2 Sequenciamento 3500 2013

Introduo ao Sequenciamento
Camila C. Ornelas
Cientista de Aplicaes Eletroforese Capilar
suporte.br@lifetech.com
1 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

Estrutura molecular do DNA
Watson e Crick (1953)

O Desenvolvimento da Tcnica de Sequenciamento
Maxam e Guilbert - 1977 Sanger - 1977

Mtodo Enzimtico ou de Terminao de Cadeia (Sanger)
Dideoxinucleotdeos trifosfato marcados radioativamente com 32P ou 35S.
P P P
dNTP T T
ddNTP
P H P H
G G
deoxinucleotdeo dideoxinucleotdeo
dideoxinucleotdeo
OH H H H
P P P
? P P P
T T T
OH OH

Sequenciamento de Sanger
Eletroforese em gel de
poliacrilamida.
Exposio em filme de raio

X (mtodo enzimtico).

Sequenciamento Automtico de DNA
Mltiplas cores em
um nico tubo
BigDye Ready
Reaction Premix
Amostra Primer
AmpliTaq
DNA Pol dNTP`s
ddNTPs marcados
Tampo
(dye terminators)

Sequenciamento de Sanger
Primer 3OH
ddT
dT dG dC
dC
dA
dT
dA
dA
Template dT dG dG
ddG
Cycle 1 dT dA
dC
dG ddA
Elongated Primer ddC
dC
CGA TG
Elongated Primer
Cycle 2
CGA TGGA T
Elongated Primer
C G A T G G A CC T G C
Etc. to 25 or more cycles...

Sequenciamento: Amplificao Linear
Mistura de reao Anelamento

dNTPs Extenso
ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP
Tampo
Polimerase
DNA amostra
25
Produtos
A
AC
ACG
1 Primer Denaturao ACGT
ACGTA

Sequenciamento: Direto e Reverso

Tecnologia da Eletroforese Capilar

Eletroforese?

Eletroforese
PCR
Antes

Eletroforese Capilar
Molculas de DNA migram para nodo;
Excitao pelo laser e deteco pela cmera CCD.
Laser
Capilar preenchido com
polmero (gel)
+ 5-20 kV
-
Tampo (nodo) Tampo (ctodo)

Injeo Eletrocintica
Ctodo
Aplicao de voltagem;
Molculas negativas entram no

capilar e migram para plo positivo;
Velocidade de migrao da molcula

interfere na quantidade injetada.
Capilar

Sequenciamento automatizado de DNA

Sequenciamento automatizado de DNA

Eletroforese Capilar: Life Technologies
1986 1995 1998 2000-2002 2002-2003 2004 Aug 2009

ABI introduces ABI introduces ABI provides ABI introduces ABI introduces ABI launches an ABI launches its
the first the first primary medium platform with improved latest and state of
automated capillary platform used throughput massive version of it the art Genetic
DNA sequencer in Human platform throughput and medium Analyzer
sequencer Genome cost advantage throughput
(310 Genetic Project (Avant and platform (3500 and 3500xl
(370A) Analyzer) 3100 Genetic (3730 and Genetic Analyzers )
(3700 DNA Analyzer ) 3730xl Genetic (3130 and
sequencer ) Analyzers) 3130xl Genetic
Analyzer )
Sequenciadores atualmente comercializados pela Life Technologies.

Caractersticas gerais do 3500 Genetic Analyzer
8 e 24 capilares;
Tubos, placas de 96 ou 384;
Laser estado slido: durabilidade e menor
aquecimento;
6 cores;
Maior faixa de deteco de fluorescncia;
Rastreamento de reagentes (RFID);
Reagentes prontos para uso;
Mdulos de corrida mais rpidos;
Versatilidade;
Performance check;
Qumica aberta.

Etapas de uma reao de sequenciamento

Extrao do DNA Passos para obter boas
sequncias de DNA
Amplificao por PCR
Verificao em gel
Purificao da PCR
Quantificao da PCR
Reao de sequenciamento
Purificao da reao
Leitura no equipamento

Extrao do DNA

Extrao de DNA
1. Qual o cido nucleico a ser purificado?
1. DNA
2. RNA (RNA total, mRNA, microRNA)
2. Qual o material de partida?
1. Clulas Animal 4. Amostras forenses

2. Tecido Vegetal 5. Bactria, levedura
3. Sangue 6. FFPE, LCM
3. Qual a aplicao?
4. Qual o formato de escolha?

5. Quantas amostras sero processadas por vez?

Pureza da Amostra
Espectro de absorbncia:
absorbncia mxima em 260
nm;
A260/280 e A260/230 = entre 1,8 e

2,0;
Razes <1,7 : presena de

protenas ou outros
contaminantes.

Mtodos para purificao de cidos nucleicos
Filtro com Fibra de

Mtodo Orgnico Beads Magnticas
Vidro (GFF)
- ISTNGu/Fenol - ISTNGu + lcool -Beads Magnticas
Protocolo - Extrao - Filtro G/F
- Precipitao: lcool
- Gold standard - Pureza - Protocolo simples
- Baixo custo - Fcil, rpido - High throughput
Vantagens - Altamente adaptado - Variedade amostras - Alta sensibilidade
- Amostras difceis - Mdio throughput -Alta consistncia
- Baixo throughput -Entupimento do Filtro -necessita de rack
Desvantagens - Produto txico -Processamento de magntica
-Potencial inibio amostras > 24 e <96
Tempo ~2 horas ~60 minutos ~30 minutos
Produto Trizol
TRIzol Reagent Plus Kit kit
PureLink MagMaxTM
Trizol Plus

Colunas com Beads
Extrao
membranas de Magnticas
orgnica
slica
DNAzol PureLink Genomic MagMAX DNA Multi-

DNA Mini Kit Sample Kit
DNAzol BD
PureLink 96 Genomic MagMAX Total Nucleic
Plant DNAzol Acid Isolation Kit
DNA Kits
Easy-DNATM kit Dynabeads DNA
PureLink Genomic
Plant DNA Purification DIRECT Kit
Kit Dynabeads DNA
PureLink Viral DIRECT Blood Kit
RNA/DNA Mini Kit PrepFiler Forensic
DNA Extraction Kit

MagMAX Magnetic Particle Processor
24 amostras
96 amostras
iPrep Purification
13 amostras

Suportes Magnticos para extrao manual - Dynal
DynaMag-2 DynaMag-Spin DynaMag-15 DynaMag-50

Tubos 1,5-2,0 mL Tubos 1,5 mL Tubos 15 mL Tubos 50 mL
DynaMag-96
side & bottom

Purificao do produto de PCR

Recomendado para retirada de primers e outras impurezas.
PureLink PCR Purification Kit (K3100-01 para 50 reaes)
Misture o produto de PCR com o tampo de ligao.
Aplique a amostra na coluna.
Lave a coluna com tampo de lavagem.
Recupere o produto purificado.

Purificao a partir das bandas presentes no gel

E-Gel
Porcentagem de agarose Tamanho do gel/nmero de poos
0,8% (800 pb 10 kb) 8, 10, 12, 16 poos (1 ou 2 pentes)
1.0% (400 pb 10 kb) 48 poos
1,2% (100 pb 5 kb) 96 poos
2,0% (100 pb 2 kb)
4,0% (10 pb 400 pb)
Colorao
Sybr Safe
Brometo de Etdeo

ExoSAP (Exonuclease I + Fosfatase Alcalina de Camaro).
MicroSEQ ID Cleanup Kits
ExoSAP-IT Performa DTR Gel

Filtration Cartridges

Quantificao do produto de PCR

Garantia de sinal adequado no sequenciamento.
Amostra Quantidade
Produto de PCR: 100-200pb 1-3ng
200-500pb 3-10ng
500-1000pb 5-20ng
1000-2000pb 10-40ng
>2000pb 40-100ng
DNA fita simples 50-100ng
DNA dupla fita 200-500ng
Cosmdeo/BAC 0,5-1g
DNA bacteriano 2-3g

Espectrofotmetro (absorbncia UV)
Simples, sensvel, amplamente utilizado
Quantificao e pureza
Agilent 2100 Bioanalyzer

Requer quantidade pequena de cido nucleico (1 L, 25 ng)
Pode tanto quantificar quanto medir a integridade
QubitTM - Fluorometria
Corante especfico
Requer quantidade pequena de amostra (1 L- 20 L)
Maior preciso e sensibilidade do que leitura de abs. em UV

Qubit Quantitation Platform
Tecnologia Quant-iTTM
Famlia de fluorforos seletivos DNA, RNA ou protena
Maior especificidade
No detectam contaminantes
Outras biomolculas
Nucleotdeos livres
Maior preciso e sensibilidade

1-20 L de amostra
Amostras diludas

Kits para uso com QubitTM
Kit Range Concentrao inicial amostra
QubitTM ds DNA HS Assay 0,2 100 ng 10 pg/uL 100 ng/uL
QubitTM ds DNA BR Assay 2 1000 ng 100 pg/uL 1 ug/uL
QubitTM ssDNA Assay 1 200 ng 50 pg/uL 200 ng/uL
QubitTM RNA Assay 5 100 ng 250 pg/uL 100 ng/uL
QubitTM RNA BR Assay 20 1000 ng 1 ng/uL 1 ug/uL
QubitTM Protein Assay 0,25 5 ug 12,5 ug/mL 5 mg/mL

pb ng/ul
50
Por comparao com um marcador de massa:
30
Low DNA Mass Ladder 20
eletroforese em gel de agarose.

10
a intensidade das bandas das amostras

5
deve ser comparada com o marcador e as
suas respectivas massas estimadas.
2.5

Reao de Sequenciamento

Protocolo BigDye
Amostras fracas so resultado de uma reao de sequenciamento desbalanceada.
importante quantificar o produto e utilizar os primers e outros componentes na
quantidade adequada.
Reagente Quantidade
BigDye Mix* 8 L
Amostra Varivel
Primer 5 pmol
gua deionizada q.s.p. 20 L
Volume Total 20 L
* BigDye Mix contm: dNTPs, ddNTPs, AmpliTaq DNA polimerase, MgCl2, tampo Tris-HCl

Otimizao da reao
A reao com o kit BigDye pode ser diluda!

Importante:
Usar sempre o 5x Sequencing Buffer

Controles Positivos
Controle positivo reao

Extrao de DNA e PCR
pGEM
Mistura BigDye;
Plasmdeo pGEM;
Primer direto M13.
Sequencing Standard
Reao pronta e precipitada.
Ressupenso em formamida;
Controle do equipamento e consumveis.

Programa de termociclagem universal
Protocolo Bsico:
Inicial 96C 1 min
Desnaturao 96C 15 seg

Hibridizao* 50C 15 seg 25-40 ciclos
Extenso 60C 4 min
Final 4-8 C Infinito
* Importante configurar o termociclador para uma rampa de

1C/seg para facilitar a hibridizao do primer.

Precipitao da Reao de Sequenciamento

Por que precipitar/purificar a reao?
Consumo de uma pequena poro dos ddNTPs adicionados;
Os ddNTPs que sobram e os sais da reao competem com o DNA durante a injeo.
ddNTPs no incorporados Dado bruto
Dado analisado

Precipitao da reao de sequenciamento
Isopropanol/Etanol: desatualizado.
Etanol/EDTA: eficiente na remoo de ddNTP`s.
Etanol/EDTA/Acetato de Sdio: bom sinal a partir das primeiras bases.
Kit BigDye XTerminator: rpido, prtico e muito eficiente na remoo
completa de ddNTPs, dessalinizao da amostra e qualidade do sinal.

Precipitao por Etanol e Sal

Papel do etanol na precipitao
A gua possui alta constante dieltrica, o que dificulta a interao dos ons
positivos em soluo e fosfato;
Etanol tem uma constante dieltrica menor e facilita a interao entre estes
ons.

Precipitao por Etanol e Sal
Tcnica mais utilizada;
Adio de sal e etanol soluo aquosa, forando a precipitao do cido nuclico;
Separao por centrifugao;
O pellet lavado com etanol gelado 70% para a remoo de sal.

Papel do sal na precipitao
Neutralizar as cargas dos grupos fosfato, tornando a molcula muito menos
hidroflica, e portanto, menos solvel em gua.
Um sal comumente utilizado o acetato de sdio.

Diferena entre etanol e isopropanol
DNA menos solvel em isopropanol (precipitao mais rpida);

Etanol, o DNA precisa estar em concentraes mais altas para precipitar, mas o
sal tende a ficar solvel mesmo em temperaturas mais baixas.

BigDye XTerminator Purification Kit
Purificao no prprio tubo ou placa;

Remove os ddNTPs no incorporados;
Dessaniliza a amostra.

BigDye XTerminator Purification Kit
XTerminator Solution
Precipita as impurezas e deixa os
fragmentos de sequenciamento livres na
soluo.
SAM Solution
Remove os ddNTPs e estabiliza os
fragmentos de sequenciamento para a
eletroforese capilar.

BigDye XTerminator
4 passos 35 minutos
Centrifugar
Agitar
Adicionar
Reagentes

Etanol x BigDye XTerminator
Precipitao por Etanol: 11 passos, > 1 h.
Adicionar Selar e incubar Centrifugar Descartar Adicionar Selar e

reagentes reagentes Incubar
Centrifugar Descartar Secar Ressuspender Selar Analisar

Comparao de perfis

Equipamentos Necessrios
Centrfuga de Placa Digital Genie 2
Para dar o spin final
Vortexers de Placa
Digital Genie 2
www.scientificindustries.com
96 or 384-well plates
IKA Vortex 3
96-well plates
www.ika.net
MixMate
384-well plates
www.eppendorf.com

Mdulos de injeo especficos
H mdulo de injeo especfico Capillar

Aumenta altura do capilar durante injeo.
Diminuir tempo de injeo.
Mdulos esto disponveis para download no
site da Life.
Amostra
Se utilizar mdulo incorreto purificada
No causa danos ao capilar.

Apenas falha a injeo.
XTerminator reagente
e impurezas

Kits para Sequenciamento

BigDye Terminator v3.1
Produtos de PCR, plamdeos, fosmdeos e BAC templates;

Picos mais homogneos maior qualidade das bases;
Corridas mais rpidas com o polmero POP-7.

Produtos de PCR, plamdeos, fosmdeos e BAC templates;
Melhor resoluo das primeiras bases;
Amplificados pequenos;
Corridas mais longas com o polmero POP-6.

BigDye Direct Cycle Sequencing Kit
Menos tempo de preparo da amostra;
Purificao da PCR e reao de sequenciamento em um nico passo;
Reagentes para a PCR e para a reao de sequenciamento;
Todos os passos em um nico tubo.

40% menos tempo desde a amplificao at o sequenciador.
BDTv1.1 - POP-6
Purificao/Reao de Purificao da reao de

BDD - POP-7 PCR Sequenciamento sequencinamento Eletroforese
Fwd
Rev
84 min 90 min 50 min 75 min

BigDye Direct Sequencing Master BigDye X-Terminator** POP-7
BigDye Direct PCR Master
Mix Mix and M13 sequencing
primer

Componentes do Kit
BigDye Direct PCR BigDye Direct BigDye Direct BigDye Direct

Master Mix Sequencing Fwd/Rev Control DNA
Enzima AmpliTaq Master Mix Sequencing Primers
Gold UP (hot
start); Especialmente Primers universais DNA controle
Amplificao de formulado para M13
PCR otimizada e limpeza ps-PCR e
mais rpida; reao de
No vendido sequenciamento
separadamente: concomitantes.
otimizado para o
Master Mix
BigDye Direct.


BigDye Terminator v 3.1 using POP-7 Polymer
1a base
depois do
primer BigDye Terminator v 1.1 using POP-6 Polymer 145 Minutes
1a base
depois do
primer
BigDye Direct using POP-7 Polymer 75 Minutes

Sequenciamento alelo-especfico

Clonagem.

PCR-SSP: Sequence Specific Primers.

Reao de sequenciamento alelo-especfica.

Software Sequencing Analysis

Algortimos
Basecalling
Dye Set / Primer

Algortimos
Basecaller: algoritmo que faz a nomenclatura das bases no

eletroferograma.
Dye set/Primer ou Mobility File: corrige o espaamento entre
os picos devido s diferenas nos tamanhos dos fluorforos
(especfico para cada kit, equipamento e polmero).
Matriz: corrige a sobreposio dos picos. gerada atravs da
calibrao espectral.

Anlise com Mobility File incorreto
BigDye v3 analisado com Mobility File do BigDye v1 e v2
A mesma amostra analisada com o Mobility File correto

Detalhes da amostra

Raw Data: dado bruto
Sinal fluorescente REAL coletado durante a eletroforese. Pode-se identificar problemas

de eletroforese, precipitao etc.

Annotation
Dedo-duro das condies da corrida: mdulo de corruda, tipo de polmero, data de

validade do polmero e detalhes da anlise.
Unidades relativas de fluorescncia

para cada base (recomendado entre
100-1000).

EPT
Voltagem
Corrente
Pico de voltagem da injeo das amostras
Temperatura

Base Spacing
Distncia mdia entre picos, medida em nmero de scans;
Velocmetro da eletroforese;
Diretamente influenciado pela corrente e voltagem de corrida.
755
781 796
820
741
720 768
731
807

Eletroferograma
Localizao das bases

Qualidade das bases
Intensidade de fluorescncia normalizada

Sequncia fasta

Analysis Report
Extenso de leitura das amostras (Length Of Read)

Software Sequence Scanner

Sequence Scanner Software
Gratuito (site da Life);
Permite visualizar eletroferogramas (pr-analisados pelo Sequencing Analysis) e avaliar
todos os parmetros de anlise, porm no permite reanalisar amostras.

Resoluo de Problemas Sequenciamento

Resultados esperados

Eletroferograma Sem Sinal
Dado analisado
Dado bruto

Eletroferograma com sinal fraco
Dado analisado
Dado bruto

Eletroferograma com sinal forte
Sinal muito alto prejudica a correo espectral e gera excesso de rudo (falsos picos).

Perfil triangular
Excesso de DNA desequilibra a reao de sequenciamento e resulta em perfil triangular

no dado bruto.

Problemas na precipitao baseada em lcool
Centrifugao ou excesso de lcool (dado analisado).
Centrifugao ou lcool na concentrao errada (dado bruto).

Manchas fluorescentes ocasionadas por ddNTPs (Blobs).
Dado bruto
Dado analisado

Mancha fluorescente ocasionada por problemas na remoo total de etanol aps a

precipitao gera erros de basecalling.

Background elevado: Problemas na extrao
Contaminao na gua, polmero, blocos, etc., resulta em background elevado. Isto pode prejudicar
a eletroforese e diminuir a vida til dos capilares.

Background elevado: Problemas na extrao
Dado bruto mostrando contaminao verde aparecendo JUNTO com os fragmentos de
DNA, talvez devido a contaminaes resultantes de m qualidade da extrao de DNA.

Degradao da formamida
T=0h
T = > 48 h

Degradao da formamida
T=0h
T = > 48 h

Sequncias Repetitivas

Sequncias Repetitivas

Sequncias Repetitivas Sequencer Enhancer
Soluo que facilita o sequenciamento de regies ricas em GC, repeties diretas ou

invertidas, hairpins e/ou curtas repeties de nucleotdeos;
Adicionado ao mix de reao;
Compatvel com as qumicas BigDye terminator v3.1 e v1.1 em todas as plataformas

de sequenciamento;
No recomendado para resoluo de problemas associados regies poli-A (>30).

dGTP BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit
Otimizado para sequenciamento de regies GT- e G-rich
v1.0 e v3.0 (Mesmos DyeSets que o BigDye tradicional)
Sequncia de DNA mitocondrial com BigDye Terminator 3.0.
Mesma regio sequenciada com dGTP BigDye Terminator v3.0.

Spikes: Picos de polmero
Picos agudos, de todas as cores, numa mesma posio devido cristais de uria no polmero.
Para evitar, retirar da geladeira o polmero ~30min antes de colocar no equipamento.
Dado analisado
Dado bruto

Entupimento temporrio do capilar
Picos inicialmente agudos, mas que ficam gradualmente alargados e arrastados. Causas
comuns: protenas e outras sujeiras da extrao de DNA.
Dado analisado
Dado bruto

Capilar velho
Picos com arraste para a direita e com m resoluo (vales pouco profundos entre os picos,
que aparecem muito cedo na sequncia).

Erros na Sntese do Primer (-1 b)

Contaminao com DNA e primer
Contaminao por DNA

ou primer

Problemas de corrente

http://lifesequencing.blogspot.com

Epigentica e Metilao

Epigentica e Componentes
Alteraes herdveis do genoma, que

ocorrem independente de alteraes na
sequncia do DNA.
Componentes:
1. RNAs no-codificadores
2. Modificao nas Histonas
3. Metilao do DNA

1. RNAs no codificadores (ncRNAs)
RNA
ncRNA
mRNA Non-coding RNA. RNA transcrito tem papel estrutural,
funcional ou cataltico
snoRNA miRNA Outros

tRNA snRNA Small nucleolar RNA Micro RNA
rRNA Transfer RNA Small nuclear RNA RNAs maiores compondo
Ribosomal RNA Encontrado no Pequenos fragmentos a estrutura da cromatina
Interface entre RNA que fazem nuclolo e esta de RNA que esto
Participa da RNAm e parte do e relacionados
sntese de protenas envolvido na envolvidos na regulao ao imprinting
aminocidos spliceossomo modificao da expresso gnica
do RNAr
siRNA
stRNA Small interfering RNA
Small temporal RNA. ativa molculas na
RNA com funo de interferncia por RNA
regulao do
desenvolvimento biolgico

2. Modificao das histonas
Luger et al., Nature (1997)
Histonas podem ser covalentemente

modificadas de vrias formas e em Felsenfeld e Groudine, Nature (2003)
mltiplos stios.

3. Metilao do DNA
Ligao de um grupo metil citosina presente na molcula de DNA.
Citosina 5 Metil-Citosina
Metilao
Enzima
DNA metil transferase

3. Como a metilao afeta a transcrio

3. Metilao do DNA
Vrios genes possuem regies com uma alta densidade de 5-CpG-3 no

promotor, conhecidas como ilhas de CpG.

3. Metilao do DNA
Aglomerados de Ilhas de CpG (~ 20.000) no genoma humano (FISH-Texas Red).
Nature Genetics, 7, pp. 376-381

3. Metilao do DNA
Inativao do X e o Imprinting Genmico

Cada local de metilao, aps estabelecido, transmitido para as demais clulas-filhas.

3. Metilao do DNA
Reprogramao epigentica
Imprinted genes
Father
Mother

Anlise da metilao do DNA
Problema PCR ou Clone
Soluo Tratamento com Bissulfito

Cells-to-CpG Bisulfite Conversion Kit
Converso das citosinas no

metiladas em uracila, sem
alterar citosinas metiladas.

MethylMiner Methylated DNA Enrichment Kit

Metilao - Sequenciamento
Passo 1: Passo 2: Passo 3: Passo 4: Passo 5:
Extrao do DNA Tratamento Desenho de Primers Sequenciamento Anlise dos
com Bissulfito e Amplificao Dados
RecoverAll Total BigDye Terminator v3.1

methylSEQr Methyl Primer SeqScape Software
Nucleic Acid Cycle Sequencing Kits
Bisulfite Conversion Express Software for Mutation Profiling
Isolation Kit for FFPE Kit v2.5
Tissues AmpliTaq Gold DNA Cycle Sequencing Kits
Polymerase Variant Reporter
MELT Total Nucleic BigDye XTerminator Software
Acid Isolation System Applied Biosystems Purification Kits
Thermal Cycler
NucPrep Chemistry Applied Biosystems
for Tissues Capillary Electrophoresis
Instruments

Metilao - Sequenciamento

Software para desenho de primers para metilao

MicroSeq
Microbial Identification System
Wesley Tsutsumida
Wesley.Tsutsumida@lifetech.com

www.microseq.com

A soluo MicroSeq
Sequenciamento automtico de DNA microbiano;

Identificao de milhares de espcies: bactrias,
leveduras, bolores e fungos;
Instrumentao, reagentes, bibliotecas de
sequncias e softwares;
Controle de qualidade que resulta em testes
acurados, confiveis e reprodutveis.

Identificao bacteriana de rotina
MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification System

Sequencia as primeiras 500 bases do gene 16S rRNA.

Identificao de microorganismos sem discriminao nos
primeiros 500 pb
MicroSeq Full Gene 16S rDNA Bacterial Identification System

Sequencia aproximadamente 1500 nucleotdeos do gene 16S rRNA.

Identificao de rotina de fungos
MicroSeq D2 rDNA Fungal Identification Kit

Sequencia aproximadamente 300 nucleotdeos da subunidade grande (LSU) do
domnio 2 (regio D2) do gene 26S rRNA.

MicroSeq Microbial Identification System
A partir de colnia ou
cultura pura em caldo
Extrao de DNA
PrepMan Ultra Reagent
(< 15 min)
PCR (20 min) e reao de
sequenciamento (2h) com kits
pr-configurados

MicroSeq Microbial Identification System
Sequenciamento automtico de DNA
Identificao e anlise automtica

usando o software MicroSeq ID v3.0
(< 20 min)

Programa de anlise
Basecalling e sequncia consenso;
Compara a sequncia consenso com as includas na biblioteca;
Compatvel com Microsoft Windows 2000, Windows XP e Vista.

SeCore - Sequenciamento HLA
Danilo Franceschi
Danilo.Franceschi@Lifetech.com

Life Technologies
Padro ouro em sequenciamento
Instrumentos
Kits
Suporte e Servio

Regio de classe I codifica as molculas HLA
de classe I:
HLA-A
HLA-B
HLA-C
Regio de classe II codifica as molculas HLA

de classe II:
HLA-DR
HLA-DP
HLA-DQ
Regio de classe III: codifica outras molculas

(citocinas, protenas do choque trmico e do
complemento)

SeCore Sequenciamento Classe I
Locus A, B, C, DR, DQ e DP
Amplificao multiplex de regies exnicas;
Primers especficos de GSSP para resolver ambiguidades.
Duas PCRs PCR PCR

Ex2 Ex3
Locus A, B e C
3R
DQB1 2F 3F
2R

Anlise pelo Programa uType

2 Sequenciamento 3500 2013

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1 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

Watson e Crick (1953)

2 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

3 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

Dideoxinucleotdeos trifosfato marcados radioativamente com 32P ou 35S.

4 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

Exposio em filme de raio

5 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

6 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

Etc. to 25 or more cycles...

7 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

Mistura de reao Anelamento

8 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

9 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

10 | Life Technologies Proprietary and Confidential 10/12/12

11 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

12 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

13 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

Molculas negativas entram no

Velocidade de migrao da molcula

14 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

15 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

16 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

1986 1995 1998 2000-2002 2002-2003 2004 Aug 2009

Sequenciadores atualmente comercializados pela Life Technologies.

17 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

18 | Life Technologies Proprietary and Confidential 8/20/2013

19 | Life Technologies Proprietary and Confidential 10/12/12

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21 | Life Technologies Proprietary and Confidential 10/12/12

2. Qual o material de partida?

1. Clulas Animal 4. Amostras forenses

4. Qual o formato de escolha?

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A260/280 e A260/230 = entre 1,8 e

Razes <1,7 : presena de

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Filtro com Fibra de

Tempo ~2 horas ~60 minutos ~30 minutos

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DNAzol PureLink Genomic MagMAX DNA Multi-

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DynaMag-2 DynaMag-Spin DynaMag-15 DynaMag-50

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PureLink PCR Purification Kit (K3100-01 para 50 reaes)

Misture o produto de PCR com o tampo de ligao.

Aplique a amostra na coluna.

Lave a coluna com tampo de lavagem.

Recupere o produto purificado.

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Purificao a partir das bandas presentes no gel

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ExoSAP (Exonuclease I + Fosfatase Alcalina de Camaro).

MicroSEQ ID Cleanup Kits

ExoSAP-IT Performa DTR Gel

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Agilent 2100 Bioanalyzer

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