Conceitos HPLC 2010 PDF

CONSELHO REGIONAL DE
QUMICA - IV REGIO (SP)
Conceitos fundamentais de
Cromatografia a lquido de
Alto Desempenho (HPLC)
Ministrante: Ayrton Argenton
CEP Curso
Contatos: ayrtonargenton@hotmail.com
Apoio
So Jos do Rio Preto, 29 de maio de 2010

Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formato
PDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
Minicursos CRQ-IV - 2010
Conceitos fundamentais de HPLC
CONCEITOS DE CROMATOGRAFIA A LQUIDO

DE ALTO DESEMPENHO(HPLC)
AYRTON ARGENTON
Prof. Ayrton Argenton: Qumico formado pela USP. Pesquisador Snior pela
REPUSA Petrobrs, Chefe do Centro de Pesquisa da Oxiteno, Chefe de
Pesquisas e Laboratrio da CGS Instrumentao Ltda. Ministrou
treinamentos tcnicos para centenas de empresas brasileiras. Mais de 20
anos de experincia e especializao em treinamento de Cromatografia a
Lquido e a Gs em Inds. Qumicas, Farmacuticas, Alimentcias,
Destilarias e Usinas de Acar e lcool e Empresas relacionadas.
Atualmente aplica Treinamentos e Consultoria pelo CEP CURSOS Centro
de Educao Profissional www.cepcursos.com
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Nas indstrias qumicas, farmacuticas,

alimentcias, refinarias, petroqumicas,
laboratrios de anlises clnicas,
ambiental e forense entre outras,
frequentemente necessrio separar,
isolar, purificar, identificar e quantificar
os componentes de misturas muitas
vezes bastante complexas.

SEPARAO
Operao pela qual uma mistura dividida em pelo menos duas fraes com
diferentes composies.
obtida por meios fsicos embora reaes qumicas podem ser envolvidas no
processo.
Os mtodos fsico-quimicos de separao so baseados na utilizao de alguma
propriedade fsica das substncias a serem separadas.
Exemplos:
TIPO DE SEPARAO PROPRIEDADE FSICA
Destilao fracionada Diferena de ponto de ebulio
Diferena na constante de distribuio

Extrao com solvente (partio) dos componentes em dois
solventes
Diferena de afinidade das substncias por
Cromatografia
um material ativo ou adsorvente

IMPORTNCIA DA CROMATOGRAFIA
Velocidade
Poder de resoluo
Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 10-15g)
Simplicidade da tcnica

EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS

EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS

VISO GERAL DE CROMATOGRAFIA
O objetivo da cromatografia separar individualmente os diversos

constituintes de uma mistura de substncias seja para identificao,
quantificao ou obteno da substncia pura para os mais diversos fins.
Tal separao d-se atravs da migrao da amostra atravs de uma fase
estacionria por intermdio de um fluido (fase mvel).
Aps a introduo da amostra no sistema cromatogrfico, os
componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais
lentamente que a fase mvel devido ao efeito retardante da fase
estacionria.
O equilbrio de distribuio determina a velocidade com a qual cada
componente migra atravs do sistema.

DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA FLUXO
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS
CROMATOGRAFIA
PLANAR EM COLUNA
TCNICA
FASE
MVEL LQUIDO GS
FLUIDO
LQUIDO
SUPERCRTICO
FASE
ESTACIONRIA
LQUIDO SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA

High Performance Liquid Chromatography

CLAD = Cromatografia a Lquido de Alto Desempenho
CLAE = Cromatografia a Lquido de Alta Eficincia
DESCRIO GERAL DE HPLC
A amostra dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatogrfica

preenchida com a fase estacionria (FE)
Um solvente (FM) bombeado com vazo constante e desloca os componentes
da mistura atravs da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo
com suas afinidades
As substncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. J as
substncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente.
Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal
eltrico o qual registrado, constituindo um cromatograma.

EXEMPLOS DE CROMATOGRAMA HPLC
Mistura de aminocidos

High Performance Liquid Chromatography

APLICAO
HPLC utilizada em anlises de compostos no volteis ou instveis termicamente onde a
cromatografia a gs no pode ser utilizada.
Como cerca de 80% dos compostos apresentam essas caractersticas, o campo de aplicao de HPLC
extremamente vasto.
ALGUNS EXEMPLOS DE APLICAES E ANALITOS
Indstria Analitos
Acares, cido ascrbico, cido benzico,

Alimentos parabenos, vitaminas, protenas, peptdeos,
aminocidos
Tintas Resinas, Tensoativos, biocidas
Qumica Polmeros
Clnicas Metablitos, protenas, peptdeos, aminocidos
Farmacutica Princpios ativos

COMPARATIVO HPLC / CG
Fator CG HPLC
Amostra ou derivado voltil

Requisitos da amostra estvel termicamente na Amostra solvel na fase mvel
temperatura de trabalho
Lquidos e slidos
Gases, lquidos e slidos
Tipo de Amostra Inicos ou covalentes
baixo peso molecular
Baixo e alto peso molecular
Tempo de anlise relativo Em geral mais rpidas que HPLC Em geral mais lentas que CG
Pratos tericos por coluna At 300000 At 30000
Capacidade preparativa Pobre Boa
10-9 g (UV)
Sensibilidade 10-12 g (DIC / DCE)
10-15 g (coulomtrico)

INSTRUMENTAO EM HPLC
DIAGRAMA DE UM CROMATGRAFO A LQUIDO
RESERVATRIO
INJETOR COLUNA DETECTOR
FASE MVEL
BOMBA AQUISIO
DE DADOS
O cromatgrafo a lquido constitudo dos seguintes componentes:
1. Reservatrio e sistema de bombeamento da fase mvel

2. Sistema de introduo de amostra
3. Sistema analtico: coluna cromatogrfica e termostato
4. Sistema de deteco (um ou mais detectores)
5. Sistema de registro e tratamento de dados.

DIAGRAMA DETALHADO DE UM HPLC

FOTO ILUSTRATIVA DE UM HPLC

RESERVATRIO DA FASE MVEL
A figura abaixo ilustra o reservatrio da fase mvel e seus componentes:
tampa de teflon

CONSIDERAO IMPORTANTE 1:
A fase mvel no pode conter partculas para evitar danos bomba, injetor e
coluna, logo necessrio filtrao antes de armazenar a fase mvel no
reservatrio.
A figura abaixo ilustra um filtro para HPLC:
A escolha do filtro funo da natureza da fase mvel. Usualmente utiliza-se

membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5
m)
CONSIDERAO IMPORTANTE 2:
A fase mvel deve ser degaseificada para evitar a formao de bolhas no processo
de separao o que pode interferir no desempenho da anlise.
As tcnicas de degaseificao so:
Ultrasom
Refluxo com resistncia de aquecimento
Vcuo (trompa dgua)
Purga com Hlio
Uso de membrana semipermevel e vcuo online.

BOMBA
CARACTERSTICAS PRINCIPAIS
Leva a fase mvel desde o reservatrio at a coluna

Alta reprodutibilidade e exatido
Vazo contnua sem pulso de 0,01ml /min - 10ml /min
Vazo constante independentemente da presso
Alta resistncia corroso inrcia qumica a solventes comuns
Opera a altas presses (6000 psi)
CONSIDERAES IMPORTANTES
Vazo constante essencial para qualquer separao por HPLC. Alta presso necessria para
impulsionar o solvente atravs da coluna cromatogrfica vencendo a enorme resistncia imposta pela fase
estacionria.
Normalmente se utiliza bombas recprocas com um ou preferencialmente dois pistes o que minimiza
pulsao.
Preferencialmente devem operar com programao de vazo e deve ser possvel a interrupo do
processo em presses fora dos limites mximos e mnimos pr-estabelecidos.
importante introduzir fatores de correo de compressibilidade para a fase mvel utilizada ainda que os
lquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrrio, a vazo real pode diferir da selecionada.

BOMBEAMENTO ISOCRTICO OU POR GRADIENTE
BOMBEAMENTO ISOCRTICO
A composio da fase mvel mantida constante durante toda anlise cromatogrfica.

Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o equipamento
necessrio para uma anlise isocrtica.

BOMBEAMENTO POR GRADIENTE
Alguma anlises necessitam alterao da composio da fase mvel, sem alterao da

vazo total, com a finalidade de diminuir tempo de anlise e/ou melhorar a separao dos
componentes da amostra.
O bombeamento por gradiente pode ocorrer baixa presso ou a alta presso.
No caso de baixa presso utiliza-se uma nica bomba e a seleo do solvente a ser
utilizado d-se atravs de vlvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema.
J no caso do bombeamento de alta presso, cada solvente tem uma bomba especfica.
A figura abaixo ilustra o equipamento necessrio para o a anlise por gradiente a baixa e
alta presso.

BOMBEAMENTO POR GRADIENTE BAIXA PRESSO
BOMBEAMENTO POR GRADIENTE ALTA PRESSO

BOMBEAMENTO ISOCRTICO OU POR GRADIENTE
A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por anlises isocrtica e por gradiente.
ISOCRTICA GRADIENTE

INJETOR
SISTEMA DE INTRODUO DE AMOSTRA
Em HPLC, a injeo de amostra realizada com auxlio de vlvulas especiais que

permitem introduo com grande preciso e exatido de volumes que variam, em geral, de
5 a 20l. A figura abaixo, mostra um esquema de uma vlvula tpica nas posies de carga
e de injeo.
A amostra introduzida na vlvula com auxlio de uma microseringa com agulha sem ponta
e a injeo efetuada pela rotao da vlvula da posio de carga para a posio de
injeo.
COLUNAS CROMATOGRFICAS
COLUNAS ANALTICAS E PRE-COLUNAS
A separao efetuada nas colunas cromatogrficas, feitas em ao e resistentes a altas

presses(at 500 atm)
Os tubos das colunas so preenchidos com a fase estacionria conveniente, geralmente
slica ou seus derivados, com granulometria de 3, 5, 7 ou 10 m (em alguns casos, at de
1 m) de dimetro mdio.
Devido a queda de presso elevada nos tubos, as colunas so relativamente curtas e de
paredes espessas.
COMPRIMENTO: 3 60 cm
DIMETRO INTERNO: 0,2 8 mm
As colunas normais apresentam dimetro interno variando de 4 6 mm e comprimento
que depende da granulometria da fase estacionria como mostra a tabela abaixo.
Granulometria (m) Comprimento (cm)

3-5 10 15
7 10 At 25 cm (em casos
especiais, at 60 cm)

COLUNAS ANALTICAS CONSIDERAES IMPORTANTES:
Como o tempo de reteno depende da temperatura, as colunas devem ser mantidas

termostatizadas em um forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada para a
separao.
Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua eficincia, esto sendo introduzidas
colunas de dimetro interno de 1 3 mm, de forma que possa operar-se com fluxos
menores o que resulta em diminuio substancial do custo de operao e aumento de
sensibilidade como ilustrado na figura abaixo.

PR-COLUNAS (GUARD COLUMNS)
SEMPRE USE PR-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA DA COLUNA
ANALTICA
CARACTERSTICAS PRINCIPAIS:
Protege a coluna analtica contra contaminaes qumicas
Mesmo material de empacotamento da coluna
Comprimento Tpico: 25 mm
Descartveis
O uso de pr-colunas de importncia vital para a vida til da coluna analtica. A filtrao da
fase mvel e da amostra nem sempre so suficientes para a eliminao de impurezas
prejudiciais coluna. Dependendo das caractersticas da fase estacionria e da natureza da
amostra, pode acontecer o que se chama de reteno irreversvel, ou seja, a afinidade do
contaminante pela coluna to grande que ele no elui, ficando retido nos primeiros
centmetros do empacotamento. Retido na cabea da coluna, o contaminate pode provocar
perda da eficincia, aumento de presso e cauda nos picos. Com o uso da pr-coluna, o
contaminante no atingir a coluna analtica. Ao perceber os sintomas de contaminao (os
mais comuns so aumento de presso e elevao no nvel de rudo), o analista substitui a
pr-coluna, que em mdia custa 10 vezes menos que a coluna analtica.
DETECTORES
O detector um dispositivo conectado na sada da coluna que percebe a presena de componentes e emite um sinal
eltrico a ser registrado na forma de um pico cuja rea proporcional a quantidade do componente analisado.
Um detector ideal deve possuir as seguintes caractersticas:
Alta Sensibilidade
Estabilidade
Mudanas de temperatura e vazo de fase mvel no devem alterar o sinal
Reprodutibilidade
Resposta Linear
A resposta do detector deve variar linearmente com a concentrao do analito numa extensa faixa
de concentrao
Resposta rpida aos analitos
No contribuir para o alargamento do pico
O volume da cela do detector deve ser o menor possvel para evitar a perda de eficincia do sistema.
Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade.
Confiabilidade
Facilidade de manuseio
No destrutivo
Condio necessria para cromatografia preparativa
Seletividade
Habilidade relativa de um detector medir um composto e no outro.

DETECTORES
TIPOS DE DETECTORES
Os principais detectores utilizados em HPLC so:
ndice de refrao
Espectrofotometira UV-Visvel
Fluorescncia
Eletroqumico
Espectrometria de massa LC/MS

DETECTORES
NDICE DE REFRAO
No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer uma alterao do ndice
de refrao. Essa alterao em relao ao valor da fase mvel livre de analito detectada.
A deteco s possvel quando o ndice de refrao do analito diferente do IR da fase

mvel.
Esse detector normalmente utilizado quando os analitos no absorvem na regio de

comprimento de onda do UV-VIS.
Apresenta as seguintes desvantagens:
baixa sensibilidade
no permite a utilizao em anlises por gradiente (pois o IR varia com a composio da
fase mvel)
temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura)
APLICAO
Anlises de carbohidratos e acares em geral.
DETECTORES
ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UV-VIS)
Baseia-se na absorbncia da luz pelo analito ao passar pelo detector.

um detector seletivo pois s detecta os compostos que absorvem no comprimento de onda
em que o detector for ajustado.
o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das substncias absorvem radiao
UV. Exemplos de substncias so: olefinas, aromticos, compostos contendo ligaes C=O,
C=S, N=O.
CONSIDERAES IMPORTANTES:
A fase mvel utilizada no pode absorver no comprimento de onda selecionado

A pureza da fase mvel extremamente importante (traos de impurezas podem absorver
intensamente no comprimento de onda utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC
TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:
Fotomtricos comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm

Espectrofotomtricos comprimento de onda varivel: 00nm a190nm

DETECTORES
Espectrofotomtricos
O comprimento de onda varivel entre 190nm e 800nm selecionado atravs do

monocromador (UV = lmpada de deutrio e VIS = lmpada de tungstnio).
Possui maior aplicao pois permite selecionar o comprimento de onda mais
adequado para os componentes a serem analisados.
Maior sensibilidade: escolha do comprimento de onda de maior absorbncia.
Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de interesse
absorve e outros no.
Permite a utilizao de anlise por gradiente: escolha do comprimento de onda onde
os constituintes da fase mvel no apresentam variao de absorbncia.
Permite obter o espectro de absorbncia de cada componente separado
interrompendo o fluxo da fase mvel e assim selecionar o melhor comprimento de
onda.

DETECTORES
Como mostra o esquema do

detector, o comprimento de onda
selecionado atravs do
monocromador do feixe de luz
emitido pela lmpada de deutrio
ou tungstnio e incide na cela por
onde passam os componentes da
amostra que absorve parte da luz
dependendo de sua absortividade
molar e concentrao. A quantidade
de luz no absorvida detectada
pela fotomultiplicadora.

DETECTORES
Espectrofotomtricos (REDE DE DIODOS DIODE ARRAY)
Nesse tipo de detector, toda luz passa pela cela. A luz emergente dispersada em uma grade
hologrfica e os comprimentos de onda resultantes so focalizados em uma rede de fotodiodos (256 a
1024). Assim, todo o espectro do componente pode ser armazenado. Com o auxlio de um computador,
pode-se reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de onda ou produzir uma
srie de espectros em intervalos de tempo fixos.
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DETECTORES
REDE DE DIODOS: VANTAGENS EM
RELAO AO DETECTOR UV-VIS
No detector UV-VIS, seleciona-se o
comprimento de onda que pode no ser o
mais adequado para todos os
componentes da amostra. Isso resulta na
perda de sensibilidade de alguns
componentes da amostra.
A figura ao lado ilustra a diferena de
intensidade do pico para um composto
em funo do comprimento de onda.
Com o DAD, pode-se selecionar o melhor

comprimento de onda para cada um dos
componentes, otimizando dessa forma a
sensibilidade. Isso extremamente
importante na determinao de
impurezas nas snteses e controle de
qualidade de princpios ativos de
produtos farmacuticos.

DETECTORES
ELETROQUMICOS
Baseia-se na possibilidade de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos quando se

aplica um potencial eltrico.
Em um processo eletroqumico, um par de eletrodos colocado na cela e um potencial

suficientemente elevado aplicado provocando uma reao de oxidao ou reduo
gerando uma corrente que medida em um detector eletroqumico. A corrente gerada
proporcional a concentrao do composto.
TIPOS DE DETECTORES
Amperomtrico
O elemento flui pela superfcie do eletrodo onde uma frao das espcies
eletroativas oxidada ou reduzida (15-20%).
Coulomtrico
O elemento flui atravs de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente
100% das espcies eletroativas so oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade
muito maior (10-15 mol = fentomol) .

DETECTORES
ELETROQUMICOS COULOMTRICO
A figura abaixo representa um esquema de uma cela coulomtrica:

DETECTORES
ELETROQUMICOS COULOMTRICO COULARRAY
possvel montar um conjuntos de detectores coulomtricos em srie o que permite aplicar um

potencial crescente em cada cela de forma a oxidar ou reduzir seletivamente cada componente
em cada uma das celas. Assim, compostos que eluem juntos podem ser quantificados apesar de
no terem sidos separados.
possvel o arranjo de 4 a 16 celas eletroquimicas obtendo-se cromatogramas tridimensionais.
Tais detectores tem grande aplicao na anlise de produtos farmacuticos, bebidas e
alimentos, anlises ambientais e em neurocincia (neurotransmissores, drogas).

DETECTORES
ELETROQUMICOS COULOMTRICO COULARRAY

COMPARAO DE DETECTORES HPLC
Espectrofotometria UV-
ndice de Refrao VIS Fluorescncia Eletroqumico
Mudana do IR da fase Absorbncia de luz UV- Excitao com luz produz Oxidao ou reduo em
Princpio de operao
mvel VIS emisso fluorescente um potencial fixo
Tipo Universal Seletivo Seletivo Seletivo
Quantidade mnima
Micrograma Nanograma < picograma Fentograma
detectvel
Faixa de linearidade 103 104 104 105 103 105 105
Volume da cela
3-15 1-20 8-25 5-10
(microlitro)
Sensibilidade a
Alta Baixa Baixa Mdia
temperatura
Compostos que
Compostos ou derivados Espcies que oxidam ou
Aplicaes Geral absorvem na regio UV-
que fluorescem reduzem
VIS

ELSD EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR
Detector universal para compostos no volteis.

Baseado na habilidade das partculas causarem espalhamento(scattering) de
ftons, quando elas atravessam um feixe de luz policromtica.
O lquido efluente do HPLC primeiro nebulizado e a mistura aerosol
resultante contendo as partculas dos analitos dirigida a um feixe de luz. As
partculas causam espalhamento da luz. gerado um sinal, que proporcional
massa presente, e independe da presena ou ausncia de grupos
cromforos, fluorforos ou eletroativos.
Qualquer analito no voltil pode ser detectado.
Pode ser usado acoplado a um espectrmetro de massa, para fornecer uma
anlise completa da amostra.
Aplicaes para o elsd:
Lpidios, acidos graxos, carbohidratos, polmeros, esteroides, aminocidos,
aditivos de plsticos, produtos farmacuticos, etc.

ELSD EVAPORATIVE LIGHT SCATTERING DETECTOR

CHARGED AEROSOL DETECTOR
CORONA
Este detector oferece os benefcios de desempenho que cada um dos detectores:
ndice de refrao, UV de baixo comprimento de onda, ELS de quimiluminescncia
de nitrognio num nico detector.
O eluente primeiro nebulizado com nitrognio, e as gotas so secas para remover
a fase mvel, produzindo as partculas dos analitos.
Uma corrente secundria de nitrognio passa por um sistema de alta voltagem e
carregado positivamente.
Esta carga transferida para as partculas do analto, que flue em sentido oposto.
A carga transferida para um coletor onde medida por um eletrmetro altamente
sensvel, gerando um sinal que diretamente proporcional quantidade de analito
presente.
O fator de resposta do analito independente da estrutura qumica.
Aplicaes do CAD:
Ideal para uma larga faixa de aplicaes de compostos no volteis e semi-volteis:
drogas, carbohidratos, lipdios, esterides, peptdios, protenas, polmeros.
Indstrias farmacuticas, alimentcias, qumicas, pesquisa life science,etc.


QUADRO COMPARATIVO DE DETECTORES
Sensibilidade Faixa Dinmica Consistncia de Aplicabilidade Reprodutibilidade Compatibilidade Facilidade

Resposta Cromatogrfica de Uso
Charged Aerosol

UV

Evaporative Light
Scattering

Chemiluminescence
Nitrogen

Refractive Index


AQUISIO DE DADOS
Atualmente utilizam-se softwares que permitem:
Processar os dados de cromatograma
Armazenar e registrar
Controlar a composio da fase mvel (isocrtica e por gradiente), vazo da bomba,

amostrador automtico, temperatura da coluna
Realizar clculos para System Suitability Test (SST)

SEPARAO CROMATOGRFICA
Em funo da fase estacionria utilizada tem-se os seguintes

mecanismos de separao:
Adsoro
Partio
Troca inica
Excluso
Bioafinidade

ADSORO
A fase estacionria um slido contendo grupos (stios ativos) que podem adsorver certas
substncias.
Na adsoro tem-se o seguinte equilbrio:
[adsorvido na FE]
Kads =
[desorvido na FM]
Compostos com diferentes constantes de adsoro so separados.
FM FE

PARTIO
A fase estacionria um lquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte slido.
As molculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionria

ligada e a fase mvel lquida de acordo com sua afinidade relativa:
[dissolvido na FE]
Kpart =
[dissolvido na FM]
Compostos com diferentes constantes de partio so separados.

PARTIO
FM FE
A FM carrega as molculas nela dissolvidas. Para reestabelecer o equilbrio,

molculas na FE passam para a FM e so arrastadas. Tem-se um equilbrio
dinmico em cada segmento da coluna. Como a FM est em contnuo movimento,
esta acaba retirando todas as molculas da coluna.

TROCA INICA
A fase estacionria uma resina catinica ou aninica.
O esquema abaixo ilustra o processo:
+
- -
+
+

POR EXCLUSO
A separao efetuada de acordo com o tamanho das molculas.

A fase estacionria tem poros de tamanho controlado
Molculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros e apresentam um maior tempo de
reteno
Molculas grandes movem-se rapidamente atravs da coluna pois no entram nos poros
A tcnica utilizada na anlise de compostos de alta massa molecular
O mecanismo da excluso forma a base da cromatografia gel (permeao de gel e filtrao
de gel) utilizada na determinao de distribuio de peso molecular de polmeros e protenas

BIOAFINIDADE
Nessa tcnica somente componentes que possuem

bioafinidade com a fase estacionria so retidos.

PARMETROS CROMATOGRFICOS
Uma srie de parmetros cromatogrficos so importantes para serem utilizados na

identificao dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatogrfico e auxiliar na
otimizao do processo de separao.
Os parmetros cromatogrficos a serem discutidos so:
TEMPO DE RETENO
FATOR DE RETENO
FATOR DE SEPARAO
NMERO DE PRATOS
RESOLUO

TEMPO DE RETENO
Por definio chamamos de TEMPO DE RETENO, tr, de uma substncia ao tempo

decorrido do instante em que a amostra foi introduzida at o instante do mximo do pico.
Na anlise cromatogrfica, mantido constantes a vazo da fase mvel e a temperatura da

coluna, o tempo de reteno constante.

A partir da figura acima, definimos os seguintes parmetros cromatogrficos de acordo com

as equaes abaixo:
Parmetro Cromatogrfico Definio
Fator de reteno k = tr / to
Fator de separao = tr2 / tr1
Nmero de pratos N = 16 ( tr / Wb )2
Resoluo Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)

NMERO DE PRATOS
N = 16 ( tr / Wb )2
Nmero indicativo da performance da coluna. a medida da largura do pico em relao ao seu tempo
de reteno. o parmetro que mais precisamente define a qualidade de um sistema cromatogrfico.
Outra medida da eficincia da coluna dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um
prato terico.
L onde L = comprimento da coluna
H= N = nmero de pratos
N
RESOLUO
Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)
Fornece uma medida

quantitativa da
habilidade da coluna
em separar duas
substncias.

EFICINCIA DA COLUNA
A introduo da amostra na coluna leva menos de 1 segundo. Como o equilbrio

entre FE e FM muito rpido, a largura dos picos tambm deveria ser
aproximadamente 1 segundo. Entretanto, isso no ocorre devido a processos de
transporte de massa que altera a velocidade das molculas de um mesmo composto
dentro da coluna. Estatisticamente algumas molculas viajam mais rapidamente e
outras mais lentamente que a mdia das molculas, atingindo o detector em tempos
diferentes. Consequentemente, o pico registrado alargado.
Alm dos processos de transporte de massa, causas externas coluna, tambm

contribuem para o alargamento dos picos.
Quanto maior o valor de N maior a eficincia da coluna.
A altura equivalente a um prato terico outra maneira de considerar a eficincia da

coluna. Quanto menor H, maior a eficincia da coluna.
H o resultado da somatria das contribuies de cada um dos processos de

alargamento intra-coluna(Hi) e extra-coluna(He).

EFICINCIA DA COLUNA
Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos:
1-Difuso catica(Eddy diffusion) caminhos preferenciais diferentes H=Ce.dp, onde Ce

uma constante do processo e dp o dimetro da particula.
2- Transferncia de massa na fase mvel ao passar no interstcio das partculas, as
molculas que viajam perto das paredes da FE tero velocidades menores das que
viajam no centro H= Cm.dp2.u/Dm, onde u a velocidade da fase mvel, Dm o
coeficiente de difuso da substncia na fase mvel.
3- Contribuio da FM estagnada.Dentro dos poros das partculas, algumas molculas
so mais retidas do que outras. H = Csm.dp2.u/Dm
4- Influncia de transferncia de massa com a FE aps a difuso das molculas dentro
dos poros, elas penetram na FE. As que penetram mais profundamente dentro da
FE, tambm demoraro mais para sair e se atrasaro em relao a outras,
consequentemente, o pico se alargar. H = s.u.df2/Ds, onde df a espessura do
filme e Ds o coeficiente de difuso da substncia da fase estacionria.

EFICINCIA DA COLUNA
Os seguintes processos intra-coluna contribuem para o alargamento dos picos (cont.):
5- Difuso longitudinal na fase mvel H = Cd.Dm/u

A somatria desses fatores contribuem para aumentar o valor de H e portanto
diminuio da eficincia da coluna.
De modo geral as seguintes variveis contribuem para o alargamento do pico:
Substncia i, FM, FE, u, Dm. Ds, 1/u, dp, dp2, df2, dimetro do poro, rea superficial,
Tcoluna).
A velocidade da fase mvel tem efeito prejudicial para alguns fatores e benficos para
outros. Portanto, a avaliao de H em funo da velocidade da FM passa por um
mnimo.
Entre as causas externas, podemos citar: comprimento e dimetro interno dos tubos
que ligam a vlvula de introduo da amostra coluna, volume das conexes
envolvidas, volume da cela do detector, etc.

EFICINCIA DA COLUNA

EFICINCIA DA COLUNA
OTIMIZANDO EFICINCIA DA COLUNA
Os seguintes fatores devem ser considerados na otimizao da eficincia da coluna:
Tamanho de partcula
Viscosidade da fase mvel
Temperatura
Empacotamento
A equao de Van Deemter mostra que quanto menor a partcula, menor H e menor a
influncia da vazo na eficincia da coluna:
10
H
5
Vazo
FASES ESTACIONRIAS
As FE so constitudas de material slido, granulado, finamente dividido e densamente

empacotado dentro de um tubo feito de material inerte, normalmente ao. O material slido
pode estar revestido ou ligado quimicamente a um lquido.
TIPOS DE FASES ESTACIONRIA

FE SLIDA
FE POR EXCLUSO
FE POR TROCA INICA
FE POR BIOAFINIDADE
FE QUIMICAMENTE LIGADA
NORMAL
REVERSA

FASE ESTACIONRIA SLIDA

Separao realizada por mecanismo de adsoro
Utiliza partculas porosas em geral de 5 micra ou 10 micra
Indicada para compostos com peso molecular menor que 2000 Daltons
Solventes mais utilizados so de mdia e baixa polaridade
Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente slica
SLICA
A slica possui grupos siloxano, Si-O-Si e grupos silanol, Si-
OH vicinal e germinal. Os grupos silanol so os mais
importantes devido a sua polaridade. Quanto mais polar o
composto, maior a reteno.
A ordem de eluio em slica : hidrocarbonetos saturados <
olefinas < aromticos < teres< steres < aldedos cetonas
< lcoois < aminas < amidas < cidos carboxlicos.
Dependendo do procedimento de produo da slica, suas
caractersticas, como volume de poro, dimetro de poro, rea
superficial, nmero de grupos silanol, variam resultando em
reteno varivel.

FASE ESTACIONRIA POR EXCLUSO
A separao baseia-se no tamanho das molculas dos componentes da amostra em relao

ao dimetro dos poros da fase estacionria.
As fases estacionrias podem ser slica ou polmeros de poliestireno-divinilbenzeno,

poliacrilamidas e outros, com distribuio de dimetro dos poros controlada.
Molculas pequenas entram nos poros pequenos enquanto as molculas grandes no

conseguem entrar nos poros. Desta forma elas so permeadas seletivamente.
A tcnica denominada cromatografia de excluso por tamanho.

FASES ESTACIONRIAS
A figura abaixo ilustra o processo de separao:

FASES ESTACIONRIAS
APLICAES:
PERMEAO EM GEL FILTRAO EM GEL

(FM orgnica) (FM aquosa)
Resinas alqudicas Peptdeos
Epxidos Proteinas
Poliestirenos Enzimas
Borracha natural cidos Nucleicos
Silicones Lipdios
Colunas de permeao de gel fabricadas com sais de clcio ou chumbo de resinas sulfnicas
com dimetro de poro controlado, so usadas nas anlises de dextrana, oligossacardeos e
acares.

FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA POR TROCA INICA
A separao baseia-se na interao eletrosttica dos componentes da amostras com

grupos inicos da FE.
A FE normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual esto ligados

grupos inicos, ou a FE slica recoberta com uma fina camada de poliestireno-
divinilbenzeno onde grupos inicos esto ligados.
Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material de troca inica so:
SO3- : trocadores fortes de ctions
CO2- : trocadores fracos de ctions
NR3+ : trocadores fortes de nions
NH2R+ : trocadores fracos de nions

FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA POR TROCA INICA

FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA QUIMICAMENTE LIGADA

So as fases mais importantes da cromatografia lquida Obtidas pela reao dos
grupos silanois da slica com compostos contendo grupos polares(Fase Normal)
ou nao polares(Fase Reversa).
Na Fase Quimicamente Ligada, a slica gel, atravs dos grupamentos Si - OH, se
liga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade
qumica.
A Cromatografia de Fase Ligada subdividida em Fase Normal e Fase Reversa

de acordo com a polaridade dos grupos funcionais ligados slica gel.
As notveis propriedades deste tipo de material fazem da Cromatografia de Fase

Ligada a mais utilizada em todo o mundo.

FASES ESTACIONRIAS
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
Grupos silanis so responsveis por retenes no especficas que
provocam alargamento dos picos.
FASES ESTACIONRIAS
Para a produo das Fases Quimicamente Ligadas, a slica gel submetida a um
processo de hidrlise formando grupos silanis SiOH, grupo quimicamente ativo
no qual se ligar o grupo funcional atravs de reaes de silanizao, utilizando
organosilanos(ex. dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou trifuncionais,
dependendo do numero de grupos no silano que pode reagir. Obtem-se fase
monomrica ou polimrica.
Infelizmente, devido a efeitos estricos, muitos grupos SiOH no reagem

permanecendo ativos e provocando encaudamento dos picos.
Ligao qumica tradicional usando silano monofuncional alcana um mximo de

50% ou uma densidade de ligante de ~4mol/m2.
Para atenuar este problema, emprega-se um processo conhecido como

Endcapping.

FASES ESTACIONARIAS
ENDCAPPING
Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais necessrio um passo

secundrio de ligao para cobrir esses grupos ainda presentes na slica.
O processo denominado endcapping efetua-se em geral com
trimetilclorosilano(TMS). Ainda assim restam grupos silanol livres
As slicas usuais s podem ser utilizadas na faixa de pH 2 8, pois os
grupos TMS sofrem hidrolise a pH menor que 2 e a slica se dissolve em
fase mvel contendo gua em pH maior que 8.
Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos bsicos, limitao
de pH, baixo tempo de vida da coluna, tem sido resolvidos ou minimizados
atravs de desenvolvimentos mais recentes, tais como: slica de alta
pureza, partculas hibridas, slica tipo C(slica hidreto) e novas quimicas
ligantes.

ENDCAPPING

FASES ESTACIONRIAS - NOVOS DESENVOLVIMENTOS
SLICA DE ALTA PUREZA(slica tipo B) maior que 99.995%, com menos de 50ppm de
metais, (metais causam caudas pois tornam os silanols extremamente cidos).
PARTCULAS HBRIDAS desenvolvido pela Waters, essas partculas so um hbrido

orgnico/inorgnico.Contm ambos slica e organosiloxane. produzida pela mistura de
dois monomeros de alta pureza: (RO)4Si + (RO)3SiR. O produto da reao contm
unidades de SiO2 e unidades RSiO1.5 combinados a nvel molecular. O teor de carbono
cerca de 7%, antes de modificaes da superfcie. Colunas Xterra so produzidas com
essas partculas.
Permitem uso na faixa de pH 1 a 12, sem perda de eficincia ou capacidade e devido ao

teor reduzido de grupos silanol, fornecem excepcional forma de picos para analitos
bsicos.
slica TIPO C slica HIDRETO desenvolvida pela Microsolv. Produzida a partir de slica
ultra pura(baixo teor de metais), atravs de uma tecnologia prpria, a slica tipo B
convertida em slica tipo C, hidreto de silicio, livre de carbono, contm menos de 3% de
grupos SiOH. Por isso no forma ligaes fortes com gua o que permite utiliza-la como
fase Normal com solventes Hexano/Acetato de etila e at Agua/Acetonitrila com excelente
preciso.
FASES ESTACIONARIAS NOVOS DESENVOLVIMENTOS
SLICA MONOLTICA MONOLITHIC slica
GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS Grupos di-isopropil e di-isobutil

incorporados aos reagentes ligantes para proteger as ligaes Si-O contra hidrlise
cida.
QUMICA SILANO POLIFUNCIONAL O uso de silanos di-funcional ou tri-funcional

para criar grupos ligados com dois ou tres pontos conduzindo a fases com maior
estabilidade em baixo e alto pH e menor sangramento para LC/MS. Porm os silanos
polifuncionais so de controle mais difcil.
GRUPOS POLARES EMBEBIDOS A incorporao de um grupo polar( ex.

Carbamato, amida, urea, eter, sulfonamida) na cadeia hidroflica de reagentes
ligantes tem conduzido a uma nova classe de fases populares com diferente
seletividade e melhor forma de pico para analitos bsicos devido a blindagem dos
silanois pelo grupo polar embebido. Essas colunas so geralmente menos retentivas
do que as C18 e C8 comuns, para analitos neutros e bsicos. Esto se tornando
muito populares para o desenvolvimento de mtodos de difceis separaes.
SLICA DE ALTA PUREZA

PARTICULAS HIBRIDAS

SLICA MONOLITICA MONOLITHIC SLICA

SLICA FUSED CORE PARTICLE

Tecnologia de partcula fused core, desenvolvida para cromatografia hiper rpida.
Uma camada de slica porosa fundida na superfcie de slica slida.
A particula tem diametro total de 2.7m e a camada porosa 0.5m, rea superficial
de 150m2/g, diametro de poro: 90a e pode ser usada na faixa de pH: 2 9.
As ligaes da fase estacionria so monomricas e endcapped maximinizado.
Como o passo de difuso de apenas 0.5m, reduz a disperso axial e minimiza o
alargamento de pico.
Possui eficincia de particulas sub-2m sem a queda de presso que estas
particulas apresentam e portanto no necessita de equipamento uhplc.
www.sigmaaldrich.com/supelco/the_reporter/207002-ascentis-express.Pdf
www.mac-mod.com/pb/halo -pb.Hmtl
Site da sigmaaldrich supelco the report volume 25.2
Colunas ascentis express particle e colunas halo

GRUPOS ESTERICAMENTE IMPEDIDOS

ADSORVENTES DE
HPLC E
CARACTERSTICAS

FASES ESTACIONRIAS
FASE ESTACIONRIA NORMAL

Grupos Funcionais Polares so ligados matriz de slica. A tcnica, em
geral, substitui com vantagens a Cromatografia por Adsoro.
GRUPOS FUNCIONAIS MAIS COMUNS:
DIOL
CIANO
AMINO

FASE ESTACIONRIA REVERSA
Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais ligados base de slica so apolares. Os
analitos so atraidos para a superficie pelos seus grupos funcionais no polares. O analito mais polar elui
primeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil e
fenila so os mais utilizados. O grupo octadecil responsvel pela maioria das separaes em
fase reversa.
OCTADECIL OCTIL FENIL
Si- O - Si - C18 Si- O - Si - C8 Si- O - Si - CH2-

O O O O O O

O O O O O O

O O O O O O

FASE MVEL
ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC
O sucesso da separao cromatogrfica s possvel se for aplicada uma FM

correta a uma FE conveniente.
A escolha da composio da FM leva em conta vrios fatores, tais como:
Propriedades fsico-qumicas que afetam a solubilidade, partio e adsoro e,

portanto, a separao
Propriedades fsicas que afetam a possibilidade de deteco dos componentes
Propriedades fsicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores ecoluna
Propriedades que afetam a segurana (toxidez e inflamabilidade)
Custo

FASE MVEL
SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS
Os seguintes parmetros devem ser considerados para uma escolha adequada da

FM:
Viscosidade
Compressibilidade
Presso de vapor
Toxidez
ndice de Refrao
Corte de UV (cut off) espectro de absoro UV-VIS
Miscibilidade de solventes e outras caractersticas importantes
Fora dos Solventes

FASE MVEL
VISCOSIDADE
A viscosidade do solvente ou misturas de solventes tem importncia fundamental
durante o bombeamento isocrtico ou por gradiente. A figura abaixo apresenta a
viscosidade de alguns solventes.
94
FASE MVEL
VISCOSIDADE
P da coluna depende da vazo, temperatura, viscosidade da FM e empacotamento da

coluna.
Viscosidade elevada acarreta em dificuldades no bombeamento e elevam o P.
Exemplo da influncia da viscosidade em coluna fase reversa C8- 5 m 25cm

4.6mm:
Solvente Viscosidade (cP) Vazo (ml/min) P (atm)
Metanol 1.1 1.00 102
Isopropanol 2.2 1.00 460

FASE MVEL
VISCOSIDADE
gua, metanol, hidrocarbonetos e outros

compostos com viscosidade menor que 1cP
so timos solventes no parmetro
viscosidade.
A viscosidade influncia na eficincia pois
afeta o coeficiente de difuso acarretando
em perda de nmero de pratos tericos da
coluna.
A viscosidade de misturas de solventes no
varia linearmente com a composio.

FASE MVEL
CORTE UV (CUT OFF)
O UV cut off o comprimento de onda abaixo do qual o solvente absorve mais que uma
unidade de absorbncia em uma cela de 1cm de caminho ptico.
uma referncia para a seleo do solvente da FM quando se usa detector UV.
importante determinar o espectro de absoro do solvente antes de us-lo como FM, pois
eventuais impurezas podem alterar muito o valor do cut off.

MISCIBILIDADE DE SOLVENTES E OUTRAS CARACTERSTICAS
Alm das propriedades discutidas, outros cuidados especiais devem ser tomados na escolha
dos solventes:
Os componentes devem se dissolver na FM para que sejam transportados

atravs da coluna
Imiscibilidade com a FE
Inrcia qumica com a FE e os componentes da amostra
Pureza condizente com o detector utilizado.
Mistura de solventes devem produzir solues homogneas fator importante
nas anlises por gradiente (o mesmo cuidado deve ser tomado na troca de
solventes; em caso de troca de dois solventes imiscveis, deve-se usar um
solvente intermedirio solvel em ambos).
Sistemas no miscveis prejudicam o desempenho da bomba, da coluna e
induzem rudos no detector alm de alterar os tempos de reteno e prejudicar
anlises quantitativas.
FORA DOS SOLVENTES
A interao das molculas dos compostos analisados (analitos) com o solvente (FM) e
consequentemente suas solubilidades depende basicamente das seguintes foras de
interao:
Disperso
Interao dieltrica
Dipolos
Pontes de hidrognio

Miscibilidade Fora do Viscosidade

UV cut off IR 20C
em gua Solvente a 20C, cP
Hexano no 200 1.3750 0.00 0.33
Isooctano no 200 1.3910 0.01 0.50
Tetracloreto de carbono no 263 1.4595 0.14 0.97
Clorofrmio no 245 1.4460 0.31 0.57
Cloreto de metileno no 235 1.4240 0.32 0.44
Tetrahidrofurano sim 215 1.4070 0.35 0.55
ter dietlico no 215 1.3530 0.29 0.23
Acetona sim 330 1.3590 0.43 0.32
Acetato de etila pobre 260 1.3720 0.45 0.45
Dioxano sim 215 1.4220 0.49 1.54
Acetonitrila sim 190 1.3440 0.50 0.37
2-Propanol sim 210 1.3770 0.63 2.30
Metanol sim 205 1.3290 0.73 0.60
gua sim - 1.3328 >0.73 1.00

FASE MVEL
RELAO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Ao variar a polaridade da
fase mvel, varia o fator
capacidade(k=tr/to) e
consequentemente a
seletividade na separao.
Variao de tr e resoluo
com a composio do
solvente em anlise de
metil, etil, propil e butil
parabenos. coluna ODS
(10cm x 0.6 cm), UV
254nm, 40C, gua/metanol

RELAO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Variao do fator capacidade com a composio da fase mvel

FASE MVEL
SELEO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MTODO ANALTICO
Abaixo descreve-se um procedimento tpico para seleo de FM em separaes isocrticas

com fase reversa:
Escolher a coluna conveniente (C8 C18)

Fixar a temperatura da coluna (40C)
Para compostos cidos ou bsicos ajustar a FM gua com cido fosfrico 0.05M ajustando
o pH a 3.5 com hidrxido de sdio
Equilibrar a coluna com solvente orgnico puro (acetonitrila ou metanol, vazo = 1.5ml/min)
Injetar 10-20 l da amostra
Se os componentes elurem perto de to, repetir as anlises alterando a concentrao de
gua crescentemente at o obter separao satisfatria.
A figura abaixo ilustra esse teste utilizando acetonitrila:

SELEO DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MTODO ANALTICO
Constata-se a fora do solvente na separao.

FASE ESTACIONRIA REVERSA
ORIENTAO PARA OTIMIZAO DA SEPARAO
Fase mvel
picos muito rpidos 100% Orgnica picos muito lentos
Adicione gua
(incrementos de Utilizar Fase Normal
20%) at k = 5
injete amostra Adicione pequenas quantidades
de modificadores orgnicos
Ajuste a > 1.2 fortes
picos muito prximos
Diminua vazo Ajuste pH para os compostos

Aumente a coluna parcialmente inicos; fora
Diminua as partculas inica
ainda no separa
Ajuste Temperatura
Altere o modificador
Tente outra Fase
fator reteno : k = tR / tM
estacionria
fator separao: = k2 / k1 = tR2 / tR1
REAES PS-COLUNAS
Para a deteco de alguns componentes, principalmente a baixas concentraes, preciso

transform-los em derivados que apresentem maior sensibilidade para um determinado
detector.
Isso necessrio quando o componente:
No bom cromforo
No bom fluorforo
No eletroquimicamente ativo
Nestes casos efetua-se reaes especficas, formando derivados que possam apresentar
algumas das seguintes propriedades:
Alta constante de equilbrio de formao

Rpida velocidade de formao
Espectro UV-VIS de alta sensibilidade
Fluorescncia
Eletroquimicamente ativos

REAES PS-COLUNAS
EXEMPLO: HERBICIDA GLIFOSATO
Caracterstica original: um mau cromforo e um mau fluorforo

Reao ps coluna: reao com hipoclorito e o-ftalaldedo (OPA) e mercaptoetanol
(MERC)
Glifosato OCl- Glicina OCl- Isoindol

MERC
Deteco: fluorimetricamente do isoindol (excitao a 230-240 nm, emisso a 420-450nm)
injetor 50C reactor reactor
bomba coluna fluormetro
registrador
bomba bomba
OCl- OPA / MERC

REAES PS-COLUNAS
EXEMPLO: BARBITRICOS
caracterstica original: baixa absorbncia no UV
reao ps coluna: elevao de pH a um sistema alcalino (em sistemas alcalinos, a
absorbncia mxima de barbitricos se desloca para comprimentos de onda mais altos,
porm, nessa condio, a FM dissolve a slica da FE, assim, o problema resolvido
elevando-se pH somente aps a coluna.)
deteco: UV a 240 nm
108
PICOS COM CAUDA EM HPLC COM FASE REVERSA
Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia.
Particularmente na separao de compostos bsicos e portanto um problema constante na

anlise de produtos farmacuticos.
Picos com cauda causam inmeros problemas, incluindo baixa resoluo, sensibilidade
reduzida , preciso e quantificao inadequada.
A figura 1 ilustra como a resoluo e sensibilidade da amostra afetada por picos com
cauda.
A figura 2 ilustra como a exatido e preciso de uma anlise pode sofrer devido a inabilidade
dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.


CAUSAS DE CAUDA NO PICO AO CORRETIVA
SOLVENTE DA AMOSTRA MAIS FORTE QUE A FASE DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MVEL OU
MVEL REDUZA A FORA DO SOLVENTE
REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJETADA

EXCESSO DE MASSA DE AMOSTRA TABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA
DE AMOSTRA A SER INJETADA PARA DIFERENTES
COLUNAS.
REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3

AUMENTE A FORA INICA DA FASE MVEL,
25mM A 50mM RECOMENDADO ADICIONE UMA
INTERAO DE SILANOL COM AMINAS AMINA COMPETITIVA NA FASE MVEL 10mM DE
TEA SUFICIENTE.
SELECIONE FASE ESTACIONRIA COM MENOR
ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6
AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MVEL.

25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE.
ADSORO DE CIDOS NA slica REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3.
ADICIONE UM CIDO ORGNICO COMPETITIVO.
1% DE ACIDO ACTICO OU 0.1% DE TFA
USUALMENTE SUFICIENTE.
SUBSTITUA A COLUNA.
VAZIOS NA COLUNA TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS
RARAMENTE VALE A PENA.

ANLISE DE COMPOSTOS BSICOS
Problemas com a forma do pico de compostos bsicos so normalmente comuns.

Mas h vrios passos simples que podem melhorar significativamente a forma do
pico de bases:
1- Selecione uma coluna base-slica desativada.
2- Usar fase mvel com baixo ph.
3 Aumento da concentrao de sais na fase mvel.
4 Selecione uma coluna heavily endcapped.
5 Adicione uma base competitiva.







ANLISE DE COMPOSTOS CIDOS
1 Adicione um cido orgnico competitivo.

Adicionou-se 1% de cido actico fase mvel para minimizar as interaes
soluto-silanol, pela ao de um cido competidor.
Os resultados foram notveis, com o pico de ibuprofen eluindo perfeitamente
gaussiano fator cauda 1.0.
2- Substituindo o cido actico por 0.1% de cido trifluoractico tfa.

A concentrao relativamente alta de cido actico resulta em rudo da linha de
base. Usando tfa 0.1% como modificador aquoso resulta numa fase mvel mais
transparente, menos rudo, e o pico de ibuprofen ainda elui com uma banda
simtrica, fator cauda 1.09.
Em pH 3, a fase mvel est tamponada, porm a capacidade tamponante

baixa. aumento da concentrao para 10 20mm melhorar a reprodutibilidade
cromatogrfica por mais tempo, alm de melhorar ainda mais a forma do pico.


HPLC FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
Tempo de reteno no reprodutvel

um problema comum quando se usa fase
mvel altamente aquosa.
Na separao de compostos muito
polares, solveis em gua no
incomum usar fm com menos de 10% de
modificador orgnico(metanol,
acetonitrila, etc.) Para conseguir
reteno suficiente.
Entretanto, nestas condies a
reprodutibilidade ruim.
Com o tempo, os picos eluiro com
tempo de reteno cada vez menores e a
resoluo piora.
A figura mostra cromatogramas de
anlise de vitaminas em coluna ymc ods-
fm:5meoh 95% 0.1M KH2PO4
f:1ml/min
Vitamina C vitamina B1 vitamina B6 -
nicotinamida

COLAPSO DE FASE ESTACIONRIA

A mudana do tempo de reteno causada pelo fenmeno denominado colapso de fase
de fases alqulicas hidrofbicas c18 ou c8 em condies de fase mvel altamente aquosas.
A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilica interagir com
solutos diminui e o tempo de reteno decresce.
H tambm evidncia que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosa dos poros da
FE, reduzindo a rea superficial acessvel para os solutos e portanto reduzindo os tempos
de reteno.
Em condies normais a fase alqulica est extendida na FM e solvente e molculas da
amostra tem total acesso a fe.
Quando se usa Fm altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo de reteno
afetado.

COLAPSO DE FASE ESTACIONRIA
A figura mostra cromatogramas em coluna c8 base

desativada;
Aps deixar por 10 min. em FM 100% aquosa o tempo

de reteno de amoxicilina diminuiu de 5 min.
Indicando colapso da fase;
Purgando a coluna com solvente orgnico a fase

alquilica novamente extendida e o tempo de
reteno restaurado.

HPLC REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA
COLUNAS QUE NO EXIBEM PROBLEMAS COM COLAPSO DE FASE
Alguns fabricantes resolveram o problema

usando silanos polares com fase ligada ou
usando endcapping hidrofilico.
Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase

alquilica(C18 ou C8) extendida, mesmo MBOS
quando se usa fase mvel 100% aquosa.
Colunas: AquaSep, HydroBond AQ,

HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ

CROMATOGRAFIA POR INTERAO INICA
ION PAIR CHROMATOGRAPHY
A anlise de compostos com carga tem sido obtida por supresso de ion (ajuste
cuidadoso do pH da fase mvel para resultar em analito no ionizvel.
Determinao do pH timo da fase mvel em supresso de ion frequentemente
requer trabalho extensivo no desenvolvimento do mtodo.
Para amostras contendo mais de um componente ionizvel, o mtodo
frequentemente nao adequado.
As limitaes da supresso de ion, conduziu ao desenvolvimento de uma
metodologia mais adequada para a separao de componentes ionizados:
cromatografia por interao inica ion pair chromatography.
A tcnica envolve a adio de composto inico na fase mvel para promover a
formao de pares de ions (ion pairs) com analitos carregados. Estes reagentes so
constituidos de uma cadeia alqulica com terminal ionizvel.
Quando usado com colunas hidrofbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem
ser usados para aumentar seletivamente a reteno de analitos carregados.

FASES MVEIS TAMPONADAS PARA HPLC COM FASE REVERSA
QUANDO UMA FASE MVEL DEVE SER TAMPONADA?

Em HPLC com fase reversa, a reteno dos analitos est relacionada com sua
hidrofobicidade. Quanto mais hidrofbico o analito, mais ele ser retido.
Quando um analito ionizado, ele torna -se menos hidrofbico e portanto sua reteno
diminui.
cidos perdem um proton e tornam-se ionizados quando o ph aumenta.
Bases ganham um proton e tornam-se ionizados quando o ph decresce.
Portanto, nas separaes contendo cidos e/ou bases utilizando fase reversa, necessrio
controlar o ph da faxe mvel, usando um tampo apropriado para se obter resultados
reprodutveis.
126

A figura 2 mostra que metilamfetamina totalmente protonada em pH menor que 3 e sua reteno
no afetada por pequena mudana no pH da fase mvel. J a pH 7, prximo de seu pKa, uma
mudana de apenas 0.2 unidades de pH desloca a reteno de quase 9% .
128

ANLISE QUALITATIVA
A anlise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificao dos analitos de

interesse.
Existem dois casos a serem considerados para anlise qualitativa com HPLC:
Anlise Qualitativa em Controle de qualidade
Anlise Qualitativa em identificaes no rotineiras

ANLISE QUALITATIVA
Anlise Qualitativa em Controle de qualidade
normalmente efetuada atravs da comparao do tempo de reteno ou

reteno relativa dos analitos de interesse com esses parmetros de padres. Tais
anlises so realizadas com metodologias j estabelecidas.
fundamental o controle e monitoramento das condies analticas para evitar
concluses errneas.
Anlise qualitativa em identificaes no rotineiras
Neste caso importante conhecer o mximo da histria da amostra e utilizar

detectores que auxiliam a identificao da estrutura do composto, como detector
de espectrometria de massa.

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS POR NORMALIZAO
Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e so

detectveis
Existem dois procedimentos:
Normalizao de rea (% em rea)
Normalizao utilizando-se a rea corrigida

ANLISE QUANTITATIVA
Normalizao de rea (% em rea)
Ai
%i x100
Ai
Ai = rea do composto i
Ai = somatria das reas de todos componentes
Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua

concentrao e que mesma concentrao de diferentes compostos resulte em
reas iguais (o que dificilmente ocorre).

ANLISE QUANTITATIVA
Normalizao com rea corrigida
Ai xFi
%i x100
Ai xFi
Ai = rea do composto i
Fi = fator de resposta do componente i
AiFi = somatria das reas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos
fatores de resposta
necessrio conhecer todos os componentes da amostra para determinao dos

fatores de resposta de cada componente

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS
Utiliza-se mtodos absolutos quando:
O objetivo da anlise quantificar um ou alguns dos componentes da

amostra.
Ao utilizar detectores especficos ou seletivos que detectam somente os

componentes de interesse
Existncia de compostos na amostra que no so eludos nas condies de

anlise ou no so detectados e que no haja interesse de quantific-los.
Quantificao de componentes em baixa concentrao.
Existem dois procedimentos:
Padronizao externa
Padronizao interna

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao externa
1. Determina-se a curva de calibrao de cada componente atravs da anlise de misturas padres

injetando-se um determinado volume.
2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtem-se a concentrao do analito atravs da
urva dec calibrao.
Ai
Ci
Nesta tcnica, se o volume injetado no for exatamente o mesmo ou se houver alterao de algum
parmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variao da intensidade
de luz do UV-VIS ou alterao na FM, as reas dos picos podero ser maiores ou menores daquelas
obtidas na calibrao e consequentemente os resultados sero incorretos.

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao interna
Para minimizar os problemas da padronizao externa, a amostra e a mistura padro so

modificadas pela adio de um composto considerado como padro interno. O padro
interno deve ter as seguintes caractersticas:
1. No estar presente na amostra original, ser estvel e no reativa.

2. Pico separado dos componentes da amostra
3. Eluir prximo dos componentes de interesse
4. Deteco semelhante dos picos de interesse
5. Concentrao que produza rea similar aos picos analisados
6. Pureza elevada ou conhecida (possveis impurezas no devem eluir com os
picos de interesse).

ANLISE QUANTITATIVA
MTODOS ABSOLUTOS - Padronizao interna
1. Determina-se a curva de calibrao de cada componente atravs da anlise de misturas

padres contendo o padro interno. Nessa curva de calibrao utiliza-se a relao entre rea
do componente i e rea do padro interno em funo das relaes de suas concentraes.
2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padro interno (preferencialmente na
mesma concentrao utilizada na calibrao) e obtem-se a concentrao do analito atravs
da curva de calibrao.
Se o volume de amostra injetado for Ai / Api

diferente do utilizado na calibrao, ou se
algum parmetro analtico for alterado
resultando em reas diferentes daquelas
esperadas nas condies de calibrao, a
relao de rea entre analito e padro
interno no ser afetada.
Ci / Cpi

UHPLC ULTRA HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPY
A tecnica utiliza particulas menores que 2m o que fornece colunas com maior
eficincia( maior nmero de pratos) e consequentemente melhor separao, desde
que os analitos tenham coeficiente de partio diferentes.
Normalmente utiliza-se colunas com 1.7m o que acarreta maior presso no
sistema, sendo necessrio utilizar equipamento configurado para isso.
O sistema necessita de baixo volume morto, bomba para trabalhar com presses
maiores que HPLC convencional, detectores de baixo volume da cela.
Em analises rpidas, o detector precisa permitir velocidade de amostragem na faixa
de 50milisegundos ou invez de 400 na HPLC convencional e constante de tempo de
0.05 seg.
SISTEMAS UHPLC E FASES ESTACIONARIAS
Waters Corporation Acquity UPLC System 6 FE BEH/slica
Thermo Scientific Accela High Speed LC 3 FE Hypersil Gold
Agilent 1200 Series 8 FE Eclipse, Extend e Stablebond
Restek(colunas) Pinnacle DB 1.9m
Grace/ Alltech - colunas

V ERIFICAO DE EQUIVALNCIA DE COLUNAS HPLC
Dois grupos projeto USP e projeto Snyder/Dolan, utilizando parmetros para caracterizar colunas
HPLC, com a finalidade de avaliar a equivalencia entre elas.
PROJETO USP Grupo de trabalho: Agilent, NIST,Phenomenex, Supelco,ThermoHypersil-
Keystone, Waters
Parmetros avaliados:
Hidrofobicidade
Quelao de metais
Atividade do grupo silanol
Seletividade
Densidade de ligaes
Projeto Snyder/Dolan Grupo de trabalho Impurezas PQRI informao obtida em Wyeth, Eli Lilly,
FDA-laboratorio de Rockville, 3M, Laboratorio de Snyder/Dolan - 8 compostos/ 2 amostras
Parmetros avaliados:
Hidrofobicidade
Seletividade
Acidez pontes de H
Basicidade pontes de H
Capacidade de troca inica
Site: www.usp.org/USPNF/columns.html
DESENVOLVIMENTO DE MTODO HPLC COM AUXILIO DE COMPUTADOR
Varios softwares foram desenvolvidos com o objetivo de auxiliar no desenvolvimento

de mtodo de anlise por HPLC.
So softwares caros, mas o investimento permite uma economia para as Empresas,
pois cada mtodo desenvolvido em pouco tempo.
Dependendo da experincia em cromatografia e da complexidade da amostra, um
mtodo desenvolvido manualmente(mtodo convencional), pode levar um ms ou
mais.
Com um desses programas eletronicos, o mtodo pode ser desenvolvido em
algumas horas ou poucos dias.
ALGUNS PROGRAMAS BEM CONHECIDOS E DOCUMENTADOS:

DRY-LAB 2000 PLUS(Rheodyne) www.molnar-institut.com/www.rheodyne.com
CHROMSWORD AUTO - (Hitachi Agilent Iris) www.chromsword-auto.com
ACD LABS METHOD DEVELOPMENT SOFTWARE www.acdlabs.com
POPLC- Phase Optimized Liquid Chromatography BISCHOFF
CHROMATOGRAPHY www.poplc.def

REFERNCIAS PARA CONSULTA
HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis George Lunn Norman Schmulf
Wiley Interscience 1997 (1632 pag.) ISBN 0471181765
HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals George Lunn Wiley

2005 (717 pag.) ISBN 9780471669418
HPLC for Pharmaceutical Scientists Yuri Kazakevich Rosario Lobrutto Wiley

Jan 2007(1104 pag.) ISBN 9780471681625
HPLC Made to Measure Stravos Kromidas Wiley 2006 ISBN 352731377X
Validation Chromatographic Methods A Practical Guide David M. Bliesner Wiley

2006 (304 pag.) ISBN 9780471741473
HPLC Practical and Industrial Applications Joel Swadesh
Modern HPLC for practicing scientists Michael W.Dong Wiley Interscience 2006
HPLC A practical users guide Marvin C. McMaster John Wiley & Sons - 2007

REFERNCIAS PARA CONSULTA
Fundamentos da Cromatografia a lquido de alto desempenho REMOLO CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1a
Ed.
Bulletin 781, How to protect your HPLC Column and prolong its life,
http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html
Bulletin 826, HPLC Troubleshouting guide,

Bulletin 788, Guidelines for formulating mobile phases for various reversed phase HPLC Columns,
Bulletin 844, Post Columns reactions enhance detections sensitivity and selectivity in HPLC analysis,
Bulletin 879, CG and HPLC Phases and packings for US Pharmacopoeia methods,
The Reporter, Optimizing HPLC Separations,

Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, nmero 3, junho 1998, Validao de mtodos cromatogrficos,
pg. 12

FONTES DE INTERNET
www.chem.agilent.com
www.alltech.web
www.dionex.com
www.esind.com
www.gls.co.jp
www.hamiltoncompany.com
www.macherey-nagel.com
www.mac-mod.com
www.merck.de
www.microlc.com
www.microsolvtech.com/
www.phenomenex.com
www.instruments.perkinelmer.com
www.polymerlabs.com
www.restekcorp.com/h
www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco
www.thermo.com
www.tosoh.com/
www.varianinc.com
www.vydac.com/
www.waters.com
www.zirchrom.com/

Agradecimentos
CEP CURSOS - Centro de Educao Profissional
O Centro de Educao Profissional (CEP) uma Empresa voltada para a Educao

Continuada e Profissionalizante atravs de: Cursos de Extenso Presenciais;
Cursos a Distncia (EAD); Cursos In-Company;Programas Especiais e Especializaes;
Assessoria e Consultoria Customizada;
Dentro das diversas reas que o CEP atua, destacam-se: Instrumentao e Desenvolvimento Analtico,
Controle de Qualidade, Garantia da Qualidade, Assuntos Regulatrios, Pesquisa e Desenvolvimento,
Microbiologia e Habilidades Gerenciais.
Informaes: www.cepcursos.com / info@cepcursos.com

Professor Ayrton: ayrtonargenton@hotmail.com
Av. Ibirapuera 2907, Ed. Comercial State, Conj. 1709, Moema - SP - SP - TEL/ FAX: 11 50539755

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CONSELHO REGIONAL DE

QUMICA - IV REGIO (SP)

So Jos do Rio Preto, 29 de maio de 2010

CONCEITOS DE CROMATOGRAFIA A LQUIDO

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Nas indstrias qumicas, farmacuticas,

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TIPO DE SEPARAO PROPRIEDADE FSICA

Destilao fracionada Diferena de ponto de ebulio

Diferena na constante de distribuio

Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 10-15g)

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VISO GERAL DE CROMATOGRAFIA

O objetivo da cromatografia separar individualmente os diversos

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Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal

High Performance Liquid Chromatography

DESCRIO GERAL DE HPLC

A amostra dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatogrfica

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High Performance Liquid Chromatography

Acares, cido ascrbico, cido benzico,

Tintas Resinas, Tensoativos, biocidas

Clnicas Metablitos, protenas, peptdeos, aminocidos

Farmacutica Princpios ativos

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Amostra ou derivado voltil

Pratos tericos por coluna At 300000 At 30000

Capacidade preparativa Pobre Boa

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O cromatgrafo a lquido constitudo dos seguintes componentes:

1. Reservatrio e sistema de bombeamento da fase mvel

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A figura abaixo ilustra o reservatrio da fase mvel e seus componentes:

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A figura abaixo ilustra um filtro para HPLC:

A escolha do filtro funo da natureza da fase mvel. Usualmente utiliza-se

As tcnicas de degaseificao so:

Refluxo com resistncia de aquecimento

Vcuo (trompa dgua)

Purga com Hlio

Uso de membrana semipermevel e vcuo online.

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Leva a fase mvel desde o reservatrio at a coluna

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A composio da fase mvel mantida constante durante toda anlise cromatogrfica.

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BOMBEAMENTO POR GRADIENTE

Alguma anlises necessitam alterao da composio da fase mvel, sem alterao da

O bombeamento por gradiente pode ocorrer baixa presso ou a alta presso.

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BOMBEAMENTO POR GRADIENTE ALTA PRESSO

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BOMBEAMENTO ISOCRTICO OU POR GRADIENTE

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Em HPLC, a injeo de amostra realizada com auxlio de vlvulas especiais que

A separao efetuada nas colunas cromatogrficas, feitas em ao e resistentes a altas