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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
1 INTRODUCCIN ................................................................................................................... - 4 -
2 EL CROMATGRAFO LQUIDO BSICO ....................................................................... - 6 -
2.1 VOLUMEN EXTRA EN COLUMNA(V0) .......................................................................................... - 9 -
2.2 CRITERIOS PARA UN MANTENIMIENTO LGICO .................................................................... - 11 -
2.3 REGLAS DE ORO EN EL DIAGNSTICO DE AVERAS ............................................................... - 12 -
2.4 PROBLEMAS TPICOS EN HPLC ............................................................................................. - 12 -
3 LA FASE MVIL .................................................................................................................. - 14 -
3.1 COMPATIBILIDAD DEL DISOLVENTE Y EQUILIBRADO DEL SISTEMA ...................................... - 14 -
3.2 PREPARACION DE LA FASE MOVIL.............................................................................................-19
3.3 DESGASIFICACIN DE LA FASE MVIL .................................................................................. - 33 -
3.4 FILTRACIN DE LA FASE MVIL ........................................................................................... - 40 -
4 SISTEMAS DE BOMBEO .................................................................................................... - 46 -
4.1 FUNCIONES DE LA BOMBA .................................................................................................... - 46 -
4.2 BOMBA RECPROCA DE PISTN SIMPLE ................................................................................ - 47 -
4.3 LA BOMBA RECPROCA DE DOBLE PISTN ........................................................................... - 49 -
4.4 LA BOMBA BINARIA DE GRADIENTE ..................................................................................... - 50 -
4.5 LA BOMBA CUATERNARIA DE GRADIENTE ........................................................................... - 51 -
4.6 FORMACIN DE GRADIENTES Y TIEMPO MUERTO (DWELL-TIME) .................................... - 52 -
4.7 INCIDENCIAS DE LA BOMBA .................................................................................................. - 55 -
TUTORIAL 1 ................................................................................................................................... - 61 -
5 INYECTORES ............................................................................................................................. - 65 -
5.1 COMPONENTES DEL SISTEMA DE INYECCIN ........................................................................ - 65 -
5.2 AUTOMUESTREADORES ......................................................................................................... - 71 -
5.3 INCIDENCIAS DEL AUTOMUESTREADOR ................................................................................ - 76 -
6 COLUMNAS ................................................................................................................................ - 86 -
6.1 LIMPIEZA, PURGA Y ALMACENAMIENTO DE LA COLUMNA ................................................... - 86 -
6.2 INCIDENCIAS DE LA COLUMNA........................................................................................................................-90-
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
1 Introduccin
El objetivo de esta seccin es:
Incidencias y Mantenimiento
Buenas prcticas de mantenimiento para;
Fase Mvil
Bomba
Sistemas de Inyeccin
Columnas
Detectores
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Botellas de Disolvente
Los disolventes que conforman la fase mvil estn contenidos en botellas
que generalmente se encuentran en la parte superior del sistema HPLC.
Dicha disposicin mejora su suministro, ya que se consigue un descenso
natural de la fase lquida por efecto sifn bajo influencia de la gravedad.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Desgasificador
Bomba HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Automuestreador
Columna
Detector
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Perspectiva Sintomtica
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Lnea de Base
Picos
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
3 La Fase Mvil
El objetivo de esta seccin es;
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Ejemplo de una lnea de base con deriva (figura superior) y una lnea de
base errtica (figura inferior) que pueden verse en un sistema no
equilibrado
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Fase mvil
Elimina de la columna todos los analitos retenidos.
H2O
Cualquier tampn usado debe ser reemplazado solo con agua, por
ejemplo, en una separacin isocrtica con 50:50 MeOH:50mM de
KH2PO4, entonces los 50mM de KH2PO4 deben ser intercambiados por
H2O y el sistema deber ser purgado adecuadamente.
H2O
Retirar la columna del sistema y purgar solo con H2O al 100% para
eliminar todas las posibles trazas de sales tampn.
Isopropanol
Isopropanol:Hexano (u otros disolventes no localizadores(*)) 50:50
Elucin en Fase Normal
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
10
O
9
R C O
8 H
7
Weakly Basic
6
k 5
4 Weakly Acidic
3
2
O
1
R C
0 O
2 4 6 8
pH = pK pH
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Fuerza Tamponadora
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Cualquier pesada estar sujeta a errores que deben ser minimizados para
asegurar la menor desviacin posible en la cuantificacin final obtenida. Se
conseguirn mnimos errores siguiendo los siguientes criterios:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Es decir, para una balanza de cuatro cifras (de lectura 0.0001g) se tendr
una MAQ igual a:
Balanza de 6 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1mg
Balanza de 4 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 100mg Balanza de 3 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1g
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Fuentes de Deriva
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Efectos Estticos
Muestras Higroscpicas
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Muestras Voltiles
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Efectos de la Temperatura
El pH Metro y el Ajuste de pH
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Determinacin del pH
Un electrodo de pH.
Un electrodo de referencia.
Un pH metro de alta impedancia.
Electrodo de Referencia
Electrodo de pH
Electrodos de pH Combinados
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Electrodo de pH
Combinado ROSS
Bulbo detector de pH
El pH-metro
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Soluciones Tampn
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60 5.40 2.72
* 40mL de H2O llevados hasta 100mL con 60mL MeOH, Calculado el k'
** 60mL de MeOH llevados hasta 100mL con 40mL H2O, Calculado el k'
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Una burbuja que entra en la columna forzar su recorrido a travs del lecho
de relleno de la fase estacionaria, provocando la formacin de canales.
Dicha canalizacin disminuye rpidamente el rendimiento de la columna ya
que los analitos son capaces de atravesar la columna por dichos canales, lo
que se traduce en un menor tiempo de retencin sobre la fase estacionaria,
saturndose rpidamente dichos huecos por molculas de analito.
Tal efecto conduce generalmente a la formacin de frentes en la forma de
los picos cromatogrficos.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Mtodos de Desgasificacin
Cuando se est usando el borboteo por helio hay que ser consciente de los
potenciales cambios que pueden tener lugar en la composicin de la fase
mvil debido a la volatilidad selectiva de cualquier aditivo de la fase mvil,
p.ej., cido Trifluoroactico (TFA).
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En discontinuo
Incidental
Desgasificacin en lnea
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Ultrasonidos
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Crecimiento microbiolgico
Rango del pH
cido clorhdrico
cidos inorgnicos y cidos fuertes
Haluros Bsicos (Cloruro de Sodio, Ioduro de Litio)
Tetracloruro de Carbono con 2-propanol o THF
Agentes acomplejantes (EDTA, cido ctrico, cido actico)
Si se usan los compuestos anteriores ser necesario un mantenimiento ms frecuente del HPLC.
Cuando se usen, al finalizar el anlisis la bomba u otros componentes del HPLC deben ser purgados a
fondo.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4 Sistemas de bombeo
El objetivo de esta seccin es:
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Principio de Operacin
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Principio de Operacin
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Efectos de Cavitacin
Durante la mezcla de disolventes en la vlvula proporcional pueden
generarse burbujas. Esto es debido a que los gases disueltos tienen
menor solubilidad en la mezcla final que en los solventes iniciales.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
No sustituir la frita puede dar como resultado una lnea de base errtica
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El material del sello del Pistn puede ser arrastrado hasta bloquear la frita
y la parte superior de la columna analtica. Los bloqueos en este punto
retrasan la entrada de los analitos en la columna, produciendo picos no
uniformes con hombros. Este tipo de picos tambin pueden originarse por
otro tipo de anomalas, pero una frita de columna bloqueada, a menudo
provocar hombros en todos los picos cromatogrficos
Una frita de Columna bloqueada por restos del sello de los pistones
produciendo picos con hombro
Pistn y Sellos
Los sellos del Pistn estn diseados para desgastarse con el uso, siendo su
vida til muy dependiente del tipo y de la concentracin de las fases
mviles tampn que se utilicen.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Cualquier cambio del sello del pistn deber implicar una inspeccin visual
del mismo, ya que si existen araazos en la superficie del pistn, pueden
llevar prematuramente al fallo del nuevo sello reemplazado. Antes de la
inspeccin del pistn se deben limpiar los posibles depsitos de sales,
principalmente los restos de los tampones o del sello, utilizando un trapo
limpio, sin pelusas, empapado con una mezcla 1:1 de H2O:MeOH , y solo en
una direccin , desde la base hacia el extremo.
Luego, lo examinaremos con luz brillante y con la ayuda de una lupa para
verificar que no hay presente ningn araazo o estras.
Los sellos del Pistn estn diseados con frecuencia para deformarse con el
fin de ajustarse al pistn con el que estn emparejados. En consecuencia es
posible que haya que sustituir el pistn y el sello al mismo tiempo.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Vlvulas Antirretorno
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 1
Pregunta 1
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 3
Pregunta 1
Observaciones:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 4
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5 Inyectores
El Objetivo de esta seccin es:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5.2 Automuestreadores
Los automuestreadores son ampliamente utilizados en los laboratorios de
anlisis para aumentar el n de muestras analizadas, mejorar la precisin,
eliminar la necesidad de que haya personal presente para hacer las
inyecciones manuales y reducir los costes laborales asociados al anlisis
rutinario.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Load
Position
Inject
Position
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Load
Position
Wash Inject
Step Position
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El volumen mximo que puede inyectarse es funcin del tamao del loop
integrado, tpicamente 100L. Los fabricantes ofrecen tambin una
funcin de multi-extraccin (multidraw option) para compensar esta
limitacin en el volumen de inyeccin. Cuando se emplea esta opcin se
permite que varios volmenes de 100L sean combinados hasta un mximo
de 1.400mL aumentando as el volumen de inyeccin y ayudando al anlisis
de trazas.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Posicin de
Inyeccin
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La aguja de muestra
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El Rotor Seal
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Fase Mvil
La mejor situacin posible es que el disolvente de la muestra y la fase mvil
sean iguales, tanto en poder de elucin como en pH. En esta situacin,
debido a la homogeneidad de disolventes, no hay que preocuparse por los
efectos de dilucin.
Sin embargo, el volumen de inyeccin es limitado. La contribucin del
volumen de inyeccin al ensanchamiento del pico cromatogrfico puede
determinarse con la siguiente ecuacin:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Problemas Mecnicos
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Efecto Memoria
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Fugas
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
6 Columnas
Los objetivos de esta seccin son:
Purga de la Columna
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Almacenamiento de la Columna
1. Sustituya la fase mvil que contiene el tampn por H2O, y cambie a una
composicin idntica de H2O: orgnico a la utilizada en el mtodo de
separacin original. Esta etapa limpia de forma muy eficiente la
columna y el sistema dejndolos libres de cualquier sal de los tampones
que pudiera precipitar.
Por ejemplo, Si la fase mvil es 50mM KH2PO4 y Acetonitrilo 60:40
(v/v), sustituiremos el 60% de tampn KH2PO4 con Agua purgando
abundantemente.
Se recomienda utilizar tpicamente 10 volmenes de columna, aunque
si se han empleado reactivos formadores de pares de iones, pueden ser
necesarios de 30 a 50 volmenes para asegurar la limpieza correcta.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Este hecho tambin puede observarse cuando se utiliza una misma columna
con diferentes mtodos y analitos. En este caso pudiera ser necesario
realizar varias inyecciones de acondicionamiento (priming injections) con
el nuevo analito para llegar a conseguir una cromatografa reproducible. Los
tiempos de equilibrado de la columna debern a menudo aumentarse para
adecuar la columna a los cambios en la selectividad.
Filtros de Lnea
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Guarda Columnas/Discos
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Sustitucin de la Columna
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Trimetilclorosilosano (TMCS)
Hexametildisilazano (HMDS)
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Un nico pico con cola tambin podra producirse por un pequeo pico
eluyendo inmediatamente despus del pico cromatogrfico de inters. La
posibilidad de que esto ocurra es la razn primordial por la que las colas de
pico nunca deben ignorarse. Como se describa en el apartado
desdoblamiento de picos y hombros, podemos confirmar la presencia de
un interferente cambiando la longitud de onda de deteccin, o mejorar la
resolucin de la separacin empleando una columna de mayor eficiencia
p.ej. una columna ms larga o empaquetada con partculas de menor
tamao.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Un nico pico que muestre frente tambin puede deberse a un pequeo pico
que eluya justo antes del pico cromatogrfico de inters. Esta posibilidad es
la principal razn por la que un pico con frente nunca debe ser ignorado.
Como se describa en el apartado desdoblamiento de picos y hombros,
podemos confirmar la presencia de un interferente cambiando la longitud de
onda de deteccin, o mejorar la resolucin de la separacin empleando una
columna de mayor eficiencia p.ej. una columna ms larga o empaquetada
con partculas de menor tamao.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 2
Pregunta 1
Usando la tabla siguiente enumere cinco partes del Automuestreador de
Loop completo que pueden requerir mantenimiento rutinario.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
A continuacin se muestran dos cromatogramas que pueden o no darnos
informacin sintomtica del status operacional del sistema HPLC.
Condiciones:
Incidencia Solucin
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
9 Detectores
El objetivo de esta seccin es:
1. Ser igual de sensible para todos los picos eluidos o registrar nicamente
aquellos picos que sean de inters.
2. No ser afectado por cambios de temperatura o composicin de la fase
mvil.
3. Ser capaz de monitorizar trazas de las especies a analizar.
4. No contribuir de forma apreciable al ensanchamiento de los picos.
5. Proporcionar una respuesta rpida que le permita detectar picos
cromatogrficos estrechos provenientes de la columna.
6. Ser robusto y fcil de mantener.
Selectividad
Un Detector no selectivo reacciona frente a una propiedad general del
eluyente que pasa a travs de l. Cuando un analito eluye de la columna, las
caractersticas de esa propiedad cambian, y ese cambio bruto se mide y se
registra. Esta deteccin no-selectiva es caracterstica del detector de ndice
de refraccin.
Sensibilidad
La seal ms baja detectable no debe ser nunca menor de tres veces la
altura del ruido promedio en la lnea de base; Es decir, una relacin seal a
ruido (S/N) de 3:1 para un analito determinado determina su "Limite de
Deteccion".
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Rango Lineal
El Detector ideal debera proporcionar una seal de respuesta cuya rea
fuera proporcional a la cantidad de muestra inyectada, independientemente
de si est cantidad es grande o pequea. Esta linealidad no es infinita, pero
debe extenderse en el rango ms amplio posible. La pendiente de la recta
en el diagrama de abajo se denomina respuesta y representa en que
magnitud el detector responde a un cambio especfico en la concentracin
de la muestra:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Beam Splitter
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La Celda de Flujo
Este procedimiento debe aplicarse con precaucin puesto que una presin
excesiva sobre la celda de flujo podra provocar fugas alrededor de las
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Una celda de flujo sucia puede atrapar microburbujas cuando pasan a travs
de ella. Estas microburbujas pasan normalmente a travs de la celda sin ser
notadas pero cuando se atrapan pueden asociarse para generar burbujas
mayores afectando al ruido y la deriva de lnea de base. Cualquier burbuja
atrapada debe purgarse de la celda requiriendo en ocasiones el uso de
isopropanol, cuya mayor viscosidad comparada con el acetonitrilo o
metanol, ayuda a arrastrar la burbuja envindola a desechos.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Para eliminar los efectos de fondo descritos hay que elegir un ancho de
banda grande, tpicamente de 100nm, y situar la longitud de onda de
referencia en el punto medio de esta ventana i.e. 360nm.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La Celda de Deteccin
Eventualmente la celda de deteccin de cada instrumento de light
scattering se ensuciar: esto es especialmente cierto para la cromatografa
acuosa. Detenga el flujo de fase mvil, y aumente el flujo de gas de
nebulizacin para arrastrar cualquier partcula no voltil del interior de la
celda. Por favor, consulte el manual de operacin antes de realizar
cualquier procedimiento de limpieza.
Cualquier fase mvil que se utilice sin filtrar o tampones que empleen sales
o modificadores no voltiles contribuirn a un ruido excesivo de lnea de
base o a picos continuos (spikes). En el peor de los escenarios dichos
aditivos pueden contaminar el tubo de deriva del detector y la celda de
deteccin. Modificadores voltiles que son aceptables incluyen: cido
Trifluoroactico, cido Actico, Formiato Amnico, Acetato Amnico e
Hidrxido Amnico.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Iones Contaminantes
La contaminacin de iones en el espectro de masas produce una prdida de
sensibilidad en los analitos y aumenta la complejidad en la asignacin de las
masas. Estos iones contaminantes pueden provenir de diferentes orgenes,
incluyendo:
1. La Fase Mvil
La mayora de los solventes de grado HPLC contendrn impurezas que
no absorban en el UV, o estn presentes a niveles de concentracin por
debajo de los lmites de deteccin de la mayora de otros detectores
LC, pero pueden ser la mayor fuente de contaminacin de iones
observada en el espectro de masas.
Las botellas de vidrio de H2O grado HPLC son extraordinariamente
proclives a contener iones sodio y potasio que generan iones aducto de
una intensidad significativa.
2. Modificadores de la Fase Mvil.
Muchos de los modificadores tpicos de las fases mviles pueden
generar por s mismos iones fuertes, o introducir iones contaminantes
en la fase mvil.
Siempre que sea posible deben utilizarse reactivos de la mayor pureza
posible, y minimizar la concentracin empleada.
3. Tubos de Conexin.
Evite los tubos de plstico para minimizar la introduccin de iones
Ftalato. El in de Ftalato 609Da es a menudo el pico base de cualquier
espectro de masas, y puede ser introducido inadvertidamente desde los
tapones con septum.
Minimice la contribucin de los Ftalatos purgando la fuente con N2 gas
a temperaturas ms altas de las utilizadas por trmino medio para
eliminar la contaminacin.
Utilice tubo PEEK incoloro para reducir el ruido de fondo.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 3
Pregunta 1
Evaluar los problemas mostrados en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas de stos y cmo pueden corregirse:
Observaciones:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
Usando los conocimientos adquiridos durante el curso complete un programa de
mantenimiento para su sistema de HPLC empleando la tabla de abajo como gua.
Frecuencia de Mantenimiento.
Procedimiento de Cada..
Componente
Mantenimiento
48 Horas Semana Mes + Mes
La Fase Mvil
Solvente
Tamponado
Filtros de
Solvente
La Bomba
Check
Valves
Pistones y
Sellos
Frita Vlvula
de Purga
Cebado
El Autoinyector
Sello del
Rotor
Aguja y
Asiento de
la Aguja
La columna
Guarda
Columna
Columna
El Detector
Lmpara
Celda Flujo
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Lneas de Base
La apariencia o el perfil de la lnea de base pueden ayudar en la
identificacin de muchos de los problemas asociados con los
componentes del sistema.
Forma de los Picos
La forma del pico cromatogrfico proporciona una valiosa informacin
al caracterizar las prestaciones proporcionadas tanto por los
componentes del sistema como por la columna.
Tiempos de Retencin
Cualquier variacin observada en los tiempos de retencin de los
analitos es crtica en el diagnstico para eliminar problemas del
sistema LC.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La siguiente tabla enumera una serie de razones por las cuales la lnea de
bsica puede ser errtica, junto a la solucin apropiada sugerida.
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
Fallos en la Vlvula Proporcional de Gradiente (mezclado) Llene las 4 botellas de disolvente con el mismo volumen del mismo y
realice una mezcla 1:1:1:1 durante un tiempo suficiente. El consumo en
cada botella de disolvente debe ser el mismo si las vlvulas individuales de
cada canal operan correctamente.
Bomba HPLC Vlvulas antirretorno de entrada y/o salida pegadas o parcialmente Sustituya y compruebe
bloqueadas. Realice los tests de mantenimiento especfico indicados por el fabricante
para evaluar la integridad de los componentes individuales del cabezal de
la bomba.
Limpie o sustituya los que sean necesarios siguiendo el protocolo descrito
(ver pg. 46 ss), o las instrucciones del fabricante.
Tiempo de Reequilibracin insuficiente Mnimo 10 volmenes de columna. En mtodos con Par Inico 2050
volmenes de columna.
Detector Polvo o suciedad en los tarjetas electrnicas Sustituya el detector y compruebe. Si es necesario solicite una visita al
servicio tcnico.
Lmpara cerca del fin de su vida til. Mantenga un diario del uso de la lmpara.
Establezca un tiempo obligatorio de sustitucin de la lmpara p.ej. 80%
del total de su vida til esperada.
Celda de Flujo contaminada con muestra y/o matriz
Desmonte y limpie o sustituya la celda de flujo segn las directrices del
fabricante.
Captura de Datos Conversor Analgico-Digital o tarjetas electrnicas defectuosas Sustituya el sistema de captura de datos y compruebe. Si es necesario
solicite una visita al servicio tcnico.
Conexiones con mala toma de tierra.
Perdda de contacto en los cables Compruebe y ajuste todos los cables de conexin visibles.
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la lnea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de corta frecuencia junto con
su solucin adecuada.
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
Vlvulas antirretorno de entrada y/o salida pegadas o parcialmente Afloje la rosca de la vlvula de salida para desplazar el aire atrapado.
bloqueadas. Sustituya y compruebe.
Limpie o sustituya si es necesario utilizando el protocolo genrico descrito
(ver pgina 46 ss), o siguiendo las instruccines del fabricante.
Sustituya o repare el amortiguador de pulsos (damper) Solicite una visita del servicio tcnico si se requiere.
Automuestreador Fuga potencial en el cuerpo de la vlvula de inyeccin que introduce aire. Realice el test de mantenimiento especificado por el fabricante para
evaluar la integridad de los componentes del automuestreador.
Loop o conexin de la aguja potencialmente defectuosos. Revise la vlvula conmutable para buscar conexiones flojas.
Desmonte y re-asiente la vlvula conmutable o sustituya sus comentes si
es necesario.
Detector Burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo. Purge el aire. NO exceda el lmite mximo de operacin-tpicamente 120
bar para una celda de flujo de 1 cm y 13L de volumen.
Revise la documentacin del fabricante para confirmar.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presin para evitar la desgasificacin. Tpicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. ser suficiente.
Fluctuaciones de la corriente elctrica de alimentacin Compruebe otros instrumentos e instale proteccin contra las
fluctuaciones si es necesario.
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La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la lnea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de larga frecuencia junto con
su solucin adecuada.
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Detector Burbuja(s) de aire atrapada(s) en la celda del detector Purge el aire. NO exceda el lmite mximo de operacin-tpicamente 120
bar para una celda de flujo de 1 cm y 13L de volumen.
Revise la documentacin del fabricante para confirmar.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presin para evitar la desgasificacin. Tpicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. ser suficiente.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La tabla siguiente indica diferentes razones por las que la lnea de base del
cromatograma puede mostrar deriva junto con su solucin adecuada.
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Re-equilbrado insuficiente de la columna o del gradiente de elucin. Si empleamos un gradiente completo (i.e. 5 100% solvente B), debemos
asegurar un cambio de 10 volmenes de columna antes de realizar una
nueva inyeccin de muestra.
Automuestreador Adsorcin de muestra en los componentes de la vlvula de inyeccin. Mantenga la posicin de inyeccin de la vlvula del inyector al menos unos
minutos despus de la introduccin de la muestra para asegurar un lavado
intenso.
Use un disolvente de la muestra tan fuerte como sea posible sin que se
comprometa la forma de pico
Implemente un rgimen de lavado de la vlvula despus de cada
inyeccin.
Columna Ligero sangrado de muestra o matriz fuertemente retenida. Asegrese de que la columna se lava con un disolvente fuerte despus de
cada muestra o lote de muestras.
Mtodo de Fase Reversa con formacin de Pares Inicos. Aumente el tiempo de re-equilibrado a 20-25 volmenes.
Exposicin del Sistema gradientes de temperatura. Termostatice la columna y las lneas de entrada y salida de la misma.
Detector Direccin Negativa Componente fuertemente absorbente en un eluyente Seleccione en el DAD la longitud de onda de referencia y un ancho de
dbil. banda adecuados para eliminar el efecto de absorbancia del (los)
componente(s)
Compruebe que est usando el disolvente correcto.
Direccin Positiva Componente fuertemente absorbente en un eluyente
fuerte. Asegrese de que la polaridad de la seal del detector est correctamente
seleccionada.
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Las especificaciones del detector se suelen dar sobre una celda seca y vaca
a 255nm. No es muy prctico tener que crear una celda seca,
especialmente si se desea medir el ruido bajo condiciones similares a las del
anlisis cromatogrfico. Es aceptable sustituir la tcnica de la celda de flujo
seca por una fase mvil isocrtica y estacionaria. Si el ruido observado en
estas condiciones est aproximadamente a 2x de la especificacin, el
detector est funcionado correctamente. El ruido a s ms bajas, como
215nm, ser mayor aquel mostrado a 255nm con la fase mvil fluyendo a
travs de la celda.
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Bomba HPLC Compruebe todas la conexiones buscando fugas que pudieran provocar la Elimine est posibilidad parando el flujo de fase mvil: si an se muestra
entrada de aire el ruido entonces el conjunto de suministro de disolvente no es la causa.
Compruebe las reas alrededor del cabezal de la bomba por si hubiera Apriete las conexiones si es necesario.
depsitos de sales de los tmpones. Sustituya los componentes dudosos si es necesario.
Crawford Scientific 2007
Automuestreador Introduccin de aire durante la inyeccin. Realice los test de mantenimiento especificados por el fabricante para
evaluar la integridad de los componentes individuales del
Automuestreador.
Disolvente de la muestra o Fase mvil incorrectas
Si la viscosidad del disolvente de la muestra es alta, o posee un bajo punto
de ebullicin, es conveniente reducir la velocidad de succin de muestra y
la de inyeccin para evitar cavitacin.
Columna Temperatura de la Columna mayor que el punto de ebullicin de alguno de Disminuya la temperatura de separacin para evitar la ebullicin del
los componentes de la fase mvil. disolvente.
Revalide el mtodo si hay una prdida deresolucin
Crawford Scientific
o cambia la 2007
Prdida de los ligandos de la fase estacionaria. selectividad de la columna.
Compruebe que el mtodo est operando en el rango correcto de pH para
esa columna.
Compruebe que el mtodo funciona dentro de los lmites de pH
Disolucin de la slice de la fase estacionaria. especificados para esa columna.
Detector Pertubaciones elctricas spikes provenientes de los circuitos Sustituya el detector y compruebe.
electrnicos. Solicite una visita del servicio tcnico si se requiere.
Purge el aire. NO EXCEDA el lmite superior de presin establecido para la
Burbujas de aire atrapadas en la celda del detector. celda del detector, tpicamente de 120 bares para una celda estndar de
1cm de paso ptico y 13L de volmen.
Revise la literatura del fabricante para confirmarlo.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presin para evitar la desgasificacin. Tpicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. ser suficiente.
Mantenga un registro de las horas de uso de la lmpara.
Lmpara cerca del lmite de su vida til. Establezca un periodo de sustitucin obligatorio de la lmpara. P.ej. al
80% de su tiempo de vida til esperada.
Captura de Datos Mala toma de tierra / Conexin floja Sustituya el sistema de adquisicin de datos y compruebe.
Revise y reconecte todos los cables de conexin visibles.
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Si todos los picos separados se han ensanchado, siendo los primeros los que
muestren ms ensanchamiento, el problema vendr causado simplemente
por la introduccin de un gran volumen extra-columna en el sistema;
Dnde;
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tR = 0.425 x (w0.5) x N y
tR = 12.0
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Dnde;
max = Masa de muestra en g
k' = Factor de Capacidad
dc = Dimetro interno de la Columna en cm
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Trimetilclorosilosano (TMCS)
Hexametildisilazano (HMDS)
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Un nico pico con cola tambin podra producirse por un pequeo pico
eluyendo inmediatamente despus del pico cromatogrfico de inters. La
posibilidad de que esto ocurra es la razn primordial por la que las colas de
pico nunca deben ignorarse. Como se describa en el apartado
desdoblamiento de picos y hombros, podemos confirmar la presencia de
un interferente cambiando la longitud de onda de deteccin, o mejorar la
resolucin de la separacin empleando una columna de mayor eficiencia
p.ej. una columna ms larga o empaquetada con partculas de menor
tamao.
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Un nico pico que muestre frente tambin puede deberse a un pequeo pico
que eluya justo antes del pico cromatogrfico de inters. Esta posibilidad es
la principal razn por la que un pico con frente nunca debe ser ignorado.
Como se describa en el apartado desdoblamiento de picos y hombros,
podemos confirmar la presencia de un interferente cambiando la longitud de
onda de deteccin, o mejorar la resolucin de la separacin empleando una
columna de mayor eficiencia p.ej. una columna ms larga o empaquetada
con partculas de menor tamao.
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Para eliminar los efectos de fondo descritos hay que elegir un ancho de
banda grande, tpicamente de 100nm, y situar la longitud de onda de
referencia en el punto medio de esta ventana i.e. 360nm.
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10.5 Sensibilidad
Una baja sensibilidad puede producirse por alguna de las razones siguientes:
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10.6 Recuperacin
Una mala recuperacin de la muestra puede producirse por mltiples
razones, pero se debe tpicamente a la adsorcin irreversible de los
ananlitos en la fase estacionaria o en los componentes extra-columna.
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