de alegria e aflio.
Ao Prof. Dr. Gilberto bida Leite Braga, colaborador deste trabalho.
Agradeo por abrir as portas do seu laboratrio, por todo conhecimento e toda
ajuda. Agradeo em especial a Ludimila e a Gabi por toda pacincia e toda ajuda
nos experimentos. Agradeo ao Henrique, a Sandrinha e ao Guilherme por toda
amizade construda esses anos, todos os almoos e cafs juntos. Por todas risadas e
momentos de descontrao que dividi com vocs.
Aos funcionrios e tcnicos do Departamento de Fsica que sempre
estiveram presentes para sanar minhas dvidas e me ajudar, em especial secretria
Nilza M. L. Marino por sempre ser to solcita e paciente.
minha amiga-irm Paulinha por dividir comigo no s um apartamento,
mas todas as dvidas e crises da ps-graduao e fora dela tambm, por sempre
me ouvir e me aconselhar. Aos amigos mais chegados que irmos que
imerecidamente so tantos que nem posso citar, mas vocs sabem que so! Obrigada
pela amizade, pelos suporte, por todos os aniversrios e surpresas, todas as caronas,
todos os almoos de domingo juntos. Por tudo que aprendi e sempre aprenderei com
vocs. Por tornar essa caminhada mais leve e alegre!
Capes pela bolsa fornecida.
Louvo Deus pela vida de cada pessoa acima. Louvo Deus pela concluso
deste trabalho e de mais um sonho. Somente Ele toda honra, glria e louvor.
Resumo
vi
vii
viii
ix
nidulans (ATCC 10074) and M. acridum (ARSEF 324) were used to evaluate the
influence of light and pH of the culture medium on the growth of fungi. The pH
values of the medium studied ranged between 5 and 8. To obtain the absorption
spectra, the conidia were gently removed and deposited on the ATR crystal of FTIR
spectrometer.
The absorption spectra were vector normalized and divided in four ranges:
910-1178 cm1 , 1178-1490cm1 , 1490-1790cm1 and 2810-2990cm1 . Spectroscopic
parameters as the displacement of the absorption peak and the ratios of the areas
under the bands were calculated for all spectra collected. The statistical test
t-Student was applied on these parameters to differentiate the samples. Both
analyzes were performed by the program Origin 8.5. The principal component
analysis and cluster analysis were performed using Minitab 16.
The techniques used for analysis were able to differentiate samples of
Aspergillus grown in the presence and absence of light, but it was not possible
to Metarhizium. Among the pH of the culture medium was only possible to
identify the pH 8. The A. flavus with white and green conidia were differentiated
among themselves and between them and the A. nidulans. Among the strains of
the same specie it was possible to obtain the correct classification according to
the taxonomy through spectral region 1178-1490 cm1 . The four methods were
considered appropriate for the analysis of absorption spectra, however displacement
of the absorption peak and the ratios of the areas are feasible for a small number of
samples and the multivariate analysis are feasible for a large number of samples.
x
xi
xviii
xix
4.9 Teste estatstico t-Student para a razo entre as reas de cada banda
de absoro da espcie A. nidulans. A comparao feita entre os dois
valores de pH vizinhos a fim de avaliar a variao das bandas com o
aumento do pH. Destacam-se em cinza as bandas que apresentam
diferenas significativas. Nas clulas em branco no foi possvel
realizar o teste devido falta da banda correspondente no outro grupo
amostral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
4.10 Valores obtidos para a anlise e componentes principais da espcie A.
nidulans submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura.
Observam-se os autovalores, a varincia explicada e a varincia
acumulada sempre superior a 86%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.11 Valores mdios do pico de absoro de cada banda da espcie M.
acridum para diferentes valores de pH do meio de cultura nos
intervalos I e II do espectro com seus respectivos desvios padro.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.12 Teste estatstico t-Student para os valores de pico da espcie M.
acridum submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura.
Os valores de pH foram agrupados dois a dois em ordem crescente
para verificar as alteraes em funo do aumento do pH. Poucas
diferenas so apontadas pelas lacunas em cinza. . . . . . . . . . . . . 101
4.13 Teste estatstico t-Student para a razo da rea de cada banda de
absoro da linhagem M. acridum submetidos a diferentes valores de
pH do meio de cultura. Os valores de pH foram agrupados dois a
dois em ordem crescente para verificar as alteraes em funo do
aumento do pH. As diferenas so apontadas pelas lacunas em cinza. 103
4.14 Valores obtidos para a anlise e componentes principais da espcie M.
acridum submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura.
Observam-se os autovalores, a varincia explicada e a varincia
acumulada sempre superior a 67%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
xxi
IV Infravermelho (Infrared ).
xxiii
xxiv
UV Ultravioleta.
Lista de Smbolos
Comprimento de onda.
Freqncia (Hz).
B Campo Magntico.
E Campo Eltrico.
n ndice de refrao.
c Velocidade da luz.
f Constante de fora.
F Fora restauradora.
re Posio de equilbrio.
p Momento de dipolo.
h Constante de Planck.
xxv
xxvi
D Detector de radiao.
X Matriz de dados.
p Autovalores.
ei Autovetor normalizado.
vetor de mdias.
Varincia estimada.
C Conglomerado.
Estiramento da ligao.
Deformao da ligao.
Flexo da ligao.
Sumrio
Lista de Figuras x
Lista de Tabelas xi
1 Introduo 1
1.1 Espectroscopia no Infravermelho[6] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1 Histrico e desenvolvimento da tcnica . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2 A Teoria Clssica e Quntica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Instrumentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.2.1 Interfermetro de Michelson . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3 Trasformada de Fourier no Infravermelho - FTIR . . . . . . . . . . . 16
1.4 Reflexo Total Atenuada - ATR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.5 Processamentos Matemticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.5.1 Deslocamento de pico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.5.2 Razes entre as reas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.5.3 Anlise de Componente Principal [11] . . . . . . . . . . . . . . 22
1.5.4 Anlise por agrupamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.6 Fungos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
xxvii
xxviii
3 Metodologia 36
3.1 Objetos de estudo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.1.1 Linhagens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.2 Cultivo dos fungos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3 Espectroscopia por FTIR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.3.1 Testes Preliminares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.3.2 Aquisio dos espectros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.4 Anlise de Dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.4.1 Normalizaao vetorial [46] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4.2 Deslocamento dos picos de absoro . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4.3 Anlise por Razes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.4.4 Anlise de Componentes Principais . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.4.5 Anlise de Agrupamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4 Resultados e Discusso 47
4.1 Influncia da Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.1.1 Aspergillus nidulans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.1.2 Metahrizium acridum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.2 Influncia do pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.2.1 Aspergillus nidulans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.2.2 Metarhizium acridum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.3 Classificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
4.3.1 Aspergillus flavus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4.3.2 Aspergillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
4.3.3 Metarhizium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
4.3.4 Metarhizium e Aspergillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Referncias 148
A Correes 155
Captulo 1
Introduo
1
1.1 - Espectroscopia no Infravermelho[6] 2
c = n (1.1)
F = f x (1.2)
x = r re (1.3)
Figura 1.3: Modelo clssico da interao da radiao eletromagntica com uma molcula
diatmica. Quando o vetor campo eltrico, E , da radiao incidente se acoplar com o
momento de dipolo, p, a molcula A-B vibrar e a energia da radiao incidente ser
absorvida pela molcula. Quando a molcula no possui momento de dipolo permanente
(A-A) no haver acoplamento eltrico nem absoro de energia.
for igual a frequncia natural de vibrao da molcula ento o vetor campo eltrico,
Figura 1.4: O modelo clssico de um rotor linear rgido ilustra as interaes rotacionais
da molcula (A-B) com a radiao eletromagntica.
consistente, como foi demonstrado anteriormente, durante o sculo XIX muitas delas
afirmavam que a matria no poderia interagir com a energia que forma contnua,
como era suposto at o momento. Trabalhos subsequentes de Einstein, Planck
e Bohr indicaram de formas diferentes que a radiao eletromagntica poderia ser
considerada uma corrente de partculas ou quanta onde cada energia, , dada pela
equao de Bohr:
= h (1.7)
E1 E0
= (1.8)
h
Figura 1.8: Funo energia potencial anarmnica apresenta nveis de energias definidos
ao invs de contnuos.
aqui aplicadas para o espectro infravermelho do modelo mais simples: uma molcula
diatmica.
As consideraes para molculas poliatmicas so maiores, mas ainda assim
suficientes para descrev-las. As molculas poliatmicas so podem tambm serem
vistas como um sistema de massas ligadas por molas com propriedades elsticas.
As posies de cada tomo podem ser descritas em funo dos eixos X, Y e Z de
um plano cartesiano. Cada tomo tem ento trs graus de liberdade. Isto significa
que ele pode executar movimento relativo a esses trs eixos. E isto conhecido
como movimento translacional. Como as molculas possuem muito mais tomos,
logo tero muitos graus de liberdade. Mas como entender e determinar o nmero de
graus de liberdade?
Se cada tomo possui trs graus de liberdade, cabvel imaginar que uma
molcula diatmica possua o dobro, ou seis graus de liberdade. Sendo assim, quais
so esses graus? Tomando como exemplo a molcula H-Cl, trs deles so os descritos
como graus de liberdade translacional. Os outros trs so provenientes dos graus de
liberdade rotacional e vibracional. No caso de uma molcula linear, como o H-Cl,
dois desses graus so rotacionais e o restante vibracional, em virtude do movimento
oposto dos dois tomos gerando o efeito de estiramento e compresso da ligao.
Ampliando essa anlise para uma molcula poliatmica contendo N tomos,
vamos distinguir dois grupos: linear e no linear. Ambas tm trs graus de liberdade
translacional. As molculas poliatmicas lineares possuem dois graus de liberdade
rotacional e as molculas no lineares possuem trs. Podemos exemplificar para
duas molculas simples como CO2 e H2 O na Tabela 1.1:
Figura 1.9: Ilustrao dos modos vibracionais para uma molculas triatmica no-linear.
Os itens i e ii correspondem a estiramentos simtricos e assimtricos respectivamente,
enquanto o iii corresponde a uma flexo.
Em muitos casos apenas uma interpretao parcial necessria, por dois motivos:
1. Certos grupos qumicos possuem massas diferentes dos seus grupos adjacentes,
com frequncias caractersticas ou nmeros de onda vibracionais especficos que
podem ser comparados com tabelas ou espectros de referncia, no intervalo de
1500-4000 cm1 .
1.2 Instrumentao
Os primeiros espectrmetros eram chamados de dispersivos e possuam
prismas ou grades de difrao da luz. A grade de difrao possua a vantagem de ter
resoluo alta e um grande intervalo de frequncias, porm os prismas permitiam a
passagem de mais energia. Entretanto, qualquer que fosse o mtodo usado, haveria
uma grande limitao do equipamento em termos energticos, obtendo espectros
com pouca resoluo e com um limitado intervalo de nmeros de onda.
Quando a posio do espelho mvel gerar dois feixes viajando com distncias
iguais at o detector, D, um forte sinal ser obtido. Conforme o espelho mvel se
movimenta em relao a sua posio central, a distncia entre os feixes varia, e um
sinal de interferncia registrado pelo detector. Michelson notou que este padro
de interferncia possua informaes espectrais.
O desenvolvimento da tcnica para registro do padro de interferncia atravs
do movimento do espelho por uma distncia /2 produz uma diferena total de
caminho . O padro de interferncia apresentado na Figura 1.11 para uma fonte
de radiao monocromtica (i) e para uma fonte policromtica (ii) de radiao.
O primeiro uma funo cosseno simples enquanto o segundo possui uma forma
mais complicada por conter toda a informao espectral da radiao que chegou ao
detector.
dado por:
Z +
I() = B() cos(2).d (1.10)
0
n1
c = sen1 ( ) (1.12)
n2
Essa tcnica tambm pode ser usada para anlise de amostras lquidas ou
emulses, reduzindo o tempo de preparo das amostras [6].
Os espectros de reflectncia total atenuada so semelhantes mas no iguais
aos espectros comuns de absoro. Em geral, os mesmo picos so observados,
porm suas intensidades relativas diferem. As absorbncias dependem do ngulo de
incidncia, mas so independentes da espessura da amostra, uma vez que a radiao
penetra apenas alguns micrmetros na mesma.
Entre as grandes vantagens do ATR est a rapidez com que os espectros so
obtidos e a variedade de amostras possveis.
O vetor de mdias ser estimado pelo vetor de mdias amostrais X definido por:
X1
1
X = [X 1 . . . X n ] = ..
(1.14)
.
n
Xp
por:
S11 S1p
Spxp
= .. .. ..
(1.15)
. . .
Sp1 Spp
p
X X Y
(i) det( pxp ) =| pxp | = |pxp | = i
i=1
X
(ii) trao( pxp ) = trao (pxp ) = 1 , 2 , . . . , p
Ento, a matriz O dada por O = [e1 ...ep ] e pelo teorema da decomposio espectral
1.5 - Processamentos Matemticos 25
p
X X
0
pxp = OO = i ei e0i (1.21)
i=1
1
kei k = (e2i1 + e2i2 + + e2ip ) 2 = 1 (1.22)
(ii) A varincia total explicada pela j-sima componente amostral dada por:
1.5 - Processamentos Matemticos 27
V ar[Yj ] j
=
(1.25)
Varincia Total Estimada de X Pp
1 i=1
Assim, as componentes principais so analisadas em funo das porcentagens de
varincia total explicada. Em termos prticos, necessrio calcular os seus valores
numricos para cada elemento amostral, chamados de escores das componentes. O
grfico de disperso dos escores das primeiras componentes principais usado para
anlise final.
onde Xij representa o valor observado da varivel i medida no elemento j. Para que
seja possvel o agrupamento, necessrio conhecer a medida de similaridade a ser
utilizada.
A distncia Euclidiana entre dois elementos Xl e Xk , l 6= k, uma medida
de dissimilaridade, ou seja, quanto menor os seus valores, mais similares sero os
elementos que esto sendo comparados. Esta distncia definida por:
p
1 1
X
0
d(Xl , Xk ) = [(Xl Xk ) (Xl Xk )] = [ (Xil Xik )2 ] 2
2 (1.27)
i=1
ni
X
SSi = (Xij X i )0 (Xij X i ) (1.28)
j=1
1
vetor de mdias de Ci = X i = [X1 + X2 + + Xn ] (1.29)
ni
gk
X
SSR = SSi (1.30)
i=1
nl ni
d(Cl , Ci ) = [ ](X L X i )0 (X l X i ) (1.31)
nl + ni
1.6 Fungos
Condios so estruturas especializadas, produzidas assexuadamente por
fungos filamentosos, envolvidos na reproduo, disperso e persistncia ambiental.
No caso de espcies patgenas, os condios tambm podem estar envolvidos no
reconhecimento e na infeco do hospedeiro. Em contraste com o miclio vegetativo,
que apresenta alta atividade metablica, os condios da maioria dos fungos so
estruturas dormentes com baixa atividade metablica [12].
O gnero Aspergillus, por exemplo, compreendem diversas espcies de fungos
que apresentam interesses mdico, agrcola e industrial, como A. fumigatus, A.
flavus e A. niger alm de espcies-modelo como A. nidulans. A maioria das
espcies apresenta ampla distribuio geogrfica. Espcies como A. fumigatus so
importantes patgenos oportunistas e representam um srio problema de sade
pblica. O fungo produz condios esfricos pequenos (2-3,5 m de dimetro)
que permanecem suspensos na atmosfera por longos perodos, facilitando as suas
disperses pelo ar [13].
A aspergilose possui uma mortalidade de 30-90%, sendo causada pela inalao
dos condios. Aps o desenvolvimento do fungo nos pulmes, a infeco pode se
disseminar para os outros rgos do corpo. A principal razo da morte dos pacientes
a baixa eficincia das drogas disponveis para o tratamento. A importncia clnica
crescente aumentou muito o interesse pelo estudo de diversos aspectos da biologia
de A. fumigatus [14].
A. nidulans tem sido um dos principais sistemas-modelo em gentica e
biologia molecular nos ltimos 50 anos e o seu estudo contribuiu muito para a melhor
compreenso de diversos processos celulares importantes, como mitose, expresso
gnica e desenvolvimento. O gnero Aspergillus tambm tem contribudo para o
entendimento do metabolismo secundrio em fungos e para o estudo de metablitos
secundrios economicamente importantes, como as aflatoxinas e penicilinas [15, 16].
1.6 - Fungos 31
33
2.1 - Objetivos 34
2.1 Objetivos
O objetivo geral deste trabalho a anlise comparativa entre as metodologias
empregadas na espectroscopia vibracional. Metodologias estas que visam diferenciar
e classificar fungos.
Para o xito deste objetivo, outros mais especficos foram estabelecidos.
Primeiramente obter os espectros vibracionais de diversas linhagens de fungos e
identificar fatores que afetem seu crescimento e que possam ser reproduzidos em
laboratrio, como a presena de luz e o pH do meio de cultura.
2.1 - Objetivos 35
36
3.2 - Cultivo dos fungos 37
3.1.1 Linhagens
Foram usadas as linhagens Aspergillus nidulans (ATCC 10074) e Aspergillus
flavus (ATCC 1410) com condios brancos e verdes do gnero Aspergillus
e Metarhizium acridum (ARSEF 324); Metarhizium acridum (ARSEF 7486);
Metarhizium anisopliae (ARSEF 2575); Metarhizium brunmeum (ARSEF 1095);
Metarhizium brunmeum (ARSEF 5626) do gnero Metarhizium. As linhagens de
Aspergillus foram obtidas da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas,
VA) e as linhagens de Metarhizium foram obtidas da USDA - ARSEF collection
of Entomopathogenic Fungal Cultures (U.S. Plant, Soil and Nutrition Laboratory,
Ithaca, NY).
As espcies fngicas foram agrupadas segundo a taxonomia hoje conhecida e
descrita na Figura 3.1. Note-se os quatro nveis de similaridade entre as linhagens:
h gneros diferentes, espcies diferentes, linhagens diferentes da mesma espcie e
variaes na cor do condio dentro da mesma linhagem. O reino Fungi compreende
muitos outros filos, assim como o filo Ascomycota compreende muitos outros gneros
alm dos que esto apresentados no diagrama abaixo, porm este grupo amostral
foi selecionado para aplicao da metodologia de interesse.
Figura 3.1: Classificao taxonmica dos fungos usados neste trabalho. O reino Fungi
apresenta diversos filos, entre eles o Ascomycota. Os gneros Metarhizium e Aspergillus
empregados neste trabalho pertencem a este Filo. Do gnero Metarhizium seis linhagens
foram utilizadas, enquanto duas do gnero Aspergillus foram utilizadas.
qualquer outra suplementao. As placas com meio foram preparadas um dia antes
da inoculao dos fungos para garantir que no havia contaminao.
Foram preparados 2,0 mL de suspenso de condios em soluo 0,01% (v/v)
de tween-80 (Sigma - Aldrich, EUA) em tubos de vidro (Schott GL 18, EUA).
A concentrao de condios foi determinada atravs da contagem na cmara de
Neubauer (Boeco, Alemanha) e a concentrao final das suspenses foi ajustada para
1, 0 108 clulas mL1 . Foram inoculados 100, 0 L de suspenso em cada placa e
para cada experimento foram preparadas trs placas de cada linhagem para garantir
a repetitividade do experimento. As placas foram incubadas em uma Incubadora
B.O.D 411D (Nova tica, Brasil) por 12 dias (Metarhizium) e 5 dias (Aspergillus),
no escuro, a 28 C. Aps esse perodo, as placas foram retiradas da incubadora e
levadas imediatamente para a coleta dos espectros de infravermelho.
Para anlise da influncia da luz, o procedimento de preparao das
amostras foi semelhante ao descrito anteriormente. Foram preparadas seis placas
de Aspergillus nidulans (ATCC10074) e seis de Metarhizium acridum (ARSEF
3.3 - Espectroscopia por FTIR 39
324). Trs placas de cada amostra foram crescidas no escuro e trs crescidas na
mesma incubadora com ciclo de 12 horas de claro/escuro usando duas lmpadas
fluorescentes Daylight Plus F30W/155-T8 (Sylvania, Germany).
No momento da preparao do meio de cultura, a variao do pH foi feita
utilizando solues de hidrxido de sdio e cido clordrico. Para cada valor usado,
no caso pH 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 7,0 e 8,0, foram preparadas seis placas, sendo todas
verificadas com um pHmetro. Em trs dessas placas foram cultivados Aspergillus
nidulans (ATCC10074) e nas outras trs Metarhizium acridum (ARSEF 324).
Todo o cultivo e crescimento dos fungos foram supervisionados por um
profissional experiente no manuseio e cultivo dos mesmos, Prof. Dr. Gilberto bida
Leite Braga da Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, colaborador
deste trabalho.
Figura 3.2: Espectro do meio de cultura usado para o crescimento dos fungos.Destaque
na regio de 900-1200 cm1 para melhor visualizao. O espectro apresenta picos em 3300
cm1 , 1630 cm1 e de 900 a 1200 cm1 .
C=O na forma aberta e C-O no anel, como ilustrado na Figura 3.3. O gar um
polmero composto por monmeros de acar tendo sua estrutura similar a dextrose,
mas com muitas ligaes C-OH.
A retirada dos condios das placas de Petri foi feita atravs de leves batidas na
placa para que os condios se desprendessem, e quando necessrio uma ala era usada
para remover apenas os condios. Entretanto, outras estruturas do fungo, como
hifas poderiam se desprender e interferir no espectro. Para verificar as estruturas
do fungo possivelmente presentes na anlise, o material desprendido foi observado
no microscpio. A Figura 3.4 apresenta uma das imagens obtidas sem a necessidade
de usar corantes, apenas a soluo de tween.
Todas as imagens obtidas foram semelhantes a anterior. Por ela observamos
apenas a presena de condios na amostra e garantimos o procedimento proposto
para obteno dos condios.
Figura 3.4: Imagem microscpica dos condios retirados pelo procedimento usado neste
trabalho.
Figura 3.5: Espectro de absoro de uma amostra do fungos Aspergillus nidulans (ATCC
10074) crescido na ausncia de luz. O espectro foi subdividido em trs regies: regio I
(910-1178 cm1 ), regio II (1178-1490 cm1 ), regio III (1490-1790 cm1 ) e a regio IV
(2810-2990 cm1 ).
I. 910-1178 cm1
Esta subdiviso foi feita para poder visualizar cada intervalo do espectro com
maior detalhamento, assim como identific-los bioquimicamente e empregar todas
3.4 - Anlise de Dados 44
ybk = yk ym (3.2)
ybk
Yk = p P (3.3)
yk )2
k (b
Figura 3.6: Um exemplo do resultado gerado pelo ajuste de picos atravs do programa
Origin 8.5 para o intervalo I do espectro de absoro do A. nidulans com 12 bandas
determinadas pela derivada de segunda ordem.
47
4 - Resultados e Discusso 48
quais se verificou alteraes qualitativas. Estes grupos sero avaliados pelas tcnicas
propostas nas prximas sees, mas aqui ser feito breve resumo sobre as alteraes
observadas.
A Figura 4.2a apresenta a espcie A. nidulans crescida na presena e na
ausncia de luz. Os dois espectros apresentam grande semelhana. O intervalo de
910-1740 cm1 apresenta uma absorbncia mais elevada para a cultura crescida na
presena de luz. Apesar dessa diferena ambos os espectros apresentam as mesmas
bandas de absoro.
A segunda figura (4.2b) apresenta a variao do espectro do A. nidulans
(ATCC 10074) com o pH do meio de cultura. Novamente observamos variaes
na amplitude do espectro no intervalo de 910-1740 cm1 , observa-se tambm um
aumento na absorbncia no intervalo entre 2600-4000 cm1 . No intervalo de
4 - Resultados e Discusso 49
(a) (b)
(c) (d)
910-2810 cm1 , que cobre quase todo o espectro, a absorbncia parece aumentar
com o aumento do pH do meio de cultura.
Os dois gneros de fungos diferentes foram comparados na Figura 4.2c atravs
das amostras de A. nidulans e de M. acridum. O espectro apresenta grande
variao na intensidade de absorbncia entre os dois gneros. A banda referente
a cidos graxos, ou sebo, localizada em 1700 cm1 , de sebo, est presente apenas
no M. acridum. No intervalo de 2810-2990 cm1 observa-se uma grande variao
na absorbncia das bandas referentes s ligaes de CH2 e CH3 . Estas primeiras
4.1 - Influncia da Luz 50
(a) (b)
(c) (d)
Tabela 4.1: Apresentao dos valores mdios da posio das bandas de absoro com
seus respectivos desvios padro e associao bioqumica subdivida nas quatro regies em
estudo. Destacam-se as bandas que esto presentes apenas em um ou outro grupo. Nas
clulas em branco a respectiva associao no foi encontrada na literatura. As letras ,
e referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes respectivamente.
947,9 (2,3)
956,3 (1,3)
959,3 (0,7)
1014,9 (0,5)
1201,8 (0,5) PO
2 Fosfato
1203,7 (0,2)
1241,4 (1,3) PO
2 Fosfato
1325,2 (0,9)
1417,7 (0,5) CN e CH
1422,1 (0,3)
1439,9 (0,5)
1452,4 (0,5)
1731,5 ster de
(21,2) cido graxo
IV 2924,9 (0,8) CH
Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student
947 0,053
956 0,122
959 0,069
1009 1,902
1014 0,477
I 1026 1,779
58
Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student
1030 0,320
4.1 - Influncia da Luz
1076 0,575
1080 1,229
1124 0,268
1127 0,059
1201 0,077
Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student
1203 0,495
4.1 - Influncia da Luz
1241 0,219
1282 0,007
1291 0,364
1325 0,023
1327
Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student
1417 0,138
1422 0,968
1439 0,372
1450 0,291
1452
1464 0,630
1471 0,014
Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student
1534 2,335
1595 0,532
Ausncia de luz Presena de luz p t-Student Ausncia de luz Presena de luz p t-Student
1731 0,226
4.1 - Influncia da Luz
IV 2924
2926
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.5: Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. nidulans (ATCC
10074) com crescimento na presena e na ausncia de luz para os quatro intervalos do
espectro de absoro. Nos intervalos I e II apresentados em (a) e (b) a distribuio dos
postos varia em torno de eixo de PC 1. No intervalo III, em (c), a distribuio dos pontos
varia em torno do eixo de PC 2. No intervalo IV mostrado em (d) no h distino dos
grupos j que os pontos se encontram sobrepostos.
(a) (b)
(c) (d)
Tabela 4.4: Valores mdios da posio das bandas de absoro com seus respectivos
desvios padro e associao bioqumica subdivida nas quatro regies em estudo. Nas clulas
em branco a respectiva associao no foi encontrada na literatura. As letras , e
referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes respectivamente.
Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student
Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student
Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student
Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student
Ausncia de luz Presena de luz t-Student Ausncia de luz Presena de luz t-Student
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.9: Anlise das componentes principais aplicada a espcie M. acridum (ARSEF
10074) com crescimento na presena e na ausncia de luz para os quatro intervalos do
espectro de absoro. Em todos os quatro intervalos observam-se a disperso e sobreposio
dos pontos onde no possvel diferenci-los atravs do PCA.
[59], alm dos mecanismos que sofrem alteraes serem importantes para a proteo
dos condios contra a radiao UVB ou para neutralizar radicais livres e oxidantes
[54].
Muitos estudos vm sendo realizados com o intuito de verificar os efeitos
de diversas condies de crescimentos na tolerncia ao estresse e a radiao UVB
nos Metarhizium [52, 53, 54]. Alguns resultados apresentam uma alta tolerncia
e estabilidade do M. acridum (ARSEF 324) a radiao UVB [58]. Tambm foi
demonstrado que a produo de pigmentos como melanina e carotenoides, muito
comuns em fungos expostos a luz, no ocorre em amostras de M. robertsii crescidos
na presena e ausncia de luz e em dois meios de cultura diferentes [54].
Ao tentar avaliar o comportamento do M. acridum na presena e ausncia de
4.1 - Influncia da Luz 80
luz atravs do espectro de absoro temos como resultado dois espectros semelhantes.
A estabilidade ou tolerncia do fungo luz evidenciada atravs desta semelhana.
Ou seja, devido tolerncia desta espcie exposio luminosa durante seu
crescimento nenhuma alterao visvel encontrada no espectro de absoro.
Para avaliar a produo de pigmentos, a banda localizada em 1155 cm1
referente aos carotenoides pode ser observada. Entretanto, esta banda no apresenta
alterao pela anlise pelo deslocamento de seu pico ou pela razo da sua rea,
logo entende-se que assim como o M. robertsii, o M. acridum tambm no produz
carotenoides na presena de luz.
Esta ltima anlise s possvel de ser realizada atravs da identificao de
cada banda de absoro seguida do deslocamento de pico e razo entre as reas. A
anlise por componentes principais no foi capaz de identificar alteraes em bandas
individuais.
As amostras analisadas nesta seo so linhagens pertencentes a dois gneros
diferentes. Quando submedidas ao crescimento na presena e ausncia de luz o
resultado obtido para cada uma foi diferente. Ao observar visualmente o espectro
da linhagem A. nidulans verificam-se variaes, porm o mesmo no ocorrer com
os espectros da linhagem M. acridum quando submetidos as mesmas condies
4.2 - Influncia do pH 81
4.2 Influncia do pH
Assim como a luz, o pH do meio de cultura tambm influencia o
desenvolvimento do microrganismo [22, 61]. O estudo desta influncia foi realizado
com as espcies A. nidulans (ATCC 10074) e M. acridum (ARSEF 324).
A espcie A. nidulans mostrou em estudos que o pH do meio altera sua
produo de aflatoxinas, com a penicilina [62], sendo menor quanto maior for o valor
do pH. J a espcie M. anisopliae, tambm do gnero Metarhizium, muito usada
como controle biolgico de pragas por produzir enzimas extracelulares responsveis
pela degradao da cutcula dos insetos, destaca-se pela capacidade de crescer em
meio com pH variando de 2,5 a 10,5.
Assim, sabendo da interao desses gneros com o meio e sua direta relao
com a produo de metablitos, espera-se que as alteraes decorrentes da variao
do pH do meio de cultura sejam identificadas atravs do espectro de absoro.
Os espectros do meio de cultura, sem a inoculao do fungo, foram obtidos
para os diferentes valores de pH utilizados (Figura 4.10). Observa-se que o espectro
de absoro do meio de cultura, ou PDA, semelhante independente do valor de
pH.
As bandas presentes nos espectros de absoro do meio de cultura j foram
identificadas e apresentadas na Tabela 3.1 do Captulo 3 deste trabalho.
Dentre os seis valores de pH preparados, o meio de cultura com pH 4 no
solidificou, logo no foi possvel realizar o cultivo dos fungos neste pH.
4.2 - Influncia do pH 82
Figura 4.10: Espectros de absoro do meio de cultura sem a inoculao dos fungos
preparado com diferentes valores de pH. Observa-se que os espectros de absoro do meio
de cultura no sofrem variaes em funo dos valores de pH.
deslocamento de alguns picos, como por exemplo o pico localizado em 1103 cm1 ,
referente polissacardeos. Tambm possvel observar o desaparecimento de
bandas, como o caso da banda localizada em 925 cm1 , no caracterizada, que no
est presente no espectro do pH 8. Entretanto, a banda em 950 cm1 apresenta um
aumento em sua absorbncia no pH 8.
(a) (b)
(c) (d)
Tabela 4.7: Valores mdios da posio das bandas de absoro com seus respectivos
desvios padro e associao bioqumica [20] subdivida nas quatro regies em estudo.
Destacam-se as bandas que esto presentes apenas em um ou outro grupo. Nas clulas
em branco a respectiva associao no foi encontrada na literatura. As letras , e
referem-se ao estiramento, deformao e flexo das ligaes respectivamente.
935,4
(3,0)
1076,3 PO
2 Fosfato
(0,6)
1128,9
(9,2)
1224,8 Colgeno
(2,0) \
Fosfato
1245,2 PO
2 Fosfato
(3,1)
1271,2
(1,6)
1302,5
(2,2)
1338,6 Colgeno
(3,2)
A Tabela 4.7 nos permite observar e semelhana entre os picos dos espectros
dos valores de pH entre 5 e 7, assim como o diferentes valores de pico encontrado
para o pH 8.
Para a anlise estatstica desse grupo de amostras o teste t-Student foi
realizado pareando os valores de pH em sequncia crescente e sem comtemplar
todas as possibilidades de combinao, j que o intuito verificar os picos
significativamente diferentes em funo do aumento do pH. Assim, a Tabela 4.8
apresenta os valores dos picos e o resultado do teste t-Student com destaque para
os valores que so significativamente diferentes. As clulas em branco correspondem
a comparaes que no foram possveis de realizar.
4.2 - Influncia do pH 89
Tabela 4.8: Teste estatstico para a posio de cada banda de absoro da espcie
A. nidulans. destacam-se em cinza as bandas que apresentam diferenas significativas
(p<0,05). Nas clulas em branco no foi possvel realizar o teste devido a falta da banda
correspondente no outro grupo amostral.
935
1025
1076
1128
1151
1224
1245
1271
1302
1338
Tabela 4.9: Teste estatstico t-Student para a razo entre as reas de cada banda de
absoro da espcie A. nidulans. A comparao feita entre os dois valores de pH vizinhos
a fim de avaliar a variao das bandas com o aumento do pH. Destacam-se em cinza as
bandas que apresentam diferenas significativas. Nas clulas em branco no foi possvel
realizar o teste devido falta da banda correspondente no outro grupo amostral.
935
1025
1076
1128
1151
1224
1245
1271
1302
1338
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.13: Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. nidulans (ATCC
10074) com crescimento em meios de cultura com diferentes valores de pH. Nos intervalos
I e II observa-se grande disperso dos pontos com apenas os pontos referentes ao pH 8
agrupados. Nos intervalos III e IV todos os valores de pH apresentam-se dispersos e
sobrepostos.
A Tabela 4.11 apresenta os valores mdios dos picos de absorbncia para cada
banda em cada valor de pH. A associao bioqumica no foi apresentada sabendo
que a mesma j foi mostrada para a espcie M. acridum no estudo da influncia da
luz sob essa espcie (Tabela 4.4).
Tabela 4.11: Valores mdios do pico de absoro de cada banda da espcie M. acridum
para diferentes valores de pH do meio de cultura nos intervalos I e II do espectro com seus
respectivos desvios padro.
pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8
926,8 (2,6) 926,5 (1,9) 926,9 (2,1) 924,3 (14,9) 917,6 (51,3)
942,5 (3,7) 943,8 (3,7) 943,6 (2,7) 943,8 (3,9) 943,2 (3,6)
954,3 (0,5) 954,5 (0,8) 953,9 (0,8) 954,2 (0,5) 954,3 (0,5)
pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8
971,7 (0,4) 971,8 (0,5) 971,8 (0,8) 971,9 (0,7) 971,9 (0,6)
993,5 (0,5) 993,4 (0,5) 993,5 (0,7) 993,6 (0,4) 993,6 (0,4)
1012,9 (0,6) 1012,7 (0,5) 1012,9 (1,0) 1012,9 (0,9) 1012,9 (0,6)
I 1031,1 (0,4) 1031,1 (0,3) 1030,9 (0,5) 1031,1 (0,3) 1031,1 (0,3)
1046,5 (1,2) 1046,7 (0,9) 1046,5 (1,3) 1046,7 (1,2) 1046,6 (0,9)
1062,5 (1,7) 1062,2 (1,6) 1062,4 (1,5) 1062,3 (1,4) 1062,4 (1,6)
1077,5 (1,1) 1077,7 (1,0) 1077,6 (0,8) 1077,6 (0,9) 1077,6 (0,9)
1108,4 (0,6) 1108,2 (0,8) 1108,6 (0,7) 1108,5 (0,3) 1108,7 (0,8)
1125,7 (3,7) 1124,7 (2,9) 1127,5 (2,8) 1125,8 (4,2) 1127,5 (4,2)
1139,9 (1,1) 1139,2 (1,9) 1139,7 (1,2) 1139,6 (1,4) 1139,6 (1,5)
1155,6 (0,4) 1155,5 (0,5) 1155,5 (0,4) 1155,5 (0,4) 1155,5 (0,5)
1228,7 (0,8) 1228,2 (1,0) 1228,2 (1,8) 1228,7 (1,8) 1228,7 (0,9)
1263,6 (0,9) 1263,9 (0,1) 1263,6 (2,8) 1261,6 (5,9) 1262,9 (3,3)
1264,5 (1,8) 1263,9 (0,2) 1265,1 (3,3) 1264,2 (1,2) 1264,0 (0,5)
1278,4 (3,9) 1276,9 (3,3) 1278,1 (2,3) 1276,2 (3,7) 1277,1 (3,5)
1295,3 (2,8) 1295,3 (2,3) 1295,4 (3,3) 1293,1 (2,9) 1295,3 (3,3)
pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7 pH 8
1311,1 (1,1) 1311,4 (2,0) 1311,6 (1,2) 1310,4 (4,5) 1311,8 (1,5)
1320,9 (1,0) 1321,8 (3,1) 1321,2 (1,7) 1321,6 (4,1) 1321,7 (2,9)
II 1339,8 (1,9) 1339,2 (3,2) 1339,4 (3,0) 1339,5 (4,2) 1338,5 (5,2)
1361,2 (3,4) 1361,4 (3,1) 1362,1 (2,2) 1360,5 (3,4) 1361,9 (2,8)
1377,6 (0,3) 1377,7 (0,3) 1377,8 (0,3) 1377,5 (0,5) 1377,6 (0,5)
1400,1 (1,1) 1400,2 (1,3) 1400,1 (1,3) 1399,7 (1,4) 1400,2 (1,9)
1416,1 (0,6) 1416,2 (0,7) 1416,1 (0,9) 1416,2 (0,9) 1416,0 (0,8)
1416,5 (0,3) 1416,6 (0,5) 1416,5 (0,1) 1416,9 (1,0) 1416,7 (0,8)
1416,8 (0,9) 1417,3 (2,3) 1416,8 (0,9) 1418,3 (3,1) 1417,8 (2,9)
1456,2 (0,4) 1456,3 (0,3) 1456,1 (0,9) 1456,3 (1,1) 1456,0 (0,5)
(a) (b)
(c) (d)
Tabela 4.12: Teste estatstico t-Student para os valores de pico da espcie M. acridum
submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura. Os valores de pH foram
agrupados dois a dois em ordem crescente para verificar as alteraes em funo do
aumento do pH. Poucas diferenas so apontadas pelas lacunas em cinza.
Tabela 4.13: Teste estatstico t-Student para a razo da rea de cada banda de absoro
da linhagem M. acridum submetidos a diferentes valores de pH do meio de cultura. Os
valores de pH foram agrupados dois a dois em ordem crescente para verificar as alteraes
em funo do aumento do pH. As diferenas so apontadas pelas lacunas em cinza.
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.15: Anlise das componentes principais aplicada a espcie M. acridum (ARDEF
10074) com crescimento em meios de cultura com diferentes valores de pH. Observa-se
a sobreposio dos pontos nos quatro intervalos, no sendo possvel a identificao dos
grupos.
4.3 Classificao
Aps os estudos de alguns fatores ambientais que podem alterar o crescimento
dos fungos e sabendo que essas alteraes podem ser detectadas pela espectroscopia
4.3 - Classificao 108
(a) (b)
(c) (d)
931,2 (2,8)
941,3 (5,2) 938,6 (11,8) 2, 05.106 0,12 (0,10) 0,08 (0,05) 5, 49.106
954,6 (3,5) 959,9 (4,4) 1, 09.108 0,23 (0,16) 0,16 (0,04) 0,034
972,1 (1,9) 975,1 (1,5) 7, 91.1010 0,08 (0,07) 0,23 (0,02) 2, 24.105
992,1 (1,2) 990,3 (0,7) 0,58 0,47 (0,24) 0,35 (0,10) 0,015
1043,6 (1,3) 1043,8 (1,0) 0,56 0,61 (0,19) 1,43 (0,25) 2, 06.1020
110
1060,9 (1,3) 1061,2 (1,5) 5, 28.1014 0,38 (0,14) 0,04 (0,03) 8, 02.1019
1078,5 (0,6) 1077,1 (0,5) 1, 48.106 0,81 (0,28) 0,93 (0,14) 0,03
1105,7 (1,7) 1103,8 (0,9) 1, 26.104 0,18 (0,07) 0,22 (0,53) 0,024
1123,8 (2,2) 1121,7 (1,6) 0,93 0,41 (0,15) 0,56 (0,10) 2, 59.105
1153,8 (0,6) 1153,8 (0,3) 0,001 0,13 (0,05) 0,14 (0,02) 0,435
1202,1 (0,6) 1201,7 (0,3) 0,065 0,08 (0,03) 0,08 (0,01) 0,74
1228,5 (0,8) 1227,9 (1,1) 0,236 0,56 (0,15) 0,69 (0,13) 4, 72.104
1247,8 (0,8) 1248,7 (3,8) 0,001 0,09 (0,02) 0,03 (0,03) 9, 83.1014
1313,2 (1,1) 1312,4 (0,7) 0,60 0,40 (0,06) 0,28 (0,10) 3, 12.107
1346,4 (1,5) 1346,2 (1,4) 1, 10.107 0,19 (0,08) 0,40 (0,13) 1, 41.109
1399,9 (1,5) 1401,5 (0,3) 0,215 0,10 (0,03) 0,31 (0,12) 9, 74.1014
1414,7 (1,4) 1414,3 (0,8) 2, 07.1011 0,31 (0,01) 0,15 (0,07) 2, 53.109
1441,8 (1,5) 1444,2 (0,7) 2, 06.1011 0,39 (0,12) 0,33 (0,15) 0,082
1470,9 (26,5) 1464,3 (1,4) 0,180 0,047 (0,02) 0,15 (0,05) 2, 75.1015
113
4.3 - Classificao 114
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.17: Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. flavus (ATCC
1410) com condios brancos e verdes. Os intervalos I, II e III destacam-se pela disperso
dos pontos amostrais permitindo a diferenciao dos grupos. O intervalo IV apresenta os
pontos sobrepostos onde no possvel diferenciar os condios brancos e verdes.
intervalos.
O primeiro intervalo capaz de diferenciar as amostras apresentando apenas a
sobreposio de alguns pontos. O intervalo II apresenta uma distribuio dos grupos
em torno do eixo de PC1, com os A. flavus verdes do lado negativo enquanto os A.
flavus brancos esto do lado positivo. O intervalo III apresenta o perfil do espectro
e segunda derivada muito semelhantes, entranto o PCA foi capaz de distinguir os
grupos com sucesso.
O resultado desta anlise (Tabela 4.16) confirma a grande quantidade de
dados agregados nas duas primeiras componentes, com menor porcentagem do
intervalo II, 69,9%. As componentes do intervalo IV apresentam as maiores
varincias acumuladas, 98,4%, porm no foram capazes de distinguir os grupos.
Tabela 4.16: Resultado da anlise das componentes principais da linhagem A. flavus
com condios brancos e verdes. Observam-se os autovalores, a varincia explicada e a
varincia acumulada sempre superior a 69%.
4.3.2 Aspergillus
Para analisar espcies diferentes dentro de um mesmo gnero selecionamos
quatro linhagens distintas, duas pertencentes ao gnero Aspergillus e duas
4.3 - Classificao 116
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.18: Espectros de absoro no infravermelho das espcies A. flavus (ATCC 1410)
com condios verdes e brancos e A. nidulas (ATCC 10074). Os espectros apresentam-se
subdivididos nos intervalos I em (a) 910-1178 cm1 , II em (b) 1178-1490 cm1 , III em (c)
1490-1790 cm1 e IV em (d) 2810-2990 cm1 com suas respectivas derivadas de segunda
ordem.
931
941 938
1009
1014
1019
I 1026
1043 1043
1046
1060 1061
1065
1146
1153 1153
119
1241
1247 1248
1261 1262
1272
1280 1291
1313 1312
1325
120
1327
II 1335 1339
1346 1346
1356
1370 1368
1377 1377
1383
1414 1414
1425 1422
121
1464 1464
1470
122
4.3 - Classificao 123
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.19: Anlise das componentes principais aplicada a espcie A. flavus (ATCC
1410) com condios brancos e verdes e a espcie A. nidulans (ATCC 10074). Os intervalos
I, II e III destacam-se pela disperso dos pontos amostrais permitindo a diferenciao dos
grupos. O intervalo IV apresenta os pontos sobrepostos onde no possvel diferenciar os
condios brancos e verdes.
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.20: Dendrogramas dos quatro intervalos dos espectros de absoro das espcies
A. flavus (ATCC 1410) com condios brancos e verdes e A. nidulans (ATCC 10074)
crescidos sob as mesmas condies.
amostras primeiro o III. Este intervalo tambm se destacou atravs anlise por
componentes principais. Assim, entre as linhagens representantes das espcies A.
flavus e A. nidulans a espectroscopia vibracional foi capaz de identificar cada uma
quando empregada com as metodologias de anlise multivariada.
4.3.3 Metarhizium
Trs espcies do gneros Metarhizium foram analisadas atravs das linhagens:
M. acridum (ARSEF324), M. anisopliae(ARSEF 5749) e M. brunmeum (ARSEF
5616). A Figura 4.21 apresenta os espectros com as respectivas derivadas de segunda
ordem de todas as seis linhagens de Metarhizium.
Como era esperado aps observar o comportamento deste gnero sob os
4.3 - Classificao 127
(a) (b)
(c) (d)
Tabela 4.20: Valores mdios dos picos de absoro das bandas com os respectivos desvios
padro das linhagens M. acridum (ARSEF 324) e M. brummeum (ARSEF 5616) com o
resultado do teste estatstico para os valores de pico e razes entre reas. Destacam-se em
cinza as bandas que apresentam diferenas significativas. Nas clulas em branco no foi
possvel realizar o teste devido a falta da banda correspondente no outro grupo amostral.
990,8 (0,7)
993,3 (0,8)
1022,4 (0,4)
I 1031,1 (0,7)
1041,0 (0,6)
1045,7 (0,7)
1126,7 (8,8)
1139,8 (2,9)
1228,2 (0,5)
1235,1 (0,9)
1252,7 (3,7)
1262,4 (3,7)
II 1358,4 (0,9)
1361,9 (0,7)
1438,1 (0,9)
1460,6 (0,7)
1467,3 (3,6)
1479,3 (3,0)
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.22: Anlise das componentes principais do gnero Metarhizium nas quatro
regies de interesse. Destaque para o inetervalo II onde as variaes da espcie M.
brunmeum (pontos pretos e azuis) apresentam-se deslocadas para o eixo negativo de PC
1, a espcie M. anisopliae (pontos amarelos) apresentam-se dispersa entre a origem do
mesmo eixo e as variaes da espcie M. acridum apresentam-se deslocadas para o eixo
positivo de PC 1.
Tabela 4.21: Resultado da anlise das componentes principais das amostras do gnero
Metarhizium crescidas sob as mesmas condies. Observam-se os autovalores, a varincia
explicada e a varincia acumulada sempre superior a 72%.
(a) (b)
(c) (d)
(a) (b)
(c) (d)
933,2 (2,1)
1022,4 (0,4)
1026,7 (0,9)
I 1041,0 (0,6)
1046,4 (0,9)
1124,4 (0,5)
1155,5 (0,5)
1146,5 (0,3)
1200,3 (1,3)
1203,73 (0,2)
1241,4 (1,3)
1279,6 (3,8)
1291,9 (0,3)
1310,5 (0,4)
1314,3 (0,8)
1325,2 (0,9)
1327,43 (1,7)
1358,4 (0,9)
1368,5 (0,2)
1416,7 (0,3)
1422,1 (0,3)
1439,9 (0,5)
1452,4 (0,5)
1454,7 (0,3)
1479,3 (3,0)
A diferena entre os espectros dessas duas amostras pode ser verificado devido
quantidade de clulas em brancos, ao deslocamento dos picos e a razo entre as
reas.
Dos resultados apresentados pelo PCA (Figura 4.25) com todas as amostras
apenas o intervalo II fornece um resultado coerente com o esperado. Nele observamos
a distribuio dos pontos em funo do gnero ao redor do eixo de PC1, onde o
Metarhizium apresenta-se deslocado para os valores negativos do eixo enquanto o
Aspergillus apresenta-se deslocado para o eixo positivo.
No gnero Aspergillus podemos observar que os pontos vermelho e preto esto
mais prximo entre s do que dos pontos verdes. Este fato o coerente j que os
primeiro referem-se espcie A. flavus com condios verdes e brancos, enquanto o
ltimo refere-se a A. nidulans.
No intervalo I podemos observar a distribuio dos pontos referentes ao
Aspergillus deslocados para o eixo negativo de PC 1. Os pontos referentes do
Metarhizium apresentam-se deslocados para o eixo positivo de PC1, com exceo
do M. acridum.
Os outros intervalos apresentaram disperses com maiores sobreposies
entre os pontos, o que dificulta sua distino.
O resultado numrico fornecido pelo PCA est discriminado na Tabela 4.24
com as varincias acumuladas novamente altas para o primeiro e o ltimo intervalo
(acima de 88,0%) e inferiores para o segundo e terceiro intervalo (mximo de 80,6%).
A anlise por agrupamento foi coerente com o resultado da anlise de
componentes principais. Na Figura 4.26 observa-se que dos quatro intervalos
4.3 - Classificao 139
(a) (b)
(c) (d)
Tabela 4.25: Resultado da anlise hierrquica dos espectros de absoro dos fungos
pertencentes ao gnero Metarhizium crescidos sob as mesmas condies.
8 8,41
7 13,40
6 13,44
5 16,68
I
Continua na prxima pgina. . .
4.3 - Classificao 141
4 23,82
3 36,25
2 50,20
1 86,00
8 9,05
7 9,31
6 14,85
5 25,01
II
4 26,03
3 35,67
2 45,78
1 103,39
8 10,33
7 10,87
6 17,66
5 31,22
III
4 36,90
3 45,67
2 46,85
1 69,01
8 6,71
7 10,42
6 11,13
5 12,45
IV
4 12,48
3 21,26
2 43,71
1 86,32
(a) (b)
(c) (d)
Figura 4.26: Dendrogramas da anlise hierarquica das quatro regies do espectro com
nove amostras pertencentes a dois gneros diferentes: Aspergillu e Metarhizium.
picos, variaes nas razes entre as reas e separao entre os grupos no diagrama
da anlise de componentes principais. Entretanto, a afirmao de que este foi
considerado o melhor grupo provm da anlise por agrupamento, onde este foi
o nico intervalo com agrupamento correto de acordo com a taxonomia vigente.
Assim, as informaes necessrias para se chegar a uma concluso, no baseiam-se
em apenas uma metodologia, mas na correlao das informaes fornecidas.
Captulo 5
Concluses e Perspectivas
Futuras
145
5 - Concluses e Perspectivas Futuras 146
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Apndice A
Correes
ste captulo contm algumas correes feitas aps a defesa. Outras correes
E menores j foram introduzidas ao logo do trabalho, porm optou-se por
destacar aqui a anlise de componentes principais (PCA).
O PCA foi aplicado atravs do programa Minitab 16 para a anlise da
influncia da luz, do pH e diferenciao de espcies e generos fngicos. Entretanto,
este programa analisa apenas a primeira e a segunda componente principal
automaticamente. Para analise da terceira componente principal, como foi sugerido
pela banca, optou-se por aplicar o programa Statistica 10 anlise da influncia da
luz e observar os resultados obtidos.
Assim, a primeira espcie apresentada a Aspergillus nidulans (ATCC
10074). Para esta linhagem a distribuio PC 1 x PC 2 diferencia os pontos
referentes amostra crescida na presena e na ausencia de luz nos intervalos I, II e III.
Entratento, no intervalo IV no possvel diferenciar as condies de crescimento. A
mesma anlise foi refeita e na Figura A.1 esto apresentados os diagramas de PC 1
x PC 3. Os pontos em preto com a letra P referem-se ao grupo crescido na presena
de luz, enquanto os em vermelho com a letra A referem-se ao grupos crescido na
ausncia de luz.
Os intervalos I e II novamente puderam ter os grupos diferenciados. Os
intervalos III e IV tiverem resultados opostos aos anteriores, sendo que agora o
intervalo III apresentou os pontos sobrepostos enquanto no IV pela primeira fez foi
possvel diferenciar os grupos em funo da presena ou ausncia de luz durante o
crescimento.
155
A - Correes 156
(a) (b)
(c) (d)
(a) (b)
(c) (d)
falor inferior apresenta um bom resultado em ambos os diagramas. Isso pode ser
consequncia dos grupos CH2 e CH3 , presentes no intervalo IV, estarem prximos
a banda de gua, sofrendo grande influncia. Assim, sua informao "til"ou que
sofre menos influncia est em uma pequena parcela do total.
O mesmo procedimento foi repetido para a linhagem Metarhizium acridum
(ARSEF 324). Anteriormente, a anlise atravs de PC 1 x PC 2, no foi capaz de
diferenciar as amostras em nenhum dos intervalos estudados. E este resultado se
repetiu na Figura A.3 onde so apresentados os diagramas de PC 1 x PC 3 para
nos quatro intervalos e na Figura A.4 onde so apresentados os diagramas de PC
2 x PC 3 no mesmo intervalos. Em nenhuma das anlises foi possvel identificar os
grupos amostrais.
A Tabela A.2 apresenta a varincia de cada componente assim como a
varincia acumulada das trs primeiras componentes. A variao desses valores
A - Correes 159
(a) (b)
(c) (d)
menor quando comparada a linhagem anteior, o que era esperado devido aos
espectros serem extremamente prximos.
Embora a linhagem M. acridum no tenha tido acrescimo de informao com
a anlise da terceira componente, a linhagem A. nidulans teve. Os intervalos I, II e
III foram capazes de diferenciar as amostras apenas atravs das duas primeiras
componentes principais. Entretanto, o intervalo IV s foi capaz de diferenciar
as amostras crescidas no claro e no escuro com a anlise da terceira componente
principal. Sendo assim, esta sugesto feita pela banca acrescenta mais informao
aos resultados j apresentados neste trabalho.
A - Correes 160
(a) (b)
(c) (d)