"Ao de la consolidacin del Mar de

Grau"

FACULTAD : Ciencias Agropecuarias

CARRERA : Ing. Agroindustrial
DOCENTE : Jess Alexander Sanchez Gonzalez
CURSO : Biotecnologa de los PAI
CICLO : IX
ALUMNO : Abanto Oblitas Carlos No

GUADALUPE-2016
DETERMINACION DE BIOMASA:
RECUENTO MICROSCPICO EN
CMARA DE NEUBAUER.
 I. OBJETIVOS

o Comprender el uso y lectura por cmara de Neubauer.

o Determinar la concentracin de microorganismos utilizando la cmara de
Neubauer en el microscopio.
o Determinar la desviacin estndar, promedio y coeficiente de variacin
de la muestra a analizar.

II. FUNDAMENTO TEORICO

En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el nmero de

microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado
en estudio de curvas de crecimiento, anlisis de alimentos, preparaciones de
inculos para fermentacin, etc.
Un parmetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de
agroindustriales dedicadas a procesos de fermentacin, panificacin entre otros
en donde se utilicen inculo es la concentracin de biomasa. Biomasa es un
trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema.
Existen muchas maneras de medir la concentracin de biomasa, como por ejemplo
masa, volumen, extensin linear de filamentos, dispersin de luz, conteo de
clulas u organelas. Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero de
microorganismos o peso (biomasa) de clulas microbianas en un cultivo; los
mtodos pueden ser directos indirectos. Entre los directos se puede mencionar a
la determinacin de peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer.
El mtodo de cuenta directa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y
econmico, aunque no se pueden distinguirlas clulas viables y no viables. Se
puede calcular el nmero de microorganismos en una muestra a partir del volumen
de la cmara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo,
tiene el inconveniente de que la observacin y cuantificacin se dificultan en
clulas muy pequeas (1 5 m) o en poblaciones de baja densidad debido al
pequeo volumen de muestra que se utiliza (0.1 0.2 mm3).
III. MARCO TEORICO

A. Cmara de Neubauer

La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio

de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con
una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es
un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas
de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1
milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida
0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un
cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el
volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.
Para contar las clulas de un cultivo lquido, se agrega una gota de este
entre estas dos placas y observar al microscopio ptico la cantidad de
clulas presentes en un campo determinado de las grilla.

Figura 1. Cmara de Neubauer.

 Figura 2. Manipulacin de la cmara de Neubauer.

B. Conteo en cmara de Neubauer

1. Colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos de la cmara e introducir

entre ambos la muestra celular previamente preparada. Debe evitarse que
la muestra rebalse, si esto sucede las clulas a contar tambin se perdern.

2. La velocidad de llenado de la cmara debe ser homognea, evitando as

una mala distribucin de las clulas en el preparado que traer aparejado
errores en el recuento.
 3. La muestra no debe secarse, por lo tanto es recomendable guardar la
cmara de Neubauer cargada dentro de una cmara hmeda para que
sedimenten las clulas.

4. Luego se coloca la cmara en un microscopio ptico y se procede al

conteo, eligiendo para ello los cuadrados apropiados.

5. Se elegir un criterio para definir qu clulas se cuentan y cules no,

cuando las mismas quedan sobre uno de los bordes del cuadrado.

6. Una vez contadas las clulas se calcula la concentracin en la muestra

original, considerando: la dilucin de la muestra hecha para el sembrado,
la cantidad de cuadrados considerados, el nmero de clulas contadas y el
volumen de muestra debajo de cada cuadrado.

Ejemplo de clculo en cmara de Neubauer

Figura 3. Conteo realizado en el retculo de Thoma.

A. Se obtendr el promedio de clulas. =10 clulas X

B. Las dimensiones del retculo ser: 0.2x0.2x0.1.
 10 (0.20.20.1)3

1000 mm3

10000
=
(0.2)(0.2)(0.1)

= 2.50 + 6 /

Frmula para reducir el clculo:

=

0.2 0.2 0.13 103
3

Donde:

D= dilucin de la muestra

IV. MATERIALES Y METODOLOGIA

A. Materiales
Pipetas
Lamina cubre objetos
Tubos de ensayo
Gradilla
Agua
Levadura

B. Equipos
Microscopio
Cmara de Neubauer

C. Metodologa

1) Colocar agua estril ms la muestra de levadura. Luego se

realizara diluciones 10-1 y 10-2.
 Figura 4. Diluciones para conteo en cmara de Neubauer.

2) Colocar la lmina cubreobjetos sobre la zona central de la Cmara

de Neubauer.
3) Con una pipeta tomar una determinada cantidad de la muestra 10-
1 y colocar en el borde del cubreobjetos de manera que el lquido
entre por capilaridad sin que se formen burbujas en la cmara.
4) Llevar la cmara al microscopio, localizar en el campo visual el
cuadrante central, enfocar de tal forma que se observen
ntidamente los cuadrantes y luego se pasa al objetivo 40x.
5) El recuento se determina sumando el total de clulas presente en la
cmara y calculando su promedio (X). El nmero promedio de
clulas nos ayudara a determinar la concentracin de clulas en
suspensin por mililitro de la muestra original.
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Concentracin: 0.05g/ml
Tabla 1. Conteo de Clulas en Cmara Neubauer
Conteo de Clulas en 25 celdas, en Cmara Neubauer
Filas n7 n9 n13 n17 n19 Prom. Desvi.
1 9 10 10 14 8
3 3 7 12 10 9
6 8 10 14 10 11
11 8 15 12 4 12
14 12 8 10 6 7
16 10 11 6 9 5
Promedio 8.3 10.2 10.7 8.8 8.7 9 1.021
Desvi. 3.0 2.8 2.7 3.5 2.6
CV 0.36 0.27 0.26 0.39 0.30

Tabla 2. Concentracin de las clulas, Desviacin estndar y coeficiente de Variacin

7 + 9 + 13 + 1719
=
= 9 ;
Concentracin de 5

clulas 233 2
. = 9 25 =
= 23333
1
110

Desviacin estndar 1.021

Coeficiente de 1.021
= = 0.11
Variacin 5

Tabla 3. Total de Clulas por ml

Concentracin de Clulas Totales

2333 103 3
= ( ) = 5.83 108 /
(0.2 0.2 0.1)3 1
 Concentracin: 0.08g/ml

Tabla 1. Conteo de Clulas en Cmara Neubauer

Conteo de Clulas en 25 celdas, en Cmara Neubauer
Filas n7 n9 n13 n17 n19 Promed Desvi.
1 19 17 15 26 25
3 23 16 16 22 26
6 18 19 23 26 23
11 22 22 15 24 21
14 20 24 24 28 28
16 20 17 20 23 30
Promedio 20.33 19.17 18.83 24.83 25.50 21 3.1920
Desvi. 1.86 3.19 4.07 2.23 3.27
CV 0.09 0.17 0.22 0.09 0.13

Tabla 2. Concentracin de las clulas, Desviacin estndar y coeficiente de Variacin

7 + 9 + 13 + 1719
=
= 21 ;
5
Concentracin de
clulas
543
2
. = 2125 =
= 54333
1101

Desviacin estndar 3.1920

Coeficiente de 3.190
= = 0.15
Variacin 21

Tabla 3. Total de Clulas por ml

Concentracin de Clulas Totales

4533 103 3
= ( ) = 1.36 109 /
(0.2 0.2 0.1)3 1
 Concentracin: 0.15g/ml

Tabla 1. Conteo de Clulas en Cmara Neubauer

Conteo de Clulas en 25 celdas, en Cmara Neubauer
Filas n7 n9 n13 n17 n19 Promed Desvi.
1 30 42 31 23 30
3 32 38 35 33 32
6 44 46 43 34 24
11 28 48 47 30 31
14 31 40 39 40 22
16 33 34 42 33 38
Promedio 33.0 41.33 39.50 32.17 29.50 35 5.064
Desvi. 5.66 5.16 5.79 5.56 5.79
CV 0.17 0.12 0.15 0.17 0.20

Tabla 2. Concentracin de las clulas, Desviacin estndar y coeficiente de Variacin

7 + 9 + 13 + 1719
=
= 35 ;
5
Concentracin de
clulas
8782
. = 3525 =
= 87753
1
110

Desviacin estndar 5.064

Coeficiente de 3.190
= = 0.14
Variacin 35

Tabla 3. Total de Clulas por ml

Concentracin de Clulas Totales

8775 103 3
= ( ) = 2.19 109 /
(0.2 0.2 0.1)3 1
 Concentracin: 0.02g/ml

Tabla 1. Conteo de Clulas en Cmara Neubauer

Conteo de Clulas en 25 celdas, en Cmara Neubauer
Filas n7 n9 n13 n17 n19 Promed Desvi.
1 9 5 7 3 7
3 6 10 9 5 6
6 4 7 8 7 5
11 6 8 8 13 4
14 7 7 7 10 5
16 6 2 10 7 6
Promedio 6.33 6.50 8.17 7.50 5.50 6.5 1.0435
Desvi. 1.63 2.74 1.17 3.56 1.05
CV 0.26 0.42 0.14 0.48 0.19

Tabla 2. Concentracin de las clulas, Desviacin estndar y coeficiente de Variacin

7 + 9 + 13 + 1719
=
= 7 ;
5
Concentracin de
clulas
163
2
. = 6.525 =
= 16253
1
110

Desviacin estndar 1.0435

Coeficiente de 1.0435
Variacin = = 0.16
7

Tabla 3. Total de Clulas por ml

Concentracin de Clulas Totales

1625 103 3
= ( ) = 4.06 108 /
(0.2 0.2 0.1)3 1
 Concentracin (g/ml) (cel./ml)
0.15 2.19E+09
0.08 1.36E+09
0.05 5.83E+08
0.02 4.06E+08

2.50E+09

2.00E+09

1.50E+09

1.00E+09
y = 1E+10x + 5E+07
5.00E+08 R = 0.9681

0.00E+00
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

Segn (Unam, 1986), en la tcnica de conteo de clulas hay que tener en cuenta
que en esta tcnica uno de los factores que afecta la observacin de las clulas de
levadura es la correcta dilucin de la muestra empleada, se puede decir que si
durante el conteo se observan aproximadamente 69 clulas la muestra se
encuentra muy concentrada, mientras que si se observan menos de 20 clulas, la
muestra se encuentra muy diluida. Comparando la informacin con los datos
obtenidos en nuestra prctica podemos ver que la mayora de nuestras diluciones
fueron concentradas.
Segn (Valencia, 2001), la desviacin estndar es el promedio con respecto de la
media aritmtica, dice cuanto tienden a alejarse de los valores puntuales del
promedio en una distribucin. El coeficiente de variacin indica un mtodo de
comparacin de datos que tienen medidas de media diferentes o unidades
diferentes.
Segn (Madigan, 1998), mediante el mtodo de conteo directo en cmara de
Neubauer se debe utilizar frmulas que expresen la concentracin de clulas,
mostrando diferencia a la utilizada para el recuento de levaduras en laboratorio.
Esto podemos ver en los datos que hallamos en la tabla 2 donde determinamos la
concentracin de clulas, desviacin estndar y coeficiente de variacin, del
mismo modo en la tabla 3 hallamos lo mismo para celdas al azar, de este modo
pudimos determinar la diferencia de levaduras en el laboratorio.
 Segn (Arniz, Isac, & Lebrato, 2000), los mtodos clsicos de determinacin d
biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o en el peso
celular. Los mtodos de enumeracin celular, son mtodos de observacin,
basados en propiedades fsicas o en la actividad metablica especfica, estos no
requieren de examen visual de los organismos ni su incubacin.

VI. CONCLUSIONES

Se logr comprender el cmo usar y leer atraves de la cmara de Neubauer.

Se pudo tambin hallar la concentracin de microorganismos en las
muestras utilizando la cmara de Neubauer.
Finalmente se logr cumplir con todos los objetivos de la prctica,
determinando para cada una de las muestras la desviacin estndar,
promedio y el coeficiente de variacin.

VII. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Arniz, Isac, & Lebrato. (2000). Determinacion de la Biomasa en procesos Biologicos. Sevilla -
Espaa.

Madigan. (1998). Biologia de los Microorganismos . En Madigan, Biologia de los

Microorganismos (pgs. 155-156). Espaa: Prentice Hall.

Unam. (1986). Biologia Celular. En Unam, Manual de practicas (pgs. 20-28). Mexico.

Valencia. (2001). Manual de practicas de Microbiologia Basica. En Valencia, Manual de

practicas de Microbiologia Basica. Colombia.