PRCTICA 5: NUMERACIN DE BACTERIAS COLIFORMES,

COLIFORMES FECALES Y E. Coli.

I. INTRODUCCIN

La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a estos

microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o
anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas.
La presencia de Coliformes fecales y Escherichia coli se utiliza para indicar una
contaminacin potencialmente peligrosa por el hecho de que el hbitat natural de
estos microorganismos son las heces humanas y de animales de sangre caliente.
E. coli es aceptada como el indicador ms positivo de contaminacin fecal reciente.
Esta contaminacin se produce, de modo general, por deficiencias en la limpieza y
desinfeccin en las industrias y por falta de higiene de los manipuladores.

II. OBJETIVOS

- Familiarizarse con los mtodos de recuento, especialmente con el de NMP.

- Detectar bacterias coliformes totales, fecales y E.coli de un alimento.

III. MATERIAL
- Muestra (Agua)
- Placas de Petri
- Tubos de ensayo 16 x 150
- Tubos de ensayo 13 x 100
- Pipetas de 10 y 1 ml.
- Campanas Durham de 10 x 75
- Gradilla
- Mechero Bunsen

- Caldo lactosa bilis verde brillante (BRILLA)

- Caldo triptonado o peptonado.
 - Estufa regulada a 35 37 C.
- Bao mara regulado a 44 C.
- Reactivo KOVACS.

IV. PROCEDIMIENTO
El procedimiento a seguir, depende del tipo de microorganismo que se quiere
enumerar en la muestra de alimento. As para la presente prctica, se determinar
en una muestra de agua el nmero de coliformes totales, coliformes fecales
(termotolerantes) y E. coli fecal.

A. DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES

1. Desinfectar la mesa de trabajo con alcohol yodado.

2. Agitar el frasco que contiene la muestra.
3. Pipetear 10 ml de la muestra original a cada uno de los tres primeros
tubos conteniendo 10 ml de caldo BRILLA doble concentrado, 1 ml a
los tres siguientes tubos conteniendo BRILLA a concentracin normal,
y 0,1 ml a los tres tubos restantes con BRILLA concentracin normal.
4. Homogeneizar la siembra adecuadamente e incubar los tubos a 35 37
C durante 24 a 48 horas.
5. Anotar como positivos los tubos que muestren produccin de gas en las
campanas Durham.
6. Obtener el Nmero Ms Probable (NMP) ver tabla.

B. DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES Y E. coli

1. De cada tubo positivo (presencia de gas) del paso anterior, sembrar una
alcuota en caldo BRILLA (concentracin simple) y otra alcuota en
caldo triptonado.
2. Incubar en bao mara a 44 C durante 24 a 48 horas.
3. Luego del tiempo de incubacin, efectuar la prueba del Indol en los
tubos con caldo triptonado, para lo cual se adiciona 2 a 3 gotas de
reactivo de Kovacs.
4. Agitar el tubo y observar la formacin de un anillo color grosella en la
interfase del medio de cultivo (reaccin positiva); un color naranja,
indica la presencia probable de escatol y puede ser reportado tambin
como una prueba positiva.
5. Los cultivos (tubos) que muestren produccin de gas en caldo BRILLA
y formacin de Indol en caldo triptonado son positivos a E. coli fecal.
6. Los cultivos que slo muestren produccin de gas ms no produccin
de Indol se consideran coliformes fecales.
7. Determinar el NMP de coliformes fecales y E. coli en la tabla de NMP.

POSITIVO
Presencia de E.coli en caldo
triptonado
 TABLA DEL NMERO MS PROBABLE
ndice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de
resultados positivos y negativos cuando se utilizan tres alcuotas de 10, 1 y 0,1
ml.

Lmite de
10 ml 1 ml 0,1ml NMP/100ml confianza

0 0 1 3 0,5 9

0 1 0 3 0,5 13

1 0 0 4 0,5 20

1 0 1 7 1 21

1 1 0 7 1 23

1 1 1 11 3 36

1 2 0 11 3 36

2 0 0 9 1 36

2 0 1 14 3 37

2 1 0 15 3 44

2 1 1 20 7 89

2 2 0 21 4 47

2 2 1 28 10 150

3 0 0 23 4 120

3 0 1 39 7 130

3 0 2 64 15 380

3 1 0 43 7 210

3 1 1 75 14 230

3 1 2 120 30 380

3 2 0 93 15 380

3 2 1 150 30 440

3 2 2 210 35 470
 3 3 0 240 36 1300

3 3 1 460 71 2400

3 3 2 1100 150 4800

TABLA DEL NMERO MS PROBABLE

Nmero Ms Probable (NMP) de bacterias; tres tubos de cada dilucin

Nmero de tubos positivos en cada nivel

Lmites de confianza
de dilucin NMP por g.
Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 99% 95%
0 1 0 3 <1 23 <1 17
1 0 0 4 <1 28 1 21
1 0 1 7 1 35 2 27
1 1 0 7 1 36 2 28
1 2 0 11 2 44 4 35
2 0 0 9 1 50 2 38
2 0 1 14 3 62 5 48
2 1 0 15 3 65 5 50
2 1 1 20 5 77 8 61
2 2 0 21 5 80 8 63
3 0 0 23 4 177 7 129
3 0 1 40 10 230 10 180
3 1 0 40 10 290 20 210
3 1 1 70 20 370 20 280
 3 2 0 90 20 520 30 390
3 2 1 150 30 660 50 510
3 2 2 210 50 820 80 640
3 3 0 200 100 1900 100 1400
3 3 1 500 100 3200 200 2400
3 3 2 1100 200 6400 300 4800

V. RESULTADOS

- DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES ( PROCEDIMIENTO)

1. Los materiales utilizados en esta prctica fueron : 9 tubos de ensayo , 4

pipetas esterilizadas , muestra de jugo batido de cualquier tienda ( jugo de
surtido de papaya) y un mechero.
2. Se utiliz el medio siembra del Caldo brilla ( verde brillante bilis 2%
caldo), 10 ml por cada tubo. Se procede a ordenar en columnas de tres y se
rotula con las concentraciones que se trabajaran.

USO: medio recomendado para recuento de coliformes totales y fecales

por la tcnica del nmero ms probable.

FUNDAMENTO : en el medio de cultivo, la peptona aporta los

nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el
 verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de
bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliforme, y la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable.
Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin d la lactosa con
produccin de cido y gas.

3. Se tom una muestra de 1 mililitro con la pipeta del jugo licuado y luego
fue aadida a la primera fila de 10-1 .
 Luego de haber puesto la muestra de un mililitro por cada tubo de la
primera columna se procede a sacar una muestra de la primera columna a la
siguiente fila como se mostrara en la imagen:
 COLUMNA COLUMNA COLUMNA
10-1 10-2 10-3

FILA C

FILA B

FILA A

Finalmente se coloca en cada tubo una campana Durham y se lleva a incubar

por 48 horas a 35 37 C.
- RESULTADOS OPTENIDOS DESPUES DE LA INCUBACIN

COLUMNA 10-1 COLUMNA 10-2

COLUMNA 10-3
 Para poder dar los resultados
debemos aclarar que la
muestra da positivo cuando la campana se desplaz para arriba a
consecuencia del aire formado por los coliformes presentes .

FILA / 10-1 10-2 10-3

COLUMNA
A POSITIVO POSITIVO POSITIVO

B POSITIVO POSITIVO POSITIVO

C POSITIVO POSITIVO NEGATIVO

TOTAL 3 3 2

TABLA 1 : RESULTADOS DE PRACTICA

VI. DISCUSIN

- A partir de la tabla de resultados de practica :

FILA / 10-1 10-2 10-3

COLUMNA
A

C -

TOTAL 3 3 2

Comparamos estos resultados con la tabla del nmero ms probables y

obtenemos lo siguiente:

Que el nmero ms probable es de 500 bacterias por ml.

VII. CONCLUSIONES
 Una de las cualidades de los coliformes es la fermentacin de la lactosa del
medio produciendo cido y gas, lo cual es nuestro indicador para saber si la
prueba resulta positiva o negativa.

El medio ( caldo brilla) es muy selectivo lo cual no permite el crecimiento de

otras bacterias a excepcin de coliformes.

El mtodo del NMP est basado en la subdivisin de la muestra y por lo

tanto puede ser descripto como el mtodo de dilucin hasta extincin en
mltiples tubos. Cuando se realizan sucesivas diluciones seriadas de una
muestra, las diluciones ms altas contendrn una cantidad tan pequea de
muestra original que podran no contener microorganismos. La informacin
ms satisfactoria se obtiene cuando todos los tubos con la mayor porcin de
muestra ( menor dilucin) muestra crecimiento y los tubos con la menor
porcin de muestra ( mayor dilucin) no muestra crecimiento . Por lo tanto
la practica nos demuestra que si hubo presencia de coliformes en el jugo
batido comprado.

Este anlisis es de relevante importancia ya que la presencia de un nmero

considerable de bacterias coliformes indica:

o Inadecuado procesamiento y/o recontaminacin post procesamiento,

frecuentemente a partir de alimentos muy contaminados, equipos
sucios o manipulacin no higinico.
o Que las condiciones fueron tambin favorables para la multiplicacin
de un amplio rango de organismos patgenos y toxicognico.
VIII. BIBLIOGRAFA

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