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ASIGNATURA:
MVZ. PhD. Carola Trinidad Melo Rojas
DOCENTE:
DISCENTE:
Informe N 2
1. INTRODUCCIN
Ya que los procesos genticos son esenciales para la comprensin de la vida misma,
muchos piensan que la disciplina de gentica se asienta en el centro de la biologa. La
informacin gentica dirige la funcin celular, determina en gran medida la apariencia
externa de los organismos y sirve de unin entre generaciones en todas las especies. En s
mismo, el conocimiento gentico es esencial para la comprensin completa de otras
disciplinas, como la biologa molecular, la biologa celular, fisiologa, evolucin, ecologa,
sistmica y etologa. Por consiguiente, la gentica unifica la biologa y constituye su
ncleo (Klug y Cummings, 2006). El DNA est constituido por dos cadenas de
nucletidos, formando una doble hlice, a manera de escalera enrollada, su estabilidad se
debe a la formacin de puentes de hidrgeno, adems existe la presencia de enlaces entre
bases nitrogenadas (A-T; G-C) y enlaces disulfuro. El modo de replicacin es
semiconservativo. Y una extraccin del DNA tiene una gran importancia en los procesos
de investigacin, identificacin de la paternidad, para el diagnstico de enfermedades y los
trastornos genticos (enfermedades hereditarias), en caso de criminalsticas y en casos de
medicina forense (Bustoset al, 2011; Agostino, 2012). Orfao (2012), menciona el
procedimiento general de extraccin de cidos nucleicos, que consisten en tres etapas
consecutivas: disgregacin de las clulas o tejidos (lisis celular), inactivacin de las
nucleasas intracelulares y en separacin de los cidos nucleicos de los dems componentes
celulares. El objetivo de la extraccin y purificacin de las muestras est determinada por
la pureza, integridad y funcionalidad de las mismas, para un correcto anlisis en PCR. Por
tanto, una buena muestra implica siempre un correcto proceso de obtencin de esta
molcula a partir de material biolgico (Casademont, 2009). Para saber, qu cantidad y
calidad se obtuvo de la extraccin usamos tres metodologas. El uso de la plataforma Qubit
provee una medicin de las muestras rpida y fcil, obtenindose la lectura directamente en
la pantalla del instrumento Fluormetro Qubit (Invitrogen, 2007).
El presente informe rene, describe, compara y discute con las informaciones existentes y
los uso de metodologa y los resultados a partir de la extraccin, purificacin y
cuantificacin del DNA de la prctica realizada.
2. OBJETIVOS
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Estudiante de Gentica animal; Medicina Veterinaria Sede Marangani; UNSAAC
Marangani; 28 de Julio de 2017
crishuaHC@gmail.com
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2.2. Objetivos especficos
- Extraccin de DNA: Obtener DNA pura a partir de una muestra de sangre de vicua
para su posterior cuantificacin.
- Cuantificacin e integridad del DNA: Conocer si se hizo bien la extraccin del
DNA.
3. REVISIN BIBLIOGRFICA
Muchas tcnicas anlticas son tiles para la investigacin del DNA y el RNA: absorcin
de la luz ultravioleta (UV) (los cidos nucleicos presentan mayor absorcin de luz
ultravioleta a 254-260 nm de longitud de onda debido a la interaccin entre la luz UV y los
sistemas anulares de las purinas y de las pirimidinas, el anlisis de UV se utiliza en muchos
protocolos establecidos para separar molculas), comportamiento de sedimentacin (las
mezclas de cidos nucleicos se puede separar sometindolas a uno o varios de los posibles
procedimientos de centrifugacin; se centrifuga esta mezcla a altas revoluciones en una
ultracentrfuga, entonces la mezcla de molculas emigrar hacia abajo, luego la
centrifugacin se detiene y se eluye el gradiente del tubo y se mide con espectrofotmetro),
desnaturalizacin y renaturalizacin de los cidos nucleicos, hibridacin molecular,
hibridacin in situ fluorescente, cintica de reabsorcin y DNA repetitivo,
electroforesis de cidos nucleicos (tcnica importante que separa o resuelve, fragmentos
de DNA de distintos tamaos hacindola migrar bajo la influencia de un campo elctrico;
se coloca la muestra en una sustancia porosa que puede ser un gel semislido) (Klug y
Cummings, 2006).
5. PROCEDIMIENTO
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5.1. Para la extraccin del DNA
Tabla 3: Procedimiento de la extraccin del DNA (datos obtenidos a partir de Orfao y
Morent, (2011))
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Paso 6: Descartamos el tubo de coleccin del
filtrado junto con los contaminantes y
transferimos al tubo de columna a un nuevo tubo
de coleccin para el nuevo filtro de lavado.
Agregamos 500 l del buffer 1 en el tubo con la
columna con una micropipeta de 1000 l para
eliminar el resto de los contaminantes de la
muestra que son arrastrados en esta solucin por
centrifugacin de 10,000 RPM en una
microcentrfuga.
Paso 7: Finalmente nuevamente transferimos la
columna a un nuevo tubo y descartamos la
anterior. Agregamos 500 l de buffer 2 y se llev
a una nueva centrifugacin con la mxima
velocidad (en este caso, mx.V. de
microcentrfuga es 15,000 RPM) durante 3
minutos para asegurar una completa eliminacin
de los restos de la solucin de lavado de la
columna previamente a la elucin de DNA.
Paso 8: Descartamos el tubo del coleccin del
filtrado y colocamos a la columna a un nuevo
tubo de coleccin de 1,5 ml con tapa. Llevamos
a cabo la separacin de DNA de la columna de
slice aadiendo 100 l de tampn o buffer
(Genomic Elutin Buffer) de baja fuerza inica.
Incubamos durante 1 minuto la columna con el
buffer de resuspensin para aumentar el
rendimiento de DNA. Por ltimo, realizamos una
centrifugacin de mxima velocidad durante 1
minuto, esta nos permiti coleccionar el DNA en
solucin en el tubo de 1.5 ml y se desecha la
columna. Finalmente almacenamos la muestra a
una temperatura de 20 C hasta su prxima
cuantificacin y secuenciacin.
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Paso 2: Preparamos la solucin Qubit,
trabajando con la solucin segn la lectura
de Qubit 1:200 en buffer Qubit.
Calculamos 199 l de buffer Qubit
dsDNA ms 1 l de colorante (tubo azul),
obteniendo 200 l de volumen total. Para
seis tubos de muestras y dos estndares
cada uno con 200 l preparamos ms
200 l de solucin Qubit. En tubo de
coleccin se prepara 1791 l (199 l x 9
tubos) y 9 l del Reangent. Total 1800 l
de solucin. Homogenizar con el vortex.
Paso 3: Preparamos 200 l para los
estndares y para las muestras. Para cada
solucin estndar se agreg 190 l de la
solucin buffer Qubit y 10 l de estndar.
Obteniendo 200 l de cada estndar
(estndar A, 200 l; estndar B, 200 l).
Hacemos vortex a cada uno.
Paso 4: Antes de lectura de las muestras al
equipo Qubit debe ser calibrada.
Calibramos con los dos estndares A y B.
Primero el estndar A es leda y este slo
grafica los dos primeros valores de la
curva, despus es leda el estndar B del
cual se grafica los tres puntos. Se coloca el
tubo de estndar a la cavidad de la parte
superior, se cierra la cubierta y se presiona
en leer el estndar. Seguidamente
cuantificamos.
Paso 5: Adicionamos 199 l de solucin
buffer Qubit a seis tubos de coleccin
respectivamente y 1 l de cada muestra de
DNA. Obteniendo 200 l de solucin.
Despus se hace vortex.
Paso 6: Finalmente se lee inmediatamente
en el Qubit. El valor final aparece dentro
de un crculo al terminar la lectura de la
muestra, estos datos no fueron exportados
al USB.
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Procedimiento para cuantificacin e integridad de DNA por electroforesis en gel de
agarosa
Paso 1: Directamente las muestras se colocaron a 1-2,5 l a
cada pocillo de la caja de gel agarosa con una micropipeta.
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1. Resultados
Tubo 8 Pocillo 3
Tubo 3 Pocillo 1
Tubo 18 Pocillo 2
Tubo 19 Pocillo 4
Tubo 12 Pocillo 5
Tubo 20 Pocillo 6
Tubo 3 4.4 ng
Tubo 18 43.6 ng
Tubo 19 52.6 ng
Tubo 12 116 ng
Tubo 20 5.94 ng
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6.2. Discusin
A partir de la tabla 6 los resultados obtenidos son evidentes comparando los dos mtodos.
Desde luego, se puede analizar intuitivamente la integridad del DNA obtenido en el
mtodo de electroforesis en gel adems de la cuantificacin sin cifra. De toda las muestras
de DNA en los seis tubos de coleccin slo los que poseen alto valor de concentracin de
DNA entrar a la secuenciacin, la posterior prctica ms brillante en gentica. En la
metodologa por electroforesis en gel de agarosa se observa panormicamente a algunas
muestras de pocillos que se arrastran de manera variable con algunas regiones bien
pronunciadas. Unos se alejan a corta distancia y otras se alejan a larga distancia. Todo este
proceso se debe a la migracin de fragmentos de DNA de acuerdo a sus tamaos, cargas
influenciadas por un campo elctrico, segn Klug y Cummings, (2006). Algunas muestras
migran con una banda uniforme especialmente la muestra del pocillo 5 que pertenece al
tubo de coleccin 12, su caracterstica es evidente con una banda pronunciada, uniforme
de gran concentracin a diferencia de otras muestras la cual define su integridad del DNA
extrado (Orfao, 2012). Adems podemos concluir que dicha muestra ha tenido menor
degradacin la cual ha caracterizado su migracin uniforme. Sin embargo, observando en
otras muestras la migracin no es uniforme, producen unas estelas o smear aunque poseen
una regin de banda pronunciada, algunas de ellas migran ms rpido o tras migran
lentamente y sus posibles causas son la mayor degradacin de la muestra que
probablemente podra haber ocurrido por la congelacin y el mayor tiempo de su
almacenaje (Orfao, 2012). Del mismo modo, la concentracin de DNA difieren
cuantitativamente, la concentracin de DNA de las muestras dependen de muchos factores
que podra influenciar de manera inevitable (almacenaje de la muestra produce
degradacin, hemlisis por muchos factores, en la extraccin de DNA falta
homogenizacin, etc.). En este aspecto, se observa la misma muestra del pocillo 5 del tubo
de coleccin 12 una gran concentracin de DNA adems de su uniformidad, y el pocillo 1
del tubo de coleccin 3 tiene una concentracin bien poqusima por factores desconocidas.
Este ltimo no podr ser usado para los prximos usos especialmente en el PCR. Ya que el
PCR necesita una pureza ptima y concentracin necesaria para observar su funcionalidad.
En la metodologa por flourometra Qubit se calcula la concentracin del DNA con mayor
precisin y menor probabilidad del error mediante cifras de nmeros. A diferencia del
anterior mtodo este es ms preciso en la cuantificacin, pero no mide la integridad. La
precisin de la cuantificacin se debe al colorante azul (Reangent) que se acoplan
solamente a DNAs ntegros en la mayor parte. No se acoplan a los contaminantes como
fenoles, sales, cloroformo ni a nucletidos libres. Una razn por lo que los resultados de la
lectura de fluorescencia refleja exactamente la cantidad de producto que el investigador
tiene inters en cuantificar (Invitrogen, 2007). En este caso, la misma muestra del pocillo 5
en anterior mtodo del tubo de coleccin 12 tiene un alto valor de 116 ng medido en
fluormetro Qubit, y las razones son menor degradacin de la muestra y buen
procedimiento de la extraccin del DNA a partir de la sangre. Comparndola tambin con
el anterior mtodo la muestra del tubo de coleccin 3 tiene un valor mucho menor de 4,4
ng, un valor no adecuado para la lectura en PCR por lo que no se podra obtener una buena
funcionalidad del DNA. Esta muestra probablemente ha podido sufrir una mayor
degradacin y otro factor podra ser fallas en el procedimiento de la extraccin del DNA.
Comparamos ambos mtodos y las coincidencias son admirables, las diferencias son bien
pequeas. Es bien contundente que las muestras ms ntegras y de alta concentracin
puedan ingresar a los prximos procedimientos. Para tener mayor confiabilidad en la
cuantificacin e integridad del DNA hubiera sido mejor el uso del equipo nanodrop.
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7. CONCLUSIN
La extraccin del DNA tiene una gran importancia en los procesos de investigacin,
identificacin de la paternidad, para el diagnstico de enfermedades y los trastornos
genticos (enfermedades hereditarias), en caso de criminalsticas y en casos de medicina
forense, etc. Y la cuantificacion e integridad es fundamental para observar la funcionalidad
del DNA, la concentracin del DNA tiene lmites en algunos procedimientos. En esta
prctica se obtuvo muestras de DNA con diferentes purezas, integridad y concentracin.
8. BIBLIOGRAFA
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