Procesamiento de cambio de pH de la biomasa de microalgas de Nannochloropsis oculata para

obtener un ingrediente de alimento o pienso enriquecido en protenas

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Reflejos

El proceso de cambio de pH se realiz en Nannochloropsis .

El producto contena protenas ricas en aminocidos esenciales.

El producto contena LC-PUFAs nutritivamente valiosos.

La ceniza y el agua se redujeron ligeramente en el producto.

Abstracto

La fraccionacin de materias primas vegetales y animales por el procesamiento de cambio de pH

se ha aplicado ampliamente para purificar protenas. El principio es solubilizar las protenas a pH
alto o bajo, eliminando los desechos y precipitando las protenas cerca de su punto isoelctrico.
Aqu describimos el proceso de cambio de pH en Nannochloropsis oculata comercialmente
disponible . Se estudi la particin de nutrientes principales en las diversas fracciones del proceso.
Se encontr que las protenas exhiban una solubilidad mxima entre pH 7 y 10, con una
solubilidad mnima por debajo de pH 4. En este estudio se investigaron dos versiones de
procedimiento, con solubilizacin a pH 7 (pH nativo) o 10; Ambas versiones se precipitaron a pH
3. Hasta el 85% de la protena y los cidos grasos totales se recuperaron en el producto final, en
comparacin con la suspensin de algas inicial. La protena, los cidos grasos totales y los
carbohidratos se concentraron en el producto final, mientras que el contenido de cenizas fue
menor en comparacin con el material de partida. Desde el punto de vista del procesamiento, se
encontr que la solubilizacin de Nannochloropsis a pH nativo era preferible, puesto que se
consuman menos productos qumicos en comparacin con la solubilizacin con alto pH. Debido a
su contenido de protenas y cidos grasos (totales) (23 y 12% de peso seco, respectivamente), este
ltimo enriquecido en cido eicosapentaenoico (EPA), el producto del proceso de cambio de pH
tiene potencial como ingrediente alimentario funcional.

Abreviaturas

EPAcido eicosapentaenoicoLC n-3 PUFAcidos grasos poliinsaturados n-3 de cadena

largaP1Pellet de la primera centrifugacinP2Pellet de la segunda centrifugacinPipunto
isoelctricoS1Sobrenadante de la primera centrifugacinS2Sobrenadante de la segunda
centrifugacinSDS-PAGEElectroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sdico

Palabras claves

MicroalgasNannochloropsisComidaSolubilidad y precipitacin cida / alcalinaProtenacidos

grasos n-3

1 . Introduccin

Las microalgas tienen potencial como nutricin humana y animal; Las especies marinas se pueden
cultivar sin competir con los cultivos tradicionales de tierra o agua dulce, y adems, muchas
especies tienen un perfil nutricional favorable [1, 2] . Los nutrientes importantes que se
encuentran en las microalgas incluyen lpidos, protenas, vitaminas y oligoelementos [3] . La
fraccin lipdica de algunas especies incluye los cidos grasos poliinsaturados n-3 de cadena larga
(LC n-3 PUFAs) que han demostrado tener efectos beneficiosos sobre las enfermedades
cardiovasculares y otras enfermedades de tipo inflamatorio [4] . Las protenas de microalgas
pueden tener perfiles equilibrados de aminocidos y buena funcionalidad tcnica [3,5,6],
Hacindolos buenos candidatos como alimento funcional o ingredientes para piensos. Sin
embargo, la mayora de las microalgas cultivadas a escala comercial no son consumidas
directamente por seres humanos o animales terrestres. A pesar del potencial de las microalgas
como ingrediente de alimentos y piensos, la mayor parte de la biomasa est dirigida hacia la
acuicultura o nutracuticos.

Para aislar las protenas microalgal, se propone el uso de su solubilidad en condiciones muy
alcalinas, un mtodo bien establecido para la recuperacin de protenas de origen animal y vegetal
materias primas [7 - 10] . Las protenas por el presente obtienen una carga neta negativa que
causa repulsiones dentro y entre molculas de protena, favoreciendo su interaccin con el agua.
Bajar el pH al punto isoelctrico (pI) de las protenas anula las cargas sobre las protenas,
minimizando la interaccin con el agua y hacindolas insolubles. Estas protenas insolubles
precipitan y pueden as recuperarse eficazmente. El mtodo, conocido como el proceso de cambio
de pH, se desarroll en todos los peces eviscerados, para eliminar las partes insolubles, como los
huesos y la piel, mientras que el aislamiento y la retencin de protenas en un estado funcional [10
, 11] , vaseFigura 1. Del mismo modo, la hiptesis de que puede ser posible aplicar el mtodo en
algas enteras para eliminar las paredes celulsicas celulsicas indigestibles mientras se recupera
un producto enriquecido en protenas. Cuando el mtodo se aplica al tejido animal crudo, el
material se tritura simplemente con cinco a diez partes de agua y el pH de la mezcla se ajusta a un
pH cido o alcalino extremo. Esta suspensin se centrifuga a continuacin, produciendo un
sedimento de restos insolubles, y un sobrenadante que contiene protena soluble. El sobrenadante
se recupera y las protenas se precipitan a un pH cercano a su punto isoelctrico. Una segunda
centrifugacin produce un sedimento de protena parcialmente deshidratado, que puede
neutralizarse antes de un procesamiento posterior. El proceso de cambio de pH es relativamente
barato, aplicable a gran escala, Y suave hacia protenas que de otro modo se desnaturalizan
fcilmente e irreversiblemente. Las protenas conservan en gran parte su funcionalidad, incluida la
capacidad de formacin de gel, en parte debido a que se aplican condiciones de tratamiento en
fro. Algunos estudios incluso han informado sobre la mejora de la funcionalidad de la protena
despus de procesamiento de cambio de pH, lo que se ha explicado por un patrn de
replegamiento de protena favorable durante la precipitacin[12] .

Visin general del proceso de cambio de pH

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Fig. 1 . Visin general del proceso de cambio de pH. Las casillas sombreadas indican los pasos de
procesamiento, mientras que las casillas blancas indican los productos de las distintas etapas.
Despus de romper las paredes celulares de N. oculata , las protenas se solubilizan ya sea al pH
natural o ajustando el pH en la regin alcalina. Las protenas solubles se recuperan despus en el
sobrenadante despus de la centrifugacin. Las protenas en el sobrenadante se precipitan
ajustando el pH a 3 en la siguiente etapa, y se recuperan en el grnulo de la segunda
centrifugacin.

Variaciones del proceso de cambio de pH para recuperar la protena de microalgas se han

publicado en Spirulina platensis [13 , 14] , y en Nannochloropsis [15] . Aunque su proceso de
recuperacin utiliz ajustes de pH para fraccionar los diferentes componentes de la materia prima,
el mtodo se aplic a la biomasa de algas que previamente se haba desgrasado con hexano [16] o
isopropanol [15] . La aplicacin de disolventes orgnicos puede provocar la desnaturalizacin de
las protenas y, por lo tanto, es cuestionable desde el punto de vista de la funcionalidad protenica.
Ms recientemente, se han recuperado protenas de Tetraselmis sp. Utilizando un proceso que
incluye ajustes de pH [17] . El objetivo de laEl fraccionamiento de Tetraselmis era recuperar un
producto proteico altamente purificado, lo que justificaba las etapas sofisticadas del proceso tales
como la dilisis y la cromatografa preparativa.

Creemos que los residuos de, por ejemplo , PUFA de LC n-3 podran mejorar el perfil nutricional y
las propiedades organolpticas de un producto proteico. Por lo tanto, proponemos un proceso de
fraccionamiento relativamente simple, en el que el producto final puede ser utilizado como
ingrediente de alimento mltiple o ingrediente de pienso, que contiene protenas y lpidos
nutricionalmente valiosos. Esto es importante debido al aumento de la demanda de protenas
tanto vegetarianas para los seres humanos, as como PUFAs y fuentes de protenas ricas en
aminocidos esenciales para los seres humanos y los animales por igual. Para reducir los costos de
procesamiento tambin sugerimos usar el medio de cultivo directamente en el proceso, en lugar
de agregar agua: la cosecha de microalgas tiende a ser costosa, requiriendo tiempo y energa para
desecar las algas.

El objetivo de este trabajo es demostrar la viabilidad de aplicar el proceso de cambio de pH a

Nannochloropsis oculata , una microalga marina comercialmente disponible, para concentrar sus
protenas. Para conseguir esto, la cartografa de la solubilidad de la protena en una gama de
valores de pH fue esencial, como tambin fue una investigacin de la particin de los lpidos y los
carbohidratos en las diferentes fracciones obtenidas durante las dos etapas de centrifugacin.
Teniendo en cuenta la aplicacin como un alimento o ingrediente de pienso, los perfiles de
aminocidos, as como los cambios de color de las algas en todo el proceso tambin fueron
controlados.

2 . material y mtodos

2.1 . Productos qumicos y materiales especiales

Microalgas, N. oculata "Hielo Phytobloom" para la acuicultura, fueron compradas en parte

deshidratadas de Necton en marzo de 2012 y entregadas congeladas. Despus de su llegada al
laboratorio, se almacenaron a -80 C. El agua de mar fue recogida de la estacin de investigacin
marina sueca de Tjrn, filtrada para eliminar las partculas visibles y esterilizada en autoclave. Los
estndares de cidos grasos utilizados fueron: i) el estndar de referencia GLC 463 (Nu-Chek Prep,
Inc., EE.UU.) ii) PUFA-3 a partir de aceite menhaden (Supelco, EE.UU.), iii) cido tricosanoico (C23:
0, Larodan, .

2.2 . Adaptacin del proceso de cambio de pH a N. oculata

2.2.1 . Homogeneizacin de la biomasa de algas con agua de mar

Una parte de la biomasa de algas congelada se mezcl con cuatro partes de agua de mar fra (3
C) y se agit hasta que las algas se disociaron, para imitar un cultivo de microalgas que se haba
cosechado mediante deshidratacin parcial hasta un peso seco del 10%. La disrupcin celular se
llev a cabo con un instrumento FastPrep-24 (MP Biomedicals, Francia): se agitaron
vigorosamente perlas de vidrio (425-600 m) y suspensin de microalgas (relacin 1: 4) (6,5 m / s,
7 ciclos a 60 s ). La suspensin celular se mantuvo en hielo entre ciclos. La microscopa de
contraste de fase confirm que muy pocas clulas permanecieron intactas [Axiostar plus, Carl
Zeiss, Alemania, con un aumento de 400 con un plano A 40 / 0,65 objetivo ( / 0,17) con la
placa de fase apropiada]. Dado que la mayora de las clulas se haban roto, la suspensin se
denominar lisado en lo que sigue. Las perlas de vidrio se retiraron del lisado helado ya sea por
sedimentacin o pasando el lisado a travs de un tamiz ( tamao de malla de 200 \ mu m ).
2.2.2 . Determinacin del pH para la solubilizacin y precipitacin de protenas

Para determinar el pH al cual las protenas de N. oculata tienen su solubilidad mxima,

correspondiente al primer ajuste de pH del proceso de cambio de pH, se llev a cabo el siguiente
experimento: Se ajustaron pequeas alcuotas de lisado (2-4 ml) A valores de pH entre 1,0 y 12,0
con pasos de 1,0 unidad con pasos de media unidad adicionales en regiones de inters (pH 4,5,
5,5, 9,5, 10,5, 11,5, pHMetro: PHM210, Radiometer analtico, BergmanLabora, Suecia, con un
electrodo de doble poro De Hamilton, Christian Berner, Suecia). El pH inicial del lisado fue 7. La
acidificacin se llev a cabo con HCl 1,0 M, alcalinizacin con 1,0 M de NaOH. Debido a los
efectos de amortiguacin de la suspensin, el pH medido tendi a cambiar ligeramente a lo largo
del tiempo, haciendo necesario volver a medir el pH de cada alcuota antes de la centrifugacin.
Despus de centrifugacin a 4000 g y 4 C durante 10 min (con cubeta oscilante centrfuga,
Heraeus Multifuge 1 SR, Kendro Laboratory Products, Alemania), se recuper el sobrenadante
(S1), se liofiliza y se almacena a - 20 C, a la espera de protenas (Descrito en la Seccin 2.3.1 ).

Solubilidad de protenas se define como la concentracin de protena en S1 ([protena] S1 ),

dividido por la concentracin de protena en el ([protena] lisado lisado ), expresado en tanto por
ciento:

(1)ProtenaSol.,Solubilizacinpaso=protenaS1protenaLisado*100.

El pH al cual las protenas solubilizadas de N. oculata son menos solubles, y por lo tanto podra
concentrarse eficazmente en la segunda centrifugacin del proceso de cambio de pH, se
determin como sigue: puesto que no estaba claro si la etapa de solubilizacin tena un impacto
sobre el pH de precipitacin , Se realizaron dos experimentos de precipitacin paralelos. En un
ensayo, el lisado se dej a su pH nativo ( aproximadamente 7) y en el otro lisado de ensayo se
ajust a pH 10. Ambos valores de pH estaban en el rango de solubilidad alto segn el ensayo
anterior (vase la Fig. 2 A ). Despus de la centrifugacin de ambos lisados, se recuper S1 y se
dividi en partes alcuotas (2-4 ml). Estas alcuotas se ajustaron por duplicado con 1,0 M HCl a
valores de pH entre 1,0 y 4,5, en pasos de 0,5 unidades. Despus de la segunda centrifugacin
(4000 x g , 4C, 10 min) se recuper el producto (P2) y se trat como S1 anterior, antes de analizar
el contenido de protena.

(A) Solubilidad de N

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Fig. 2 . (A) Solubilidad de la protena de N. oculata en cuatro partes de agua de mar en la primera
etapa del proceso de cambio de pH, en el rango de pH 1-12. (B) Solubilidad de la protena de N.
oculata en la segunda etapa del proceso de cambio de pH en el que la solubilizacin se llev a cabo
ya sea a pH 7 10, y S1 se ajust entonces a pH 1-5. Obsrvese la diferencia de escala en el panel
A. Los puntos muestran repeticiones individuales, con experimentos de 5 das separados en A y 2
das separados (para ambos pH 7 y 10) en B.
La solubilidad de las protenas despus de la segunda centrifugacin se defini segn el mismo
principio anterior:

(2)ProtenaSol.,precipitacinpaso=protenaS2protenaS1*100,Donde [protena] S2 es la
concentracin de protena en S2.

Las solubilidades de las protenas en las etapas de solubilizacin y precipitacin se utilizaron para
adaptar el proceso de cambio de pH a N. oculata (vase la seccin 2.2.3 y la descripcin general de
la figura 1 ).

2.2.3 . Proceso de cambio de pH adaptado a N. oculata

N. oculata se mezcl con agua de mar hasta un peso seco del 10% y las clulas se interrumpieron
por latido de perlas. En la versin ms simple del proceso, el lisado se centrifug a continuacin a
su pH natural ( ca . 7) en 4000 g y 4 C durante 10 min. El sobrenadante de la primera
centrifugacin (S1), que contena la mayora de las protenas y lpidos, se transfiri a un tubo de
ensayo nuevo y se ajust a pH 3 mediante la adicin de HCl 1,0 M. Se repiti el centrifugacin
(4000 x g y 4 C durante 10 min), produciendo un sedimento (P2) con protenas y lpidos
concentradas. En un procedimiento alternativo, el lisado se ajust a pH 10 con 1,0 M antes
de la (primera) centrifugacin, con etapas de precipitacin y concentracin de protena como
anteriormente. Las muestras S2 y P2 de las dos versiones de proceso se denominan pH 7/3 o pH
10/3.

2.3 . Caracterizacin de las fracciones del proceso de cambio de pH

2.3.1 . Protena, polipptidos y aminocidos

El contenido de protenas en todas las fracciones liofilizadas se determin de acuerdo a [18] . El

mtodo se basa en el de Lowry [19] y extrae protenas usando precipitacin con cido
tricloroactico y cuantificacin espectrofotomtrica (Cary Win UV 50, Varian, Australia, con una
cubeta de flujo de suprasil de cuarzo, Hellma, Alemania o 0,5 ml de cubetas de plstico
desechables , Kartell, Italia, para muestras con volmenes < 3 ml). Se utiliz como patrn la
seroalbmina bovina (Bio-Rad Laboratories AB, Suecia).

La recuperacin de protenas se calcul de la siguiente manera: las masas de P2 y S2 se sumaron

para calcular una masa terica de S1. La masa de P1 se aadi a S1 para calcular la masa terica
inicial del lisado. Este retroclculo se realiz para compensar las prdidas de muestra de tubos de
centrifugacin, pipetas, etc. durante el proceso de cambio de pH. Debido al alto contenido de
agua, se supuso que la densidad de las fracciones hmedas era de 1,0 g / ml, dando el volumen
terico de cada una de las fracciones. Este volumen se multiplic con la concentracin de protena
medida (mg / ml) para obtener una masa proteica terica para cada una de las fracciones. Las
masas de protenas de las fracciones se expresaron luego como porcentaje de las protenas totales
en el lisado ( es decir, El material de partida) o S1 (dando el rendimiento durante la segunda etapa
de centrifugacin).

Para anlisis de electroforesis en gel de poliacrilamida del perfil polipeptdico, muestras de lisado
pH 7, lisado pH 10, S1 pH 7, S1 pH 10, P2 pH 7/3, P2 pH 10/3, S2 pH 7/3 y S2 pH 10 / 3 se
recogieron de un solo proceso de cambio de pH, se mezcl con un volumen igual de tampn de
muestra Laemmli, preparado de la siguiente manera: se adquiri tampn de muestra Laemmli 1: 1
de Bio-Rad y 1,0 ml aument con 78,5 mg de dodecilsulfato de sodio (Sigma - Aldrich) y 479 mg
de urea (Sigma - Aldrich). Las muestras se incubaron a continuacin a temperatura ambiente
durante 30 min y se congelaron rpidamente a - 20 C para el almacenamiento. Despus de
descongelar ellos, las muestras se centrifugaron a 15.000 g durante 5 Min (Heraeus Fresco 17,
Thermo Fisher Scientific, Suecia) y sobrenadante correspondiente a 20 g de protena cargada
sobre el gel. La escalera utilizada fue Precision Plus de Bio-Rad Plus Protein Dual Color Standard
(10-250 kD). El gel utilizado fue gel mini-proteico de poliacrilamida TGX 12% (Bio-Rad) en un
tampn de funcionamiento Tris / Glicina / SDS (Bio-Rad). El voltaje (220 V) fue constante durante
todo el recorrido (22 min). El gel se fij en una solucin 2: 5: 13 de cido actico (Scharlau), 2-
propanol (Fluka) y agua desionizada durante 30 min, se ti en azul de Coomassie C25 al 0,025%
(p / v) disuelto en agua desionizada Con cido actico al 10% durante 120 minutos y se destil en
cido actico al 10% en agua desionizada durante la noche. Para fines de formacin de imgenes,
los geles se escanearon en un Densitmetro Calibrado GS-800 (Bio-Rad).

La composicin de aminocidos se determin usando cromatografa lquida de alta presin (HPLC)

por un laboratorio externo acreditado (Eurofins) para el material inicial (lisado), producto P2 pH
7/3 y P2 pH 10/3. Se realizaron mediciones individuales para lisado pH 7 y lisado pH 10, mientras
que P2 pH 7/3 y P2 pH 10/3 se analizaron en duplicados.

2.3.2 . Acidos grasos: contenido y rendimiento

El contenido de lpidos se analiz como cidos grasos totales despus de la transmmetilacin

directa con HCl como se describe en otra parte [20] . Se analizaron las siguientes fracciones
liofilizadas: lisado, S1 pH 7, S1 pH 10, P1 pH 7, P1 pH 10, S2 pH 7/3, S2 pH 10/3, P2 pH 7/3 y P2 pH
10 / 3. El proceso de cambio de pH y el anlisis se repitieron en das separados, dando al menos
duplicados de cada medicin. Los rendimientos para cidos grasos totales se calcularon como para
la protena (vase la seccin 2.3.1 ).

2.3.3 . Contenido de carbohidratos

Total de carbohidratos se determinaron mediante un mtodo basado en Herbert, Phipps &

Strange [21] , adaptado para placas de 96 pozos. Se pipetearon 30 l de cualquiera de los
siguientes en una placa de 96 pocillos (Nunclon Delta Surface, Thermo Scientific, Dinamarca) en
triplicado: muestra (diluida con agua MQ, si era necesario), en blanco o estndar. A esto se a~
nadieron 30 l de fenol al 5% en agua MQ y se mezclaron, despus de que se a~ nadieron 150 l
de cido sulfrico concentrado y se mezclaron. La placa se incub a temperatura ambiente
durante 30 minutos y se midi la absorbancia a 488 nm en un lector de placas (Safire II, Tecan,
Austria). Las curvas estndar se construyeron a partir de glucosa. Las siguientes fracciones
liofilizadas se analizaron a partir de dos procesos de cambio de pH (realizados el mismo da):
lisado, pH S1 7, S1 pH 10, P1 pH 7, P1, pH 10, S2 pH 7 / 1,0-4,5, en pasos de 0,5 unidades, S2
10 / 1,0-4,5 en pasos de 0,5 unidades, P2 pH 7 / 1,0-4,5, en 0,5 Unidad de pasos, y P2 10 / 1.0-4.5,
en pasos de 0,5 unidad. En un da separado, el experimento se repiti parcialmente, de nuevo con
dos procesos paralelos, con anlisis de las siguientes fracciones: lisado, S1 pH 7, S1 pH 10, P1 pH
7, P1, pH 10, S2 pH 7 / 1.0-4.5 , En pasos de 1,0 unidad, S2 10 / 1,5-4,5, en pasos de 1,0 unidad,
P2 pH 7 / 1,5-4,5, en 1,0 pasos unitarios, y P2 10 / 1,0-4,5, en 1,0 pasos unitarios.

2.3.4 . Contenido de agua, cenizas y sodio

Contenido de agua en todas las fracciones se determin pesando las muestras antes y despus de
la liofilizacin (a - 50 C y una presin mnima de 0,05 mPa) a presin constante. El contenido de
agua tambin se confirm por la etapa de secado durante la noche de la determinacin del
contenido de cenizas.

El contenido de ceniza se determin pipeteando 2 ml de muestra en un crisol previamente

pesado, secando el crisol durante una noche a 90 C, volvindolo a pesar y calentando el crisol a
550 C durante 3 h. Despus de enfriar el crisol en un desecador, se determin la masa de la
muestra restante. Se analizaron las siguientes fracciones: lisado, S1 pH 7, S1 pH 10, P1 pH 7, P1
pH 10, S2 pH 7/3, S2 pH 10/3, P2 pH 7/3 y P2 pH 10/3. El proceso de cambio de pH y el anlisis
se repitieron en das separados, dando al menos duplicados de cada medicin (excepto para P2 pH
10, donde estn presentes triplicados de un proceso de cambio de pH).

El contenido de sodio del lisado, P2 pH 7/3 y P2 pH 10/3 se analiz por duplicado mediante
cromatografa inica de alta presin: las muestras se diluyeron con precisin en agua MQ, se
centrifug a 16.000 g durante 10 min a las partculas de sedimento y 20 l Inyectado en una
columna IonPac CS14 equipada con una columna de proteccin CG14, una bomba de gradiente
Dionex GS50 BioLC, un supresor de CMMS3 y un detector de conductividad Dionex CD20. La
elucin fue isocrtica con cido metanosulfnico 9 mM como la fase mvil a 0,90 ml / min. Los
picos se integraron manualmente con Chromeleon Software v. 6.80. Se prepar un patrn a partir
de cloruro sdico (Sigma). En el clculo, se asumi que cada ion de sodio en la muestra se
emparejaba con un ion de cloruro.

2.3.5 . Medidas de color

El color se midi con un colormetro (CR-400, Konica Minolta Sensing, Japn) en el espacio de
color CIE L * a * b * sujetando una sonda directamente contra el fondo de los tubos de centrfuga
de fondo redondo (centrfuga de polipropileno de base redonda transparente Tubos, TPP, Suiza)
que mantenan 3,0 ml de las suspensiones, tomando cinco mediciones de L *, a * yb *. A partir de
los resultados, se calcul la media y se us para calcular la blancura de acuerdo con la frmula:

(3)blancura=100-100-L2+un2+segundo2.
Las siguientes fracciones se analizaron a partir de dos procesos de cambio de pH realizados en das
separados con solubilizacin a pH 7 o 10 (con duplicados de anlisis): lisado, S1, S2 y P2. El
proceso de cambio de pH y el anlisis de color se repitieron en das separados, dando al menos
duplicados de cada medicin.

Para determinar cmo cambi el color a lo largo del tiempo, se llev a cabo un experimento sobre
P2 pH 7/3 y P2 pH 10/3: las muestras se mantuvieron sobre hielo y el color se midi como
anteriormente en el tiempo 0 (justo despus de separar el sedimento y el sobrenadante) , Despus
de 0,5 h, 1,1 h y 3,3 h. A las 4 h se congelaron las muestras de (- 20 C). La muestra congelada
se midi despus de 27 h en su estado congelado. Las muestras se prepararon por duplicado.

2.4 . Estadstica

Con el fin de determinar si los grupos eran significativamente diferentes, 2-tailed independiente
de la muestra T-tests se aplicaron (SPSS, versin 19, IBM). Los valores de P < 0,05 se consideraron
significativos.

3 . Resultados

3.1 . Adaptacin del proceso de cambio de pH a N. oculata

Para establecer ajustes de pH adecuados para las diversas etapas del proceso de cambio de pH, se
determin inicialmente la solubilidad de la protena para N. oculata en agua de mar a lo largo de
un amplio intervalo de pH. La solubilidad de las protenas fue elevada (> 60%) entre pH 5,5 y 10,5,
ver Fig. 2 A. A pesar de alguna variacin causada por experimentos que se repitieron en das
separados, hubo una meseta entre pH 5,5 y 8,5, donde 73 a 103% de La concentracin de protena
en el lisado se pudo detectar en el sobrenadante 1. A medida que aumentaba el pH, la solubilidad
disminuy lentamente a un promedio de 51% a pH 11,5-12. En el otro extremo del intervalo,
cuando el pH disminuy, la solubilidad disminuy bruscamente por debajo de 5,5, y fue 9% o
menor a pH 3.5. Basndose en este resultado, se eligieron pH 7 y 10 como pH de
solubilizacin en investigaciones posteriores.

La segunda parte del proceso de cambio de pH tiene como objetivo precipitar tanto como sea
posible la protena en S1, es decir , como poca protena debe permanecer soluble como sea
posible. Como se puede ver en la Fig. 2B, la concentracin de protena de S2 era solamente 2 - 7%
de S1 por debajo de 3,5. El pH de solubilizacin (7 10) no pareca tener un impacto importante
en la precipitacin de protenas; Sin embargo, despus de la centrifugacin, se observ que S2 pH
7 no se separaba de manera distinta de P2, como S2 pH 10. Aunque la solubilidad era muy
constante en el intervalo de pH de 1-3.5, el volumen de P2 disminuy a medida que la cantidad de
cido aadido Aumentado (vase la figura 3 ), Que refleja una conformacin de protenas ms
densa y / o reducida capacidad de retencin de agua de las protenas que permanecen en el
grnulo [22] . Como compromiso entre la solubilidad de la protena, la cantidad de cido a~nadido
y el volumen de P2, se eligi como pH de precipitacin el pH de 3 para investigaciones adicionales
del proceso de cambio de pH.

Volumen de P2 como porcentaje de S1 para el proceso de cambio de pH con solubilizacin ...

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Fig. 3 . Volumen de P2 como porcentaje de S1 para el proceso de cambio de pH con solubilizacin

a pH 7 (eje izquierdo) y la hipottica concentracin de HCl en el lisado de algas (eje derecho). Se
trazan puntos individuales. Vase la Fig. 2B para la curva de solubilidad de la protena.

3.2 . Caracterizacin de las fracciones del proceso de cambio de pH: macronutrientes

3.2.1 . Concentracin de macronutrientes

La Tabla 1 da una visin general de los macronutrientes del material de partida y fracciones de las
diversas etapas del proceso de cambio de pH. El proceso dio lugar a un enriquecimiento de
protenas, cidos grasos y carbohidratos, mientras que la cantidad de cenizas y agua se redujo,
como puede verse comparando el lisado y P2 ( es decir, el material de partida y el producto). El
aumento en el contenido de protena fue menor para ambos procesos, de 19% a ca. 24% de
protena por masa seca; La diferencia fue significativa (p < 0,05) slo para el pH de 7-proceso. El
aumento en el contenido total de cidos grasos fue slo significativo para el pH 10-proceso: de
10% a 13% de cidos grasos totales / peso seco. En ambos procesos el aumento en el contenido de
carbohidratos fue significativo cuando se compar el lisado con P2 en el intervalo entre pH 2,5 y
3,5. A pH 3, los carbohidratos / peso en seco aumentaron de 37% a 42% para el proceso de pH 7 y
de 37% a 58% para el proceso de pH 10. El contenido de cenizas disminuy durante el proceso de
34% a 25% en peso seco para el proceso de pH 7 y de 37% a 28% para el proceso de pH 10, lo que
representa una disminucin media de 25% en cenizas, aunque la disminucin fue estadsticamente
significativa Para el pH 7-proceso. Paralelamente a esta disminucin, se observ una pequea
eliminacin neta de agua a travs del proceso: Aunque el material de partida contena 10% de
materia seca, el producto final contena 13% de materia seca; Este incremento en materia seca fue
significativo para ambos procesos. La concentracin de cloruro de sodio no cambi de forma
mensurable durante el proceso: en lisado y P2 (independientemente del pH de solubilizacin) fue
2,5% en base hmeda.

Tabla 1 . La materia seca, la composicin macronutritiva y el contenido de cenizas de las diferentes

fracciones obtenidas en el proceso de cambio de pH se realizan con solubilizacin a pH 7 o 10. Los
macronutrientes (protena, cidos grasos totales, carbohidratos) y cenizas se muestran como
porcentaje de materia seca. SD = desviacin estndar, n, nmero de muestras, Rn = rango (mx-
min). Cada medicin es el resultado de al menos dos experimentos de cambio de pH de diferentes
das, con 1 a 4 cuatro repeticiones.

Muestra Masa seca / hmeda (%) Seco total (%) Protena / masa seca (%) FAs
/ masa seca (%) Carbohidratos / masa seca (%) Granos / masa seca (%)
Muestra Media Dakota del Sur norte Media Rn norte Media Rn
norte Media Rn norte Media Rn norte

Lisato, pH 7 10 0,4 11 100 19 0,7 4 11 0,6 3 37

3.3 2 34 4.8 3

S1, pH 7 9 0,6 9 103 17 1.9 2 10 0,4 4 37

0,9 2 38 7,7 3

P1, pH 7 20 0,2 4 97 17 2,0 2 11 2,5 2 40

3,0 2 29 13,3 2

S2, pH 7/3 6 1.0 12 79 1 0,1 2 2 4.6 7 32

1.1 2 44 3.1 3

P2, pH 7/3 13 1.2 7 103 23 1.0 2 12 1,5 2 42

4.5 2 25 2,4 3

Lisato, pH 10 10 1.1 6 103 No se mide un 10 0,6 3 No se mide

un 37 1.0 3

S1, pH 10 9 0,4 10 102 diecisis 0,1 2 10 0,5 4

34 2.1 2 41 8,6 3

P1, pH 10 17 0,9 4 98 18 1,6 2 13 1.0 2 40

3.9 2 27 2,9 2

S2, pH 10/3 6 1,5 12 76 1 0,1 2 1 0,8 7 30

0,3 2 44 22,5 3

P2, pH 10/3 13 1.3 7 123 24 2.2 2 13 0,5 2 58

4.6 2 28 14,5 3

un

El lisado de pH 10 no se midi, pero como la nica diferencia con respecto al lisado de pH 7 es una
pequea cantidad de base aadida, se supone que el pH 10-lisado es como pH 7.

3.2.2 . Rendimientos: protena y cido graso total

Se encontr que el proceso de cambio de pH recuperaba la mayor parte de la protena y los cidos
grasos totales inicialmente presentes en N. oculata . La recuperacin de protenas durante el
proceso de cambio de pH fue de 86% para el proceso de pH 7 y de 72% para el proceso de pH 10
(vase la Tabla 2 ). La prdida de protenas se produjo principalmente en el primer paso ( es decir,
la solubilizacin), donde el 15% de la protena no se cuenta, aunque parte de esta prdida se cree
que el muestreo y el error de anlisis.
Tabla 2 . Porcentaje de protena y cidos grasos recuperados para las diversas fracciones del
proceso de cambio de pH, expresado como porcentaje de protenas totales y cidos grasos en
lisado o S1.

Protena Total de AF

Lisado % S1 Lisado % S1

S1, pH 7 80 - 90 -

P1, pH 7 5 - 7 -

S2, pH 7 2 2 3 3

P2, pH 7 86 107 85 95

S1, pH 10 70 - 81 -

P1, pH 10 14 - 21 -

S2, pH 10 2 2 3 3

P2, pH 10 72 103 73 90

Los cidos grasos presentes en el lisado original se recuperaron principalmente en S1 en el primer

paso. Sin embargo, durante la etapa de precipitacin, slo quedaron trazas en S2, lo que indica
que los cidos grasos se acumulan en el producto rico en protenas del proceso de cambio de pH.
Como se puede observar en la Tabla 2 , el 85% de los cidos grasos totales presentes en el lisado
se recuperaron en P2 cuando el homogeneizado se solubiliz a pH 7, mientras que el 73% se
recuper en P2 cuando el homogeneizado se solubiliz a pH 10.

3.3 . Caracterizacin adicional de aislados del proceso de cambio de pH

3.3.1 . Perfil de aminocidos y polipptidos

El patrn de aminocidos para el lisado y P2 se muestra en la Tabla 3 . El cido glutmico y la

prolina fueron especialmente abundantes en todas las fracciones, representando el 11 y el 10% de
los aminocidos totales, respectivamente. El porcentaje de prolina en el producto fue
significativamente menor que en el lisado en ambos procesos: 10,3% de los aminocidos del lisado
fueron prolina, mientras que P2 contena 8,5% y 7,7% de prolina para el proceso de pH 7 y pH 10 ,
Respectivamente. 1 En el proceso de pH 10, esto fue compensado por un ligero pero significativo
aumento de leucina y fenilalanina (de 8,7 a 9,2% y de 5,1 a 5,4%, respectivamente).

Tabla 3 . Composicin de aminocidos para el lisado de N. oculata y producto (P2) del proceso de
cambio de pH con solubilizacin a pH 7 u 10. Los aminocidos esenciales estn marcados con
asteriscos. La primera columna indica la media de mg de aminocidos / g de masa seca; La
segunda columna muestra el intervalo (Rn = max-min), n = 2, donde indica que P2 es
significativamente diferente (p < 0,05) del lisado. La tercera columna muestra el porcentaje de
aminocidos individuales de los aminocidos totales.

Lisado P2, pH 7 P2, pH 10

Mg / g Rn % Total Mg / g Rn % Total Mg / g Rn % Total

Suma 235 24 265 10 340 8,2

Suma no esencial 137 14 59 151 5 57 193 5 57

Suma esencial 97 11 41 114 5.1 43 147 3.7 43

Alanina diecisis 2.2 7,0 18 0,6 7,0 24 1.1 7,0

Arginina 15 1.2 6,2 17 0,7 6,4 22 0,5 6,3

cido asprtico 21 2.2 8,9 24 1,4 9,0 31 1,4 9,2

Cystein + cistina 2,5 0,1 1.1 2.7 0,0 1.0 3,0 0,1 0,9

cido glutamico 26 2.6 11 29 1,6 11 38 0,8 11

Glicina 14 1,6 5,8 15 1.0 5,7 20 0,7 5,8

Histidina * 4.4 0,8 1.9 5,5 0,4 2.1 7.1 0,3 2.1

Isoleucina * 10 1.0 4.5 12 0,9 4.5 diecisis 0,4 4.6

Leucina 20 2.1 8,7 24 1,5 9,0 31 1.0 9,2

Lisina * 15 1,4 6.5 18 1.1 6,7 23 0,7 6,8

Metionina * 4.3 0,2 1.8 5,5 0,6 2.1 7,0 0,5 2.1

Fenilalanina * 12 1.3 5.1 14 1.0 5,3 18 0,6 5,4

Prolina 24 2,0 10 22 0,4 8.5 26 0,8 7,7

Serina 11 1,5 4.6 12 0,5 4.6 diecisis 0,7 4.7

Treonina * 12 1,4 5.0 13 0,6 5.0 17 0,9 5.1

Tryptophane (total) * 4.1 0,7 1,7 4.8 0,7 1.8 6,2 0,1 1.8

Tirosina8,8 0,5 3.7 10 0,7 3.9 13 0,6 3.9

Valina 15 2.2 6,3 17 0,4 6,4 21 0,7 6,3

Los polipptidos de lisado, S1, P2 y S2 se separaron por electroforesis en gel en patrones de banda
casi idnticos, vase la Fig. 4 , indicando que las composiciones de polipptidos apenas se vieron
afectadas por el proceso de cambio de pH, independientemente de si se llevaron a cabo con
solubilizacin a pH 7 o 10. bandas prominentes en todas las muestras tenan pesos moleculares
aparentes de 50 kDa y ca . 21 kDa. La banda de 21 kDa se enriquece ligeramente en S2 y P2 en
comparacin con el lisado y S1, particularmente despus de la solubilizacin a pH 10.

SDS-PAGE de varias fracciones del proceso de cambio de pH, con solubilizacin a ...

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Fig. 4 . SDS-PAGE de varias fracciones del proceso de cambio de pH, con solubilizacin a pH 7
(pistas 2-5) o pH 10 (carriles 7-10). Los carriles 1 y 6 contienen escalera de protena, con la masa
molecular (en kD) indicada en la extrema izquierda. Las fracciones de muestra son: lisado (carriles
2, 7), S1 (carriles 3, 8), P2 (carriles 4, 9), S2 (carriles 5, 10).

3.3.2 . Perfil de cidos grasos

Los principales cidos grasos de N. oculata en el lisado a pH 7 fueron el cido palmitoleico al 31%
de los cidos grasos totales, el cido palmtico al 28% y el cido n-3 PUFA eicosapentaenoico (EPA)
al 18% ( Tabla 4 ) ; Estos porcentajes tambin eran tpicos para productos precipitados a pH 3,
independientemente de si el lisado inicial se solubiliz a pH 7 10. Otros cidos grasos
identificados en lisado y producto final fueron cido oleico, cido araquidnico, cido mirstico y
cido linoleico, presente a 3 -8% del total de cidos grasos.

Tabla 4 . Composicin de cidos grasos para el lisado de N. oculata y producto (P2) del proceso de
cambio de pH con solubilizacin a pH 7 10. La primera columna indica la media de mg de cidos
grasos / g de masa seca; La segunda columna muestra SD (desviacin estndar) o Rn (rango = max-
min) con el nmero de repeticiones (n) de experimentos de cambio de pH realizados en dos
ocasiones diferentes; La tercera columna muestra el porcentaje de cidos grasos totales.

Lisato, pH 7 P2, pH 7 P2, pH 10

Mg / g SD, n = 3 % Total Mg / g Rn, n = 2 % Total Mg / g Rn, n = 2 % Total

Suma 105 2,9 123 15 129 4,9

C12: 0 0,3 0,0 0,3 0,4 0,1 0,3 0,4 0,0 0,4

C14: 0 5,5 0,2 5,2 6,7 1.1 5,4 7,0 0,4 5,7

C15: 0 0,4 0,0 0,3 0,4 0,1 0,4 0,5 0,0 0,4

C16: 0 29 1.1 28 34 4.5 28 36 1,7 29

C16: 1 n7 32 1.2 31 37 4.3 30 39 1,4 31

C17: 0 0,3 0,0 0,3 0,4 0,1 0,3 0,4 0,0 0,3

C17: 1 0,3 0,0 0,3 0,4 0,1 0,3 0,5 0,0 0,4

C18: 0 0,4 0,0 0,4 0,5 0,1 0,4 0,5 0,0 0,4

C18: 1 n9 7,9 0,2 7,5 9,5 1,4 7,7 9,9 0,6 8.0

C18: 1 n7 0,4 0,0 0,4 0,5 0,1 0,4 0,5 0,1 0,4

C18: 2 n6 3,5 0,1 3.3 4,2 0,6 3,4 4.5 0,2 3.6

C18: 3 n6 0,4 0,0 0,4 0,5 0,1 0,4 0,6 0,0 0,5

C _ {20}: 4 n _ {6} 5,2 0,2 4,9 6,2 0,7 5.0 6.5 0,1 5,3

C20: 5 n3 19 0,6 18 23 2.1 18 24 0,1 19

3.3.3 . Color

Todas las fracciones aparecieron de color verde oscuro a simple vista (aproximadamente el color
de la espinaca fresca), lo que se reflej en un * -valores entre - 5,7 y - 8,4. P1, que no se midi
debido a que el volumen de la muestra era demasiado pequeo, era tambin de color verde
oscuro, pero se observ que era la nica fraccin que no pareca homognea: en cambio, una
delgada capa gris divida el grnulo de color verde oscuro. El lisado y S1 eran indistinguibles en
color con respecto a los valores de L * - (ligereza), a * - (enrojecimiento) y b * - (amarillez), con
muy poca diferencia entre el pH de solubilizacin, vase la Fig. 5 . Las fracciones finales de la etapa
de precipitacin, S2 y P2, tuvieron valores significativamente incrementados de L *, b * y W
cuando se compararon con el lisado tanto para el pH 7 como para el pH 10-proceso. Al mismo
tiempo, un * disminuy significativamente en P2 cuando se compar con el lisado, reflejando un
mayor color verde. Con el tiempo, a * aument en P2, es decir , el producto se volvi menos verde
(vase la figura 6 ). Este cambio fue visto tanto durante el almacenamiento en hielo, y despus del
almacenamiento congelado posterior a - 20 C.

Color del lisado ("lys"), S1, P2 y S2 del proceso de cambio de pH con ...

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Fig. 5 . Color del lisado ("lys"), S1, P2 y S2 del proceso de cambio de pH con solubilizacin a pH 7
(izquierda) y pH 10 (derecha). (A) muestra b * (eje de color amarillo / azul) y un * (eje de color
rojo / verde). (B) muestra L * (ligereza) y W (blancura) de la muestra. Las barras de error indican
desviacin estndar, n = 4 de duplicados en dos ocasiones separadas; indica donde el lisado es
significativamente (p < 0.05) diferente del producto, indica que el proceso de pH 7 es
significativamente diferente del proceso de pH 10.

Cambios en un * -valores sobre 3

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Fig. 6 . Cambios en los valores de * * durante 3,3 h de almacenamiento de hielo de P2 del proceso
de cambio de pH con solubilizacin a pH 7 o 10; Tenga en cuenta que la muestra se congel
despus de la cuarta medicin; Se representa la media de n = 2.

4 . Discusin

4.1 . Proceso

En este estudio se evaluaron dos versiones del proceso de cambio de pH, una con la primera etapa
de separacin realizada al pH nativo del lisado de algas y la segunda despus de la alcalinizacin
del lisado a pH 10; Ambas versiones consistieron en agua de mar (el principal componente de los
medios de cultivo de algas) como una forma de reducir el consumo de agua de proceso. La
alquizacin se ha utilizado en una larga serie de estudios sobre el aislamiento de protenas
musculares [10 , 11 , 23 , 24] , y tambin en los estudios de aislamiento de protenas vegetales [7 ,
8] , incluyendo las microalgas [15 - 17]. Una razn de la etapa de alcalinizacin ha sido que mejora
la solubilizacin debido a la repulsin negativa entre protenas. En este estado solubilizado, se ha
facilitado la separacin entre protenas y compuestos no solubles. Sin embargo, encontramos que
el pH en el rango de 5,5 a aproximadamente 11 tiene poco impacto sobre la solubilidad y el
rendimiento de protenas de N. oculata . Por lo tanto, sugerimos que se omita el ajuste inicial del
pH, ahorrando tiempo de procesamiento y productos qumicos. Sin embargo, se observ que el
producto final, P _ {2}, del proceso de pH 7 no se empaquet tan densamente como el del proceso
de pH 10. En otras palabras, P2 y S2 eran menos distintos. Aunque el sobrenadante con un lmite
brumoso era ms difcil de separar del grnulo, no se observ diferencia significativa del producto
final a partir del pH 7 en comparacin con el proceso de pH 10 con respecto al contenido de
humedad, composicin macronutritiva o color.

P1 era de volumen pequeo en comparacin con S1, independientemente del pH de

solubilizacin. No est claro exactamente qu se estaba eliminando en la primera centrifugacin:
la composicin de macronutrientes de P1 fue similar al lisado, S1 y P2 sugiriendo una similitud
considerable con estas fracciones. Sugerimos que la parte verde de P1 consisti en clulas intactas
de N. oculata y, por lo tanto, puede haber sido eliminado mediante la ampliacin de la perla baten
tiempo. La banda gris en P1 puede ser organismos invasivos y otros contaminantes, considerando
que la biomasa comercial de algas utilizada en nuestro estudio no era de calidad alimentaria, sino
que estaba destinada a la acuicultura.

De acuerdo con los trabajos anteriores sobre los pescados grasos y semi-grasos [10 , 24 , 26] ,
puede ser posible recuperar una capa de grasa flotante en la primera centrifugacin: N. oculata
puede acumular triacilgliceroles cuando se cultivan en condiciones de nitrgeno limitado [ 27-29] .
Puede ser posible utilizar el proceso de cambio de pH para recuperar tales triacilgliceroles que
podran esperarse coalescerse y flotar como una capa de aceite o emulsin dependiendo de la
capacidad de emulsin de los otros constituyentes de lisado. A un contenido lipdico bajo, tal
como el N. oculata utilizado en el presente estudio (10% de lpidos por peso seco), los cidos
grasos estn presentes principalmente en forma de lpidos polares, por ejemplo fosfolpidos y
glicolpidos asociados con membranas[28] . Se puede esperar que estas clases de lpidos se
asocien con protenas a travs de la red citoesqueltica [30] y, por lo tanto, no se separarn a las
fuerzas centrfugas relativamente bajas aplicadas aqu (4000 g ). Trabajos anteriores sobre el
proceso de cambio de pH tambin ha ilustrado cmo las membranas celulares pueden sedimentar
a la aplicacin de las fuerzas centrfugas en contraste con los triacilgliceroles que flotan [10] .

La solubilidad proteica de Nannochloropsis obtenida en este estudio es comparable a la de

estudios similares: aqu, la solubilidad fue alta (> 80%) en el rango de pH 6 a pH 11, mientras que
fue baja por debajo de pH 4. Estudios anteriores han encontrado que Scenedesmus Acutus
protena fue maximalmente soluble a pH 11,5 con el pI a pH 3,5 [31] , S. platensis protena fue
maximamente soluble a pH 8,0 con el pI a pH 3,0 [13] , y Tetraselmis sp. La protena era muy
soluble por encima de pH 6 con mnima solubilidad por debajo del pH 4 [17] . Trabajos recientes
sobre Nannochloropsis Es algo difcil de interpretar en relacin con nuestros propios datos, ya
que la biomasa desgrasada se utiliz en la cartografa de la solubilidad dependiente del pH [15] .
Sin embargo, surgi el mismo patrn general, con mayor solubilidad a pH alto y baja solubilidad
por debajo de pH 5; PI se determin a pH 3,2. En general, [15] encontr menor solubilidad de la
protena de Nannochloropsis desgrasado que no desgrasado que se les atribuye, por ejemplo,
desnaturalizacin parcial de las protenas por el disolvente desgrasante. En nuestro estudio, pI no
fue tan distinto como en el estudio de [15] ; Solubilidad en su lugar se mantuvo baja de pH 3 a 1, lo
que es ms probable explicado por el uso de agua de mar en nuestro estudio. Es bien conocido
que los aniones tales como Cl - puede interactuar con grupos cargados positivamente en
protenas, desplazando el pI hacia valores de pH ms bajos [32] . Esto es ms apoyado por el
trabajo de [17] , que investig cmo la protena solubilidad curva de Tetraselmis sp. Respondi a la
fuerza inica (0,03, 0,2 0,5 M, lograda por diferentes niveles de NaCl) del medio acuoso; Que
demostr que a pH bajo, la solubilidad era menor a mayor fuerza inica, mientras que tambin no
pI distinta podra ser visto [17] .

En el estudio mencionado anteriormente [15] donde Nannochloropsis desgrasado y no desgrasado

se compar en un proceso de cambio de pH similar a la que presentamos aqu, algunas diferencias
fueron que i) P1 fue re-extrado y ii) la centrifugacin se llev a cabo en 20.000 x g . Dado que P1
era muy pequeo en nuestro caso, es decir , no conserv una gran cantidad de protenas
solubilizadas, no sentimos que era necesario volver a extraer P1. Tambin hemos elegido una
fuerza centrfuga inferior para facilitar la ampliacin. A pesar de la menor fuerza centrfuga
aplicada aqu, hemos logrado recuperar 72% de la protena, lo que sugiere que 4000 g es
suficiente.

4.2 . Limitaciones analticas

Para la composicin de macronutrientes de las diversas fracciones, el total no alcanz el 100% en

todos los casos. En S2 pH 7/3 y S2 pH 10/3, algunos macronutrientes slo estaban presentes en
cantidades traza, haciendo la cuantificacin incierta. Puesto que S2 era una solucin clara, parece
improbable que exista mucho lpido presente que se podra esperar que forme micelas de
dispersin de la luz. Tambin parece improbable que S2 contenga ms protenas que las
detectadas, considerando que toda la protena presente en S1 se recuper en P2 (vase la Tabla
2). La medicin del contenido de ceniza es un mtodo robusto, y adems se esperaba una cantidad
considerable de cenizas en el producto, debido al agua de mar utilizada en el mtodo. Sin
embargo, se observ una variacin considerable en el mtodo de carbohidratos, que puede
explicar parcialmente por qu los macronutrientes no se suman al 100% en S2 o P2 pH 10/3.

El mtodo para la deteccin de protena total dio un resultado inferior a la de aminocidos ( cf .

Tablas 1 y 3 ): Lisado contena% de protena 19 con el mtodo espectrofotomtrico y 24% con el
mtodo cromatogrfico. Aunque la diferencia fue ligeramente menor para P2, pH 7 (23% y 27%,
respectivamente), fue grande para P2, pH 10: 24% y 34%, respectivamente. No est
completamente claro para nosotros por qu el anlisis espectrofotomtrico dio resultados ms
bajos, aunque es posible que alguna protena se perdi en la manipulacin o que el pesaje inicial
de la muestra seca fue errnea. Tambin se ha descrito cmo el principio de anlisis de Lowry
puede dar subestimaciones para las protenas con bajo porcentaje de tirosina, triptfano o
residuos de cistena [33] .

4.3 . Color

El color del producto (P2) era inicialmente verde oscuro, reflejado por un valor negativo a *,
aunque el color verde disminuy con el tiempo. Presumiblemente, la reduccin en el color verde
fue el resultado de Mg 2 + dejando el anillo de porfirina de la clorofila, una reaccin conocida
como la reaccin de ffetianizacin [34] . La ffetitinizacin tiene lugar a pH bajo. Mg 2 + se
sustituye por 2H + y esta reaccin produce un cambio en la longitud de onda de absorcin [35] . Si
se desea un producto fuertemente verde, es probable que el aumento del pH de nuevo a neutro
estabilizara la clorofila. Si, por otra parte, el color verde se considera indeseable, puede ser
posible degradarlo almacenando el producto a pH 3 por tiempo prolongado, aunque
investigaciones adicionales deberan abordar esta cuestin especficamente. La estabilidad al
almacenamiento de protenas, cidos grasos y otros nutrientes en el producto de algas producido
por el cambio de pH no se conoce en este punto.

4.4 . Consideraciones sensoriales y nutricionales

Dado que el agua de mar se utiliz en nuestro proceso, el contenido de cloruro de sodio en el
producto final (hmedo) fue de 2,5%. Este contenido de sal es ligeramente menor que en otros
alimentos salados como arenque en vinagre (~ 3,5%), jamn ahumado (~ 3,6%), el queso feta (~
2,7%), y las aceitunas en vinagre (~ 5,6%) [36] , y Sugiere que el aislamiento de algas podra
aportar sabor / salinidad a los alimentos compuestos, mientras que al mismo tiempo la entrega de
protenas valiosas y LC n-3 PUFA.

El patrn de aminocidos para el lisado y P2 de acuerdo con lo publicado anteriormente por

Brown para N. oculata [37] . Se encontr que N. oculata es una buena fuente de protenas, ya que
excede las cantidades de aminocidos indispensables por aminocidos totales, como recomienda
la OMS para los seres humanos [38] . En particular, el triptfano y la treonina fueron abundantes:
la OMS recomienda que estas protenas estn presentes al menos en 0,6 y 2,3% de los
aminocidos totales de la dieta, respectivamente [38]. Aunque el triptfano comprenda slo el
1,8% de los aminocidos totales en todas las fracciones y la treonina 5,0%, esto corresponde al
triple y el doble de los porcentajes recomendados, respectivamente. Del mismo modo, el patrn
de cidos grasos estuvo de acuerdo razonablemente bien con el determinado previamente para N.
oculata [39] . Con aproximadamente 10% de cidos grasos por peso seco, de los cuales casi el 20%
fue el LC n-3 PUFA EPA, N. oculata es una excelente fuente tanto de protenas de alto valor como
de cidos grasos n-3. Como parte del proceso de cambio de pH, las paredes celulares se
interrumpen, un paso que creemos aumenta considerablemente la biodisponibilidad de los
nutrientes, aunque los estudios futuros deben investigar esta cuestin ms cerca. Vemos potencial
para el uso del producto del procesamiento de N. oculataComo ingrediente funcional de alimentos
y piensos, aunque debe tenerse en cuenta la legislacin local. Elegimos N. oculata no slo porque
se cultiva en gran escala, sino tambin porque es un organismo seguro al mejor de nuestro
conocimiento.

5 . Conclusin

Hemos demostrado que es factible aplicar el proceso de cambio de pH a N. oculata . El producto

contena concentraciones ligeramente elevadas de protenas, cidos grasos totales e hidratos de
carbono, mientras que el contenido de agua y cenizas se redujo. Para las versiones neutras y
alcalinas probadas, los rendimientos de protenas y cidos grasos fueron superiores al 80% y al
70%, respectivamente. Por lo tanto, proponemos el producto del proceso de cambio de pH sobre
N. oculata como un ingrediente funcional rico en protenas y LC n-3 PUFA tanto para alimentos
como para piensos.

Expresiones de gratitud

Este estudio fue financiado por Chalmers University of Technology . Nos gustara agradecer a
Andrew Vicente por la asistencia prctica con la electroforesis; Jenny Veide Vilg y Nathalie Scheers
para la asistencia terica con electroforesis y protena estndar; Y Nils-Gunnar Carlsson para
asistencia con cromatografa inica