Morte Celular

Tipos de morte celular:
Necrose e Apoptose
Biologia Celular e Molecular, 2008/2009

Objectivos:
Definir o papel da morte celular em biologia, tanto
fisiolgica quanto patologicamente.
Exemplificar a sua funo no desenvolvimento
embrionrio, na organognese, na renovao de clulas,
na regresso de tumores e ainda em processos
neurodegenerativos
Definir necrose.
Listar alguns tipos de necrose e caracterizar as diferentes
alteraes celulares.
Definir a apoptose.
Identificar e descrever as diferentes vias apoptticas.
Biologia Celular e Molecular (1 semestre - 1 ano, 2008-2009) Ciclo Bsico de Medicina e Medicina Dentria Sandra Morais Cardoso
Homeostase de um organismo
multicelular
Controlada por: Proliferao Diferenciao Morte Celular
Remoo activa de clulas indesejveis a uma comunidade social
Controlo social da comunidade
Sobrevivncia do organismo
Longevidade das clulas
210 tipos de clulas diferentes
Cerca de 5x1011 de clulas de sangue morrem por dia
Os neutrfilos vivem 6-7 h na circulao
Em clulas incapazes de receber sinais de sobrevivncia e/ou
capazes de receber sinais de morte
Em clulas que no podem reparar uma leso adequadamente
Perda do contacto c/ membrana basal - ANOIKIA (Loss of Home)
Hormonas, citocinas (TNF),

Radiao, citostticos
Activao de um programa gentico de suicdio
Morte celular em diferentes processos
biolgicos
Desenvolvimento embrionrio
Ex: Formao dos dedos
Sindactilia
Morte celular patolgica
Doenas degenerativas
Actividade Dopaminrgica
Evoluo da perda neuronal num doente de
Parkinson
Cancro
Necrose:
Morte acidental das clulas ou de um tecido, por
causas fisiolgicas (isqumia, isto , obstruo
arterial), traumatismos graves ou agentes
infecciosos (fungos, bactrias e vrus)
Processo passivo (independente de ATP)

Caracterizado por uma destruio massiva da clula:
-Colapso da membrana plasmtica e por conseguinte das membranas
dos organelos
-Libertao dos componentes intracelulares
-Geralmente, os restos celulares so difceis de serem fagocitados, por
falta de emisso de sinais, pelas clulas do sistema imunolgico !
inflamao
Exemplos de doenas onde a necrose est envolvida:
Peste bubnica (peste negra)
Pandemia que, no sculo XIV (Idade
Mdia), assolou a Europa e dizimou cerca
de 25 a 75 milhes de pessoas (1/3 da
populao).
Doena infecciosa causada pela Yersinia
pestis, bactria transmitida ao homem
pelas pulgas dos ratos-pretos (Rattus
rattus) ou outros roedores.
Estas bactrias (bacilos) invadem os
ndulos linfticos que ficam
inflamados, necrticos e
hemorrgicos.
Doena Vascular
Acidente Vascular Cerebral:
interrupo da irrigao sangunea (oxignio e glicose) numa regio do

crebro ! perda da funo neuronal;
Existem dois tipos:

Isqumico: falta de irrigao
Hemorrgico: ruptura de um vaso
sanguneo intracraniano
Factores de risco para AVC:

Hipertenso,
Aterosclerose,
Diabetes,
Colesterol elevado,
Tabagismo,
lcool,
Problemas cardacos
Doena Vascular
Gangrena: a necrose de um tecido por isqumia, ou
seja, devido a uma obstruo arterial, por embolia,
choque, infeco, ou por exposio a frio intenso
! 1. perda do fornecimento de
oxignio e outros nutrientes
! 2. invaso bacteriana
! 3. putrefaco do tecido
Gangrena devido a uma lcera diabetica
Necrose - eventos celulares
http://www.youtube.com/watch?v=g4tlx2W8ssY
O que a Apoptose
Apoptose ou Morte Celular
Programada um modo de
"autodestruio celular" que
requer energia e sntese
proteica, exercendo o papel
oposto ao da mitose
Apoptose
Condies fisiolgicas
Desenvolvimento embrionrio - Metamorfose

- Morfogenese
- Sinaptogenese
Adulto - Normal turnover celular

- Seleco tmica negativa
negativa
- Citotoxicidade mediada por clulas
Regulao defeituosa - Doenas
Cancro, doenas autoimunes
Doenas neurodegenerativas, SIDA, osteoporose, envelhecimento
Fases da apoptose
A mitocndria controla a deciso para a morte celular

Receptores Membranares
Apoptticos
(Famlia TNF/NGF)
Domnio Apopttico Insultos Celulares

(comp. citotxicos, radiao,
Molcula
choque trmico, privao de
Adaptadora
Pr-Caspase-8 Citocromo c factores de crescimento)
Caspase-8 Apoptossoma
Pr-Caspase-9
Caspase-9
RE
Pr-Caspase-4 Caspase-3 Caspase-7

Insultos ao RE
Caspase-6 Caspase-2
(Tapsigargina)
Caspase-4
Condensao e
Fragmentao do
ADN
Ncleo
Morte da Clula
Via membranar ou
extrnseca
Via mitocondrial ou intrnseca
Libertao de Citocromo c da Mitocndria
Ruptura no Especfica da
Membrana Mitocondrial
Externa
A) Formao de um megacanal
mitocondrial no selectivo de A
elevada condutncia
(PTP: ANT + VDAC + Ciclofilina D)
![Ca2+], ROS, !"#m,
Bax, !pH, Pi,
$[nucle
nucletidos adenina]
Bax
tBid
B C D
Formao de Canais
Condutores de Citocromo c
Funo Mitocondrial Preservada

(Importante para o processo de (Desagher & Matinou, 2000)
activao das caspases)
Via mitocondrial ou intrnseca
Morte celular por apoptose
Protena
Pro-apopttica
Protenas
Anti-apoptticas
Protenas que promovem ou suprimem a
apoptose
Pr-apoptticas Funo
Caspases Clivagem de enzimas, citosqueleto e canais inicos
Bax, Bad Formao de poros, libertao de Cit c
Receptores do glutamato Influxo de Ca2+, activao de cinases e proteases
Fas Inicia cascata da morte/caspase-8
Par-4 Disfuno mitocondrial, inibio NF-kB
p53 Transcrio genes de morte, aumento de aco da Bax
Anti-apoptticas
Bcl-2, Bcl-XL Estabiliza funo mitocondrial, antioxidante
IAPs Inibio das caspases
Factores trficos/Citoquinas Expresso de enzimas antioxidantes, protenas
reguladoras de Ca2+, IAPs, Bcl-2
Telomerase Previne o encurtamento dos telmeros
Enzimas antioxidantes Reduz o stresse oxidativo
Protena cinase C% Estimula a expresso de NF-kB
Protenas que ligam Ca2+ Homeostase de Ca2+
APOPTOSE
Activao de Caspases
(cysteine-aspartic proteases)
&
Activao de endonucleases
&
Fragmentao do DNA
Apoptose: eventos celulares
http://www.youtube.com/watch?v=witLM-V2v8
Anlise da Apoptose
Anexina
Br-dUTP
TUNEL
Imunohistoqumica
Funo mitocondrial
Microarrays
Anexina
PI Annexin V
So protenas que ligam fosfolipidos na presena de clcio

As alteraes celulares que ocorrem durante o processo apopttico
incluem a perda da assimetria dos fosfolpidos numa fase inicial
Os conjugados de Anexina V so utilizados para se detectar clulas
apoptticas
Utiliza-se a Anexina V marcada fluorescentemente (Citometria de fluxo,
microscopia de fluorescncia e confocal)
DNA Laddering
Degradao do ADN genmico em fragmentos de 180-200 pb

A fragmentao cria locais 3-OH
Estes locais podem ser marcados com Br-dUTP (bromodeoxiuridina
trifosfato)
Pela aco da TdT (transferase terminal)
Microarrays
Anlise da expresso gnica diferencial

Genes agrupados em famlias de genes
N total de genes envolvidos na apoptose: 198
Apoptose na clnica
Seres humanos tm aproximadamente 1014

clulas
-Capazes de entrarem em apoptose
O processo apopttico pode ficar comprometido

-Pode resultar numa morte celular inapropriada dando origem a doena
Potencial uso teraputico

-Modulao da apoptose para o tratamento de doenas
Factores Genticos e Ambientais podem
desencadear a apoptose:
Disorder Genetic factors Environmental factors
AD APP, Presenilin mutations, ApoE Head trauma, low education, calorie intake
PD '-synuclein, parkin mutations Head trauma, toxins, calorie intake
HD Poly-CAG expansions in huntingtin
ALS Cu/Zn-SOD mutations Toxins, autoimmune response
Doena de Alzheimer
* Doena neurodegenerativa que ocorre tardiamente:
- clinicamente ( decrscimo progressivo da capacidade cognitiva
- primeiro sintoma da DA ( declnio da memria recente
* Estadio inicial da DA: Alterao do citosqueleto por hiperfosforilao anormal
da protena tau (neurnios piramidais corticais)

- A tau fosforilada dissocia-se dos microtbulos ( filamentos
insolveis
* Cortex cerebral de doentes de DA: depsitos extracelulares de b-amilide (Ab,
)4 kDa); Ab - produto minoritrio do metabolismo da APP
Evidncias de morte celular por apoptose:

- decrscimo Bcl-2 em neurnios contendo tranas neurofibrilhares
- aumento dos nveis de Bax (obs. antes da clivagem do ADN)
- abertura PTP; libertao citocromo c; activao de caspases
Gostaria de no ficar inutilizada e se possivel melhorar
(Escrito por um doente de Alzheimer)
Doena de Poliglutaminas
Causadas por repitio do codo CAG, que codifica a glutamina
Disease Gene name Chromosomal Pattern of Protein Normal repeat Disease repeat
location inheritance length length
Spinobulbar AR Xq1321 X-linked recessive androgen receptor 936 3862
muscular atrophy (AR)
(Kennedy disease)
Huntington disease HD 4p16.3 autosomal dominant huntingtin 635 36121
Dentatorubral- DRPLA 12p13.31 autosomal dominant atrophin-1 635 4988

pallidoluysian
atrophy (Haw River
syndrome)
Spinocerebellar SCA1 6p23 autosomal dominant ataxin-1 644 3982
ataxia type 1
Spinocerebellar SCA2 12q24.1 autosomal dominant ataxin-2 1531 3663
ataxia type 2
Spinocerebellar SCA3 14q32.1 autosomal dominant ataxin-3 1240 5584
ataxia type 3
(Machado-Joseph
disease)
Spinocerebellar SCA6 19p13 autosomal dominant '1A-voltage- 418 2133
ataxia type 6 dependent calcium
channel subunit
Spinocerebellar SCA7 3p1213 autosomal dominant ataxin-7 435 37306
ataxia type 7
Spinocerebellar SCA17 6q27 autosomal dominant TATA binding 2542 4563
ataxia type 17 protein
Mecanismos
celulares
Biologia da Protelise:
Autofagia e Sistema Ubiquitina
Proteassoma
Biologia Celular e Molecular, 2008/2009

Objectivos:
Descrever o processo autofgico e relacionar este
processo com a doena.
Descrever autofagia celular como a chave para o
desenvolvimento de novos tratamentos contra o cancro,
doenas degenerativas e infeces.
Descrever o papel dos lisossomas na funo celular.

Identificar as doenas associadas disfuno dos
lisossomas.
Definir o papel do sistema ubiquitina-proteassoma na

funo celular.
Identificar as doenas associadas disfuno do
proteassoma.
ENDOPLASMIC RETICULUM (ER) Nuclear envelope
Nucleolus NUCLEUS
Rough ER Smooth ER
Chromatin
Flagelium
Plasma membrane
Centrosome
CYTOSKELETON
Microfilaments
Intermediate filaments
Microtubules Ribosomes
Microvilli
Golgi apparatus
Peroxisome
Lysosome
Mitochondrion
Lisossomas: compartimentos
Digestivos
Lisossoma
um organelo membranar do citosol das clulas
Contem vrias enzimas hidrolticas
Tem um pH de 4.5 a 5.5
Tem como funo a digesto intracelular
Digestivos
As enzimas do lisossoma so as hidrolases
Peptidases
DNAases
RNAases
Lipases
Fosfatases
Glucosidases
Carboxilases
Sulfatases
Esterases
Existe uma hidrolase para cada tipo de biomolcula
Digestivos
nucletidos
H+
Bomba de protes
glucose
H+ H+
H+
Transportadores
H+ membranares
Glicoprotenas que protegem

contra a hidrlise aminocidos
Funo dos lisossomas
Fagocitose: processo pelo qual as clulas internalizam material do
meio extracelular (<0.5 !m) que depois digerido pela aco do
lisossoma. Ex: macrofagos
Autofagocitose ou autofagia: processo pelo qual as clulas degradam

organelos velhos ou danificados
Endocitose mediada por receptores: processo pelo qual as clulas

que tem determinados receptores tomam determinadas
macromolculas. Ex: hormonas, anticorpos, lipoprotenas
Digesto intracelular
Nucleus 1 m
Fagocitose
Lysosome
Lysosome contains Food vacuole Hydrolytic

active hydrolytic fuses with enzymes digest
enzymes lysosome food particles
Digestive
enzymes
Lysosome
Plasma membrane
Digestion
Food vacuole
(a) Phagocytosis: lysosome digesting food
Autofagocitose Fagocitose
Doenas associadas aos lisossomas
Aspartylglucosaminuria Morquio A Disease
Batten Disease Morquio B Disease
Cholesterol Ester Storage Disease Mucolipidosis IIIC
Cystinosis Mucolipidosis IV
Danon Disease Mucopolysaccharidosis IX
Fabry Disease Multiple Sulfatase Deficiency
Farber Disease Neuronal Ceroid Lipofuscinosis
Fucosidosis Niemann-Pick Disease A, B, C1, and C2
Galactosialidosis Northern Epilepsy
Gaucher Disease Pompe Disease
GM1 Gangliosidosis Pseudo-Hurler Polydystrophy (mucolipidosis
GM2 Gangliosidosis (AB Variant) IIIC)
Hunter Disease Pycnodysostosis
Hurler Disease Salla Disease
Hurler-Scheie Disease Sandhoff Disease
I-Cell Disease (mucolipidosis II) Sanfilippo disease A, B, C, and D
Infantile Free Sialic Acid Storage Santavuori-Haltia disease
Disease Scheie Disease
Jansky-Bielschowsky Disease Schindler Disease
Krabb Disease Sialidosis
Kuf Disease Sly disease
Mannosidosis Sphingolipid Activator Protein Deficiency
Maroteaux-Lamy Disease Tay-Sachs Disease
Metachromatic Leukodystrophy Wolman Disease
Sistema Ubiquitina-Proteassoma:
processo de degradao proteica
Ubiquitinao
Marcao da protena alvo a uma cadeia de
poliubiquitina
Direciona estas protenas para o proteassoma
Proteassoma
um complexo multienzimtico que degrada
protenas
Estas enzimas so proteases
Via da Ubiquitinao
E2, conjugadora
da ubiquitina
E1, activadora da
ubiquitina
E3, ligase da
4 monomeros de ubiquitina
ubiquitina
Translocao de protenas marcadas
DUB: Enzimas que desubiquitinam ou so proteases especficas para a ubiquitina;

ambas removem a ubiquitina das proteinas alvo, impedindo a sua degradao
Protelise
A subunidade 20S do proteassoma tem 3 subunidades catalticas com diferentes

especificidades para o substracto:
-Quimiotripsina-like
-Tripsina-like
-PHGH-like (peptidyl-glutamyl peptide-hydrolyzing)
O resultado da protelise so polipeptdeos de 4 a 25 resduos
Via de degradao
Essencial para muitos Produtos da degradao:

processos celulares:
Pequenos peptdeos
Ciclo celular-mitose Factores de transcrio activos-NFkB
Expresso gnica Reguladores do ciclo celular activos-
Respostas ao stress oxidativo p53
Apoptose
Funo do Proteossoma
http://www.youtube.com/watch?v=w2Qd6v-4IIc
Disfuno do proteossoma
Inibio
Actividade anti-tumural
Reduo das leses da psoriase
Efeito positivo na asma
Doenas associadas ao
proteossoma
Directamente: Duas formas familiares de
Parkinson:
Mutao no gene da parkina (ligase E3 da ubiquitina)

Mutao no gene da UCHL1 (terminal carboxilico da hidrolase 1 da
ubiquitina)
Indirectamente: Doena de Parkinson

Doena de Creutzfeldt-Jakob
Doena de Huntington
Doena de Parkinson
Afecta 1-2 % da populao >65 anos
Espordica ou familiar
Marcadores Neuropatolgicos:
- Morte dos neurnios dopaminrgicos na substantia nigra pars compacta
seguida de perda da inervao dopaminrgica do striatum
- Corpos de Lewy ('-sinuclena agregada)
Caracterstica clnicas:
- distrbios extrapiramidais : bradicinsia, tremor de repouso, rigidez
Kuru
Doena neurolgica descoberta em 1950 no povo Fore da Papua Nova Guin
Tipo de encefalia espongiforme
Sintomas: tremores
Doena Creutzfeldt-Jakob
Afecta 1-1000000 de indivduos
Idade mdia de incio 50 anos
Sintomas:
perda de memria, tremores, desordem na marcha, postura rgida e ataques
epilpticos devida uma rpida perda de clulas cerebrais causada por uma
protena transmissvel chamada prio
Doena de Hungtinton
Doena de Hungtinton
Idade mdia de incio: 40-50 anos (tb alguns casos de ocorrncia

juvenil)
Morte dos doentes aps 10-20 anos
Autossmica dominante (1:10000 indivduos)
Marcadores Neuropatolgicos:
- Morte dos neurnios ao nvel do estriado, envolvido na iniciao dos
movimentos voluntrios, e do cortex cerebral
Caracterstica clnicas:
- Movimentos involuntrios, frequentes e rpidos,
- Reduo da funo cognitiva e demncia progressiva distrbios
Lysosome containing
two damaged organelles
1m Autofagia
um processo catablico que
Mitochondrion
envolve a degradao de
fragment
componentes celulares atravs da
Peroxisome
fragment
maquinaria do lisossoma
Permite manter a homeostase celular, entre a sntese e a degradao

de produtos celulares
Tipos de autofagia
Macroautofagia
Caracteriza-se pela sequestrao de organelos ou de protenas numa vescula
membranar- autofagossoma- que posteriormente funde com o lisossoma
autofagolisossoma- sendo o seu contedo degradado por hidrolases
lisossomais
Tipos de autofagia
Microautofagia
Ocorre quando os lisossomas engolem partes do citoplasma
H+
H+
Tipos de autofagia
Desde o principio
Autofagia: visualizao por M.E.
Funes da autofagia
Privao de nutrientes
Durante o jejum prolongado, os nveis de autofagia aumentam: !
degradao de componentes celulares no vitais e, consequentemente, !
libertao de nutrientes para a prpria clula ! processo de sobrevivncia,
adaptativo, da clula e do organismo.
Infeco
Quando as clulas so infectadas por determinadas bactrias, o processo
autofgico activado como forma de as eliminar.
Morte celular autogfica (autophagic cell death)

Morte celular tipo II
Regulao da autofagia
Estimulam a autofagia TOR-Regulador da autofagia
Inibem a autofagia
Como que a autofagia mata uma clula?
Autofagia massiva (Morte celular tipo II)
Durante este processo ocorre a destruio de largas pores de citosol e de

organelos, causando uma irreversvel atrofia celular, induzindo o colapso da
funo celular.
Autofagia activa a Apoptose (Morte celular tipo I)
A autofagia desenvolve-se como a primeira resposta ao estimulo (stress) e s

depois activa a apoptose que vai ser responsvel pela morte celular
A relao entre a autofagia e a apoptose
Interaco entre a autofagia e a apoptose
Doenas associadas
Indirectamente: Doena de Parkinson

Doena de Alzheimer
Doena de Huntington
Cancro
SIDA
Doena de Parkinson
HIV-SIDA
A SIDA provocada pelo vrus da imunodeficincia humana (human
imunnedeficiency virus, HIV), podendo a sua transmisso ocorrer por:
relaes sexuais,
contacto com sangue infectado (por exemplo, transmisso de me para filho
durante a gravidez ou durante o parto),
amamentao (transmisso de me para filho).
A SIDA matou mais de 20 milhes de pessoas nos ltimos 20 anos.
Ao atingir o sistema sanguneo do organismo humano, o VIH comea de

imediato a reproduzir-se nos linfcitos T4 (clulas CD4+) conduzindo-os
sua morte.
Sob a aco do vrus, a funo de defesa do organismo fica enfraquecida; a

pessoa infectada, ou seropositiva, torna-se mais vulnervel infeco por
outras bactrias e vrus ! doenas oportunistas: so exemplos as formas
raras de pneumonia, toxoplasmose, candidose, meningite criptoccica e
cancros, como o Sarcoma de Kaposi.
HIV-SIDA
No incio ! infeco aguda (at quatro semanas aps o contgio)
O indivduo infectado manifesta vrios sintomas pouco caractersticos,
semelhantes aos de uma gripe;
O vrus continua-se a multiplicar, podendo o indivduo ser seropositivo e

no apresentar quaisquer sintomas por um perodo de tempo longo
(exemplo, 15 anos);
O organismo j no consegue repor completamente a quantidade de
clulas CD4+ destrudas pelo vrus; esta fase caracteriza-se por uma
imunodepresso moderada, com sintomas e sinais associados:
emagrecimento, suores nocturnos, diarreia prolongada e febre;
O indivduo seropositivo passa a desenvolver a doena SIDA quando
as clulas CD4+ baixam para valores inferiores a 200 celulas por mililitro
de sangue, ficando o organismo desprotegido ! infeces e/ou doenas
oportunistas.
HIV-SIDA
HIV-SIDA
Cancro
Cancro
Bibliografia
Papers:
- Kanduc D et al. Cell death: apoptosis versus necrosis (review). Int J Oncol, 21: 165-170 (2002)
Klionsky DJ. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in

less than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 931-937 (2007).
Ravikumar B, Rubinsztein DC. Role of autophagy in the clearance of mutant
huntingtin: a step towards therapy? (Review) Mol Aspects Med, 27: 520-527
(2006).
Espert L et al. Autophagy and CD4+ T lymphocyte destruction by HIV-1
(Review). Autophagy. 3: 32-34 (2007).
- Karantza-Wadsworth V, White E. Role of autophagy in breast cancer.
Autophagy. 3: 610-613 (2007)
Kanduc D et al. Cell death: apoptosis versus necrosis (review). Int J Oncol,
21: 165-170 (2002)
Maiuri MC et al. Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy
and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 741-752 (2007)
Thorburn A. Apoptosis and autophagy: regulatory connections between two
supposedly different processes. Apoptosis (in press, 2008)
Livros:
- Alberts et al. Cell Biology: Chapter 18
Biologia das clulas estaminais:
Terapias Celular e Gnica
Biologia Celular e Molecular 2008/2009

Objectivos:
Definir o que so clulas estaminais.
Identificar os diferentes tipos de clulas estaminais.
Explicar o cancro como uma doena das clulas estaminais.
Analisar a aplicabilidade da terapia celular na prtica clnica.

-Doenas autoimunes
-Diabetes
-Doenas Neurodegenerativas
Descrever a Terapia Gnica como um novo ramo teraputico da medicina

moderna.
Analisar a aplicabilidade da terapia gnica na terapia celular
-Exemplificar a importncia dos siRNA
Clulas estaminais
Clulas indiferenciadas com capacidade proliferativa.
Podem-se diferenciar em diferentes tipos celulares em

resposta a diferentes estmulos.
Tm o potencial de se desenvolver em clulas maduras,

com funes especializadas
Classificao das clulas estaminais
Clulas Totipotentes:
Zigoto ou Ovo fertilizado
Clulas Pluripotentes:
Clulas que do origem a todas as
clulas das camadas embrinicas
germinativas
Unipotente: do origem a um
tipo especfico
de clulas
Clulas estaminais embrionrias
Oviducto
Derivam do embrio antes

da sua implantaono tero
Clulas estaminais da placenta e
do cordo umbilical
Uma fonte de clulas estaminais no
embrionrias o sangue do cordo
umbilical, que possui uma grande
concentrao de clulas estaminais
hematopoiticas, para alm de clulas
estaminais mesenquimais e clulas
estaminais/progenitoras endoteliais.
Estas clulas estaminais neonatais

podem ser colhidas e processadas logo
aps o nascimento, num processo
totalmente seguro e indolor para a me e
para o recm-nascido, tendo substancial
aplicabilidade teraputica
Clulas estaminais adultas
Como qualquer clula estaminal divide-se durante longos

perodos dando origem a cpias idnticas,
Podem dar origem a diferentes tipos de clulas

diferenciadas
Tipicamente so
chamadas de clulas
precursoras ou
progenitoras de um
determinado tipo de
clulas diferenciadas
Tipos de clulas estaminais adultas
Clulas estaminais neuronais:
- na zona Subventricular
- na zona Ventricular
- no Hipocampo
- no crebro fetal
- na crista neural
Clulas estaminais da medula ssea e sangue:
- Hematopoiticas
- Medula ssea
Clulas estaminais adultas em diferentes tecidos:
- Clulas progenitoras endoteliais
- Clulas musculo esqueltico
- Clulas precursoras epiteliais da pele e sistema digestivo
- Clulas do pncreas e fgado
Plasticidade de clulas estaminais adultas
Doenas autoimunes
Tem de distinguir os mais variados componentes celulares do prprio
corpo dos componentes celulares dos organismos invasores
Infeco versus Doenas autoimunes
Pneumonia Esclerose mltipla

Cistite Diabetes tipo1
Lpus
Sistema Imunolgico
No Timo as clulas T so educadas a
distinguirem as protenas do prprio
corpo das outras
As clulas T auto-reactivas, so
eliminadas no Timo
Se o sistema falha: doenas auto-imunes
Clulas estaminais hematopoiticas
Hematopoiese: todas as clulas derivadas de uma nica

clula precursora, o hemocitoblasto, que d origem a um
progenitor para cada tipo de clula
- Eritrcitos
- Leuccitos
- Plaquetas
Diferenciao das clulas hematopoiticas e da medula
Seleco de clulas estaminais hematopoiticas
Clulas ligadas
a ferro
FACS
Clulas
marcadas com
fluorescncia
(1:10000
clulas)
Cancro
uma doena das clulas estaminais
As clulas estaminais adultas permaneceram no organismo durante
um perodo de tempo alargado, podendo acumular mutaes pr-
oncognicas.
As clulas estaminais (em constante diviso) podem facilmente

adquirir um fentipo tumorognico.
O transplante de clulas estaminais em indivduos adultos pode

conduzir formao de tumores: teratocarcinomas, tumores
complexos derivados de clulas embrionrias pluripotentes. No
entanto nunca foram encontradas metstases aps transplantes de
clulas estaminais embrionrias.
Teraputica
Drogas anti-inflamatrias, imunossupressores (esterides,
inibidores de citocinas)
Transplante de clulas hematopoiticas do prprio indivduo
(autlogo)
- Injeces de um factor de crescimento: libertao de clulas
estaminais da medula ssea para a corrente sangunea
- Isolam-se as clulas estaminais do sangue do doente
- Faz-se quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar as clulas
maduras do sistema imunolgico
- Transfuso das clulas estaminais, que migram para a medula
ssea onde se comeam a diferenciar
7 doentes com Lpus receberam este tratamento e durante 3 anos

no necessitaram de medicao imunossupressora

Diabetes
Caracterizada por nveis elevados
de glicose no sangue
(hiperglicemia).
Os sintomas mais comuns so:

secreo excessiva de urina
(poliuria), sede (polidpsia) e fome
(polifagia) intensas.
O diabetes tipo 1 uma doena

autoimune caracterizada pela
destruio das clulas beta
pancreticas pelas clulas do
sistema imune, e os pacientes
necessitam de injeces de insulina
exgena para sobreviver.
O diabetes tipo 2, est intimamente

relacionado a obesidade e atinge
principalmente pessoas com mais
de 40 anos.
How are embryonic stem cells stimulated to differentiate?
Doenas Neurodegenerativas:
Doena de Parkinson
! Segunda doena neurodegenerativa mais comum

- idade mdia de incio: 55 anos
! Afecta 1-2 % da populao > 65 anos
! Idade o principal factor de risco
Caractersticas clnicas
! ~80% dos casos de Parkinsonismo
! distrbios motores graves
- bradicinsia (lentido de movimentos)
- tremor de repouso
- rigidez
Na doena de Parkinson a via nigrostriatal degenera
! Perda acentuada de neurnios dopaminrgicos que projectam para o putamen

e modesta dos neurnios que projectam para o caudate
! Despigmentao da SNpc devido perda de neurnios dopaminrgicos (perda

do pigmento castanho escuro neuromelanina)
Incio dos sintomas: ~80% de

depleco de DA no putamen e
~60% de morte de neurnios
dopaminrgicos na SNpc
Terapias na doena de Parkinson
Terapias Neuroprotectoras
"Antioxidantes
" L-DOPA
" Agonistas dopaminrgicos
" Antagonistas dos receptores do glutamato
" Inibidores da NOS
Terapias Cirrgicas
" Estimulao cerebral profunda
" Palidotomia
Terapias de Substituio Celular

" Transplantes: clulas neuronais fetais
clulas estaminais embrionrias
clulas estaminais neuronais adultas
Transplante de clulas neuronais fetais dopaminrgicas
Problemas: ticos (neurnios de mesencfalo de fetos com 6 a 9 semanas)

clulas no formam sinapses
viabilidade e funcionalidade das clulas
aquisio de um fentipo dopaminrgico
Investigao em clulas estaminais:
porqu?
http://www.youtube.com/watch?v=a9WB_PXjTBo
Ensaios clnicos em 2005:
10% doenas hereditrias monognicas (ex: fibrose qustica, SCID)
66% doenas polignicas (ex: cancro)
Embora esta tenha muito potencial, ainda muito experimental
Fase I: nmero pequeno de pacientes que so cuidadosamente observados, sendo dada

ateno especial a quaisquer efeito colateral detectados. Testada em vrias doses, com o
objectivo de descobrir a dosagem ideal.
Fase II: se o tratamento apresenta

um efeito positivamente til, ser
testado num nmero maior de
pacientes
Fase III: Geralmente, esse ensaio envolve a comparao do novo tratamento com o que
tem sido o tratamento padro at o momento. Num ensaio aleatrio, geralmente metade dos
pacientes recebem o tratamento padro e metade, o tratamento experimental.
A promessa:
Transplantes teraputicos
1. Podem crescer em cultura indefinidamente (fceis de manter)
2. Pluripotentes (formam vrios tipos de clulas)
3. A presena de vrus/doenas transmissveis pode ser analisada
4. Assumem o fentipo das clulas vizinhas aps transplante
5. Possuem a capacidade de migrao aps transplante
6. Produzem factores que contribuem para a reparao tecidular
Terapia Gnica
um novo ramo teraputico da medicina moderna.
Permite a transferncia de informao gentica em clulas,

tecidos ou rgos de pacientes para que o produto da sua
expresso possa curar ou retardar a progresso da
doena.
Terapia Gnica
Esta abordagem permite tratar doenas:

- eliminando genes deletrios
- substituir genes anormais por genes normais
- introduzir genes que codificam protenas mediadoras, por
ex do sistema imunolgico que ajudem a combater o
cancro
Tipos de Terapia Gnica
Terapia Gnica in situ O gene(s) teraputico
transportado por um vector directamente administrado
ao tecido afectado.
Terapia Gnica in vivo - O gene(s) teraputico

transportado por um vector directamente administrado
ao doente.
Terapia Gnica ex vivo As clulas do paciente so

colhidas e semeadas em laboratrio. So incubadas
com vectores que transportam o gene teraputico. As
clulas com a nova informao gentica so colhidas e
transplantadas no paciente.
Terapia gnica: onde?
Terapia germinativa O gene inserido no DNA das
clulas germinativas (vulo ou espermatozide), de
modo a que a descendncia tenha o gene inserido.
Terapia somtica Envolve a manipulao da

expresso gnica em clulas que ser alteradas no
paciente mas no nos seus descendentes. As clulas
somticas incluem todas as clulas do corpo humano
menos as reprodutivas.
Vectores: veculos que transportam e protegem o DNA at
sua chegada a uma populao celular alvo
Viral No viral
integram o seu material Fsico
gentico no genoma -Injeco do DNA livre na clula
hospedeiro -Electroporao
-Retrovirus Qumico
-Lentivirus (HIV) -Lipossomas
-Adeno-associados
Mantm o seu material gentico

epissomal
-Adenovirus
Terapia Gnica: Doenas
genticas
SCID ligada ao X (Severe Combined Immune
Deficiency)
- Mutao no gene que codifica a protena "c presente na membrana

celular dos precursores dos linfcitos
- Estes no diferenciam em linfcitos NK e T
- 3 das 17 crianas tratadas desenvolveram leucemia
Hemofilia
- Mutao nos genes que codificam factores de coagulao
- O gene teraputico foi inserido no fgado dos doentes
- O efeito teraputico foi transiente, pois as clulas geneticamente
modificadas foram destrudas pelo sistema imune dos doentes.
Terapia Gnica: Doenas
adquiridas
Cancro
Teraputica: Terapia Gnica suicida; Terapia viral oncognica ( Vrus
modificados que reconhecem as clulas tumorais e promovem a
sua lise) etc.
2/3 dos ensaios clnicos so para cancro
Doenas Neurodegenerativas
Teraputica: Remover clulas da pele de
doentes de Alzheimer, introduzir o gene que
codifica o NGF (Nerve growth factor),
e injectar estas clulas no crebro dos doentes.
Terapia Gnica & Terapia Celular
Terapia Celular Infuso ou transplante de clulas num
paciente para o tratamento de doenas herdadas ou adquiridas
Sobreposio das terapias gnica

e celular:
Ex Utilizao de linfcitos-T no
tratamento do cancro. Muitos
tumores so reconhecidos e
destrudos pelas clulas T dos
doentes. Isolam-se os linfcitos-T
e expandem-se fora do corpo,
para depois serem administrados
ao doente. Estas clulas podem
ser manipuladas geneticamente
por forma a tornarem as clulas
eficientes a matarem as clulas
tumorais.
Manipulao gentica e seleco das clulas
estaminais em cultura
Para introduzir o material gentico no interior da clula necessrio fazer chegar o

gene at s clulas defeituosas.
Transfeco, processo de entrega e expresso de material gentico com sucesso.
(lipossomas, DNA desaparece em poucos dias ou semanas se transiente)
(vector viral, transfeco estvel, integrao no genoma da clulas hospedeiras,

mas episomal)
Integrao random
-silenciamento de genes,
-introduo de mutaes
Recombinao homloga
(processo de reparao do DNA)
Processo raro
Integrao do transgene no genoma das clulas
Terapia gnica: Hoje
Janeiro, 2008
Distrofia Muscular Duchenne

Gene que codifica a protena distrofina (A
distrofina uma protena que faz parte do
complexo que liga o citoesqueleto de uma fibra
muscular matrix extracelular, atravs da
membrana celular) est presente no
cromossoma X. Mutaes neste gene do
origem distrofia muscular Duchenne em
indivduos do sexo masculino.
Injeco no musculo: gene da distrofina
Terapia gnica: Hoje
Outubro, 2007
(SCID) (severe combined immunodeficient)

por deficincia da adenosina deaminase
(ADA)
Estes doentes no tm linfcitos-T e tm poucos ou disfuncionais linfcitos B.
Teraputica: Transplante de medula ossea.

Ou Terapia Gnica: o gene da ADA inserido nas clulas da medula
ssea do prprio doente. Estas clulas so depois administradas ao doente aps
uma depleo moderada das clulas da medula ssea.
RNAi em clulas estaminais
O RNA de interferncia pode ser usado para manter um

determinado nvel de actividade de um gene.
A supresso estvel de genes deletrios por RNAi, em clulas

estaminais adultas isoladas e modificadas ex vivo e depois
reintroduzidas, pode ser uma nova estratgia no tratamento de
determinadas doenas.
RNA de interferncia
RNA de interferncia (RNAi):

Processo biolgico
altamente conservado,
desde os nemtodos at
ao homem.
Regulao da expresso
gnica por silenciamento
RNA de interferncia e sua importncia na
biomedicina molecular
Aplicaes
1. Anlise funcional de genes (genmica funcional)
a supresso estvel dos genes pode ser induzida nas
clulas de mamferos, permitindo estudar os seus
fentipos em vrias geraes de clulas,
estudo de genes implicados nas vias metablicas;
2. Identificao de genes implicados no processo
tumoral;
A quase totalidade
3. Desenvolvimento de novas abordagens dos 19 000 genes do
teraputicas: C. elegans foi
cancro " inibio da expresso de oncogenes ou de estudada por RNAi.
genes que conferem resistncia quimioterapia,
doenas virais " inibio da replicao do vrus da
SIDA ou do vrus da hepatite.
A promessa:
Terapia gnica
1. So facilmente transfectveis com genes teraputicos,

podendo expressar mais de um gene de interesse
2. Apresentam uma implantao correcta no tecido
hospedeiro, permitindo a transcrio gentica, logo a
expresso proteca
3. Migram para reas lesadas, permitindo a distribuio
de genes em diferentes reas (crebro)
Biotica
O que a vida?
Um ser Humano vivo tem de ser protegido jurdica,
tica e moralmente.
Critrios de morte cerebral por declarao da Ordem dos Mdicos

prevista no artigo 12 da Lei n 12/93 de 22 de Abril, pressupem
que a certificao requer a demonstrao da cessao das funes
do tronco cerebral e da sua irreversibilidade. Aps se assegurarem
as condies prvias, como por exemplo a ausncia de respirao
espontnea e se observarem as regras de semiologia, que
presupem a ausncia na totalidade de determinados reflexos do
tronco cerebral, a verificao de morte cerebral requer entre outras
metodologias a execuo das provas de morte cerebral por dois
mdicos especialistas.
Biotica
Portanto, se um indivduo morto aquele que no responde a um

estimulo doloroso, no respira espontaneamente, etc
ento ser cientificamente correcto dizer que um zigoto ou vulo

fertilizado no um indivduo vivo, mesmo que tenha todo o
potencial de vir a ser?

Morte Celular

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Tipos de morte celular:

Biologia Celular e Molecular, 2008/2009

Remoo activa de clulas indesejveis a uma comunidade social

Controlo social da comunidade

Em clulas que no podem reparar uma leso adequadamente

Perda do contacto c/ membrana basal - ANOIKIA (Loss of Home)

Hormonas, citocinas (TNF),

Activao de um programa gentico de suicdio

Ex: Formao dos dedos

Processo passivo (independente de ATP)

interrupo da irrigao sangunea (oxignio e glicose) numa regio do

Existem dois tipos:

Factores de risco para AVC:

Desenvolvimento embrionrio - Metamorfose

Adulto - Normal turnover celular

Regulao defeituosa - Doenas

Cancro, doenas autoimunes

Doenas neurodegenerativas, SIDA, osteoporose, envelhecimento

A mitocndria controla a deciso para a morte celular

Domnio Apopttico Insultos Celulares

Pr-Caspase-4 Caspase-3 Caspase-7

Funo Mitocondrial Preservada

So protenas que ligam fosfolipidos na presena de clcio

Degradao do ADN genmico em fragmentos de 180-200 pb

Anlise da expresso gnica diferencial

N total de genes envolvidos na apoptose: 198

Seres humanos tm aproximadamente 1014

O processo apopttico pode ficar comprometido

Potencial uso teraputico

Disorder Genetic factors Environmental factors

- clinicamente ( decrscimo progressivo da capacidade cognitiva

- primeiro sintoma da DA ( declnio da memria recente

* Estadio inicial da DA: Alterao do citosqueleto por hiperfosforilao anormal

da protena tau (neurnios piramidais corticais)

* Cortex cerebral de doentes de DA: depsitos extracelulares de b-amilide (Ab,

)4 kDa); Ab - produto minoritrio do metabolismo da APP

Evidncias de morte celular por apoptose:

Dentatorubral- DRPLA 12p13.31 autosomal dominant atrophin-1 635 4988

Biologia Celular e Molecular, 2008/2009

Descrever o papel dos lisossomas na funo celular.

Definir o papel do sistema ubiquitina-proteassoma na

Existe uma hidrolase para cada tipo de biomolcula

Glicoprotenas que protegem

Autofagocitose ou autofagia: processo pelo qual as clulas degradam

Endocitose mediada por receptores: processo pelo qual as clulas

Lysosome contains Food vacuole Hydrolytic

(a) Phagocytosis: lysosome digesting food

DUB: Enzimas que desubiquitinam ou so proteases especficas para a ubiquitina;

A subunidade 20S do proteassoma tem 3 subunidades catalticas com diferentes

O resultado da protelise so polipeptdeos de 4 a 25 resduos

Essencial para muitos Produtos da degradao:

Mutao no gene da parkina (ligase E3 da ubiquitina)

Indirectamente: Doena de Parkinson

Doena neurolgica descoberta em 1950 no povo Fore da Papua Nova Guin

Tipo de encefalia espongiforme

Idade mdia de incio: 40-50 anos (tb alguns casos de ocorrncia

Permite manter a homeostase celular, entre a sntese e a degradao

Morte celular autogfica (autophagic cell death)

Estimulam a autofagia TOR-Regulador da autofagia

Autofagia massiva (Morte celular tipo II)

Durante este processo ocorre a destruio de largas pores de citosol e de

Autofagia activa a Apoptose (Morte celular tipo I)

A autofagia desenvolve-se como a primeira resposta ao estimulo (stress) e s