ICIDCA.

Sobre los Derivados de la Caa de

Azcar
ISSN: 0138-6204
revista@icidca.edu.cu
Instituto Cubano de Investigaciones de los
Derivados de la Caa de Azcar
Cuba

Guerra, Mercedes; Ortega, Grisel

Separacin, caracterizacin estructural y cuantificacin de antocianinas mediante mtodos qumico-
fsicos. Parte I
ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, vol. XL, nm. 2, mayo-agosto, 2006, pp. 35-44
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar
Ciudad de La Habana, Cuba

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120664005

Cmo citar el artculo

Nmero completo
Sistema de Informacin Cientfica
Ms informacin del artculo Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal
Pgina de la revista en redalyc.org Proyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
 Mercedes Guerra, Grisel Ortega

Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar (ICIDCA)

e.mail: mercedes.guerra@icidca.edu.cu

RESUMEN

Las antocianinas son compuestos fenlicos del grupo de los flavonoides y estn presen-
tes en la naturaleza como pigmentos en las flores, frutos y hojas de algunas plantas. Se
presenta una revisin bibliogrfica sobre separacin y caracterizacin estructural de las
antocianinas. Se describen las propiedades qumico-fsicas y los mtodos utilizados para
la separacin y purificacin de las mismas en materiales vegetales y en extractos comer-
ciales. Se muestran diferentes adsorbentes y sistemas de fase mvil especficos en anli-
sis de mezclas de antocianinas utilizando los mtodos de cromatografa de placa delga-
da y HPLC.

Palabras clave: Antocianinas, flavonoides, Cromatografa de Capa Delgada,

Espectroscopa UV-VIS, adsorbente, fase mvil

ABSTRACT

Anthocyanins are phenolic compounds that belong to the flavonoid group and appear in
nature as pigments in flowers, fruits and leaves of some plants.
The present paper is a bibliographic description concerning to the separation and struc-
tural characterization of anthocyanins and describe its physico-chemical properties and
the methods used in their separation and purification from plant materials and com-
mercial extracts. Different adsorbents as well as specific movil-fhase systems in tests of
anthocyanins mixtures, using methods of thin layer chromatography are shown.

Key words: Anthocyanins, flavonoid, Thin Layer Chromatography, VIS-UV Spectroscopy,

adsorbent, movil-phase

ICIDCA No. 2, 2006 35

INTRODUCCIN
Las antocianinas son compuestos fenli-
cos del grupo de los flavonoides (1) y estn
presentes en la naturaleza en forma de pig-
mentos en flores, frutos, bayas y hojas con
grandes variedades de estructuras qumicas,
concentraciones y siendo caracterstica de
cada material y atributo especfico para la
caracterizacin del mismo. Tambin se con-
sidera que son metabolitos secundarios de
las plantas con actividad biolgica.
En la actualidad en la industria alimen-
taria, cosmetolgica y farmacutica son uti-
lizados una gran cantidad de compuestos
obtenidos por va sinttica que ocasionan
graves daos a la salud, entre los cuales se
encuentran los colorantes. Por esto, la ten-
dencia actual es sustituir este tipo de com-
puesto de amplio uso por pigmentos de ori-
gen natural, sobre todo de compuestos que
imparten coloraciones rojos brillantes (2)
que brindan un aspecto ms atractivo para
la comercializacin de algunos productos.
En estudios recientes, se ha reportado
que las antocianinas inhiben el crecimiento
de las clulas (3) cancergenas y ayudan a
prevenir el cncer del coln e impiden
enfermedades del corazn al inhibir la sn-
tesis del colesterol, mejoran la circulacin y
fragilidad de los vasos capilares (4), logran-
do beneficios antienvejecimiento. Por esta
razn, se ha incrementado la demanda del
producto, lo que conlleva a la bsqueda de
nuevas tcnicas para la obtencin de anto-
cianinas a grandes escalas y en particular la
de origen natural, por lo que se ha encami-
nado la va biosinttica, lo cual ha conlleva-
do a los estudios de separacin, caracteriza-
cin estructural y al desarrollo de nuevas
tcnicas analticas para cuantificar las anto-
cianinas obtenidas.
DESARROLLO DEL TRABAJO
Mecanismo de biosntesis de los flavonoides
Las variaciones en la estructura del
esqueleto de los flavonoides se reportan que
dependen de reacciones de hidroxilacin
O- metilacin y formacin de glucsidos y
oxidacin del anillo B. Algunas variaciones
asociadas con el anillo B han sido encontra-
das para los isoflavonoides y rotenonas. (5)
36
El paso principal en la biosntesis de
todos los flavonoides est relacionado con
la formacin de un intermediario chalcona.
Se reporta que la formacin de la chalcona
se produce por condensacin de la coenzi-
ma p- coumaril.
En los primeros intermediarios de la for-
macin de chalcona se identifican tres uni-
dades de malonil-CoA enzima (acetil -CoA.
La chalcona y echinatina presentan un
modelo de hidroxilacin inusual, ya que la
funcin cetona insaturada en la molcula de
chalcona normal sufre una transposicin.
Los grupos hidroxilos se convierten en 5,7
dihidroxiflavonoides.
La sntesis de flavona es altamente espe-
cfica slo para p-coumaril-CoA enzima y
para grupos hidroxilos.
Las Flavonas se forman a partir de meca-
nismos de oxidacin. Las dihidroflavonas
son intermediarios importantes en la biosn-
tesis de diferentes flavonoides. Por ejemplo,
para la biosntesis de cianidina y quercitina,
el dihidrokaempferol se reporta como un
excelente precursor.
En la biosntesis de taxifolina ocurre la
incorporacin de chalcona con retencin de
un protn en la posicin C-2. Esto excluye
que para los intermediarios y la formacin
de chalcona pueda ocurrir por la va de un
epxido.
La formacin de isoflavonoides puede
ocurrir mediante una reestructuracin en el
esqueleto de la chalcona involucrando un
cambio en las posiciones de enlaces 1,2 -ar-
licos.
Caracterstica qumico-fsica de las antocia-
ninas
Las antocianinas son compuestos fenli-
cos caracterizados por la presencia de un
aglicn (antocianidina) del grupo de los fla-
vonoides. Su frmula bsica est conforma-
da por dos anillos aromticos unidos por
una estructura de tres carbonos. En su
forma natural, esta estructura corresponde a
hetersidos formado por la combinacin de
un aglicn (antocianidina) y de un azcar
(generalmente glucosa). Si adems del az-
car en la molcula existe un radical acilo,
entonces son antocianinas aciladas (1) (5).
Con pH cido las antocianinas son muy
estables, pero esta estabilidad se reduce,
cuando el pH se aproxima a la neutralidad,
llegando a destruirse completamente con
ICIDCA No.2, 2006
pH superior a 7. Sin embargo, las antociani-
nas de tipo aciladas, como la petanina
[petunidina 3-(6``,4`` p-coumarilramnosi-
do)-5glucsido] son ms estables y conser-
van su color caracterstico con pH alcalino.
Las diferencias entre los antocianos
individuales se encuentran en el nmero de
grupos hidrxilos de la molcula y el grado
de metilacin de estos grupos hidroxilos
(que son los factores que caracterizan a las
diferentes antocianidinas), de la naturaleza
y el nmero de azcares ligados a la mol- Peonidina
cula y de la posicin del enlace y en la
naturaleza y el nmero de cidos alifticos
o aromticos unidos a los azcares en la
molcula. Respecto a estos ltimos, son
importantes los derivados acetilados y los p-
cumarilados. (6)
Cuando en las antocianidinas se sustitu-
ye el grupo hidroxilo de la posicin 3 con
una molcula de azcar se conoce como
derivado sustituido 3- glucsido y con la
sustitucin del hidroxilo en la posicin 3 y
5 se conoce como el derivado sustituido 3,5
diglucsido.
Las estructuras ms comunes y sencillas
son:
Pelargonidina
Estructura molecular
+
OH
- Soluble en HCl formando agujas prpura
Cl
Frmula emprica: C15H11ClO5
Peso molecular: 306.7
No funde a 350 C
Forma de cristales: Prisma de color carmeli-
ta rojizo y soluble en alcohol, metanol,
moderadamente soluble en agua y ligera-
mente soluble en cloroformo.
Derivados mono y disusttuidos de la
Pelargonidina
Pelargonidina-3-monoglucsido
Frmula emprica: C21H21ClO10
Forma cristalina: Agujas con color rojo cas-
tao y brillo bronceado.
ICIDCA No. 2, 2006
Soluble en agua, metanol, etanol, HCl
0.5-7 % y moderadamente soluble en HCl
10 %.
Pelargonidina 3,5 diglucsido
Frmula emprica: C27H31ClO15.
Forma cristalina: Agujas rojas
Se descompone 175-180 C
Soluble: en agua, alcohol
O C H3
+
OH
-
Cl
Frmula emprica: C16H13ClO6
Peso molecular: 336.73
Forma cristalina: Agujas carmelita rojizo
Soluble: En alcohol dando una solucin
rojo oscuro y moderadamente soluble
en agua dando una solucin carmelita
rojizo.
Derivados mono y disustituidos de la
Peonidina
Peonidina 3, 5 diglucsido
Frmula emprica: C28H33ClO6
intenso
Punto de fusin: 165-167 C
Cianidina
OH
+
OH -
Cl
Frmula emprica: C15H11ClO6 (7)
Soluble HCl alcohlico para dar agujas rojo
castao monohidratado, muy soluble en
alcohol y alcohol amlico dando una solu-
cin violeta, soluble en carbonato de sodio
con color azul. y poco soluble en HCl dilui-
do o H2SO4.
37
Cianidina 3-glucsido
Frmula emprica: C21H21ClO11
Soluble en HCl diluido en medio alcohlico
con formacin de lminas o prisma carmeli-
ta rojizo con brillo metlico. Soluble en
alcohol con fuerte florescencia y en carbo-
nato de sodio con azul-violeta.
Se descompone a 205 C sin fundir
Cianidina 3-ramnoglucsido
Frmula emprica: C27H31ClO15
Agujas rojas en HCl o primas oscuros en
HCl diluido metanlico.
Soluble en agua caliente, alcohol.
Cianidina 3-galactsido
Frmula emprica: C21H21ClO11
Agujas rojas con brillo bronce metlico en
HCl en medio metanol
Descompone a 210-212 C
Soluble en agua, etanol, metanol, HCl dilui-
do. Prcticamente insoluble en HCl al 7 %.
Cianidina 3,5 -diglucsido
Frmula emprica: C27H31ClO6
Lminas con brillo metlico en HCl diluido
Punto de fusin: 203-204 C.
Cianidina 3-soforosida o mecocianina
Frmula emprica: C27H31ClO16.
Cristales rojos oscuros en HCl diluido y ace-
tato de etilo o agujas rojo oscuro en HCl en
medio alcohlico al 2 %
Soluble en agua.
Delfinidina
Frmula emprica.C15H11ClO7
Prismas o agujas carmelita-chocolate con
brillo metlico en HCl 5 %
Soluble en metanol, etanol, acetato de etilo
Derivados de la delfidina mono y disusti-
tuido
Delfidina 3-glucsido
Frmula emprica: C21H21ClO12
Cristales rojo oscuro en HCl diluido
38
Delfidina 3,5 diglucsido
Frmula emprica: C27H31ClO17
Cristales en forma de hoja con brillo bron-
ceado en HCl diluido
Insoluble en agua fra, alcohol, cido dilui-
do. Soluble en HCl diluido y caliente.
Delfina
Con sustitucin de una molcula de glucosa
y cido hidroxibenzoico.
Frmula emprica: C41H39ClO21
Cinta o prisma de color rojo-carmelitoso
oscuro en HCl al 3 %
Descompone a 200-203 C.
Soluble en agua con descomposicin, alco-
hol diluido, acetona, alcohol en ebullicin.
Violana
Con sustitucin de glucosa, ramnosa y
cido p-hidroxicinamico
Frmula emprica: C36H37ClO18
Lmina violeta azulado con brillo verde
metlico en HCl metanlico y ter
Soluble en alcohol amlico, HCl 0.15-0.5 %,
menos soluble en HCl 1 %, ligeramente
soluble en agua y prcticamente insoluble
en HCl 5-12 %.
Malvidina
H3C O OH
+
O C H3 C l-
Frmula emprica: C17H15ClO7
Peso molecular: 366.75
Prismas con forma rmbica con aparicin
del color rojo por luz trasmitida y brillo
verde cuando tiene contacto con el solvente
toma un brillo azul acero.
Usualmente se obtienen los cristales mono
o dihidratado y las sales anhidra son muy
higroscpica y no funde a 300 C
Soluble en alcohol absoluto dando una
solucin rojo-violeta, soluble alcohol amli-
co. Ligeramente soluble en agua.
En metanol, el compuesto es soluble por
formacin de una solucin color rojo, pero
ICIDCA No. 2, 2006
comienzan a separarse cristales de color
rojo, los cuales se observan violeta por la
luz transmitida.
Derivados de la malvidina mono y disust-
tuidos
Malvidina 3- glucsido tetrahidratado
Frmula emprica: C23H25ClO12.4H2O
En alcohol-HCl se obtienen unos prismas
oscuros con brillo verde metlico.
Ligeramente soluble en agua, alcohol, glice-
rol; prcticamente insoluble en benceno,
cloroformo, ter.
Malvidina 3,5 diglucsido
Frmula emprica: C29H35ClO17
En HCl se obtienen prismas o agujas de
color carmelita rojizo con brillo verde.
Descompone a 165 C
Malividina 3-galactsido hemihendecahi-
drato
Frmula emprica: C23H25ClO12.5 H2O
En HCl-metanol se obtienen cristales en
forma de prisma o agujas de color bronce
metlico y luz transmitida violeta-azulado.
Muy soluble en metanol, alcohol, agua fra
formando una solucin rojo oscuro.
Ligeramente soluble en acetona y prctica-
mente insoluble en acetato de etilo.
Petunidina
OH
+
OH
C l-
O C H3
OH
Frmula emprica: C16H13ClO7
Peso molecular: 352,74
En HCl diluido se obtienen cristales en forma
de prisma o agujas de color carmelita gris.
Derivado de la petunidina 3,5 diglucsido
Petunidina 3,5 diglucsido
Frmula emprica: C28H33ClO17
ICIDCA No. 2, 2006
Punto de fusin: 178 C
En HCl diluido se obtienen cristales en
forma de lmina violeta con brillo cobrizo.
Separacin y caracterizacin estructural
de las antocianinas
A continuacin se detallan las diferentes
vas de tratamiento y purificacin de una
muestra, la evaluacin de la estructura
dependiendo del tipo de material de partida
que presente diferentes tipos de antociani-
nas.
Separacin y caracterizacin de antociani-
nas de la flor fistulosa de Monarda
Se extraen las antocianinas y otros flavo-
noides de los ptalos de fistulosa de
Monarda con metanol/cido actico/agua
(10:1:9) y se purifica el extracto en una
columna Sephadex LH20 (3 x 80 cm). Los
flavonoides se separan por HPLC en una
columna Spheri 10-RP18 10 (25 cm x 4.6
mm) con una elucin de gradiente, utilizan-
do 5 % cido frmico/metanol y un detector
de longitud de onda variable y un fotodiodo.
En el cromatograma aparecen dieciseis
picos, cinco corresponden a pigmentos de
antocianinas, los cuales se identifican utili-
zando longitudes de onda a 280 y 510 nm.
Los derivados de las antocianinas y la pre-
sencia de acilacin se pueden caracterizar
por los tiempos de retencin y los espectros
UV-Visibles. Los pigmentos hidrolizados en
medio cido se separan mediante
Cromatografa de papel, TLC y electrofore-
sis.(10)
Separacin y caracterizacin de las anto-
cianinas en las frutas de edulis de
Passiflora y P. de suberosa
Las antocianinas en el edulis de
Passiflora (la fruta de pasin) y P. de subero-
sa se extraen con metanol acidificado con
TFA (trifloroactico) al 2 %. Los extractos
filtrados se concentran a vaco y se purifica
por particin en acetato de etilo y se aplica
a una columna de Amberlite XAD-7
(Andersen, el Acta Chem Scand., 1988, 42,
462). Las antocianinas se separan en una
columna Sephadex de LH-20 (100 x 2.6 cm
i.d.) con metanol/TFA/agua (99:2:99). La
Cromatografa de HPLC se realiza en una
columna ODS (20 cm x 5 mm i.d.) 5 con
un flujo de elusin de 1.2 ml/min con cido
39
frmico/agua (1:9) y H2O/ metanol/frmico
(5:1:4) como fase mvil y se caracterizan las
estructuras mediante: Espectrofotometra
UV-VIS de 210 a 600 nm., Espectrometra de
masa FAB y RMN (11).
Caracterizacin estructural de antociani-
nas de arndano
Las antocianinas extradas de arndano
se analizan por Espectrofotometra UV-VIS,
Densitometra de TLC y HPLC con una eva-
luacin cuantitativa de antocianinas totales
por Espectrofotometra a 535 nm.
Las antocianinas se determinan por TLC
en celulosa con espesor de capa de 300 F
(0.1 mm espesor) con un sistema de solven-
te formado por cido frmico/agua/cido
clorhdrico (6:5:1) y se detectan a 540 nm.
La Cromatografa de HPLC se realiza uti-
lizando una columna de C18 y aplicando un
gradiente de elusin de cido frmico/aceto-
nitrilo y deteccin a 280 nm. El anlisis de
antocianinas de arndano result mejor
empleando el mtodo de espectrofotometra
directa o posterior a una separacin croma-
togrfica (TLC/HPLC). Para la evaluacin
cuantitativa, se recomienda el mtodo
espectrofotomtrico directo. La densitome-
tra de TLC slo se recomienda para extrac-
tos de alta pureza y la cromatografa HPLC
resulta apropiada para la estandarizacin de
extractos de arndano y la identificacin de
impurezas como cidos del tipo fenlico y
taninos (12).
Caracterizacin de antocianinas extradas
de arndano en muestras comerciales
Los extractos secos de antocianinas se
disuelven en HCl 0.1 M en metanol, poste-
riormente se miden sus espectros y el conte-
nido de antocianinas se determina a 535 nm.
Luego, se disuelven las muestras en 5 %
cido frmico y se analizan por HPLC en una
columna Partisil 10 ODS (25 cm x 4.6 mm)
con una velocidad de elucin de 0.5 min/ml,
utilizando gradiente de cido frmico/aceto-
nitrilo (100:0 a 9:1 en 60 min sostenidos a
90 min) y la deteccin se realiza a 280 nm.
(13)
Separacin y caracterizacin estructural
de antocianinas en el Sylvestris de Malva
La extraccin de antocianinas se realiza
con HCl-metanol, y las leucoantocianinas
en el residuo se extraen similarmente des-
40
pus de un proceso de oxidacin en presen-
cia de oxgeno del aire. Los extractos se ana-
lizan utilizando diferentes mtodos analti-
cos para su caracterizacin y cuantificacin
como: TLC en fase inversa, Cromatografa
de HPLC y separacin en fase inversa para
las antocianinas hidrolizadas y determina-
cin por espectrofotometra de antocianinas
totales como cloruro de malvidina. (14)
Composicin de los pigmentos de antocia-
ninas en tomates rojos
Las antocianinas presentes en tomates
rojos se extraen previamente utilizando ace-
tona y se realiza una segunda extraccin
con 70 % de acetona seguido por agitacin
con cloroformo/acetona (2:1). Se determina
el contenido de antocianinas monmericas
por el mtodo de pH diferencial en un rango
de 2-40 mg/100 g. La composicin de anto-
cianinas se caracteriza por HPLC, anlisis
espectral y espectrometra de masa. En
todas las muestras se detecta el pigmento
pelargonidina-3-rutinosida-5-glucsido ace-
tilada con cido p-coumrico (15).
Complejidad de las antocianinas y su
expresin de color
Se presenta una resea que incluye los
factores que afectan en la formacin del
rango de colores de las antocianinas en las
plantas (diversidad de cromforos, rango
natural de valores de pH de 3-7, compleji-
dad molecular incluyendo el origen de los
compuestos complejos y efecto intermole-
cular a rango amplio). Los mtodos que se
utilizan para estudiar estas propiedades son
Espectroscopa UV-VIS, RMN, Dicroismo
Circular y para lograr mayor selectividad
Difraccin de Rayos X. (16)
Antocianinas aciladas de los ptalos azules
de Salvia uliginosa
Los ptalos secos y congelados se
extraen con cido frmico/metanol/agua
1:10:9); luego se filtra y se evapora hasta
tener un volumen pequeo a presin redu-
cida. Se realiza una Cromatografa de HPLC
preparativa en columna ODS (10 mm d.i x
250 mm) con fase mvil cido
frmico/metanol/agua (1:6:13) a (1:8:11) y se
purifica por HPLC utilizando la misma
columna con cido frmico/acetonitrilo/
agua (5:16:79). El producto se identifica uti-
lizando tcnicas analticas de espectrome-
ICIDCA No. 2, 2006
tra de masa FAB y RMN-H` a 500 y 600
Mhz en metanol conteniendo HCl al 0.1 %
(17).
Cianidina 3-(2``,3``digaloilglucosido) en
hojas rojas
Se pesan 400 g de hojas rojas de la flor
"Crimson King"y se extraen con TFA (triflo-
roactico) al 1 % en metanol. Se filtra y se
purifica por particin con acetato de etilo
seguido por cromatografa usando columna
Amberlita XAD-2. Las antocianinas diaceti-
ladas (cianidinas) se separan en columna de
Sephadex LH-20 utilizando una elucin
paso a paso con metanol/TFA/agua de
(19.8:0.2:80 a 59.4:0.6:40). Las estructuras
se identifican empleando Espectrometra
RMN homo y heteronuclear RMN-2D a
600.13 y 150.92 MHz para H`y C13 y los
valores de los datos espectrales UV-VIS de la
cianidinas separadas (18).
Pigmentos de antocianinas de tulipanes
La flor de tulipn "Queen Wilhelmina"
se extrae con metanol conteniendo TFA al
1% y se realiza una particin con acetato de
etilo. Las antocianinas se separan por cro-
matografa de columna Amberlite XAD-7 y
se purifican usando una columna Sephadex
LH20 y un sistema de solvente agua/meta-
nol/TFA(80:19.6:0.4). La Cromatografa de
HPLC se lleva a cabo en columna Hipersil
ODS. La identificacin de estructuras se
realiza mediante espectroscopa UV-VIS uti-
lizando como solvente metanol/cido clor-
hdrico al 0.01 % en un rango de longitud de
onda entre 240-600 nm, espectroscopa
RMN y masa con ionizacin a presin
atmosfrica e inyeccin de flujo y como
resultado se obtienen estructuras molecula-
res del tipo de dos pelargonidinas y dos cia-
nidinas con grupos acilos enlazados a la
posicin axial del azcar (19).
Purificacin e identificacin de antociani-
na de capulina (Prunus serotina ERC)
Las antocianinas se extraen en acetona,
se somete a un proceso de particin con clo-
roformo y se purifica en un cartucho de
fase slida C18 .
Los mtodos de bisulfito y pH diferen-
cial se utilizan para determinar el contenido
de antocianinas monomricas y color poli-
mrico. Las antocianinas se identifican por
anlisis espectral, HPLC, Espectrometra de
ICIDCA No. 2, 2006
Masa-electrospray. La Cromatografa HPLC
se realiza (despus de hidrlisis alcalina y
cida) en columna C-18 (25 cm x 4.6 mm
d.i) 5 con gradiente de elucin (1ml/min)
usando sistema de solvente acetonitrilo/
cido fosfrico/cido actico (el programa se
detalla en el trabajo) y deteccin a 280, 310
y 520 nm. Como resultado del estudio
estructural se obtienen dos tipos de cianidi-
na: cianidina-3-glucsido y cianidina -3-
rutinosida y un tercer pigmento amarillo
naranja detectado por Espectrometra de
Masa (20)
Enlace convalente entre pigmentos de
antocianinas-flovonol de la flor
Agarparthus azul
Se separan dos antocianinas de la flor de
Agaparthus azul. La purificacin involucra
varios pasos cromatogrficos, el primero
con Diaion Hp-20, una comatografa de
columna con Sephadex G25, celulosa, Rp y
Toyopearl HW-40 y los productos separados
se caracterizan por RMN-H`, RMN-C13,
Espectrometra de Masa-Cromatografa
Gaseosa, HPLC acoplado a un espectrofto-
metro UV-VIS seguida de una hidrlisis
cida o bsica. La estructura encontrada es
una delfidina diglucsido p-coumarilada
unido a flavonol triglucsido. (21)
Petunidina 3-O- ramnopiranosida-5-O-
glucopiranosa y otras antocianinas de la
flor Vicia villosa
Las antocianinas se extraen toda la
noche de la flor Vicia Villosa con 1 L de
metanol/ cido actico (19:1; Solvente A) y
luego se filtra y se concentra el solvente A
filtrado.
Este concentrado se extrae con acetato de
etilo 3 x 300 ml y se aplica a una columna
Amberlite XAD-7. Las antocianinas se eluyen
con 1 L del solvente A y se separan en colum-
na de Sephadex LH-20 (10 cm x 1 cm d.i) con
metanol /agua/TFA (39.9:60:0.1). El TLC se
realiza con slica microcristalina F5565
Merck con 1-butanol/cido actico/ agua
(4:1:5) como fase superior y cido
frmico/cido clorhdrico/agua (1:1:2). Se
toma una alcuota de 15 l y se inyecta en
una columna de HPLC Hypersil ODS 5 m
(20 cm x 5 mm d.i) con cido frmico y
cido frmico/agua/metanol (1:4:5) por elu-
sin isocrtica y gradiente. Se separan tres
antocianinas que se identifican por:
41
Espectrofotometra UV-VIS con registro del
espectro de 240 a 600 nm, RMN homo y
heteronuclear, RMN 2D y como estructuras
se propone el 3-O- ramnopiranosida-5-O-
glucopiranosidas de petunidina (71 %),
delfidina (12 %) y malvidina (9 %). (22)
Antocianinas de flores y Lirio (Liliaceae)
Se pesa 1 g de segmentos secos y conge-
lados de 10 cultivos de flores, incluyendo
adems una especie de Lirio y se extraen
con 13 ml de acetonitrilo al 50 % conte-
niendo 3 % de TFA. Se filtra y el extracto se
pasa por una columna Develosil ODS-Hg-5
(25 cm x 4.6 mm d.i) a 40 C con gradiente
de elusin (1ml/min) con acetonitrilo acuo-
so de 0-30 % conteniendo 0.5 % de TFA
durante 30 min y deteccin de diodo en un
rango de 260 - 530 nm. Una segunda elusin
con 1.5 ml/min con agua/TFA (99:1, solven-
te A) y acetonitrilo/agua/TFA (3:7:0.05, sol-
vente B, abarcando 16,38, 44, 50, 67 y 100 %
de B a 0,3,10,20,25 y 40-50 min respectiva-
Tabla 1. Valores de Rf x100 de antocianinas y ant ocianidinas en varios sistema s de solventes
mente. El lmite deteccin de la cianidina 3-
O- rutinosida y cianidina 3-O- rutinosi-
da-7-O--Dglucosido fue de 1.2 mol. Las
estructuras se confirman por Espectrome-
tra UV-VIS, RMN y masa-FAB. Estos com-
puestos son los responsables del color rojo
de la flor de lirio.(23)
Antocianinas en plasma humano despus
de una administracin oral de un extracto
de baya de saco
Un mililitro de plasma se disuelve en
200 l de una solucin acuosa de 0.44 M de
TFA y la mezcla se aplica en un cartucho de
extraccin en fase slida Sep-Pak C18. Las
antocianinas se eluyen con TFA a 0.44 M
en metanol y posteriormente, la fase se
evapora a sequedad y se redisuelve en
solucin de TFA a 0.44M. Una porcin de
la solucin se analiza por HPLC con una
columna Zorbax SB-C18 (25 cm x 4.6 mm
d.i) con un gradiente de elusin (1ml/min)
con solucin acuosa de acetato de sodio 25

Poliacrilonitrilo
-Poliamida (7:2)
mezclada con
Silica Gel Celulosa
Adsorbente 40 ml de 0.05 M Celulosa Poliamida
D-O MN 300
fosfato de
potasio
primario
Antocianid inas A B C D E F G F G
Cianidina 3 glucsido 46
Cianidina 3 triglucsido 42
Cianidina 3,5 glucsido 36 52
Delfinidina 3 glucsido 36
Delfidina 3,5 glucsido 35 26
Malvidina 3 glucsido 57 60 61
Malvidina 3,5 glucsido 54 44 33
Peonidina 3,5 glucsido 56 37
Petunidina 3 glucsido 38
Antocianinas
Cianidina 31 83 92 47 53 70 75 57 75
Delfidina 21 41 34 50 60 50 72
Malvidina 37 95 94 62 61 87 84 84 91
Paeonidina 39 55 65 90 86 83 85
Pelargonidina 41 51 71 95 92 69 78
Petunidina 27 54 46 70 75 72 79

42 ICIDCA No. 2, 2006

mM (fase mvil B) (de 0-24 % de B en A
durante 50 min, 38 % de B en A durante
110 min hasta 100 % de B en A durante
120 min) y deteccin a 520 nm. Dos picos
de antocianinas se pueden separar si se
modifica la programacin de fase mvil de
0-26 % de B en A durante 20 min hasta 33
% de B en A durante 80 min (24).
Caractersticas de las antocianinas en
Cromatografa de Capa Delgada
En la tabla 1 se observan los Rf de algu-
nas antocianinas y antocianidina en varios
sistemas de solventes.
Sistema de solvente
A= Pentanol-1-propanol-1- cido actico-
agua (3:2:2:1) se puede aadir dos partes
de heptanol-1 y un desarrollo a 12 cm para
mejorar la placa.
B= n-butanol- cido actico-agua (4:1:2).
C= formato de etilo-metil-etil acetona-cido
formico-agua (3:4:1:2).
D= cido formico - cido clorhdrico-agua
(10:1:3).
E= alcohol amlico - cido actico - agua (2:
1: 1).
F= cido actico - cido clorhdrico - agua
(10:1:3), distancia de desarrollo de 12 cm.
G= cido actico- agua (3:2), distancia de
desarrollo.
La manchas de antocianinas y antociani-
dinas se pueden ver a luz ultravioleta, pero
se puede incrementar su intensidad rocian-
do con una solucin de cido oxlico al 10 %
en acetona.agua (1:1). (25)
CONCLUSIONES
En esta revisin se muestran las diferen-
tes estructuras moleculares de las antociani-
nas presentes en diversos materiales de ori-
gen vegetal, lo cual implica una gran canti-
dad de variantes de tcnicas analticas para
el tratamiento de muestra, de mtodos de
purificacin por Cromatografa de particin 10. Davies,-AJ; Mazza,-G. Separation and
y extraccin; caracterizacin estructural
mediante tcnicas de TLC, Cromatografa
HPLC, Espectrofotometra UV-VIS,
Espectrometra de RMN H` y C13,
Espectrometra de Masa-FAB y Masa-
Electrospray, lo cual constituye una herra-
mienta importante para el desarrollo del tra-
ICIDCA No. 2, 2006
bajo de investigacin en el tema de separa-
cin, identificacin y cuantificacin de
estas molculas a partir de plantas superio-
res o por cultivo de clulas inferiores.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Salinas, Y.; Martnez, F.; Soto, M. Efectos
de la mixtamalizacin sobre las antociani-
nas del grano de maces pigmentados
Agrociencia .37 (6) pp. 617-628, Nov-Dic
2003.
2. Harbone, J.; Grayer, R. The anthocyanins
in: The flavonoids. Advances in research
since 1980. Londres: Chapman and Hall,
1988. p 1-20.
3. Kame, H.; Kojima, S.; Hasegawa, M.;
Yukawa, K. Suppressive effect of flavo-
noid extracts from flower petals on culte-
red human malignant cells. J Clin Exp
Med 164 : p. 829, 1993.
4. Miniati, E.; Coli, R. Anthocyanins not
only for colour for foods in: Papers pre-
sented at the 1st International Symposium
on natural colorants for foods.
Nutraceuticals, Beverages and
Confectionary. The Herald Organization,
1993.
5. Harbone, J. B. Phytochemical methods: A
guide to modern techniques of plant
analysis. Ed. Chapman and Hall. UK.
1984, pp:61-68.
6. Valls, J; Mateos, S; Lampreave, M; Nadal,
M; Arola, L. Contenido y evolucin de los
antocianos en la maduracin de varieda-
des antctonas y forneas. Revista Tcnica
de Inters permanente No 3.056 5 de
marzo de 2005. pp. 726-730.
7. Valls, J.; Lampreave, M.; Nadal, N.; y
Arola, L. Importancia de los compuestos
fenlicos en la calidad de los vinos tintos
Enologa: pp 119-121, marzo 2000.
8. Indice de MERCK Eleventh Edition, USA:
Merck Co, 1989
9. Rao, C. Espectroscopa ultravioleta y visi-
ble,. madrid: Alambra, S.A., 1970. p. 258.
characterization of anthocyanins of
Nonarda fistulosa by high performance
liquid chromatography, J-Agric-Food-
Chem. 40(8): p.1341-1345, 1992.
11. Kidoy, L.; Nygard, A.M.; Andersen,
O.M.; Pedersen, A.; Aksnes, D.W.;
Anthocyanins in fruits of Passiflora edulis
43
 and Psuberosa. J-Food-Compos-Anal.
Spectr 10(1): p. 49-54, 1997.
12. Petri, G.; Krawczyk, U.; Kery, A.
Spectrophotometric and chromatographic
investigation of bilberry anthocyanins for
quantification purposes. Microchem-J.
55(1): p. 12-23, Enero, 1997.
13. Krawczyk, U.; Petri, G. Application of
RP [reversed-phase]-HPLC and spectro-
photometry in standarization of bilberry
anthocyanin extract. Arch-Pharm
(Weinheim,-Ger).325(3): p. 147-149,
Marzo, 1992.
14. Pourrat, H; Texier, O; Barthomeuf, C.
Identification and assay of anthocyanin
pigments in Malva sylvestris". Pharm-
Acta-Helv. 65(3): p. 93-96, marzo, 1990.
15. Rodrguez, L.E; Guisty, M.M.; Wrolstad,
R. Anthocyanin pigment composition of
red-flished potatoes. J Food Sci, 63 (3):
458-465, mayo-junio 1998.
16. Dangles, O. Anthocyanin complexation
and colour expression. Analysis 25 (8)
m50-m52, octubre, 1997.
17. Ishikawa, T; Kondo, T; Kinoshita, T;
Haniyama, H; Inaba, S; y otros. An acety-
lated anthocyanin from the blue petals of
Salvia uliginosa. Phytochemistry, 52(3): p.
517-521, octubre, 1999.
18. Fossen, T; Andersen, O. Cyanidin 3-
(2``,3``-digalloylglucoside) from red lea-
ves of our platanoides. Phytochemistry, 52
(8) p. 1697-1700, diciembre, 1999.
44
19. Torskangerpoll, K.; Fossen, T.; Andersen,
O. Anthocyanin pigments of tulips
Phytochemistry, 52 (8): 1687-1692, Dec
1999.
20. Ordaz, A.; Wische-Ebeling, P; Wrolstad,
R. y otros. Purification and identification
of capulin (Prunus serotina Ehrh) anthoc-
yanins. Food Chem 65(2): p. 201-206,
mayo, 1999.
21. Bloor; S.; Folshave, R. Covalently linked
anthocyanin-flavonol pigments from blue
Agapartus flower. Phytochemistry, 53 (5)
p. 575-579, Mar 2000.
22. Calatano, G.; Fossen, T.; Andersen, O.
Petunidisn 3-O--rhamnopyranoside-5-O-
glucopyranosa and other anthocyanins
from flowers of Vicia Villosa, J. Agric Food
Chem, 46 (11), 4568-4570 Nov 1998.
23. Norback, R.; Kondo, T. Anthocyanins
from flowers of Lilium (Liliaceae)
Phytochemistry, 50 (7): p.1181-1184. abr
1999.
24. Cao, G; Prior, R. Anthocyanins are detec-
ted in human plasma after oral adminis-
tration of an elderberry extract. Clin
chem. 45 (4) : p. 574-576, apr. 1999.
25. Kirchner, J. Technique of Organic
Chemistry. Vol Xii Thin Layer
Chromatography (S.I.): Interscience
publishers, 1967 pp. 559.
ICIDCA No. 2, 2006