CENTRO NACIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA Y FORESTAL

ENRIQUE ALVAREZ CRDOVA

Identificacin de hongos endfitos del fruto de Cacao (Theobroma cacao)

cosechado en la parcela de San Andrs, Ciudad Arce, El Salvador.

Informe presentado por:

Otto Ren Amaya Melndez.

Identificacin con asesoramiento de los Tcnicos del Laboratorio de

Parasitologa Vegetal del CENTA.

05 de Septiembre del 2017.

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIN

Objetivo General:
Identificar hongos endfitos del fruto de Cacao (Theobroma cacao) cosechado
en la parcela de San Andrs, Ciudad Arce, El Salvador.

Objetivos especficos:

Aislar e Identificar los hongos endfitos con mayor frecuencia de

crecimiento en el mucilago y el endocarpio de frutos de cacao.

Determinar el porcentaje de crecimiento micelial de los hongos

presentes en el mucilago y el endocarpio de los frutos de cacao.
INTRODUCCIN

Los hongos endfitos son microorganismos asintomticos que se encuentran

dentro de los tejidos de la planta husped, durante al menos parte de su ciclo
de vida, ocupando hojas, tallos, frutos y ramas. Estos hongos pueden
desempear diferentes funciones en la planta; es decir, pueden ser
fitopatgenos, que han perdido su virulencia o que estn en periodo de latencia
y activarse cuando la planta se encuentre dbil, o bien pueden ser saprofitos
latentes que se reactivan cuando la planta comience su senescencia. Tambin
pueden desempearse como controladores biolgicos protegiendo a la planta
de infecciones causadas por patgenos. Por ello, los hongos que habitan las
plantas perennes leosas las protegen por uno o ms mecanismos (antibiosis,
micoparasitismo, resistencia inducida y / o exclusin competitiva) (Crozier et al
2006; Baralt et al 2012).

Los microorganismos endfitos confieren a las plantas un potencial adaptativo

frente a estreses biticos y abiticos, esto fue comprobado en estudios
recientes que demuestran la enorme capacidad que tienen los hongos
endfitos para producir compuestos activos que le confieren proteccin a su
hospedera contra el ataque de patgenos y herbvoros, constituyendo una
nueva va para la obtencin de diversos precursores o molculas novedosas de
utilidad en la agricultura y en la medicina (Snchez et al 2013).

La colonizacin a sus huspedes no les causa ningn sntoma de enfermedad

externo, excepto cuando el husped est bajo condiciones de estrs. Se cree
que el desarrollo de inculo se da mediante el medio ambiente y no por
transferencia de generacin en generacin. Por lo tanto, las plantas que han
sido retirados de su entorno natural y cultivadas, genera un agotamiento en la
presencia endfita especfica, como resultado, pueden ser ms susceptibles a
las plagas y enfermedades (Rubini et al 2005; Crozier et al 2006).

Es importante el estudio de estos hongos para conocer la interaccin de la

comunidad endoftica, ya que la comprensin de la fisiologa de la enfermedad
y la ecologa es crucial para disear mejores estrategias de control para el
patgeno (Rubini et al 2005; Crozier et al 2006).

Esta investigacin tuvo como objetivo principal el aislar e identificar hongos

endfitos del fruto del cacao, a partir de fragmentos de tejidos (mucilago y
endocarpio) cultivados en medio artificial agar papa y dextrosa (PDA, por sus
siglas en ingles), donde se observ colonias de crecimiento vegetativo. Dicha
identificacin se realiz hasta gnero, basndose en la morfologa y anatoma
que presentaba cada hongo. Estos microorganismos se encuentran al interior
de los tejidos de las plantas y pueden conferir un grado de proteccin contra
plagas generando de manera indirecta un impacto econmico contra el manejo
y control de plagas en plantaciones de cacao.
Por lo tanto, es importante conocer que tipos de hongos estn presentes en los
frutos de cacao, ya que mediante la literatura se puede deducir que tipo de
interaccin o simbiosis existe entre planta y hongo, y as mejorar el manejo del
cultivo incluyndolos como agentes controladores de las plagas existentes.

- Estudios sobre el control de plagas mediante hongos endfitos del

cacao.
Rubini et al (2005), plntulas de cacao axnico fueron inoculadas con hongos
endfitos de los cuales catorce aislamientos fueron capaces de inhibir
completamente el desarrollo de sntomas de escoba de bruja en las plntulas
evaluadas. Sin embargo, en condiciones de invernadero, solo un aislado
identificado como Gliocladium catenulatum fue capaz de reducir en 70,84% los
sntomas de dicha enfermedad.
Hanada et al (2010), se confirm la actividad de biocontrol de 74 de 103
microhongos aislados a partir de cacao axnico, esto sugiere que la
biodiversidad de hongos endofticos es de tipo principalmente mutualista con el
husped. Los gneros de los hongos endofticos que presentaron el nivel ms
alto de actividad contra el patgeno Phytophthora palmivora son: Trichoderma,
Pestalotiopsis, Curvularia, Tolypocladium y Fusarium.

Posada et al (2010), El hongo entomopatgeno Beauveria bassiana puede ser

establecido como hongo endfito de frutos de cacao, ya que los resultados de
esta investigacin indicaron que la frecuencia de colonizacin de B. bassiana
en el fruto de cacao fue de 0,8% y 1,3% luego de dos y tres meses de la
aspersin de las esporas a las flores de plantas criadas en invernadero, las
cuales fueron polinizadas manualmente y asperjadas con una suspensin de
1x107 mL-1 esporas de B. bassiana. Por lo tanto, puede ser utilizado en el
manejo de insectos perforadores de frutos de cacao en programas de control
biolgico de insectos plaga.
Rodriguez et al (2011), en esta investigacin se determin la capacidad
antagnica de ocho hongos endfitos de cacao (Botryosphaeria, Clonostachys,
Trichoderma, Acremonium, Pestalotiopsis, Xylaria, Fusarium y Colletotrichum).
Los resultados indicaron que de manera in vitro, los que presentaron mayor
porcentaje de inhibicin del crecimiento micelial del patgeno (M. perniciosa)
fueron Trichoderma (100%) y Botryosphaeria (45.2%); sin embargo,
Clonostachys, y Colletotrichum no tuvieron efecto en la inhibicin micelial.
- Recopilacin de gneros de hongos endfitos del cacao.

Los aislamientos de hongos endfitos en ramas, tallos, hojas y frutos, han

llevado una serie de investigaciones recientes por parte de Rubini et al 2005,
Hanada et al (2010), Rodriguez et al (2011) and Baralt et al (2012),
encontrando una diversidad de micobiota endoftica con actividad
antipatognica, as como tambin, posibles patgenos del cultivo, a
continuacin un cuadro de los gneros de hongos endfitos identificados en las
plantas de cacao.

Cuadro 1. Registro de hongos endfitos aislados de rboles de T. cacao.

N Gneros N Gneros N Gneros

1 Acremonium spp 14 Diaporthe spp 27 Pestalotiopsis spp
2 Arthrinium spp 15 Fusarium spp 28 Phoma spp
3 Aspergillus spp 16 Geotrichum spp 29 Phomopsis spp
4 Asteromella spp 17 Gibberella spp 30 Pleurotus spp
5 Blastomyces spp 18 Gliocladium spp 31 Pseudofusarium spp.
6 Botryosphaeria spp 19 Glomerella spp 32 Rhizopycnis spp
7 Cladosporium spp 20 Lasiodiplodia spp 33 Septoria spp
8 Clonostachys spp 21 Myrothecium spp 34 Syncephalastrum spp
9 Colletotrichum spp 22 Monilochoetes spp 35 Talaromyces spp
10 Coniothyrium spp 23 Nectria spp 36 Tolypocladium spp
11 Cordyceps spp 24 Nigrospora spp 37 Trichoderma spp
12 Curvularia spp 25 Paecilomyces spp 38 Verticillium spp
13 Cylindrocladium spp 26 Penicillium spp 39 Xylaria spp
DESCRIPCIN DE ACTIVIDADES

I. Obtencin de la muestra.

Para la obtencin de la muestra se seleccionaron cuatro rboles de cacao de la

parcela de San Andrs-CENTA. Posteriormente se procedi a cortar un fruto
maduro y sano de cada rbol y cada uno se rotul con su respectiva
informacin para luego ser trasladados al Laboratorio de Parasitologa Vegetal
del CENTA donde se realiz su respectivo anlisis.

II. Preparacin del medio de cultivo.

Para el cultivo de hongos endfitos del fruto de T. cacao, se utiliz medio de

cultivo artificial PDA (fig. 1).

Figura 1. Medio de cultivo PDA.

Para la preparacin del medio de cultivo primero se realiz los clculos

correspondientes para la cantidad gramos de medio y mililitros de agua
destilada a utilizar. Posteriormente se procedi a pesar la cantidad previamente
calculada del medio de cultivo en una balanza analtica y de igual manera se
midi en una probeta el volumen de agua a utilizar. Despus se mezcl el
medio deshidratado con el agua y se llev a ebullicin en un hot plate,
finalizada la ebullicin se esteriliz en la autoclave y posteriormente se le
agreg un antibitico antes de decantar aproximadamente 20 ml de PDA en
cada caja Petri (fig. 2), para evitar posibles contaminantes se realiz en la
cmara de flujo laminar.
 Figura 2. Cajas Petri con medio de cultivo PDA.

III. Preparacin y siembra de la muestra.

Los frutos se desinfectaron frotando sobre la superficie una torunda de algodn

con etanol al 90%. Una vez desinfestados se procedi a hacer un corte
longitudinal y transversal a cada fruto, y de igual manera se hizo con las
semillas seleccionadas de cada uno (fig. 3).

Para la obtencin de muestras representativas por fruto de cacao se cort 8

fragmentos de endocarpio por pice y borde de cada fruto, y se seleccionaron
al azar 8 semillas por fruto y se cort dos fragmentos de cada una. Cada
fragmento de endocarpio y mucilago se cort de aproximadamente 3-5 mm.

Figura 3. Preparacin de los fragmentos de endocarpio y mucilago.

La siembra de los fragmentos en las cajas Petri con medio realiz de acuerdo
con la metodologa de Arnold et al 2003 y Rubini et al 2005, la cual consisti en
desinfectar las muestras de endocarpio y mucilago, sumergindolas en etanol
al 90% y despus en agua estril por 10 segundos. Una vez esterilizadas las
muestras se procedi a colocar en forma circular 8 fragmentos de endocarpio y
de mucilago por cada caja Petri (fig. 4), luego se incubaron a una temperatura
de 23C por 10 das.
 Figura 4. Siembra de los fragmentos de endocarpio y mucilago en cajas Petri.

IV. Identificacin de los hongos endfitos.

Para la identificacin se tom en cuenta las caractersticas morfolgicas (color,

consistencia y forma del micelio) observadas en el estereoscopio y las
caractersticas anatmicas (forma y color de las esporas y conidiforos y
filiades) observadas mediante un microscopio de campo claro. Con la
observacin de estas caractersticas y con la ayuda de dos guas taxonmicas
de hongos (Illustrated Genera of Imperfect Fungi y Los hongos comunes que
atacan cultivos en Amrica Latina) se identificaron los microorganismos hasta
gnero.

De igual manera, se contabiliz el nmero de colonias fngicas por gnero y se

calcul el porcentaje de crecimiento de las colonias fngicas por caja Petri
(fig.5).

Figura 5. Colonias fngicas en fragmentos del endocarpio y mucilago.

RESULTADOS

I. Gneros identificados de microhongos endfitos en cacao.

a. Aspergillus spp

- Caracterizacin macroscpica: el color de la colonia fngica es negro en el

centro y en el rea del margen blanco, el micelio crece regularmente
formando una colonia plana (Amin et al 2014).

- Caracterstica microscpica: las hifas son aseptadas, los conidiforos se

mantienen en posicin vertical y son prolongados, pero no tienen
ramificaciones, el borde se hincha y forma una vescula la cual cubre al
micelio y forma las filides (fig.6) (Amin et al 2014).

Figura 6. Colonias de Aspergillus sp. y conidios observados a 40X.

b. Fusarium spp.

- Caracterizacin macroscpica: aspecto algodonoso de diversos colores que

van del blanco, rosado y salmn (Trabelsi et al 2017).

- Caractersticas microscpicas: los macroconidios de este hongo son de

forma curvada ms anchos del centro de su longitud. Las microconidias son
ovaladas, reniformes, ovaladas alargados con una base truncada, y
septadas (fig. 7). El tamao de los conidios es de 44-78 3.3-5.6 m
(Trabelsi et al 2017).
 Figura 7. Colonias de Fusarium sp. y conidios observados a 40X.

c. Cladosporium spp.

- Caractersticas macroscpicas: sus colonias son de color gris oliva a verde

oliva con micelios areos gris (Zhan et al 2014).

- Caractersticas microscpicas: Las hifas ocasionalmente presentan

ramificacin siendo la mayora sin ramificacin y miden de 1 a 4 m de
ancho. Los conidiforos son solitarios, rectos o ligeramente curvos, sin
ndulos, y ocasionalmente geniculados de 40-300 m 3-4 m. Las hifas
tienen una punta que es estrechada, y la base a veces esta hinchada. Las
conidias se formaron en cadenas, casi esfricas, ovales o en forma de
limn, y miden de 3-6 m 2-3 m (fig. 8) (Zhan et al 2014).

Figura 8. Colonia de Cladosporium sp. y conidios observados a 40X.

d. phytium spp.

- Caractersticas microscpicas: micelio hialino, bien ramificado. Hifas

principales de hasta 6-8 m de ancho. Los esporangios son globosos o
cilndricos, ovalados y, a veces, en forma de cacahuate, en su mayora
intercalares; midiendo 15-55 m en dimetro y hasta 65 m en longitud (fig.
9) (Paul et al 2005).
 Figura 9. Conidios de phytium sp observados a 40X.

e. Micelio estril.
Bajo el nombre de micelio estril se comprenden a las formaciones de colonias
de crecimiento vegetativo que no producen conidios o esporas ya sea porque
han perdido esta capacidad, las condiciones no eran adecuadas o requeran
perodos muy largos para producir esporas, es decir, que carecen de
fructificacin conocida, reproducindose por simple divisin celular de sus
elementos (fig. 10) (McQuade 1962; Talbot 1971; Kung'u 2016).

Figura 10. Micelio estril.

II. Hongos endfitos identificados en mucilago y endocarpio.

Se registr en el mucilago y el endocarpio de cacao, una riqueza de 5 unidades

taxonmicas identificadas hasta gnero, 6 levaduras no identificadas y un
aislamiento de micelio estril (cuadro 2). Dicha riqueza, se identific en 30 de
un total de 64 fragmentos del endocarpio y en 38 de 64 fragmentos de
mucilago.

Cuadro 2. Hongos endfitos identificados en los fragmentos de mucilago y endocarpio

de cacao.

Especies Nmero de colonias Nmero de colonias

fngicas en muclago fngicas en endocarpio
Aspergillus sp 6 19
Fusarium sp 25 3
Cladosporiumsp 3 0
Phytium sp 0 2
Trichoderma sp 3 0
Levaduras 1 5
Micelio Esteril 0 1

Frecuencia de hongos endfitos

Muclago endocarpio

30
25
20
15
10
5
0

Grfico 1: Frecuencia de los hongos endfitos presentes en el mucilago y endocarpio

de los frutos de cacao.
El grafico 1 muestra los hongos encontrados en las dos partes del tejido del
fruto, presentando con mayor frecuencia de crecimiento en la parte del
mucilago fue Fusarium sp, ya que se reportaron 25 colonias vegetativas en los
fragmentos de este tejido, y los hongos con menor frecuencia fueron las
levaduras. En cambio, el hongo con mayor frecuencia de crecimiento en el
endocarpio fue Aspergillus sp, ya que se reportaron 19 colonias y el de menor
frecuencia fue micelio estril con solo dos colonias reportadas.

III. Porcentaje del crecimiento micelial de los hongos presentes

en el mucilago y el endocarpio.

Grfico 2: Porcentaje de crecimiento micelial de los hongos endfitos del mucilago de

cacao.

NMERO DE COLONIAS FNGICAS EN MUCLAGO

Aspergillus sp
9%

Sin crecimiento
vegetativo
41%

Fusarium sp
39%

Levadura
1%
Trichoderma sp Cladosporiumsp
5% 5%

El grfico 2 muestra, el porcentaje de distribucin de crecimiento vegetativo en

los fragmentos del mucilago, represent un crecimiento del 59% de 64 trocitos
del mucilago del fruto y un 41% donde no se observ crecimiento vegetativo.
Con mayor presencia fue Fusarium Sp con 39% y un 1% para la levadura.
Grfico 3: Porcentaje de crecimiento micelial de los hongos endfitos del endocarpio
de cacao.

NMERO DE COLONIAS FNGICAS EN

ENDOCARPIO
Micelio Esteril
Levaduras
1%
8%

Aspergillus sp
30%

Fusarium sp
5%
Fragmento sin Phytium sp
crecimiento 3%
53%

El grfico 3 muestra el porcentaje de distribucin de crecimiento vegetativo en

los fragmentos del endocarpio, represent un crecimiento del 47% de 64
trocitos del endocarpio del fruto y un 53% donde no se observ crecimiento
vegetativo. Estos resultados representan menor presencia de crecimiento de
hongos endfitos en la parte del fruto del endocarpio comparados con el
mucilago. La mayor presencia fue Aspergillus Sp con 30% y un 1% para el
micelio estril.
CONCLUSIONES

De manera natural, las plantas de cacao han adoptado a estos

microorganismos endfitos en sus tejidos como su sistema de proteccin antes
enemigos fitopatgenos y entomopatgenos, aparte dndole beneficios de un
mejor crecimiento. Los gneros de hongos endfitos varan segn el hbitat
que presente el cultivo de cacao, con la recopilacin de hongos aislados de
investigaciones anteriores se demuestra, que no todos los arbustos presentan
la misma cantidad microorganismo.

Comparando los resultados de crecimiento de hongos endfitos de la parte del

fruto del endocarpio y el mucilago, se concluye que la parte con ms presencia
de crecimiento vegetativo micelial se encontr en el mucilago. No se afirma que
presente mayor crecimiento esta parte del fruto, ya que no se contaba con un
gran nmero de muestra para examinar, por el motivo que se estaban
realizando investigaciones del mejoramiento de la semilla, dejando un nmero
menor de muestra para la investigacin endoftica.

AGRADECIMIENTOS
Agradesco al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y al
Centro Nacional de Tecnologa Agropecuaria y Forestal "Enrique lvarez
Crdova" (CENTA), por el apoyo que me brindaron en el programa de mi
primer empleo y la prestacin de las instalaciones del laboratorio de
parasitologa. Este trabajo cientfico contribuir para el implemento de hongos
endfitos que directa e indirectamente dan la proteccin a las plantas, el
crecimiento y el desarrollo.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

Amin N., Salam M., Asman M.J. y Baco, M.S. (2014). Isolation and identification
of endophytic fungi from cocoa plant resistante VSD M.05 and cocoa
plant Susceptible VSD M.01 in South Sulawesi, Indonesia.
Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci (2014) 3(2): 459-467

Arnold, A.E., Meja, L.C., Kyllo, D., Rojas, E.I., Maynard, Z., Robbins, N., and
Herre, E.A. (2003). Fungal endophytes limit pathogen damage in a
tropical tree. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Dec 23; 100(26): 15649
15654.

Baralt, E.A., Sosa D., Fernndez R., Prez M. S. (2012). Identificacin

preliminar de hongos endfitos cultivables presentes en hojas y frutos de
cacao. Caracas, Venezuela. Pp. 2-7.

Barnett, H. L. (Horace Leslie) & Hunter, Barry B (1998). Illustrated genera of

imperfect fungi (4th ed). APS Press, St. Paul, Minn

Crozier, J., Thomas, S. E., Aime, M. C., Evans, H. C. and Holmes, K. A. (2006).
Molecular characterization of fungal endophytic morphospecies isolated
from stems and pods of Theobroma cacao. Volume 55, Issue 6. Pages
783791.

Finch,H.C. 1974. Los Hongos Comunes que Atacan Cultivos en Amrica

Latina. Editorial Trillas.1 ed. 58,116 p.

Hanada E. R., Pomella V. A.W., Costa. H. S., Bezerra, J. L., Loguercio L. L.,
Pereira O. J. (2010). Endophytic fungal diversity in Theobroma cacao
(cacao) and T. grandiflorum (cupuacu) trees and their potential for growth
promotion and biocontrol of black-pod disease. Fungal Biology 114
(2010) 901 e 910.

Kung'u, J. 2016. How to Interpret Laboratory Results for Airborne Fungal

(Mould) Samples. Visitado en el sitio web: https://goo.gl/BZDfkX

MacQuade, A.B. 1962. Morphogenesis and Nutrition in the Mernnionella-

Stachybotrys Group of Fungi. J. gen. Microbiol. (1963), 30, 429-435

Paul B., Bala K., Gognies S., and Belarbi A. (2005). Morphological and
molecular taxonomy of Pythium longisporangium sp. nov. isolated from
the Burgundian region of France. FEMS Microbiology Letters 246 (2005)
207212
Posada, F.J., Chaves, F.C., Gianfagna, T.J., Pava-Ripoll, M. and Hebbar, P.
(2010). EStablishment of the fungal entomopathogen Beauveria
bassiana as an endophyte in cocoa pods (Theobroma cacao L.). Rev.
U.D.C.A Act. & Div. Cient. 13 (2): 71-78.

Rodrguez, G., Flores, E.J., Len, B. and Arvalo, E. (2011). Caracterizacin

morfolgica de hongos endfitos asociados a cacao nativo y su
capacidad antagnica para el control de Moniliophthora perniciosa.
Universidad Nacional de San Martn, Tarapoto, Per. Pp. 1-19.

Rubini, M. R., Silva-Ribeiro, R.T., Pomella, A. W., Maki, C.S., Arajo, W. L., dos
Santos, D.R. and Azevedo. J.L. (2005). Diversity of endophytic fungal
community of cacao (Theobroma cacao L.) and biological control of
Crinipellis perniciosa, causal agent of Witches' Broom Disease. Int. J.
Biol. Sci. 2005 1: 24-33

Snchez F. R.E., Snchez O. B.L., Monserrat S. Y.K., Bentez, A.U., Beatriz

Armendriz G. B., Garca M. M.C. and Macas R, M.L. (2013). Hongos
endfitos: fuente potencial de metabolitos secundarios bioactivos con
utilidad en agricultura y medicina. TIP Revista Especializada en Ciencias
Qumico-Biolgicas, 16(2):132-146, 2013

Talbot P.H.B. (1971) Fungi with a Sterile Mycelium or Conidia: Eumycota

Subdivision Deuteromycotina. In: Principles of Fungal Taxonomy.
Palgrave, London. pp 133-149.

Trabelsi R., Sellami H., Gharbi Y., Krid S. Cheffi M., Kammoun S., Dammak M.,
Mseddi A., Gdoura R., and Trikil, M.A., (2017). Morphological and
molecular characterization of Fusarium spp. associated with olive trees
dieback in Tunisia. 3 Biotech. 2017;7(1):28

Zhan G., Tian Y., Wang F., Chen X., Guo J., Jiao M., Huang L. and Kang Z.
(2014). A novel fungal hyperparasite of Puccinia striiformis f. sp. tritici,
the causal agent of wheat stripe rust. Northwest A&F University,
Yangling, Shaanxi 712100, P. R. China.