Green Fluorescent Protein

GFP has a -barrel structure consisting of eleven -strands, with an alpha helix containing
the covalently bonded chromophore 4-(p-hydroxybenzylidene)imidazolidin-5-one (HBI)
running through the center. Five shorter alpha helices form caps on the ends of the
structure. The -barrel structure is a nearly perfect cylinder, 42 long and 24 in diameter,
creating what is referred to as a -can formation, which is unique to the GFP-like family.
Inward-facing sidechains of the barrel induce specific cyclization reactions in Ser65Tyr66
Gly67 that induce chromophore formation. The hydrogen-bonding network and electron-
stacking interactions with these sidechains influence the color, intensity and photostability
of GFP and its numerous derivatives. The tightly packed nature of the barrel excludes
solvent molecules, protecting the chromophore fluorescence from quenching by water.
 Biofsica de Membranas Biolgicas

Distribucin de iones entre la clula y el medio

Difusin
Movimiento trmico, primera ley de Fick, permeabilidad de
la membrana, potenciales de difusin, potencial de
membrana

R. Daniel Peluffo, PhD

Profesor Titular de Biofsica (grado 5, DT)
Director del Polo de Biofisicoqumica
CENUR Litoral Norte sede Salto
dpeluffo@unorte.edu.uy
 Objetivos
Al concluir esta clase usted debera ser capaz de:

definir difusin en trminos de la primera Ley de Fick

reconocer las variables involucradas en el proceso de
difusin
aplicar este conocimiento a la difusin a travs de
membranas biolgicas
distinguir entre sustancias que cruzan o no las
membranas biolgicas
predecir la permeacin de cidos y bases dbiles
sumarizar el concepto de potencial de membrana
Las membranas compartimentan las clulas

lysosome
Gradientes inicos en clulas y organelas

= -30 to -80 mV

[Na+]o = 145 mM [Na+]i = ~12 mM

[K+]o = 4 [K+]i = 140
[Cl-]o = 116 [Cl-]i = 4
Transportadores

[Mg2+]o = 1.5 [Mg2+]i = 0.8

pHo = 7.4 pHi = 7.1
Canales
[Ca2+]o = 1.8 [Ca2+] i = ~10-4

pH = 4.5-6 [Ca] ~ 1 mM

Lisosomas, ER,
Golgi, Golgi
Endosomas
 Difusin Movimientos trmicos al azar

desplazamiento en tiempo =
relacin con Coeficiente de Difusin, D
Difusin de una sola partcula
1 2
D =
2

Primera Ley de Fick de la difusin

dC C
J = D D
dx x
Difusin a travs de una membrana
J = P (Cext Ccyt )

Difusin de muchas partculas Difusin a travs de un canal

http://nerve.bsd.uchicago.edu/diffusion.html http://nerve.bsd.uchicago.edu/memb.htm

Simulations courtesy of Dr. F. Bezanilla, Univ. Chicago

 Primera Ley de Fick
dC C
J = D D
dx x
El flujo, J, es el nmero de moles que cruzan un plano de rea unitaria
en la unidad de tiempo (moles/cm2s). En este caso J = J / A
D es el coeficiente de difusin (cm2/s). Dw20
dC/dx ~ C/x (moles/cm3/cm = moles/cm4) es el gradiente de
concentracin
Por lo tanto, la velocidad de difusin es directamente proporcional a la
magnitud del gradiente de concentracin
z
C C C
J = D + +
x y z y

x
J = J12 J21 = D(C1 C2) / dx = D (dC / dx)

J12

J21
J

J
ecuacin de kT kT
Einstein: D = =
6 r
ecuacin de
f Stokes

k=R/N

K = 273,15 + oC
 Volumen de una partcula hidratada

M
Vh = (v 2 + d1v1 )
N
v2 volumen especfico promedio de la partcula (cm3/g)

v1 volumen especfico promedio del solvente en la capa

de solvatacin (cm3/g)
d1 grado de hidratacin de la partcula en gramos de solvente por
gramo de soluto (no tiene dimensiones)
 Volumen de una partcula hidratada

M
Vh = (v 2 + d1v1 )
N
v2 volumen especfico promedio de la partcula (cm3/g)

v1 volumen especfico promedio del solvente en la capa

de solvatacin (cm3/g)
d1 grado de hidratacin de la partcula en gramos de solvente por
gramo de soluto (no tiene dimensiones)

Si la partcula fuese una esfera su volumen hidratado sera:

 Volumen de una partcula hidratada

M
Vh = (v 2 + d1v1 )
N
v2 volumen especfico promedio de la partcula (cm3/g)

v1 volumen especfico promedio del solvente en la capa

de solvatacin (cm3/g)
d1 grado de hidratacin de la partcula en gramos de solvente por
gramo de soluto (no tiene dimensiones)

Si la partcula fuese una esfera su volumen hidratado sera:

4
Vh = r 3
3
 4
Vh = r 3
3

3 3 4
Vh = r 3
4 4 3

3
Vh = r 3
4

1 3 1
Vh = r 3
4

1 3 3 3
Vh = r 3 Vh = r 3 r3 = Vh
4 4 4

3
r3 = 3
3 3
Vh r =3 Vh
4 4
 Volumen de una partcula hidratada

M
Vh = (v 2 + d1v1 )
N
v2 volumen especfico promedio de la partcula (cm3/g)

v1 volumen especfico promedio del solvente en la capa

de solvatacin (cm3/g)
d1 grado de hidratacin de la partcula en gramos de solvente por
gramo de soluto (no tiene dimensiones)

Si la partcula fuese una esfera su volumen hidratado sera:

4
Vh = r 3
3

3Vh
r =3
4
 Volumen de una partcula hidratada

M
Vh = (v 2 + d1v1 )
N
v2 volumen especfico promedio de la partcula (cm3/g)

v1 volumen especfico promedio del solvente en la capa

de solvatacin (cm3/g)
d1 grado de hidratacin de la partcula en gramos de solvente por
gramo de soluto (no tiene dimensiones)

Si la partcula fuese una esfera su volumen hidratado sera:

4
Vh = r 3
3

3Vh 3 M
r =3 r =3 (v 2 + d1v1 )
4 4 N
 Volumen de una partcula hidratada

M
Vh = (v 2 + d1v1 )
N
v2 volumen especfico promedio de la partcula (cm3/g)

v1 volumen especfico promedio del solvente en la capa

de solvatacin (cm3/g)
d1 grado de hidratacin de la partcula en gramos de solvente por
gramo de soluto (no tiene dimensiones)

Si la partcula fuese una esfera su volumen hidratado sera:

4
Vh = r 3
3

3Vh 3 M
r =3 r =3
3 M
(v 2 + d1v1 ) f = 6 3 (v 2 + d1v1 )
4 4 N 4 N
ecuacin de kT kT
Einstein: D = =
6 r
ecuacin de
f Stokes

3 M
f = 6 3 (v 2 + d1v1 ) f = 6 C 3 M
4 N
ecuacin de kT kT
Einstein: D = =
6 r
ecuacin de
f Stokes
La velocidad de difusin es directamente proporcional a la
temperatura absoluta (Kelvin) e inversamente proporcional a la
viscosidad del medio y el radio molecular (~ 3 Molec Weight )
12
D= or = 2 D
2
Diffusing substance D (cm2/s) (1 s) (24 hr)

O2 (air) 0.178 0.6 cm 175 cm

Glucose (H2O) 6.7 x 10-6 37 m 1.1 cm

Cu (solid) 1.9 x 10-10 195 nm 57 m

En una escala celular (m), la difusin es un proceso rpido

La difusin es rpida sobre pequeas distancias,
y lenta sobre distancias grandes
2=2D

Difusin a travs de membranas biolgicas

ecuacin de Permeabilidad
coeficiente de Permeabilidad
J = P(Cext Ccyt ) Dm K p
P=
x
Dm = coeficiente de difusin en la membrana
Kp = coeficiente de particin aceite/agua
x = espesor de la membrana ~ 5 nm

Coil
Kp =
Cwater
alta solubilidad en lpidos = alta permeabilidad
Aceite (heptano)
Kp se mide determinando la distribucin
de la sustancia entre el aceite y el agua
Agua
Difusin pasiva a travs de membranas biolgicas

La permeabilidad aumenta con la

solubilidad en lpidos y disminuye con el
tamao molecular
 Acidos y bases dbiles cruzan las membranas rpidamente

H+ + A- HA
A. Acidos dbiles
H+ y A- son impermeables
La forma no ionizada (HA) HA
es permeable
HA cruza rpidamente la H+ + A-
membrana y se disocia adentro

H+ + B BH+
B. Bases dbiles
H+ y BH+ son impermeables
La forma no ionizada (B) es permeable
B cruza rpidamente la B + H+
membrana y se protona adentro
BH+
C. Estas consideraciones son muy importantes para entender como el
cuerpo absorbe y maneja medicamentos (Farmacocintica)
 Difusin de iones - Definiciones
Potencial elctrico (): la cantidad de trabajo requerido para traer una
carga positiva unitaria desde el infinito hasta una ubicacin particular

Campo elctrico: un gradiente espacial de potencial elctrico,

d/dx ~ /x. Molculas con carga solo experimentan una fuerza
si estn en un campo elctrico, no cuando el potencial es constante
Principio de electroneutralidad: En cualquier volumen macroscpico
debe haber siempre el mismo nmero de cargas positivas y negativas. La
separacin de cargas produce un campo elctrico y ocurre solamente sobre
distancias moleculares en Biologa
 Potenciales de difusin
En este ejemplo, el ion positivo difunde ms + Ion positivo
rpidamente que el ion negativo
- Ion negativo
La lnea de trazos separa una solucin que
contiene gran cantidad de iones (izquierda) de
otra solucin libre de iones (derecha) -
+
- +
-
+
Cuando comienza la difusin, los iones - - +

positivos difunden ms rpido, ocurre - + + + +

-
separacin de cargas en la interface (lnea de - -
+
trazos), y se desarrolla un potencial de difusin + - +
+
-
(positivo del lado derecho) + +
(+)
El potencial de difusin acelera la velocidad de
difusin de los iones negativos, y disminuye la
difusin de los iones positivos (-)
Ambos iones entonces difunden a favor de
disipar sus gradientes de concentracin a igual
velocidad, de manera de preservar la
electroneutralidad excepto en la interface
 Potenciales de membrana

Potenciales de membrana son potenciales de difusin

generados a travs de membranas debido a gradientes de +
concentracin inica y permeabilidades distintas para los Ion positivo
diferentes iones - Ion negativo
En este ejemplo, la solucin de la izquierda es
ms concentrada y la membrana es selectivamente
permeable a los iones positivos -
- + -
+
Los iones positivos difunden a travs de la membrana de + - +
-
izquierda a derecha, dejando atrs los iones negativos. Esto +
- -
genera un potencial de membrana que previene cualquier +
- +
movimiento neto ulterior de iones -
+ - +
Las cargas en exceso permanecen muy cerca
-
de las superficies de la membrana debido al campo +
elctrico a travs de la membrana
En esta situacin, tanto el potencial de membrana como
las concentraciones inicas a cada lado de la membrana (+)
sern constantes en el tiempo (-)
El potencial de membrana puede escribirse como ,
Vm o Em

For an excellent simulation, see http://nerve.bsd.uchicago.edu/memb.htm (courtesy of Dr. F.

Bezanilla, Univ. Chicago)
 Resumen
definir difusin en trminos de la primera Ley de Fick
reconocer las variables involucradas en el proceso de difusin
apply this
aplicar esteknowledge to diffusion
conocimiento acrossa biological
a la difusin travs de membranes
membranas biolgicas
distinguir entre sustancias que cruzan o no las membranas biolgicas
predecir la permeacin de cidos y bases dbiles
summarize the concept
resumir el concepto of membrane
de potencial potential
de membrana

Gap Junction
 Elija la respuesta correcta
Respecto del coeficiente de permeabilidad P:
a) las unidades de P son masa/rea
b) P es independiente del espesor de la
membrana
c) si aumenta al doble el coeficiente de particin
lpido/agua (KP) de una sustancia en la
membrana, el flujo aumenta tambin al doble
d) es independiente del coeficiente de difusin D
de la sustancia en la membrana
e) cuanto mayor es el valor de P menor es el flujo
de la sustancia