Inmovilizacion 2 PDF

2011 Volumen 3, No.
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Revista Cientfica de la Universidad Autnoma de Coahuila
INMOVILIZACIN DE CLULAS Y ENZIMAS

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Ral Fajardo-Ochoa , Juan Alberto Osuna-Castro , Carlos VillaVelzquez-Mendoza , Pilar
Escalante-Minakata2 y Vrani Ibarra-Junquera3*
1
Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias, km 40 autopista Colima-
Manzanillo, Tecomn, Colima, MEXICO.
2
Universidad de Colima Facultad de Ingeniera Civil, km 9 carretera Colima-Coquimatln, Coquimatln,
Colima, MEXICO, CP 28400.
3
Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Qumicas, km 9 carretera Colima-Coquimatln,
Coquimatln, Colima, MEXICO, CP 28400.
*Correo electrnico: vij@ucol.mx, ibarrajunquera.vrani@gmail.com
INTRODUCCIN
El trmino inmovilizacin de clulas y enzimas se refiere a clulas y enzimas fsicamente confinadas o localizadas
en una cierta regin definida en el espacio reteniendo sus propiedades y actividades catalticas. Asimismo,
dependiendo del tipo de inmovilizacin tanto las clulas como las enzimas pueden ser inmovilizadas de forma
permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos proceso qumicos.
Por razones tcnicas y econmicas la mayora de los procesos qumicos catalizados por enzimas o llevados a cabo
por clulas requieren su reutilizacin o el continuo uso de biocatalizadores durante largos periodos de tiempo. Bajo
esta perspectiva, la inmovilizacin debera ser definida como una tcnica capaz de reutilizar o dar uso continuo de
biocatalizadores y clulas. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de los mtodos de inmovilizacin juegan un papel
fundamental en la seleccin de protocolos de inmovilizacin. Es por ello que por medio de la inmovilizacin es
posible no solo controlar la ubicacin de las clulas o las enzimas sino tambin modificar sus propiedades
selectivamente.
En este artculo se presenta una breve revisin del estado del arte de la inmovilizacin de clulas y enzimas,
haciendo nfasis en los distintos mtodos de inmovilizacin y cmo inciden en las propiedades de las enzimas y
clulas inmovilizadas. De igual forma, se discuten aspectos relacionados con la seleccin de soportes o matrices
durante el proceso de inmovilizacin.
1. INMOVILIZACIN DE CLULAS
La investigacin sobre inmovilizacin de organismos unicelulares ha generado gran inters en la comunidad

cientfica, debido a sus grandes ventajas tcnicas y econmicas respecto a la fermentacin tradicional. Entre las
principales ventajas que presentan los sistemas biotecnolgicos que utilizan clulas inmovilizadas se encuentra su
facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor control
en sistemas continuos y la posible recuperacin de la biomasa para su posterior reutilizacin. En general, los
materiales para inmovilizar clulas deben cumplir importantes requisitos como: ser grado alimenticio (segn sea el
caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para condiciones de pH y temperatura bajas (Bakoyianis et
al., 1992 y 1996; Bardi y Koutinas, 1994; Fumi et al., 1987; Shimobayashi y Tominaga, 1986). Los mtodos de
inmovilizacin de clulas ms usados son la autofloculacin (Verstrepen y Klis, 2006; Stewart y Russel, 1986), la
adsorcin sobre soportes (Bardi et al., 1996) y la incorporacin de levaduras en matrices slidas.
La floculacin es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural (Stewart y Russel, 1986). La adsorcin
consiste en la adhesin de las levaduras a la superficie externa de un soporte como es el caso del gluten (Stewart y
Russel, 1986) o de la DEAE-Celulosa (Lommi y Ahvenaimen, 1990). La incorporacin de clulas a matrices slidas
se realiza por el atrapamiento de las mismas en el seno de un material polimrico. Las matrices ms adecuadas son
polmeros naturales como el alginato, el carragenato y el agar ya que polimerizan en condiciones muy suaves
aunque tambin se pueden usar matrices sintticas como poliacrilamida y poliuretano (Groboillot et al., 1994).
El atrapamiento de levaduras en matrices slidas puede realizarse por difusin de las clulas en matrices slidas
sintetizadas previamente (Baron y Willaert, 2004) o por formacin de las matrices alrededor de las clulas
(Ramakrishna y Pakasham, 1999). Este mtodo de inmovilizacin permite conseguir grandes concentraciones de
biomasa (Stewart y Russel, 1986) con el uso de reactores fluidizados (Verbelen et al., 2006). Adems se pueden
inmovilizar en matrices independientes clulas que no podran coexistir en contacto directo debido al efecto killer
http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html
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(Prez e et al., 2001). No obstante, al igual que los otros mtodos de inmovilizacin presenta desventajas. Las ms
importantes son los posibles problemas de difusin de nutrientes y productos a travs de la matriz porosa y la pobre
resistencia mecnica de los soportes slidos (Verbelen et al., 2006).
La inmovilizacin de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha utilizado con xito en la fermentacin de

vino blanco y en la produccin de etanol (Cachon y Divies, 2001). Debido a cambios en la composicin de las
clulas por interaccin con el soporte de alginato, estos catalizadores se vuelven ms activos y se observa que la
fermentacin ocurre a mayor velocidad respecto a los casos en los que se emplean levaduras libres (Galazzo y
Bailey, 1990). Otra ventaja importante de estos sistemas inmovilizados es que el soporte protege la levadura de la
accin de inhibidores, metales pesados, fenoles y temperaturas extremas. Adems, a diferencia de los flculos de
biomasa, estos slidos al ser ms sencillos de manejar, permiten un mejor control de la actividad cataltica en
reactores de tipo lote y continuos.
La implementacin de sistemas con levaduras inmovilizadas ha sido de especial inters para el rea de los vinos
espumosos. La forma tradicional de preparacin de estos vinos implica el uso de levaduras libres y la posterior
eliminacin de stas por medio del dgorgement, esto es mediante congelacin (-25C) del cuello de la botella
donde las levaduras se acumulan por sedimentacin durante el remuage. Este proceso lento y costoso puede ser
sustituido mediante el uso de levaduras inmovilizadas en perlas de alginato sin que la cintica del proceso se vea
afectada consiguindose las mismas propiedades organolpticas que los vinos producidos de manera tradicional
(Yokotsuka et al., 1997). En el ao 2001 el Institute Oenologique des Vins de Champange (IOC) report la
fabricacin de tres millones de botellas mediante el uso de este tipo de tecnologa (Divies y Chacon, 2005). Tambin
se han reportado estudios en los que se usan estos dispositivos para la produccin de sidra espumosa y vinos de
pia (Divies y Deschamps, 1986).
Cabe destacar que combinando esta tecnologa con el uso de reactores de alta presin y reactores de flujo continuo
ha sido posible la produccin a gran escala de vinos espumosos con composiciones y propiedades sensoriales
similares a los fabricados tradicionalmente en botellas con levaduras libres (Iconomopoulou et al., 2002)
En el campo de los vinos espumosos tambin se ha implementado el uso de membranas acopladas al tapn de la
botella que permiten el contacto entre el vino y las levaduras durante la fermentacin final (Lemonnier, 1992). Esta
tcnica alarga los tiempos de fermentacin, pero ofrece la posibilidad de realizar el dgorgement de manera ms
sencilla sin necesidad de enfriar la botella.
Otro proceso de inters en el que la inmovilizacin de clulas exhibe gran potencial es en la fermentacin
malolctica. Este proceso es esencial en la preparacin de muchos vinos, ya que la transformacin de cido
malolctico en cido lctico y anhdrido carbnico reduce la acidez y mejora la calidad de los mostos. Esta
fermentacin es difcil de controlar mediante las tcnicas de fabricacin tradicionales, ya que las bacterias que
catalizan dicha fermentacin, principalmente Oenococcus oeni, son especialmente sensibles a la temperatura, pH y
concentracin de SO2. En 1991, se report que el O. oeni inmovilizado en perlas de alginato se puede adaptar
fcilmente a procesos en continuo sin que se observe prdida de actividad en procesos de fermentacin malolctica
(Fleet et al., 1991). Sin embargo, tambin se han reportado resultados en los que s se observa una prdida
importante de actividad en sistemas parecidos (Naouri et al., 1991).
Con base en lo presentado anteriormente es posible afirmar que la produccin de vinos espumosos se ha
beneficiado con el uso de tecnologas que involucran la inmovilizacin de clulas. No obstante, es de esperar que
con un mejor entendimiento de los procesos de fermentacin y la fisiologa de los microorganismos inmovilizados,
sea posible implementar esta tecnologa a otros procesos de produccin.
1.1 Problemas con la inmovilizacin de clulas
Si bien, el uso de clulas inmovilizadas en matrices slidas ha permitido la implementacin de procesos de

fermentacin en sistemas de flujo continuo. Existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los
cuales se describen a continuacin.
Los sistemas floculados presentan un difcil manejo debido a que la floculacin depende de factores como el pH, la
concentracin de Ca2+, temperatura y la agitacin (Verstrepen et al., 2003; Sampermans et al., 2005). Adems, cada
cepa de levadura presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers, 1999).
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Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en el reactor, lo cual
resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos. El mayor problema que presenta esta tcnica es el
bloqueo que eventualmente sufren los poros de la membrana debido a partculas o a las mismas levaduras (Lebeau
et al., 1998). Por otro lado, la inmovilizacin de clulas por adsorcin sobre la superficie de materiales es fcil de
conseguir, pero al ser la adsorcin un fenmeno fundamentalmente electrosttico, durante los procesos en continuo,
especialmente por efecto de la agitacin, las clulas se liberan del soporte. Adems, por este mtodo es difcil
inmovilizar grandes cantidades de biomasa (Verbelen et al., 2006).
1.2 Otros mtodos de inmovilizacin de clulas para procesos de fermentacin
Si bien, existe una problemtica alrededor del uso de clulas inmovilizadas, hoy en da se han enfocado esfuerzos
en el desarrollo de rutas novedosas que permitan el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de
materiales porosos diferentes a los polmeros de origen natural que se han usado hasta ahora. Muchos de estos
slidos porosos podran encontrar un lugar importante en los procesos de produccin de vinos y fermentaciones
alcohlicas en general.
Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en diversos procesos catalticos,
prueba de ello es su extensa aplicacin (Corma, 1995). Debido a su tamao de poro pequeo, no sera posible
inmovilizar levaduras dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeolticas s podra ser de gran
utilidad en procesos de fermentacin en los que se requiere eliminar el etanol del reactor de forma selectiva (Bowen
et al., 2003). Para tal aplicacin se podran emplear materiales zeolticos hidrofbicos convencionales como la
zeolita beta (Camblor et al., 1996) o materiales hbridos orgnicos-inorgnicos como los metilaluminofosfatos-alfa y
metilaluminofosfatosbeta (Maeda et al., 1997). Cabe mencionar que la produccin de membranas zeolticas
compactas y con propiedades mecnicas adecuadas no es sencilla y hoy en da sigue siendo un reto para muchos
grupos de investigacin.
Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares (Taguchi y Schuth, 2005), aunque
siguen sin presentar el tamao de poro adecuado para la inmovilizacin de levaduras, s permiten la inmovilizacin
de enzimas (Yiu y Wright, 2005). Esto hace que estos slidos tengan un inters especial en la industria vincola ya
que mediante el uso de enzimas podran modificarse la naturaleza de algunas sustancias responsables de aromas y
sabores caractersticos del vino consiguindose productos con propiedades organolpticas diferentes. Los
materiales mesoporosos ms adecuados para la inmovilizacin de enzimas seran los slidos del tipo SBA-15
debido a su gran tamao de poro (Zhao et al., 1998). La inmovilizacin de las enzimas se conseguira por difusin
de las mismas en los poros del slido previamente funcionalizado con molculas que anclaran la enzima a la
pared del material (Hartmann, 2005). Slidos como los que se proponen aqu podran usarse en procesos en
continuo o en sistemas fluidizados.
La inmovilizacin de levaduras requiere de materiales macroporosos con radios del orden de algunas micras. Estos
materiales pueden sintetizarse mediante dos tcnicas:
La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerizacin en microemulsin, que posteriormente son usadas
como moldes que se recubren con precursores de xidos, metales u otros materiales (Grochowicz et al., 2008;
Marrero-Lpez et al., 2008). Por medio del proceso de calcinacin de las esferas es posible sintetizar materiales
macroporosos de cavidades esfricas regulares conectados por ventanas de menor tamao. Mediante esta tcnica
sera posible sintetizar bioslidos de gran resistencia mecnica en los que no habra grandes problemas de difusin
de reactivos o productos. El paso ms complejo de sntesis sera la inoculacin de las clulas en el interior del
slido, ya que aunque los poros pueden ser muy grandes, las levaduras deben difundir por las ventanas que
comunican los poros. La estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podra resultar de inters para la
fabricacin de membranas para la retencin de levaduras en reactores en continuo.
El segundo mtodo que posee gran potencial es el uso de materiales porosos sintetizados por congelacin
unidireccional y posterior liofilizacin (Choi et al., 2009). Esta tcnica de preparacin de slidos macroporosos, al ser
reciente, es la menos explorada en el campo de la catlisis. Este mtodo implica la congelacin de una solucin de
partculas que pueden ser polimricas, silceas, metlicas etc. a temperatura de nitrgeno lquido de manera
unidireccional y a velocidad controlada. El proceso que parece complejo, es en realidad un mtodo sencillo de
fabricacin de materiales macroporosos que, adems, permite la incorporacin de especies biolgicas in-situ en la
matriz durante la sntesis del material debido a que no se requiere calcinacin de ningn molde orgnico. Para
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inmovilizar bacterias dentro de una matriz polimrica Gutirrez et al. (2007), partieron de una suspensin acuosa
concentrada de bacterias E. coli protegidas con alginato de calcio y glucosa. Las cuales incorporaron a la
suspensin alcohol polivinlico y la mezcla se transfiri a una jeringa de insulina. Esta se introdujo en un bao con
nitrgeno lquido a velocidad controlada (5.9 mm/min) y posteriormente se liofiliz. Durante el proceso de
congelacin unidireccional se producen frentes de congelacin perpendiculares a la direccin de inmersin en los
que los cristales de hielo apartan las impurezas, que en este caso seran las bacterias y el alcohol polivinlico. Una
vez eliminado el hielo por liofilizacin se obtiene una matriz porosa de alcohol polivinlico en la que quedan retenidas
las bacterias. En este caso las bacterias se recubrieron con alginato-glucosa para protegerlas durante el proceso de
congelacin criognica. Mtodos similares de proteccin deben usarse si se pretende inmovilizar sistemas
biolgicos sensibles al proceso de congelacin. Otra ventaja de este mtodo es que se obtienen monolitos con la
forma y geometra del recipiente que contiene la suspensin que se congela, en lugar de los clsicos polvos que dan
como resultado los otros mtodos de inmovilizacin. Tambin es posible modular el tamao de poro al jugar con la
relacin masa suspendida/agua de la suspensin a congelar y con la velocidad de inmersin. De ah que estos
mtodos novedosos de inmovilizacin de clulas abran un abanico de posibilidades empleando matrices slidas de
diversa naturaleza, y as de esta forma lograr disear sistemas de fermentacin que trabajen en reactores continuos.
Asimismo, existen otros mtodos modernos que no requieren del uso de dispositivos inmovilizadores complejos.
Uno de estos mtodos es el uso de catalizadores artificiales inertes, como los nanotubos de carbono, que inducen la
floculacin de los micro-organismos. Utilizando nanotubos de carbono, clulas de Saccharomyces cerevisiae han
sido inmovilizadas exitosamente por el mtodo de floculacin (T.A. Mamvura, 2010). Aunque esta tcnica aporta
buenos resultados con respecto a la inmovilizacin, la sntesis selectiva de nanotubos de carbono sigue siendo
costosa.
Es comn que la inmovilizacin de levaduras y enzimas con los mtodos mencionados anteriormente enfrenten
problemas tcnicos y cientficos. No obstante, es importante plasmar una visin sobre las expectativas y
potencialidades que tienen estos materiales en el proceso de fermentacin alcohlica. Por lo tanto, surge la
motivacin para realizar investigacin profunda y novedosa fundamentada en el hecho de que los recientes avances
en la sntesis de micro y nano materiales porosos an no se han permeado al campo de la catlisis con levaduras.
Por lo cual, se abren nuevos horizontes en el rea de investigacin y aplicacin de estos mtodos de inmovilizacin
de clulas.
2. INMOVILIZACIN DE ENZIMAS
En la actualidad, la industria requiere gran cantidad de enzimas con el fin de obtener productos con mejores
caractersticas y menor costo. Por ello, la implementacin de procedimientos que aumenten la estabilidad de las
enzimas y permitan su reutilizacin ha sido por muchos aos el objetivo de diversos laboratorios alrededor del
mundo. La preparacin y estabilizacin de enzimas ha sido un tema de estudio desde hace casi 50 aos (Piug-
Muset, 1964) y es de inters tanto cientfico como econmico.
La inmovilizacin combina la actividad elevada y especfica de las biomolculas activas, como las enzimas o
anticuerpos, con la estabilidad qumica y mecnica del soporte. Consiste en mantener la biomolcula unida o
atrapada en un soporte fsico, conservando su actividad cataltica y permitiendo el flujo de sustratos y productos. Las
enzimas pueden ser inmovilizadas en sustratos naturales y/o sintticos por medios qumicos (unindolas al sustrato
mediante enlaces covalentes) o fsicos (fuerzas electrostticas o membranas), y pueden adems ser encapsuladas
mecnicamente la adicin de agentes que formen una pelcula protectora alrededor de la enzima inmovilizada,
permitiendo el paso de reactivos y productos de pequeo tamao, pero no de protenas (Heering et al., 2004; Wang
y Caruso, 2005).
Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en solucin. Permiten un uso continuo,
reutilizacin y control de las concentraciones de protena empleada. Asimismo, es viable mejorar la estabilidad y
actividad de la enzima en funcin del pH y la temperatura, adems, al ser inmovilizadas quedan protegidas ante
enzimas proteolticas, aumentando as la eficiencia del sistema. Sin embargo, la inmovilizacin tambin puede
presentar ciertas desventajas, por ejemplo, la actividad de la enzima puede verse afectada por el proceso de
inmovilizacin, adems, la velocidad de reaccin puede estar limitada por la velocidad de difusin de sustratos y
productos hacia dentro y fuera del sistema.
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2.1 Clasificacin de mtodos de inmovilizacin

Los mtodos de inmovilizacin de enzimas se clasifican en dos rubros: mtodos reversibles y mtodos irreversibles
(Gupta y Mattiasson, 1992).
2.1.1 Mtodos de Inmovilizacin Irreversibles

El concepto de inmovilizacin irreversible implica el enlace del biocatalizador a un soporte de manera permanente,
por lo cual el biocatalizador no puede ser liberado sin destruir o modificar su actividad biolgica o el soporte. Los
procedimientos ms comunes de inmovilizacin irreversible son el enlace covalente, enlace cruzado, atrapamiento y
micro encapsulado.
a) Formacin de enlaces covalentes
La inmovilizacin de protenas por mtodos basados en la formacin de enlaces covalentes estn entre los ms
usados. La ventaja de estos mtodos estriba en la naturaleza estable de los enlaces formados entre las enzimas y el
soporte. De igual manera, las enzimas en este mtodo no son liberadas en la solucin en uso. Sin embargo, para
lograr altos niveles de enlace, los residuos de aminocidos esenciales para la actividad cataltica no deben
involucrar un enlace covalente con el soporte aunque esto puede resultar difcil de lograr en algunos casos.
Los mtodos covalentes de inmovilizacin son empleados cuando existe un requerimiento estricto de ausencia de
enzimas en el producto.
Los mtodos de acoplamiento en general pueden dividirse en 2 clases: 1) activacin de la matriz o soporte por
adicin de una funcin reactiva en un polmero y 2) modificacin del polmero para producir un grupo activado. Los
procesos de activacin son comnmente diseados para generar grupos electroflicos en el soporte, el cual durante
el acoplamiento reaccionan con los fuertes nuclefilos en las protenas. Los principios bsicos que controlan el
acoplamiento covalente con matrices son anlogos con las usadas en la modificacin qumica de protenas. Las
reacciones ms usadas involucran las siguientes cadenas de amino cidos: lisina (grupo amino), cistena (grupo
tiol), y cidos asprtico y glutmico (grupo carboxilo).
En este mtodo se enlaza covalentemente la enzima con un soporte insoluble natural o sinttico. El enlace se da
entre algn grupo funcional reactivo de la enzima (amino, Cis-tiol, Tir-hidroxil o His-imidazol) y el soporte
previamente activado, generalmente recubierto con grupos funcionales orgnicos en la superficie (Monocapas tiol
autoensambladas, oro, CNBr-Sepharosa, etc.) (Figura 1). El seguimiento de la inmovilizacin se realiza
cuantificando la concentracin de protena libre (generalmente por el mtodo de Bradford), y de la protena unida
covalentemente al soporte (ej. cido bicinconnico). Las desventajas de este mtodo radican en el sitio del enlace,
ya que puede modificarse el sitio activo o pueden ocurrir impedimentos estricos que reduzcan la actividad. Sin
embargo, esto es poco probable y puede verse reducido al dirigir el enlace a sitios especficos y/o con una
orientacin molecular definida (Wood et al., 1997; Heering et al., 2004). Adems, la unin por enlace covalente
confiere a la enzima una inmovilizacin ms estable a cambios de pH y temperatura en el medio (Queiroz-Claret et
al., 1997).
Soporte con grupos

funcionales en la superficie
Enzima inmovilizada y
orientada mediante
enlace covalente
Sitio de enlace
Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un soporte fsico por enlace covalente, las enzimas se encuentran orientadas
espacialmente en el soporte
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b) Formacin de enlaces cruzados
Con esta tcnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilizacin se da por un enlace directo entre enzimas,
que puede ser mediado o no por un agente de unin. Generalmente se aade el agente de bajo peso molecular (ej.
glutaraldehdo) a la enzima en solucin, uniendo covalentemente los grupos funcionales de las enzimas para formar
agregados (Figura 2). Este mtodo tiene como ventaja su sencillez, sin embargo, es susceptible a cambios
pequeos de pH y temperatura en las condiciones de operacin (Gdia-Casablancas, 2005).
Protena inmovilizada
Agente de unin
Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces cruzados (lneas negras).
c) Atrapamiento
El mtodo de atrapamiento est basado en la oclusin de las enzimas dentro de una red polimrica que permite al
sustrato y a los productos pasar a travs de ellos y retener las enzimas (ODriscoll, 1976). Este mtodo difiere de
los mtodos de acoplamiento covalente descritos anteriormente, ya que las enzimas no estn enlazadas a la matriz
o soporte. Existen diversos mtodos de atrapamiento de enzimas como el de gel (Bernfeld y Wan, 1963) o
atrapamiento por fibras (Dinelli et al, 1976), microencapsulado (Wadiack y Carbonell, 1975) y por inclusin. El uso
prctico de estos mtodos es limitado debido a la baja transferencia de masa a travs de las membranas o geles.
Atrapamiento por inclusin. Con este mtodo la enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite
una fcil difusin de productos. La matriz puede ser de origen natural o sinttico y de diversos materiales (Slica gel,
poliacrilamida, agarosa, carregnatos, entre otros), y pueden clasificarse como geles hmedos, geles secos
(xerogeles) o geles en aerosol (aerogeles) (Figura 3). En este mtodo las enzimas son colocadas en una solucin
que posteriormente es gelificada (por temperatura o adicin de polimerizantes), quedando atrapadas dentro de la
matriz (Figura 3A). En algunos casos el gel es sometido a un proceso de secado y molido, obteniendo as mayor
rea de contacto entre la enzima y la solucin que contiene el sustrato (Figura 3B), dando como resultado esferas
de 2 m con un tamao de poro de 35 7 (Mureseanu et al., 2005). Tambin es posible incrementar la capacidad
de inmovilizacin de los geles al utilizar agentes estabilizadores (sorbitol, polietilenglicol, diferentes mono- o
disacridos) y surfactantes (lecitina, lactosa, 3-sn-fosfatidilclorina, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB))
(Mureseanu et al., 2005), o al aadir agentes policatinicos o polianinicos con carga contraria a la enzima o a
regiones de la superficie de la misma como el poli(1-vinilimidazol) (PVI) y la poli(etilamina) (PEI) antes de la
polimerizacin (Chen et al., 1998). La inclusin tiene la ventaja de prevenir el acceso de proteasas y mantener
intacta la estructura de la protena, por lo que su actividad no se ve afectada. Sin embargo, el tamao de los poros
no puede ser controlado, es difcil de escalar y reutilizar ya que el gel puede disolverse bajo ciertas condiciones o
tras poco tiempo de uso, y un aumento en la cantidad de enzima cargada ms all de cierto punto no implica
necesariamente un aumento de la actividad, debido a las limitantes de difusin que se podran presentar.
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Matriz de gel
Protena inmovilizada incluida en la matriz
B Matriz de gel reducida

a pequeas esferas
Protena incluida
en las esferas
Figura 3. Enzimas inmovilizadas por inclusin dentro de una matriz de gel. A) gel hmedo. B) esferas del gel seco y
triturado.
Atrapamiento por micro-encapsulacin. El mtodo puede ser de dos tipos: por microencapsulacin en soportes
porosos (con un dimetro de 2-50 nm), que posteriormente pueden ser recubiertos con un revestimiento
nanocompuesto, atrapan la enzima en su interior y permiten el paso de sustratos y productos (Figura 4A); por
microemulsin o liposomas, combinando la enzima con agentes emulsificantes y agitando para formar micelas que
la protegen de medios cidos/alcalinos, proteasas y durante los periodos de almacenamiento (Chen et al., 1999;
Kuiper et al., 2008) (Figura 4B).
En la microencapsulacin las partculas porosas (esferas de slice con nanoporos, micropartculas de CaCO3, etc.)
son puestas en suspensin con la enzima por un tiempo dado (aprox. 40 min), y la cantidad de enzima inmovilizada
es monitoreada por espectroscopa. La desventaja radica en la inclusin de la enzima en el interior de la matriz, ya
que generalmente queda atrapada en la superficie exterior y puede desprenderse paulatinamente debido al tipo de
interacciones presentes o tras varios ciclos de uso (Volodkin et al., 2004). Sin embargo, esto se ve solucionado al
controlar el tamao de poros de las esferas y al dar un tratamiento con un agente que encapsule la protena (ej.
policloruro de dialilamonio, nanopartculas de slice, polihidrocloruro de alilamina o poliestirensulfonato) evitando su
fuga y protegindola de proteasas, adems, este mtodo por su naturaleza de interaccin suave, permite una alta
actividad y resistencia a cambios de pH y temperatura (Wang y Caruso, 2004; 2005).
La microemulsin tiene la ventaja de ser muy sencilla, suficientemente porosa para permitir que la enzima funcione
en un sistema en solucin, pero al mismo tiempo protegida del ambiente degradante. Tambin puede llevarse a
cabo repetidas veces (emulsin mltiple), agregando agentes emulsificantes secundarios y espesantes (ej. goma
arbiga, Tween 80, polestireno40-b-poili(isocianoalanina(2-thiophen-3-il-etil)amida)50, entre otros), para proporcionar
una mayor proteccin. Adems, por la naturaleza de los reactivos utilizados, puede tener uso farmacolgico en la
administracin oral de inmunoglobulinas. La desventaja de este mtodo radica en la prdida de actividad ante la
inmovilidad de la protena al quedar atrapada en la interface agua/aceite, o al ser desnaturalizada por el esfuerzo de
corte generado durante la preparacin de las micelas (Chen et al., 1999; Kuiper et al., 2008). El dimetro de las
micelas puede variar de 100 a 250 nm, dependiendo de los emulsificantes utilizados, de la fluidez del copolmero y
de la habilidad de la enzima para ser adsorbida en la membrana.
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Protena inmovilizada
dentro de los poros
A
Soporte esfrico poroso Protena inmovilizada

dentro de la micela
Figura 4. Enzimas inmovilizadas por encapsulacin.

A) microencapsulacin dentro de esferas porosas. B) Microemulsin en micelas.
2.1.2 Mtodos de Inmovilizacin Reversible

En el mtodo de inmovilizacin reversible, las enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas del soporte bajo
condiciones no extremas. El uso de mtodos reversibles para la inmovilizacin de enzimas es altamente atractivo,
principalmente por razones econmicas debido a que el soporte puede regenerarse y recargarse con enzimas
nuevas cuando la actividad enzimtica decae. Existen distintos mtodo de inmovilizacin reversible, que a
continuacin se describen:
Por adsorcin
El mtodo de adsorcin emplea soportes orgnicos o inorgnicos que presentan un adsorbente activo (monocapas-
tiol auto ensambladas, oro, entre otros) en los cuales, las enzimas son atradas y retenidas por medio de
interacciones inicas o fuerzas dbiles (puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones
hidrofbicas) (Figura 5) (Wood et al., 1997). Este mtodo consiste en poner en contacto la enzima en solucin
acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48 h), para despus lavar el soporte y eliminar la
enzima que no fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la enzima, ya que la unin
es dbil y no afecta su conformacin, sin embargo, esta caracterstica hace que al mismo tiempo la unin sea
reversible y sensible a cambios de pH y temperatura.
49
Soporte con adsorbente activo

cargado negativamente
Protena inmovilizada con

una regin cargada
positivamente
Figura 5. Enzimas inmovilizadas en un soporte fsico. A) Por adsorcin, la regin positiva de la protena interacta
con el soporte negativo.
Adsorcin no especfica. El mtodo de inmovilizacin reversible ms simple es la adsorcin no especfica, el cual

se basa en la adsorcin fsica o enlace inico (Messing, 1976; Woodward, 1985). En la adsorcin fsica las enzimas
son unidas a la matriz a travs de puentes de hidrgeno, fuerzas de van der Waals, o interacciones hidrofbicas;
mientras que enlaces inicos de enzimas son producidos a travs de uniones con sales. La naturaleza de las
fuerzas involucradas en la inmovilizacin no covalente resulta en un proceso que puede ser reversible cambiando
las condiciones que influyen en la resistencia de la interaccin (ej. pH, resistencia inica, temperatura y polaridad del
solvente). La inmovilizacin por adsorcin es fcil de realizar y usualmente preserva la actividad cataltica de la
enzima. Dichos mtodos son, por lo tanto, atractivamente econmicos, pero pueden presentar problemas como la
liberacin de enzimas cuando las interacciones son relativamente dbiles. De igual forma es difcil encontrar
condiciones bajo la cuales las enzimas permanecen enlazadas fuertemente y activas.
Adsorcin hidrofbica. Otro mtodo es el uso de interacciones hidrofbicas, donde la adsorcin hidrofbica ha
sido utilizada como un principio cromatogrfico por ms de 3 dcadas. Consiste en variables experimentales
conocidas como el pH, concentracin de sales, y la temperatura (Porath, 1987). La resistencia de las interacciones
radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la protena. La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser regulada por
el grado de sustitucin del soporte y por el tamao de la molcula ligante hidrofbica. El xito de la inmovilizacin
reversible de la -amilasa y amiloglucosidasa en soportes de hexilagarosa ha sido reportada (Caldwell et al 1976;
Caldwell et al, 1982). Muchos otros ejemplos de enlace reversible con adsorbedores hidrofbicos ha sido tambin
mostrado en la literatura. (Cashion, 1982; Yon, 1974; Dixon, 1979)
Quelacin o enlace metlico. Sales de metales de transicin o hidrxidos depositados en la superficie de soportes
orgnicos han podido ser enlazados gracias a la coordinacin de los grupos nucleoflicos en la matriz. Se utilizan
principalmente sales de titanio y circonio, siendo este mtodo conocido como inmovilizacin por enlace metlico
(Cabral, 1991; Cabral, 1986; Kennedy, 1985). La sal metlica o el hidrxido es precipitado en el soporte (ej.
celulosa, quitina, acido algnico y bases de slice) por calentamiento o neutralizacin. Debido a los factores
estricos es posible para la matriz ocupar todas las posiciones de coordinacin del metal, por lo tanto algunas de las
posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos de enzimas.
La elusin de protenas enlazadas puede ser fcilmente lograda por competencia con ligantes solubles o
disminuyendo el pH. El soporte es subsecuentemente regenerado lavndolo con un fuerte quelante como el cido
etilendiaminotetraactico (EDTA). Estos soportes metlicos han sido utilizados ampliamente en cromatografa de
protenas (Porath, 1992; Kagedal, 1998).
Formacin de enlaces disulfuro. Estos mtodos son nicos, porque aunque se forma un enlace covalente estable
entre la matriz y la enzima, es posible que se rompan los enlaces por medio de una reaccin utilizando agentes
apropiados como el dithiotreitol (DTT) bajo suaves condiciones. Adems, debido a que la reactividad de los grupos
50
tiol pueden ser modulados mediante la alteracin del pH, la actividad es alta para mtodos que usan enlaces
disulfuro, con la condicin de que el apropiado tiol adsorbente con alta especificad sea utilizado (Carlsson, 1998).
Puntos crticos. Cabe mencionar que aunque la inmovilizacin sea dirigida a un sitio y/o por un mtodo especfico,
los enlaces qumicos y las interacciones entre la enzima y el soporte son complejos, y un mtodo de estabilizacin
nico no asegura que las interacciones sean 100% propias del mtodo (Wood et al., 1997). La estabilidad de
protenas globulares en una matriz generalmente depende de las interacciones electrostticas, interacciones
estricas, cambios en el estado de hidratacin y reacomodos en la estructura de la protena (Volodkin et al., 2004),
adems, dicha estabilidad es determinada por la combinacin de fuerzas electrostticas globales e interacciones
locales especficas (Chen et al., 1998). Las fuerzas electrostticas globales tienen efecto directo en la adsorcin de
la enzima, y el pH del medio altera el grado de influencia de estas fuerzas electrostticas, en especial la interaccin
protena-sustrato (Volodkin et al., 2004).
En lo que concierne a la mejora de la estabilidad de enzimas han surgido dos conceptos fundamentales, el primero
indica que al restringir el movimiento de los segmentos en las cadenas de la protena se reduce la probabilidad de
un cambio estructural irreversible; el segundo, un cambio similar irreversible en la estructura de la protena ocurre
por el choque de los segmentos con la superficie en la que la enzima es inmovilizada o adsorbida (Chen et al.,
1998).
En algunos casos cuando se estabiliza una enzima por inmovilizacin, un cambio estructural irreversible puede ser
prevenido restringiendo el movimiento de los segmentos al encerrar la enzima en cavidades estrechas (Chen et al.,
1998). Un tamao de poro similar al tamao de la enzima es ms apropiado para obtener una buena actividad
(Mureseanu et al., 2005). Un alto rendimiento en la estabilizacin puede ser logrado al aadir azcares a la enzima
en solucin, ya que estos pueden contribuir a mantener la estructura tridimensional de la protena, lo que es crucial
para su actividad, adems, el tipo y la cantidad de azcar utilizado en la estabilizacin es determinante para generar
una alta actividad cataltica (Mureseanu et al., 2005). A continuacin se indican algunas enzimas que han sido
inmovilizadas por distintos mtodos (Tabla 1).
Tabla 1. Comparacin entre los distintos mtodos de inmovilizacin de enzimas

Enzima inmovilizada % de actividad tras Tipo de proteccin
Enzima Mtodo de inmovilizacin Caracterstica Cantidad Porcentaje la inmovilizacin Proteasas pH T Tiempo Referencias
Cit C BMS 231 mg/g 23.10% - - - -
Lisozima BMS 397 mg/g 39.70% - - - -
Proteasa Microencapsulacin BMS 203 mg/g 20.30% - - - - Wang y Caruso, 2005.
BMS 75 mg/g 7.50% 35% Tras 25 ciclos No Si - Si
Catalasa PDDA/SiNP 75 mg/g 7.50% 70% Tras 25 ciclos Si Si - Si
HRP Microencapsulacin CaCO3 poroso 1.5 pg/esfera 37% - - Si - Volodkin et al ., 2004.
Gox An Si - - Si
HRP Ar Microemulsin PS-PIAT Si - - Si Kuiper et al ., 2008.
Tween-80 58.70% Si Si - -
IgG de leche Microemulsin Protena de soya 50% Si Si - - Chen et al ., 1999.
Estearato de sacarosa 56.10% SI SI - -
Gox An Slica-Gel - - Si -
Lox Av Inclusin Slica-Gel/PVI - - Si - Chen et al ., 1998.
GLyOx So Slica-Gel/PEI - - Si -
Lipasa N 0.5 mg/g 0.05% 20% - - - -
Estearasa GB Inclusin MTS 1 mg/g 0.10% 46% - - - - Mureseanu et al ., 2005.
Lipasa MY 1 mg/g 0.10% 20% - - - -
Covalente 22%
Cit C Sc Adsorcin SAMS 78% Wood et al ., 1997.
Fosfatasa 2A Covalente CNBr-Sepharosa 70-85% Casi 100% Neg Neg Si - Queiroz-Claret et al ., 1997.
Enzimas: Citocromo C (Cit C), peroxidasa de rabano (HRP), glucosa oxidasa de Aspergillus niger (GOx An), peroxidasa de rbano de Amoracia rusticana (HRP Ar), inmunoglobulina G de leche (IgG),
glucosa oxidasa de Aspergillus niger (GOx An) lactato oxidasa de Aerococcus viridans (LOx Av), glicolato oxidasa de Spinacia oleracea (GLyOx So), lipolasa de Thermomyces lanuginosus
recombinante de Aspergillus oryzae (Lipolasa N), estearasa de Mucor miehei (Estearasa GB), lipasa MY de Candida cylindracea (Lipasa MY), citrocromo C de Saccharomyces cerevisiae (Cit C Sc)
y fosfatasa 2A de Yarrowia lipolytica (Fosfatasa 2A).
Abreviaciones: BMS, Silica con mesoporos bimodales; PDDA/SiNP, poli(dialilmetilamonio)/nanopartculas de slica; PS-PIAT, polestireno40-b-poili(isocianoalanina(2-thiophen-3-il-etil)amida)50;
PVI, poli(1-vinilimidazol); PEI, poli(etilamina); MTS, micelas de silica templada; SAMS, monocapas tiol autoensambladas. -, no reportado; Neg, efecto negativo.
2.2 Seleccin de soportes
Las caractersticas de las matrices o soportes son de gran importancia en la determinacin de la eficiencia del
sistema de inmovilizacin de enzimas. Las propiedades ideales de un soporte incluyen la resistencia fsica a la
compresin, hidrofilicidad, inertes entre las enzimas y sus derivados, biocompatibilidad, resistencia al ataque
microbial y bajo costo (Trevan, 1980; Brodelius y Mosbach, 1987; Buchholz y Klein, 1987). Asimismo, los soportes
pueden clasificarse en inorgnicos y orgnicos en funcin de su composicin qumica. En donde los soportes
orgnicos pueden dividirse en polmeros naturales y sintticos (Cabral y Kennedy, 1991).
Las caractersticas fsicas de los soportes (como el tamao medio de partcula, resistencia mecnica a la
compresin, etc.) son de gran importancia en el comportamiento del sistema inmovilizador y determinar el tipo de
51
reactor por usar bajo condiciones tcnicas. En particular, el parmetro de poro y el tamao de partcula establecern
el total del rea superficial, por lo tanto la adecuada seleccin incidir en la capacidad de enlace de las enzimas. Los
soportes no porosos muestran pocas limitaciones difusionales, pero presentan baja capacidad de carga. Por lo
tanto, los soportes porosos son generalmente preferidos por su alta rea superficial que permite una alta carga de
enzimas, as como porque las enzimas inmovilizadas quedan aisladas del medio ambiente. Se debe controlar la
distribucin del tamao de poro en los soportes porosos para optimizar la capacidad y las propiedades de flujo. A
pesar de las muchas ventajas de los soportes inorgnicos (ej. alta estabilidad ante degradacin fsica, qumica y
microbial), la mayora de las aplicaciones industriales se realizan con soportes orgnicos. El carcter hidroflico es
uno de los factores ms importantes que se utilizan para determinar el nivel de actividad de las enzimas
inmovilizadas (Gemeiner, 1992). Una excelente matriz o soporte que ha sido utilizada es la agarosa. Adems de su
alta porosidad que influye en su elevada captacin de protenas, tambin presenta un carcter hidroflico, fcil
obtencin, ausencia de grupos con carga (el cual previene la adsorcin no especfica del sustrato y los productos) y
es de bajo costo. Sin embargo, como la mayora de las enzimas son relativamente inestables, el costo del
aislamiento es todava alto, y es tcnicamente difcil recuperar un enzima activa despus de una reaccin.
CONCLUSIONES
En conclusin, la inmovilizacin de clulas y enzimas es un proceso prometedor en la industria, con las ventajas y
desventajas antes mencionadas, y bajo condiciones que pueden ser optimizadas en el laboratorio, pero sobre todo
con un enorme campo de aplicacin. Este proceso puede ayudar a mejorar la produccin de alimentos, frmacos,
qumicos y bioproductos de inters cientfico y econmico.
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1.1 Problemas con la inmovilizacin de clulas

Si bien, el uso de clulas inmovilizadas en matrices slidas ha permitido la implementacin de procesos de

1.2 Otros mtodos de inmovilizacin de clulas para procesos de fermentacin

2.1 Clasificacin de mtodos de inmovilizacin

2.1.1 Mtodos de Inmovilizacin Irreversibles

a) Formacin de enlaces covalentes

Soporte con grupos

b) Formacin de enlaces cruzados

Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces cruzados (lneas negras).

B Matriz de gel reducida

Soporte esfrico poroso Protena inmovilizada

Figura 4. Enzimas inmovilizadas por encapsulacin.

2.1.2 Mtodos de Inmovilizacin Reversible

Soporte con adsorbente activo

Protena inmovilizada con

Adsorcin no especfica. El mtodo de inmovilizacin reversible ms simple es la adsorcin no especfica, el cual

Tabla 1. Comparacin entre los distintos mtodos de inmovilizacin de enzimas

2.2 Seleccin de soportes

Divies, C. y Chacon, R. 2005. Applications of Cell Immobilisation. Biotechnology. 285-293.

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