FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS

BIOQUMICA

PRESENTADO POR:
DANIELA RAMIREZ PATIO

GUA 2. RECONOCIMIENTO DE BIOMOLCULAS

LABORATORIO DE BIOQUMICA 502507

Consulta

1- La ecuacin de las reacciones que catalizan las enzimas a utilizar en la

prctica.

-Accin de la succnico deshidrogenasa.

De succinato a fumarato

La primera reaccin de oxidacin es catalizada por el complejo enzimtico de la

succinato deshidrogenasa, la nica enzima del ciclo que tiene como aceptor de
hidrgeno al FAD en vez de al NAD+. El FAD es enlazado de modo covalente a
la enzima por un residuo de histidina. La enzima se vale del FAD ya que la
energa asociada a la reaccin no es suficiente para reducir el NAD+. Karp PD
(2010)

Accin de la citocromo oxidasa.

Oxgeno para formar agua

4 Fe2+-citocromo c + 8 H+in + O2 4 Fe3+-citocromo c + 2 H2O + 4 H+fuera

El complejo IV o citocromo c oxidasa; EC 1.9.3.1 capta cuatro electrones de las
cuatro molculas de citocromo c y se transfieren al oxgeno (O2), para producir dos
molculas de agua (H2O). Al mismo tiempo, se translocan cuatro protones al
espacio intermembrana, por los cuatro electrones. Adems "desaparecen" de la
matriz 2 protones que forman parte del H2O. Voet JG (2004)
2-Para los rganos a utilizar mencione brevemente si su metabolismo es ms
fermentativo (anaerobio) o aerobio, tenga en cuenta el color caracterstico de
los citocromos que hacen parte de la fosforilacin oxidativa.
En el tejido muscular heptico el metabolismo es fermentativo anaerobio llega a
producir etanol, ya que si fuese aerobio llegara a formar aldehdo del acido actico.
En los primeros minutos de ejercicio intenso, la gluclisis y fermentacin lctica
constituyen una manera de adaptacin celular, permite que los msculos trabajen
anaerbicamente y representa una fuente de energa esencial hasta que los niveles
de oxgeno se repongan y pueda ocurrir la respiracin aerobia. McMurry, John
(2004)
La actividad muscular contina, la disponibilidad de oxgeno en los mitocondrias
como aceptor final de los electrones en la cadena respiratoria se convierte en un
factor limitante. Pronto se agotan las reservas de oxgeno, lo que provoca un
estancamiento de la respiracin celular y se empieza a acumular piruvato y NADH.
Para que la gluclisis pueda continuar en situaciones anaerbicas, el piruvato entra
en la va alternativa de fermentacin lctica , donde el enzima citoslico lactato
deshidrogenasa (LDH) convierte el piruvato en lactato. Este proceso es
imprescindible, ya que re oxida el NADH para que pueda volver a ser reducido en
la gluclisis. A fin de mantener tasas adecuadas de ATP en este contexto con
menos rendimiento de ATP, la gluclisis anaerbica y fermentacin lctica debe
aumentar considerablemente, acelerando an ms la sntesis de lactato. Sin
embargo, si no se recicla el lactato, rpidamente se acumulara este producto dentro
del msculo y cuando los tampones no sean suficientes para compensar el
incremento de iones de hidrgeno, se producira una acidosis. Ya que los tejidos
musculares producen ms lactato y piruvato de lo que pueden catabolizar, el lactato
entra en el plasma y es transportado hasta el hgado (6). La segunda parte del ciclo
ocurre en el hgado, donde el lactato es convertido en piruvato y luego, mediante la
gluconeognesis (7), a glucosa una vez ms. Despus, la glucosa entra en el
plasma y es transportada a los msculos, as terminando el ciclo. En esencia, la
acidosis es el precio que se debe pagar para cubrir las necesidades energticas
durante la hipoxia celular. McMurry, John (2004)

Para la el metabolismo en el tejido heptico

La coloracin de los citocromos al realizar la fosforilaxion oxidativa se tornara
osucura , La actividad del complejo citocromo C oxidasa se demuestra mediante la
oxidacin de aceptores electrnicos artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH2)
en presencia del sistema de citocromos de los complejos de la cadena respiratoria.
Esta sustancia es muy reactiva as que se condensa y polimeriza fcilmente
originando mezclas de pigmentos oscuros. (Brunori M et al 2004)
3- tabla con los valores de potencial redox para todos los componentes de la
cadena respiratoria, as como del azul de metileno y la p-fenilendiamina,
compuesto que se usarn para evidenciar la actividad de las enzimas
citocromo oxidasa y succnico deshidrogenasa.

(Jan de 1999)
Indicador Color (reducido) Color (oxidado)

Azul de metileno Incoloro Azul

Presentan un color bien definido en cada uno de sus estados de oxidacin (oxidado
o reducido) Cobb, C. E. (2004)

4- De acuerdo con el fundamento terico de la gua y la bibliografa describa

brevemente los cambios de color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina
cuando:

a- La citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa se encuentran sin

inhibidores.

la succino deshidrogenasa al encontrarse sin la presencia de los inhidores

cidos dicarboxlicos como el malonato, oxalacetato y y oxalato, puede
oxidarse y originar el fumarato removiendo dos protones y dos electrones
del succinato para esta , oxidacin esta asociada a la coenzima FAD+. La
coloracin con el azul de metileno da un tono azul. BRENDA. (2015).
La citocromo oxidasa al encontrarse sin los inhibidores puede catalizar y
reducir el oxgeno para formar agua. La oxidacin de aceptores elecronicos
como la p-fenilendiamina ayuda a demostar la actividad del complejo
citocromo C oxidasa, esta sustancia es muy reactiva en presencia del
sistema de citocromos en los complejos de la cadena respiratoria. Se
expresa formando una coloracin oscura.alvarado (2008)

b- La citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa se encuentran con los

inhibidores (cianuro, azida, malonato u oxalato).

la succino deshidrogenasa se encuentra inhibida por la presencia de cidos

dicarboxlicos como el malonato, oxalacetato y y oxalato, los cuales se unen
fuertemente al sitio activo de la enzima, situacin que genera la acumulacin
de succinato. Cuando se encuentra inhibida no se oxida y la coloracin con
el azul de metileno es incolora. BRENDA. (2015).
La citocromo oxidasa es sensible a la presencia de aceptores ms fuertes
como es el caso de in cianuro (CN-), azida (N3-), monxido de carbono (CO)
y otros inhibidores que bloquean irreversiblemente este complejo enzimtico.
Con ello se ve interrumpido el transporte electrnico y se deja de utilizar el
 O2 generando una condicin de cianosis celular. La coloracin no se torna
oscura. Alvarado (2008)

- procedimiento

Seguimiento de la reaccin
catalizada por la citocromo oxidasa.

Preparar una serie de tubos

debidamente

Dejar los tubos incubando a

37C durante 10 minutos

Agregar el extracto enzimtico

y la p-fenilendiamina

Agitar

Observar y registrar el tiempo en que

aparece el complejo coloreado, el
color final y la intensidad del color.

Tabla 1. Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa 1

Tubos

Blanco 1 2 3 4
Reactivos (mL)

Buffer fosfatos pH 7,4 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Malonato de sodio 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0
Cianuro de potasio 0,0 0,0 1,0 0,0 0,0
 Azida de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0

Agua destilada 2,0 1,0 0,0 0,0 0,0

Extracto enzimtico 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
p-fenililendiamina 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Hiptesis: se espera una coloracin oscura como muestra positiva de la reduccin

de oxgeno y la formacin de agua gracias a la la p- p-fenilendiamina que actua en
presencia del sistema de citocromos de los complejos de la cadena respiratoria.

Seguimiento de la reaccin catalizada

por la succnico deshidrogenasa

Marcar una serie de tubos

Dejar los tubos incubando a

37C durante 10 minutos

Agregar extracto
enzimtico

Agitar

Colocar el aceite mineral

anotar el tiempo en que cambia el color,

color e intensidad de color final.

Tabla 2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico

deshidrogenasa1
 Tubos
Blanco 1 2 3 4 5
Reactivos
mL
Buffer fosfato pH 7.4 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 1,0
Succinato de sodio 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
1%
Azul de metileno 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0,5
Malonato de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0
1%.
Oxalato de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0
Extracto enzimtico 1,0 0,5 1,0 1,5 1,0 1,0
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1,0

Hiptesis: se espera una coloracin azul gracias al azul de metileno que nos
evidencia el paso de la succino deshidrogenasa a fumarato.

Fichas tcnicas de seguridad

Nombre formula aspecto peligrosi Primeros eliminacio

dad auxilios n
Evacuar la
zona de
peligro.
Consultar a
un
Cristales Inhalacion: experto.
higroscpi Aire limpio, Proteccin
cos o reposo. No personal:
slido en realizar traje de
Cianuro diversas respiracin proteccin
de formas, boca a boca. qumica,
Potasio KCN de olor Administrar incluyendo
caracters Oxgeno por equipo
tico. personal autnomo
Inodoro especializado. de
seco Proporcionar respiracin.
asistencia Ventilar.
mdica. Barrer la
sustancia
derramada
e
 introducirla
en un
recipiente
seco
precintable
y
etiquetado.
Neutralizar
cuidadosa
mente el
residuo con
una
solucin
de
hipoclorito
de sodio.
Eliminarlo a
continuaci
Suministar Depositar
aire fresco. Al en lugar
haber especial
trastornos para
Polvo consltese al desechos.
Sodio NaOOC - CH2 - cristalino, mdico. Tras
Succinato CH2 - COONa . blanco ingestin: Co
6H2O
inodoro nsultar un
mdico si
algunos
trastornos
persisten.
Inhalacion: Barrer la
Aire limpio, sustancia
reposo, derramada
posicin de e
Cristales, semiincorpora introducirla
entre do y someter en un
blancos a recipiente,
y atencin recoger
P- C6H8N2/C6H4( ligeramen mdica. cuidadosa
fenilendia NH2)2 te rojos, mente el
mina vira a residuo, y
oscuro trasladarlo
por a
exposici continuaci
n al aire n a un lugar
seguro.
 (Proteccin
personal
adicional:
respirador
de filtro P2
para
partculas
nocivas
Azul de C16H18 Aspecto: Por ingestin Depositar
metileno ClN3SxH2O Slido de grandes en lugar
Color: cantidades: especializa
verde Irritaciones en do para
oscuro vas urinarias. residuos de
con lustre No se este
broncead descartan caractre en
o otras el
Granulom caracterstica laboratorio.
etra Olor: s peligrosas.
Inodoro Observar las
precauciones
habituales en
el manejo de
productos
qumicos
Evitar su ateriales
liberacin al peligrosos
medio muy
ambiente.: EN txicos,
CASO DE combustibl
Asida de NaN Solido,bla exposicin es, txicos
sodio nco manifiesta o agudos
inodoro. presunta: Cat. 1 y 2
Llamar
inmediatamen
te a un
CENTRO DE
TOXICOLOG
A o a un
mdico.
EN CASO DE Depositar
CONTACTO en lugar
CON LOS espezialida
OJOS: do en ele
Aclarar laboratorio
Liquido cuidadosame para
Malonato C7H12O4 incoloro nte con agua sustancias
 durante varios con esos
minutos. caracteres.
Quitar las
lentes de
contacto, si
lleva y resulta
fcil. Seguir
aclarando.
P337+P313:
Si persiste la
irritacin
ocular:
Consultar a un
mdico.
Depositar en
desechos
organicos
especial del
Aceite laboratorio.
mineral aceite
Bibliografa
McMurry, John (2004) Elmhurst College 190 Prospect Avenue Elmhurst,
Illinois 60126-3296 (630) 279-4100 or (630) 617-3500 consultado mayto 4
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51871/Ma