Biotecnologa de Materiales.

Curso 2011-2012

Tema 2 Formacin de Biofilms

BIOPELCULAS = BIOFILMS
Characklis & Marshall (1990): Conjunto de clulas inmovilizadas en un sustrato y embebidas en
una matriz exopolimrica de origen microbiano que las mantiene unidas junto a otras sustancias
del medio en que se encuentran

FASES DE FORMACIN DE UNA BIOPELCULA

1. Transporte a la superficie
Formacin del SUSTRATO CONDICIONANTE previa a la llegada de los microorganismos
Llegada de los microorganismos planctnicos (Gravedad, Difusin, Cilios y Flagelos, Agregados
procedentes de otras biopelculas, ).
2. Adhesin inicial reversible
En estas interacciones iniciales entre las clulas microbianas y el sustrato participan fuerzas
electrostticas y fuerzas hidrofbicas e hidroflicas.
Si las condiciones del medio no resultan ptimas para el desarrollo del biofilm, las bacterias
pueden desprenderse y volver al estado planctnico, buscando otros nichos ms apropiados
3. Adhesin irreversible, Attachment
Esta unin con el sustrato es ms estable. Se forman microcolonias que van aumentando su
tamao mediante procesos de multiplicacin de las clulas antiguas y de las que se van
incorporando desde el medio. Las clulas comienzan a segregar sustancias polimricas
extracelulares (EPS) y quedan englobadas en una matriz protectora, dando al conjunto mayor
cohesin y fuerza de unin. Esta matriz contribuye a muchas de las caractersticas estructurales y
funcionales del biofilm maduro.
4. Colonizacin
Se produce el crecimiento de las microcolonias, formndose macrocolonias, con mayor nmero
de clulas, donde hay mayor heterogeneidad metablica y fisiolgica. La estructura final de la

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macrocolonia se describe, en el grupo de las pseudomonas, como un champin de bordes bien

definidos y el conjunto de championes y los canales que los separan es lo que se conoce como
biofilm maduro. Una vez formado, el mantenimiento de este biofilm maduro requiere procesos de
diferenciacin celular que permiten a las clulas organizarse estructuralmente y distribuir las
actividades metablicas entre las distintas clulas que forman el consorcio. Para ello, los
microorganismos ssiles expresan genes que no lo hacan cuando estaban en estado planctnico
5. Desprendimiento, Detachment
En cualquier momento durante la formacin del biofilm, se pueden producir desprendimientos de
microorganismos o pequeos fragmentos de biopelcula que pasan al medio y son transportados a
otras zonas. La liberacin de las bacterias desde el biofilm es el proceso que menos se conoce, se
han descrito algunas protenas-enzimas con la funcin de degradar la matriz de EPS y as
favorecer esta fase de detachment.
En todas estas fases, es necesario un alto grado de interaccin celular donde se hayan implicados
mecanismos de comunicacin clula-clula a travs de diferentes seales qumicas o Quorum
sensing.
SUSTANCIAS POLIMRICAS EXTRACELULARES
(Extracellular Polymeric Substances, EPS)
Characklis & Wilderer (1989): Polmeros orgnicos de origen microbiano y que, en las
biopelculas, son responsables de la cohesin entre las clulas y otras partculas del medio as
como de la unin de esta estructura al sustrato
Las EPS proporcionan una matriz viscosa en la que se localizan las clulas y actan como una
capa protectora frente a agentes potencialmente peligrosos, as como una fuente de carbono y
energa en condiciones limitantes. Son consideradas las principales responsables de las
propiedades biolgicas y fisicoqumicas de los biofilms. Su proporcin en los biofilms puede
variar entre el 50% y el 90% del contenido total en materia orgnica.

Polisacridos
Los polisacridos suelen ser los componentes mayoritarios de las EPS. Basndose en la
composicin qumica, la especificidad antignica y la biosntesis, los polisacridos bacterianos se
han dividido en dos grupos, denominados polisacridos especficos y no-especficos.
Polisacridos especficos o antignicos: poseen propiedades inmunolgicas y son especficos de
ciertas cepas bacterianas. La especificidad de estos polisacridos reside en la posicin y
configuracin de uniones glucosdicas.
Polisacridos no-especficos se encuentran en gran variedad de cepas bacterianas y son por regla
general estructuralmente diferentes y ms simples que los polisacridos especficos.
La composicin del exopolisacrido es diferente en cada bacteria y vara desde alginato en P.
aeruginosa, celulosa en S. typhimurium, poly-N-acetilglucosamina en S. aureus, etc. Adems,
estudios recientes han puesto de manifiesto que incluso una misma bacteria, dependiendo de las
condiciones ambientales en las que se encuentre, puede producir distintos exopolisacridos como
componentes de la matriz del biofilm.

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Protenas
Lectinas: se unen irreversiblemente a estructuras especficas de los hidratos de carbono mediante
puentes de hidrgeno e interacciones hidrofbicas. En las bacterias, muchas de ellas parecen estar
implicadas en la patognesis mediando en la adhesin especfica a la clula del husped. En el
biofilm, una funcin para estas protenas sera mediar la adhesin de la clula a la matriz de EPS
o a otras clulas de la comunidad del biofilm,
Liasas y polisacarasas: degradan polisacridos para originar oligosacridos. Estn implicadas en
la biosntesis y utilizacin de estos compuestos. En el contexto del biofilm, la combinacin de
varias liasas permitira la degradacin completa de los exopolisacridos de la matriz de EPS
proporcionando una fuente de nutrientes a los microorganismos. Esta degradacin colectiva de
polisacridos podra a su vez modular el desprendimiento de las bacterias del biofilm.

ADN
Es un componente importante de la matriz de EPS, aunque su origen es incierto. Se pensaba que
proceda fundamentalmente de clulas muertas y que no tena un papel en el biofilm, pero hay
estudios que sugieren que el ADN es un componente estructural de la matriz en los primeros
estados del desarrollo de ciertos biofilms.
Funciones de los EPS
Adhesin de las clulas al sustrato
Estructura (gel que une las clulas entre s)
Proteccin frente a agentes externos: barrera fsica y qumica (Predadores, sistema inmune,
desinfectantes, toxinas, luz UV,)
Patognesis: infecciones bacterianas crnicas
Fuente de energa y de nutrientes
Desecacin

QUORUM SENSING (QS) = SEAL DE QURUM

Mecanismo de comunicacin clula-clula, que se utiliza para la regulacin de procesos celulares

dentro de una comunidad. Basado en la secrecin de molculas seal. Las clulas vecinas

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sienten la densidad poblacional y se produce un cambio de la expresin gnica que tiene como
resultado el comportamiento social coordinado: biopelcula ~ organismo multicelular.
1. Produccin constante de sustancias difusibles: AUTOINDUCTOR
2. Masa CRTICA de clulas: Concentracin UMBRAL de autoinductor
3. Activacin transcripcional: Cambia expresin gnica
Entre las bacterias Gram negativas, la seal de qurum dependiente de AHL (N-Acyl-L-
Homoserine Lactone) es la ms conocida. La participacin de un sistema de QS en la formacin
de biofilm se indic por primera vez en 1998 para P.aeruginosa, al detectarse un mutante (en el
sistema las) que formaba biofilms indiferenciados al ser comparados con los formados por la
cepa salvaje con sus championes y canales, lo que llev a pensar que el sistema las era necesario
para el desarrollo de la arquitectura del biofilm. El sistema las consiste en un activador
transcripcional LasR y la sintasa de AHL LasI que dirige la sntesis de N-3-oxo-dodecanoil-
homoserina lactona (3-oxo-C12-HSL), el autoinductor. Cuando el autoinductor alcanza una
concentracin crtica y se une a su activador transcripcional se produce la expresin de toda una
serie de genes implicados en la formacin y desarrollado del biofilm maduro, as como genes de
virulencia implicados en la infectividad, dao tisular y generacin de la respuesta inflamatoria del
husped.
INTERCAMBIO GENTICO EN LOS BIOFILMS
Transferencia horizontal de genes (parasexualidad): un organismo adquiere informacin gentica
de otro organismo en un proceso independiente de la reproduccin, dentro de la misma
generacin. Se puede dar entre organismos de la misma especie o de especies diferentes.
1. Transformacin
Requiere la unin y captura de ADN libre hacia el interior bacteriano y la expresin de la
informacin gentica que contiene. El proceso que permite la transformacin se denomina
competencia, que es un estado transitorio que precisa que las clulas se encuentren activas
metablicamente y capaces de activar un conjunto de genes
especficos.
En el caso de las bacterias gram-positivas la induccin de la
competencia ocurre en la fase exponencial de crecimiento y
parece estar asociado a procesos de quorum sensing, mediante la
CLULA produccin, exportacin y captura subsiguiente por las clulas
COMPETENTE
vecinas de un pequeo pptido seal llamado factor de
competencia (CF). Cuando el CF alcanza una cantidad crtica es
detectado por el activador transcripcional (una histidina-kinasa
unida a membrana) que inicia la induccin de una cascada de
genes especficos de competencia, que provocan la degradacin
parcial y controlada de la pared celular, de modo que quedan al
descubierto complejos de protenas que son sitios de unin al
ADN exgeno. La transformacin comienza con la unin del
ADN de doble hlice al exterior celular de forma independiente de su secuencia. Al poco de
unirse, el ADN va pasando al interior del citoplasma y recombina con la zona complementaria
del cromosoma bacteriano, expresndose.

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El ADN capturado puede conferir un fenotipo ventajoso como la resistencia a algn txico o un
aumento de la actividad metablica. Pero tambin puede ser heterlogo o inservible para
recombinacin y expresin o incluso puede que siendo homlogo y se exprese no confiera
ninguna ventaja al receptor.
En el caso de bacterias gram-negativas, la transformacin implica la captura de secuencias
especficas de DNA de doble hlice que deben ser reconocidas por la clula receptora. Adems es
un proceso que ocurre entre bacterias de la misma especie o de especies muy prximas durante la
fase estacionaria de crecimiento.
2. Conjugacin
El material gentico se transfiere desde la bacteria donadora hasta la
bacteria receptora sin pasar por el medio de suspensin. El intercambio
de material gentico depende del contacto directo entre dos clulas y
est polarizado, es decir, ciertas cepas designadas F+ (fertilidad ms)
actan siempre de donadoras y otras, F- (fertilidad menos) actan como
receptoras. Las cepas F+ contienen un plsmido, llamado plsmido F,
que lleva todos los genes que codifican la transferencia gentica por
conjugacin.

3. Transduccin
Implica la transferencia del material gentico empaquetado en unas
partculas fagocticas. Como la partcula es ms o menos estable la
clula donadora y receptora no necesitan encontrarse en el mismo
sitio simultneamente. En este caso la clula receptora debe tener
sitios especficos de unin que sean reconocidos por el fago
atacante. La transduccin puede ser generalizada, cuando cualquier
DNA bacteriano es empaquetado y transferido, o especializada
cuando slo algunos genes particulares pueden ser transferidos.

PROPIEDADES DE LAS BIOPELCULAS

Las biopelculas parecen ser una forma de vida muy favorable para los microorganismos as
como una estrategia de supervivencia.
En los biofilms las bacterias estn unidas entre s y a la superficie del material, viven
continuamente a altas densidades celulares en poblaciones mixtas, facilitando los procesos de
reconocimiento celular gracias a la estrecha proximidad de las bacterias que se mantienen
unidas gracias a los EPS. La transferencia horizontal de genes se ve facilitada por este
estrecho contacto entre los agregados de clulas y la acumulacin de ADN en la matriz de
EPS, lo que puede contribuir a cambios fenotpicos en los microorganismos del biofilm.
El fenmeno de quorum sensing tambin puede ocasionar la expresion de nuevos fenotipos.
Las seales qumicas activan la transcripcin de una serie de genes para que se inicie una
respuesta coordinada de la poblacin. Estas seales de quorum estn implicadas en la
adhesin y el mantenimiento del biofilm.

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Adems los EPS secuestran nutrientes de la fase acuosa lo cual es muy interesante en ambientes
oligotrficos, y retienen agua lo que previene de la desecacin.
La matriz de EPS constituye una barrera, tanto fsica como qumica, protegiendo a las bacterias
de condiciones adversas como los biocidas, antibiticos, radiaciones, sistema inmunitario en caso
de infecciones, ....
Adems en los biofilms se establecen gradientes de oxgeno y otros aceptores de electrones, as
como gradientres de diferentes sustratos, de productos y gradientes de pH. Esto permite la
creacin de microambientes donde pueden coexistir una gran variedad de especies distintas.

RESISTENCIA A AGENTES ANTIMICROBIANOS (Antibiticos, Biocidas, Desifectantes)

La resistencia a sustancias antimicrobianas es una caracterstica que comparten todos los
biofilms. Cuando las bacterias se agrupan en estas comunidades multicelulares son capaces de
soportar condiciones antimicrobianas que erradicaran a las clulas en estado planctnico.

Clulas Planctnicas BIOFILM

Mutacin gentica Cambio en la expresin gentica
Adquisicin de genes de Estado fisiolgico REVERSIBLE
resistencia a antibiticos (Quorum Sensing)

Son muchos los factores que controlan el grado de resistencia de un biofilm a un antimicrobiano
entre los que se pueden destacar la concentracin de antimicrobiano, el grosor del biofilm, la
edad del biofilm, la densidad celular, la composicin de especies y el genotipo. Los biofilms ms
gruesos, ms maduros y ms densos son, por lo general, menos susceptibles al ataque por
antimicrobianos que los biofilms delgados, jvenes y dispersos. En general los biofilms
compuestos por varias especies son ms resistentes que los formados por una nica especie
porque en los biofilms mixtos una especie puede proteger a otra mediante diversos mecanismos y
viceversa. Aunque existen pocos datos experimentales es probable que la presencia de partculas
abiticas en el biofilm aumente la resistencia a estos agentes antimicrobianos. Los productos de
corrosin, precipitados, fibras, clulas muertas, etc, que forman parte de los biofilms podran
aumentar la proteccin reduciendo la difusin de los antimicrobianos y/o incrementando la
capacidad de sorcin, es decir, pueden obstruir fsicamente la difusin o pueden unirse al
antimicrobiano impidiendo su llegada a las clulas del biofilm.
Otro aspecto muy importante es la dosis de antimicrobiano y el tiempo de aplicacin que se
emplean para tratar a los biofilms. La regla concentracin-tiempo supone que la eficacia del
tratamiento con el antimicrobiano es proporcional a la concentracin del mismo y a la duracin
del tratamiento. Sin embargo, en la prctica esto no ocurre y se ha comprobado que en el
tratamiento de biopelculas funciona mejor una dosis elevada que una dosis ms baja aplicada
durante un periodo prolongado.

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CONSECUENCIAS DEL DESARROLLO DE BIOFILMS

Una vez que las biopelculas se han desarrollado sobre la superficie del material, las
consecuencias pueden ser favorables o desfavorables.
Entre los aspectos negativos del desarrollo de biopelculas sobre los materiales se encuentran el
Bioensuciamiento, el Biodeterioro y la Corrosin Microbiana.
El bioensuciamiento consiste en la acumulacin de microorganismos y/o macroorganismos y sus
productos metablicos sobre los materiales lo que, por ejemplo, si hablamos de intercambiadores
de calor o sistemas de enfriamiento puede originar prdidas en la transferencia de calor
El concepto de biodeterioro de materiales, se refiere a cualquier cambio indeseable en las
propiedades de un material causado por la actividad vital de los seres vivos.
Al hablar de biodeterioro de un material metlico nos estamos refiriendo a la corrosin
microbiana, que implica la participacin de los microorganismos en el proceso corrosivo, y que
ha adquirido gran importancia en los ltimos aos especialmente en la industria, causando la
prdida de millones de euros anuales como consecuencia del dao a materiales y equipos. La
corrosin microbiana representa aprox. entre el 5-10% de todos los casos de corrosin y causas
prdidas econmicas en torno al 0,4-0,5% del PIB de un pas desarrollado.
Entre los aspectos positivos del desarrollo de biopelculas destaca la Biodegradacin y la
Biorremediacin.
La Biodegradacin se refiere a la transformacin de materiales o substancias nocivas o
perjudiciales para el hombre y posterior aprovechamiento de los productos resultantes del
proceso.
La Biorremediacin implica la reparacin del dao ocasionado al ecosistema provocado como
consecuencia de la actividad humana
Otros aspectos positivos del desarrollo de biopelculas seran: el incremento de la produccin
agrcola mediante interaccin de las biopelculas con las races de plantas, la produccin de
enzimas, aditivos, antibiticos, etc.

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