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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTBAL DE

HUAMANGA
FACULTAD DE INGENIERA QUMICA Y METALURGIA
Departamento Acadmico de Ingeniera Qumica
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

PRCTICA N10

FISICOQUMICA II QU- 343

CATLISIS ENZIMTICA:

Accin De La Catalasa Sobre El Perxido De Hidrgeno

PROFESOR : LIC. QUISPE MISAICO, Hernn

ALUMNOS : PILLACA GUILLEN, Yomar


QUINTO ROMAN, Adelayda

SEMESTRE ACADMICO : 2017-I

FECHA DE ENTREGA : 17/07/17 mircoles de 7:00 10:00am

FECHA DE EJECUCIN : 10/07/17 mircoles de 7:00 10:00am

AYACUCHO PER
2017
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Escuela Profesional de Ingeniera Qumica

PRACTICA N10

CATALISIS ENZIMTICA
ACCIN DE LA CATALAZA SOBRE EL PEROXIDO DE HIDRGENO

I. OBJETIVOS

1. Medir los volmenes de oxigeno liberados en cada tiempo para los ensayos con
diferentes concentraciones del sustrato H2o2, [S] a determinada temperatura
manteniendo la masa constante de enzima (E) presente en el tubrculo o frutas.
2. Determinar la velocidad inicial (Vo) de la reaccin de la enzima (E) con diferentes
muestras de sustrato H2o2 a temperatura constante.
3. Hallar los parmetros cinticos: velocidad mxima (Vmx) y la constante de Michaelis
Menten (KM) representando 1/Vo VS 1/[S] y representar la ecuacin de Lineweaver-
Burk o de la doble recproca.
4. Representar el significado de Vmx y KM, la ecuacin de Henry-Michaelis-Menten y
trazar la curva corregida con Vo con la ecuacin de LineweaveR-Burk (c).
5. Explicar el significado de Vmx y KM en la presente catlisis enzimtica.
6. Hallar los parmetros cinticos: velocidad mxima (Vmx)y la constante de Michaelis-
Menten (KM) representando Vo VS Vo/[S] y presentar la ecuacin de Eadie-Hofstee.
7. Comparar los resulados de 3,5 y 6

II. REVISION BIBLIOGRFICA

CATLISIS ENZIMTICA

LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Y SU DEPENDENCIA CON LAS CONCENTRACIONES DE


SUSTRATO Y ENZIMA
Recordemos que las reacciones catalizadas por enzimas pueden ser expresadas como:

k1 k2
E + S [ES] (1) [ES] E + P (2)
k-1 k-2

De acuerdo a la ecuacin (2) la velocidad inicial (Vo) de una reaccin catalizada por enzimas
estara determinada por la desaparicin del ES y, por lo tanto, es proporcional a su concentracin:
Sin embargo, k2 y [ES] son difciles de determinar directamente por lo que Michaelis y Menten

V
o=k
2[
ES] (
3)
derivaron la ecuacin (3) en trminos de otras variables que pueden ser medidas
experimentalmente:

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V ma x [ S ]
Vo = ( 4)
K m + [S ]

El efecto de la velocidad al variar la concentracin de sustrato [S], mientras se mantiene constante


la concentracin de enzima [E], se observa en la siguiente grfica:

Vo
Vmx

-K m
1

[S]

Figura 1: Efecto del sustrato sobre la velocidad de


reaccin una
enzimtica
En la Figura 1 observamos que a bajas [S], V0 incrementa casi linealmente con el incremento de la
[S] (1). A concentraciones mayores de sustrato, los incrementos de velocidad inicial en respuesta a
los incrementos de la concentracin de sustrato son cada vez menores (2). Finalmente alcanzamos
un punto donde los aumentos de velocidad son despreciables frente a los incrementos de S. En este
momento decimos que la reaccin enzimtica tiende a velocidad mxima (3). La curva es una
hiprbola rectangular que pasa por el origen y, cuyas asntotas son [S] = -Km y Vo = Vmx.
Las constantes en la ecuacin (4) son Vmx y Km. La Vmx depende nicamente de la concentracin
de enzima y Km es independiente de la concentracin de enzima y de la concentracin de sustrato.
Km se define (en la deduccin de la ecuacin 1 y 2) como el cociente entre la suma de las
constantes de disociacin del complejo [ES] y las constantes de formacin de dicho complejo.
k
-1+k2
K
m= (5
)
k
1

Si consideramos en la ecuacin de Michaelis-Menten que Vo es igual a 1/2 Vmx (ecuacin 6), se


deduce que Km es numricamente igual a la concentracin de sustrato necesaria para alcanzar la
mitad de la velocidad mxima (ecuacin 7) y por eso se expresa en unidades de sustrato.

V max V m ax [S]
= K m + [S] = 2 [S] K m = 2 [S] - [S] (6)
2 K m + [S]

El conocimiento de Km nos indica la afinidad de la enzima por un determinado sustrato. Cuanto

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menor es Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato. El clculo de Km se utiliza,


por ejemplo, para comparar la afinidad de una misma enzima por sustratos diferentes o de enzimas
diferentes por un mismo sustrato (Figura 2).

(A) (B)
Vo V max Vo V max
S us trato 1 E nz i ma 1

ato 2
S ustr

V mx V mx
2 2 Enzima 1 : Hexoquinasa
a 2 Enzima 2 : Glucoquinasa
E nz im
Enzima: Hexoquinasa Sustrat : glucosa
Sustrato glucosa oK =m10,1 mM
Sustrato
1: K =m210 mM
2: fructosa
Km K m2 [S] Km [S]
1 1

Figura 2: Curvas de sustrato. (A)Una enzima con dos sustratos. (B)Dos enzimas con el mismo
sustrato.
Vo
El conocimiento de Vmx nos da informacin sobre la cantidad
de enzima presente ya que la Vmx es directamente
proporcional a la concentracin de enzima.
A medida que aumenta la concentracin de enzima aumenta el
complejo [ES] y por lo tanto aumenta la velocidad de la
reaccin (Figura 3). Cuando se trabaja con concentraciones de
sustrato saturantes, toda la enzima est formando el complejo
[ES] y el aumento de la velocidad es proporcional al aumento
de la concentracin de enzima, es decir que estamos
[Enzima]
trabajando en condiciones de Vmx. Si la concentracin de
sustrato deja de ser saturante el aumento de la actividad deja Figura 3: Efecto de la concentracin de enzima en
de ser proporcional, y la velocidad deja de ser mxima (Figura reaccin una
enzimtica
3).
Teniendo en cuenta estas consideraciones, cuando se necesita conocer la cantidad de enzima presente
en una muestra se recurre a la velocidad de la reaccin enzimtica que cataliza, en condiciones
saturantes de sustrato (Vmx). Cabe aclarar que los kits comerciales estn diseados para medir actividad
enzimtica dentro de un rango de concentracin de enzima. Si la concentracin de enzima es demasiado
alta, puede suceder que la concentracin de sustrato deje de ser saturante y en esos casos lo correcto es
diluir la muestra problema y luego repetir la medicin.

FORMAS DE EXPRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

La actividad de una enzima se puede expresar en trminos de unidades de enzima o unidades


internacionales (UI). La UI (recomendada por la Unin Internacional de Bioqumica) de cualquier
enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversin de un micromol de sustrato en un minuto
(mol/min). La actividad especfica es el nmero de unidades internacionales de enzima por
miligramo de protena (UI/mg de protena).
Asimismo, es til definir una constante de velocidad general, kcat, para describir la velocidad

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limitante de cualquier reaccin enzimtica a saturacin. En una reaccin Michaelise kcat=


Vmx/[Et]. La kcat, denominada tambin nmero de recambio, es una constante de velocidad de
primer orden con unidades de tiempos inversos y es equivalente al nmero de molculas de sustrato
convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola molcula de enzima, cuando la
misma est saturada de sustrato.
Vmx es proporcional a la [Et]. Entonces, Vmx = cte. x [Et]. Dicha cte. es kcat = Vmx / [Et]

MTODOS GRFICOS PARA LA DETERMINACIN DE LAS CONSTANTES CINTICAS DE LAS


ENZIMAS
Diversos mtodos han sido propuestos para determinar Km y Vmx en forma grfica: Hanes- Woolf,
Eadie-Hofstee, Lineweaver-Burk, etc. Todos ellos se basan en modificaciones de la ecuacin de
Michaelis-Menten para que responda a la ecuacin de una recta.

MTODO DE LA DOBLE INVERSA (Lineweaver-Burk)


Invirtiendo y reordenando la ecuacin de Michaelis-Menten se obtiene la ecuacin de una recta:

1 1 Km 1
= + x ( 8)
Vo V m ax V m ax [ S]

Al graficar 1/Vo en funcin de 1/[S] se obtiene la Figura 4B. De la interseccin de la recta con la
ordenada se obtiene 1/Vmx y de la interseccin de la recta con la abscisa se obtiene 1/Km.

V max (A) 1 (B)


Vo
Vo

Km
V max Pendiente
V max
2 =
1
V max

Km [S] 1 1
Km [S]

Figura 4: Curvas de sustrato. (A) Representacin de la ecuacin de Michaelis-Menten (hipbola


(B) Representacin lineal de Lineweaver-Burk (doble recproca).
rectangular).

La ventaja del uso del mtodo de la doble recproca respecto a los otros mtodos grficos radica en
la determinacin ms precisa de Vmx y como veremos ms adelante ser de utilidad en el anlisis
de la inhibicin enzimtica.
En la actualidad se usan mtodos de regresin no lineal que estn disponibles en diversos
programas para PC, los que por aproximaciones matemticas sucesivas (iteraciones) encuentran los

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valores de los parmetros cinticos. Cabe aclarar que todas las tcnicas de clculo por
mtodos grficos son menos precisas que los mtodos de regresin no lineal.

INHIBICIN ENZIMTICA
Los inhibidores de enzimas son molculas que interfieren con la catlisis disminuyendo la velocidad
de las reacciones. Varias sustancias pueden inhibir la actividad enzimtica, tales como: anlogos de
sustratos, toxinas, drogas, complejos metlicos, anticoagulantes, etc.
Los estudios sobre inhibicin enzimtica nos dan informacin sobre las vas metablicas, una visin
acerca de los mecanismos de accin de drogas y toxinas, y una mejor comprensin de los
mecanismos de las reacciones enzimticas. La determinacin de Km y Vmx tiene gran importancia y
utilidad al trabajar con inhibidores, pues en base a los valores obtenidos se puede determinar la
presencia y tipo de inhibidor.
Los inhibidores de enzimas se dividen en dos clases: reversibles e irreversibles.

INHIBIDORES REVERSIBLES
1- INHIBICIN COMPETITIVA
Un inhibidor competitivo, compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima e impide la unin
del sustrato.
Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen estructuralmente al
sustrato y que se combinan con la enzima formando el complejo [EI]. Debido a que el inhibidor se
une de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competicin en favor del
sustrato simplemente aadiendo ms sustrato. Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la
probabilidad de que se fije una molcula de inhibidor por lo que la reaccin muestra la misma V mx
que la reaccin sin inhibidor, pero Km aumenta en presencia del inhibidor (Km) (Figura 5).

Vo Vmax (A) (B)


1
r
ido

Vo
hib

r
ido
n in

or idor ib
ibid inhib
h
Co

h in
n i n Con Si
n
Si
Vmax
2
1
Vmax

Km Km [S] 1 1 1
Km Km [S]

Figura 9: Efecto de un inhibidor competitivo en una reaccin enzimtica. (A) Curva de sustrato en presencia
Figura 5:
y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recproca en presencia y en ausencia del inhibidor.

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2- INHIBICIN NO COMPETITIVA
Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato. La fijacin
del inhibidor puede o no bloquear la fijacin del sustrato, pero si este ltimo se une al sitio activo no
se puede transformar a P o lo hace a menor velocidad. El inhibidor disminuye de manera efectiva la
concentracin de enzima activa por lo que disminuye la Vmx aparente (Vmx). Frecuentemente el
efecto sobre Km es nulo (Figura 6).

Vo Vmax (A) 1 (B)

r
do
Vo

ibi
nh
r
bidor ido

ni
inhi ib

Co
Sin nh
ni
Vmax
1 Si
idor
n inhib Vmax

Vmax Co
2
1
Vmax Vmax
2

Km [S] 1 1
Km [S]
6: Efecto de un inhibidor no competitivo en una reaccin enzimtica. ( A) Curva de sustrato en presencia
Figura 10:
y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recproca en presencia y en ausencia del inhibidor.

3- INHIBICIN ACOMPETITIVA
En este caso el inhibidor se une al complejo [ES], con lo cual el valor de Km disminuye (como si la
enzima tuviera ms afinidad por el S). Tambin disminuye la Vmx ya que el complejo [SEI] es
inactivo (Figura 7).

Vo Vmax (A) (B)


1
Vo
or or
hibid ib id
Si n in nh r
on i bido
Vmax C nh i
ibidor ni
n inh Si
Vmax Co 1
Vmax
2
Vmax

2 1
Vmax

Km [S] 1 1 1
Km Km Km [S]
Figura
Figura7:11: Efecto de un inhibidor acompetitivo en una reaccin enzimtica. (A) Curva de sustrato en presencia
y en ausencia del inhibidor. (B) Doble recproca en presencia y en ausencia del inhibidor.

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INHIBIDORES IRREVERSIBLES
Con el uso de inhibidores irreversibles es frecuente la formacin de un enlace covalente entre
un inhibidor y la enzima. Los inhibidores irreversibles son muy tiles para estudiar los mecanismos
de reaccin. Estos juegan un papel central en los mtodos modernos para obtener nuevos agentes
farmacuticos, proceso que se denomina diseo racional de frmacos. Debido a que el inhibidor se
ha diseado para una enzima especfica y no es reactivo hasta que se encuentre en el sitio activo
de la enzima, los frmacos basados en este mtodo son con frecuencia muy efectivos y tienen
pocos efectos secundarios.

Mtodo continuo para la determinacin de actividad enzimtica


Los mtodos utilizados para determinar las actividades enzimticas pueden ser de dos tipos: los
mtodos Punto Final (como el utilizado hasta aqu) y los mtodos Continuos.
Un mtodo continuo para la determinacin de la actividad de una enzima consiste en la lectura de
muchos puntos de datos primarios (podra ser absorbancia o fluorescencia) durante el tiempo que
dura la determinacin. Si el sustrato o producto de la reaccin no presentan absorbancia o
fluorescencia fcilmente detectable se emplean reacciones acopladas a la reaccin enzimtica a
determinar. Se utiliza el producto de la reaccin como sustrato de una segunda reaccin acoplada
que producir un cambio que se puede monitorear fcilmente en un espectrofotmetro. A menudo
la reaccin acoplada tambin est catalizada por una enzima. Esta reaccin no debe ser limitante
de la velocidad, lo que se logra agregando una gran cantidad de la enzima que cataliza la reaccin
acoplada, para que todo el producto formado por la primera reaccin sea consumido en la reaccin
acoplada inmediatamente despus de su formacin.
En la mayora de los casos las reacciones enzimticas se acoplan a una segunda reaccin en la
que interviene una enzima que tiene como cofactor
al NAD+ o al NADH. Como resultado de estas
reacciones acopladas la concentracin de NADH 100
ir disminuyendo o aumentando en funcin del
tiempo, en forma proporcional a la aparicin del 80
Abs

producto de la primera reaccin. 60

NADH + H+ NAD+ + 2H+ + 2 e- NADH + H+


40

20
El cofactor tiene un espectro de absorcin NAD
+

diferente en su forma oxidada (NAD+) o en su 0


forma reducida (NADH) (ver Figura 8). La 220 260 300 340 380
concentracin de NADH se puede determinar Longitud de onda (nm)
espectrofotomtricamente siguiendo el cambio de
absorbancia a 340 nm. Figura 8. Espectro de absorcin del NAD+ y
NADH.

CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN

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Aunque es imposible medir exactamente la concentracin de sustrato que da Vmax, las


enzimas pueden caracterizarse mediante la concentracin de sustrato a la cual la
velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Esta concentracin de
sustrato se conoce como constante de Michaelis-Menten (KM).
Para enzimas que exhiben una cintica de Michaelis-Menten simple esta constante
representa la constante de disociacin del complejo enzima-sustrato (ES) (o la inversa
de la afinidad entre enzima y sustrato). Valores bajos indican que el complejo ES est
unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar
producto.
En estos casos se obtendr una KM diferente segn el sustrato especfico sobre el que
acte la enzima (como sucede en el caso de enzimas que actan sobre sustratos
anlogos) y segn las condiciones de reaccin en que se realicen las mediciones.
Nota: KM solo se puede usar para determinar la afinidad de una enzima por un
sustrato k2 es limitante de la velocidad, por ejemplo, k2 << k1 y KMse convierte en k-
1/k1. Generalmente, k2 >> k1 o bien k2 y k1 son comparables.
ECUACIN
La derivacin de Michaelis y Menten est descrita por Briggs y Haldane. Se obtiene de
la siguiente manera:
Se supone que la reaccin enzimtica es irreversible, y que el producto no se liga con la
enzima despus de la reaccin.

Siguiendo la aproximacin del estado estacionario, que seala que la concentracin del
complejo enzima-sustrato (ES) es pequea y se mantiene casi constante a lo largo de la
reaccin enzimtica:

Se define:

Entonces:

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Reordenando:

Esta ecuacin se puede analizar experimentalmente con un diagrama de Lineweaver-


Burke, un diagrama de Eadie-Hofstee o un diagrama de Hanes-Woolf.
E0 es el total de enzima. No es prctico medir la cantidad de complejo enzima-
sustrato durante la reaccin, por lo que debe escribirse sta en trminos de
cantidad total o inicial de enzima, que es una cantidad conocida.
d[P]/dt o V0 es la velocidad de formacin del producto.
k2[E0] o Vmax es la velocidad mxima. k2 se denomina con frecuencia kcat.
Cabe observar que [S] es grande comparada con Km, [S]/(Km + [S]) tiende a 1. La
velocidad de formacin de producto es igual a k2[E0] en ese caso.
Cuando [S] es igual a Km, [S]/(Km + [S]) vale 0.5. En ese caso, la velocidad de
formacin de producto es la mitad de la mxima (1/2 Vmax). Representando
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grficamente V0 frente a [S] se puede fcilmente determinar Vmx y Km. Esto requiere
una serie de experimentos a E0constante y diferentes concentraciones de sustrato [S].

1 3 1
202 () + () 22() () + 2() + 2()
2 2

FIGURA N1 GASMETRO PARA SEGUIR LA REACCIN DE DESCOMPOSICION


DEL PEROXIDO DE HIDRGENO
A: Nivel de fluido manomtrico
B: Bureta invertida colectora de gases
C: Termmetro
D: Soporte universal.
E: Tubo de goma
F1: Erlenmeyer CON h2O
F2: Luna de reloj con muestra de catalasa
G: Llave para purgar gases
H: Cuba termosttica

III. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS.


Materiales
2 soportes universales
2 porta buretas dobles de Fisher
2 buretas de 10 o 25 ml
2 embudos de vstago corto
2 termmetros 0-50C

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2 lupas
2 Erlenmeyer de 150 ml
2 pisetas
2 pinzas
2 agujas hipodrmicas de5 o 10 ml
Cpsulas de Petri con tapa

Equipos
2 equipos gasomtricos y accesorios
1 balanza analtica digital (*/-0.1mg)
2 termocuplas
2 cronmetros
1 molde circular de 1-2cm
1 almetro barmetro
1 psicrmetro
1 cuchilla

Reactivos

50 ml de H202 al 30 % w/v
100g de papa
1 L de agua destilada

IV. METODO EXPERIMENTAL:

1. Instalar los equipos gasomtricos tal como se muestra en la figura N4


2. Regular y mantener las dos cubas termodinmicas a la temperatura establecida.
3. Preparar en cuatro Erlenmeyer las muestras del sustrato, perxido de hidrgeno,
utilizando 5.0, 10.0, 12.5, y 15.0 ml de H2o2 al 30% w/v y aadir agua destilada
para que el volumen total sea 15 ml. Etiquetar tapar. Anotar en la tabla I.1
CUIDADO. POR NINGUNA CIRCUNSTANCIA EL AGUA OXIGENADA DEBE
ENTRAR EN CONTACTO CON LA PIEL O MUCOSAS, PRODUCE
QUEMADURAS.

4. Termostatizar los Erlenmeyer por 7-12 minutos, dos en cada cuba del
termostato.
5. Pesar cuatro muestras con una masa constante de la fuente de catalasa (papa),
de forma circular con una altura de 1-2mm y cuya masa constante debe estar
entre 1.2 y 1.50 g. (emplear una masa constante: +/- 0.001 g). guardarla en la
respectiva cpsula de Petri. Registrar las masas en la tabla T.1 LA FORMA Y
TAMAO DEL ENZIMA DEBE SER UNIDFORME.
6. Asegurarse de la hermeticidad de ambos equipos. Nivelar el volumen de agua en
cero. Ensayar sucesivamente la dinmica de medicin del Vo2 cada 30 y 60 s.
7. Colocar en el Erlenmeyer el trozo de papa e instantneamente cerrar la llave y la
tapa, estando el nivel de agua en la bureta en cero.

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8. Registrar cada minuto (durante 7 minutos) el volumen del oxgeno liberado, en ml


anotar los volmenes ledos en la tabla I.2. LOS DOS PRIMEROS VOLUMENES
SON LOS MS IMPORTANTE.

9. Repetir los pasos anteriores (6-8) con los otros tres Erlenmeyer.

V. CALCULOS, GRFICAS Y RESULTADOS

Construir la Figuras NI.1, I.2, I.3 y I.4 para cada concentracin de sustrato los volmenes
de oxigeno desprendido en cada tiempo transcurrido.

TABLA N1 DATOS EXPERIMENTALES, CALCULOS, GRFICAS Y RESULTADOS

TABLAN1.1 PREPARACIN DE CUATRO MUESTRAS SUSTRATO (H2O2)


Y ENZIMA (CATALASA)

Ensayo V H2o2 al 30% VH2O, ml %W H2o2/V Mtubrculo,g


w/v, ml
[s]1 1(A) 15 15 0 1.2827
[s]2 2(B) 15 12 03 1.2817
[s]3 3(C) 15 09 06 1.2827
[s]4 4(D) 15 06 09 1.2822

TABLAN1.2. DETERMINACIN DE LA MASA DE OXIGENO LIBERADO


DURANTE EL TIEMPO T Y PARA CADA CONCENTRACIN DE
SUSTRATO(H2O2) A TEMPERATIRA CONSTANTE DE 30 C.
m02, mg
T, min Ensayo N1 Ensayo N2 Ensayo N3 Ensayo N4
[H2o2]=[S]=3.0%w/v [H2o2]=[S]=2.4%w/v 1.8[H2o2]=[S]=1.8%w/v 1.2[H2o2]=[S]=1.2%w/v
0 0 0 0 0
1 1.0 2.70 3.3 0.70
2 2.0 3.57 6.3 1.30
3 2.5 4.52 8.0 2.50
4 3.7 5.51 9.6 2.70
5 4.7 6.66 10.2 3.50
6 5.9 7.30 11.7 3.90

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TABLA N1.3 DETERMINACIN DE VELOCIDADES INICIALES PARA


CADA CONCENTRACION DE SUSTRATO A PARTIR DE LAS CUATRO
GRAFICAS DE mo2 (mg) vs t, min, siendo P0(0,0)

Ensayo N Figura N P1(x1, y1) P1, (t1, mo2 1) Vo, mg de O2/min


t,1 mO2 1, mg
1 1.1 1 2.358 1.4482
2 1.2 1 1.885 0.9598
3 1.3 1 1.4138 1.3116
4 1.4 1 0.9425 1.6685

TABLA N1.4 DETERMINACION DE LA VELOCIDAD MXIMA (VMX) Y DE


LA CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN(KM) A PARTIR DE LA GRAFICA
DE LINEWEAVER-BURK O DOBLE RECIPROCA (FIGURA N5), Y
REPRESENTACIN DE LA GRFICA DE MICHAELIS-MENTEN O DE
MONOD (FIGURA N6)
Figura 1.5 Ensayo N Figura N1.6
1/Vo2(mgO2/min)-1 1/[H2o2], (%w/v)-1 Vo mgO2/min [H2o2], %w/v

2.358 1.4482 1 1.4482 3


1.885 0.9598 2 0.9598 2.4
1.4138 1.3116 3 1.3116 1.8
0.9425 1.6685 4 1.6685 1.2

Ec. de Lineweaver-Burk: Ec. De Michaelis-Menten o de Monod

1 1 1 []
= + =
[] + []

Vmx= Vmx=
KM= kM=

Accin De La Catalasa Sobre El Perxido De Hidrgeno

Perxido de hidrgeno (H2O2) comercial.

10% 3%H2O2 /

100 10%

3 H2O2

Moles iniciales
12H2O2X
15H2O2 3%

14
w
2.4% X
v
9H2O2 2.4%/
1.8% /


6H2O2 2.4%

1.2% /

Hallar la velocidad inicial, Vo, para cada concentracin de sustrato, [S]. anotar
RECOMENDACIN: LA DETERMINACIN DE CADA VELOVIDAD INICAL DE CADA
EXPERIMENTO DEBE UTILIZAR LAS MISMAS ESCALAS.

[H2o2]=[S]=3.0%w/v
6

y = 0.7536x + 0.4393
5

4
VO2, mg

0
0 1 2 3 4 5 6
t, min

[H2o2]=[S]=2.4%w/v
9
8 y = 1.1343x + 0.92
7
6
VO2, mg

5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6
t ,min
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[H2o2]=[S]=1.8%w/v
14
y = 1.8643x + 1.4214
12

10

8
VO2, mg

0
0 1 2 3 4 5 6
t,min

[H2o2]=[S]=1.2%w/v
4

y = 0.5607x + 0.1321
3.5

2.5
VO2, mg

1.5

0.5

0
0 1 2 3 4 5 6
t,min

12
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3.0[H2o2]=[S]=%w/v 2.4[H2o2]=[S]=%w/v

1.8[H2o2]=[S]=%w/v 1.2[H2o2]=[S]=%w/v

Poly. (3.0[H2o2]=[S]=%w/v) Poly. (2.4[H2o2]=[S]=%w/v)

Poly. (1.8[H2o2]=[S]=%w/v) Poly. (1.2[H2o2]=[S]=%w/v)


12

10

8
vO2, mg

0
0 1 2 3 4 5 6
t, min

Calcular 1/Vo VS 1/[S]

mO2 1, mg Vo, mg de O2/min 1/Vo 1/[S]


3 0.7536 1.326963907 0.333333333
2.4 1.1343 0.881600987 0.416666667
1.8 1.8643 0.536394357 0.555555556
1.2 0.5607 1.78348493 0.833333333

Construir la figura NI.5. (grfica de Lineweaver-Burk) aplicando el mtodo de mnimos


cuadrados hallar la pendiente, m, la ordenada, y el coeficiente de determinacin, R2.

1/Vo 1/[S]
1.326963907 0.333333333
0.881600987 0.416666667
0.536394357 0.555555556
1.78348493 0.833333333

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Grfico de Linmeweaver-Burk
2
1/Vo 1/Vo= 1.1966(1/[S]) + 0.4923
R = 0.2345
1.5

0.5

0
-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

-0.5
1/[S]

Ubicar dos puntos corregidos(o) y trazar la recta corregida con lnea entrecortada.
Extrapolar hasta interceptar el eje X.

1/Vo 1/[S]
1.326963907 0.333333333
0.881600987 0.416666667
0.536394357 0.555555556
1.78348493 0.833333333

Grfico de Linmeweaver-Burk
2 1/Vo= 1.1966(1/[S]) + 0.4923
1/Vo R = 0.2345
1.5

0.5

0
-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

-0.5
1/[S]

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Escribir la ecuacin corregida sobre la recta sealando el valor de R2.

1
1/ = 1.1966( ) + 0.4923
[]
= 0.2345

Leer el valor de 1/Vmx y compararlo con b. calcular Vmx.

Entonces cuando x = 0,
= 0.5

= 0.4923

1
= 0.4923


= 2.0313

Construir la Figura N I.6. (Grfica de Henry-Michaelis-Menten).

Vo2 [H2o2]
0.7536 3.0
1.134300001 2.4
1.8643 1.8
0.5607 1.2

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VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES


Se midieron los volmenes de oxigeno liberados en cada tiempo para los
ensayos con diferentes concentraciones del sustrato a determinada temperatura
manteniendo la masa constante de la enzima presente en el tubrculo.
Determinamos la velocidad inicial de la reaccin de la enzima catalasa con
diferentes muestras de sustrato a temperatura constante. (KM) representando
1/Vo VS 1/[S] y representar la ecuacin de Lineweaver-Burk o de la doble
recproca.
Representamos el significado de Vmx y KM, la ecuacin de Henry-Michaelis-
Menten y trazar la curva corregida con Vo con la ecuacin de LineweaveR-Burk
(c).
Explicamos el significado de Vmx y KM en la presente catlisis enzimtica.
Hallar los parmetros cinticos: velocidad mxima (Vmx)y la constante de
Michaelis-Menten (KM) representando Vo VS Vo/[S] y presentar la ecuacin de
Eadie-Hofstee.
Comparramos los resultados de 3,5 y 6

VII. BIBLIOGRAFA
CHANG, R.(2000) Fisicoqumica. Edit. McGraw-Hill interamericana. Mxico, D. F.
Mxico.
BALL, R (2005) Fisicoqumica. Edit. Thomson. Buenos Aires. Argentina.

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