INTEGRANTES:

Arbildo Bailon Yoseli.

Baca Chavez Janai.
Galiano Mejia Deisy.
Perez Cotrina Javier.
Yauce Ormeo Eliana.

DOCENTE: Msc. R. Diomedes Camones Maldonado.

Es una tcnica deinmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se
detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar
un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo.

La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada

para determinar si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad
autoinmune.
 La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-
anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad
conocida.
El color se genera por la interaccin de un sustrato
cromognico y una enzima que ha sido acoplada al
anticuerpo detector.
Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en la
fase slida, como una capa de captura.
Despus de la reaccin del antgeno con el suero del
paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo
antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG) para
detectar respuesta de anticuerpos clase especficos
 Los mtodos de ELISA dependiendo de la actividad
enzimtica se dividen en dos tipos:

:
En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a
competir con el conjugado por un nmero limitado
de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de
color en una muestra positiva debido a que el
sustrato no encontrar a la enzima porque el
conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo
presente en la muestra.
 Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o
anticuerpo que est en la fase slida. Si una
muestra es positiva se formar el complejo
antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado
reaccionar con el respectivo sustrato
desarrollando color

Dentro de los no competitivos tenemos:

Los directos que detectan antgenos
Los indirectos que detectan anticuerpos.
Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos

especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados
deficientemente o no fijados.

Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una

enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el
complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la

enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los
anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos
fijados deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos
reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales
reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior
y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los
anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
Pasos generales de un ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo
2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o
anticuerpos
3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o
antgeno tapizado en el posillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o
antgeno no unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adicin del sustrato
9. Unin del sustrato a la enzima
10. Desarrollo del color
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado
expuesto a virus u otras sustancias que causen infeccin.
Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas
o presentes.
Es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas
en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas,
como un extracto tisular).

El western blot es una tcnica que se utiliza para identificar y localizar

protenas basada en la capacidad de unin a anticuerpos especficos. Luego
de separar las protenas en un gel de SDS-poliacrilamida(SDS-PAGE), las
bandas de protenas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa
(electro transferencia), las bandas individuales de protena (protena de
inters) se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con
anticuerpo policlonal o monoclonal radio marcado o unido a enzimas
especficas para la protena de inters.
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de
un cultivo celular:

Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de

extraccin. Despus se procede a homogeneizarlos, sea con
una licuadora (para grandes volmenes de muestra), con un
homogenizador (para muestras pequeas) o por sonicacin.
Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el
sobrenadante, la fraccin no precipitada.

Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos

mecnicos. Tambin pueden
usarse detergentes,sales o tampones que favorezcan la lisis
y solubilicen las protenas. A veces se
aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la
digestin por las enzimas celulares de las protenas y de
las fosfoprotenas, respectivamente.
Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel
La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de
poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS).

En esta tcnica las protenas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la
prdida de las estructuras secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes
disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH + SH)) y mantiene los polipptidos en este
estado desnaturalizado.

De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no influye en la electroforesis, y

pueden separarse nicamente en funcin del tamao.
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las
transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o
de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin
de un campo elctrico (electrotransferencia).

Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan

por su capacidad de unir protenas de forma inespecfica (es decir, se
adhieren a todas las protenas con idntica afinidad):

Las membranas de nitrocelulosa Las membranas de PVDF

Se ponen en contacto las superficies del gel electrofortico y de la membrana
y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el
proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este
montaje se coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia el
papel de filtro arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la membrana,
quedarn retenidas en ella.

En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a

un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde
el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa.
Se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar las
protenas desde el gel hacia la membrana.

Para ello, se apilan en el siguiente orden (del polo negativo o ctodo al positivo
o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia,
gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja.

Se aplica una corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al

tiempo disponible, las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan
atrapadas por la membrana.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas,
tpicamente de albmina de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en
ingls, BSA), leche en polvo o casena, con una diminuta fraccin de detergente,
como Tween 20 o Tritn X-100.

Las protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de unin de la

membrana que no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este
modo, el anticuerpo slo podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as
el ruido de fondo y los falsos positivos.

Se comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena.

Para ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que,
en presencia de su sustrato, catalice una reaccin colorimtrica (produce
color). De esta forma, se hace patente la unin con el antgeno, la protena, as
como su localizacin.
El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo
primario contra la protena buscada. ste se consigue inoculando
dicha protena o uno de sus eptopos (regiones capaces de
desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como
un conejo o una cabra) o a un cultivo celular.

Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que

no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. ste
reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo
primario.
Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario,
amplificando la seal.
 Tras el lavado de las sondas marcadas no
unidas, se procede a la deteccin de aquellas
que s se han unido a la protena de inters.

Depende de la incubacin del Western blot con un sustrato que

reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por
ejemplo) unida al anticuerpo secundario.

La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la

membrana con un sustrato, que emitir luminiscencia al ser expuesto
al reporter que trae unido el anticuerpo secundario.
 La luz emitida es captada por una pelcula fotogrfica o, ms recientemente,
por cmaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la
imagen por densitometra para evaluar la cantidad relativa de mancha y
cuantifica el resultado en trminos de densidad ptica.

se coloca una pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad

radiactiva del marcador provoca la aparicin en ella de regiones oscuras. stas
se correspondern con las bandas de las protenas de inters.

Se procede a la excitacin lumnica de stos que les provoca una excitacin. sta es
detectable por un fotosensor, como una cmara CCD equipado con los filtros de
emisin apropiados. Se consigue as una imagen digital del Western blot que
puede ser analizado para obtener el peso molecular o la cuantificacin proteica.
 El Western blot es una de las tcnicas ms
usadas en el estudio de la biologa molecular.

Prueba de VIH
Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme
bovina, comnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme
usan el Western blot.
 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Tcnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento especfico de
DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulacin

Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de

los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo
cual se emplean ciclos de altas y
bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de
ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin.
 DESNATURALIZACION DEL ADN DOBLE
CADENA:
la doble hlice de ADN se separa
en dos hebras. Para ello se realiza
una incubacin de la muestra a
altas temperaturas (93-97C). La
renaturalizacin se producir
cuando la temperatura disminuya.
 HIBRIDACIN DE LOS INICIADORES A LA ZONA 3
ESPECFICA DE CADA UNA DE LAS HEBRAS

los cebadores se unen a las zonas 3

complementarias que flanquean el
fragmento que queremos amplificar. Se
realiza gracias a la bajada de la
temperatura (50-65 C)
 EXTENSIN DEL CEBADOR POR ACTUACIN DE LA DNA
POLIMERASA

Se produce la sntesis de una cadena

sencilla (producindose un fragmento de
doble cadena por la complementariedad)
en la direccin 5-> 3 mediante la
enzima DNA polimerasa, la cual
incorpora los desoxinucletidos fosfato
presentes en el medio siguiendo la
cadena molde.
 Secuenciacin:

Una de las razones mas comunes para

el uso de la PCR es la formacin de
suficiente cantidad de ADN molde
para su secuenciacin. Es mucho mas
sencillo y rapido que la clonacin en
clulas.
 Estudios evolutivos:

Mediante la PCR se pueden amplificar

genes de organismos ya extinguidos. Se
pueden comparar estos genes con los
genes semejantes de organismos actuales y
poder reconstruir rboles filogenticos.
El PCR tambin se ha utilizado para
conseguir el mapa del genoma humano.
 Huellas dactilares del ADN:

La determinacin de las huellas

dactilares genticas constituye una de
las aplicaciones mas interesantes de la
PCR.
Mediante esta tcnica es posible
comparar muestras diferentes de ADN
para comprobar si pertenecen al mismo
individuo o no, o si existe parentesco
entre ellas.
 La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una tcnica muy
sensible, por lo que es de gran importancia evitar
contaminaciones

1. Lugar fsico exclusivo para realizar la PCR

2. Uso de instrumental exclusivo para la PCR
3. Utilizacin de reactivos y tubos estriles
4. Uso de guantes por el manipulador
 Se desarrollan lneas de investigacin en enfermedades
infecciosas y no infecciosas de impacto en salud pblica,
determinando caractersticas epidemiolgicas y
prevalencia de enfermedades virales: herpes-virus,
citomegalovirus, hepatitis, rubola, dengue, VIH/SIDA y
otras ITS, HTLV I/II y parasitarias: toxoplasmosis,
leishmaniasis, enfermedad de Chagas. En cuanto a las
enfermedades no infecciosas se estudian enfermedades
autoinmunes, Enfermedad Celiaca e inmunodeficiencias
primarias.
 Los marcadores tumorales (MT) son sustancias biolgicas o bioqumicas
que aparecen como respuesta del organismo ante cierto tipo de tumores, se
detectan en el torrente sanguneo y reflejan su crecimiento y actividad.
Constituyen una herramienta til sobre todo para el seguimiento, evolucin
y control del tumor, as como para el diagnstico precoz de sus recidivas.
Estas sustancias pueden encontrarse en la sangre, en la orina, en la materia
fecal, en tejido de tumores o en otros tejidos o lquidos del cuerpo de
algunos pacientes con cncer. La mayora de los marcadores de tumores son
protenas. Sin embargo, ms recientemente, los patrones de expresin de los
genes y los cambios de ADN han empezado a usarse como marcadores de
tumores. Los marcadores del segundo tipo se evalan especficamente en el
tejido tumoral.
 Los marcadores de tumores se usan para ayudar a detectar, a
diagnosticar y a controlar algunos tipos de cncer. Aunque una
concentracin elevada de un marcador de tumores puede
sugerir la presencia de cncer, este hecho solo no es suficiente
para diagnosticar cncer. Por lo tanto, las mediciones de los
marcadores tumorales se combinan en general con otras
pruebas, como con biopsias, para diagnosticar el cncer.
 Un doctor toma una muestra de tejido del tumor o de
lquido del cuerpo y lo enva a un laboratorio, en donde se
usan varios mtodos para medir la concentracin del
marcador de tumores.
Si el marcador de tumores se usa para determinar si el
tratamiento est funcionando o si hay una recurrencia, la
concentracin se medir en muchas muestras tomadas en
un perodo de tiempo. En general, estas mediciones "en
serie", que indican que la concentracin de un marcador
est en aumento, que est igual, o que est disminuyendo,
son ms importantes que una sola medicin.
Tipos de Marcadores Tumorales
Varios marcadores de tumores se usan actualmente para
una amplia gama de tipos de cncer.
Alfa-fetoprotena (AFP)
La alfafetoprotena (AFP, siglas en ingls) puede ser til para diagnosticar y
guiar el tratamiento contra el cncer de hgado (carcinoma hepatocelular).
Los niveles normales de AFP generalmente son menores a 10 ng/ml; Los
niveles de AFP a menudo son altos en los pacientes con cncer de hgado.
La AFP tambin es elevada en hepatitis aguda y crnica, pero rara vez es
superior a 100 ng/ml en estas enfermedades.
En alguien con un tumor en el hgado, un nivel de AFP mayor a cierta
cantidad puede significar que la persona tiene cncer. En personas sin
problemas en el hgado, el valor es de 400 ng/ml. Sin embargo, una persona
con hepatitis crnica a menudo presenta niveles elevados de AFP. Para estas
personas, un nivel de AFP por encima de 4,000 ng/mL indica una seal de
cncer de hgado.
La AFP tambin es til para dar seguimiento de la repuesta al tratamiento
contra el cncer de hgado. Si el cncer es extirpado completamente
mediante ciruga, el nivel de AFP deber bajar a niveles normales. Si el
nivel vuelve a subir, a menudo indica que el cncer ha regresado.
Receptor del factor de crecimiento
epidrmico (EGFR)
Esta protena, conocida tambin como HER1, es un receptor que se encuentra en
clulas que fomenta su crecimiento. Las pruebas realizadas en una muestra de tejido
canceroso pueden buscar si hay cantidades en aumento de estos receptores, lo cual
es una seal que puede que indique que el cncer sea de rpido crecimiento y
propagacin, al igual que ms difcil de tratar. Los pacientes con un nivel elevado de
EGFR puede que tengan resultados menos favorables y requieran de un tratamiento
ms agresivo, especialmente con medicamentos que bloqueen (o inhiban) los
receptores de EGFR.
El nivel de EGFR puede que se use para guiar el tratamiento y predecir el resultado
para el cncer de clulas no pequeas (cncer no microctico) de pulmn, as como
cncer de cabeza, cuello, colon, pncreas o seno. Los resultados se reportan como un
porcentaje en funcin del nmero de las clulas sometidas a prueba.
Algunos cnceres de pulmn presentan ciertos defectos (mutaciones) en el gen
EGFR, lo cual los hace ms propensos a responder a determinados medicamentos
contra el cncer. Estos cambios genticos son ms comunes entre pacientes mujeres,
no fumadores o asiticos con cncer de pulmn.
Gonadotropina corinica humana
Los niveles sanguneos de la gonadotrofina corinica humana (tambin
conocida como HCG,) son elevados en pacientes con ciertos tipos de cncer
testicular y ovrico , as como con neoplasia trofoblstica del embarazo,
principalmente el coriocarcinoma. Tambin son elevados en algunas personas
con tumores de las clulas germinales mediastinales (cncer en la parte media
del pecho: el mediastino) los cuales se originan a partir de las mismas clulas
que los tumores de las clulas germinales en testculos y ovarios. Los niveles de
HCG son tiles para diagnosticar estas afecciones y pueden ser observados
durante el tratamiento para comprobar su efectividad. Tambin son tiles en
detectar la recurrencia de cncer una vez que haya terminado el tratamiento.
En ciertas situaciones, un nivel elevado de HCG en la sangre indicar tambin
sospecha de cncer; por ejemplo, un aumento de este marcador en una mujer
que sigue teniendo su tero dilatado despus de que el embarazo haya concluido
podra ser un signo de cncer. Esto aplica tambin para los hombres con un
testculo agrandado o con un tumor en el pecho.
Es difcil determinar el nivel normal de HCG debido a que hay distintas formas
para someter este marcador a prueba y cada una tiene su propio rango de valores
normales.
Lactato deshidrogenasa
La lactato deshidrogenasa (LDH, siglas en ingls) se usa como un marcador tumoral
para el cncer testicular y otros tumores de las clulas germinales. No es tan til
como la AFP y la HCG para el diagnstico debido a que se eleva por muchas otras
razones adems del cncer, incluyendo afecciones de la sangre y el hgado. No
obstante, los altos niveles de LDH predicen un pronstico de supervivencia menos
favorable. Los niveles de LDH tambin se usan para monitorear el efecto del
tratamiento y ver si hay recurrencia de la enfermedad.
La LDH puede que se use para otros tipos de cncer tambin, incluyendo linfoma,
melanoma y neuroblastoma.
Lactato deshidrogenasa
La lactato deshidrogenasa (LDH, siglas en ingls) se usa como un marcador tumoral
para el cncer testicular y otros tumores de las clulas germinales. No es tan til
como la AFP y la HCG para el diagnstico debido a que se eleva por muchas otras
razones adems del cncer, incluyendo afecciones de la sangre y el hgado. No
obstante, los altos niveles de LDH predicen un pronstico de supervivencia menos
favorable. Los niveles de LDH tambin se usan para monitorear el efecto del
tratamiento y ver si hay recurrencia de la enfermedad.
La LDH puede que se use para otros tipos de cncer tambin, incluyendo linfoma,
melanoma y neuroblastoma.
MARCADORES PARASITARIOS
Parasitarias: toxoplasmosis, leishmaniasis, enfermedad de
Chagas.
MARCADORES VIRALES

Enfermedades virales: herpes-virus,

citomegalovirus, hepatitis, rubola, dengue,
VIH/SIDA y otras.
Hepatitis Viral A

R.N.A del VHA: Se detecta en heces, suero e hgado.

Anti-HA IgM: Se eleva en sangre al mismo tiempo en que se presentan los sntomas y
permanecen en suero durante 3-6 meses. Indica infeccin aguda o reciente.
Anti-HA IgG: Indica recuperacin y estado de inmunidad

Hepatitis Viral B
HBs Ag: Se detecta en el periodo de incubacin, fase aguda y crnica.
Anti-HBs: Indica recuperacin o curacin de la enfermedad, pacientes vacunados.
HBc Ag: Se detecta precozmente en tejido heptico
Anti-HBc IgM: Se detecta en la fase aguda cuando aparecen los primeros sntomas.
Anti-HBc IgG: Aparece 6-12 meses despus de la recuperacin.
HBe Ag: Indica replicacin viral aguda y la sangre portadora es altamente infecciosa
Anti-HBe: En la fase aguda indica buena evolucin y en la fase crnica escasa repli cacin.
DNA VHB: Es el ms especfico
DNAp VHB: Indica infectividad y replicacin viral.

Hepatitis Viral C
RNA VHC:
Anti HC: Aparece 2 a 17 semanas despus de adquirida la infeccin aguda, su persistencia es
indicador de infeccin crnica.
Anti-HC IgM: Infeccin aguda.
Anti-HC IgG: Indica estado de inmunidad.
HEPATITIS B
Las tcnicas serolgicas actuales permiten detectar, en los pacientes
infectados, los antgenos del VHB y la respuesta de anticuerpos frente
dicha infeccin con distintos grados de sensibilidad y especificidad. Su
determinacin cualitativa y cuantitativa nos permite realizar un
diagnstico, establecer un pronstico fiable de la infeccin, con o sin
tratamiento, y conocer la susceptibilidad de la poblacin a la infeccin
por VHB (prevencin).
HEPATITIS B
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-
protocolos.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot
http://www.slideshare.net/gabo91/western-blot-10328376
http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_po
limerasahttp://www.cancer.org/espanol/servicios/comocomprendersudiag
nostico/fragmentado/marcadores-tumorales-specific-markers
http://www.cancer.gov/espanol/recursos/hojas-informativas/deteccion-
diagnostico/marcadores-de-tumores
http://www.iics.una.py/?option=com_content&view=article&id=98&Itemid
=127
http://www.monografias.com/trabajos10/hepat/hepat.shtml