4.8.

-Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, segn la conformacin, la naturaleza de los sistemas

de luz y otros elementos utilizados para obtener las imgenes.

El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para microfotografa). En los
microscopios binoculares la observacin se hace con los dos ojos y esto permite una
observacin ms cmoda y se percibe una mayor nitidez de los detalles en la imagen. Se
fabrican en diferentes tamaos incluyendo microscopios pequeos porttiles o de viaje.
Dentro de los tipos de microscopios se describen:

Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a partir de los modelos

antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la platina. Es el
microscopio de uso ms comn.

Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en comparacin al

microscopio convencional. La fuente de luz est ubicada por encima de la platina y el principio
de funcionamiento y formacin de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional.
Utilizado principalmente para cultivos celulares (clulas vivas) sin una preparacin previa y
para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento) (fig. 4-18).

Figura 4-18.-Microscopio invertido con el revlver y objetivos por debajo

de la platina. La fuente de luz se ubica en la parte superior. Tomado de Instrumental Pasteur.
Microscopio Olympus. (78).

Microscopio estereoscpico: Este tipo de microscopio proporciona una imagen

estereoscpica, en tres dimensiones (3D) del espcimen. Se fundamenta en la visin binocular
convencional, en la que los dos ojos observan el espcimen con ngulos levemente distintos. El
microscopio estereoscpico debe ser binocular. Se utiliza para observar especmenes de gran
tamao, sin corte o preparacin previa puesto que emplea luz incidente y no funciona por
trans-iluminacin. Es ideal para realizar microdiseccion (fig. 4-19).
 Figura 4-19.-Microscopio estereoscpico. Tomado
de Kosmos Scientific de Mxico (79).

Microscopio quirrgico: Es un microscopio que

se emplea en microciruga. Proporciona un campo
muy bien iluminado y un aumento de las estructuras
anatmicas, facilitndole al cirujano una mayor
visibilidad de los tejidos sanos y patolgicos que
sern manipulados ms cuidadosamente y con
menores posibilidades de lesin. Algunos modelos
ms sofisticados tienen piezas automatizadas
robticas. Se utiliza principalmente en intervenciones
quirrgicas en las que se amerite una minuciosa
diseccin, como por ejemplo del crneo y cerebro o
del globo ocular (fig. 4-20) (80, 81).

Microscopios fotnicos especiales: Ciertos especmenes, principalmente las clulas vivas o

muestras no coloreadas, al ser observados en el microscopio comn de campo claro, muestran
un muy pobre contraste de sus estructuras y no aportan datos relevantes, a pesar del poder de
resolucin de los objetivos empleados. Para ello se han creado microscopios con ciertas
particularidades que permiten la observacin de ese tipo de especmenes con un incremento
muy satisfactorio del contraste. Entre ellos se citan:

Microscopio de campo oscuro: es un microscopio que utiliza un haz enfocado de luz muy
intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre la muestra. El objeto iluminado dispersa
la luz y se hace as visible contra el fondo obscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo
iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. El objetivo recibe la luz
dispersa o refractada por las estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo
oscuro est equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte
indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrs de la muestra como un fondo
oscuro sobre el cual aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de
la luz hacia el objetivo.

Microscopio de luz ultravioleta: Las lentes del objetivo, que habitualmente se componen de
vidrio se sustituyen por lentes de cuarzo, y la iluminacin se produce por lmparas de mercurio.
No usa filtros y se observa en placas fotogrficas. La variedad de fluorescencia, si usa filtros, y
la observacin es directa. espectrofotmetro pero sus resultados son registrados en fotografas.
La muestra no se puede observar directamente a travs del ocular porque la luz ultravioleta
puede daar la retina. El mtodo sirve para detectar cidos nucleicos, protenas que contienen
determinados aminocidos. Mediante longitudes de ondas especficas para la iluminacin se
puede obtener mediciones espectrofotomtricas para cuantificar el ADN y el ARN de cada clula.

Microscopio de fluorescencia: no es ms que es un microscopio ptico convencional al que se

le adapta un accesorio complementario de iluminacin, denominado "fluorescencia".
En Bioindicacin te hablaremos de este accesorio de fluorescencia que utiliza los mismos
objetivos de aumento para formar la imagen. Con este accesorio incorporado podremos realizar
una observacin ptica convencional y adems una observacin de contraste con fluorescencia.

Microscopio de polarizacin: Los microscopios de luz polarizada son microscopios a los que se les han
aadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el
observador), el material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol dejando pasar
nicamente la luz que vibra en un nico plano (luz polarizada). Algunos compuestos orgnicos responden
al efecto de la luz, stos tienen un alto grado de orientacin molecular (sustancias anistropas), que hace
que la luz que lo atraviesa pueda hacerlo en determinados planos vibratorios atmicos. El prisma de Nicol
permite el paso de luz en un solo plano, as el cuarzo gira la posicin de polarizacin, facilitando la
identificacin de sustancias que extinguen la luz. Al fenmeno de extincin de luz causado por estos
planos atmicos y orientaciones moleculares se llama birrefringencia. Este tipo de microscopio se usa
para poder identificar mejor sustancias cristalinas o fibrosas (como el citoesqueleto), sustancia amiloide,
asbesto, colgeno, cristales de uratos, queratina, slice, y otras de origen exgeno.

El microscopio de polarizacin se basa en el empleo de dos filtros polarizadores. El primero de ellos, el

polarizador propiamente dicho, sirve para generar un haz de ondas luminosas que oscilan en un solo plano
y que se hace incidir en la muestra. El segundo, denominado analizador, se encuentra entre la muestra y
el ocular. Cuando ambos polarizadores se encuentran cruzados, se extingue la luz generada por el primer
polarizador. Sin embargo, si la muestra contiene sustancias que presentan anisotropa, se produce
birrefringencia y esta puede detectarse. Qu utilidad tiene el microscopio de polarizacin?
En el laboratorio de histologa y anatoma patolgica, la microscopa de polarizacin permite
determinadas aplicaciones diagnsticas. Numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lpidos, protenas,
depsitos seos, depsitos de amiloide etc. poseen birrefringencia.

Microscopio de contraste de fases: ermite observar clulas sin colorear y resulta

especialmente til para clulas vivas.1 La mayora de los organismos vivos no pueden ser teidos
debido a que los colorantes utilizados pueden daar su estructura celular hasta el punto de su
muerte. Esta tcnica de microscopa aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de
refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido.
La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda
fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras
longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del
condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un
contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones
densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas.
Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes
semifinos no coloreados.

Microscopios interferenciales: En este ejemplar de microscopa, la luz emitida por una nica
fuente es dividida en dos haces, uno de los cuales es mandado a travs del objeto, y el otro pasa
alrededor de este. Los dos haces luego se recombinan e interfieren uno en el otro como en
la microscopa de fase. El haz que ha atravesado el objeto se ha retardado, ha sufrido un cambio
en su fase, en comparacin con el haz directo. Este retardo () depende del espesor (t) y de la
diferencia entre el ndice de refraccin del objeto (No) y el del medio y el del medio que lo rodea
(Nm). No-Nm=/t Si se conoce Nm, no puede ser determinado. Con este instrumento pueden
realizarse medidas del peso seco del objeto debido a que el peso est relacionado con el ndice
de refraccin. Cuando este es medido en agua, se puede aplicar la siguiente relacin: Co=100no-
nw/x Donde Co es el porcentaje de concentracin del material en el objeto; nw es el ndice de
refraccin del agua; X es una constante que equivale a 100 (siendo el incremento del ndice
de refraccin especfico del material en solucin). X es de alrededor de 0,18 para la mayora de
las sustancias de la clula, protenas, lipoprotenas y cidos nucleicos. Debido a este principio
de funcionamiento el Microscopio de Interferencia presenta las siguientes ventajas con respecto
al Microscopio de Fase. Permite detectar pequeos cambios en el ndice de refraccin, mientras
que el microscopio de fase solo detecta las discontinuidades ms notables en el ndice de
refraccin. Adems las variaciones de fases pueden ser traducidas en cambios de color tan
notables que una clula viviente puede parecerse a una preparacin coloreada.

LABORATORO DE MICROBIOLOGIA
Descripcin

Un laboratorio de Microbiologa es un lugar habilitado para manejar y estudiar microorganismos.

El trabajo debe realizarse de acuerdo con los estndares tcnicos y de seguridad propios de un
laboratorio de Microbiologa Clnica.

Es importante recordar que la finalidad es determinar los microorganismos presentes en la muestra por
lo que es preciso extremar las precauciones para evitar contaminaciones que den lugar a resultados
errneos.
Todas las muestras deben ser manejadas con precaucin por su potencial patogenicidad.

Para deshacerse del material contaminado se deben utilizar recipientes adecuados que deben ser
esterilizados posteriormente.

Nunca se puede tirar nada contaminado por el fregadero o al cubo de la basura comn sin haber sido
esterilizado previamente.

El el laboratorio deben existir unas recomendaciones generales de limpieza y en caso de vertidos:

Procedimientos de limpieza de superficies externas mediante papel humedecido con solucin

desinfectante (alcohol 70%, desinfectante fenlico diluido, etc.). Aclarar con agua los restos de
desinfectante.

En caso de usar soluciones de hipoclorito en zonas metlicas, limpiar posteriomente para evitar el
efecto corrosivo. En caso de derramamientos de material peligroso o formacin de aerosoles: evitar
inspiraciones de esos aerosoles, esperar 30 minutos hasta que las partculas se hayan depositado y
limpiar con mascarilla, guantes y otros tiles protectores. En caso de vertido de materiales, cubrir la
superficie con desinfectante y posteriormente cubrir con papel humedecido con desinfectante. Dejar
durante 15 minutos y limpiar. En caso necesario aclarar con agua.

En caso de derramamientos menores limpiar el material vertido mediante papel humedecido y

posteriormente aclarar, cuando sea necesario.

Los laboratorios debern disponer de los aparatos e instrumental necesario para el correcto desarrollo
de su actividad.
Debe existir un procedimiento de control de calidad en el laboratorio de Microbiologa Clnica que
implique la monitorizacin de los medios e instrumentos, con el fin de asegurar la adecuada realizacin
de los aislamientos, identificacin y caracterizacin de los patgenos y la realizacin precisa de las
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos como referencia teraputica. El sistema de la calidad
deber contemplar la existencia de registros de formacin de personal es imprescindible la existencia de
un procedimiento sobre medidas de proteccin personal en el manejo de equipos y aparatos.

Los equipos del laboratorio deben funcionar de forma que se asegure la reproducibilidad de los
resultados de las pruebas diagnsticas.

El laboratorio deber estar bajo la direccin y responsabilidad de un facultativo con la especialidad

correspondiente, legalmente capacitado para realizar aqullas determinaciones clnicas que el
laboratorio tenga autorizadas.

El personal tcnico y sanitario del laboratorio deber disponer la titulacin adecuada para las funciones
que desarrolla de conformidad con la legislacin vigente.

Estructura de un laboratorio de Microbiologa Clnica

rea administrativa

rea de recepcin de muestras

rea de extraccin que deber:

Disponer de material de un solo uso para contacto con muestras biolgicas.

Disponer de un rea de extracciones y toma de muestra, una sala de espera para los pacientes y los
servicios de higiene correspondientes.
Disponer de personal legalmente autorizado para la toma de muestras.
Disponer de un manual de extraccin, toma y transporte de muestras.
El manual antedicho deber ser elaborado por el responsable

rea de trabajo: anlisis y procesado de muestras

El puesto de trabajo debe debe de estar limpio y ordenado

El material necesario debe prepararse antes de empezar a trabajar y colocarse de forma adecuada para
que se facilite su utilizacin asi se evitarn accidentes y se minimizar el riesgo de contaminacin

Nunca se debe pipetear con la boca. Utilizar siempre elementos manuales o automticos.

Todo el material utilizado debe estar estril.

1. Elementos y materiales ms frecuentes de un laboratorio de Microbiologa Clnica

1.1. Mesas de laboratorio y fregadero

1.2. Vitrinas y armarios

1.3. Mechero Bunsen

Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la llama del mechero (zona
asptica).
En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de la llama

Antes de comenzar a trabajar se procurar disponer de todo el material necesario para el

procesamiento de la muestra

Tomar las medidas necesarias para evitar la contaminacin de las muestras o/ y cultivo por
microorganismos ambientales

1.4. Gradillas

1.5. Estufa de incubacin

Es una cmara de temperatura controlada para cultivo de

microorganismos.
Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su
temperatura ptima de crecimiento (generalmente 35-37).

1.6. Frigorfico o cmaras refrigeradas

Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos)

como microorganismos.

Generalmente estn a una temperatura fija de 4C.

1.7. Congeladores

Se utilizan para la conservacin de reactivos y microorganismos a temperaturas

inferiores a 0C, llegando a -80C (los ms frecuentes son -20, -40 y -80).

1.8. Microscopio ptico

1.9. Centrfuga

Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrfuga lo que permite la
separacin de los distintos componentes de la muestra mediante la
precipitacin en el fondo del tubo de las partculas en suspensin.

1.10. Cmaras de seguridad biolgica (ver practica 2)

1.11. Desionizador de agua.

La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de

Microbiologa Clnica necesitan la utilizacin de agua pura con el fin de
evitar cualquier tipo de interferencia. Entre otra caractersticas debe:
estar exenta de materiales en suspensin o un pH comprendido entre
5,0 y 7,5. Durante aos se ha utilizado agua destilada, en la actualidad
los destiladores se han ido abandonando para dar paso a desionizadores que funcionan con resinas de
intercambio inico. Tambin se pueden utilizar otras tcnicas como la smosis inversa.

1.12. Contador de colonias: Es un aparato que mediante la iluminacin de

la placa y una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y
por tanto facilita su recuento.

1.13. Balanzas

1.14. Baos termostticos: son

recipientes que contienen agua y un
sistema de regulacin de la
temperatura. Se utilizan para atemperar
medios de cultivo o incluso para incubar
cultivos de microorganismos.

1.15. Agitador/ mezclador

1.16. Jarras de anaerobios:

Recipientes que se usan para conseguir una atmsfera libre de

oxgeno para el cultivo de microorganismos anaerobios.

1.17. Asas de siembra:

Se utilizan para sembrar. Pueden ser metlicas o de

plstico, curvas o rectas (para la siembra por picadura).

1.18. Ph-metros:

1.19. Material fungible

Placas de Petri: recipientes para la preparacin de medios de cultivo slidos

Tubos con medio lquido

Tubos con medio slido

 Pipetas de vidrio, de plstico y pipeteadores.

Pipetas

Pipetas automticas (micropipetas) y puntas de pipeta:

Se utilizan para pipetear pequeas cantidades de

lquidos.

Se utilizan con puntas desechables de distinto tamao y

color segn la micropipeta. Existen cuatro tamaos: de
0,5-2m; de 2-20 m; de 20-200 m y de 200-1000 m.

Pipeteador
Pipeteador manual
automtico

Asas acodadas o Asas de Digralsky:

Se utilizan para la extensin de microorganismos sobre la superficie de un

medio de cultivo en placa Petri.

Portas y cubres

Para realizar las observaciones al microscopio.

Vasos de precipitados y matraces

Cucharas y esptulas: Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.

rea de limpieza de material y eliminacin de residuos

Zona donde se procede a la esterilizacin mediante autoclave del material

utilizado. El material desechable se elimina y con el material reciclave se
procede a la eliminacin de residuos y lavado. De esta manera el material
queda dispuesto para ser utilizado.

rea de esterilizacin

Procedimiento por el que se consigue la muerte de todos los organismos vivos y formas de resistencia
en un objeto o producto tratado.

Autoclave

Es el equipo ms utilizado.

Es un procedimiento de esterilizacin mediante calor hmedo. Se realiza en al autoclave durante 15

20 min, segn el volumen, a 115C 121C, segn la naturaleza del material que se desee esterilizar.

Autoclavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a presin (a 1 atmsfera). Como tiene

gran poder de penetracin la temperatura y el tiempo utilizados son
menores que los que se emplean con el horno Pasteur (121 C, 15-20
minutos). Se utiliza para esterilizar: Medios de cultivo, ropa, material
de plstico resistente al calor hmedo, objetos de metal que no se
alteren con la humedad y sobre todo material de vidrio.

Horno de Pasteur: emplea altas temperaturas (160-180 C) durante un

tiempo prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de
penetracin se usa para esterilizar vidrio y metales. Acta
principalmente desnaturalizando las protenas y secundariamente
oxidando los compuestos celulares.