UFRGS estuda bioengenharia para alimentos

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CINCIAS E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
ITA02003
BIOENGENHARIA PARA ENGENHARIA QUMICA
- POLGRAFO -
Profa Rosane Rech
Semestre 2006/2
ITA02003 Bioengenharia para Engenharia Qumica Profa. Rosane Rech
Semestre 2006/2 2
ndice
1 Introduo Engenharia de Bioprocessos................................................................................................7

1.1 Definies.........................................................................................................................................7
1.2 Histrico do desenvolvimento dos bioprocessos..............................................................................7
1.3 Produtos provenientes de processos biotecnolgicos ......................................................................8
1.4 Processos fermentativos industriais................................................................................................10
2 Microbiologia .........................................................................................................................................12
2.1 Distribuio dos organismos vivos.................................................................................................12
2.2 Morfologia e estrutura ....................................................................................................................13
2.2.1 Bactrias (procariotos)............................................................................................................13
2.2.2 Fungos ....................................................................................................................................14
2.3 Nutrio microbiana .......................................................................................................................15
2.3.1 Consideraes gerais ..............................................................................................................15
2.3.2 Requisitos Nutricionais...........................................................................................................15
2.3.2.1 Fontes de material plstico .................................................................................................15
2.3.2.2 gua ...................................................................................................................................16
2.3.2.3 Oxignio .............................................................................................................................16
2.4 Fatores fsico-qumicos...................................................................................................................17
2.4.1 Temperatura............................................................................................................................17
2.4.2 pH ...........................................................................................................................................18
2.4.3 Presso Osmtica....................................................................................................................18
2.5 Meios de Cultura ............................................................................................................................18
2.6 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial .......................................................19
3 Biorreatores e Processos Fermentativos .................................................................................................20
3.1 Classificao dos biorreatores ........................................................................................................20
3.2 Formas de conduo de um processo fermentativo:.......................................................................21
4 Cultivo Descontnuo...............................................................................................................................22
4.1 Inculo............................................................................................................................................22
4.2 Meio de cultura...............................................................................................................................22
4.3 Cintica de um cultivo em batelada................................................................................................23
4.3.1 Cintica de crescimento celular ..............................................................................................24
4.3.2 Equao de Monod: interpretao da fase exponencial de crescimento.................................25
4.3.3 Cintica de formao de produto............................................................................................27
4.3.4 Cintica de consumo de substrato pela clula ........................................................................27
4.4 Clculo do nmero de biorreatores descontnuos...........................................................................29
5 Cultivo Contnuo ....................................................................................................................................31
5.1 Formas de operao do sistema contnuo .......................................................................................31
6 Cultivo Semi-contnuo............................................................................................................................33
6.1 Produtividade de um processo semi-contnuo ................................................................................33
7 Cultivo em Regime Batelada Alimentada ..............................................................................................34
8 Reatores com clulas imobilizadas.........................................................................................................38
8.1 Mtodos de imobilizao celular ....................................................................................................38
8.1.1 Imobilizao sobre a superfcie de um suporte slido............................................................38
8.1.2 Envolvimento em uma matriz porosa: ....................................................................................39
8.1.3 Floculao celular (agregao) ...............................................................................................40
8.1.4 Conteno mecnica atrs de uma barreira.............................................................................40
8.2 Caractersticas e vantagens da imobilizao celular.......................................................................40
8.3 Exemplos de usos de clulas imobilizadas .....................................................................................41
9 Biorreatores com membranas .................................................................................................................44
10 Cultivo Semi-Slido ...........................................................................................................................47
10.1 Microrganismos normalmente utilizados: ......................................................................................47
Semestre 2006/2 3
10.2 Substratos: caractersticas e composio: .......................................................................................47

10.3 Biorreatores para CSS ....................................................................................................................48
10.4 Controle de processo em CSS ........................................................................................................49
10.4.1 Teor de umidade .....................................................................................................................49
10.4.2 Atividade de gua: ..................................................................................................................49
10.4.3 Temperatura............................................................................................................................49
10.4.4 pH ...........................................................................................................................................50
10.4.5 Aerao:..................................................................................................................................50
10.4.6 Agitao..................................................................................................................................51
10.4.7 Estimativa de crescimento ......................................................................................................51
10.4.8 Extrao dos produtos ............................................................................................................51
11 Agitao e aerao em biorreatores....................................................................................................52
11.1 Transferncia de oxignio da bolha de gs para a clula................................................................52
11.2 Mtodo dinmico para o clculo do kLa ........................................................................................53
11.3 Respirao microbiana ...................................................................................................................54
11.4 Anlise conjunta da transferncia e do consumo do oxignio........................................................55
11.5 Sistemas para a transferncia de oxignio ......................................................................................56
11.6 Transferncia de oxignio em meios agitados e aerados................................................................57
11.6.1 Agitao de lquidos newtonianos..........................................................................................57
11.6.2 Agitao de lquidos newtonianos submetidos aerao.......................................................59
11.6.3 Transferncia de oxignio ......................................................................................................60
12 Escalonamento de biorreatores...........................................................................................................62
12.1 Critrios para ampliao de escala .................................................................................................63
12.2 Comparaes entre os critrios de ampliao de escala .................................................................63
13 Esterilizao .......................................................................................................................................64
13.1 Modos de atuao dos agentes esterilizantes..................................................................................64
13.2 Esterilizao de equipamentos e meios de cultivo por calor mido ...............................................66
13.2.1 Cintica de morte celular ........................................................................................................66
13.2.2 Esterilizao em batelada de meios de cultivo .......................................................................66
13.2.3 Esterilizao contnua de meios de cultivo.............................................................................68
14 Bibliografia.........................................................................................................................................70
14.1 Livros..............................................................................................................................................70
14.2 Artigos Cientficos..........................................................................................................................70
Semestre 2006/2 4
Lista de Figuras
Figura 1.1: Passos no desenvolvimento de um processo biotecnolgico (Doran, 1997). .............................10

Figura 1.2: Fluxograma de um processo fermentativo (Fonte: Schmidell et al., 2001)................................11
Figura 2.1: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de R. H. Wittaker em 1969 (Fonte:
Borzani et al., 2001). ..............................................................................................................................12
Figura 2.2: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de C. Woese em 1979 (Fonte: Borzani et
al., 2001).................................................................................................................................................12
Figura 2.3: Representao esquemtica de uma bactria (Fonte: Lehninger, 1997)....................................13
Figura 2.4: Diferentes tipos de bactrias.......................................................................................................14
Figura 2.5: Esquema de clulas eucariticas (a) animal e (b) vegetal (Fonte: Borzani et al., 2001). ...........14
Figura 2.6: Classificao dos microrganismos quanto sua temperatura tima de crescimento..................17
Figura 2.7: Efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula. .......................................17
Figura 3.1: Configuraes de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) air-lift; (d) plug-flow; (e) com
clulas imobilizadas (leito fixo); (f) com clulas imobilizadas (leito fluidizado); (g) reator com
membranas planas; (h) hollow-fiber (Fonte: Schmidell et al., 2001). ....................................................21
Figura 4.1: Representao esquemtica do preparo do inculo (Fonte: Schmidell et al., 2001) ..................23
Figura 4.2: Curvas de ajuste dos resultados de uma determinada fermentao. ...........................................24
Figura 4.3: Curva de crescimento em reator batelada (Fonte: Doran, 1995). ...............................................24
Figura 4.4: Curvas da equao de Monod para valores hipotticos de mx = 0,14h-1 e KS = 0,60mg.L-1
(Curva A) e KS = 0,030mg.L-1 (Curva B). ..............................................................................................25
Figura 4.5: Cintica de inibio pelo substrato (Curva A) e sem inibio (Curva B), conforme a equao de
Monod para mx = 0,14 h-1.....................................................................................................................27
Figura 4.6: Representao esquemtica da formao de produtos: a) formao de produto associada ao
crescimento celular; b) formao de produto resultante de metabolismo secundrio; c) produto formado
na fase estacionria de crescimento........................................................................................................28
Figura 4.7: Resumo das principais rotas metablicas. ..................................................................................29
Figura 4.8: Cronograma de funcionamento de biorreatores em um processo descontnuo. (1) incio do
preparo do biorreator; (2) fim da carga; (3) fim do cultivo; (4) fim da descarga (Fonte: Schmidell et al.,
2001).......................................................................................................................................................30
Figura 4.9: Cronograma de funcionamento dos biorreatores nmero 1 e nmero D em um processo
descontnuo. (1) incio do preparo do biorreator; (2) fim da carga; (3) fim do cultivo; (4) fim da
descarga (Fonte: Schmidell et al., 2001). ...............................................................................................30
Figura 5.1: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e
da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 =
40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L. ...............................................................................................................31
da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 =
40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L em um sistema com reciclo interno onde a frao de meio que sai
diretamente do biorreator 0,2 e o fator de diluio do meio filtrado 0,1. .........................................32
Figura 6.1: influncia de sobre a produtividade de um processo semi-contnuo (Fonte: Schmidell et al.,
2001).......................................................................................................................................................33
Figura 7.1: Grficos da variao da vazo de alimentao, F, do volume, V, da taxa de diluio, D, da
velocidade especfica de crescimento e da concentrao da biomassa, X em cultivos em regime batelada-
alimentada com vazo de alimentao constante, linear crescente e exponencial..................................35
Figura 7.2: Biomassa e produo de ergosterol para diferentes mtodos de controle de alimentao em
cultivos batelada alimentada (Fonte: Gao & Tan, 2003)........................................................................36
Figura 8.1: Desenho esquemtico dos mtodos bsicos de imobilizao celular (Fonte: Kourkoutas et al.,
2004).......................................................................................................................................................39
Figura 8.2: Imobilizao de clulas por envolvimento em gel hidroflico induzida por Ca++ e K+. .............40
Figura 8.3: Produo de lipase com clulas imobilizadas e clulas livres (Fonte: Ellaiah et al., 2004). ......41
Figura 8.4: Cintica de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-imobilizadas em
alginato de sdio (Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001). ....................................................................41
Semestre 2006/2 5
Figura 8.5: Produtividade de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-

imobilizadas em alginato de sdio (b) Produtividade de um cultivo contnuo de clulas de Z. mobilis e S.
diastaticus co-imobilizadas em alginato de sdio em biorreator PBR com 60mL de volume de trabalho
(Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001). ................................................................................................42
Figura 8.6: Biomassa e atividade de bacteriocina em um biorreator contnuo com clulas livres (Fonte:
Bhugaloo-Vial et al., 1997). ...................................................................................................................42
Figura 8.7: Produtividade de bacteriocina com a taxa de diluio (a) em um biorreator contnuo com clulas
livres e (b) em biorreator contnuo PBR com clulas imobilizadas em alginato de sdio (Fonte:
Bhugaloo-Vial et al., 1997). ...................................................................................................................42
Figura 8.8: Produo de etanol, evoluo de CO2 e consumo de glicose por clulas de S. cerevisiae
imobilizadas (smbolo cheio) e livres (smbolo aberto) (Fonte: Wendhausen et al., 2001). ..................43
Figura 8.9: Produtividade (smbolo cheio) e concentrao de etanol (smbolo aberto) em clulas de S.
cerevisiae imobilizadas em funo da taxa de diluio e em funo do tempo em um bioreator de leito
empacotado alimentado com 33% de caldo de cana (180 g/L de sacarose) a 30oC (Fonte: Wendhausen et
al., 2001).................................................................................................................................................43
Figura 9.1: Configuraes de MBRs: (a) membrana submersa, (b) circulao externa (Fonte: Melin et al.,
2006).......................................................................................................................................................44
Figura 10.1: Influncia do tamanho das partculas na velocidade de fermentao de acar de beterraba por
Zymomonas mobilis para produo de etanol. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ......................................48
Figura 10.2: Reatores para cultivo semi-slido industrial (a) tanques circulares; (b) esteira rolante; (c) reator
tubular com agitao interna. (Fonte: Schmidell et al., 2001)................................................................48
Figura 10.3: Influncia do teor de umidade sobre o crescimento de Aspergillus niger. ( Schmidell et al.,
2001).......................................................................................................................................................49
Figura 10.4: Relao entre a atividade de gua e as reaes de deteriorao dos alimentos. .......................50
Figura 10.5: Influncia da temperatura sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al., 2001)..50
Figura 11.1: Variao da concentrao de oxignio dissolvido em gua com a temperatura. ......................52
Figura 11.2: Etapas da transferncia de oxignio da bolha de ar para a clula (Doran, 1995. p. 200). ........53
Figura 11.3: Representao esquemtica da variao de QO2 com a concentrao de O2 dissolvido...........54
Figura 11.4: Curva de variao de concentrao de oxignio dissolvido para clculo de kLa e q O2 conforme o
mtodo dinmico. Fonte: Ayub, 1991, p. 60. .........................................................................................56
Figura 11.5: Sistemas diversos de transferncia de oxignio em biorreatores..............................................57
Figura 11.6: esquema de um biorreator agitado com turbinas de ps planas. ...............................................58
P NDi2
Figura 11.7: nmero de potncia N P = 3 5 em funo do nmero de Reynolds N Re = para
N Di
impelidor tipo hlice e Rushton. .............................................................................................................59
Q
Figura 11.8: Pg/P em funo do nmero de aerao N A = para um sistema de agitao com duas
NDi3
turbinas Rushton. ....................................................................................................................................60
Figura 12.1: Etapas do desenvolvimento de um processo produtivo, com as fases de obteno de dados e
instantes principais de tomadas de deciso.............................................................................................62
Figura 13.1:Perfil tpico de temperatura do meio de cultivo e evoluo da morte celular em uma
esterilizao em batelada (Fonte: Doran, 1997). ....................................................................................67
Figura 13.2: Curvas de aquecimento e resfriamento em uma esterilizao em batelada. .............................68
Figura 13.3: Equipamentos para esterilizao contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash;
(b) transferncia de calor utilizando trocadores de calor........................................................................68
Figura 13.4: Curvas de aquecimento, manuteno da temperatura e resfriamento durante uma esterilizao
contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferncia de calor utilizando
trocadores de calor..................................................................................................................................69
Figura 13.5: Trocador de calor de placas (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995). ...............................69
Figura 13.6: Trocador de calor tubular (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995)....................................69
Lista de Tabelas
Semestre 2006/2 6
Tabela 1.1: Estgios do desenvolvimento cronolgico dos processos biotecnolgicos..................................7

Tabela 1.2: Principais produtos provenientes de processos biotecnolgicos ..................................................8
Tabela 3.1: Classificao geral dos biorreatores. ..........................................................................................20
Tabela 4.1: valores de KS para diferentes microrganismos............................................................................26
Tabela 4.2: Exemplos de produtos conforme sua associao com o metabolismo energtico......................28
Tabela 4.3: Coeficiente de manuteno de diversos microrganismos em glicose como fonte de carbono. ..28
Tabela 9.1: Comparao das caractersticas dos diferentes mdulos de membranas utilizados em MBRs. ...45
Tabela 11.1: Valores de concentrao crtica de oxignio para alguns microrganismos ..............................55
Tabela 11.2: Coeficientes e da equao 11.22 conforme a escala de trabalho. ......................................61
Tabela 12.1: Variao da freqncia de rotao (N) numa ampliao de escala...........................................63
Tabela 12.2: Relao entre variveis em uma ampliao de escala (V1 = 60L; V2 = 7,5m3) .........................63
Semestre 2006/2 7
1 Introduo Engenharia de Bioprocessos
1.1 Definies
Biochemical engineering is concerned with conducting biological processes on an industrial scale,
provinding the links between biology and chemical engineering. (...) The heart of biochemical engineering
lies on the scale up and management of cellular processes. Aiba, Humphrey, Millis Biochemical
Engineering (1973).
Processing of biological materials and processing using biological agents such cells, enzymes or
antibodies are the central domain of biological engineering. Sucess in biochemical engineering requires
integrated knowledge of governig biological properties and principles and of chemical engineering
methodology and strategy. (...) Reaching this objective clearly requires years of careful study and practice.
Bailey, Ollis Biochemical Engineering Fundamentals (1986).
1.2 Histrico do desenvolvimento dos bioprocessos

interessante notar como se deu o desenvolvimento da biotecnologia ao longo dos anos.
Cronologicamente ele pode ser dividido em 5 fases. Na Tabela 1.1 mostram-se algumas caractersticas dos
processos fermentativos em cada uma destas fases.
Tabela 1.1: Estgios do desenvolvimento cronolgico dos processos biotecnolgicos

ESTGIO PRODUTOS EQUIPAMENTO CONTROLE DE MTODO DE CULTURA CONTROLE DE PLANTA SELEO DE CEPA
PROCESSO QUALIDADE PILOTO
1 lcool vaso de madeira termmetros batelada nenhum no cultura de fermento
at 1900 vinagre vaso de cobre hidrmetros puro
barris trocador de calor inoculao com bons
filtros gotejantes vinagres
2 fermento de vaso de ao sensor de pH batelada nenhum no cultura pura
1900-1940 Baker agitador mecnico controle de temperatura batelada alimentada
glicerol aerador
cido ctrico
cido ltico
acetona
butanol
3 penicilina vasos aerados eletrodos esterilizados batelada muito importante sim mutao
1940-hoje estreptomicina operao assptica de pH e oxignio batelada alimentada programa de seleo
aminocidos contnuo
enzimas
4 protenas (SCP) vasos com jatos de uso de computador cultura contnua com muito importante muito produo de cepas
1960-hoje presso e ciclos de reciclo importante atravs da
presso Engenharia gentica
5 insulina batelada muito importante muito tecnologia do DNA-
1970-hoje interferon batelada alimentada importante recombinante
contnuo
6 kits de diagnose reatores especias batelada muito importante
1980-hoje para cultura de contnuo
clulas de
mamferos
A primeira fase durou at 1900. Nessa poca apenas dois produtos eram fabricados em grande
escala: o vinagre e o lcool (incluindo as bebidas alcolicas). A operao se dava em reator batelada
utilizando-se cepas de culturas puras.
A segunda fase abrange o perodo de 1900 a 1940. Fabricava-se um nmero maior de produtos. Os
fermentadores eram equipados com agitadores mecnicos e passou a ser feita a aerao do meio. O controle
do processo era feito atravs da monitorao fora de linha do pH e da temperatura. O biorreator batelada
alimentada passou a ser utilizado.
A terceira fase comeou em 1940 e vai at os dias de hoje. Aos produtos que j eram fabricados
acrescentou-se os antibiticos, os aminocidos, as enzimas, etc. A assepsia dos equipamentos e do meio de
cultura, o controle de pH, de O2 dissolvido e de temperatura tornaram-se prtica comum. Com o avano das
tcnicas de medio em linha, a tendncia atual a monitorao e o controle do processo utilizando-se o
computador. Alguns processos passaram a ser realizados em operao contnua. O controle de qualidade
Semestre 2006/2 8
passou a ser importante e comeou-se a empregar plantas piloto. Tcnicas de mutao e programas de
seleo passaram a ser essenciais no desenvolvimento de novos processos.
A quarta fase comeou em 1960 com a aplicao de tcnicas de engenharia gentica para produzir
cepas mais eficientes. A produo de SCP (single cell protein) a partir de hidrocarbonetos constitui-se na
principal aplicao desta fase. Devido aos problemas de transferncia de calor e massa apresentados por este
processo, tem-se utilizado fermentadores tipo air lift no processamento.
A quinta fase comeou em 1970 com a aplicao da tecnologia do DNA-recombinante. Esta tcnica
de engenharia gentica tem propiciado a alterao de microrganismos de modo que estes produzam
substncias que no so produzidos naturalmente por eles. A aplicao desta tcnica j obteve como
resultado prtico a produo em escala comercial de insulina e interferon por microrganismos.
A sexta fase data do incio dos anos 80. Ela baseia-se principalmente em aplicaes mdicas,
notadamente em diagnstico de doenas de origem virtica tais como AIDS, rubola, hepatite, etc. e
monitorao de nveis de compostos importantes tais como colesterol, glicose, uria, etc.. A principal linha
de aplicao a tcnica de hibridoma na produo de anticorpos monoclonais (monoclonal antibodies).
1.3 Produtos provenientes de processos biotecnolgicos
Tabela 1.2: Principais produtos provenientes de processos biotecnolgicos

Produtos de fermentao Organismo tpico utilizado Mercado
mundial
(kg/ano)
Solventes orgnicos
Etanol Saccharomyces cerevisiae 2 1010
Acetona/butanol Clostridium acetobutylicum 2 106 (butanol)
Biomassa
Culturas starter Bactrias lticas e leveduras 5 108
Single-cell protein Pseudomonas methylotrophus ou Candida utilis 0,5-1 108
cidos orgnicos
cido ctrico Aspergillus niger 2-3 108
cido glucnico Aspergillus niger 5 107
cido ltico Lactobacillus delbrueckii 2 107
cido itacnico Aspergillues itaconicus
Amino-cidos
cido L-glutmico Corynebacterium glutamicum 3 108
L-lisina Brevibacterium flavum 3 107
L-fenilalanina Corynebacterium glutamicum 2 106
L-arginina Brevibacterium flavum 2 106
outros Corynebacterium spp. 1 106
Trasnformaes microbianas
Esterides Rhizopus arrhizus
D-sorbitol para L-sorbose (na produo de vitamina C) Acetobacter suboxydans 4 107
Antibiticos
Penicilinas Penicillium chrysogenum 3-4 107
Cefalosporina Cephalosporium acremonium 1 107
Tetraciclina Streptomyces aureofaciens 1 107
Antibiticos (ex: eritromicina) Streptomyces erythreus 2 106
Antibiticos polipeptdicos (ex: gramicidina) Bacillus brevis 1 106
Antibiticos aminoglicosidados (ex: estreptomicina) Streptomyces griseus
Antibiticos aromticos (ex: griseofulvina) Penicillium griseofulvum
Polissacardeos extracelulares
Goma xantana Xanthomonas campestris 5 106
Dextrana Leuconostoc mesenteroides Pequeno
Nucleotdeos
5-guanosina monophosphate Brevibacterium ammoniagenes 1 105
Enzimas
Proteases Bacillus spp. 6 105
-amilase Bacillus amyloliquefaciens 4 105
Glucoamilase Aspergillus niger 4 105
Glicose isomerase Bacillus coagulans 4 105
Pectinase Aspergillus niger 1 104
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Renina Mucor miehei ou leveduras recombinantes 1 104

Outras 5 104
Vitaminas
B12 Propionibacterium shermanii ou Pseudomonas denitrificans 1 104
Riboflavina Ieremothecium ashbyii
Pigmentos
-caroteno Blakeslea trispora
Vacinas < 50
Difteria Corynebacterium diphtheriae
Ttano Clostridium tetani
Coqueluche Bordetella pertussis
Poliomielite Vrus atenuados em clulas renais diplides humanas ou de macacos
Rubola Vrus atenuados em clulas renais de hamsters recm-nascidos
Hepatite B Anticorpo de superfcie expressado em leveduras recombinantes
Protenas teraputicas < 20
Insulina Escherichia coli recombinante
Hormnio de crescimento Escherichia
coli recombinante ou clulas recombinantes de mamferos
Eritropoitina clulas recombinantes de mamferos
Fator VIII-C clulas recombinantes de mamferos
Interferon-2 Escherichia coli recombinante
Anticorpos monoclonais Clulas de hibridinoma < 20
Inseticidas
Esporos de bactrias Bacillus thuringiensis
Esporos de fungos Hirsutella thompsonii
Fonte: Doran, 1997.
Produtos a serem desenvolvidos em processos biotecnolgicos:

- drogas medicinais mais sofisticadas;
- culturas de tecidos e rgos humanos;
- biochips para computadores;
- pesticidas compatveis com o meio-ambiente;
- microrganismos degradadores de efluentes.
Papel do engenheiro qumico na engenharia de bioprocessos:

- desenho e operao de biorreatores, esterilizadores e equipamentos para recuperao de produtos;
- desenvolvimento de sistemas para automao e controle de processos;
- projetos de indstrias de fermentao seguras e eficientes.
Semestre 2006/2 10
Figura 1.1: Passos no desenvolvimento de um processo biotecnolgico (Doran, 1997).
1.4 Processos fermentativos industriais

O objetivo primordial da biotecnologia a obteno de produtos metablicos teis atravs do
processamento biolgico. Entende-se por processo biolgico, todo sistema reacional envolvendo seres vivos.
Dentre estes seres, destacam-se microrganismos tais como fungos, bactrias, algas, etc. Denominam-se
processos fermentativos os processos biolgicos que tm aplicao industrial.
Em geral, um processo fermentativo compreende seis etapas, conforme ilustra a Figura 1.2. Estas
etapas so:
Formulao do meio de cultura: define-se a composio qualitativa e quantitativa do meio de
cultura, o pH e a temperatura ideal de cultivo;
Esterilizao do meio de cultura e dos equipamentos - promove-se a assepsia de todo material que
entrar em contato direto com os microrganismos.
Desenvolvimento do inculo. Produo de cultura pura em quantidade suficiente para inocular o
biorreator - para operacionalizar o cultivo de microrganismos em escala industrial necessrio promover o
cultivo destes microrganismos em uma srie de vasos ou reatores em escala reduzida (pr-reatores), de modo
a garantir o crescimento acelerado e a eliminao da fase de adaptao (lag). Alm disto, necessrio
garantir a qualidade do inculo em todas as etapas de forma a garantir resultados consistentes.
Promoo do crescimento da populao de clulas no biorreator sob condies propcias para a
formao do produto - nesta etapa aplicam-se todos os conhecimentos adquiridos no estudo da fisiologia do
microrganismo de maneira a propiciar as condies mais favorveis para o crescimento celular e a produo
do metablito desejado.
Semestre 2006/2 11
Extrao e purificao do(s) produto(s) - Aps a converso biolgica, o produto ou produtos

precisam ser separados do meio de cultura e purificados em seguida. Muitos dos produtos do processamento
biolgico so quimicamente frgeis, devendo-se controlar cuidadosamente a temperatura e o pH da mistura e
aplicar tcnicas de separao que preservem a atividade biolgica dos produtos.
Tratamento dos efluentes - recomendvel o tratamento dos efluentes do processo biolgico antes
deles serem descartados. Muitas vezes, os efluentes constituem-se em produtos teis, podendo-se aumentar a
margem de lucro do processo atravs da utilizao eficiente desses efluentes.
Figura 1.2: Fluxograma de um processo fermentativo (Fonte: Schmidell et al., 2001)
Em muitos processos uma ou mais destas etapas so desnecessrias ou diferentes. Por exemplo, a
produo de etanol por Saccharomyces cerevisae no Brasil feita sem a esterilizao do meio e dos
equipamentos. J a produo de SCP (single cell protein) d-se pela ao de uma mistura de microrganismos,
sendo o preparo do inculo diferente do mencionado acima e as prprias clulas so produto desejado.
A eficincia do processo fermentativo pode ser aumentada atravs de programas de pesquisa e
desenvolvimento atuando principalmente em trs das etapas citadas acima: modificando o microrganismo
atravs de tcnicas de mutao e de engenharia gentica, e selecionando variaes de clulas mais
produtivas, otimizando as condies do meio durante a reao e desenvolvendo estratgias de separao e
purificao do produto.
Semestre 2006/2 12
2 Microbiologia
2.1 Distribuio dos organismos vivos
Figura 2.1: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de

R. H. Wittaker em 1969 (Fonte: Borzani et al., 2001).
Figura 2.2: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de

C. Woese em 1979 (Fonte: Borzani et al., 2001).
Semestre 2006/2 13
A nomenclatura dos organismos vivos binomial, sendo que o nome cientfico dado por uma
combinao do nome genrico (gnero) seguido da espcie. O nome do gnero iniciado com letra
maiscula mas o da espcie no. Ambos devem ser escritos em itlico ou grifado. Exemplo:
Saccharomyces cerevisiae
gnero espcie
2.2 Morfologia e estrutura
2.2.1 Bactrias (procariotos)

As clulas bacterianas podem ter forma esfrica (cocos), cilndrica (bacilos) ou espiralada. Os
cocos podem estar isolados (micrococos), em duplas (diplococos), formar correntes (estreptococos) ou
formaes aleatrias tipo cachos (estafilococos). Os bacilos podem apresenta-se isolados ou formar correntes
(estreptobacilos). As bactrias espiraladas podem ter a forma de espiral (espirilos) ou de uma vrgula
(vibries). Seu tamanho varia entre 0,5 e 4,0m para os cocos e em torno de 19,0m para os bacilos.
As principais estruturas bacterianas, mostradas na Figura 2.3, so:
Membrana citoplasmtica: de composio lipoprotica, regula as trocas com o meio externo e
executa processos respiratrios, fotossntese, sustentao de ribossomos, orientao da diviso celular e
biossntese de estruturas de superfcie.
Parede celular: garante a forma celular e protege contra a diferena de presso osmtica entre o
interior da clula e o ambiente externo.
Figura 2.3: Representao esquemtica de uma bactria (Fonte: Lehninger, 1997).
Citoplasma: solubiliza sais minerais, aminocidos, pequenas molculas, protenas e acares, e

possui partculas em suspenso: ribossomos e grnulos de material de reserva (amido, glicognio, lipdeos,
fosfatos).
Nucleide: filamento duplo de DNA (cromossomo) no associado a protenas e preso a uma
invaginao da membrana plasmtica (mesossomo).
Flagelos: mobilidade celular.
Fmbrias ou pili: fixao celular (formao de biofilmes).
Algumas bactrias possuem a capacidade de formar esporos. Os esporos se constituem em uma
clula em tamanho menor, com material nuclear e citoplasma condensado, baixo teor de gua, maior
quantidade de clcio e presena do cido dipicolnico. Alm da membrana citoplasmtica, o esporo possui
Semestre 2006/2 14
vrias camadas de invlucro, possuindo um revestimento bastante espesso e com considervel resistncia
agentes externos, sobretudo temperatura.
A reproduo das bactrias se d por diviso binria simples, gerando duas clulas filhas iguais.
Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Lactobacillus acidophilus Propionibacterium acne
Figura 2.4: Diferentes tipos de bactrias.
2.2.2 Fungos
So organismos eucariticos, heterotrficos. Podem ser divididos em leveduras (unicelulares) e
bolores ou mofos.
As leveduras possuem forma esfrica, elptica ou filamentosa, com 1 a 5m de dimetro a 5-30m
de comprimento. Bolores so constitudos por clulas multinucleadas que formas tubos denominados hifas.
Um conjunto de hifas denominado de miclio.
A clula fngica possui parede celular, membrana citoplasmtica, e membrana nuclear, dentro da
qual existem diversos cromossomos, nuclolo e histonas. O citoplasma possui vacolos, mitocndrias,
retculo endoplasmtico, ribossomos e material de reserva.
A reproduo das leveduras pode ser assexuada, por brotamento ou diviso celular, ou sexuada, via
formao de esporos.
Figura 2.5: Esquema de clulas eucariticas (a) animal e (b) vegetal (Fonte: Borzani et al., 2001).
Semestre 2006/2 15
2.3 Nutrio microbiana
2.3.1 Consideraes gerais

Plantas:
Fotossintticas: obtm energia da luz solar
Auxotrficas: nutrem-se basicamente de substncias inorgnicas
Animais, fungos:
Quimiotrficos: obtm energia atravs de reaes qumicas.
Heterotrficos: exigem fontes orgnicas de carbono.
2.3.2 Requisitos Nutricionais

Os microrganismos retiram do meio ambiente todas as substncias necessrias para a sntese de
material celular e de obteno de energia. As necessidades nutricionais dos microrganismos variam muito.
Organismos autotrficos podem sintetizar todos os metablitos necessrios pela clula a partir de compostos
inorgnicos; os heterotrficos requerem um ou mais nutrientes orgnicos. Essas diferenas nutricionais
refletem diferenas na habilidade de sntese dos microrganismos. A habilidade em usar diferentes compostos
como fonte de energia e de sintetizar protenas e compostos do citoplasma a partir de compostos inorgnicos
depende da presena de uma srie de enzimas, sem as quais as clulas tornam-se mais exigentes
nutricionalmente. A formao dessas enzimas diretamente controlada pela gentica da clula. A falta ou a
represso de um ou mais genes que codificam a formao de uma destas enzimas reflete-se diretamente nas
necessidades nutricionais da clula.
Geralmente o cultivo de microrganismos para aplicao em biotecnologia feito em ambiente
controlado. A formulao do meio de cultura essencial para a produo do metablito desejado. O meio de
cultura deve conter todas as substncias que constituem o material celular. As principais substncias so
descritas seguir.
2.3.2.1 Fontes de material plstico

O Carbono representa de 45 a 50% do peso seco celular. o componente bsico para a
biossntese, fazendo parte de todos os compostos sintetizados pela clula. Geralmente a mesma fonte de
carbono serve como fonte de energia. As fontes de carbono mais comuns so os aucares e os glicdios
(pentoses, hexoses, polissacardeos). Outras fontes de carbono menos comuns abrangem uma ampla faixa de
compostos, indo desde os mais simples como metano e metanol s mais complexas como celulose e
hemicelulose. No entanto, a eficincia de assimilao destes compostos, do ponto de vista biotecnolgico,
muito menor do que as fontes tradicionais e poucos microrganismos selvagens so capazes de assimilar tais
compostos.
O Nitrognio consiste de 10 a 15% do peso seco das clulas. o componente bsico na formao
de aminocidos. assimilado sob forma amoniacal. Fontes de nitrognio em outras forma que no a
amoniacal so primeiro transformadas em ons amnio sendo ento utilizadas normalmente no metabolismo
celular. Muitas substncias servem como fonte de nitrognio:
i) Fontes inorgnicas de nitrognio: NH4Cl, (NH4)2SO4 , NH4NO3, N2, etc.
ii) Fontes orgnicas de nitrognio: aminocidos e hidrolisados de protenas naturais, peptdeos, uria, purinas
e pirimidinas.
Os ons inorgnicos dividem-se em macronutrientes e micronutrientes. Entre os primeiros esto o
fsforo e o enxofre. O fsforo assimilado somente na forma de di-hidrognio fosfato (ortofosfato) H2PO4-.
importante na regulao do metabolismo celular e no fornecimento de fosfatos para a gerao de energia.
A concentrao intracelular de PO43- regula a sntese de lipdeos e carboidratos. O enxofre representa 1 a 2%
do peso seco celular e entra na constituio dos aminocidos sulfurados metionina e cistena. As fontes
inorgnicas de enxofre so tipicamente K2SO4 ou mais comumente (NH4)2SO4. A formao de pontes de
dissulfeto e importante para a atividade de protenas. O enxofre encontrado em certas vitaminas tais como
biotina e tiamina.
Semestre 2006/2 16
Os micronutrientes so necessrios em concentraes da ordem de miligramas por litro de cultura.

Esses compostos, s vezes, esto presentes como impurezas de outros ingredientes do meio de cultura. O
Potssio regulador da presso osmtica (para cada on metlico divalente absorvido, o dobro da quantidade
de K+ excretada), estimula fermentao e respirao em pH reduzido. e co-fator de vrias enzimas. O
Magnsio co-fator de vrias enzimas. Participa na ativao das enzimas glicolticas, estimula a sntese de
cidos graxos essenciais, regula os nveis inicos celulares, a ativao de ATPase na membrana e a absoro
de fosfato juntamente com K+. A concentrao de Mg++ afeta a associao de ribossomos. O Clcio estimula
a crescimento celular pela incorporao na parede celular e membrana plasmtica. O Ferro necessrio para
a sntese dos citocromos e de certos pigmentos. Outros ons como Cl-, Na+, Ba2+, Zn2+, Mn2+, Co+2 so
encontrados na composio elementar de muitos microrganismos e esto envolvidos em importantes etapas
do metabolismo.
O Fator de Crescimento um metablito essencial que o microrganismo incapaz de sintetizar,
devendo encontrar pr-formado no meio. A bactria Zymomonas mobilis, por exemplo auxotrfica em
relao a pantotenato, um precursor da coenzima A. Em geral, os fatores de crescimento podem ser:
i) aminocidos - indispensveis para a sntese de protenas;
ii) bases pricas e pirimdicas - necessrias para a sntese dos cidos nuclicos;
iii) vitaminas - so co-enzimas ou precursores de co-enzimas.
2.3.2.2 gua
Representa 75% de peso celular. essencial para a absoro dos nutrientes e a remoo de
produtos indesejveis.
2.3.2.3 Oxignio
O oxignio o receptor final de eltrons na respirao celular. Tambm altera o potencial de
oxidao-reduo das clulas. Muitos sistemas enzimticos de clulas requerem condies extremamente
reduzidas, isto , um baixo potencial de oxidao-reduo, para funcionar. Outros requerem condies
oxidadas, um potencial de oxidao-reduo elevado.
Os microrganismos podem ser classificados quanto ao requerimento de oxignio em (Figura 2.6):
i) aerbios - necessitam do oxignio para a sua sobrevivncia. O oxignio participa do metabolismo
desses microrganismos como receptor final de eltrons. Bacillus, Pseudomonas e Streptomyces pertencem a
esta classe.
ii) anaerbios - no sobrevivem na presena de oxignio, que txico para esta classe de
microrganismos. As espcie do gnero Clostridium incluem-se nesta classe.
iii) anaerbios facultativos - sobrevivem na ausncia ou na presena de oxignio. Tais organismos
podem ser subdivididos em dois grupos, dependendo se o oxignio ativamente metabolizado ou
meramente tolerado. As bactrias acticas (Streptococcus, Leuconostoc e Lactobacillus) pertencem ao grupo
que obtm energia exclusivamente de fermentao, embora no sejam prejudicadas pelo oxignio. Por outro
lado, bactrias coliformes, tal como Escherichia coli, podem obter energia de fermentao ou respirao. O
desenvolvimento timo destes microrganismos geralmente acontece em uma das duas condies.
Zymomonas mobilis por exemplo, se desenvolve na presena de oxignio, porm no o utiliza no seu
metabolismo e a taxa de crescimento inferior que na sua ausncia.
iv) microaerfilos - precisam de oxignio para sobreviver, mas a concentraes muito baixas.
v) aerotolerantes - so bactrias anaerbias que crescem em presses de oxignio inferiores a da
atmosfera terrestre.
Semestre 2006/2 17
2.4 Fatores fsico-qumicos
2.4.1 Temperatura
A temperatura ideal para o crescimento do organismo varia de espcie para espcie. Os
microrganismos podem ser classificados de acordo com a temperatura em que o seu crescimento pleno em
(Figura 2.6):
i) mesfilos - se desenvolvem em temperaturas mdias entre 20C e 40C
ii) termfilos - se desenvolvem em temperaturas entre 45C e 100C. A principal vantagem destes
microrganismos sobre os outros que crescem em temperaturas inferiores o metabolismo mais rpido.
iii) psicrfilos- se desenvolvem em temperaturas baixas entre -4C e 15C. Estes microrganismos,
por sua vez, apresentam taxas metablicas bastante reduzidas.
Figura 2.6: Classificao dos microrganismos quanto sua temperatura tima de crescimento.
Figura 2.7: Efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula.
A influncia da temperatura no crescimento , em ltima anlise, o reflexo do efeito da temperatura

nas reaes enzimticas conduzidas na clula. Na Figura 2.7 mostra-se que com a reduo da temperatura, a
atividade enzimtica, e portanto a taxa de crescimento celular, diminui. No ponto de congelamento a
atividade metablica pra, no somente devido diminuio da atividade enzimtica como tambm porque a
clula desprovida de gua. Um aumento da temperatura acima da temperatura tima de crescimento,
aumenta a atividade metablica, porm ao mesmo tempo a taxa de degradao das enzimas e das protenas
tambm aumenta, resultando eventualmente em dano aos componentes celulares e conseqentemente na
morte da clula.
Semestre 2006/2 18
Note-se, que a faixa de temperatura em que um microrganismo se desenvolve otimamente muito

mais estreita que a representada pela classificao acima. A temperatura tima para o crescimento de uma
espcie de microrganismo est diretamente relacionada com a temperatura do seu habitat natural.
2.4.2 pH
Existe uma faixa tima de concentrao de ons hidrognio para o desenvolvimento de
microrganismos, embora a faixa de pH em que eles se desenvolvam seja relativamente ampla. As bactrias
preferem os meios neutros (pH 7-7,5), sendo a maioria tolerantes a pH entre 6 e 9. As leveduras e os mofos
preferem meios relativamente cidos de pH 3 a 6.
Os microrganismos geralmente crescem melhor no pH do seu habitat natural. Em muitos casos, o
prprio microrganismo, como resultado do seu metabolismo, exerce papel preponderante na definio do pH
ideal para o seu crescimento. Bactrias produtoras de cido, mofos e leveduras aumentam a concentrao de
ons hidrognio no ambiente e tendem a crescer melhor em valores de pH moderadamente baixos. Outras
bactrias, especialmente as putrefativas que decompem protenas em aminocidos e amnia, aumentam o
pH do ambiente e vivem bem em condies alcalinas.
2.4.3 Presso Osmtica

A presso osmtica de microrganismos independente da presso osmtica do meio de cultura em
que eles esto suspensos. Quando uma clula colocada em um meio, uma presso osmtica exercida
atravs de sua membrana semi-permevel. Um microrganismo normalmente cresce melhor em meios que
tenham concentraes osmticas levemente inferiores sua prpria. Isto causa o fluxo de gua para o interior
clula, condio essencial para a difuso de nutrientes e manuteno de uma presso exercida de dentro para
fora da clula (turgor). Quando a concentrao do meio consideravelmente menor que a da clula (meio
hipotnico), a gua difunde em excesso para interior da clula, aumentando a presso de turgor e causando
muitas vezes, o rompimento da membrana celular (plasmlise) em clulas que no so protegidas por uma
parede celular rgida. Se a concentrao osmtica do meio maior que a da clula (meio hipertnico), a gua
deixa a clula, e a membrana citoplasmtica encolhe se afastando da parede celular. Organismos que crescem
em altas presses osmticas ou em altas concentraes salinas so ditas osmoflicos e haloflicos,
respectivamente.
2.5 Meios de Cultura

So meios lquidos ou slidos (semi-slido) contendo substncias capazes de proporcionar o
crescimento de microrganismos. Os meios de cultura so classificados de acordo com as fontes de nutrientes
em complexo e sinttico.
Meio Complexo - um meio emprico consistindo de extratos de tecidos animal ou vegetal. Estes
meios geralmente contm todos os ingredientes necessrios para o crescimento dos microrganismos, mas
eles esto em formas cruas, isto , nem todos os componentes do meio nem as quantidades exatas deles so
conhecidas. Muitos componentes de meio complexo so produtos da digesto cida ou enzimtica de tecidos
de plantas, carnes, casena e clulas de levedura que so fontes ricas em polipeptdeos, aminocidos,
vitaminas e sais minerais. Exemplos de meios complexos so os extratos de levedura e as peptonas
(hidrolisados de protena). Estes extratos, geralmente contm carboidratos, no entanto os meios complexos
so suplementados com acar.
Meio Sinttico (Quimicamente Definido) - so os meios de cultura em que todos os nutrientes
necessrios para o crescimento do microrganismo so fornecidos na forma de produtos qumicos
relativamente puros e suas quantidades so conhecidos. Diz-se que o meio mnimo quando todos os
compostos, exceto fatores de crescimento, so provenientes de fontes inorgnicas.
Semestre 2006/2 19
Alguns autores chamam de meio semi-definido ou completo, o meio complexo complementado por
quantidades conhecidas de sais minerais.
Os meios de cultura so usualmente esterilizados com calor em autoclave a 121oC e 15 libras de
presso de vapor durante 15 a 30 minutos.
2.6 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial
Os microrganismos que possam ter interesse industrial podem ser obtidos basicamente das seguintes formas:
- isolamento a partir de recursos naturais
- compra de colees de cultura
- obteno de mutantes naturais
- obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais
- obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de biologia molecular.
Caractersticas desejveis em microrganismos industriais:

- Apresentar elevada eficincia na converso do substrato em produto;
- permitir o acmulo de produto no meio de cultura, de forma a se obter elevada concentrao deste
no caldo fermentado;
- no produzir substncias incompatveis com o produto;
- apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico;
- no ser patognico;
- no exigir condies de processo muito complexas;
- no exigir meios de cultura dispendiosos;
- permitir rpida liberao do produto para o meio.
Caractersticas desejveis nos meios de cultivos:

- Ser o mais barato possvel;
- atender as necessidades nutricionais dos microrganismos;
- auxiliar no controle do processo, como o caso de meios ligeiramente tamponados, que evitam
variaes drsticas de pH, ou evitar formao excessiva de espuma;
- no provocar problemas na recuperao do produto;
- os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem disponveis o
tempo todo;
- ter composio razoavelmente fixa;
- no causar dificuldades no tratamento final dos efluentes.
Semestre 2006/2 20
3 Biorreatores e Processos Fermentativos
Denominam-se biorreatores, reatores bioqumicos ou reatores biolgicos os reatores

qumicos onde ocorrem uma sries de reaes qumicas catalisadas por biocatalisadores. Estes
biocatalisadores podem ser enzimas ou clulas vivas (microbianas, animais ou vegetais). Assim, os
biorreatores podem ser classificados em dois grandes grupos:
1. biorreatores nos quais as reaes ocorrem na ausncia de clulas vivas, ou seja, so reatores
enzimticos;
2. biorreatores onde as reaes se processam na presena de clulas vivas
3.1 Classificao dos biorreatores

Os biorreatores podem receber diversos tipos de classificao, como por exemplo:
- quanto ao tipo de biocatalisador (clulas ou enzimas);
- quanto configurao de biocatalisador (cel/enz livres ou imobilizadas);
- quanto a forma de se agitar o lquido no biorreator.
Considerando as vrias propostas uma classificao mista e abrangente apresentada na Tabela 3.1,
seguir.
Tabela 3.1: Classificao geral dos biorreatores.
CLASSIFICAO DOS BIORREATORES
1. Reatores em fase aquosa (fermentao submersa):

1.1. Clulas ou enzimas livres:
- reatores agitados mecanicamente (STR: stirred tank reactors)
- reatores agitados pneumaticamente:
o coluna de bolhas (bubble column)
o reatores air-lift
- reatores de fluxo empistonado (plug-flow)
1.2. clulas ou enzimas imobilizadas em suportes:
- reatores com leito fixo;
- reatores com leito fluidizado
- outras concepes
1.3. clulas ou enzimas confinadas em membranas:
- reatores com membranas planas
- reatores de fibra oca
2. Reatores de fase no aquosa (fermentao semi-slida)
- reatores estticos (bandejas)
- reatores com agitao (tambor rotativo)
- reatores com leito fixo
- reatores com leito fluidizado gs-slido.
Fonte: Schmidell et al., 2001

Semestre 2006/2 21
A Figura 3.1 mostra alguns tipos de configuraes de biorreatores.
Figura 3.1: Configuraes de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) air-lift; (d) plug-flow; (e) com
clulas imobilizadas (leito fixo); (f) com clulas imobilizadas (leito fluidizado); (g) reator com membranas
planas; (h) hollow-fiber (Fonte: Schmidell et al., 2001).
3.2 Formas de conduo de um processo fermentativo:

a) descontnuo:
- com um inculo por tanque;
- com recirculao de clulas;
b) semicontnuo:
- sem recirculao de clulas;
c) descontnuo alimentado:
- sem recirculao de clulas;
d) contnuo:
- executado em um biorreator (com ou sem recirculao de clulas);
- executado em vrios biorreatores (com ou sem recirculao de clulas).
Semestre 2006/2 22
4 Cultivo Descontnuo
Os cultivos descontnuos clssicos vm sendo utilizados pelo homem desde a Antigidade e, ainda
hoje so os mais utilizados para a obteno de diversos produtos. So tambm conhecidos como
fermentaes descontnuas, fermentaes por batelada ou processo descontnuo de fermentao.
Forma de operao:
No primeiro instante, o meio de cultura esterilizado adicionado ao biorreator. Aps adicionada o
inculo e inicia-se o cultivo. Ao longo do cultivo podem ser adicionados ar, no caso de cultivos aerbios,
soluo cida e/ou alcalina, quando se deseja manter o pH constante, e antiespumante. Terminado o tempo de
cultivo, esvazia-se o biorreator e o meio fermentado segue para a etapa de extrao e purificao dos
produtos. O biorreator ento lavado, esterilizado e recarregado novamente com meio de cultivo.
Caractersticas dos cultivos descontnuos:

- volume de meio de cultura praticamente constante ao longo do cultivo;
- pode ter baixos rendimentos e/ou produtividades devido a efeitos de inibio pelo substrato
ou pelo produto e dos tempos mortos de carga, descarga, lavagem e esterilizao do
biorreator;
- baixo risco de contaminao;
- grande flexibilidade de operao.
4.1 Inculo
Denomina-se de inculo, p-de-cuba ou p-de-fermentao um volume de suspenso de
microrganismo de concentrao adequada capaz de garantir, em condies econmicas, o cultivo de um dado
volume de meio de cultura.
O armazenamento dos microrganismos possui o objetivo de conservar a cepa vivel e com
capacidade produtiva, portanto, como o mnimo possvel de divises celulares, evitando desta forma o
aparecimento de mutaes. O principais mtodos de armazenamento das cepas so em gar inclinado ou
secas. A manuteno da cepa to importante que algumas empresas possuem centros especializados para
manuteno e distribuio das cepas.
O volume de inculo introduzido em um fermentador normalmente em torno de 10% de sua
capacidade til, podendo variar, no entanto entre 0,5% e 50% de sua capacidade conforme o processo.
A Figura 4.1 apresentas as diversas fases de preparao do inculo.
Nos processos industriais, as bateladas podem ser classificadas conforme seu inculo em trs tipos:
- cada biorreator recebe um inculo;
- processo com recirculao de microrganismos;
- processo por meio de cortes.
4.2 Meio de cultura

Tambm denominado de mosto, o meio de cultura deve possuir os nutrientes necessrios para o
crescimento celular:
a) elementos principais: C, H, O e N;
b) elementos secundrios: P, K, S, Mg;
c) vitaminas e hormnios;
d) elementos traos: Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, etc.
Na hora de escolher um meio de cultivo para utilizao industrial, a quantidade de cada um dos
elementos no meio de cultivo deve levar em conta a necessidade de nutrientes do microrganismo e favorecer
a formao do produto final. Outro fatores importantes so:
- o custo;
- a quantidade de carbono disponvel;
Semestre 2006/2 23
- a disponibilidade e o armazenamento
- dificuldade de esterilizao;
- a fermentescibilidade
- o comportamento do meio durante e aps o cultivo (ex: formao de espuma);
Exemplos de substratos disponveis para utilizao como meio de cultura industrial: acares,
melaos, soro de queijo, celulose, amido, e resduos como gua de macerao de milho, metanol, etanol,
alcanos, leos e gorduras, etc.
Figura 4.1: Representao esquemtica do preparo do inculo (Fonte: Schmidell et al., 2001)
4.3 Cintica de um cultivo em batelada

O estudo cintico de um processo fermentativo consiste, inicialmente, na anlise da evoluo dos
valores de concentrao de um ou mais componentes do sistema. Por componentes do sistema entende-se:
- Microrganismo (biomassa) X
- Substratos do meio de cultura S
- Produto ou metablito P
Parmetros de um processo biolgico:

Velocidades instantneas de transformao, r: tambm denominadas velocidades volumtricas
de transformao, com unidades (massa) (comprimento)-3 (tempo)-1.
Velocidades especficas de transformao, : tambm denominada velocidade especfica de
crescimento em (tempo)-1.
Tempo de duplicao, td : O crescimento celular muitas vezes expresso em termos de tempo de
duplicao.
Fatores de converso e coeficientes especficos de manuteno, Y.
Semestre 2006/2 24
6 1200
lactase (U/ml)
5 lactase (U/mg cl) 1000
lactase (UONPG/mg cl)

lactase (UONPG/ml)
4 800
3 600
2 400
1 200
0 0
0 5 10 15 20 25 30
100 60
50
acares totais (g/l) / etanol (g/l)

10
40
biomassa (g/l)
biomassa
1 30
acares totais
etanol 20
0,1
10
0,01 0
0 5 10 15 20 25 30
tempo (h)
Figura 4.2: Curvas de ajuste dos resultados de uma determinada fermentao.
4.3.1 Cintica de crescimento celular

Em um cultivo descontnuo so observadas diferentes fases na curva de crescimento celular. Estas
fases so bem visveis quando se desenha o grfico semilogartmico da concentrao de clulas viveis
contra o tempo, como mostrado na Figura 4.3.
Figura 4.3: Curva de crescimento em reator batelada (Fonte: Doran, 1995).
Fase lag ou de latncia: durante a fase lag, a taxa de crescimento nula (X = X0 = cte), pois as
clulas esto se adaptando ao novo meio de cultura, sintetizando novas enzimas ou componentes estruturais.
A durao da fase lag varia com a concentrao do inculo, com a idade do microrganismo e com seu estado
fisiolgico. Conforme a composio e a durao do pr-inculo possvel que a fase lag nem exista.
Semestre 2006/2 25
Fase de acelerao: a fase de transio em que se observa o incio da reproduo microbiana.

Ocorre um aumento gradual na velocidade de reproduo e, conseqentemente, na velocidade especfica de
crescimento.
Fase exponencial de crescimento: a velocidade especfica de crescimento constante e mxima (
= mx). Desta forma, pode-se concluir, atravs da equao (4.1), que a velocidade de crescimento
diretamente proporcional concentrao celular X:
dX
= mx X
dt (4.1)
Fase de declnio ou desacelerao: medida que os nutrientes do meio de cultura vo se esgotando,
ou que so formados produtos inibitrios, a taxa de crescimento cai e a curva de crescimento celular entra na
fase de declnio.
Fase estacionria: nesta fase foi atingida a concentrao mxima de clulas no meio de cultivo e
esta concentrao constante (X = Xmx) durante a fase estacionria. H um balano entre a velocidade de
reproduo e a velocidade de morte dos microrganismos, ocorrendo tambm modificaes na estrutura
bioqumica da clula.
Fase de morte: o valor da concentrao celular diminui porque as clulas perdem viabilidade ou so
destrudas por lise.
4.3.2 Equao de Monod: interpretao da fase exponencial de crescimento

A equao emprica abaixo, proposta por Monod, tem sido normalmente utilizada para explicar a
relao entre a concentrao de substrato limitante no meio de cultivo, S, e a velocidade especfica de
reproduo do microrganismo, X:
mx S
= (4.2)
KS + S
onde mx representa a velocidade especfica mxima de crescimento do microrganismo e KS a constante de
saturao. Na equao (4.2), fazendo-se S = KS, tem-se que = mx , ou seja, KS a concentrao de
substrato quando a metade de mx. A equao (4.2) est representada na Figura 4.4 para dois valores
diferentes de KS. Quanto menor for o valor de KS, maior ser a durao da fase exponencial de crescimento.
A Tabela 4.1 apresenta valores de KS para diversos microrganismos.
0,16
0,14
0,12
B
0,10 A
(h )
-1
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
S (mg/L)
Figura 4.4: Curvas da equao de Monod para valores hipotticos de mx = 0,14h-1 e KS = 0,60mg.L-1
(Curva A) e KS = 0,030mg.L-1 (Curva B).
Semestre 2006/2 26
Tabela 4.1: valores de KS para diferentes microrganismos.

Microrganismo Substrato limitante KS (mg.L-1)
(gnero)
Saccharomyces Glicose 25
Escherichia Glicose 4,0
Lactose 20
Fosfato 1,6
Aspergillus Glicose 5,0
Candida Glicerol 4,5
Oxignio 0,042-0,45
Pseudomonas Metanol 0,7
Metano 0,4
Klebsiella Dixido de carbono 0,4
Magnsio 0,56
Potssio 0,39
Sulfato 2,7
Hansenula Metanol 120,0
Ribose 3,0
Cryptococcus Tiamina 1,4 10-7
Fonte: Doran, 1997
A equao de Monod no leva em conta o efeito inibidor tanto do substrato como do produto
formado, contudo no o nico modelo que tenta explicar a relao entre o substrato limitante e a velocidade
de crescimento microbiano nesta condio de cultivo. Outras equaes foram propostas e merecem ser
citadas:
Equao de Teissier:
= mx 1 e
S

KS
(4.2)

Equao de Moser:
Sn
= mx (4.3)
KS + S n
Equao de Contois e Fujimoto:
S
= mx (4.4)
KS X + S
Equao de Powell
S
= mx (4.5)
KS + KD + S
A ausncia de inibio , na verdade, uma situao pouco comum na prtica, principalmente em
cultivos descontnuos, onde h um crescente acmulo de metablitos que acabam interferindo
desfavoravelmente sobre o metabolismo e crescimento microbianos.
O efeito da inibio pelo substrato ocorre quando um alto valor inicial de S, ao invs de aproximar
de mx, provoca o efeito contrrio, conforme mostrado na Figura 4.5:
Semestre 2006/2 27
0,14
B
(h )
-1
0,07
0,00
0,0
KS 5,0 10,0 15,0 K 20,0
I,S 25,0
S (mg/L)
Figura 4.5: Cintica de inibio pelo substrato (Curva A) e sem inibio (Curva B), conforme a equao de
Monod para mx = 0,14 h-1.
Com o objetivo de explicar esta reduo na velocidade especfica de crescimento, foi proposta uma
modificao na equao de Monod:
S K I ,S
= mx (4.6)
K S + S K I ,S + S
Nesta nova expresso, KS continua sendo a constante de saturao da equao de Monod, e KI,S a constante
de inibio pelo substrato, que se refere a um valor de S para qual X = mx , porm para um valor de S de
cause inibio, sendo assim superior ao valor de S da equao de Monod. Se KI,S muito maior que S, a
ltima parte da equao 4.6 fica igual unidade e no h inibio pelo substrato.
Quando ocorre inibio pelo produto, uma equao semelhante foi proposta:
S K I ,P
= mx (4.7)
K S + S K I ,P + P
onde KI,P a constante de inibio pelo produto, com significado semelhante KI,S da equao 3.20.
4.3.3 Cintica de formao de produto

Os produtos de fermentao podem ser classificados conforme a relao entre a cintica de
formao do produto e a gerao de energia pela clula. Conforme a Tabela 4.2 podemos classificar a
cintica de formao de produtos durante a fermentao em trs tipos:
- produtos diretamente associados formao de energia na clula (crescimento celular);
- produtos indiretamente associados ao crescimento celular;
- produtos no associados ao metabolismo energtico.
4.3.4 Cintica de consumo de substrato pela clula

As clulas consomem substrato do meio externo e os canalizam para diferentes vias metablicas.
Parte direcionada a crescimento e sntese de produtos, outra frao utilizada para gerar energia para a
manuteno da atividade celular (ver Figura 4.7).
A necessidade de substrato para manuteno depende do microrganismo e das condies de cultura.
A velocidade especifica de consumo de substrato para manuteno da atividade celular conhecida como
Semestre 2006/2 28
coeficiente de manuteno, mS, com dimenso (tempo)-1, geralmente expresso em (kg de substrato) (kg de
biomassa)-1 (s)-1. Alguns exemplos de coeficiente de manuteno so mostrados na Tabela 4.3.
Tabela 4.2: Exemplos de produtos conforme sua associao com o metabolismo energtico.
Classe de produto Exemplos
Etanol, cido actico, cido glucnico,

produtos diretamente associados formao de energia na clula acetona, butanol, cido ltico e outros
produtos de fermentao anaerbica.
produtos indiretamente associados formao de energia na Aminocidos e derivados, cido ctrico,

clula nucleotdeos.
produtos no associados ao metabolismo energtico Penicilina, estreptomicina, vitaminas

Fonte: Doran, 1997.
Figura 4.6: Representao esquemtica da formao de produtos: a) formao de produto associada ao

crescimento celular; b) formao de produto resultante de metabolismo secundrio; c) produto formado na
fase estacionria de crescimento.
Tabela 4.3: Coeficiente de manuteno de diversos microrganismos em glicose como fonte de carbono.
Microrganismo Condio de cultivo mS (kg glicose) (kg clulas)-1 (s)-1
Saccharomyces cerevisiae anaerbia 0.036
anaerbia, 1,0M NaCl 0,360
Azotobacter vinelandii fixao de nitrognio, tenso de O2 dissolvido: 0,2 atm 1,5
fixao de nitrognio, tenso de O2 dissolvido: 0,02 atm 0,15
Klebsiella aerogenes anaerbica, limitao de triptofano, 2g.L-1 NH4Cl 2,88
anaerbica, limitao de triptofano, 4g.L-1 NH4Cl 3,69
Lactobacillus casei 0,135
Aerobacter clocae anaerbia, limitao de glicose 0,094
Penicilium crysogenum aerbia 0,022
Fonte: Doran, 1997
Semestre 2006/2 29
A fora inica do meio de cultivo possui grande influncia no coeficiente de manuteno celular,
pois so necessrias grandes quantidades de energia para manter os gradientes de concentrao atravs da
membrana celular.
Figura 4.7: Resumo das principais rotas metablicas.
4.4 Clculo do nmero de biorreatores descontnuos

Considerando a uma instalao com biorreatores funcionando em processo descontnuo que deva
fornecer, de maneira ininterrupta, meio cultivado parte de extrao e purificao dos produtos. Sendo:
F = vazo mdia de meio cultivado que deve ser fornecido ao setor de extrao e purificao dos produtos;
tf = tempo de cultivo;
V = volume de meio no biorreator;
D = nmero de biorreatores com volume V, necessrios para manter a vazo F de meio cultivado;
td = tempo de descarga de um biorreator;
tc = tempo de carga de um biorreator.
A vazo F depende:
- da quantidade de produto final desejada;
- do rendimento da extrao e purificao;
- da concentrao do produto no meio cultivado.
Se M for a massa de produto final que se deseja produzir num tempo t, com r sendo o rendimento
da etapa de extrao e purificao do produto e C a concentrao do produto no meio cultivado, ento:
M
F=
C t r (4.8)
E o tempo de descarga :
Semestre 2006/2 30
V
td =
F (4.9)
Para fins de aproximao inicial, pode-se considerar:
tc = t d (4.10)
A Figura 4.8 mostra um sistema em que, cada vez que um biorreator termina de ser descarregado,
existe outro pronto para comear a ser descarregado, fornecendo meio cultivado ininterruptamente ao setor
de extrao e purificao dos produtos.
Figura 4.8: Cronograma de funcionamento de biorreatores em um processo descontnuo. (1) incio do

preparo do biorreator; (2) fim da carga; (3) fim do cultivo; (4) fim da descarga (Fonte: Schmidell et al.,
2001).
Assim, pode-se escrever, para ter-se o setor de extrao e purificao dos produtos funcionando
continuamente:
( D 1) t d = t d + t f para D3 (4.11)
substituindo a equao (4.9) na (4.11) e rearranjando:
F t f
D = 2+
V (4.12)
A equao (4.12) nos permite calcular o nmero de biorreatores, desde que se conhea F, V e tf. A
Figura 4.9 mostra visualmente o resultado da equao (4.12)
Figura 4.9: Cronograma de funcionamento dos biorreatores nmero 1 e nmero D em um processo

descontnuo. (1) incio do preparo do biorreator; (2) fim da carga; (3) fim do cultivo; (4) fim da descarga
(Fonte: Schmidell et al., 2001).
Semestre 2006/2 31
5 Cultivo Contnuo
O cultivo contnuo caracteriza-se por possuir uma vazo de alimentao contnua e constante de
meio de cultura dentro do biorreator, sendo que o volume de meio de cultura mantido constante dentro do
biorreator atravs da retirada contnua de meio cultivado. Nesta operao o biorreator atinge a condio de
estado-estacionrio ou regime permanente, no qual as variveis de processo permanecem constantes ao longo
do tempo.
Vantagens do processo contnuo em relao ao descontnuo:
- aumento da produtividade do processo devido da reduo dos tempos mortos e no
produtivos;
- o meio de sada do biorreator uniforme, facilitando os processos de extrao e
recuperao de produto;
- manuteno das clulas num mesmo estado fisiolgico;
- possibilidade de associao com outras operaes contnuas da linha de produo;
- menor necessidade de mo-de-obra.
Desvantagens do processo contnuo:
- maior investimento inicial na planta;
- possibilidade de ocorrncia de mutaes genticas espontneas;
- maior possibilidade de ocorrncia de contaminaes;
- dificuldade de operao do estado estacionrio.
5.1 Formas de operao do sistema contnuo

O cultivo contnuo normalmente tm incio num cultivo em batelada. Aps o final de um processo
batelada tpico, inicia-se a entrada e retirada de meio de cultivo, dando-se incio operao contnua
propriamente dita. Uma vez iniciado o processo, ele ir convergir para o estado estacionrio com maior ou
menor rapidez, dependendo das condies do processo..
O sistema contnuo extremamente verstil quanto as vrias possibilidades de operao:
- contnuo em um nico estgio (um nico reator) com ou sem reciclo de clulas.
- contnuo em mltiplos estgios (n reatores em srie):
i. com uma nica alimentao (com ou sem reciclo de clulas);
ii. com mltiplas alimentaes (com ou sem reciclo de clulas).
20 12
18
10
16
X
14 S 8
Qx (g/(L.h)
X, S (g/L)
12 Qx
10 6
8
4
6
4
2
2
0 0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
diluio (1/h)
da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L,
YX/S = 0,45 e KS = 1g/L.
Semestre 2006/2 32
70 40
60 35
30
50
25
Qx (g/(Lh))
X, S (g/L)
40
X S 20
30 X S
15
Qx Qx
20
10
10 5
0 0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
diluio (1/h)
da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L,
YX/S = 0,45 e KS = 1g/L em um sistema com reciclo interno onde a frao de meio que sai diretamente do
biorreator 0,2 e o fator de diluio do meio filtrado 0,1.
Semestre 2006/2 33
6 Cultivo Semi-contnuo
O cultivo recebe a denominao de semi-contnuo quando, uma vez colocados no biorreator o meio
de cultura e o inculo, as operaes que se seguem obedecem seguinte ordem:
1. aguarda-se o trmino do cultivo
2. retira-se parte do meio cultivado, mantendo-se no reator o restante do meio cultivado
3. adiciona-se no reator um volume de meio de cultivo igual ao volume retirado na operao
anterior (2).
Este processo chamado semi-contnuo porque so intermitentes tanto o fluxo de entrada de meio
no reator quanto o de sada de material cultivado.
O antigo processo de fabricao de vinagres partir do vinho um exemplo tpico de processo
semi-contnuo.
Vantagens do processo semi-contnuo
a) possibilidade de operar o biorreator por longos perodos sem que seja necessrio preparar um
novo inculo;
b) possibilidade de aumentar a produtividade do biorreator apenas modificando-se o cronograma
de trabalho;
c) possibilidade de, uma vez conhecidas as condies timas de operao, conseguir
produtividade significativamente maior que a obtida em processos descontnuos.
6.1 Produtividade de um processo semi-contnuo

A produtividade do processo semi-contnuo depende de fatores como:
- a quantidade inicial de clulas no biorreator
- a concentrao inicial de substrato
- a concentrao inicial de produto.
Contudo, os fatores acima relacionados dependem de uma nica varivel: a frao de meio
cultivado de que retirada do biorreator aps cada cultivo, . A Figura 6.1 mostra algumas relaes de
com a produtividade.
Duas situaes devem ser comentadas:
a) se = 1, todo o meio do reator retirado e no haver mais cultivo
b) se se aproximar muito de zero, o volume de meio retirado do biorreator ser muito pequeno e
o processo se aproximar de um cultivo contnuo.
Figura 6.1: influncia de sobre a produtividade de um processo

semi-contnuo (Fonte: Schmidell et al., 2001).
Semestre 2006/2 34
7 Cultivo em Regime Batelada Alimentada
O cultivo em regime batelada alimentada definido como a tcnica em que um ou mais nutrientes
so adicionados ao biorreator durante o cultivo com vazo de alimentao controlada, e os produtos
permanecem no biorreator at o final do cultivo. A vazo de alimentao pode ser constante ou pode variar
com o tempo. Pode ser ainda contnua ou intermitente.
No cultivo em batelada-alimentada, a concentrao de um dado substrato pode ser controlada
dentro do biorreator de modo que, por exemplo, o metabolismo microbiano seja deslocado para uma
determinada via metablica, levando ao acmulo de um produto especfico.
Vantagens do cultivo em baleada-alimentada:
a) minimizao da represso catablica de enzimas do metabolismo de fontes de carbono
complexas pela glicose e outras fontes de carbono rapidamente metabolizveis;
b) minimizao da represso catablica pela glicose sobre a produo de metablitos secundrios
como alcalides de ergot, cefalosporina C, indolmicina, bacitracina, estreptomicina, neomicina,
novobiocina, penicilina, etc.;
c) inibio da produo de proteases quando o produto um protena recombinante extracelular;
d) preveno da inibio por substratos como etanol, metanol, cido actico e compostos
aromticos;
e) minimizao da formao de produtos txicos do metabolismos celular, como etanol para
leveduras, cido actico para Escherichia coli e lactato e amnia no cultivo de clulas animais;
f) minimizao de problemas como contaminao, mutao e instabilidade de plasmdeo;
g) adequao do bioprocesso s condies operacionais:
i. formao de espuma
ii. nutriente instvel
iii. processos aerbios de longo perodo (1 a 2 semanas).
h) estudo da cintica de processos fermentativos.
Os cultivos em batelada alimentada permitem que se trabalhe com cultivos em duas fases, uma de
crescimento e outra de produo de produto e ainda que se obtenham cultivos com grandes concentraes de
clulas, at 100g/L.
O cultivo em batelada-alimentada repetitiva aquele em que uma frao constante do volume da
cultura removida em intervalos de tempos fixos, podendo ser mantido indefinidamente.
O cultivo em batelada-alimentada estendida aquele em que a concentrao do substrato
limitante mantida constante no meio de fermentao atravs do suprimento contnuo deste nutriente.
O cultivo em batelada-alimentada ainda pode ser dividido em dois tipos baseado no fato de a vazo
de alimentao ser ou no baseada em um sistema de retro-alimentao. No modo de operao com sistema
retro-alimentado, a vazo de alimentao pode ser controlada atravs da concentrao de substrato no meio
de alimentao (sistema direto) ou em funo de outros parmetros (controle indireto) como densidade tica,
pH, coeficiente de respirao, concentrao de etanol e outros. No modo de operao no reto-alimentado a
vazo de alimentao pode ser intermitente ou contnua, seguindo um padro pr-estabelecido.
Semestre 2006/2 35
0,25 3,5
exponecial
linear 3,0
0,20
constante
2,5
F (m /h)
0,15 2,0
V (m )
3
3
0,10 1,5
1,0
exponecial
0,05
0,5 linear
constante
0,00 0,0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
tempo (h) tempo (h)
0,10
exponecial
0,08 linear
constante
0,06
D (1/h)
0,04
0,02
0,00
0 5 10 15 20 25 30
tempo (h)
0,50 70
veloc espec crescimento (1/h)
exponecial
60
0,40 linear
constante 50
0,30
X (g/L)
40
0,20 30
20
exponecial
0,10
10 linear
constante
0,00 0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
tempo (h) tempo (h)
Figura 7.1: Grficos da variao da vazo de alimentao, F, do volume, V, da taxa de diluio, D, da

velocidade especfica de crescimento e da concentrao da biomassa, X em cultivos em regime batelada-
alimentada com vazo de alimentao constante, linear crescente e exponencial.
Semestre 2006/2 36
Figura 7.2: Biomassa e produo de ergosterol para diferentes mtodos de controle de alimentao em
cultivos batelada alimentada (Fonte: Gao & Tan, 2003).
Semestre 2006/2 37
Figura 7.3: Cultivo batelada-alimentada com alimentao exponencial combinada com pH-stat de
Escherichia coli K12 com velocidade especfica de crescimento controladas em 0,1h-1 (esquerda) e 0,3h-1
(direita) (Fonte: Kim et al., 2004)
Semestre 2006/2 38
8 Reatores com clulas imobilizadas
Clulas imobilizadas so definidas como clulas fisicamente confinadas ou localizadas em um

espao definido com a reteno das suas atividades catalticas, e qu podem ser utilizadas repetida e
continuamente.
Pode-se dividir os processos com clulas imobilizadas em dois tipos:
Os primeiros so os que utilizam as enzimas contidas nas clulas, no havendo necessidade de
coenzimas (ATP, NADH) e vias anablicas presentes na replicao celular. Exemplos: produo industrial
de cido mlico, cido asprtico e xarope de frutose de milho (High Frutose Corn Syrup).
O segundo tipo o que necessita manter a viabilidade celular, uma vez que os produtos formados
requerem mltiplos passos de transformaes, regenerao de coenzimas, presena de cadeia respiratria,
vias metablicas geradoras de produtos intermedirios e outros mecanismos inerentes s clulas vivas.
Histrico:
1916: Nelson e Griffin descobriram que uma invertase de levedura mantinha sua atividade
cataltica de hidrlise de sucrose quando adsorvida em carvo ativado (activated charcoal).
1953: Grubhofer e Schleith imobilizaram diversas enzimas (carboxipeptidase, diastase, pepsina e
ribonuclease) numa resina de poly-amino-estireno diazotizado por ligao covalente.
1969: Chibata e colaboradores desenvolveram a primeira aplicao industrial de biocatalizadores
imobilizados. Uma aminoacilase fngica foi imobilizada em DEAE-Sephadex por ligao inica e foi
utilizada para a hidrlise estreo-seletiva de N-acil-D,L-aminocidos para produzir L-aminocidos e N-acil-D-
aminocidos.
1973: Chibata e colaboradores desenvolveram a primeira aplicao industrial de clulas
imobilizadas, produzindo L-aspartato de fumarato de amnia atravs de clulas de Escherichia coli
imobilizadas em gel de poliacrilamida.
8.1 Mtodos de imobilizao celular

A imobilizao celular freqentemente imita fenmenos que ocorrem na natureza: muitos
microrganismos possuem a capacidade de aderir naturalmente sobre diferentes tipos de materiais e estruturas,
formando biofilmes.
As vrias tcnicas de imobilizao celular podem ser classificadas em quatro grupos, conforme o
mecanismo de imobilizao empregado (Figura 8.1):
1. ligao ou adsoro sobre a superfcie de um suporte slido;
2. envolvimento em uma matriz porosa;
3. formao de agregados celulares por floculao (natural) ou ligao com o uso de agentes
qumicos (induzida artifcialmente);
4. conteno das clulas atrs de uma barreira.
8.1.1 Imobilizao sobre a superfcie de um suporte slido

A imobilizao celular sobre a superfcie de um suporte slido ocorre atravs de adsoro devido
foras eletrostticas entre a membrana celular e a superfcie do suporte, ou devido ligaes covalentes. A
espessura do biofilme varia de uma monocamada celular at em torno de 1 mm.
Suportes slidos utilizados:
a) materiais celulsicos: DEAE-celulose (Dietilaminoetil-celulose), madeira, serragem;
Semestre 2006/2 39
b) materiais inorgnicos: poligorsquita, montmorilonita, hidromica, porcelana poroso, vidro

poroso, etc.
Os materiais slidos como vidro e celulose podem tambm ser tratados com polictions, quitosana
ou outros compostos qumicos para aumentar sua capacidade de adsoro.
Figura 8.1: Desenho esquemtico dos mtodos bsicos de imobilizao celular

(Fonte: Kourkoutas et al., 2004).
8.1.2 Envolvimento em uma matriz porosa:

um mtodo de imobilizao muito utilizado devido sua facilidade, baixssima toxidez e alta
capacidade de reteno celular. As clulas ficam imobilizadas dentro de uma matriz polimrica formadora de
um gel hidroflico. Os poros da matriz no menores que as clulas contidas no seu interior e permitem a
transferncia de nutrientes e metablitos.
Os materiais mais utilizados para a produo de partculas so os gis polissacardecos de alginato,
K-carragena, agar, quitosana e cido poligalacturnico, ou outras matrizes polimricas como gelatina,
colgeno e lcool polivinlico. A imobilizao em gar realizada pelo abaixamento da temperatura, e dos
outros polmeros polissacardeos conforme o esquema da Figura 9.2.
A principal desvantagem desta tcnica a limitao imposta pela difuso intraparticular de
substratos e produtos metablicos. O tamanho da partcula, a difusividade atravs da matriz polimrica e a
concentrao celular na partcula devem ser otimizados no sentido de minimizar estes efeitos.
Semestre 2006/2 40
Polissacardeo (1 a 4%) +
clulas
Partculas contendo
clulas imobilizadas
dimetro de 0,5 a 5 mm
250 mg de clulas / g Soluo de KCl ou CaCl2
matriz 0,05 a 0,5M
Agitador magntico
Figura 8.2: Imobilizao de clulas por envolvimento em gel hidroflico induzida por Ca++ e K+.
8.1.3 Floculao celular (agregao)

A floculao celular definida como uma agregao de clulas formando uma unidade maior ou
como a propriedade de clulas em suspenso de formarem agregados e sedimentarem. Sobretudo fungos e
clulas de plantas formam agregados, contudo pode-se adicionar agentes floculantes em culturas celulares
que no floculam naturalmente.
A floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fabricao de cerveja de grande
importncia, pois afeta a produtividade da fermentao e a qualidade da cerveja, alm de interferir na
separao e recuperao da levedura.
8.1.4 Conteno mecnica atrs de uma barreira

A conteno das clulas atrs de uma barreira pode ser obtida utilizando-se membranas
microporosas, pelo envolvimento das clulas em microcpsulas ou pela imobilizao das clulas na
superfcie de interao entre dois lquidos imiscveis. Os biorreatores de membranas so um exemplo deste
tipo de imobilizao e so tratados no Captulo 9.
8.2 Caractersticas e vantagens da imobilizao celular

Os suportes so adequados para a imobilizao celular quando possuem as seguintes caractersticas:
1. o suporte deve possuir uma grande superfcie, com grupos funcionais para a adeso celular;
2. o suporte deve ser de fcil manipulao e regenerao;
3. o biocatalisador imobilizado deve possuir grande viabilidade celular e alta estabilidade, alm de ficar
retido (imobilizado) por longos perodos de tempo;
4. a atividade biolgica das clulas imobilizadas no pode ser afetada pelo processo de imobilizao;
5. o suporte deve ter porosidade uniforme e controlvel, permitindo a transferncia de massa de
substratos, produtos, co-fatores e gases;
6. o suporte e a tcnica de imobilizao devem ser simples, de custo acessvel, e passvel de
escalonamento.
Semestre 2006/2 41
Os cultivos com clulas imobilizadas possuem diversas vantagens sobre os cultivos com clulas
livres:
atividade e estabilidade prolongada do biocatalisador, pois o suporte de imobilizao pode atuar como
uma barreira protetora aos efeitos fsico-qumicos do pH, temperatura, solvente ou metais pesados;
maior densidade de clulas por unidade de volume do biorreator, levando a uma maior produtividade
volumtrica, menor tempo de cultivo, eliminao de fases de crescimento celular no produtivas;
maior consumo de substrato e aumento do rendimento;
possibilidade de processamento contnuo;
aumento da tolerncia a altas concentraes de substrato e menor inibio pelo produto final;
maior facilidade na recuperao do produto, diminuindo a necessidade de filtrao e separao,
diminuindo assim os custo de equipamento e mo-de-obra e o consumo de energia;
regenerao e reutilizao do biocatalizador em cultivos batelada, sem remov-los do biorreator, levando
a cultivos semi-contnuos;
reduo do risco de contaminao microbiana devido alta concentrao celular;
possibilidade do uso de biorreatores menores, com processos mais simplificados, reduzindo o custo.
8.3 Exemplos de usos de clulas imobilizadas
5000
atividade lipoltica (U/L)
4000
3000
2000
1000
0
72 96 120
tempo (h)
cl livres alginato de sdio k-carragena poliacrilamida
Figura 8.3: Produo de lipase com clulas imobilizadas e clulas livres (Fonte: Ellaiah et al., 2004).
Figura 8.4: Cintica de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-imobilizadas em

alginato de sdio (Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001).
Semestre 2006/2 42
produtividade (g EtOH / (L.h))
5,0
produtividade (g EtOH / (L.h))

10
4,0 (a) (b)
8
3,0 6
2,0 4
1,0 2
0,0 0
1 2 3 4 5 6 7 0 5 10 15 20 25 30
batelada vazo de alimentao (mL/h)
Figura 8.5: Produtividade de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-

imobilizadas em alginato de sdio (b) Produtividade de um cultivo contnuo de clulas de Z. mobilis e S.
diastaticus co-imobilizadas em alginato de sdio em biorreator PBR com 60mL de volume de trabalho
(Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001).
Figura 8.6: Biomassa e atividade de bacteriocina em um biorreator contnuo com clulas livres (Fonte:
Bhugaloo-Vial et al., 1997).
Figura 8.7: Produtividade de bacteriocina com a taxa de diluio (a) em um biorreator contnuo com clulas
livres e (b) em biorreator contnuo PBR com clulas imobilizadas em alginato de sdio (Fonte: Bhugaloo-
Vial et al., 1997).
Semestre 2006/2 43
Figura 8.8: Produo de etanol, evoluo de CO2 e consumo de glicose por clulas de S. cerevisiae
imobilizadas (smbolo cheio) e livres (smbolo aberto) (Fonte: Wendhausen et al., 2001).
Figura 8.9: Produtividade (smbolo cheio) e concentrao de etanol (smbolo aberto) em clulas de S.
cerevisiae imobilizadas em funo da taxa de diluio e em funo do tempo em um bioreator de leito
empacotado alimentado com 33% de caldo de cana (180 g/L de sacarose) a 30oC (Fonte: Wendhausen et al.,
2001).
Semestre 2006/2 44
9 Biorreatores com membranas
Os biorreatores com membranas (MBR Membrane Bioreactor) so um importante avano no

desenvolvimento de processos por membranas. Desde que se iniciaram as pesquisas em MBR na dcada de
70, foram desenvolvidas diversas geraes de MBRs. Desde ento os sistemas com MBRs so utilizados
sobretudo para tratar efluentes industriais, domsticos e municipais, quando os padres de descarga so
bastante rgidos ou se faz a reutilizao da gua.
Um MBR combina o processo de lodo ativado com o processo de separao por membranas. O
reator operado de forma similar a um reator convencional de lodo ativado, porm no necessita de passos
secundrios de clarificao, e tercirios como filtrao em areia. Pode-se se utilizar membranas de micro ou
de ultrafiltrao para separar o lodo ativado do efluente. As duas principais configuraes de MBRs so os
MBRs de membrana submersa ou com membrana de circulao externa, conforme mostrado ma Figura 10.1.
Figura 9.1: Configuraes de MBRs: (a) membrana submersa, (b) circulao externa (Fonte: Melin et al.,
2006).
A primeira gerao de MBRs foram os sistemas de circulao externa, onde o mdulo de filtrao
(membranas) localizado fora do biorreator. A soluo efluente bombeada em alta velocidade
paralelamente s membranas, e a soluo concentrada retorna ao tanque de lodo ativado. Os MBRs
desenvolvidos recentemente possuem a configurao de membrana submersa, onde o mdulo de filtrao
colocado dentro do tanque de aerao contendo o efluente e o lodo ativado. A caracterstica desta
configurao o baixo fluxo atravs da membrana reduzindo as obstrues (fouling) tanto quanto possvel e
operando a baixa presso transmembrana.
Os MBRs com circulao externa normalmente utilizam mdulos tubulares de membranas,
enquanto que os de membrana submersa utilizam os mdulos de membrana plana (flat plate) ou de fibra-oca
(hollow-fibre). A Tabela 10.1 mostra a comparao entre estes mdulos de membranas.
O papel principal da membrana em um MBR uma barreira contra slidos suspensos. Contudo,
devido complexidade do efluente lquido, possvel a remoo de espcies solveis, conforme o tipo de
membrana: microfiltrao (MF), ultrafiltrao (UF) ou nanofiltrao (NF).
Microfiltrao:
- poros: 0,1-0,2 m
- remoo de slidos suspensos como bactrias
- remoo parcial de vrus e macrosolutos
Semestre 2006/2 45
Ultrafiltrao:
- poros de 0,1 m a 5 nm
- boa remoo de vrus e substncias polimricas extracelulares (SPE)
Nanofiltrao:
- poros de 2 nm
- retm quase todas as espcies solveis, com exceo de alguns ons e substncias
orgnicas de baixo peso molecular.
Tabela 9.1: Comparao das caractersticas dos diferentes mdulos de membranas utilizados em MBRs.
Mdulo de membrana Membrana plana Fibra-oca Tubular
Vazo (L/(h.m2)) 15-25 20-30 70-100

MLSS recomendado (gMLSS/L) 10-15 10-15 15-30
Consumo de energia (kWh/m3) 0,3-0,6 0,3-0,6 2-10
Custo por m2 alto mdio Muito alto
Faixa de pH 1-12 2-11 1-13
Temperatura de trabalho < 60oC < 40oC < 100oC
Densidade do empacotamento moderada alta baixa
limpeza moderada retrolavagem possvel uma boa limpeza fsica
Fonte: Lesjean et al. (2004); Fane (2002)
Vantagens da tecnologia de MBRs comparadas ao processo de lodo ativado convencional:

- Desinfeco do efluente, pois as membranas constituem uma barreira fsica para as
bactrias e, no caso das membranas de UF, para os vrus;
- Menor tamanho de biorreator como conseqncia da alta concentrao de slidos
suspensos no efluente (MLSS - Mixed Liquor Suspended Solids) quando se opta por uma
idade de lodo baixa ou moderada;
- Menor produo de lodo quando se opta por uma alta idade do lodo;
- Efluente com qualidade maior e mais consistente, como resultado da filtrao por
membrana;
- Menor sensibilidade a picos de concentrao e contaminao.
Principais desvantagens dos MBRs:
- Custo relativamente alto de instalao e operao
- Necessidade de monitoramento e manuteno freqente da membrana;
- Limitaes de pH, temperatura e presso;
- As membranas tambm podem ser sensveis algumas substncias qumicas;
- Menor eficincia de transferncia de oxignio devido alta concentrao de MLSS;
- A tratabilidade do lodo excedente questionvel.
A tecnologia de MBR mais cara que a tecnologia convencional de tratamento de efluentes,

contudo encontra suas aplicaes em alguns casos especiais:
- quando se necessita de uma tecnologia compacta, devido falta de espao ou ao alto
custo da terra em reas urbanas;
- quando se necessita de uma lata qualidade final do efluente, por exemplo, para
reutilizao da gua (irrigao, atividades recreacionais, indstria, reutilizao
Semestre 2006/2 46
domstica, ou recarga de aqferos), ou como pr-tratamento antes de nanofiltrao,

osmose reversa ou deionizao (na dessalinizao e produo de gua ultrapura).
Segundo Yang et al. (2006) existem mais de 2200 instalaes de MBRs em operao ou em
construo espalhadas pelo mundo, a grande maioria para tratamento de esgoto municipal. A sia,
especialmente o Japo e a Coria do Sul, abraaram a tecnologia de MBRs sobretudo para o tratamento em
pequena escala de esgotos domsticos.
Semestre 2006/2 47
10 Cultivo Semi-Slido
O cultivo semi-slido (CSS) definido como processos que se referem a cultura de

microrganismos sobre ou dentro de partculas em uma matriz slida (substrato ou material inerte, onde o
contedo de lquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela est a um nvel de atividade de gua que,
por um lado assegure o crescimento e o metabolismo das clulas e, por outro, no exceda a mxima
capacidade de ligao da gua com a matriz slida.
Histrico do CSS:
- produo de molho de soja em 1000a.C. e de chiang entre 2500a.C. e 500a.C. na
China;
- produo de queijo Roquefort em 100 d.C.
- hoje: produo de enzimas
10.1 Microrganismos normalmente utilizados:

Utilizam-se sobretudo fungos filamentosos como:
- Rhizopus, Trichoderma, Penicillium ou Aspergillus enriquecimento protico e
produo de enzimas
- Mucor ou Rhizopus produo de renina microbiana;
- Penicillium produo de penicilina;
- Fusarium o Giberella produo de cido giberlico.
A utilizao de bactrias e leveduras tem aumentado recentemente:
- Bacillus thuringiensis bioinseticidas e -amilase;
- Zymomonas mobilis ou leveduras produo de etanol.
10.2 Substratos: caractersticas e composio:

O substrato ou matriz slida deve possuir algumas caractersticas que possibilitem o maior
rendimento do processo. O principal fator do CSS o grau de acessibilidade do microrganismo ao meio de
cultivo, assim, as caractersticas que mais se destacam so a porosidade, o tamanho e o formato das
partculas.
Quanto menor o tamanho da partcula, maior a sua rea superficial e, conseqentemente, maior o
grau de transformao. Por outro lado o processo necessita ter uma granulometria que permita a circulao
doa ar por entre a massa de meio, e a dissipao dos gases produzidos, os quais poderiam via a prejudicar a
produtividade do processo. A Figura 10.1 apresenta a velocidade de fermentao, avaliada em termos de
produo de CO2 durante o processo, em funo do tamanho das partculas em meio slido.
Quanto porosidade, sua principal conseqncia a absoro de gua, que facilita o transporte de
enzimas e metablitos por entre o meio e os microrganismos.
Processos empregados para facilitar a atuao dos microrganismos sobre o meio:
- esmagamento, quebra moagem e peneiramento;
- suplementao de nutrientes e correo de pH;
- hidrlise cida ou alcalina de material celulsico;
- embebio;
- aquecimento do substrato (gelatinizao ou inchamento)
- adio de agente quelante;
- esterilizao.
Semestre 2006/2 48
Figura 10.1: Influncia do tamanho das partculas na velocidade de fermentao de acar de beterraba por
Zymomonas mobilis para produo de etanol. (Fonte: Schmidell et al., 2001)
Diversas matrias-primas e, dentre estas, principalmente os diversos tipos de resduos

agroindustriais, podem ser empregadas como substrato em CSS. A escolha de cada meio depender da
disponibilidade, do microrganismo e do produto final que se deseja obter.
10.3 Biorreatores para CSS

O CSS ocorre sobretudo em processos batelada: o meio adicionado ao biorreator, que ento
inoculado e ocorra a incubao por um determinado perodo de tempo. A seguir o produto pode ser extrado
atravs da suspenso do meio com gua, solues-tampo ou solventes, ou ento simplesmente seco e
armazenado.
Biorreatores para laboratrio: frascos cnicos, garrafas de cultivo, copos de Becker.
Biorreatores industriais: bandejas, tanques circulares, esteira rolante e reatores tubulares horizontais
com agitao interna (Figura 10.2)
Figura 10.2: Reatores para cultivo semi-slido industrial (a) tanques circulares; (b) esteira rolante; (c) reator
tubular com agitao interna. (Fonte: Schmidell et al., 2001)
Semestre 2006/2 49
Para mais detalhes consultar Durand, A. Bioreactor desings for solid-state fermentation.
Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 113-125.
10.4 Controle de processo em CSS

Os controles de umidade, temperatura e pH do meio de cultivo, a velocidade e freqncia de
agitao, as condies de transferncia de oxignio e de nutrientes, as caractersticas do substrato, alm das
caractersticas e estimativas de crescimento e automao do processo so os parmetros mais freqentemente
analisados nos diversos estudos revistos.
10.4.1 Teor de umidade

A natureza do substrato, as necessidades do microrganismo utilizado e o tipo de produto final
desejado so os principais parmetros que determinam o grau de umidade que o substrato dever ter no incio
e ao longo do cultivo.
Um substrato apropriadamente umedecido dever possuir um filme superficial de gua visando
facilitar a dissoluo e a transferncia de massa de nutrientes e de oxignio. Porm, entre as partculas devem
existir canais que permitam a difuso de gases e a dissipao de calor.
A Figura 10.3 apresenta a velocidade de produo de protena de Aspergillus niger de acordo com a
umidade inicial do meio de cultura.
Figura 10.3: Influncia do teor de umidade sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al.,
2001)
10.4.2 Atividade de gua:

Este parmetro definido como a razo entre a presso de equilbrio de vapor de um substrato em
relao gua pura, mesma temperatura. A atividade de gua (aw) influencia o desenvolvimento
microbiano e os processos bioqumicos. Assim, cada microrganismo possui um nvel de aw mnimo para que
possa efetuar suas atividades metablicas, conforme a Figura 10.4.
10.4.3 Temperatura
Devido s atividades metablicas do microrganismo e dependendo da altura da cama de substrato,
uma grande quantidade de calor pode ser produzida durante o cultivo. Como a temperatura afeta diretamente
a germinao dos esporos, o crescimento e a esporulao dos microrganismos, e a formao de produto, o
calor produzido dever ser imediatamente dissipado para que o aumento da temperatura no prejudique a
fermentao desejada.
A Figura 10.5 apresenta a velocidade de produo de protenas por Aspergillus niger em relao
temperatura empregada no processo.
Semestre 2006/2 50
Figura 10.4: Relao entre a atividade de gua e as reaes de deteriorao dos alimentos.
Figura 10.5: Influncia da temperatura sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al., 2001)
10.4.4 pH
O controle do pH durante o CSS, embora crtico, difcil de ser conseguido devido
heterogeneidade e a consistncia do meio de cultivo. Como tentativa de evitar variaes bruscas no pH
utilizam-se substratos com boa capacidade tamponante ou a adio de soluo tampo durante a etapa de
umidificao do substrato.
10.4.5 Aerao:
A aerao necessria para o bom rendimento de praticamente todos os processos produtivos
biotecnolgicos, incluindo os via CSS. A oxigenao pode ser realizada via entrada de ar estril sob presso
dentro do biorreator. A quantidade de ar que deve ser fornecido ao cultivo depende do microrganismo, da
quantidade de calor metablico a ser dissipado no processo, da espessura da camada de substrato. Da
quantidade de CO2 e outros volteis a serem eliminados e da necessidade de oxignio para sntese dos
produtos.
Semestre 2006/2 51
10.4.6 Agitao
Visa obter uma melhor homogeneizao do meio de cultivo, gerando uma melhor distribuio do
inculo e do meio umidificante, impedindo a formao de agregados e favorecendo tanto a transferncia
gasosa como a troca de calor do meio.
10.4.7 Estimativa de crescimento

realizado a travs de metodologias indiretas, pois na maioria das vezes no possvel separar-se
o microrganismo do substrato slido onde este se desenvolveu. Mtodos mais utilizados:
- quantificao da protena total
- estimativa da quantidade de ATP ou glicosamina;
- medida contnua da quantidade de O2 e CO2 no gs de sada do biorreator.
10.4.8 Extrao dos produtos

Normalmente utilizado um diluente como gua destilada, soluo salina ou soluo-tampo. A
extrao realizada por agitao do meio como o solvente ou por percolao do solvente atravs do leito de
slidos.
Semestre 2006/2 52
11 Agitao e aerao em biorreatores
O oxignio necessrio para todas as culturas aerbias, e manter uma concentrao apropriada de
oxignio dissolvido no meio de cultura importante para a operao eficiente do reator (Fogler, 1992). A
equao estequiomtrica da oxidao completa da glicose dada por:
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O
Ou, seja, para que ocorra a oxidao de 1 mol de glicose, so necessrios 6 moles de oxignio.
Contudo, enquanto fontes de carbono e de nitrognio e outros nutrientes so bastante solveis em gua, o
oxignio pouco solvel. Pode-se dissolver centenas de gramas de glicose em gua, mas a solubilidade do
oxignio a 35oC da ordem de 7mgO2/L (7ppm). Desta forma de nada adianta colocar centenas de gramas
por litro de glicose do meio de cultivo se no se consegue transferir oxignio ao microrganismo numa
velocidade suficientemente grande para suportar um crescimento exclusivamente aerbio.
0,016
0,014
Conc O2 (kg.m-3)
0,012
0,01
0,008
0,006
0 10 20 30 40 50
o
temperatura ( C)
Figura 11.1: Variao da concentrao de oxignio dissolvido em gua com a temperatura.
11.1 Transferncia de oxignio da bolha de gs para a clula

Nas culturas aerbias, as molculas de oxignio devem transpor uma srie de resistncias
transferncia antes de serem utilizadas pela clula. O diagrama da Figura 11.2 apresenta oito etapas
envolvidas no transporte de oxignio do interior da bolha de gs at o interior da clula:
i) transferncia do interior da bolha para a interface gs-lquido;
ii) movimento atravs da interface gs-lquido;
iii) difuso atravs do filme de lquido estagnado em torno da bolha;
iv) transporte atravs da massa de lquido;
v) difuso atravs do filme de lquido estagnado em torno da clula;
vi) movimento atravs da interface lquido-clula;
vii) se as clulas estiverem em flocos ou em partculas slidas, difuso atravs do slido at a clula
individual;
viii) transporte atravs do citoplasma ao stio de reao.
Se as clulas esto suspensas individualmente no meio de cultura, o passo (vii) desaparece.
Quando as clulas esto dispersas no meio de cultura e este possui mistura perfeita, a maior
resistncia transferncia de oxignio o filme lquido em torno da bolha. Conseqentemente, o transporte
Semestre 2006/2 53
de oxignio da bolha at a clula controlado pelo passo (iii) e a taxa de transferncia de massa pode ser
calculada a partir da Equao 11.1 (Doran, 1995).
Figura 11.2: Etapas da transferncia de oxignio da bolha de ar para a clula (Doran, 1995. p. 200).
Uma expresso para a taxa de transferncia de oxignio do gs para o lquido dada pela equao
(11.1).
(
N = k L a C* C ) (11.1.)
onde N a velocidade de transferncia de oxignio por unidade de volume de fluido (mol.m-3.s-1), kL o
coeficiente de transferncia de massa da fase lquida (m.s-1), a a rea da interface lquido-gs por unidade
de volume do fluido (m2.m-3), C a concentrao de oxignio no meio de cultura (mol.m-3), e C* a
concentrao de oxignio no meio de cultura em equilbrio com a fase gasosa (mol.m-3), tambm denominada
solubilidade do oxignio no meio de cultura.
Caso o sistema no esteja em regime permanente, ou seja, est ocorrendo uma variao de O2
dissolvido no meio de cultivo, N pode ser expresso por dC/dt e a equao 11.1 fica:
dC
dt
(
= kLa C * C ) (11.2.)
Esta equao, apesar de extremamente simples permite uma compreenso exata de todas as formas
disponveis para o controle da concentrao de oxignio dissolvido em um certo meio.
11.2 Mtodo dinmico para o clculo do kLa

Em um meio lquido mergulha-se um eletrodo de O2 dissolvido. Aps o eletrodo calibrado, retira-se
todo o O2 dissolvido borbulhando-se gs N2, por exemplo. A seguir inicia-se a aerao e a agitao nas
condies que se pretende calcular o kLa. O sinal do eletrodo aumentar at atingir 100%. Nesta condio, a
equao 11.2 pode ser integrada conhecendo-se a condio inicial (t0 = 0 e C0 = 0):
dC
= k L a dt
C C
*
ou
C
ln 1 * = k L a t (11.3.)
C
Semestre 2006/2 54
ou ainda:
C
*
= e k L at (11.4.)
C
Da equao 11.3 percebe-se que plotando-se os valores de ln1 C contra o tempo obtm-se uma
C *
reta cujo coeficiente angular -kLa. Ainda, no necessrio conhecer o valor de C*, apenas a frao C/C* que
obtida de um eletrodo calibrado entre 0 e 100%.
11.3 Respirao microbiana

A velocidade especfica de respirao dos microrganismos pode ser definida como:
1 dO2
QO2 =
X dt (11.5.)
onde QO2 velocidade especfica de respirao (g O2 / (g cl . h)). A grandeza QO2 introduz a caracterstica
biolgica do sistema em questo, pois depende do microrganismo emprega do, das condies de fermentao
(pH, temperatura) e do meio de cultivo.
O valor de QO2 para um dado microrganismo funo da concentrao de O2 dissolvido no meio de
cultivo, e segue uma equao do tipo Monod, ou seja:
C
QO2 = QO2 mx (11.6.)
K O2 + C
onde QO2 mx o valor mximo de QO2 e K O2 a constante de saturao da equao de Monod para o O2. A
Figura 11.3 mostra a variao de QO2 com a concentrao de O2 dissolvido, onde observa-se a existncia de
uma dada concentrao de O2, denominada crtica, acima da qual o valor de QO2 constante e mximo. Um
sistema adequadamente dimensionado de aerao/agitao deve permitir a mxima capacidade respiratria
dos organismos, mantendo a concentrao de O2 acima da crtica a fim de que este no seja limitante. Alguns
valores de Ccrit so mostrados na Tabela 11.1.
Figura 11.3: Representao esquemtica da variao de QO2 com a concentrao de O2 dissolvido.

Semestre 2006/2 55
Tabela 11.1: Valores de concentrao crtica de oxignio para alguns microrganismos
Microrganismo Temperatura (oC) Ccrit (mg/L)

Escherichia coli 37,8 0,26
Serratia marcenscens 31,0 0,48
Levedura 34,8 0,15
P chrysogenum 24,0 0,70
30,0 0,29
Arpergillus oryzae 30,0 0,64
Como se pode observar, os valores de Ccrit encontram-se entre 0,3 e 0,7ppm, abaixo de 10% da
concentrao de saturao do O2 no ar atmosfrico a 1 atm e 35oC.
Clulas crescendo a altas velocidades especficas de crescimento possuem uma alta velocidade
consumo de substrato e tambm uma alta velocidade de respirao. Desta forma natural que exista uma
relao entre a velocidade especfica de crescimento da cultura () e a velocidade especfica de respirao,
conforme a equao abaixo:
1
QO2 = mO2 + (11.7.)
YO2
onde mO2 o coeficiente de manuteno das clulas para o O2 (g O2 / (g cl . h)) e YO2 o fator de converso
de O2 para clulas (g cl / g O2). Foram determinados valores de 2mmolO2/(g cl . h) para mO2 e 1,55 g cl /
g O2 para YO2 de Aspergillus awamori NRRL3112.
11.4 Anlise conjunta da transferncia e do consumo do oxignio

Seja um biorreator aerado em estado estacionrio. Em dado instante corta-se a entrada de ar do
sistema e monitora-se a queda da concentrao de oxignio no meio de cultura. Aps um tempo de 20 a 60
segundos, abre-se novamente a entrada de ar do sistema.
Durante este perodo de tempo pode-se considerar que no h formao de biomassa no biorreator,
desta forma a variao da concentrao de oxignio descrita pela equao abaixo:
dC
dt
( )
= k L a C * C Q O2 X (11.8.)
Cessando o suprimento de oxignio, temos que o primeiro termo do lado direito da Equao (11.8)
torna-se zero, resultando em:
dC
= QO2 X (11.9.)
dt
Deste modo, QO2 X pode ser facilmente obtido atravs da inclinao da curva do grfico C contra
t, mostrado na Figura 11.4. Dividindo-se o valor de QO2 X pela biomassa correspondente, a taxa especfica
de consumo de oxignio, QO2 , pode ser calculada.
A aerao reassumida antes que a concentrao de oxignio dissolvido atinja um valor crtico (em
torno de 5 a 10% da saturao), e a Equao (11.8) pode novamente ser utilizada para descrever o processo.
Rearranjando os termos da Equao (11.8) obtemos:
Semestre 2006/2 56
dC * QO2 X
= C C k L a
(11.10.)
dt kLa
Q O2 X
Para um sistema particular, C* e podem ser considerados constantes e agrupados:
kLa
QO X
C * 2 = Ci
(11.11.)
kLa
onde Ci a concentrao de oxignio dissolvido original do sistema em estado estacionrio.
Substituindo a Equao (11.11) na Equao (11.10), obtemos:
= k L a(Ci C )
dC
dt (11.12.)
integrando a Equao (11.12), o kLa pode ser isolado e calculado:
C C0
ln i
Ci C
k La =
t t0 (11.13.)
onde Ci, C0 e C so diferentes valores de concentrao de oxignio dissolvido mostrados na Figura 11.4.
Figura 11.4: Curva de variao de concentrao de oxignio dissolvido para clculo de kLa e q O2 conforme o
mtodo dinmico. Fonte: Ayub, 1991, p. 60.
11.5 Sistemas para a transferncia de oxignio

Os principais sistemas de aerao de reatores lquidos so mostrados na Figura 11.5. Os sistemas
(1) e (2) utilizam uma aerao superficial, e so encontrados em lagoas de tratamento biolgico de
efluentes e em reatores com clulas imobilizadas, respectivamente. Os sistemas (3) e (4) realizam a
transferncia de oxignio para o meio por borbulhamento de ar, sendo que o biorreator (4), conhecido como
air-lift, possuem bons coeficientes de transferncia de O2 sem a necessidade de agitao, logo com uma baixa
Semestre 2006/2 57
tenso de cisalhamento sobre as clulas. Os reatores (5) e (6) so os aerados de tanque agitado. O biorreator
(5) conhecido como padro e corresponde a 93% das aplicaes industriais. O biorreator (6), conhecido
como draugth-tube o sistema que causa o maior cisalhamento celular.
O biorreator tipo tanque agitado e aerado (padro), apresenta altura do lquido igual ao dimetro do
tanque e agitado por um impelidor dom 6 ps planas que apresentam dimetro igual a 1/3 do dimetro do
tanque. A fim de evitar a formao de vrtice, utiliza-se um sistema de 4 chicanas, diametralmente opostas,
com largura de 1/10 ou 1/12 do dimetro do tanque.
Figura 11.5: Sistemas diversos de transferncia de oxignio em biorreatores.
11.6 Transferncia de oxignio em meios agitados e aerados
11.6.1 Agitao de lquidos newtonianos

O objetivo de uma operao de agitao ou mistura pode ser a homogeneizao da soluo, manter
slidos em suspenso ou tornar mais eficientes os transportes de calor e massa. Estes objetivos podem ser
atingidos atravs da agitao, ou seja, da transmisso de potncia (energia/tempo) ao lquido.
Quando uma turbina gira dentro de um reator com lquido, como o exemplificado na Figura 11.6, a
capacidade desta turbina de transmitir potncia ao lquido depende de diversos fatores, como mostra a anlise
dimensional a seguir:
P NDi2 N 2 Di H L DT WB
NP = = f N
Re = , N = , , , (11.14.)
N 3 Di5 Di Di Di
Fr
g
onde: NP = nmero de potncia (adimensional)
NRe = nmero de Reynolds (adimensional)
NFr = nmero de Froude (adimensional)
P = potncia transmitida na agitao (W)
N = freqncia de agitao (s-1)
= densidade do lquido (kg.m-3)
= viscosidade do lquido (kg.m-1.s-1)
Semestre 2006/2 58
g = acelerao da gravidade (m.s-2)

Di = dimetro do impelidor (m)
HL/Di , DT/Di, WB/Di = adimensionais ligados geometria do biorreator
HL = altura do coluna de lquido (m)
DT = dimetro do biorreator (m)
WB = largura da chicana (m)
C = distncia do impelidor ao fundo do biorreator (m)
Wi = altura da p da turbina (m).
Figura 11.6: esquema de um biorreator agitado com turbinas de ps planas.
O grfico da Figura 11.7 apresenta a relao entre o NP e o NRe para o impelidor tipo hlice e
para a turbina de disco com 6 ps planas (turbina Rushton) para tanques com as relaes padro conforme o
item anterior. Para esta situao tem-se que a equao 11.14 fica:
N P = f ( N Re ) (11.15.)
Na Figura 11.7 pode-se observar trs regies distintas: a regio de escoamento laminar (NRe <
10), uma regio de transio e a regio de escoamento turbulento (NRe > 104).
Na regio laminar tem-se que N P = k1 ( N Re ) ou seja:

1
P = k1 N 2 Di3 (11.16.)
na regio de escoamento turbulento tem-se que N P = k 2 , ou seja:
P = k 2 N 3 Di5 (11.17.)
Na regio de transio h uma tendncia queda do Np, o que interessante quando, durante o
cultivo, ocorre um aumento da viscosidade do meio. Assim, se o motor foi planejado para a regio turbulenta
no h risco de sobrecarga at o incio do escoamento laminar.
Para se calcular a potncia transmitida em sistemas geometricamente distintos do que foi
utilizado para as relaes acima, foi proposto um fator de correo para ser aplicado sobre a potncia
calculada a partir das equaes 11.16 e 11.17.
* *
DT H L
D Di
fc = i
DT H L
D Di
i
Semestre 2006/2 59
* *
onde T
D e H L so as relaes geomtricas da Tabela 11.1 e DT e H L so as
Di Di D Di
i
novas relaes geomtricas.
Quando se utilizam mais de um impelidor no eixo, se estes estiverem muito prximos um do
outro no ser obtida a mxima potncia de transferncia. Desta forma as seguintes relaes normalmente
so utilizadas para o nmero e a distncia entre os impelidores:
Di < Hi < 2Di (11.18.)
H L Di H 2 Di
> nmero de impelidores > L (11.19.)
Di Di
onde Hi a distncia entre os impelidores.
P NDi2
Figura 11.7: nmero de potncia N P = em funo do nmero de Reynolds N = para
N 3 Di5
Re
impelidor tipo hlice e Rushton.
11.6.2 Agitao de lquidos newtonianos submetidos aerao

Quando se tem bolhas de ar suspensas no lquido ocorre uma diminuio da densidade aparente
o que deve provocar uma diminuio da potncia transmitida ao lquido. A fim de estudar este tipo de
situao definiu-se um nmero adimensional chamado nmero de aerao (NA), definido como:
Q
NA = (11.20.)
NDi3
onde: NA = nmero de aerao
Q = vazo de ar (m3.s-1)
A Figura 11.8 mostra a relao entre a potncia transmitida ao lquido aerado em relao ao
no aerado (Pg/P) em funo do nmero de aerao.
A partir dos dados experimentais a seguinte equao foi proposta:
Semestre 2006/2 60
0 , 45
P 2 NDi3
Pg = 0,706 0,58 (11.21.)
Q
com as unidades no sistema internacional de unidades.
Q
Figura 11.8: Pg/P em funo do nmero de aerao N A = para um sistema de agitao com duas
NDi3
turbinas Rushton.
11.6.3 Transferncia de oxignio

Este subitem trata da relao entre a potncia transferida ao meio de cultura em um biorreator
aerado e o coeficiente de transferncia de oxignio. A equao emprica abaixo correlaciona a transferncia
de oxignio com a potncia cedida e a velocidade de aerao do sistema:

P
KV = K 3 g (Vs ) (11.22.)
V
onde: KV = coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio para uma soluo de sulfito de sdio;
K3 = constante que depende da geometria do sistema;
V = volume do lquido submetido aerao (m3);
Q
Vs = velocidade superficial do ar = (m/s);
S
Q = vazo de ar (m3/s);
2
DT
S = ;
4
, = constantes empricas.
Os coeficientes e variam de um sistema coalescente para um no-coalescente e com a escala
de trabalho, conforme a Tabela 11.2, a seguir.
Semestre 2006/2 61
Tabela 11.2: Coeficientes e da equao 11.22 conforme a escala de trabalho.
Volume do reator (m3) a sistema

0,005 0,95 0,67 no coalescente
0,5 0,6 - 0,7 0,67 no coalescente
50 0,4 - 0,5 0,50 no coalescente
0,002 - 2,6 0,4 0,50 coalescente
Semestre 2006/2 62
12 Escalonamento de biorreatores
O estudo da variao de escala de processos examina os problemas associados com a

transposio dos dados obtidos em equipamentos de escalas de laboratrio e piloto para a escala e produo
industrial.
O desenvolvimento tradicional de um bioprocesso normalmente executado em trs escalas:
- escala de bancada
- escala piloto
- escala industrial
Figura 12.1: Etapas do desenvolvimento de um processo produtivo, com as fases de obteno de dados e
instantes principais de tomadas de deciso.
Semestre 2006/2 63
12.1 Critrios para ampliao de escala

Os critrios para ampliao de escala basicamente so os listados a seguir:
- constncia da potncia do sistema no aerado por unidade de volume de meio (P/V)
- constncia do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa)
- constncia da velocidade na extremidade do impelidor (vtip)
- constncia do tempo de mistura (tm)
- constncia da capacidade de bombeamento do impelidor (FL/V)
- constncia do nmero de Reynolds (NRe)
- constncia da presso parcial ou concentrao de O2 dissolvido (C).
Princpios bsicos a ser considerados no aumento de escala de biorreatores:

1. Indentificar qual ou quais propriedades so importantes para otimizar a operao de um sistema agitado
(kLa, capacidade de bombeamento, cisalhamento).
2. Lembrar que os biorreatores grandes apresentam tempo de mistura maior (tm) e cisalhamento maior.
3. Para reaes qumicas homogneas, o consumo de potncia do sistema no aerado por unidade de volume
de meio (P/V) deve ser utilizado como critrio de aumento de escala.
4. No escalonamento de sistemas bifsicos (ar-lquido) como o dos cultivos aerbios, o kLa deve ser
utilizado preferencialmente como critrio de aumento de escala.
12.2 Comparaes entre os critrios de ampliao de escala
Tabela 12.1: Variao da freqncia de rotao (N) numa ampliao de escala

(V1 = 10L; V2 = 5.000L; ar = 0,3vvm)
Critrio para ampliao de escala N (rpm) (V = 5.000 L)

P/V 175,9
kLa (A = 0,5 e B = 0,5) 91,3
Cisalhamento (vtip) 88,2
tm* 1174,9
FL / V 700
NRe 11,1
*
NRe > 105
Tabela 12.2: Relao entre variveis em uma ampliao de escala (V1 = 60L; V2 = 7,5m3)
Relao entre variveis P/ V FL / V NDi NRe tm*

N2 / N1 0,34 1 0,2 0,04 1,5
(FL )2 (FL )1 42,7 125 25 5 187
P2 / P1 125 3125 25 0,2 10449
(P V )2 (P V )1 1 25 0,2 0,0016 83,6
(FL V )2 (FL V )1 0,34 1 0,2 0,04 1,5
(NDi )2 (NDi )1 1,7 5 1 0,2 7,5
(N Re )2 (N Re )1 8,6 25 5 1 37,4
(tm )2 (tm )1 2,7 1,3 3,8 0,089 1
* 5
NRe > 10
Semestre 2006/2 64
13 Esterilizao
Em muitos bioprocessos, a presena de microrganismos estranhos, genericamente denominados

contaminantes, pode levar a prejuzos considerveis. O grau de eliminao de contaminantes com o objetivo
de obter bons resultados depende de cada caso.
Em um processo podem ou devem ser esterilizados os equipamentos (biorreatores, tubulaes,
bombas, centrfugas, homogeneizadores, etc.), os meios de cultivo, o ar que entra nos biorreatores e as
embalagens finais.
A esterilizao engloba todos os procedimentos fsicos, mecnicos e qumicos utilizados para
destruir microrganismos contaminantes.
Os mtodos qumicos englobam o uso de xido de etileno, aldedos, gs-plasma de perxido de
hidrognio. Os mtodos fsicos compreendem a utilizao de calor e radiaes. Ainda podem ser utilizados
agentes esterilizantes e desinfetantes.
Terminologia:
Esterilizao: um processo fsico ou qumico que destri ou inativa todas as formas de vida
presentes em um determinado material atravs de agentes fsicos.
Desinfeco: um processo menos rigoroso de eliminao de microrganismos, objetivando
sobretudo a destruio dos microrganismos patognicos presentes, envolvendo normalmente o uso de um
agente qumico, temperatura ambiente ou moderada.
Antissptico: substncia que impede a proliferao de bactrias atravs da inativao ou destruio
das mesmas .
Assepsia: conjunto de mtodos utilizados com o intuito de impedir a entrada de microrganismos
em local que no os contenha .
13.1 Modos de atuao dos agentes esterilizantes

Calor mido:
A temperatura elevada associada com alto grau de umidade provoca a desnaturao das protenas.
Os carboidratos do meio de cultivo tambm sofrem alteraes, muitas vezes gerando produtos txicos.
O calor mido possui alta penetrao, destruindo esporos e bactrias em tempos bastante curtos.
tambm econmico e no deixa resduos txicos. Contudo no pode ser utilizado em solues que formam
emulses com a gua e possui ao corrosiva sobre alguns metais.
A esterilizao de biorreatores via calor mido normalmente ocorre via injeo de vapor no
equipamento. A esterilizao normalmente realizada a 121oC e 1 atm em tempos que variam entre 20
minutos a mais de 1 hora conforme a necessidade.
Calor seco:
Destri microrganismos atravs da oxidao de seus constituintes qumicos. utilizado para
vidrarias, metais e slidos resistentes ao calor. Ocorre em fornos ou estufas que atingem temperaturas
maiores do que 150oC. Contudo, a ausncia de umidade torna a transferncia de calor mais lenta e os
microrganismos mais resistentes. Desta forma o calor seco necessita de tempos mais longos para atingir o
grau de esterilizao desejado, cerca de 3 a 4 horas.
Radiao ultravioleta (UV):
Os efeitos letais esto associados mutagnese atravs de transformaes fotoqumicas nas bases
de pirimidinas no DNA. A reao principal a formao de ligaes cruzadas entre purinas adjacentes.
Tambm ocorrem dmeros citosina-timina, citosina-citosina e uracila-uracila (RNA). produzida por
lmpadas emissoras de radiao UV. Devido sua baixa penetrao somente utilizada para a esterilizao
de superfcies e do ar. O tempo de exposio necessrio da ordem de horas.
Semestre 2006/2 65
Radiao ionizante:
So as radiaes alfa (), beta (), gama (), raios X, raios catdicos, alm de prtons, nutrons e
eltrons de alta energia. Estas radiaes podem produzir radicais qumicos altamente reativos, como
perxidos e radicais livres, os quais podem alterar grupos qumicos e at quebrar fitas de DNA. Dentre estas
a radiao gama a mais importante.
A radiao gama em geral produzida por cobalto 60 ou csio 137, e possui um poder de
penetrao extremamente alto. Os materiais expostos radiao gama no guardam nenhum resqucio
radioativo, tornando a irradiao um mtodo seguro.
O bombardeio com radiao gama realizados em cmaras especiais que uma vez postas em
operao, no mais possvel impedir a emisso de radiao, de forma que estas cmaras operam de forma
contnua. Materiais como vidrarias, metais, alimentos, sementes, solo, ps, embalagens podem ser
submetidos este tipo de esterilizao.
Plasma de perxido de hidrognio:
O plasma, considerado um quarto estado da matria, definido como uma nuvem de ons, eltrons
e partculas neutras, altamente reativas. A gerao de um campo eletromagntico pela energia de
radiofreqncia produz a formao do plasma. Os radicais livres gerados no plasma de perxido de
hidrognio apresentam-se com cargas negativas e positivas, que excitados tendem a se reorganizar,
interagindo com molculas essenciais ao metabolismo e reproduo microbianos, ligando-se de maneira
especfica s enzimas, fosfolipdeos, DNA e RNA. Essa reao qumica extremamente rpida, viabilizando
o processo de esterilizao em curto espao de tempo.
indicado para esterilizao de artigos termossensveis. O ciclo de esterilizao ocorre em torno de
1 hora. compatvel com a maioria dos metais, plsticos, vidros, borrachas, acrlicos e incompatvel com
celulose e ferro. O produto final gua e oxignio, no oferecendo portanto toxicidade para os profissionais
e clientes.
xido de etileno (EtO):
um ter cclico que reage substituindo um tomo de H de grupos funcionais de protenas, cidos
nuclicos e outras molculas (radicais carboxil, amino ou sulfidril) pela molcula de EtO aberta (CH2CH2O-).
Esta reao causa a inativao destas molculas. O xido de etileno um gs inodoro, sem cor, inflamvel e
explosivo. A adio de estabilizantes como dixido de cloro ou clorofluorocarbonado reduz o risco de
exploso e de fogo. Vantagens: podem ser esterilizados materiais sem danific-los. Desvantagens: alto custo,
toxicidade, e tempo longo do ciclo.
Glutaraldedo:
O glutaraldedo reage como os grupamentos amina livres da camada de peptidioglicano na
superfcie das clulas, onde ocorrem reaes glutaraldedo-protenas, o que interfere no transporte de
aminocidos de baixo peso molecular. Em alguns microrganismos ocorre a aglutinao celular, devido
formao de ligaes intercelulares. indicado para desinfeco em alto nvel em artigos termossensveis
com tempo de exposio de 30 minutos em soluo a 2%. Tambm indicado como esterilizante, com o
tempo de exposio entre 8 e 10h. O produto sofre alteraes em temperaturas superiores a 25C. txico,
no biodegradvel, portanto deve ser manipulado em local ventilado e com uso de EPI.
Formaldedo:
Formaldedo um monoaldedo que existe como um gs solvel em gua. Embora tenha sido usado
durante muitos anos, seu uso foi reduzido com o aparecimento do glutaraldedo. Suas desvantagens
principais estavam relacionadas a menor rapidez de ao e carcinogenicidade. Embora tido como
carcinognico, isto foi demonstrado a altas doses de exposio.
Ao: ativo apenas na presena de umidade para formao do grupo metanol. Interage com
protenas, DNA e RNA. No entanto difcil especificar acuradamente seu modo de ao na inativao
bacteriana. Possui amplo espectro de ao, inclusive contra esporos.
Semestre 2006/2 66
Tem o mesmo mecanismo de ao semelhante ao do glutaraldedo. pouco ativo a temperaturas

inferiores a 20C, aumentando a atividade em temperaturas superiores a 40C. Em processo de desinfeco
ou esterilizao possui desvantagens, pois tem baixo poder de penetrao, distribuio no uniforme e alta
toxicidade que restringem o seu uso. O tempo de exposio deve seguir orientaes do fabricante: para
desinfeco utiliza-se soluo 4% volume-volume (v/v) por trinta minutos. Para esterilizao, tanto na
soluo alcolica a 8%, quanto para a soluo aquosa a 10%, o tempo mnimo de 18 horas.
lcoois:
Agem por desnaturao das protenas dos microrganismos e sua ao bactericida aumenta quando
hidratado. Possuem ao bactericida, fungicida e viruscida, porm no destroem esporos bacterianos.
lcool isoproplico: tem ao seletiva para vrus, mais txico e com menor poder germicida que o
lcool etlico.
lcool etlico (70%): a concentrao 77% (v/v) que corresponde a 70% em peso, tem baixa
toxicidade, indicado para desinfeco de nvel intermedirio ou mdio. Deve ser utilizado por frico, em
trs aplicaes, com secagem espontnea e tempo total de exposio de 10 minutos.
Compostos liberadores de cloro ativo:
Hipoclorito de sdio/clcio/ltio: Produto instvel, termossensvel, fotossensvel e inativado
rapidamente em presena de matria orgnica, o que diminui sua atividade rapidamente em recipientes claros
ou em altas temperaturas. Por ser corrosivo seu uso contra-indicado em artigos metlicos.
Efeitos adversos: os compostos inorgnicos liberadores de cloro ativo so txicos, irritantes de
pele, mucosa e rvore respiratria.
cido Peractico:
bactericida, fungicida, viruscida e esporicida. Promove a desnaturao de protenas e alterao na
permeabilidade da parede celular. Possui como vantagens manter-se efetivo em presena de matria orgnica
e no promover a formao de resduos txicos. Como desvantagens: corrosivo e instvel aps diludo. O
cido peractico ou peroxiactico, em baixas concentraes (0,001% a 0,02%) apresenta rpida ao contra
os microorganismos, incluindo os esporos.
13.2 Esterilizao de equipamentos e meios de cultivo por calor mido
13.2.1 Cintica de morte celular
13.2.2 Esterilizao em batelada de meios de cultivo

O meio de cultivo colocado dentro do biorreator e aquecido seguir. Deste modo o meio de
cultivo e o biorreator so esterilizados simultaneamente.
Formas de aquecimento:
- vapor passando por uma camisa ou serpentina de aquecimento
- injeo direta de vapor
- aquecimento eltrico do meio dentro do biorreator.
Perfil tpico de temperatura (Figura 13.1):
- aquecimento: durao de horas
- manuteno da temperatura: durao de minutos
- resfriamento: durao de horas
O clculo de um processo de esterilizao consiste em calcular o tempo de manuteno necessrio
para atingir um determinado nvel de destruio celular.
Esterilizao absoluta tempo infinito
Desta forma trabalha-se com probabilidade de contaminao. Por exemplo: Nf = 10-3 significa o
risco de sobrevivncia de 1 microrganismo em cada 1000 bateladas esterilizadas.
Semestre 2006/2 67
Figura 13.1:Perfil tpico de temperatura do meio de cultivo e evoluo da morte celular em uma
esterilizao em batelada (Fonte: Doran, 1997).
Curvas de aquecimento conforme o mtodo de aquecimento:

a) injeo direta de vapor (curva hiperblica, Figura 13.2):
hM& s t

M mC pT0
T = T0 1 + (13.1)
M&
1+ s t
Mm

b) aquecimento eltrico (curva linear, Figura 13.2):
Qt
T = T0 1 + (13.2)
M CT
m p 0
c) trocador de calor com vapor isotrmico (curva exponencial, Figura 13.2):

T T MUAt
T = Ts 1 + 0 s e m p
C
(13.3)
Ts

d) resfriamento com passagem de gua no isotrmica (Figura 13.2):

M& wC pwt
UA

1 e
M& wC pw
T0 Tci M mC p

T = Tci 1 + e
(13.4)
Tci

onde:
A = rea de transferncia de calor;
Cp = calor especfico do meio de cultivo;
Cpw = calor especfico da gua;
h = diferena especfica de entalpia entre o vapor e o meio;
Mm = massa inicial de meio de cultivo ;
M& s = vazo mssica de vapor;
M& = vazo mssica de gua;
w
Q = velocidade de transferncia de calor;

Semestre 2006/2 68
T = temperatura;
T0 = temperatura inicial do meio de cultivo;
Tci = temperatura inicial da gua de resfriamento;
Ts = temperatura do vapor;
t = tempo;
U = coeficiente global de transferncia de calor.
120
manuteno da temperatura
100
80
temperatura (oC)
60
40 injeo direta de vapor

aquecimento eltrico
20 transferncia de calor de vapor isotrmico
resfriamento
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tempo (horas)
Figura 13.2: Curvas de aquecimento e resfriamento em uma esterilizao em batelada.
13.2.3 Esterilizao contnua de meios de cultivo

Na esterilizao contnua de meios de cultivo consegue-se trabalhar com processos de alta
temperatura e tempo de exposio curtos, o que reduz significativamente a destruio de componentes do
meio de cultivo, e levando a um alto grau de destruio de microrganismos. Entre as vantagens da
esterilizao contnua em relao esterilizao em batelada esto a economia de vapor (a esterilizao
contnua consome entre 20% e 25% do vapor consumido pelo processo em batelada) e o tempo reduzido de
processo, pois o aquecimento e o resfriamento so quase instantneos. As Figuras 13.3 e 13.4 mostram
configuraes tpicas de equipamentos de esterilizao contnua e os seus respectivos perfis de temperatura, e
as Figuras 13.5 e 13.6 mostram trocadores de calor de placa e tubulares, respectivamente, utilizados para o
aquecimento e o resfriamento dos meios de cultivo nos processos de esterilizao contnua.
meio de cultivo
(a) resfriador flash (b) seo de manuteno
da temperatura
trocador
de calor
trocador meio de
seo de manuteno cultivo
de calor
da temperatura estril
meio de cultivo
trocador
meio de cultivo estril de calor
injeo de vapor
biorreator biorreator
vapor
Figura 13.3: Equipamentos para esterilizao contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash;
(b) transferncia de calor utilizando trocadores de calor.
Semestre 2006/2 69
(a) (b)
Figura 13.4: Curvas de aquecimento, manuteno da temperatura e resfriamento durante uma esterilizao
contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferncia de calor utilizando trocadores
de calor.
Figura 13.5: Trocador de calor de placas (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995).
Figura 13.6: Trocador de calor tubular (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995).
Semestre 2006/2 70
14 Bibliografia
14.1 Livros
Bailey J E, D F Ollis. Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw-Hill Book Company, 1986.

Borzani W, W Schimidell, U A Lima, E Aquarone. Biotecnologia Industrial Vol. 1 Fundamentos.
Editora Edgar Blcher Ltda, 2001.
Doran P M. Bioprocess Engineering Principles. Academic Press, 1997.
Lehninger A L, D L Nelson, M M Cox. Principles of Biochemistry. Worth Publishers, 1997.
Lima U A, E Aquarone , W Borzani, W Schimidell. Biotecnologia Industrial Vol. 3 Processos
fermentativos e Enzimticos. Editora Edgar Blcher Ltda, 2001.
Schimidell W, U A Lima, E Aquarone, W Borzani. Biotecnologia Industrial Vol. 2 Engenharia
Bioqumica. Editora Edgar Blcher Ltda, 2001.
Stephen D, Flickinger M. Encyclopedia of Bioprocess Technology. John Wiley, 1999.
14.2 Artigos Cientficos
Bhugaloo-Vial P, W Grajek, X Dousset, P Boyaval. Continuous bacteriocin production with high cell density
bioreactors. Enzyme and Microbial Technology 21 (1997) 450-457.
Ellaiah P, T Prabhakar, B Ramakrishna, AT Taleb, K Adinarayana. Production of lipase by immobilized
cells of Aspergillus niger. Process Biochemistry 39 (2004) 525-528.
Fane AG. Membrane bioreactors: design & operational options. Filtration & Separation 39 (2002) 26-29.
Gao H, T Tan. Fed-batch fermentation for ergosterol production. Process Biochemistry 39 (2003) 345-350.
Judd S. Submerged membrane bioreactors: flat plate or hollow fibre? Filtration & Separation 39 (2002)
30-31.
Kim B S, S C Lee, S Y Lee, Y K Chang, H N Chang. High cell density fed-batch cultivation of Escherichia
coli using exponential feeding combined with pH-stat. Bioprocess and Biosystems Engineering 26
(2004) 147-150.
Kourkoutas Y, A Bekatorou, IM Banat, R Marchant, AA Koutinas. Immobilization technologies and support
materials suitable in alcohol beverages production: a review. Food Microbiology 21 (2004) 377-397.
Lesjean B, S Rosenberger, JC Schrotter, A Recherche. Membrane-aided biological wastewater treatment: an
overview of applied systems. Membrane Technology 2004 (2004) 5-10.
Melin T, B Jefferson, D Bixio, C Thoeye, W De Wilde, J De Koning, J van der Graaf, T Wintgens.
Membrane bioreactor technology for wastewater treatment and reuse. Desalination 187 (2006) 271-282.
R Amutha, P Gunasekaran. Production of ethanol from liquefied cassava starch using co-immobilized cells
of Zymomonas mobilis and Saccharomyces diastaticus. Journal of Bioscience and Bioengineering 92
(2001) 560-564
Wendhausen R, A Fregonesi, PJS Moran, I Joekes, JR Rodrigues, E Tonella, K Althoff. Continuous
fermentation of sugar cane syrup using immobilized yeast cells. Journal of Bioscience and
Bioengineering 91 (2001) 48-52.
Yang W, N Cicek, J Ilg. State-of-the-art of membrane bioreactors: Worldwide research and commercial
applications in North America. Journal of Membrane Science 270 (2006) 201-211.
Semestre 2006/2 71
14.3 Bibliografia complementar
Al-Masry W A. Effects of antifoam and scale-up on operations of bioreactors. Chemical Engineering and
Processing 38 (1999) 197-201.
Bellon-Maurel V, O Orliac, P Christen. Sensors and measurements in solid state fermentation: a review.
Process Biochemistry 38 (2003) 881-896.
Cabezas Jr H. Theory of phase formation in aqueous two-phase systems. Journal of Chromatography B
680 (1996) 3-30.
Durand A. Bioreactor designs for solid state fermentation. Biochemical Engineering Journal 13 (2003)
11312.
Gogate P R, A A C M Beenackers, A B Pandit. Multiple-impeller systems with a special emphasis on
bioreactors: a critical review. Biochemical Engineering Journal 6 (2000) 109144.
Komives C, R S Parker. Bioreactor state estimation and control. Current Opinion in Biotechnology 14
(2003) 468-474.
Leib T M , C J Pereira, J Villadsen. Bioreactors: a chemical engineering perspective. Chemical Engineering
Science 56 (2001) 5485-5497.
Liu H, R Ramnarayanan, B E Logan. Production of electricity during wastewater treatment using a single
chamber microbial fuel cell. Environmental and Science Technology (2004) in press.
Mitchell D A, O F von Meien, N Kriege. Recent developments in modeling of solid-state fermentation: heat
and mass transfer in bioreactors. Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 137147.
Ogez J R, J C Hodgdon, M P Beal, S E Builder. Downstream processing of proteins: recent advances.
Biotechnology Advances 7 (1989) 467-488.
Pandey A. Solid-state fermentation Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 8184.
Raghavarao K S M S, T V Ranganathan, N G Karanth. Some engineering aspects of solid-state fermentation
Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 127135.
Rito-Palomares M. Practical application of aqueous two-phase partition to process development for the
recovery of biological products. Journal of Chromatography B 807 (2004) 311.
Sweere A P J, K Ch A M Luyben, N W F Kossen. Regime analysis and scale-down: tools to investigate the
performance of bioreactors. Enzyme and Microbial Technology 9 (1987) 386-398.
Yang C, X D Chen. A class of simple models of time-dependent plasmid stability in a continuous
fermentation process. Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 6367
Zhang Z, M Moo-Young, Y Chisti. Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae.
Biotechnology Advances 14(4) (1996) 401-435.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CINCIAS E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

BIOENGENHARIA PARA ENGENHARIA QUMICA

Profa Rosane Rech

1 Introduo Engenharia de Bioprocessos................................................................................................7

10.2 Substratos: caractersticas e composio: .......................................................................................47

Figura 1.1: Passos no desenvolvimento de um processo biotecnolgico (Doran, 1997). .............................10

Figura 8.5: Produtividade de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-

Tabela 1.1: Estgios do desenvolvimento cronolgico dos processos biotecnolgicos..................................7

1 Introduo Engenharia de Bioprocessos

1.2 Histrico do desenvolvimento dos bioprocessos

Tabela 1.1: Estgios do desenvolvimento cronolgico dos processos biotecnolgicos

1.3 Produtos provenientes de processos biotecnolgicos

Tabela 1.2: Principais produtos provenientes de processos biotecnolgicos

Renina Mucor miehei ou leveduras recombinantes 1 104

Produtos a serem desenvolvidos em processos biotecnolgicos:

Papel do engenheiro qumico na engenharia de bioprocessos:

Figura 1.1: Passos no desenvolvimento de um processo biotecnolgico (Doran, 1997).

1.4 Processos fermentativos industriais

Extrao e purificao do(s) produto(s) - Aps a converso biolgica, o produto ou produtos

Figura 1.2: Fluxograma de um processo fermentativo (Fonte: Schmidell et al., 2001)

2.1 Distribuio dos organismos vivos

Figura 2.1: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de

Figura 2.2: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de

2.2 Morfologia e estrutura

2.2.1 Bactrias (procariotos)

Figura 2.3: Representao esquemtica de uma bactria (Fonte: Lehninger, 1997).

Citoplasma: solubiliza sais minerais, aminocidos, pequenas molculas, protenas e acares, e

Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Lactobacillus acidophilus Propionibacterium acne

Figura 2.4: Diferentes tipos de bactrias.

2.3 Nutrio microbiana

2.3.1 Consideraes gerais

2.3.2 Requisitos Nutricionais

2.3.2.1 Fontes de material plstico

Os micronutrientes so necessrios em concentraes da ordem de miligramas por litro de cultura.

2.4 Fatores fsico-qumicos

Figura 2.7: Efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula.

A influncia da temperatura no crescimento , em ltima anlise, o reflexo do efeito da temperatura

Note-se, que a faixa de temperatura em que um microrganismo se desenvolve otimamente muito

2.4.3 Presso Osmtica

2.5 Meios de Cultura

2.6 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

Caractersticas desejveis em microrganismos industriais:

Caractersticas desejveis nos meios de cultivos:

3 Biorreatores e Processos Fermentativos

Denominam-se biorreatores, reatores bioqumicos ou reatores biolgicos os reatores

3.1 Classificao dos biorreatores

Tabela 3.1: Classificao geral dos biorreatores.

CLASSIFICAO DOS BIORREATORES

1. Reatores em fase aquosa (fermentao submersa):

Fonte: Schmidell et al., 2001

A Figura 3.1 mostra alguns tipos de configuraes de biorreatores.

3.2 Formas de conduo de um processo fermentativo:

Caractersticas dos cultivos descontnuos:

4.2 Meio de cultura

4.3 Cintica de um cultivo em batelada

Parmetros de um processo biolgico:

lactase (UONPG/mg cl)

acares totais (g/l) / etanol (g/l)

Figura 4.2: Curvas de ajuste dos resultados de uma determinada fermentao.

4.3.1 Cintica de crescimento celular

Figura 4.3: Curva de crescimento em reator batelada (Fonte: Doran, 1995).

Fase de acelerao: a fase de transio em que se observa o incio da reproduo microbiana.