Anlisis Qumico Instrumental

CROMATOGRAFA

Logro de sesin
El alumno determina parmetros caractersticos de una
columna cromatogrfica

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin, en el cual los

componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases;
una de estas fases constituyen una capa estacionaria de gran rea
superficial, la otra es un fluido que eluye a travs o a lo largo de la
fase estacionaria, Underwood(1989).

Clasificacin de los mtodos cromatograficos en columna

PLATOS TERICOS

Donde
N es el nmero de platos de una columna con respecto a
determinado compuesto
tR es el tiempo de retencin
wb es el ancho del mximo medido en la base, en las mismas
unidades que tR.

El nmero efectivo de platos corrige los platos tericos por volumen

muerto (o vaco), por lo que es una medida del nmero real, til, de
platos en una columna:

tR =tR -tM

DESCRIPCIN CUANTITATIVA DE LA EFICIENCIA DE LA

COLUMNA
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Dos trminos afines se utilizan ampliamente como medidas

cuantitativas de la eficiencia de una columna cromatografica:

1) la altura de plato H
2) el nmero de platos o cantidad terica de platos, N. Los dos estn
relacionados por la ecuacin

Donde

L es la longitud (por lo regular en centmetros) del relleno de la

columna.

La eficiencia de la columna cromatografica aumenta cuanto mayor es

el nmero de platos N y cuanto menor es la altura H del plato.

Ecuacin de Van deemeter

Segn Underwood(1989) la ecuacin de Van Deemeter, tiene la
siguiente forma:

AEPT: Altura equivalente de plato terico

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Esta ecuacin puede ser simplificada de la siguiente forma:

Donde:
A= difusin por remolino
B/u=difusin longitudinal
Cu=resistencia a la transferencia de masa
Segn Underwood(1989) recomienda los siguientes valores tpicos
para columnas empacadas. 1

La eficiencia de la cromatografa de gases se puede calcular por la

ecuacin de Van Deemeter, donde H(altura del plato) Gary,H(2007)
tiene la siguiente forma:

1 Qumica analtica Pg. 602

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Relaciones y cantidades derivadas importantes

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PROBLEMAS CROMATOGRAFA
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1. Mediante la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) se

consigue separar seis hidrocarburos aromticos policclicos,
empleando una columna RP-18 de 25 cm de longitud. El caudal
de la fase mvil acetonitrilo/agua de 0.8 mL/min, obtenindose
los siguientes resultados:
Analito tR w(min)
No retenido 3.4 -
Naftaleno 5.2 .41
Fluoreno 7.4 0.62
Fenantreno 8.3 0.81
Benzoantracen 11.5 1.53
o
Criseno 12.1 1.95
A partir de estos datos, calcular:
a) El factor de retencin o de capacidad para las cinco
primeras especies eluidas.

b) El nmero de platos tericos promedio.

c) La resolucin para el primer par y para el ltimo par de

compuestos.

2. En una separacin HPLC dos componentes tienen tiempos de

retencin que difieren 15 segundos. El primer pico eluye en 90
minutos y los anchos de picos son casi iguales. El tiempo
muerto es de 65 segundos. Determine la cantidad mnima de
platos tericos que se necesitan para alcanzar los siguientes
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valores de resolucin: 0.5 , 0.75, 0.90, 1.0, 1.10, 1.25, 1.50,

1.75, 2.0, 2.5. Cmo afectara a la resolucin que el segundo
pico tuviera el doble de ancho que el primero?

3. Calcular el nmero de platos en la columna que genera el

mximo cromatgrafo de la figura.
Calcular el factor de retencin para el mximo cromatografico
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4. Se separan etanol y metanol en una columna capilar de

cromatografa de gases y sus tiempos de retencin respectivos
son 370 y 385 s. Los anchos de base respectivos (wb) son 16.0
y 17.0 s. El mximo no retenido se presenta a los 10.0 s.
Calcular el factor de separacin y la resolucin.
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5. Las sustancias A y B tienen tiempos de retencin de 16.40 y de

17.63 minutos, respectivamente, en una columna de 30.0 cm.
Una especie que no es retenida pasa por la columna en 1.30
minutos. Las anchuras de pico (en la base) para A y B son 1.11
y 1.21 minutos, respectivamente.
Calcule
a. La resolucin de la columna
b. El nmero de platos promedio de la columna
c. La altura de plato
d. La longitud de la columna necesaria para conseguir
una resolucin de 1.5
e. El tiempo necesario para que la sustancia B eluya
en la columna que da un valor de Rs de 1.5
f. La altura de plato necesaria para obtener una
resolucin de 1.5 mediante la columna original de
30.0 cm y en el tiempo que se da en un principio.
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6. Los siguientes datos corresponden a una columna para

cromatografa de lquidos:

Un cromatograma de una mezcla de las especies A, B, C y D

proporciona los siguientes datos:

Calcule
a) El nmero de platos para cada pico.
b) La altura de plato de la columna.

7. Un mximo de una cromatografa de gases tuvo un tiempo de

retencin de 65 s. El ancho de la base, obtenido con las
intersecciones de la lnea base y las extrapolaciones de los
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lados del mximo fue 5.5 s. Si la columna era de 3 pies de

longitud, De cunto fue el valor de H en cm/plato?

8. Los siguientes datos se obtuvieron mediante cromatgrafo gas-

liquido con una columna rellena de 40 cm:

Calcule
a) El nmero de platos promedio a partir de los datos.
b) La altura de plato promedio para la columna.

Si fuera necesaria una resolucin de 1.5 para separar

metilciclohexano y metilciclohexeno.

c) Cuantos platos se necesitaran?

d) Que longitud debera tener la columna si se utiliza el mismo
relleno?
e) Cul sera el tiempo de retencin del metilciclohexeno en la
columna del inciso b)?

Si VS y VM para la columna inicial son 19.6 y 62.6 mL respectivamente

y el pico de aire no retenido aparece despus de 1.9 min, calcule:
f) El factor de retencin para cada compuesto.
g) La constante de distribucin para cada compuesto.
h) El factor de selectividad para el metilciclohexano y el
metilciclohexeno.

9. Se desea resolver dos mximos de una cromatografa de gases

con tiempos de retencin de 85 y 100 s, respectivamente,
usando una columna con H _ 1.5 cm/plato bajo las condiciones
de operacin. Qu longitudes de columna se requieren? Asumir
que los dos mximos tienen el mismo ancho de base.

10. Tres compuestos, A, B y C, tienen factores de retencin kA

= 1.40, kB = 1.85 y kC =2.65, respectivamente, en una
columna que solo tiene 500 platos. Se pueden separar con una
resolucin mnima de 1.05?

11. Se obtuvieron los siguientes datos para cuatro

compuestos separados en una columna Adsorbosphere CN-AQ,
5m, 150 mm x 4.6 mm. (a) Calcular el nmero de platos
tericos para cada uno de los compuestos y el nmero
promedio de platos tericos de la columna, (b) calcular la altura
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promedio y (c) Explicar por qu cada compuesto tiene un

nmero diferente de platos tericos.
Compuesto tR (min) W (min)
tM 2.51
A 8.04 0.15
B 8.26 0.15
C 8.43 0.16
D 9.01 0.14

12.

13. A chromatography column with L = 10.3 cm and ID =

4.61 mm is packed with a stationary phase that occupies 61.0%
of the volume. The linear flow rate = 17.4 cm min-1.
How long does it take for solvent to pass through the column?
Find the retention time for a solute with a capacity factor of
10.0?
tM = L / ux = 10.3 cm / [17.4 cm min-1] = 0.592 min.
k' = t'R / tM = (tR-tM) / tM
=> tR = k' tM + tM = tM (1 + k') = 0.592 min x 11 = 6.51 min.

14. A chromatogram with ideal Gaussian bands has tR = 9.0

min and w0.5 = 2.0 min.
How many theoretical plates are present?
N = 5.54 tR2 / w0.52 = 5.54 * 92 min2 / 22 min2 = 112.

Find the plate height if the column is 10 cm long?

H = L / N = 10 cm / 112 = 0.89 mm.

15. Two compounds with partition coefficients of 0.15 and

0.18 are to be separated on a column with Vm / Vs = 3.0.
Calculate the number of theoretical plates needed to produce a
resolution of 1.5.
K 2 K 0.18 / 0.15 1.2
N 1 k '2 1
R
4 1 k 'av k '2 K 2
Vs
0.18 / 3 0.060
Vm
2
1 k 'av 2 V5s
NN=[6
4
* R
1.2/0.2
*
1.055/0.06]
= k
(400689 '
=) K
4
x10 . 0.15 / 3 0.050
1 1 V
1 k '2
m
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16. An open tubular column (OTC) with L = 30.1 m and ID =

0.530 mm is coated on the inside wall with a layer of stationary
phase that is 3.1 m thick. Unretained solute passes through in
2.16 min, whereas a particular solute has a retention time of
17.32 min.
Find the capacity factor for the solute and the fraction of
time spent in the stationary phase.
Find the partition coefficient Cs/Cm for this solute.

k' = t'R / tM = (tR-tM) / tM = (17.32 min 2.16 min) / 2.16 min =

7.02.
k' = ts / tm => ts = k' * tm = 7.02 x 2.16 min = 15.16 min.
fraction in stat. phase = 15.16/17.32 = 0.875

K = C s / Cm
k' = K Vs/Vm
=> K = k' * Vm / Vst = k' * (L*Amob)/(L*Ast) = k' Amob / Ast
Ast = Atotal - Amob = D2/4 - Dmob2/4
= /4 [(530 x10-6 m)2 (523.8 x 10-6 m)2]
= 5.13 x10-9 m2
K = k' * Amob / Ast = 7.02 * 2.15 x10-7 m2/ 5.13 x10-9 m2 = 294.

17. A chromatographic procedure separates 4.0 mg of

unknown mixture on a column with a length of 40 cm and a
diameter of 0.85 cm.
What size column would you use to separate 100 mg of the
same mixture?

same length (40 cm),

diameter: mB / mA = rB2 / rA2 = dB2 / dA2
dB2 = dA2 * mB/mA = 0.852 cm2 * 100 mg/4 mg = 18.06 cm, dB
= 4.25 cm

18. Heptane and toluene were separated with retention times

of 15.4 and 16.5 min respectively on a 1.0 meter packed
column. An unretained species passed through the column in
1.8 min. The peak widths measured at the base were 1.15 for
heptane and 1.20 min for toluene.
a) Calculate the resolution between the peaks:

b) Calculate the average number of plates for the column.

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c) Calculate the average plate height.

d) Calculate what column length will be necessary to achieve a

resolution of 1.5 on this column.
Since k and do not change with column length, Equation 4.13

indicates that the resolution is proportional to . So,

and . N2 = 7504.
Since L=NH, the length required to generate this number of plates is :
L = 7504 x 0.34 = 2551 mm or 2.5 meters
e) Calculate the capacity factor for toluene:

19. Una de las aplicaciones frecuentes de la cromatografa de

exclusin molecular es la determinacin de la masa molecular
de protenas globulares. Para ello, es preciso disponer de
protenas patrn de masa conocida.

Tras un proceso de purificacin que parti de un extracto

celular, el cromatograma de exclusin obtenido con la muestra
resultante indic la presencia de 2 protenas diferentes. Calcule
cul es su masa molecular, a partir de los datos de volumen de
elucin obtenidos con la mezcla de protenas patrn
cromatografiada bajo las mismas condiciones.

Cromatograma de la muestra: Cromatograma y datos de la

mezcla de protenas patrn:
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masa
protena Ve
molecular
aldolasa 39.2 kDa 24.0
mL
seroalbmina 66.2 kDa 21.3
mL
fosforilasa b 97.0 kDa 18.0
mL
- 116.0 kDa 16.5
galactosidasa mL
miosina 212.0 kDa 14.0
mL

Leemos en el cromatograma de la muestra los Ve de sus dos

componentes: 15.5 y 20 mL.

Construimos una tabla con los datos de los patrones y con ellos una
curva de calibrado (dada la gran dispersin de valores de masa
molecular, es habitual representar stos en una escala logartmica,
para conseguir agruparlos y adems normalmente as se ajustan
mejor a una recta).

Puesto que la distribucin de puntos patrn es bastante lineal,

ajustamos a una recta (lo ideal sera un ajuste por regresin no lineal
a una curva logartmica). La ecuacin resultante es:

log(Mr/1000) = 3.25 0.069 Ve

Mr es masa molecular relativa, es decir, sin unidades; si ponemos

Da o kDa ya hay unidades y es masa molecular, mejor que
peso molecular. El ajuste se hizo con los valores numricos de
kDa, por lo cual la variable Y es Mr/1000

Ntese la escala logartmica en el eje de ordenadas.

Interpolando el volumen al que han eluido las dos protenas

componentes de la muestra (picos a 15.5 y 20 mL) obtenemos: 151 y
75 kDa.
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STUDY QUESTIONS
1. What are the common factors which exist in all types of
chromatography?
2. What is the significance of to in gas chromatography?
3. A gas chromatographic peak from a 25 m long column has an
adjusted retention time of 11.2 minutes, and a width at half height
of 20 seconds. How many theoretical plates are present in the
column? What is the value of H?
4. In gas chromatography predict the effect on the efficiency of a
separation when the following changes are made:
a. Particle size of the packing is increased
b. Gas flow is increased
c. Thickness of liquid phase in a capillary column is increased
6. In an HPLC analysis, a reverse phase column is being used with
a solvent gradient, starting with solvent A and increasing
concentration of solvent B over time. The program starts with 50%
A and 50% B and runs linearly, reaching 100%B at 20 minutes.
Explain which of the two solvents is more polar.
7. What are some of the properties of a good chromatographic
detector.
8. What is the advantage in using a halogen specific detector such
as the ECD in environmental analyses?
9. Define the following terms:
Gas-Liquid chromatography.
Bonded phase
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Normal phase HPLC

Gradient elution
10. What is the function of the suppresser column in ion
chromatography? Under what conditions is it not needed?
11. Predict the elution order of the following in reverse phase and in
normal phase chromatography: (a) n-heptane, heptanol, and
toluene.
(b) nitrobenzene, benzene and phenol
12. What parameters can be used to improve resolution in GC? in
HPLC?
13. What are some advantages of SFC over GC? Over HPLC?
14. In a normal phase LC separation, nitrobenzene had a retention
time of 28.0 min, while an unretained compound eluted in 0.9 min.
The mobile phase was a 50:50 mixture of chloroform and hexane.
What mixture of chloroform and hexane will reduce the k to 9.0.
The following data were obtained for a separation using a 0.5 mm
id, 10 meter open tubular column:
Retention time Peak base width
(min) (min)
Methane 2.0
Cyclohexane 8.0 0.65
Methylcyclohexan 8.17 0.72
e
Toluene 10.2 0.95
Draw the chromatogram and label the peaks
b) Calculate the number of peaks for each compound
c) Calculate the capacity factor for toluene
d) Calculate the length of the column needed to separate
cyclohexane and methylcyclohexane at a resolution of 1.6.
15) In a reverse phase separation of chlorinated phenols,
trichlorophenol has a retention time of 15.0 min, when 30:70
acetonitrile-water mixture is used as the mobile phase. What mixture
of these two solvents will reduce the retention time to 12.0.
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Referencias bibliogrficas
Skoog. Principios de Anlisis Instrumental. Cengage Learning.
Sexta edicin. 2007.
CHRISTIAN, GARY. Qumica Analtica. Mc Graw Hill.
Washington. 2009.
Underwood, Qumica Analtica Cuantitativa. Prentivce Hall.
Quinta edicin. 1989.