GENTICA MOLECULAR E INGENIERA

GENTICA: Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones

Blga: Wendy Morales Oviedo 2017

TEMA 1. CIDOS NUCLEICOS: Preparacin,
Purificacin y anlisis de cidos nucleicos
 1.1. INTRODUCCIN
Ingeniera gentica Manipulacin DNA para obtencin de DNA recombinante
Evolucin de la gentica:
S. XIX Mendel Leyes de la herencia biolgica

1903 Sutton
1910 Morgan Genes residen en cromosomas
1944 Avery
MacLeod
MacCarty El material gentico es el
1952 Hershey DNA
Chase
1952/66 Delbrck Estructura del DNA
Chargaff Cdigo gentico
Crick Proceso de transcripcin
Monod Proceso de translacin
Inicio de tcnicas de DNA recombinante o
1971/73
Ingeniera gentica
1985 K. Mullis Cadena de reaccin de la polimerasa (PCR)

1990 Secuenciacin masiva de genomas

Conceptos:

- ds/ssDNA
- ds/ssRNA
- cccDNA
- Genoteca
- Librera de cDNA
- Clones
- Vector
- Nick
- Gap

Genoteca
Aplicaciones de la ingeniera gentica:

Biofarmacetico:
- Antibiticos
- Protenas heterlogas (insulina,)
- Protenas ms operativas o con nuevas funciones
- Generacin de vacunas (hepatitis,)

Agrcola y ganadero:
- Modificacin gentica de plantas
- Animales transgnicos

Clnico:
- Diagnsticos (HIV, Hepatitis, etc)
- Terapia gnica

Forense:
- Resolucin de crmenes
- Pruebas de paternidad
- Identificacin de sexo
 1.2. PREPARACIN Y PURIFICACIN DE
CIDOS NUCLEICOS
Aislamiento y purificacin del DNA procariota
Etapas:
1. Cultivo bacteriano en crecimiento mximo
2. Centrifugacin y lisis celular extracto celular
3. Purificacin del DNA
4. Concentracin del DNA
Rotura de clulas:

Mtodos fsicos Poco usados

Mtodos qumicos

Mecanismos qumicos usualmente utilizados:

- Lisozima
- EDTA
- SDS

Preparacin del DNA total: lisis celular y centrifugacin

Purificacin del DNA

Extracto celular Purificacin del DNA

RNA RNAsas
Protenas Mtodos:

- Proteinasa K Proteasa de amplio espectro, poco especfica

- Fenolizacin Desnaturaliza protenas, poco usado
- Cromatografas Sistemas ms utilizados

Proteinasa K
Fenolizacin

Cromatografa
Concentracin del DNA

Alta concentracin de DNA eliminacin del agua biodisponible trabajo ptimo

Mtodo Precipitacin en etanol Mantener DNA resuspendido en (Tris + EDTA). Conservar 4C o 20C

Recuperacin del DNA. a)Rotacin con varilla de vidrio, b) Centrifugacin

Aislamiento y purificacin del DNA eucariota

DNA de plantas o animales clonacin de genes de plantas o animales

Mismos pasos bsicos de purificacin de DNA

Modificaciones en purificacin del DNA:

- Lisis celular Lisozima no tiene efectos en clulas vegetales
Detergentes clulas animales
Mayor importancia a mtodos fsicos
- Contenido bioqumico celular es diferente a bacterias (ejemplo: carbohidratos) uso de otros
mtodos

Mtodos de purificacin de DNA eucariota:

- CTAB detergente
Mtodo CTAB para purificacin de DNA de plantas
Aislamiento de DNA plasmdico

Diferencia importante respecto a purificacin de DNA total necesidad de separacin de DNA

plasmdico de cromosomas de DNA bacteriano

Lisis celular:

Separacin en base al tamao EDTA y lisozima formacin de esferoplasto Tritn X-100

Separacin en base a la conformacin Mtodos:

- Mtodo de lisis alcalina Mtodo de Birmboin

- Gradiente de Cloruro de Cesio
 Separacin en base a la conformacin

Separacin en base al tamao

 Purificacin del
plsmido por mtodo
de desnaturalizacin
alcalina

Purificacin del
plsmido por
Bromuro de etidio
ultracentrifugacin en
gradiente de densidad
de Cloruro de Cesio
Aislamiento de DNA vrico

Ciclo ltico Lisis de bacterias y fagos DNAsa y RNAsa Centrifugacin Unin de unos fagos
con otros (PEG), centrifugacin Obtencin de fagos Fenolizacin Concentracin del DNA

Preparacin de una suspensin de fagos de un

cultivo de bacteria infectado

Recoleccin de las partculas de fagos por

precipitacin con PEG
Ejemplo: Suspensin de fago M13

1. Cultivo de clulas infectadas

2. Centrifugacin para remover clulas
3. Aadir PEG a la suspensin de fagos, centrifugar
4. Resuspender fagos en buffer
5. Aadir fenol para quitar las protenas de la cpside
6. Remover fase acuosa aadiendo fenol, centrifugar
7. Resuspender DNA del fago M13 en un pequeo volumen
 1.3. ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS
- Electroforesis en gel de agarosa Visualizacin de DNA migracin de DNA por diferencia de carga
- Electroforesis en campo pulsante DNA mayor a 20 kb (cromosomas eucariotas) migracin de DNA

Electroforesis en campo pulsante

Electroforesis en gel de agarosa

Electroforesis en gel de agarosa Electroforesis en campo pulsante
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