Claudia I Beth Hernandez

INSTITUTO TECNOLGICO DE ZACATEPEC
CRECIMIENTO Y FORMACIN DE PRODUCTOS EN

CULTIVOS AERBICOS Y ANAERBICOS DE Bacillus
subtilis CON GLUCOSA, XILOSA Y CELOBIOSA
OPCIN I
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

INGENIERO BIOQUMICO
P R E S E N T A
CLAUDIA IBETH HERNNDEZ BUSTOS
ZACATEPEC MOR Septiembre, 2003
i
El presente trabajo se realiz bajo la asesora del
Dr. Alfredo Martnez Jimnez en el Departamento de
Ingeniera Celular y Biocatlisis del Instituto de
Biotecnologa de la Universidad Nacional Autnoma de
Mxico.
Para la realizacin del mismo se cont con el

financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnologa (CONACyT) a travs del proyecto Z-003 y de
la beca de tesis de licenciatura No. 4323.
ii
A ti por ser mi apoyo y mi gua en todo momento.
A mis padres: Javier y Toa por todo el apoyo incondicional que

siempre me han brindado, por todo lo que han hecho por m y de m.
A Nancy por ser siempre el ejemplo a seguir
A Blanquis por ser as, como solo t puedes ser y por tu enorme
capacidad de dar y ver por los dems.
A mis chiquitas Dany y Lucy por ser siempre mi motivacin y

apoyo.
Y a una pequea personita que dio un giro importante en mi vida:

Eduardo Javier.
A todos gracias por creer en mi
iii
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Alfredo Martnez Jimnez por haberme dado la oportunidad de trabajar con l,
por todos los conocimientos y la experiencia adquirida pero sobre todo por la amistad
que me brindo.
A Q. Georgina Hernndez por todo el apoyo tcnico en el manejo y anlisis de

muestras por HPLC.
A MC Ramn de Anda por haberme proporcionado las cepas utilizadas en este trabajo
y por el apoyo tcnico en la instalacin y manejo del equipo de fermentacin.
A todos y cada uno de los integrantes del laboratorio Bolvar/Gosset por la amistad
incondicional que me brindaron, especialmente a Mechita, Ponchito, Naty, Gerardo,
Victor, Saida y Noemi.
A todos mis profesores, especialmente al Ing. Benjamn Aguilar, Ing. Jose Luis Morales,
Ing. Rodolfo Lpez Bailn, Ing. Carlos Cano, Ing. Francisco Hernndez, Dr. Jess
Porcayo por todos los conocimientos y consejos compartidos, pero sobre todo por
motivarnos a ser profesionistas integros.
A todos mis amigos, a Nelly, Cinthya, Odette, Nayelli, Sandra, Anita, Carmen, Luis
Arturo, Mario, Victor Hugo, Alfonso, Leandro y Odon por todos los momentos que
compartimos juntos.
iv
NDICE GENERAL
_________________________________________________________________________________________________________
NDICE GENERAL
NDICE DE FIGURAS ................................................................................................... viii

NDICE DE TABLAS .......................................................................................................ix
NOMENCLATURA .......................................................................................................... x
1. RESUMEN .................................................................................................................. 1
2. INTRODUCCIN Y JUSTIFICACIN ......................................................................... 3
3. ANTECEDENTES ....................................................................................................... 5
3.1 Caractersticas de Bacillus subtilis......................................................................... 5
3.2 Metabolismo de azcares ...................................................................................... 7
3.3 Fermentacin......................................................................................................... 9
3.4 Respiracin de Nitratos ....................................................................................... 12
4 PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO ....................................................... 14
5 HIPTESIS ................................................................................................................ 15
6. OBJETIVOS DEL PROYECTO ................................................................................. 16
7. MATERIALES Y MTODOS ..................................................................................... 17
7.1 Microorganismos. ................................................................................................ 17
7.2 Generacin de un banco de clulas. ................................................................... 18
7.3 Medios de cultivo. ................................................................................................ 18
7.4 Condiciones de cultivos. ...................................................................................... 19
7.4.1 Cultivos aerbicos......................................................................................... 19
7.4.2 Cultivos anaerbicos..................................................................................... 20
7.4.3 Desarrollo de inculos................................................................................... 20
7.5 Transformacin de B. subtilis WB700. Eliminacin de auxotrofia a triptfano. .... 21
7.6 Generacin de mutantes de B. subtilis Xil+.......................................................... 22
7.7 Concentracin Celular ......................................................................................... 22
7.8 Determinacin de azcares. ................................................................................ 22
7.8.1 Mtodo de azcares reductores (DNS) ......................................................... 23
7.8.2 Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) ................................... 23
7.8.3 Determinacin enzimtica de glucosa........................................................... 23
7.9 Determinacin de cidos orgnicos..................................................................... 23
v
NDICE GENERAL
_________________________________________________________________________________________________________
8. INSTALACIN DE EQUIPO DE FERMENTACIN .................................................. 24

8.1 Descripcin del equipo ........................................................................................ 24
8.2 Instalacin y puesta en marcha de 6 sistemas de fermentacin.......................... 27
8.3 Operacin de equipo de fermentacin................................................................. 30
9 PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS................................................ 32
9.1 Evaluacin del crecimiento de Bacillus subtilis WB700 ....................................... 32
9.2 Eliminacin de auxotrofa a triptfano en la cepa WB700 ................................... 33
9.3 Evaluacin de B. subtilis WB700CH1 en condiciones aerbicas......................... 36
9.4 Generacin de mutantes de B. subtilis xil+ (Cepa WB700CH2)........................... 40
9.5 Evaluacin de B. subtilis WB700CH2 en condiciones aerbicas......................... 41
9.6 Evaluacin de B. subtilis WB700CH2 en condiciones anaerbicas..................... 44
9.6.1 Evaluacin del crecimiento en medio mineral suplementado........................ 53
9.6.2 Produccin de L-lactato en cultivos anaerobios con 50 g/l de glucosa. ........ 58
9.6.2.1 Comparacin de la produccin de L-lactato en B subtilis WB700CH2 con
reportes de la literatura de otros microorganismos............................................. 61
9.7 Evaluacin del crecimiento de B. subtilis en mezclas de azcares ..................... 64
9.8 Evaluacin de la tolerancia a etanol y furfural sobre el crecimiento de B. subtilis
en condiciones anaerbicas. ..................................................................................... 72
10 CONCLUSIONES..................................................................................................... 76
11 PERSPECTIVAS...................................................................................................... 78
12 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................... 79
13 ANEXOS .................................................................................................................. 87
13.1 Determinacin de peso seco de Bacillus subtilis. .............................................. 87
13.2 Extraccin de ADN cromosomal. ....................................................................... 88
13.3 Operacin de un sistema de mini-fermentadores no aireados. ......................... 89
13.4 Determinacin de azcares y cidos orgnicos por HPLC. ............................... 92
13.4.1 Preparacin del equipo ............................................................................... 92
13.4.2 Preparacin de estndares ......................................................................... 92
13.5 Preparacin de Amortiguador y estndares para analizador enzimtico YSI. ... 95
13.5.1 Amortiguador YSI 10x: ................................................................................ 95
13.5.2 Estndar de D-glucosa (2.5 g/l)................................................................... 95
vi
NDICE GENERAL
_________________________________________________________________________________________________________
13.5.3 Estndar de L-lctico (0.5 g/l) ..................................................................... 95

13.6 Clculos. ............................................................................................................ 95
13.6.1 Estimacin de la velocidad especifica de crecimiento................................. 95
13.6.2 Correccin de biomasa por factor de dilucin. ............................................ 96
13.6.3 Clculo de rendimientos y velocidades de consumo de azcares y
formacin de productos.......................................................................................... 96
13.6.4 Clculo de la velocidad especifica de consumo de azcar y de produccin
de L-lactato. ........................................................................................................... 97
13.6.5 Clculo de la productividad volumtrica de L-lactato. ................................. 97
13.6.6 Clculo de la concentracin mnima inhibitoria de etanol y furfural............. 97
vii
NDICE DE FIGURAS
___________________________________________________________________________________________________
NDICE DE FIGURAS
Figura 3.1 Rutas metablicas de fermentacin propuestas para Bacillus subtilis. ........ 12
Figura 8.1 Sistema de fermentacin Applikon............................................................... 25
Figura 8.2 Diagrama de tuberas e instrumentacin para seis sistemas de fermentacin
Applikon. .................................................................................................................... 28
Figura 8.3 Preparacin del Bioreactor para esterilizacin. ............................................ 31
Figura 9.1 Conservacin del genotipo proteasas menos en WB700CH1...................... 35
Figura 9.2 Crecimiento aerbico de B. subtilis WB700CH1 en medio Luria.................. 37
Figura 9.3 Crecimiento aerbico de B. subtilis WB700CH1 en medio mineral.............. 38
Figura 9.4 Crecimiento aerbico de B subtilis WB700CH2. .......................................... 42
Figura 9.6 Crecimiento anaerbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral.......... 47
Figura 9.7 Balance de ATP y NADH en el metabolismo de azcares en Escherichia coli.
................................................................................................................................... 49
Figura 9.8 Crecimiento anaerbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral
suplementado con extracto de levadura industrial..................................................... 55
suplementado con slidos de licor de maz. .............................................................. 56
Figura 9.10 Produccin de L-lactato en cultivos de B. subtilis con 50 g/l de glucosa.... 60
Figura 9.11 Cultivo aerbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-xilosa..................... 67
Figura 9.12 Cultivo aerbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-celobiosa............... 68
Figura 9.13 Cultivo anaerbico de B. subtilis en mezclas de azcares: A) Mezcla
glucosa-xilosa y B) Mezcla glucosa-celobiosa........................................................... 70
Figura 9.14 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis WB700CH2 con furfural...... 73
Figura 9.15 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis con etanol. .......................... 74
Figura 13.1 Curva de peso seco de clulas para B subtilis a 600 nm ........................... 87
Figura 13.2 Sistema de minifermentadores o fleakers. ................................................. 90
Figura 13.3 Preparacin de fleaker para esterilizacin. ................................................ 91
Figura 13.4 Curva de calibracin de azcares por ndice de refraccin........................ 93
Figura 13.5 Curva de calibracin de cidos orgnicos por el detector de arreglo de
diodos a 210 nm. ....................................................................................................... 94
viii
NDICE DE TABLAS
_________________________________________________________________________________________________________
NDICE DE TABLAS
Tabla 3.1 Caractersticas del genero Bacillus. ................................................................ 6

Tabla 3.2 Azcares catabolizados por B. subtilis. ........................................................... 9
Tabla 6.1 Cepas de Bacillus subtilis.............................................................................. 17
Tabla 9.1 Datos sobre el crecimiento aerobio de distintas cepas de B. subtilis. ........... 33
Tabla 9.2 Velocidad especfica de crecimiento de colonias de B. subtilis prottrofas a
triptfano obtenidas por transformacin. ................................................................... 35
Tabla 9.3 Resumen de resultados de cultivo aerbicos de B subtilis WB700CH1........ 39
Tabla 9.4 Resumen de formacin de actico con B. subtilis WB700CH1 en cultivos
aerbicos utilizando glucosa como fuente de carbono. ............................................. 40
Tabla 9.5 Parmetros de crecimiento y de consumo de xilosa de B subtilis WB700CH2.
................................................................................................................................... 43
Tabla 9.6 Resumen de resultados de cultivos anaerbicos de B subtilis WB700CH2. . 46
Tabla 9.7 Resumen de resultados de la produccin de L-lctico con B subtilis
WB700CH2 con 10 g/l de azcar............................................................................... 52
Tabla 9.8 Resumen de cultivos anaerbicos en medio mineral-glc 10 g/l suplementado.
................................................................................................................................... 57
WB700CH2 en medio mineral-glucosa 10 g/l suplementado..................................... 58
Tabla 9.10. Produccin de L-lactato con B. subtilis con alta concentracin de glucosa.
................................................................................................................................... 61
Tabla 9.11 Microorganismos reportados recientemente para la produccin de cido
lctico. ....................................................................................................................... 62
Tabla 9.12 Parmetros cinticos de B subtilis WB700CH2 en cultivos con medio
mineral en mezclas de azcares. .............................................................................. 72
Tabla 9.13 Concentracin de etanol y furfural requerida para inhibir el crecimiento de B
subtilis WB700CH2.................................................................................................... 75
ix
NOMENCLATURA
_________________________________________________________________________________________________________
NOMENCLATURA
Smbolo Definicin Unidades
Cel Celobiosa.
DCW Peso seco de clulas (por sus siglas en ingls: Dry gDCW/l
Cellular Weight).
ELI Extracto de levadura industrial.
Em Eritromicina.
Glc Glucosa.
IC50 Concentracin que causa un 50 % de inhibicin en el g/l
crecimiento.
Lm Lincomicina.
MIC Concentracin mnima inhibitoria. g/l
P Producto.
qp Velocidad especfica de formacin de producto. gP/gDWC.h
qS Velocidad especfica de consumo de sustrato. gS/gDWC.h
QP Productividad volumtrica de lactato. glactato/ l.h
S Sustrato, fuente de carbono, azcares: glucosa, xilosa
o celobiosa.
SLM Slidos de licor de maz.
Trp Triptfano.
Xyl Xilosa.
XMAX Biomasa mxima alcanzada durante la fase de gDCW/l
crecimiento exponencial.
YP/S Rendimiento producto / sustrato. gP/gS
YX/S Rendimiento biomasa / sustrato. gDWC/gS
-1
Velocidad especfica de crecimiento. h
RESUMEN
_________________________________________________________________________________________________________
1. RESUMEN
El desarrollo de nuevas tecnologas para obtener productos qumicos de gran volumen
estn basadas en el uso de sustratos abundantes y econmicos, tales como los
residuos agroindustriales, los cuales contienen principalmente mezclas de xilosa,
glucosa y celobiosa. Bacillus subtilis puede utilizarse para estos fines por su capacidad
de metabolizar una amplia variedad de azcares. Sin embargo sus caractersticas
metablicas para usar xilosa y celobiosa en aerobiosis y para fermentar glucosa, xilosa
y celobiosa no han sido estudiadas. En este trabajo se evalu esta capacidad en medio
rico y mineral suplementado son glucosa, xilosa y celobiosa, y mezclas binarias de
glucosa-celobiosa y glucosa-xilosa en condiciones aerbicas y anaerbicas.
Para el desarrollo de este proyecto inicialmente se instalaron dos sistemas de

fermentacin, con tres unidades de 1 litro, los cuales se controlan de manera
automtica: temperatura, velocidad de agitacin, aireacin, pH, eliminacin de espuma
y oxgeno disuelto. El control se lleva a cabo por tcnicas de control proporcional-
integral-derivativo, el cual puede ser sustituido por un control inteligente adaptativo.
Cada sistema de tres unidades esta enlazada a una computadora personal la cual,
adems de registrar los eventos de los cultivos, puede tomar el control de las unidades
de fermentacin.
B. subtilis sintetiza todas las enzimas para metabolizar xilosa, pero no puede
trasportarla. Como primera etapa de este proyecto se obtuvieron mutantes en medio
mineral y en condiciones aerbicas, las cuales adquirieron la habilidad para transportar
xilosa.
En aerobiosis, las velocidades de crecimiento y de consumo de azcar son menores

con celobiosa y xilosa para ambos medios en comparacin con glucosa, sin embargo el
rendimiento de formacin de biomasa es similar con los tres azcares. Bajo estas
condiciones el nico producto obtenido fue cido actico con rendimiento de conversin
de glucosa en actico de 0.48 y 0.16 gactico/gglc, para medio rico y mineral,
1
RESUMEN
_________________________________________________________________________________________________________
respectivamente. En el caso de celobiosa y xilosa, no se detectaron cantidades

apreciables de producto.
En condiciones de fermentacin con xilosa, el crecimiento se reduce

considerablemente en ambos medios. En medio rico las velocidades de consumo de
glucosa y celobiosa son similares a los de aerobiosis. En medio mineral el crecimiento
y la velocidad de consumo de azcar se reducen considerablemente, posiblemente por
un desbalance energtico. La adicin de extracto de levadura grado industrial o de
slidos de licor de maz al medio mineral permiti obtener velocidades de crecimiento y
de consumo de glucosa y celobiosa similares a los obtenidos con medio rico,
obteniendose como producto nico cido lctico. El gen presente en B. subtilis codifica
para una L-lactato deshidrogenasa. En las condiciones evaluadas en este estudio se
logr obtener L-lactato, ptimamente puro, con un rendimiento de conversin mayor al
70% de glucosa o celobiosa en este producto.
Estos resultados muestran que la mutante de B. subtilis, obtenida en este trabajo,

puede metabolizar celobiosa y xilosa con eficiencias similares a la glucosa en
aerobiosis. La misma cepa en condiciones de fermentacin convierte eficientemente
glucosa y celobiosa en L-lactato ptimamente puro y, en consecuencia, potencialmente
puede ser utilizada para obtener L-lactato a escala de produccin o bien ser
modificado, por tcnicas de ingeniera de vas metablicas, para obtener otros
productos de fermentacin, tales como etanol a partir de hidrolizados de residuos
agroindustriales. Para ello, como parte de este trabajo, se evalu la toxicidad del etanol
y furfural (producto de deshidratacin de pentosas que se encuentra en hidrolizados de
la fraccin hemicelulsica de residuos agroindustriales), como inhibidores del
crecimiento de Bacillus subtilis en medio rico en condiciones anaerbicas. De acuerdo
a los resultados obtenidos se concluye que B. subtilis presenta tolerancias similares a
las obtenidas con otros catalizadores etanolognicos, tales como Escherichia coli, ya
que las concentraciones mnimas inhibitorias fueron de 50 y 2.5 g/l para etanol y
furfural, respectivamente.
2
INTRODUCCIN
_________________________________________________________________________________________________________
2. INTRODUCCIN Y JUSTIFICACIN
Actualmente la mayora de los productos qumicos de gran volumen son obtenidos a
partir del petrleo. Desafortunadamente para la industria y economa de muchos
pases, las reservas de este producto se agotarn en el presente siglo (Ingram et al.,
1998). Este hecho plantea la necesidad de desarrollar nuevos procesos con
tecnologas renovables para generar energticos y productos qumicos en general.
Los materiales lignocelulsicos son una fuente abundante y renovable que han sido
propuestos como alternativa para su uso como materia prima en la produccin de
biocombustibles y plsticos (Ingram et al., 1998; Dien et al., 2001). Estos materiales
son altamente heterogneos y estn compuestos principalmente por hemicelulosa,
celulosa, lignina y pectinas, los cuales para su bioconversin, requieren ser
hidrolizados en azcares solubles utilizando mtodos qumicos (hidrlisis con cidos
minerales) y/o enzimticos. Sin embargo, estos procesos conllevan la aparicin de
compuestos txicos para la mayora de los microorganismos empleados en procesos
de fermentacin. Dentro de estos txicos se encuentra compuestos como el furfural,
hidroximetilfurfural y cido actico entre otros (Taherzadeh et al., 1997; Larsson et al.,
1999; Martnez et al., 2000; Martnez et al., 2001)
La fraccin hemicelulsica est compuesta principalmente de pentosas (xilosa) y

hexosas (glucosa) y una pequea fraccin de otros azcares (arabinosa y manosa;
Ingram et al., 1999). De la hidrlisis enzimtica de la fraccin celulsica se obtiene una
mezcla de glucosa y celobiosa. La mayora de los microorganismos en la naturaleza
utilizan glucosa para llevar acabo sus actividades metablicas. No obstante, la variedad
de microorganismos que metabolizan pentosas y hexosas es restringida, ms an, no
existen microorganismos silvestres que puedan catabolizar eficientemente xilosa o
arabinosa o mezclas de glucosa-xilosa o glucosa-celobiosa, en productos de
fermentacin (Hernndez-Montalvo et al., 2001)
Actualmente la biotecnologa moderna cuenta con herramientas que permiten

modificar, modular y disear vas metablicas en una amplia variedad de
3
INTRODUCCIN
_________________________________________________________________________________________________________
microorganismos, obteniendo de esta manera cepas para aplicaciones industriales con

rendimientos elevados de conversin de sustratos en productos. Adems, por su
capacidad para secretar grandes cantidades de enzimas extracelulares directamente al
medio de cultivo, Bacillus subtilis es un microorganismo usado ampliamente a nivel
industrial en condiciones aerbicas (Ye et al., 1996). Se sabe que naturalmente
metaboliza una amplia variedad de azcares incluyendo xilosa, arabinosa, manosa,
sacarosa, celobiosa y glucosa (Stlken y Hillen, 2000). Sin embargo, a pesar del
extenso conocimiento gentico y bioqumico de B. subtilis, sorprendentemente existe
poca informacin de aspectos bioenergticos, metablicos, de crecimiento y de
formacin de productos en condiciones aerbicas para la utilizacin de xilosa y
celobiosa y bajo condiciones anaerbicas, sea por respiracin de nitratos o por
fermentacin para el catabolismo de glucosa, xilosa y celobiosa (Sauer et al., 1996;
Espinosa de los Monteros et al., 2001). Esto plantea la necesidad de generar
conocimiento bsico del metabolismo y consumo de glucosa, xilosa y celobiosa en
condiciones anaerbicas, y de xilosa y celobiosa en condiciones aerbicas de B.
subtilis, que sirvan de base a futuros proyectos que conlleven al desarrollo de cepas de
B. subtilis con aplicaciones para nuevos bioprocesos.
4
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
3. ANTECEDENTES
3.1 Caractersticas de Bacillus subtilis.
El genero Bacillus incluye a una variedad de especies utilizadas ampliamente en la
industria de fermentacin (Zukowski, 1992). Los microorganismos representativos son
bacterias aerobias, Gram positivas formadoras de endoesporas (Slepecky, 1992;
Devine, 2000). Este genero comprende mas de 50 especies y esta subdividido dentro
de 6 grupos considerando la variedad morfolgica y metablica de cada especie (Tabla
3.1; Priest 1993). La mayora de las cepas de Bacillus son microorganismos mesfilos
que crecen satisfactoriamente, produciendo colonias de buen tamao en 24 h, a 37C.
Sin embargo especies como B. stearothermophilus crecen en rangos de temperatura
de 50 a 70C, mientras que para B. larvae y B popilliae su temperatura ptima de
crecimiento es de 25-30C.
El grupo II, tambin conocido como grupo de Bacillus subtilis, esta formado por
bacterias que catabolizan un amplio rango de carbohidratos por las vas de Embden-
Meyerhof-Parnas (gliclisis) y de pentosas fosfato. La mayora de estas bacterias
crecen en condiciones anaerbicas por respiracin de nitratos a excepcin de B.
megaterium y B. pumilus, mientras que algunas como B. cereus, B. licheniformis y B.
thuringiensis fermentan azcares en ausencia de un aceptor final de electrones
(Shariati et al., 1995).
En lo que se refiere a B. subtilis, este fue considerado por mucho tiempo como un
microorganismo aerobio estricto, sin embargo fue hasta 1993 cuanto Priest dio a
conocer la habilidad de B. subtilis para crecer en condiciones anaerbicas. Esta
reportado que en ausencia de oxgeno, B. subtilis puede crecer bajo respiracin de
nitratos o, en contados reportes, por fermentacin en medios ricos con glucosa y
piruvato (Hoffmann et al 1995; Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Espinosa de
los Monteros et al., 2001).
5
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
Tabla 3.1 Caractersticas del genero Bacillus.

(Priest, 1993)
Grupo Caractersticas del grupo
I Anaerobios facultativos, crecen rpidamente en ausencia de
oxgeno. Producen cidos a partir del metabolismo de una amplia
variedad de azcares.
Ej. B. polymyxa y B. macerans.
II Producen cidos a partir del metabolismo de una amplia variedad de

azcares, incluyendo glucosa. La mayora es hbil para crecer, al
menos lentamente, en ausencia de oxgeno, particularmente en
presencia de nitratos. Las esporas son elipsoides y no hinchan la
clula progenitora.
Ej. B. subtilis.
III Aerobios estrictos, no producen cidos a partir del metabolismo de

azcares. Producen esporas que hinchan a la clula progenitora.
Ej. B. brevis.
IV Producen esporas esfricas que pueden hinchar a la clula

progenitora y contienen L-lisina u orntina en la pared celular.
Aerobios estrictos, algunos presentan una habilidad limitada para
producir cidos a partir del metabolismo de azcares.
Ej. B. sphaericus.
V Especies termfilas, con temperaturas de crecimiento menores a

50C. Fisiolgica y morfolgicamente son heterogneos, pero
producen esporas ovales que hinchan a la clula progenitora.
Ej. B. stearothermophilus, B. thermocloacae, B. kaustophilus y B.
coagulans.
VI Especies termfilas y acidfilas con cidos grasos alicclicos en la

membrana.
Ej. B. acidocaldarius, B. acidoterrestris y B. cycloheptanicus.
No B. benzoevorans, B. fastidiosus y B. naganoensis.

Clasificados
B. subtilis, despus de E. coli y Saccharomyces cerevisiae, es uno de los

microorganismos mejor caracterizados dentro de la investigacin microbiolgica bsica
y aplicada y en aspectos de biologa molecular (Nakano y Hulett, 1997), es
6
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
ampliamente utilizado en la industria alimenticia por ser considerado (por la FDA),

como un organismo seguro para su uso en alimentos (GRAS, generally regarded as
safe; Zukowski, 1992, Devine, 2000). Sin embargo, un factor limitante para su uso en la
produccin de protenas heterologas, es la sntesis y excrecin de proteasa
extracelulares en el medio de cultivo (Ye et al., 1996; Stephenson et al., 1999). Hasta la
fecha son ocho las proteasas que se han identificado en B. subtilis, las cuales estn
clasificadas en dos grandes grupos: serinoproteasas y metaloproteasas (Stephenson et
al., 1999). La sntesis de estas proteasas extracelulares esta fuertemente regulada y la
induccin usualmente ocurre durante la etapa de transicin de la fase de crecimiento
exponencial a la fase estacionaria (Stephenson et al., 1999). No obstante el desarrollo
tecnolgico en la biologa molecular ha permitido que varios grupos de investigacin se
dediquen al diseo y construccin de nuevas cepas de B. subtilis deficientes en la
produccin de proteasas, las cuales se pueden utilizar para su aplicacin en nuevos
procesos biotecnolgicos (Ye et al., 1996)
3.2 Metabolismo de azcares
Las principales fuentes de carbono para los organismos vivos son los carbohidratos.
Estos constituyen la clase ms abundante de molculas biolgica, las cuales por
oxidacin, proveen a la clula de esqueletos de carbono y la energa necesaria para
llevar acabo los procesos metablicos. La fuente natural de carbohidratos ms
abundante para los microorganismos lo constituye la biomasa vegetal. Las plantas
producen una gran cantidad de polisacridos, los cuales sirven como sustratos a los
hongos y bacterias del suelo. Bacillus subtilis es un organismo aislado del suelo, que
participa conjuntamente con otras bacterias en las primeras etapas de descomposicin
de la biomasa vegetal (Mota et al., 1999) y que mediante el uso de carbohidrolasas
extracelulares degrada varios polisacridos presentes en estos materiales, produciendo
oligo, di o mono sacridos que son transportados, fosforilados y subsecuentemente
catabolizados va gliclisis o pentosas fosfatos (Stlken y Hillen, 2000; Rodionov et al.,
2001).
7
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
B. subtilis puede utilizar un intervalo amplio de carbohidratos (alrededor de 18

diferentes mono o disacridos; tabla 3.2) como fuente de carbono y energa (Krispin y
Allmansberger, 1998; Stlken y Hillen; 2000, Rodionov et al., 2001). Sin embargo, dos
azcares que frecuentemente se encuentran en la naturaleza, la D-xilosa y la D-
galactosa, no pueden ser utilizados por B. subtilis como nicas fuentes de carbono, lo
cual es sorprendente ya que este microorganismo sintetiza todas las protenas
necesarias para metabolizar ambos azcares. En 1998, Krispn y Allmansberger,
investigando el efecto txico de la galactosa en cepas de B. subtilis (galE negativo),
obtuvieron mutantes espontneas de B. subtilis 168, las cuales eran hbiles para
crecer en D-galactosa como nica fuente de carbono. La caracterizacin de esas
mutantes revelaron que el transportador para arabinosa (AraE) funcionaba como
transportador para 3 diferentes azcares: arabinosa, xilosa y galactosa, y en
consecuencia podan ser metabolizados.
Estos investigadores concluyeron que una simple mutacin era suficiente para convertir
una cepa de B. subtilis 168 en una derivada capaz de importar galactosa y xilosa, y que
adems en presencia de L-arabinosa se induce la utilizacin de xilosa y galactosa, lo
cual parece lgico sabiendo que en la naturaleza los tres azcares forman parte de la
pared celular de las plantas y raramente se encuentran solos como nica fuente de
carbono (Krispin y Allmansberger, 1998).
8
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
Tabla 3.2 Azcares catabolizados por B. subtilis.

(Stlken y Hillen, 2000)
Azcar Ruta metablica
Celobiosa Gliclisis
Fructosa Gliclisis
Glicerol Gliclisis
Glucitol Gliclisis
Glucosa Gliclisis
Glucosamina Gliclisis
Maltosa Gliclisis
Manitol Gliclisis
Manosa Gliclisis
Sacarosa Gliclisis
Trehalosa Gliclisis
N-Acetil-glucosamina Gliclisis
Oligo- - glucsido Gliclisis
Oligo- - mansido Gliclisis
-glucsido Gliclisis
Inositol Ruta metablica especial
Arabinosa Pentosas Fosfato
Galactosa Pentosas Fosfato
Gluconato Pentosas Fosfato
Ribosa Pentosas Fosfato
Xilosa Pentosas Fosfato
3.3 Fermentacin
Los microorganismos frecuentemente se enfrentan con cambios drsticos en su
hbitat, siendo la disponibilidad de nutrientes y de oxgeno una de las ms importantes.
Estas fluctuaciones traen consigo cambios en su metabolismo celular, tales como
9
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
ajustes en las rutas metablicas y en las velocidades de utilizacin de las fuentes de

carbono, en el flujo de electrones para el mantenimiento del balance redox, en los
mecanismos para la produccin de energa y en ciertas reacciones biosintticas
(Nakano y Zuber, 1998). Los principales cambios en el metabolismo ocurridos debido a
la presencia o ausencia de oxigeno, estn dados al nivel de gliclisis,
fundamentalmente en el destino de los dos productos de esta va: el piruvato y el
NADH.
La gliclisis juega un papel clave dentro del metabolismo energtico de los

microorganismos, pero con esta va solo se puede aprovechar una pequea fraccin de
la energa, suficiente para sintetizar 2 molculas de ATP por cada molcula oxidada de
glucosa, la mayor parte de la energa permanece almacenada en forma de piruvato y
NADH + H+. Este ltimo debe ser continuamente regenerado para el mantenimiento del
flujo glicoltico. En presencia de oxigeno, el NADH + H+ es reoxidado por medio de la
cadena respiratoria, con la formacin de una fuerza protn motriz la cual permite
generar ATP. Por otro lado, el piruvato es convertido a CO2 y Acetil CoA, este ltimo es
subsecuentemente oxidado a dixido de carbono, generando ATP, GTP y poder
reductor (NADH + H+ y FADH + H+) mediante el ciclo de Krebs. En ausencia de un
aceptor de electrones, por ejemplo el oxgeno (en respiracin aerobia) o nitratos (en
respiracin anaerobia), el NADH + H+ es regenerado por fermentacin, mediante la
conversin del piruvato en varios productos finales (alcoholes, cidos orgnicos y
solventes) mientras que el ATP es generado a nivel de fosforilacin de sustrato. Los
productos finales generados a partir del piruvato son especficos para cada
microorganismo, caractersticos de cada especie, de las condiciones y de la fase de
crecimiento.
E. coli es un microorganismo anaerobio facultativo, que en condiciones anaerbicas

presenta una fermentacin mixta de cidos orgnicos a partir del metabolismo de
glucosa con la formacin de etanol, succinato, D-lactato, acetato, frmico, hidrgeno y
dixido de carbono como productos finales (Bck y Sawers, 1996; Chang et al., 1999,
Cruz Ramos et al., 2000). En el caso de Bacillus subtilis, este fue considerado por gran
10
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
tiempo como un microorganismo estrictamente aerobio, sin embargo en 1993, Priest

reporto la capacidad de B. subtilis para crecer en condiciones anaerobias respirando
nitratos. A partir de esa fecha algunos grupos de investigacin se han enfocado en el
estudio del crecimiento de B. subtilis en condiciones anaerbicas. Estos estudios han
demostrado la presencia de dos diferentes tipos de crecimiento anaerbico: la
respiracin de nitratos y la fermentacin (Hoffmann et al 1995; Nakano y Hulett, 1997;
Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Cruz Ramos et al., 2000; Espinosa de los
Monteros et al., 2001).
Cuando se utilizan medios minerales con glucosa como nica fuente de carbono, se ha
demostrado la existencia de un crecimiento deficiente por fermentacin en B. subtilis,
sin embargo se ha logrado incrementar el crecimiento bajo estas condiciones mediante
la adicin de piruvato o mezcla de aminocidos a dichos medios (Nakano et al., 1997;
Cruz Ramos et, al 2000; Espinosa de los Monteros et al., 2001). Esto debido
probablemente a que la cantidad de piruvato acumulado por el metabolismo de glucosa
no es suficiente para la induccin de la expresin de los genes involucrados en el
catabolismo de piruvato (induccin por sustrato), o para activar algunas enzimas
involucradas en este proceso, o problemas en la regeneracin de cofactores oxidados,
y por ello sea necesario la adicin de piruvato exgeno o de mezclas de aminocido ya
que algunos aminocidos sirven como precursores de piruvato (Nakano et al., 1997)
An se desconoce el sistema fermentativo de B. subtilis y varios grupos de

investigacin han propuestos rutas metablicas posiblemente involucradas, en base a
los productos finales identificados y a la secuencia de genes reportados a partir del
proyecto de secuenciacin del genoma completo de B. subtilis (figura 3.1. Kunst et al.,
1997; Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Cruz Ramos et al., 2000). En medios
minerales en presencia de glucosa y piruvato, se han identificado acetato, etanol,
lactato y pequeas cantidades de acetoina y 2,3-butanodiol como principales productos
de fermentacin (Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998), sin embargo bajo las
mismas condiciones de cultivo, Cruz Ramos et al (2001) identificaron la presencia de
lactato, actico y 2,3-butanodiol como nicos productos de fermentacin. En medios
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ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
ricos con glucosa se reporta la presencia de lactato como nico producto de

fermentacin (Espinosa de los Monteros et al., 2001). Lo anterior sugiere la presencia
de varias rutas metablicas involucradas en el proceso de fermentacin de B. subtilis,
las cuales an no han podido ser identificadas completamente.
Lactato
NAD+
(LDH)
NADH + H+
(PYC)
Acetolactato Piruvato Oxalacetato
(ALS)
NADH + H+
(ALDC) NAD+ (MDH)
(PDH)
NAD+
Acetoina NADH + H+
Malato
+
NADH + H Acetil CoA
NADH + H+ (FUM)
+ (AR)
NAD (PTA)
NAD+ (ALDH) Fumarato
2,3-Butanodiol Acetil-fosfato FADH + H+
Acetaldehdo (FRD)
ADP
(ACK) FAD+
NADH + H+ ATP Succinato
NAD+ (ADH)
Acetato
Etanol
Figura 3.1 Rutas metablicas de fermentacin propuestas para Bacillus subtilis.

(Nakano et al., 1997).
Las letras en parntesis indican las enzimas que catalizan la reaccin correspondiente: ACK,
acetato quinasa; ADH, alcohol deshidrogenasa; ALCD, acetolactato descarboxilasa; ALDH,
aldehido deshidrogenasa; ALS, acetolactato sintasa; AR, acetoina reductasa; FRD, fumarato
reductasa; FUM, fumarasa; LDH, lactato deshidrogenasa; MDH, malato deshidrogenasa; PDH,
piruvato deshidrogenasa; PTA, fosfotransacetilasa; PYC, piruvato carboxilasa.
3.4 Respiracin de Nitratos

Los microorganismos aerbicos emplean oxigeno molecular para extraer energa a
partir del NADH+ H+ y FADH + H+ obtenidos en la gliclisis y el ciclo de Krebs, sin
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ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
embargo el sistema respiratorio esta diseado para oxidar una amplia variedad de
sustratos y utilizar algunos de estos compuestos como aceptores finales de electrones
en ausencia del oxgeno. En E. coli se han identificado una amplia variedad de
compuestos utilizados como aceptores finales de electrones entre ellos oxgeno,
fumarato, nitrato, nitrito, S y N-oxidos, tetratinatos y tiosulfatos (Gennis y Stewart,
1996). Uno de los aceptores preferentemente utilizado por los microorganismos,
cuando el oxgeno esta ausente, es el nitrato. La respiracin de nitrato (NO3-) esta
ampliamente distribuida entre las especies bacterianas, incluyendo las enterobacterias
(Gennis y Stewart, 1996), debido a su alto potencial redox (E=+430mV), adems de
que inhibe la sntesis de enzimas involucradas en la respiracin de otros aceptores de
electrones (Gennis y Stewart, 1996; Nakano y Zuber, 1998).
Como otros miembros del gnero Bacillus, B. subtilis tiene la habilidad de utilizar
nitratos como un aceptor alternativo de electrones (Cruz Ramos et al., 2000). En el
caso de B. subtilis, cuyo hbitat es el suelo, las fluctuaciones en la disponibilidad de
oxgeno son derivadas por los cambios en el contenido de agua de este, por ello la
utilizacin de nitrato o nitrito como aceptor terminal de electrones es razonable,
considerando que estos estn presentes normalmente en el suelo en altas
concentraciones (Nakano y Zuber, 1998). La utilizacin de otros aceptores de
electrones durante el crecimiento anaerbico no ha sido reportada, siendo la
respiracin de nitratos o nitritos la nica forma anaerbica de respiracin conocidas
para B. subtilis. (Nakano y Hulett, 1997; Nakano y Zuber, 1998; Espinosa-de-los-
Monteros, 2001).
13
PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO
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4 PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO
Bacillus subtilis es un microorganismo del cual se conoce su habilidad para metabolizar

una amplia variedad de azcares. No obstante, solo se ha estudiado y caracterizado su
crecimiento aerobio y parcialmente anaerobio utilizando glucosa como fuente de
carbono. Si se pretende utilizar este microorganismo en cultivos en los cuales se
empleen fuentes de carbono renovables y de bajo costo, tales como los azcares
mayoritarios presentes en hidrolizados, qumicos o enzimticos, de las fracciones
hemicelulsica y celulsica del bagazo de caa, es necesario responder:
Cual es la eficiencia de B. subtilis para consumir y metabolizar celobiosa y xilosa

como nicas fuentes de carbono en condiciones aerbicas.
Si tiene la capacidad de fermentar glucosa, celobiosa y xilosa con medios ricos y,

principalmente, con el uso de medios minerales.
Cuales son los principales productos que se obtiene en condiciones de

fermentacin con medios minerales-glucosa, celobiosa y xilosa.
Determinar las velocidades especficas de crecimiento y de consumo de azcares,

as como de formacin de productos que se obtienen tanto en condiciones aerbicas
como anaerbicas.
Cmo es su crecimiento aerobio y anaerobio en mezclas binarias de glucosa-

celobiosa y glucosa-xilosa.
HIPTESIS
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5 HIPTESIS
Por reportes de la literatura, se sabe que las cepas silvestres de Bacillus subtilis tienen
la capacidad para metabolizar una amplia variedad de azcares, entre ellos glucosa y
celobiosa. El metabolismo de glucosa esta documentado para condiciones aerobias,
sin embargo la utilizacin de celobiosa en procesos de fermentacin no lo esta. Al ser
la celobiosa un dimero de glucosa, conociendo que B. subtilis posee una -glucosidasa
y que requiere de dos ATPs para fosforilar las dos moleculas producto de la hidrlisis
de la celobiosa, se plantea que este microorganismo puede utilizar y metabolizar este
azcar con eficiencias similares a la glucosa. Por otro lado, reportes previos indican
que las cepas silvestres de B. subtilis 168 carecen de un sistema de trasporte
especifico para xilosa, por lo cual no crecen en presencia de dicho azcar como nica
fuente de carbono. No obstante B. subtilis posee todos los genes necesarios y por
consiguiente enzimas para su metabolismo. En consecuencia, aprovechando la
capacidad de este microorganismo para mutar, en el presente proyecto planteamos
generar y aislar mutantes, que potencialmente transporten y metabolicen xilosa con
eficiencias similares a glucosa.
Es sabido que en condiciones aerbicas B. subtilis produce actico como producto del
metabolismo primario de glucosa, y en condiciones anaerbicas en medios ricos
mezclas de lctico, actico, acetoina y 2, 3-butanodiol. En este sentido planteamos que
este microorganismo potencialmente producir los productos citados arriba
metabolizando celobiosa o xilosa.
OBJETIVOS
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6. OBJETIVOS DEL PROYECTO
GENERAL
Caracterizar a nivel fermentador parmetros cinticos de crecimiento y de formacin de

productos con Bacillus subtilis en condiciones aerobias y anaerobias utilizando como
fuentes de carbono glucosa, xilosa y celobiosa.
PARTICULARES
Instalar y realizar pruebas de arranque de control automtico de 6 fermentadores de

1 litro.
Evaluar el crecimiento, la velocidad especfica de crecimiento y de consumo de

azcares, rendimientos y velocidades especficas de formacin de productos de
Bacillus subtilis en condiciones aerbicas y anaerbicas con glucosa, xilosa, celobiosa
y mezclas de glucosa-xilosa y glucosa-celobiosa.
Evaluar el potencial de Bacillus subtilis para fermentar glucosa.
Evaluar la tolerancia a etanol y furfural de Bacillus subtilis WB700CH2 en condiciones

anaerbicas.
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MATERIALES Y MTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7. MATERIALES Y MTODOS
7.1 Microorganismos.
Los microorganismos utilizados en el presente estudio se presentan en la tabla 6.1.
Tabla 6.1 Cepas de Bacillus subtilis

Designacin Genotipo Relevante Referencia
168 TrpC2 Cepario del Laboratorio
BB80 nprE glyB hisA Cepario del Laboratorio
WB700 TrpC2 nprE aprE epr bpf mpr::ble Ye et al., 1996
nprB::bsr vpr::ery
WB700CH1 WB700 Trp+ Este trabajo
WB700CH2 WB700 Trp+ xil+ Este trabajo
Inicialmente se seleccion la cepa de B. subtilis WB700 debido a que tiene eliminados

y/o interrumpidos los genes que codifican para las siete proteasas mayoritarias de este
microorganismo, disminuyendo de esta manera su actividad proteoltica a tan solo
0.32% con respecto a su cepa progenitora (Ye et al., 1996). Esta cepa se esta
utilizando en el Laboratorio de Ingeniera Metablica del Departamento de Ingeniera
Celular y Biocatlisis del Instituto de Biotecnologa para expresar protenas
heterlogas. Es bien sabido que B. subtilis es buen productor de proteasas y que stas
tienen la capacidad de hidrolizar varias protenas heterlogas, por lo cual se considera
que WB700 constituye una buena cepa receptora para expresar de manera estable
protenas recombinantes heterlogas dada las manipulaciones realizadas en WB700
(Ye et al., 1996). Esta cepa presenta resistencia a eritromicina, lincomicina y
cloranfenicol. En la mayor parte de los estudios realizados se utilizaron las cepas
WB700CH1 y WB700CH2, las cuales se obtuvieron en el presente trabajo a partir de
WB700 y se describen en secciones posteriores.
17
MATERIALES Y MTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7.2 Generacin de un banco de clulas.
Para obtener inculos bajo las mismas condiciones a lo largo de todo el estudio, y
disminuir variaciones en los cultivos, se generaron bancos de clulas con las cepas
168, WB700, WB700CH1 y WB700CH2.
Las cepas se crecieron en medio slido con agar (15 g/l) utilizando los componentes
indicados en la siguiente seccin (6.3). Las cajas se incubaron a 37C hasta obtener
colonias de tamao mayor a 1mm de dimetro (aprox. 24 horas). De estas cajas se
transfirieron de 3 a 5 colonias aisladas a un tubo de ensaye estril conteniendo 1 ml del
medio respectivo, resuspendindolas mediante agitacin con la ayuda de un vortex.
Esta suspensin se utiliz como semilla para el desarrollo de los preinculos. Con sta
se inocularon 100 ml de medio de cultivo y se incubaron hasta que se alcanz la fase
de crecimiento exponencial, a aproximadamente 22 horas de cultivo, alcanzando una
DO600 nm 3.5. Muestras de 2 ml se almacenaron en crioviales con glicerol al 40% a
70C. Las cepas, a excepcin de la WB700CH2, se crecieron en medio Luria y
mineral 10 g/l de glucosa. La cepa WB700CH2 se creci con 10 g/l de xilosa.
7.3 Medios de cultivo.

En la evaluacin del metabolismo de azcares en condiciones aerbicas y anaerbicas
se utilizaron dos medios de cultivo: medio Luria Bertani (Wang, 1992) y medio mineral
(Martnez et al., 1997), ambos suplementados con 10 g/l de azcar.
En la evaluacin de crecimiento en mezclas de azcares se utiliz medio mineral con 5

g/l para cada uno de los azcares evaluados.
Para la evaluacin de la tolerancia a etanol y furfural, los cultivos se llevaron acabo en

condiciones anaerbicas utilizando medio LB suplementado con 10 g/l de glucosa. Las
concentraciones de los inhibidores utilizadas se detallan en la seccin de resultados.
En condiciones anaerbicas, para algunos casos el medio mineral fue suplementado

con diferentes concentraciones de extracto de levadura industrial (ELI) o slidos de
licor de maz (SLM), tal y como se detalla en la seccin de resultados.
18
MATERIALES Y MTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
En todos los casos los azcares se esterilizaron por calor hmedo (121oC, 20 min) por
separado y se mezclaron, una vez fros y previo a la inoculacin, con los otros
componentes del medio.
La composicin del medio Luria Bertani fue (por litro) 10 g de Bacto-Triptona, 5 g de

extracto de levadura y 5 g de cloruro de sodio.
La composicin del medio mineral fue (por litro) 10 g de azcar, 4 g de (NH4)2SO4, 5.32
g de K2HPO4, 6.4 g de KH2PO4, 10 mg de cido ctrico, 0.4 g de MgSO4.7H2O, 5 mg de
MnCl2, 40 mg de CaCl2, 30 mg de FeSO4.7H2O. El sulfato de amonio y las sales de
fosfato se esterilizaron juntos (por calor) y se prepararon soluciones patrn de los otros
componentes del medio, los cuales se esterilizaron por filtracin (0.22 m) y se
adicionaron al medio base antes de inocular los cultivos.
7.4 Condiciones de cultivos.

7.4.1 Cultivos aerbicos
Los cultivos aerbicos se realizaron en fermentadores Applikon (Capitulo 8.1) con un
volumen de trabajo de 500 ml, equipados con turbina tipo Rushton de 6 paletas planas.
La temperatura fue controlada a 37C. El pH se mantuvo a 7.0 mediante adiciones
automticas de KOH 1N y 2N, y cuando fue necesario se llevaron acabo adiciones
automticas de cido fosfrico 0.5 M. La espuma fue controlada mediante adiciones
manuales de Silicn grado alimenticio al 10% (Droguera Cosmopolita). El oxgeno
disuelto fue controlado por arriba del 20% (con respecto al valor de saturacin en aire)
mediante un control Proporcional-Integral-Derivativo (PID), por incrementos
automticos en la velocidad de agitacin. Los parmetros de control fueron
determinados empricamente y se ajustaron a valores de 3, 1500 y 0 para el
proporcional, integral y derivativo, respectivamente. La velocidad de agitacin inicial fue
de 600 rpm con un flujo constante de aire, 1 vvm. Los cultivos fueron monitoreados y
controlados mediante el Biocontrolador ADI 1010, la adquisicin de datos se llev a
cabo con la ayuda de una computadora personal mediante el software Bioexpert 1.20x
de Applikon.
19
MATERIALES Y MTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7.4.2 Cultivos anaerbicos

Los cultivos anaerbicos se realizaron en sistemas de mini-fermentadores o mini-
fleakers (Beall et al., 1991; Anexo 12.3), con un volumen de trabajo de 200 ml. La
temperatura fue controlada a 37C y el pH se mantuvo a 7.0 mediante la adicin
automtica de KOH 2N. Los cultivos se mantuvieron a una velocidad de agitacin de
100 rpm para garantizar el mezclado de los nutrientes.
7.4.3 Desarrollo de inculos

Para el desarrollo de inculos se adicion 1 ml del preinculo en glicerol por cada 100
ml de medio. Los inculos se incubaron durante 22 h, hasta alcanzar una DO600 de
aproximadamente 2.5, a 37C y a 250 rpm para los cultivos en condiciones aerbicas y
a 120 rpm para los cultivos anaerbicos. Todos los cultivos fueron inoculados
centrifugando (5000 rpm; 10 min; 25C) la cantidad suficiente de inculo para obtener
una DO600 inicial 0.5, las clulas fueron transferidas a cada cultivo resuspendindolas
en una pequea cantidad de NaCl 10 mM en el caso de los cultivos aerbicos y en el
medio respectivo en el caso de los cultivos anaerbicos (la variacin de la
concentracin inicial celular en todos los cultivos se debe al error experimental).
La evaluacin de los cultivos se realiz en medio Luria y mineral con 10 g/l de azcar.
Todos los cultivos se realizaron por duplicado y en los resultados se presentan los
promedios de los mismos.
Los parmetros evaluados fueron: velocidad especfica de crecimiento (); rendimiento

Biomasa / sustrato (YX/S); velocidad especfica de consumo de azcar (qS); producto
final, as como la velocidad especfica de formacin de producto (qP), los cuales se
determinaron durante la fase de crecimiento exponencial y fueron corregidos por factor
de dilucin en funcin de la base o cido adicionado a los cultivos para el control de pH
(Ver anexo 12.6).
20
MATERIALES Y MTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7.5 Transformacin de B. subtilis WB700. Eliminacin de auxotrofia a

triptfano.
La eliminacin de la auxotrofia a triptfano presentada por la cepa WB700, se llev a
cabo mediante tcnicas de biologa molecular empleadas en el Laboratorio de
Ingeniera Metablica del Departamento de Ingeniera Celular y Biocatlisis del Instituto
de Biotecnologa. La misma se basa en la capacidad que tiene B. subtilis para alcanzar
un estado de competencia naturalmente. La competencia es la habilidad de las clulas
para incorporar y unir ADN exgeno, presente en el medio, a su cromosoma. Esta
capacidad se desarrolla cuando existe una limitacin de nutrientes (principalmente de
la fuente de carbono) y se presenta durante la etapa de transicin de la fase
exponencial de crecimiento a la fase estacionaria (Devine, 2000).
Para llevar acabo esta transformacin se requirieron las siguientes soluciones: Sales
10x, solucin de TBI, solucin de TBII y medio Luria.
La composicin de las sales 10x fue (para 100 ml) 14 g de K2HPO4, 6.0 g de KH2PO4,
2.0 g de (NH4)2SO4, 1.0 g de citrato de sodio. La solucin TBI contiene (por cada 2.5 ml
de sales 10x): 0.05% de glucosa, 5mM de MgSO4, 0.02% de casa aminocidos, 50
g/ml de Trp. La solucin TBII contiene (por cada 2.5 ml de sales 10x): 0.05% de
glucosa, 5mM de MgSO4, 0.01% de casa aminocidos, 5 g/ml de Triptfano.
Se inocul 1 ml de solucin TBI en un tubo de 150 x 15 mm, con colonias frescas de B.

subtilis WB700 y se incubaron a 37C hasta que las clulas alcanzaron el estado de
competencia (9 h aproximadamente). Se transfirieron 250 l de cultivo a 2.25 ml de
solucin TBII y se agregaron 10 l de ADN cromosomal extrado de la cepa BB80 (Trp+;
anexo 12.2). Se incubaron durante 1.5 h a 37C. Una vez concluido el tiempo de
incubacin, se procedi a estriar cajas de medio mineral sin Trp, con 200 l de medio
de cultivo e incubndose a 37C durante 48 h, de esta forma solo se desarrollaron y
aislaron aquellas colonias que adquirieron la habilidad para crecer en ausencia de
triptfano. Adicionalmente, para evitar tener colonias que hubieran recuperado los
genes para la produccin de proteasas, las colonias obtenidas se purificaron realizando
21
MATERIALES Y MTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
un pase a cajas de medio mineral sin triptfano con eritromicina (Em) 5 g/ml y
lincomicina (Lm) 5 g/ml, debido a que WB700 fue seleccionada mediante la
resistencia presentada a estos antibiticos y de esta manera se asegur seguir
conservando el genotipo original. Una vez probado que las cepas no haban perdido la
resistencia a Em y Lm, a manera de comprobacin, las colonias purificadas se
sembraron en cajas de medio slido de leche descremada (Skim milk) con Em 5 g/ml
y Lm 5g/ml, incubndose durante 12 h a 37C.
7.6 Generacin de mutantes de B. subtilis Xil+.

Se sigui el procedimiento descrito por Schiedel y Hillen (1996). La cepa WB700CH1
se sembr en cajas de medio mineral con xilosa (10 g/l), a partir de colonias obtenidas
de cajas de medio mineral con glucosa. Las cajas se incubaron a 37C durante 72 h,
observndose poco crecimiento (colonias muy pequeas). Estas colonias fueron
resembradas nuevamente en cajas medio mineral con xilosa. Despus de varios pases
se logr observar un crecimiento similar al presentado en cajas de medio mineral con
glucosa con la misma cepa, obtenindose colonias grandes (1 mm) y homogneas a un
tiempo de incubacin aproximado de 36 h.
7.7 Concentracin Celular

La concentracin celular se midi en un espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 11 y
fue convertido a peso seco de clulas (DWC) de acuerdo con una curva de calibracin
realizada: 1 DO600nm = 0.35 gDWC /l (Anexo 12.1). El monitoreo de los cultivos se llev
acabo tomando dos muestras de 1 ml cada una, centrifugndolas a 5,000 rpm durante
5 min. Los sobrenadantes se almacenaron a 70C hasta su anlisis.
7.8 Determinacin de azcares.

El consumo de azcares se determin mediante el mtodo de azcares reductores del
cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS; Chaplin y Kennedy, 1987) y por tcnicas de
cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC). En el caso de medio mineral
suplementado con extracto de levadura industrial o slidos de licor de maz, la
determinacin de glucosa se realiz mediante un analizador enzimtico.
22
MATERIALES Y MTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7.8.1 Mtodo de azcares reductores (DNS)

Este consiste en agregar 1.0 ml del reactivo de DNS a un volumen de 0.1 ml de
muestra o estndar, calentar a ebullicin durante 10 min, una vez terminado el tiempo
de reaccin enfriar durante 5 min en un bao de agua a temperatura ambiente y leer la
absorbancia a 570 nm. Las mediciones se realizaron en un espectrofotmetro (Perkin
Elmer Lambda 11).
El reactivo de DNS se prepara disolviendo 75 g de tartrato de sodio y potasio en 100 ml

de agua destilada, agregando despus 50 ml de NaOH 2M y 75 ml de agua destilada
caliente, entonces se adiciona lentamente 0.25 g de cido 3,5-dinitrosaliclico hasta
disolver por completo.
7.8.2 Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC)

La determinacin por HPLC, se llev acabo por cromatografa isocrtica con H2SO4 5
mM como fase mvil a un flujo de 0.5 ml/min en una columna Aminex HPX-87H a 50
C. La deteccin se hizo simultneamente con un detector de arreglo de diodos
(Waters 996) y un detector de ndice de refraccin (Waters 410). El anlisis y
procesamiento de datos se realiz con el sistema Milenium Versin 3.01 Waters).
7.8.3 Determinacin enzimtica de glucosa

La determinacin enzimtica de glucosa se llev acabo en un analizador Bioqumico
YSI mod. 2700, utilizando D-glucosa oxidasa inmovilizada.
7.9 Determinacin de cidos orgnicos

La concentracin de actico y lactato fue obtenida por tcnicas de HPLC, utilizando las
mismas condiciones que para la determinacin de azcares. En el caso de lactato,
tambin fue cuantificado mediante un analizador Bioqumico (YSI modelo 2700),
utilizando L-lactato oxidasa inmovilizada.
23
INSTALACIN DE EQUIPO DE FERMENTACIN
_________________________________________________________________________________________________________
8. INSTALACIN DE EQUIPO DE FERMENTACIN

8.1 Descripcin del equipo
El equipo de fermentacin para cultivos aerobios que se instal y puso en marcha,
consiste de 6 fermentadores de la compaa Applikon (Dependable Instrument, B.V
Schiedam, Holanda). Para llevar a cabo la adquisicin de datos en lnea y estrategias
avanzadas de control automtico, los fermentadores, en grupos de tres, estn
conectados por medio de tres puertos seriales (RS232) a dos computadoras
personales. Cada sistema (figura 8.1), esta integrado por:
a) Bioreactor
Constituido por una jarra de fermentacin, con volumen nominal de 1,250 ml, volumen
de trabajo mnimo de 350 ml y mximo de 900 ml La relacin altura de lquido/dimetro
interno del reactor (H/D) es de 1.5 para un volumen de operacin de 900 ml. El sistema
de agitacin est integrado por 2 turbinas Rushton de 45 mm de dimetro total con 6
paletas planas y un motor de velocidad variable (mod. P100; rango de velocidad: 0-
1250 rpm), cuenta adems con 2 deflectores, dispersor de aire de orificio, sistema de
enfriamiento mediante recirculacin de agua a travs de los deflectores, calentamiento
por medio de una mantilla trmica de 110 W, sensores de pH (rango: 0-14), de oxgeno
disuelto (rango: 0-500% de saturacin en aire) y de temperatura (rango: 0-150C).
b) Biocontrolador ADI 1010

El cual lleva acabo la medicin y control de las variables de proceso: pH, temperatura,
oxgeno disuelto, nivel de lquido o adicin de antiespumante y velocidad de agitacin.
Este funciona mediante un control de tipo Proporcional-Integral-Derivativo (PID). El
control PID funciona por medio de actuadores. Los actuadores para cada variable son:
Para el control del oxgeno disuelto:
Velocidad de agitacin.
Flujo de aire (vlvula de aire)
Flujo de oxgeno (vlvula de oxigeno)
Flujo de nitrgeno (vlvula de Nitrgeno)
24
_________________________________________________________________________________________________________
Bioconsola Biocontrolador
ADI 1025 ADI 1010
Ro tmetros
Bombas
Bioreactor
Figura 8.1 Sistema de fermentacin Applikon.
Para el control de pH:

Adicin de cido (bomba de cido).
Adicin de base (bomba de base).
Flujo de CO2 (vlvula de CO2)
Para el control de temperatura:

Flujo de agua de enfriamiento (vlvula de agua)
Elemento calefactor.
c) Bioconsola ADI 1025
25
_________________________________________________________________________________________________________
La bioconsola consta esencialmente de los actuadores y recibe las seales del

biocontrolador para llevar a cabo el control de las variables del proceso. La bioconsola
est equipada con:
i) Tres bombas de adicin para cido, base y control del nivel, las cuales pueden ser
operadas de forma manual o automtica.
ii) Dos rotmetros, en los cuales se controla de forma manual, mediante una vlvula
de aguja, el flujo de aire u oxgeno
iii) Dos vlvulas solenoides para controlar la entrada de agua al sistema de
enfriamiento
iv) . Una fuente de poder para la mantilla de calentamiento
d) Sistema de computo
Mediante un programa de control y de adquisicin de datos (Software BioXpert versin

1.20x), cada computadora lleva acabo el monitoreo simultneo y de ser necesario el
control remoto de 3 sistemas de fermentacin. El Software permite llevar acabo:
i) S se requiere, el control remoto de los parmetros del cultivo (pH, oxgeno
disuelto, temperatura, nivel, control de espuma) por medio de algoritmos de
control y algoritmos de tipo apagado/encendido (ON/OFF).
ii) El monitoreo del cultivo mediante un registro de datos y grfico del
comportamiento de cada uno de los parmetros del cultivo.
La adquisicin de datos se lleva acabo por periodos de tiempo determinados por el
usuario, en funcin del tiempo de operacin del sistema los periodos de adquisicin
pueden variar desde 1 hasta 60 min.
26
_________________________________________________________________________________________________________
8.2 Instalacin y puesta en marcha de 6 sistemas de fermentacin.

Para la operacin adecuada de los sistemas de fermentacin, se instalaron vlvulas de
alimentacin de agua y aire as como la adaptacin de una toma de gas LP para la
instalacin de un mechero Bunsen auxiliar en el mantenimiento del rea estril durante
la inoculacin y toma de muestra. Lo anterior se representa en la figura 8.2
Los Biocontroladores ADI 1010 fueron conectados a fuentes de poder ininterrumpibles
(no-breaks), mientras que las Bioconsolas 1025 fueron conectadas a tomas de
corriente directa de 120 V.
Una vez instalados los seis sistemas de fermentacin se realizaron cultivos control
sobre los cuales se llev acabo la capacitacin en el manejo y operacin del equipo.
Durante estos se monitore la respuesta y el control del biocontrolador.
Los sensores de pH fueron calibrados utilizando amortiguadores certificados de pH 7.0

y 4.0. El sistema de medicin de oxgeno disuelto se calibr, con la ayuda de un
simulador de oxgeno disuelto (Metler-Toledo, Inc.), a valores de 0 y 100%. Es
importante mencionar que para cada cultivo es necesario, antes de agregar el inculo
al reactor, calibrar los sensores de oxgeno disuelto a 100% de saturacin en aire, esto
es solo con el medio completo a utilizar y a las condiciones operacionales del mismo
(pH, temperatura, flujo de aire y velocidad de agitacin).
Los sensores de temperatura se calibraron a temperatura de fusin del hielo y de

ebullicin del agua, con la ayuda de un termmetro de mercurio de referencia,
colocando tanto el sensor como el termmetro, en primer lugar en hielo y
posteriormente en agua a ebullicin, se tomaron las lecturas del termmetro y con esas
se realiz la calibracin respectiva.
27
_________________________________________________________________________________________________________
B6
B5
B4
M
TF
S R
Colector de agua
P
de enfriamiento
TC
B3
FF
R
FC
B2
Agua
Gas
Aire
B1
S R
TF
D
Figura 8.2 Diagrama de tuberas e instrumentacin para seis sistemas de fermentacin

Applikon.
28
_________________________________________________________________________________________________________
Simbologa Nomenclatura
Direccin de flujo
B Bioconsola
Controlador de flujo msico M Mechero
S TF Flujo hacia el fermentador

Vlvula solenoide
R TC Flujo hacia el condensador
Vlvula de No Retorno
FF Flujo del fermentador
Vlvula reguladora de presin FC Flujo del condensador

P
D Flujo de agua de enfriamiento hacia el

Vlvula de compuerta drenaje
Conectores rpidos en T
Manmetro de presin
Manguera de Neopreno No. 15
para agua
Manguera de Silicn flexible No. 15
para agua de enfriamiento
Manguera rgida para aire
Manguera de ltex de para gas
Durante los cultivos control se observ que la respuesta y control automtico del
biocontrolador ADI 1010, no eran adecuadas, debido a que no se tena un control fino y
exista una gran variacin de los parmetros de temperatura y oxgeno disuelto. Para
encontrar los valores adecuados de PID se llev acabo la determinacin y el ajuste de
valores PID como se menciona a continuacin:
a) Temperatura: el ajuste emprico fue por prueba y error, utilizando agua como
fase lquida. Se emplearon 3 sistemas probando valores arbitrarios. El
Biocontrolador 1010 es un controlador adaptativo que automticamente realiza
ajustes de los valores PID en funcin del historial de los cultivos. Sin embargo, la
estabilidad de los parmetros no era buena para un proceso biolgico, es decir
se tena variaciones elevadas en la temperatura, pH, velocidad de agitacin y de
oxgeno disuelto de los cultivos. No obstante, los valores obtenidos de manera
automtica, en corridas previas, se tomaron como referencia para llevar a cabo
29
_________________________________________________________________________________________________________
las pruebas iniciales. Estas se iniciaron solicitando la misma temperatura a los

tres sistemas y variando el valor de control proporcional (P) de la siguiente
manera: al sistema 1 se le dieron valores menores que el valor determinado de
forma automtica, al sistema 2 un valor mayor y el sistema 3 conserv el valor
automtico. Se observo por un periodo de tiempo de 1 hora, la variacin de la
temperatura requerida como punto de control para diferentes valores de P,
eligindose aquel valor con el cual la variacin fuera menor. Una vez obtenido
este valor se prosigui a evaluar el valor integral (I). Este se realiz de la misma
manera que con el valor P. Se observ que con solo el uso de estos dos
parmetros era suficiente para lograr un control adecuado de la temperatura con
variaciones de +/-0.1C para temperaturas de 30-37C, corroborndose despus
con lo observado durante los cultivos realizados. De esta manera los valores PID
determinados para el control de la temperatura fueron 10, 2700 y 0, para las
constantes P, I y D, respectivamente.
b) Oxgeno disuelto: para este caso los valores fueron determinados con cultivos
de Bacillus subtilis en medio mineral durante la fase de crecimiento exponencial.
Se emplearon dos sistemas de fermentacin, llevando acabo el ajuste de los
parmetros PID de igual forma que para la temperatura. Los valores obtenidos
fueron 3, 1500 y 0 para P, I y D, respectivamente.
c) pH: Los valores PID obtenidos de forma automtica presentaron un mejor control
de este parmetro, por lo que en este caso no fue necesario realizar ningn
cambio.
8.3 Operacin de equipo de fermentacin

La jarra de fermentacin se prepara para su esterilizacin de acuerdo al esquema
presentado en la figura 8.3 y se esteriliza por calor hmedo a 121C durante 20 min,
con el medio de cultivo. Para el caso del medio mineral, la jarra se esteriliza solo con
las sales de fosfato y el sulfato de amonio y una vez estril se adicionan las sales
30
_________________________________________________________________________________________________________
restantes previamente esterilizadas por filtracin como se indica en el capitulo 6.3,

esterilizando por separado la fuente de carbono (glc, xil o cel). Una vez estril y a
temperatura ambiente se adiciona la fuente de carbono y los dems componentes del
medio segn sea el caso y se ajusta el volumen de trabajo a 500 ml con agua destilada
estril. Se ajusta el pH, la agitacin y la temperatura a las condiciones de trabajo y una
vez estables se calibra el sensor de oxgeno al 100 % de saturacin y se procede
inocular.
Sensor de oxigeno
Sensor de pH
Venteo
Puertos de
adicin Toma de muesta
Puerto de toma
de muestra
Matraz para venteo
Figura 8.3 Preparacin del Bioreactor para esterilizacin.
31
PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
9 PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS

9.1 Evaluacin del crecimiento de Bacillus subtilis WB700
Bacillus subtilis WB700 tiene eliminados o interrumpidos, en el cromosoma, los genes
que codifican para sus 7 proteasas mayoritarias (Ye et al., 1996). En el presente
proyecto se seleccion la cepa WB700 para ser utilizada posteriormente en la
expresin intra y extracelular de protenas recombinantes y evitar el efecto de hidrlisis
de las mismas por las proteasas nativas de B. subtilis. La cepa WB700 proviene de la
cepa silvestre de B. subtilis 168 y ambas presentan auxotrofa a triptfano (Trp; tabla
6.1).
Las primeras evaluaciones se realizaron en medio Luria y medio mineral bajo

condiciones aerbicas. Debido a la auxotrofa presentada, el medio mineral fue
suplementado con 100 g Trp/ml, requerimiento superior a lo reportado para cepas que
presenta auxotrofa a este aminocido en E. coli (20 g/ml de L-triptfano) y para B.
subtilis 168 (40 g Trp/ml; Schmiedel y Hillen, 1996). En el caso del medio Luria,
debido a su composicin, contiene aproximadamente 139 g Trp/ml (The Difco manual,
11th Edition). Sin embargo, a pesar de que el triptfano se encontraba en exceso tanto
en el medio rico como en el medio mineral empleado, las primeras 4 cinticas
realizadas con B. subtilis WB700 en medio mineral mostraron velocidades de
crecimiento menores a las reportadas para otras cepas de B. subtilis (tabla 8.1).
Adems el porcentaje de azcar residual al inicio de la fase estacionaria era del 32%,
es decir que la fuente de carbono no era lo que estaba limitando el crecimiento ya que
con medio rico tambin se observaba ese comportamiento. En cultivos con medio Luria
y mineral, la XMX alcanzada fue en promedio 50% menor a lo reportado para otras
cepas derivadas de B. subtilis 168 (BB804), pero que no presentan auxotrofa a ningn
aminocido (Martnez et al., 1997; tabla 9.1).
Para dilucidar a que se deba el comportamiento presentado en el prrafo anterior, se

llevaron a cabo cinticas de comparacin en medio rico glucosa entre la cepa WB700 y
su progenitora (B. subtilis 168). El objetivo de esta comparacin fue determinar si la
32
_________________________________________________________________________________________________________
biomasa mxima alcanzada se deba a cambios en el fondo gentico (genotipo) de

WB700 o si estaba relacionado con deficiencias en el transporte de triptfano.
La variacin entre las velocidades de crecimiento observadas y la biomasa mxima

alcanzada fueron menores al 5% (tabla 9.1), lo cual indica que el fondo gentico
(integracin de marcadores de seleccin, e interrupciones y eliminacin de genes) de
WB700 no son la causa por la cual la cepa crece deficientemente. Esto permiti sugerir
que la auxotrofa a triptfano en las cepas WB700 y 168 est relacionada con el
crecimiento limitado, probablemente ocasionado por deficiencias en el transporte del
aminocido. En consecuencia se decidi eliminar la auxotrofa a triptfano en WB700 y
evaluar el crecimiento de las cepas obtenidas en medio mineral con glucosa, a nivel
matraz, con el fin de corroborar dicha hiptesis.
Tabla 9.1 Datos sobre el crecimiento aerobio de distintas cepas de B. subtilis.

a b
Cepa de Medio Glucosa XMAX. Glucosa Referencia
B. subtilis inicial residual
(g/l) (h-1) (g/l) (g/l)
BB804 Mineral 11.2 0.44 5.21 0.0 Martnez et al.,1997
WB700 Mineral 9.5 0.35 2.14 3.0 Este trabajo
WB700 Luria 11.5 0.73 2.84 7.8 Este trabajo
168 Luria 11.6 0.70 2.86 6.9 Este trabajo
a
Biomasa mxima obtenida al termino de la fase de crecimiento exponencial.
b
Glucosa residual al termino de fase de crecimiento exponencial.
9.2 Eliminacin de auxotrofa a triptfano en la cepa WB700

Se extrajo y purific ADN cromosomal de otra cepa de B. subtilis, la BB80, la cual no
presenta auxotrofa a triptfano (tabla 6.1). El ADN extrado fue resuspendido en 125 l
de amortiguador TE. Para conocer su concentracin, se corrieron tres distintas
cantidades del extracto de ADN en un gel de agarosa al 1%, el ADN se separ por
tcnicas de electroforesis utilizando un marcador de 1kilobase (1 kb DNA ladder
33
_________________________________________________________________________________________________________
Fermentas). La concentracin del ADN extrado se estim en base a la intensidad

presentada por las bandas obtenidas. La concentracin estimada fue de 16 g/l.
Para complementar la auxotrofa a triptfano se llev acabo una transformacin con

clulas competentes de B. subtilis WB700, de acuerdo al procedimiento descrito en
materiales y mtodos, utilizando el ADN cromosomal extrado de la cepa BB80.
Para poder aislar y seleccionar las colonias transformadas que hubieran adquirido la
capacidad para crecer en ausencia de triptfano, se estriaron 5 cajas de medio mineral
sin triptfano con 200 l de cultivo cada una. Despus de 48 h solo se observo el
crecimiento de 8 colonias.
Con el fin de purificar colonias y evitar contaminaciones posibles, que pudiesen

provenir de la transformacin, las colonias obtenidas se resembraron en cajas de
medio mineral-glucosa 10 g/l, usando dos de los marcadores de seleccin (antibiticos)
que se usaron para construir la cepa WB700, es decir Em 5 g/ml y Lm 5 g/ml. El
crecimiento de las colonias obtenidas, en cajas de medio mineral sin triptfano fue
mayor comparado con la cepa WB700, ya que en las primeras se observ crecimiento
a las 24 h, mientras que en la progenitora el crecimiento se observaba despus de 48 h
usando triptfano.
Esta mismas colonias se picaron en medio slido de leche descremada (skim milk),
para probar la conservacin del genotipo proteasas menos, utilizando como controles a
la cepa WB700 (control negativo para la produccin de proteasas) y a BB80 (control
positivo para la produccin de proteasas). El medio skim milk es empleado para la
deteccin de hidrlisis de protenas, particularmente de la casena de la leche.
Como se observa en la figura 9.1, despus de 24 horas de incubacin a 37oC, la cepa

BB80 mostraba la formacin de un alo alrededor de las colonias, lo cual no se
observaba para las cepas WB700 y las 8 prottrofas aisladas mediante el
procedimiento antes descrito. Este resultado en conjuncin con el de crecimiento en
34
_________________________________________________________________________________________________________
medio mineral slido en presencia de los marcadores de seleccin, permiti concluir

que las 8 cepas aisladas son prottrofa a triptfano y que conservan la propiedad de no
producir proteasas.
BB80
Transformantes prottrofas a
triptfano
WB700
Figura 9.1 Conservacin del genotipo proteasas menos en WB700CH1.
Para seleccionar la colonia que se empleara en el presente proyecto, se realiz una

cintica de crecimiento, con las 8 colonias aisladas, en matraces con medio mineral-
glucosa 10 g/l sin triptfano. De acuerdo a los resultados (tabla 9.2), la colonia 2
present una mayor velocidad de crecimiento, en consecuencia fue seleccionada para
futuras evaluaciones y se denomino WB700CH1.
Tabla 9.2 Velocidad especfica de crecimiento de colonias de B. subtilis prottrofas a

triptfano obtenidas por transformacin.
Colonia 1 2 3 4 5 6 7 8
(h-1) 0.148 0.168 0.118 0.111 0.109 0.106 0.108 0.118
35
_________________________________________________________________________________________________________
9.3 Evaluacin de B. subtilis WB700CH1 en condiciones aerbicas.

Con el fin de conocer y determinar los parmetros de crecimiento de B. subtilis en
condiciones anaerbicas y poder tener un patrn de comparacin, se llevaron a cabo
cultivos a nivel fermentador de 1 litro, bajo condiciones aerbicas, con tres diferentes
azcares: glucosa, xilosa y celobiosa. En las figuras 9.2 y 9.3 se presentan las cinticas
de crecimiento, consumo de azcar y formacin de producto, para los cultivos
realizados con medio Luria y medio mineral en aerobiosis, respectivamente, con la
cepa de B. subtilis WB700CH1.
Como puede observarse en la figura 9.2 y Tabla 9.3, en medio rico la velocidad de
crecimiento presentada para cultivos con glucosa fue 20% mayor que para los cultivos
con celobiosa y xilosa, a pesar de esto, en los tres casos se lleg a la fase estacionaria
prcticamente en el mismo tiempo de cultivo (4-5 h) y la biomasa obtenida en este
tiempo fue mayor con glucosa. No obstante en ninguno de los casos se consumi todo
el azcar siendo esto ms notorio en los cultivos con celobiosa y xilosa, en los cuales el
consumo de azcar fue mnimo. En el caso de glucosa, solo el 35% de este azcar fue
consumido durante la fase de crecimiento con una velocidad especfica de 1.31
gS/gDWC.h. Todo lo anterior indica que B. subtilis utiliz parte de los componentes
(aminocidos) del medio para crecer y que aproximadamente a las 4 h de cultivo,
alguno de estos componentes (probablemente un aminocido otro microcomponente)
se agot e impidi un mayor crecimiento celular.
En medio mineral (figura 9.3) solo se observ crecimiento en los cultivos con glucosa y
celobiosa y no as con xilosa. Esto al parecer se debe, como se menciono en los
antecedentes, a que B subtilis presenta una deficiencia en el transporte de xilosa,
impidindole metabolizar y utilizar este azcar como nica fuente de carbono
(Schmiedel y Hillen, 1996; Krispin y Allmansberger, 1998; Mota et al., 1998). En
consecuencia se decidi obtener mutantes que pudiesen transportar y metabolizar
xilosa, lo cual es presentado a detalle en el capitulo 9.4.
36
_________________________________________________________________________________________________________
10 14
A)
12
Biomasa (g/l)
Actico x 4 (g/l)
10
Glucosa (g/l)
8
1
6
0.1 0
10 14
B)
12
Biomasa (g/l)
Celobiosa (g/l)
10
Actico (g/l)
8
1
6
0.1 0
10 14
C)
12
Biomasa (g/l)
10
Actico (g/l)
Xilosa (g/l)
8
1
6
0.1 0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (h)
Figura 9.2 Crecimiento aerbico de B. subtilis WB700CH1 en medio Luria.

A) Glucosa; B) Celobiosa y C) Xilosa.
37
_________________________________________________________________________________________________________
10 12
A)
10
Biomasa (g/l)
Actico x 8 (g/l)
Glucosa (g/l)
8
1 6
0.1 0
10 12
B)
10
Biomasa (g/l)
Actico x 10 (g/l)
Celobiosa (g/l)
8
1 6
0.1 0
10 12
C)
10
Biomasa (g/l)
Actico (g/l)
Xilosa (g/l)
1 6
0.1 0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (h)
Figura 9.3 Crecimiento aerbico de B. subtilis WB700CH1 en medio mineral.

38
_________________________________________________________________________________________________________
En medio mineral con glucosa, la velocidad especfica de crecimiento y de consumo de

azcar fueron mayores que las observadas con celobiosa (tabla 9.3), sin embargo con
celobiosa se obtuvo un mayor consumo de azcar as como tambin una mayor
formacin de biomasa durante la fase de crecimiento. A pesar de esto, el rendimiento
de conversin de sustrato en biomasa fue similar para ambos casos, ya que parte de la
glucosa consumida se canaliz a la formacin de actico. Sin embargo, en los cultivos
con celobiosa no se detect la formacin de actico.
En comparacin con los cultivos llevados a cabo con glucosa y celobiosa en medio rico,
se observa que las velocidades de crecimiento se reducen, aproximadamente en un
50% para los cultivos en medio mineral (tabla 9.3). Las velocidades especficas de
consumo de azcar fueron similares en ambos medios en el caso de glucosa, pero
mayores para el medio mineral, en aproximadamente un 50%, para celobiosa. Esta
velocidad elevada de consumo de celobiosa en medio mineral, probablemente se deba
a que, en comparacin con medio rico, la cepa requiere de una mayor sntesis de ATP
y aminocidos para formar la biomasa, y el medio rico aporta una cantidad elevada de
aminocidos reduciendo los requerimientos de ATP y de los mismos aminocidos.
Adicionalmente, el consumo de azcar durante la fase exponencial fue mayor en medio
mineral para glucosa y celobiosa.
Tabla 9.3 Resumen de resultados de cultivo aerbicos de B subtilis WB700CH1.

a b
Medio Azcar XMAX YX/S qS Azcar
-1
(g/l) (h ) (gDWC/gS) (gS/gDWC.h) consumida (g/l)
Luria Glucosa 2.89 0.84 NA 1.31 4.52
Celobiosa 2.02 0.67 NA 0.47 1.44
Xilosa 2.04 0.65 NA 0.18 0.06
Mineral Glucosa 2.97 0.45 0.40 1.14 7.49
Celobiosa 3.69 0.36 0.40 0.90 9.26
Xilosa ---- 0.0 ---- ---- ---
a
b
Azcar consumida durante la fase de crecimiento exponencial, azcar inicial 10g/l.
NA No aplica.
39
_________________________________________________________________________________________________________
Adicionalmente, el nico producto detectado, mediante la tcnica de HPLC empleada,

fue cido actico y la produccin de ste esta asociado al crecimiento y se observa
solo en cultivos con glucosa, tanto en medio rico como en medio mineral, obtenindose
concentraciones mximas, durante la fase de crecimiento, de 2.18 y 1.18 g/l
respectivamente (Tabla 9.4). Mientras que en cultivos con celobiosa y xilosa la
produccin de actico es prcticamente nula en ambos medios. (Figura 9.2 y 9.3).
En B. subtilis, la produccin de cido actico como producto del metabolismo aerbico

esta directamente relacionado con las velocidades especficas de crecimiento, de esta
manera a velocidades de crecimiento bajas se ha reportado la existencia de actico
como principal producto, sin embargo a velocidades especficas de crecimiento
mayores, el metabolismo tiene un cambio hacia la produccin de cido lctico. (Snay et
al., 1989). En el presente trabajo y en otros trabajos llevados a cabo con cepas
derivadas de la cepa 168 (Martnez el al. 1997), nicamente se ha encontrado actico
como producto, durante la fase de crecimiento exponencial, en condiciones aerbicas.
Tabla 9.4 Resumen de formacin de actico con B. subtilis WB700CH1 en cultivos

aerbicos utilizando glucosa como fuente de carbono.
Medio YP/S YP/X qP Actico finala
(gP/gS) (gP/gX) (gP/gDWC.h) (g/l)
Luria 0.48 0.75 0.63 2.18

Mineral 0.16 0.40 0.18 1.18
a
Produccin de cido actico al final de la fase de crecimiento exponencial.
9.4 Generacin de mutantes de B. subtilis xil+ (Cepa WB700CH2).

Las cepas de B. subtilis sintetizan todas las protenas necesarias para metabolizar
xilosa, pero no pueden utilizarla como fuente de carbono, debido aparentemente a una
deficiencia en el transporte de este azcar (Schmiedel y Hillen, 1996; Krispin y
Allmansberger, 1998; Mota et al., 1998). Sin embargo, previamente se ha reportado
que se pueden obtener fcilmente mutantes espontneas capaces de transportar xilosa
40
_________________________________________________________________________________________________________
y que una mutacin sencilla, con una frecuencia de 1x10-6/clulas, es suficiente para
convertirlas en derivadas capaces de transportar xilosa (Schmiedel y Hillen, 1996;
Krispin y Allmansberger, 1998).
Basados en estos reportes y al protocolo reportado por Schmiedel y Hillen (1996), se

gener una cepa mutante derivada de B subtilis WB700CH1. En resumen, WB700CH1
se sembr en cajas de medio mineral - xilosa 10 g/l con eritromicina 5 g/ml y
lincomicina 5 g/ml, incubndose a 37C. Despus de 72 h se observ crecimiento con
colonias muy pequeas, estas se resembraron sucesivamente hasta que despus de
varios pases se lograron obtener colonias grandes y homogneas a un tiempo de
incubacin de 36 h. Para corroborar que la cepa obtenida presentaba la mutacin en el
transporte de xilosa y que su crecimiento no se deba a una fase larga de adaptacin,
se seleccion una colonia obtenida a partir de cajas de medio mineral-xilosa, se creci
en matraces con medio mineral - glucosa a 250 rpm y durante la fase de crecimiento
exponencial se traslado a matraces con medio mineral que contena 10 g/l de xilosa
como nica fuente de carbono, en los cuales se observ crecimiento similar al
observado en medio mineral - glucosa. De esta manera se comprob la obtencin de
una cepa mutante capaz de crecer en medios minerales con xilosa como nica fuente
de carbono: Esta cepa fue denominada WB700CH2 (tabla 6.1).
A diferencia de la cepa WB700CH1, la cepa WB700CH2 crece en medio mineral -

xilosa 10 g/l y llega, en trminos prcticos, a la misma cantidad de biomasa que la cepa
WB700CH1 cultivada en las mismas condiciones con medio mineral - glucosa 10 g/l.
9.5 Evaluacin de B. subtilis WB700CH2 en condiciones aerbicas.

Una vez obtenida la cepa mutante WB700CH2 y despus de haber verificado que el
consumo de xilosa se deba a una mutacin y no solo a una fase de adaptacin que
pudiese haber presentar esta cepa, se llevaron a cabo las evaluaciones a nivel
fermentador en medio Luria y medio mineral. Las cinticas de crecimiento y consumo
de azcar se presentan en la figura 9.4.
41
_________________________________________________________________________________________________________
10
(A) 10
Biomasa (g/l)
Xilosa (g/l)
6
1
4
0.1 0
10
(B) 10
Biomasa (g/l)
Xilosa (g/l)
6
1
4
0.1 0
0 4 8 12 16 20
Tiempo (h)
Figura 9.4 Crecimiento aerbico de B subtilis WB700CH2.

(A) en medio mineral y (B) en medio Luria.
42
_________________________________________________________________________________________________________
En medio rico (figura 9.4), WB700CH2 presenta una velocidad especfica de

crecimiento 3 veces mayor que en medio mineral. Sin embargo, tambin se observa el
mismo comportamiento presentado en cultivos en medio rico con glucosa y celobiosa
(figura 9.2), en los cuales el consumo de azcar fue mnimo. Para este caso, el
consumo de xilosa fue solo del 10% (tabla 9.5).
En medio mineral el consumo de xilosa durante la fase de crecimiento fue del 65% y la
velocidad especfica de consumo de azcar, como tambin se observ con celobiosa,
fue mayor (2.6 veces) que la obtenida en medio Luria (tabla 9.5). En ambos medios la
XMAX alcanzada fue similar.
Si se realiza una comparacin con lo observado en cultivos en medio mineral con

glucosa (figura 9.3), los resultados obtenidos con xilosa en el mismo medio, muestran
una disminucin aproximada del 50% en la velocidad especfica de crecimiento y de
consumo de azcar (tabla 9.3 y 9.5).
En cuanto a la formacin de productos, tanto en medio rico como en medio mineral con
xilosa no se observa la produccin de actico, ni se detecto ningn otro producto
metablico con las tcnicas de HPLC empleada.
Tabla 9.5 Parmetros de crecimiento y de consumo de xilosa de B subtilis WB700CH2.

-1 a b
Medio (h ) YX/S qS XMAX Azcar
(gDWC/gS) (gS/gDWC.h) (g/l) consumida (g/l)
Luria 0.59 NA 0.19 3.17 1.05

Mineral 0.24 0.49 0.49 2.96 6.25
a
b
Azcar consumida durante la fase de crecimiento exponencial.
NA: No aplica.
43
_________________________________________________________________________________________________________
9.6 Evaluacin de B. subtilis WB700CH2 en condiciones anaerbicas.

Las evaluaciones de crecimiento anaerbico de B. subtilis WB700CH2 se llevaron
acabo en fleakers, en las condiciones que se indican en la seccin de materiales y
mtodos. Las cinticas de crecimiento, consumo de azcar y formacin de producto,
para los cultivos con medio Luria y medio mineral se presentan en las figuras 9.5 y 9.6
respectivamente.
En cultivos con medio Luria (figura 9.5) se observa crecimiento con los tres azcares
utilizados, sin embargo solo se presenta un consumo significativo de azcar en los
cultivos con glucosa y celobiosa.
En cultivos con glucosa y celobiosa, la biomasa mxima alcanzada al final de la fase de

crecimiento fue menor a 1 g/l (0.92 y 0.61, respectivamente) y la velocidad de
crecimiento fue 2 veces mayor con glucosa que con celobiosa (tabla 9.6). En ambos
casos se observa el consumo total de los azcares, siendo la mayor parte de este
consumo durante la fase estacionaria (figura 9.5).
En cultivos con xilosa en medio rico (figura 9.5), se observa una pequea fase de
crecimiento retardado (2 h) y dos etapas con diferentes velocidades de crecimiento.
Al parecer, en la primera el crecimiento se debe al aprovechamiento de los

componentes del medio rico (aminocidos) debido a que el consumo de xilosa es
prcticamente nulo (0.35 g/l). En sta, la velocidad especfica de crecimiento es 3
veces menor con respecto a la obtenida con medio Luria glucosa bajo las mismas
condiciones. La segunda etapa inicia a las 10 h y en sta la velocidad de crecimiento
es 50% menor que en la anterior, sin embargo el consumo de xilosa es tres veces
mayor que en la otra etapa. No obstante, el consumo total de azcar fue mnimo
(menos del 20%). La biomasa promedio alcanzada durante la fase estacionaria fue
0.616 g DWC/l, similar a la obtenida al final del crecimiento en cultivos con medio Luria -
celobiosa.
44
_________________________________________________________________________________________________________
12
A)
10
Biomasa (g/l)
1
Glucosa (g/l)
Lctico (g/l)
8
0.1 0
12
B) 10
Biomasa (g/l)
Celobiosa (g/l)
Lctico (g/l)
8
0.1 0
12
C)
10
Biomasa (g/l)
1
Lctico (g/l)
8
Xilosa (g/l)
0.1 0
0 12 24 36
Tiempo (h)
Figura 9.5 Crecimiento anaerbico de B. subtilis WB700CH2 en medio Luria.

45
_________________________________________________________________________________________________________
En cultivos con medio mineral (figura 9.6) solo se observa crecimiento cuando se utiliza
glucosa y celobiosa como fuentes de carbono, no as cuando se utiliz xilosa como
nica fuente de carbono. En cultivos con glucosa y celobiosa, la fase estacionaria se
presenta aproximadamente en el mismo tiempo (24 h) y la velocidad especfica de
crecimiento, de consumo de azcar as como el rendimiento de conversin de sustrato
en biomasa fueron similares para ambos casos. Debido a que se present un mayor
consumo de azcar durante la fase de crecimiento exponencial en cultivos con glucosa,
la biomasa alcanzada al final del crecimiento fue 30% mayor a la obtenida en cultivos
con celobiosa (tabla 9.6).
Es importante resaltar que en medio mineral con xilosa, a pesar de que no se observa
un cambio significativo en la densidad celular an despus de 48 h de cultivo, tampoco
se present una fase de muerte o de lisis celular, misma que se observa cuando B.
subtilis se enfrenta con alguna limitante de nutrientes o cuando se agota la fuente de
carbono o nitrgeno (ver figuras 9.6 y ms adelante 9.11. Jolliffe et al.,1980; Martnez
et al., 1997). A pesar de ello, se observa un consumo, aunque no significativo, de
xilosa.
Tabla 9.6 Resumen de resultados de cultivos anaerbicos de B subtilis WB700CH2.

a b
Medio Azcar XMAX YX/S qS Azcar
-1
Luria Glucosa 0.923 0.31 NA 1.16 2.33

Celobiosa 0.611 0.13 NA 0.61 2.91
Xilosa 0.159 0.09 NA 0.08 0.294
Mineral Glucosa 0.320 0.04 0.05 0.77 6.142

Celobiosa 0.223 0.05 0.06 0.72 3.455
Xilosa --- 0.00 --- --- ---
a
b
NA: No aplica.
46
_________________________________________________________________________________________________________
1 12
A)
Biomasa (g/l) 10
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
8
0.1 0
1 12
B)
10
Biomasa (g/l)
Celobiosa (g/l)
Lactato (g/l)
8
0.1 0
1 12
C)
10
Biomasa (g/l)
8
Xilosa (g/l)
0.1 0
0 12 24 36 48
Tiempo (h)
Figura 9.6 Crecimiento anaerbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral.

47
_________________________________________________________________________________________________________
Sin embargo, el escaso crecimiento puede atribuirse a la produccin limitada de ATP

con xilosa, debido a que durante la fermentacin con xilosa, los requerimientos
energticos para su transporte y fosforilacin son mayores en comparacin con
glucosa. La glucosa es transportada y posteriormente fosforilada por el sistema de la
fosfotransferasa (PTS), utilizando para ello, un enlace fosfato proveniente
delfosfoenolpiruvato- de alto contenido energtico (Postma et al., 1996). En el caso de
xilosa es transportada por un simporte de protones o un sistema dependiente de ATP y
posteriormente es fosforilada por un quinasa intracelular dependiente de ATP
(Fraenkel, 1996; Lin, 1996; Underwood et al., 2002). De esta manera, para la
produccin de una molcula glucosa-6-fosfato se requiere de un solo enlace fosfato de
alto contenido energtico, mientras que para xilosa-fosfato, el requerimiento es de 2
enlaces fosfato de alto contenido energtico, por lo cual el rendimiento neto de la
conversin de glucosa a piruvato es de 2 ATP, mientras que para xilosa es ~0.67 ATP
(Figura 8.7; Tao et al., 2001; Underwood et al., 2002). Lo anterior se ve reflejado
directamente en el crecimiento celular observado (figura 9.6).
En base a una reduccin del 80% en las velocidades de crecimiento, con respecto al
medio rico (Figura 9.7; Tabla 9.6), el desbalance energtico no solo se presenta en
medio mineral con xilosa, sino tambin cuando se utiliza glucosa y celobiosa. Datos en
la literatura muestran que B. subtilis presenta un deficiente crecimiento por
fermentacin de glucosa, requiriendo del aporte de intermediarios metablicos
(piruvato), o nutrientes adicionales como vitaminas y/o aminocidos, mismos que estn
presentes en medio rico (Nakano et al., 1997; Cruz Ramos et, al 2000; Espinosa de los
Monteros et al., 2001).
48
_________________________________________________________________________________________________________
- 6 ATP
6 Xilosa Ribosa-5P
- 6 ATP
Xilosa Xilulosa Xilulosa-5P Ribulosa-5P
Glucosa ATP ADP Sedoheptulosa-7P

GAP
PTS
Glucosa6P
Eritrosa-4P Xilulosa-5P
Fructosa-6P
PEP Piruvato ATP
- 4 ATP
- 1 ATP
- 1 ATP ADP
Fructosa-1,6
bisfosfato
Dihidroxiacetona-P Gliceraldehdo-3P (GAP)

NAD +
+2 NADH +10 NADH
NADH+H +
1,3-Difosfoglicerato
ADP
+2 ATP +10 ATP
ATP
3-fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato (PEP)
Acetato
ADP
+2 ATP +10 ATP
ATP ATP
+2 ATP
ADP
Acetil P Acetil CoA Piruvato Lactato
CoA NADH+H + NAD +
NADH+H + NAD +
+2 NADH -2 NA DH
Balance de ATP
De Xilosa a Piruvato De Glucosa a Piruvato
Por cada 6 molculas de xilosa Por molcula de glucosa
-6 ATP por transporte
-2 ATP por activacin
-10 ATP por activacin
+4 ATP producidos
+20 ATP producidos
2 ATP por molcula de glucosa
4 ATP por 6 molculas de xilosa
Rendimiento neto: 0.67 ATP por xilosa Rendimiento neto: 2 ATP por glucosa
Balance de NADH
De Xilosa a Lctico De Glucosa a Lctico
+10 NADH en gliclisis +2 NADH en gliclisis

- 10 NADH en produccin de lctico - 2 NADH en produccin de lctico
Balance REDOXa Balance REDOX
Figura 9.7 Balance de ATP y NADH en el metabolismo de azcares en Escherichia coli.

Modificado de: Fraenkel (1996) y Tao et al. (2001)
49
_________________________________________________________________________________________________________
a) Si la xilosa se canaliza hacia la formacin de lctico, entonces se establece un balance

REDOX, en el caso de B. subtilis en donde no existe la formacin de lctico, no se establece
dicho balace y consecuentemente el crecimiento es nulo.
- Simbologa:
Consumo o produccin de ATP
Consumo o produccin de NADH
Los smbolos abiertos corresponden al metabolismo de glucosa y los rellenos al metabolismo

de xilosa.
Para estas condiciones, el nico producto de fermentacin detectado en cantidades

significativas fue cido lctico. Este producto fue obtenido en diferentes
concentraciones para los tres azcares evaluados, tanto en medio rico como en medio
mineral, con la excepcin de los cultivos con xilosa en medio mineral. La produccin del
mismo se da durante la fase de crecimiento y la fase estacionaria, es decir que la
produccin de lactato es constitutiva y esta parcialmente asociada a crecimiento bajo
las condiciones evaluadas
Bajo condiciones de fermentacin, la energa se genera solo por fosforilacin a nivel de

sustrato, mientras que el mantenimiento del balance redox es fundamental para
garantizar la continuidad del ciclo glicoltico. En este caso el balance redox se lleva
acabo por la conversin de piruvato en cido lctico (Figura 9.7), reaccin que
regenera el NAD oxidado en las clulas. En trabajos anteriores se haba reportado, la
formacin de lctico como uno de los principales productos de fermentacin (Nakano et
al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Cruz Ramos et al., 2000; Espinosa de los Monteros et
al., 2001). Sin embargo, tambin se reportaba la presencia de otros subproductos del
metabolismo como acetoina y 2,3-butanodiol, mismos que no fueron detectados en el
presente trabajo
Como se observa en la figura 3.1, Nakano et al. (1997) han propuesto que la
generacin de AcetilCoA con B. subtilis en condiciones anaerbicas conlleva la
generacin de NADH + H+; es decir una molcula de NADH + H+ por cada molcula de
AcetilCoA sintetizada, o desde el punto de vista de un balance 2 molculas de NADH +
H+ por cada molcula de glucosa canalizada a la formacin de AcetilCoA. El AcetilCoA
50
_________________________________________________________________________________________________________
es un metabolito clave en la sntesis de precursores necesarios para el crecimiento

celular y por consiguiente debe ser sintetizado siempre para que las clulas puedan
sobrevivir. Sin embargo si el cofactor (NAD) no es oxidado, la sntesis de AcetilCoA no
puede llevarse a cabo y por tanto B. subtilis no crecera. Los resultados obtenidos
muestran que B. subtilis produce lctico en condiciones anaerbicas cuando se usa
xilosa como fuente de carbono en medios ricos (Luria). En stas condiciones los
componentes del medio rico proporcionan una cantidad limitada de los precursores
necesarios para que la bacteria crezca y el NADH+H+ generado por el metabolismo de
la xilosa en la gliclisis es regenerado a NAD oxidado al producir lctico. En el caso del
medio mineral ni se produce lctico ni las clulas crecen, sugiriendo que el exceso de
NADH + H+ potencialmente generado por la sntesis de AcetilCoA ocasiona un
desbalance redox y evita el crecimiento celular y por consiguiente la generacin de
cualquier producto de fermentacin. Una forma de evaluar dicha hiptesis sera crecer
a B. subtilis en condiciones anaerbicas en medio mineral-xilosa y suplementar los
medios con AcetilCoA y piruvato, de tal manera que si se obtiene crecimiento cuando
se adiciona AcetilCoA y no hay crecimiento cuando se agrega piruvato la hiptesis
sera probada. Durante el transcurso de este proyecto no se evalu dicha posibilidad y
se plantea como trabajos a realizar en el futuro.
Por otro lado, en condiciones anaerbicas se form poca biomasa, lo que se puede
explicar si consideramos que la mayor parte de los azcares se canalizaron a la
formacin de L-lactato. En los cultivos en medio mineral los rendimientos finales de
conversin de glucosa y celobiosa a lactato fueron mayores al 80% del terico (tabla
9.7).
Cabe resaltar que en medio rico (Luria) los rendimientos de conversin de azcar a
lctico fueron mayores al terico, esto se debe a que B. subtilis puede utilizar a los
componentes del medio rico como precursores o intermediarios metablicos y de esta
manera canalizar parte de ellos hacia la formacin de lctico.
51
_________________________________________________________________________________________________________

WB700CH2 con 10 g/l de azcar.
a b c d e
Medio Azcar YP/S qP qP QP L-lctico
(gP/gS) (gP/gDWC.h) (gP/gDWC.h) (gp/l h) final (g/l)
Luria Glucosa 0.89 1.25 0.11 0.49 8.42
Celobiosa 1.02 0.88 0.37 0.35 10.44
Xilosa 1.42 0.26 0.061 0.096 4.59
Mineral Glucosa 0.96 0.67 0.51 0.24 8.48

Celobiosa 0.82 0.54 0.38 0.17 8.05
a
Rendimiento final de conversin de azcar a lctico.
b
qP: Velocidad especfica de produccin de L-lctico durante la fase de crecimiento
exponencial.
c
qP: Velocidad especifica de produccin de L-lctico durante la fase estacionaria.
d
QP: Productividad volumtrica de lctico (g lactato/ l.h).
e
L-lctico al final en la fase estacionaria.
Esto fenmeno se puede observar claramente en cultivos en donde se utiliz xilosa

como fuente de carbono, ya que como se ha discutido anteriormente, en condiciones
anaerbicas y en medio LB, B. subtilis crece utilizando los componentes del medio y no
solo la xilosa, por ello los valores del rendimiento son altos adems de que la
productividad volumtrica es muy baja (tres veces menor en comparacin con LB-
glucosa; Tabla 9.7).
La productividad volumtrica de lctico, cuando se utiliza glucosa es mayor en medio

LB en comparacin con medio mineralglucosa y con la obtenida en medio LB y
mineral con celobiosa.
Cabe resaltar que el gen de B. subtilis (lctE), codifica exclusivamente para una L-lactato
deshidrogenasa (Nakano y Zuber, 1998). De tal manera que el lactato producido fue
pticamente puro y de la forma L. Este hecho se comprob cuantificando el lactato
producido mediante la tcnica de HPLC descrita en la seccin de materiales y mtodos
y verificada con un ensayo enzimtico que permite detectar exclusivamente L-lactato.
Las dos metodologas arrojaron las mismas concentraciones de lactato.
52
_________________________________________________________________________________________________________
Adicionalmente, se evalu que el D-lactato producido por E.coli, y por la mayora de los
microorganismos, no era detectado por el analizador enzimtico pero si por la tcnica
de HPLC empleada.
9.6.1 Evaluacin del crecimiento en medio mineral suplementado.

Debido al poco crecimiento observado en medio mineral, se decidi suplementar este
medio con componentes ricos en vitaminas y aminocidos, pero que adems fuesen
econmicos, por ello se recurri al uso de slidos de licor de maz (SLM) y extracto de
levadura industrial (ELI).
Las evaluaciones con medio mineral suplementado se llevaron a cabo utilizando

glucosa como fuente de carbono. Se realiz un barrido de concentraciones con ambos
suplementos para determinar el valor adecuado que contrarrestara dicho desbalance,
para ello se utilizaron concentraciones de 8 a 12 g/l para extracto de levadura industrial
y de 5 a 30 g/l para slidos de licor de maz.
Cuando se utiliz extracto de levadura industrial, a concentraciones de 8, 10 y 12 g/l,

las velocidades de crecimiento observadas fueron similares entre s (~0.23 h-1) y en los
tres casos se alcanz la fase estacionaria aproximadamente a las 8 h de cultivo (figura
9.8).
El efecto de la concentracin de ELI en el medio de cultivo, se observa claramente en

la biomasa mxima producida, as como en la cantidad de azcar consumida, ya que
los valores de estos fueron ligeramente mayores a mayor concentracin de ELI
utilizada (tabla 9.8). No obstante, al parecer 8 g/l de ELI son suficientes para
suplementar el medio mineral y alcanzar un crecimiento similar al obtenido con medio
rico-glucosa en condiciones anaerbicas (8.9 gDWC/l; tabla 9.6)
En comparacin con cultivos en medio rico con glucosa, las velocidades de crecimiento
fueron 25% menores, mientras que las velocidades de consumo de glucosa fueron
53
_________________________________________________________________________________________________________
ligeramente mayores (17%), a pesar de ello, la cantidad de glucosa consumida durante

la fase de crecimiento fue 3 veces mayor utilizando 12 g/l de ELI (tabla 9.6)
Con las tres concentraciones probadas de ELI, se logr incrementar las velocidades de
crecimiento (6 veces), as como la biomasa mxima producida, con respecto a los
cultivos en medio mineral con glucosa (tabla 9.6 y 9.8).
Cuando el medio fue suplementado con slidos de licor de maz, las velocidades de
crecimiento fueron similares entre si, pero mayores en un 85 % con respecto a las
observadas en medio mineral y ligeramente mayores al medio mineral glucosa
suplementado con ELI (tabla 9.6y 9.8).
Al igual que cuando se utiliz el ELI, el efecto de la concentracin de los SLM est
directamente relacionada con la generacin de biomasa durante la fase de crecimiento
siendo mayor en cultivos con 20 y 30 g/l de SLM. Con respecto al medio mineral con
glucosa, el consumo de azcar durante la etapa de crecimiento fue menor en las
concentraciones evaluadas por debajo de 30 g/l de SLM y similar con 30 g/l de SLM
(tabla 9.8, figura 9.9).
En cuanto a la formacin de lctico, los rendimientos obtenidos fueron mayores al 80%

para todas las concentraciones evaluadas con ELI y para 20 y 30 g/l de SLM (tabla
9.9).
Sin embargo, el uso de SLM, para la produccin de lctico, tiene como desventaja
principal el contenido de mezclas racmicas de lactato, lo cual contamina el producto
final disminuyendo la pureza del mismo (Atkinson y Mavituna, 1991; Akhtar et al.,
1997).
.
54
_________________________________________________________________________________________________________
A) 10
Biomasa (g/l)
1
8
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
6
0.1 0
B) 10
Biomasa (g/l)
1
8
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
6
0.1 0
C) 10
Biomasa (g/l)
1
8
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
0.1 0
0 6 12 18
Tiempo (h)

suplementado con extracto de levadura industrial.
A) 8 g/l; B) 10 g/l y C) 12g/l.
55
_________________________________________________________________________________________________________
10 10
A)
8
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
6
1
4
0.1 0
10 10
B)
8
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
6
1
4
0.1 0
0 6 12 18
Tiempo (h)

suplementado con slidos de licor de maz.
A) 25 g/l y B) 30 g/l.
56
_________________________________________________________________________________________________________
Esta misma estrategia ha sido reportada en trabajos anteriores para enriquecer los
medios minerales con nutrientes de bajos costos. Por ejemplo, Underwood et al. (2002)
y Martinez et al. (1999) emplearon SLM al 1% para cultivos en medio mineral con xilosa
con cepas etanologenicas de E. coli, logrando incrementar la productividad de etanol y
el crecimiento celular hasta valores similares a los obtenidos en medio Luria
Tabla 9.8 Resumen de cultivos anaerbicos en medio mineral-glc 10 g/l suplementado.

a b
Suplemento XMAX YX/S qS Azcar
-1
ELI
8 g/l 0.89 0.23 0.17 1.36 5.30
10 g/l 0.95 0.23 0.17 1.31 5.48
12 g/l 1.25 0.21 0.17 1.19 7.18
SLM
5 g/l 0.30 0.24 0.21 1.17 1.45
10 g/l 0.40 0.31 0.26 1.21 1.55
15 g/l 0.68 0.27 0.18 1.49 3.73
25 g/l 1.25 0.25 0.27 0.96 4.70
30 g/l 1.18 0.28 0.20 1.38 5.77
a
b
Las concentraciones adecuadas para lograr velocidades de crecimiento y rendimientos

de formacin de productos similares a las observadas en medio rico fueron de 8 a 12
g/l de ELI y de 25 a 30 g/l para SLM, con las cuales se reduce a la mitad los tiempos de
cultivo. De esta manera se puede decir que la adicin de nutrientes de bajo costo al
medio provee a las clulas de los requerimientos necesarios para su crecimiento y para
llevar acabo sus actividades metablicas, dndole el mismo aporte que los medios
complejos como el medio Luria.
57
_________________________________________________________________________________________________________

WB700CH2 en medio mineral-glucosa 10 g/l suplementado.
a b c d e
Suplemento YP/S qP qP QP L-lctico
(gP/gS) (gP/gDWC.h) (gP/gDWC.h) (gP / l h) final (g/l)
ELI
8 g/l 0.76 1.06 0.38 0.52 8.31
10 g/l 0.71 0.94 0.32 0.47 7.48
12 g/l 0.71 0.97 0.19 0.47 7.51
SLM
25 g/l 0.88 0.82 0.27 0.52 8.37
30 g/l 0.85 1.22 0.26 0.51 8.16
a
Rendimiento final de conversin de glucosa a lctico.
b
qP: Velocidad especfica de produccin de L-lctico durante la fase de crecimiento
exponencial.
c
qP: Velocidad especfica de produccin de L-lctico durante la fase estacionaria.
d
QP: Productividad volumtrica de Lctico.
e
L-lctico al final de la fase estacionaria.
9.6.2 Produccin de L-lactato en cultivos anaerobios con 50 g/l de

glucosa.
Actualmente la produccin global de cido lctico es de aproximadamente 13,000
toneladas mtricas/ao y es destinado principalmente a la industria alimentaria,
farmacutica y de cosmticos. Su demanda se est incrementando debido a la
introduccin de dos nuevos productos derivados del lactato: el polilactato y el etil-
lactato (Dien et al., 2002; Skory, 2003). El polilactato (PLA) es un plstico de alta
calidad, que tiene grandes ventajas sobre los plsticos ya existentes en el mercado,
principalmente debido a su carcter biodegradable, adems de que puede ser
producido a partir de fuentes renovables. Las propiedades del PLA dependen de las
mezclas racmicas del cido lctico, es por ello, que para la produccin de PLA, se
requiere de cido lctico pticamente puro, preferentemente L-lctico en mayor
proporcin (Dien et al., 2001; Bai et al., 2003).
58
_________________________________________________________________________________________________________
Con el incremento en la demanda del cido lctico, aumenta tambin el inters por
encontrar mtodos mas eficientes para la produccin de ste (Dien et al., 2002; Skory,
2003). Actualmente, el cido lctico es producido por sntesis qumica y por
fermentacin. Los procesos de fermentacin tienen ventajas potenciales sobre la
sntesis qumica, ya que a partir de estos se pueden obtener solo los ismeros
deseables. El uso de materiales lignocelulsicos es una alternativa para reducir los
costos de produccin de cido lctico. Sin embargo, la conversin de estos materiales
presenta serios problemas, debido a que estn compuesto por mezclas de azcares,
principalmente de glucosa-xilosa y glucosa-celobiosa. La xilosa es una pentosa, que no
es fermentable por la mayora de las bacterias lcticas utilizadas industrialmente para
la produccin de cido lctico (Dien et al., 2001). Otra desventaja, es que la mayora de
los microorganismos empleados para este fin, requieren de medios de cultivos
complejos, incrementando los costos de produccin por nutrientes, purificacin del
producto, etc. Adems la mayora, sintetiza D-lctico o una mezcla de D y L-lctico,
siendo pocos los que producen nicamente L-lctico.
De esta manera se han iniciado el desarrollo de nuevas cepas, mediante ingeniera de

vas metablicas, con la propiedad de crecer en medios minerales, producir cido
lctico, fermentar los azcares presentes en los materiales lignocelulsicos, adems,
de que sinteticen solo una forma isomrica del cido lctico, el L-lactato, disminuyendo
de esta forma los costos de produccin y purificacin del producto. A la fecha, las
bacterias lcticas, hongos, levadura y bacterias modificadas genticamente han sido
investigadas como potenciales biocatalizadores para la produccin de cido lctico. En
la mayora de los trabajos, indican el uso de medios complejos (ricos) para alcanzar
rendimientos cercanos al terico de conversin de glucosa a lctico, siendo muy pocos
los trabajos hechos utilizando medios minerales con altos rendimientos de conversin
(Revisiones: Chang et al., 1999; Dien et al., 2001; Yun y Ryu, 2001; Dien et al., 2002;
Bai et al., 2003; Skory, 2003; Zhou et al., 2003a; Zhou et al., 2003b).
Basndose en los resultados obtenidos de las evaluaciones hechas en medio mineral

(seccin 9.3 y 9.3.1), cuyo nico producto de fermentacin obtenido fue el cido lctico,
59
_________________________________________________________________________________________________________
y conociendo que B. subtilis posee una L-lactato deshidrogenasa funcional en

condiciones de fermentacin (Nakano y Zuber, 1998), se plante la posibilidad de
incrementar la productividad de L-lctico, suplementando el medio mineral con SLM y
utilizando 50 g/l de glucosa.
10 60
50
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
40
1 30
20
10
0.1 0
10 60
50
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
40 Lactato (g/l)
1 30
20
10
0.1 0
0 24 48 72 96 120
Tiempo (h)
Figura 9.10 Produccin de L-lactato en cultivos de B. subtilis con 50 g/l de glucosa

A) Medio mineral y B) Medio mineral con 30 g/l de SLM
60
_________________________________________________________________________________________________________
De acuerdo a las cinticas presentadas en la figura 9.10, la glucosa (50 g/l) se

consumi aproximadamente en 107 h en el medio suplementado con slidos de licor de
maz, mientras que en medio mineral (sin suplementos) el consumo de glucosa fue solo
de 20 g/l en el mismo tiempo. Despus de ese tiempo las clulas comenzaron a lisarse.
A pesar de ello, las velocidades especificas de produccin de L-lctico fueron mayores
en medio mineral (tabla 9.8). Sin embargo la productividad volumtrica en el medio
suplementado fue 2.4 veces mayor que en el medio mineral (sin suplementos).
La produccin final de cido L-lctico fue de 17 g/l para medio mineral y 43 g/l para
medio mineral suplementado, siendo los rendimientos finales de conversin de glucosa
a L-lctico similares entre s, con valores superiores al 70 % del terico (1 g de lactato
/g de glucosa; Tabla 9.10).
Tabla 9.10. Produccin de L-lactato con B. subtilis con alta concentracin de glucosa.
a b c d e
Medio de cultivo glucosa inicial qP XMAX YP/S qP QP
(g/l) (h-1)
Mineral 53 0.031 0.57 0.44 0.72 0.38 0.16
Mineral-SLM 30 g/l 57 0.087 0.49 3.32 0.75 0.15 0.38
a
qP= Velocidad especifica de produccin de lctico durante la fase de crecimiento exponencial
(gLactato/gDWC.h)
b
XMAX = Biomasa promedio durante la fase estacionaria (gDWC/l)
c
YP/S =Rendimiento final producto /sustrato (g L-lctico /g azcar)
d
qP = Velocidad especifica de produccin de lctico durante la fase de crecimiento estacionaria
(gLactato/gDWC.h)
e
QP: Productividad volumtrica de Lctico (glactato/l.h).
9.6.2.1 Comparacin de la produccin de L-lactato en B subtilis

WB700CH2 con reportes de la literatura de otros microorganismos.
En la tabla 9.11 se presenta un resumen que describe los microorganismos que han
sido reportados recientemente para la produccin de lctico. Como puede observarse,
en la mayora de los trabajos se ha trabajado principalmente con Escherichia coli. Este
microorganismo ha sido modificado mediante ingeniera de vas metablicas,
61
_________________________________________________________________________________________________________
eliminando genes especficos e incorporando otros que codifican para enzimas

especficas de microorganismo que naturalmente producen una sola forma de cido
lctico.
Tabla 9.11 Microorganismos reportados recientemente para la produccin de cido

lctico.
d a b C
Microorganismo Medio de Fuente de carbono, Tiempo de YP/S QP Tipo de
y referencias cultivo concentracin (g/l) cultivo (h) lctico
A Complejo Glc, 50 90 0.46 NR NR
B Mineral Glc, 65 67 0.70 NR L
C Mineral Glc, 56 60 0.90 1.09 D
D Complejo Lac, 40 26 0.92 3.21 L
E Complejo Glc, 150 35 0.90 3.56 NR
Complejo Fru, 150 35 0.96 4.12 NR
Complejo Mal, 150 35 0.92 3.54 NR
F Complejo Glc, 100 30 0.93 2.33 L
Xyl, 100 100 0.78 0.73 L
G Complejo Glc, 50 500 0.85 NR NR
H Complejo Glc, 50-Xyl, 50 150 0.77 NR L
I Mineral Glc, 83 18-20 0.76 NR L
J Complejo Glc, 92 30.5 0.45 NR NR
K Mineral Glc, 50 120 0.95 0.65 L
Mineral Xyl, 50 312 0.93 0.32 L
NR: No reportado
a
YP/S: Rendimiento final de conversin de la fuente de carbono a lctico.
b
QP : Productividad volumtrica mxima (glactato/l*h)
c
Tipo de estereoismero del cido lctico: L o D.
d
Descripcin del microorganismo:
A) Kluyveromyces lactis: Interrupcin de la piruvato descarboxilasa y expresin
heterloga del gen de la enzima lactato deshidrogenasa de mamfero (bovino; Porro
et al., 1999).
62
_________________________________________________________________________________________________________
B) Escherichia coli JP204: Cepa con interrupcin de los genes que codifican para las
enzimas fosfotransacetilasa y D-lactato deshidrogenasa y la expresin heterloga de
L-LDH de Lactobacillus caseii. Estrategias de cultivo: crecieron E. coli JP204 en
condiciones aerbicas hasta alcanzar una concentracin de biomasa igual a 7.2 g/l,
para despus cambia a anaerobiosis y realizaron cultivos lote alimentado (Chang et
al., 1999).
C) Escherichia coli JP203: Cepa con delecin de los genes que codifican para las
enzimas fosfotransacetilasa y fosfoenolpiruvato carboxilasa. Estrategias de cultivo
similares a las reportadas para el crecimiento de JP204 (descripcin anterior; Chang
et al., 1999).
D) Lactobacillus helveticus GRL89: Bacteria GRAS, homofermentativa, termo y cido
lctico tolerante. La construccin de la cepa se llev a cabo por inactivacin del gen
ldhD mediante reemplazo por el gen ldhL. (Kyl-Nikkil et al., 2000).
E) Enterococcus faecalis RKY1: Cepa silvestre. Produce L-lctico a partir de diferentes
fuentes de carbono: glucosa, fructosa y maltosa; as como en mezclas de stos
azcares, pero no en xilosa, galactosa y sacarosa (Yun y Ryu, 2001).
F) Escherichia coli: Expresin heterloga del gen ldh de Streptococcus bovis.
Fermenta glucosa y xilosa (Dien et al., 2001).
G) Kluyveromyces lactis: Interrupcin de la piruvato descarboxilasa y piruvato
deshidrogenasa y la expresin heterloga del gen de la enzima lactato
deshidrogenasa de mamfero (bovino; Bianchi et al., 2001).
H) Escherichia coli: Expresin heterloga del gen ldh de Streptococcus bovis e
interrupcin de la piruvato formato liasa y D-lactato deshidrogenasa. Fermenta
mezclas glucosa - xilosa (Dien et al., 2002).
I) Rhizopus oryzae R1021: Los cultivos requieren de una alta transferencia de
oxgeno y son morfolgicamente complejos. En este trabajo estudiaron la forma ideal
de micelio para obtener una alta productividad de cido lctico (Bai et al., 2003).
J) Saccharomyces cerevisiae InvScl (pLdhA68X; diploide): Expresin heterloga del
gen para la L-lactato deshidrogenasa de Rhizopus oryzae. Presenta bajos
rendimientos, adems de presentar produccin de etanol. Primer reporte sobre la
expresin de un gen de un hongo en una levadura (Skory, 2003).
63
_________________________________________________________________________________________________________
K) Escherichia coli SZ85: Presenta 5 interrupciones cromosomales de lo genes que

codifican para las enzimas: piruvato formato liasa (pflB), acetato quinasa (ackA),
alcohol deshidrogenasa (adhE), lactato deshidrogenasa (ldhA) y fumarato reductasa
(frdBC) y la integracin cromosomal del gen de la L-lactato deshidrogenasa (ldhL) de
Pediocooccus acidilactici (Zhou et al., 2003b)
En comparacin con los resultados obtenidos en el presente trabajo, los rendimientos

finales de conversin de glucosa son similares a las reportadas para cepas de
Rhizopus oryzae y ligeramente menores a los obtenidos con cepas recombinantes de
E. coli. Lo que indica que B. subtilis potencialmente tiene la capacidad para ser
aplicado en la produccin industrial de L-lactato, pero que adems se requiere llevar a
cabo estudios adicionales para maximizar la concentracin y velocidad de produccin
de L-lactato con este microorganismo.
Una de las opciones para disminuir los tiempos de fermentacin e incrementar la

produccin de L-lactato, sera implementar estrategias de cultivo como las propuestas
por Chang et al., (1999). Estas estrategias consisten en crecer a B. susbtilis bajo
condiciones aerbicas hasta alcanzar una biomasa elevada, entonces, cambiar las
condiciones del cultivo a anaerobiosis. De esta forma se lograra una productividad
especfica similar a los cultivos en condiciones nicas de anaerobiosis, pero con una
productividad volumtrica mayor, debido a la alta concentracin celular.
9.7 Evaluacin del crecimiento de B. subtilis en mezclas de azcares

Como se cita en la introduccin de este proyecto, a futuro se pretende utilizar a B.
subtilis para metabolizar fuentes de carbono renovables y de bajos costos como los
hidrolizados de residuos agroindustriales, los cuales estn compuestos por mezclas de
azcares (glucosa-xilosa, glucosa-celobiosa y pequeas cantidades de arabinosa,
galactosa y manosa). Con el propsito de evaluar el comportamiento de este
microorganismo se llevaron acabo cultivos en condiciones aerbicas y anaerbicas con
64
_________________________________________________________________________________________________________
medio mineral (sin adicin de suplemento en el caso de condiciones anaerbicas) con

mezclas binarias de azcares.
La concentracin inicial total de azcares fue de 10 g/l y las mezclas evaluadas fueron
glucosa-xilosa y glucosa-celobiosa en relacin 1:1. En la figura 9.11, 9.12 y 9.13 se
presentan las cinticas de crecimiento, consumo de azcar y formacin de productos
observados en estas evaluaciones.
Cuando se utilizan dos o ms fuentes de carbono, estas son consumidas

subsecuentemente, presentando varias fases de crecimiento exponencial, las cuales
estn separadas por fases de adaptacin, lo cual comnmente es denominado
crecimiento diuxico. El consumo de cada una de las fuentes de carbono est
generalmente sujeto a represin catablica por glucosa. Es decir que la glucosa es
metabolizada primeramente y el (los) otro (s) azcar (res) es (son) metabolizado (s)
una vez que la glucosa se agota. Debido a esto, las mezclas de azcares no pueden
ser metabolizadas de manera rpida y eficiente (Hernndez-Montalvo et al., 2001). La
represin catablica es un mecanismo de regulacin por el cual la clula coordina el
metabolismo de las fuentes de carbono y energa para maximizar su eficiencia y regular
otros procesos metablicos. En B. subtilis, como en la mayora de las bacterias, la
represin catablica por glucosa es un sistema global que regula fuertemente la
expresin de genes y operones involucrados en el metabolismo de otros carbohidratos
(Chambliss, 1993).
En las evaluaciones llevadas acabo tanto en cultivos aerbicos como anaerbicos, se

observa que la utilizacin de otras fuentes de carbono est fuertemente regulada por la
presencia de glucosa en el medio de cultivo. Adems, no se presenta el crecimiento
tipo diuxico esperado, si no que al agotarse la glucosa, B. subtilis experimenta una
fase de muerte acelerada (lisis celular), alcanzando, en algunos casos, densidades
celulares menores a las originalmente inoculadas (figura 9.11, 9.12 y 9.13). Al parecer
este comportamiento puede atribuirse parcialmente a la eliminacin de los genes que
codifican para las 7 proteasas mayoritarias en la cepa utilizada (tabla 7.1). Varios
grupos de investigacin han demostrado que la sntesis de proteasas extracelulares en
65
_________________________________________________________________________________________________________
B. subtilis est directamente involucrada en el control de la autolisis mediante

modulacin de la actividad de las enzimas autolticas (Jolliffe et al., 1980, Stephenson
et al., 1999). Las mutantes deficientes en proteasas extracelulares evaluadas en dichos
trabajos, mostraron un incremento en la velocidad de cambio de peptidoglicanos e
incrementaron la susceptibilidad a la lisis celular debido a una actividad autoltica no
controlada (Stephenson et al., 1999).
Despus de la fase de muerte acelerada se presenta una fase de adaptacin y

posteriormente una segunda fase de crecimiento exponencial.
En ambas condiciones, no se puede decir que la segunda fase de crecimiento

observado se debe a un proceso de germinacin-esporulacin de B. subtilis durante la
fase de muerte acelerada debido a las siguientes razones:
1. El proceso de esporulacin se lleva en ocho estadios en un periodo aproximado de
8 h (en medio rico) y se inicia durante la fase de crecimiento estacionario (Martnez,
1997), sin embargo para los casos evaluados, no se observa una fase estacionaria.
Adems, el periodo de muerte y adaptacin de las clulas tiene una duracin
aproximada de 2-5 h para condiciones aerbicas (figura 9.11 y 9.12), el cual no es
suficiente para el desarrollo de dicho proceso.
2. En condiciones anaerbicas, en donde el proceso de muerte y adaptacin tiene una

duracin mayor a 24 h (figura 9.13), el proceso de esporulacin no puede darse,
debido a que B. subtilis pierde la capacidad de esporular bajo estas condiciones.
(Hoffmann et al., 1995; Espinosa de los Monteros et al., 2001)
En cultivos aerbicos con mezclas de azcares (figura 9.11 y 9.12), despus de la fase
de muerte acelerada, la fase de adaptacin para la mezcla glucosa-xilosa fue mayor (3
h) que la presentada en la mezcla glucosa-celobiosa (1 h).
66
_________________________________________________________________________________________________________
100
% de Oxigeno disuelto
80
60
40
20
0
10
5
Biomasa (g/l)
Actico (g/l)
Azcar (g/l)
1
3
0.1 2
0.01 0
0 6 12 18 24 30
Tiempo (h)
Figura 9.11 Cultivo aerbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-xilosa.

Los smbolos abiertos corresponden a los datos obtenidos por la utilizacin de xilosa.
Las flechas indican el tiempo en el cual se da el cambio en la concentracin de oxgeno
disuelto.
67
_________________________________________________________________________________________________________
100
% de Oxigeno disuelto
80
60
40
20
0
10
5
Biomasa (g/l)
Actico (g/l)
Azcar (g/l)
1
3
0.1 2
0.01 0
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
Figura 9.12 Cultivo aerbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-celobiosa.

Los smbolos abiertos corresponden a los datos obtenidos por la utilizacin de
celobiosa. Las flechas indican el tiempo en el cual se da el cambio en la concentracin
de oxgeno disuelto.
68
_________________________________________________________________________________________________________
Despus de la fase de muerte acelerada, el medio de cultivo se ve enriquecido por la

presencia de los componentes provenientes de la lisis del material celular. Al parecer
por ello en la mezcla glucosa-xilosa, el microorganismo utiliza a todos estos
componentes para crecer, lo cual es corroborado con el bajo consumo de xilosa
observado (Tabla 9.12; figura 9.11). A pesar de encontrarse en condiciones de cultivo
similares a cultivos con medio rico, las velocidades de crecimiento observadas fueron
similares a las obtenidas en medio mineral con xilosa como nica fuente de carbono
(Tabla 9.3). En el caso de glucosa-celobiosa, en donde la fase de muerte fue menor
que para el caso anterior, la celobiosa es consumida totalmente durante la segunda
fase de crecimiento, adems de que contrario a la mezcla con xilosa, presenta una
velocidad especfica de crecimiento y de consumo de azcar mayor que las observadas
para cultivos en medio mineralcelobiosa bajo las mismas condiciones (tabla 9.3 y
9.12).
En ambos casos, las velocidades de crecimiento observadas durante la primera fase de

crecimiento fueron similares a las obtenidas para medio mineral-glucosa (tabla 9.12).
Se observa la formacin de cido actico debido al metabolismo de glucosa y ste es
consumido totalmente durante la segunda fase de crecimiento exponencial en los
cultivos con glucosa-xilosa en anaerobiosis (figura 9.11 y 9.12).
En todos los cultivos aerbicos la concentracin de oxigeno disuelto fue mayor al 20%
de saturacin. Como generalmente sucede, el cambio en la concentracin del oxgeno,
como respuesta al agotamiento de la fuente de carbono es muy notorio. Observndose
un incremento drstico en el nivel de oxgeno disuelto en el medio precisamente en el
momento en que se agota la fuente de carbono, hasta llegar a valores cercanos del
100% de saturacin (figuras 9.11 y 9.12). Cuando B. subtilis cambia de la fase de lisis
celular a una nueva fase de crecimiento, se observa de nuevo ms consumo de
oxgeno y el nivel de oxgeno disuelto se incrementa de nuevo drsticamente cuando
se agota la segunda fuente de carbono (xilosa o celobiosa).
69
_________________________________________________________________________________________________________
1
A) 8
Biomasa (g/l)
Actico (g/l)
Azcar (g/l)
Lctico (g/l)
0.1 4
0.01 0
1
8
B)
Biomasa (g/l)
Actico (g/l)
Azcar (g/l)
Lctico (g/l)
0.1 4
0.01 0
0 12 24 50 62 74 86 98
Figura 9.13 Cultivo anaerbico de B. subtilis en mezclas de azcares: A) Mezcla

glucosa-xilosa y B) Mezcla glucosa-celobiosa.
Los smbolos abiertos corresponden a los datos obtenidos por la utilizacin de la fuente
de carbono distinta a glucosa (xilosa o celobiosa)
70
_________________________________________________________________________________________________________
En cultivos en condiciones anaerbicas, se observa la formacin de cido lctico

durante la primera fase de crecimiento y cido actico durante la segunda. Para el caso
de glucosa-xilosa, el cido lctico formado durante la primera etapa del crecimiento es
consumido parcialmente por el microorganismo durante la segunda fase de crecimiento
Estos hechos sugieren que el crecimiento observado con xilosa se debe a que utiliza
los componentes del medio provenientes de la lisis celular y en menor proporcin a las
fuentes de carbono: xilosa y cido lctico (figura 9.13).
En resumen, podemos decir que en comparacin con los parmetros obtenidos en

cultivos con una sola fuente de carbono y en medios minerales:
Las velocidades especificas de crecimiento presentadas en estos cultivos en
condiciones aerbicas, fueron similares cuando el crecimiento se debe al consumo de
glucosa en la mezcla glucosa-xilosa y mayor en la mezcla glucosa-celobiosa. Con
xilosa la velocidad de crecimiento fue similar y mayor en un 70% en el caso de
celobiosa.
En condiciones anaerbicas, las velociades especificas de crecimiento fueron en
promedio 75% mayores.
En condiciones aerbicas, los rendimientos biomasa/sustrato fueron menores
durante el consumo de glucosa y similares durante el consumo de celobiosa. En
condiciones anaerbicas los rendimientos fueron similares con glucosa y mayores con
xilosa y celobiosa.
Las velocidades de consumo de azcar (qS) fueron mayores en todos los casos.
Todo lo anterior es resumido en la tabla 9.12.
71
_________________________________________________________________________________________________________
Tabla 9.12 Parmetros cinticos de B subtilis WB700CH2 en cultivos con medio

mineral en mezclas de azcares.
Mezcla Condiciones YX/S qS
-1
(h ) (gDWC/gS) (gS/gDWC.h)
Glc-xil Aerbicas 0.49glc 0.24 xil 0.20glc 0.90 xil 2.52glc 0.26xil
Glc-cel Aerbicas 0.60 glc 0.61 cel 0.29glc 0.49 cel 2.04 glc 1.23 cel
Glc-xil Anaerbicas 0.07glc 0.01 xil 0.07glc 0.11 xil 0.99glc 0.06xil
Glc-cel Anaerbicas 0.06 glc 0.06 cel 0.07glc 0.12 cel 0.84 glc 0.53 cel
Los subndices indican el azcar con el cual se evalu cada parmetro.
9.8 Evaluacin de la tolerancia a etanol y furfural sobre el crecimiento de B.

subtilis en condiciones anaerbicas.
Con el fin de conocer las posibilidades y el potencial de B. subtilis para utilizarse en la
produccin de etanol a partir de hidrolizados lignocelulsicos es necesario evaluar la
tolerancia a etanol y a los compuestos derivados de la hidrlisis cida de dichos
materiales, tales como el furfural, hidroximetilfurfural y cido actico entre otros.
Estudios previos han demostrado que entre los furanos presentes en los hidrolizados
de los materiales lignocelulsicos, el furfural presenta una mayor toxicidad en cepas
etanolognicas de E. coli (Zaldivar et al., 1999), siendo adems el que se encuentra en
mayor proporcin en dichos hidrolizados (Palmqvist et al., 1999), por ello se llev acabo
la evaluacin de la tolerancia de B. subtilis a dicho compuesto, as como tambin su
tolerancia a etanol.
Para ello, los cultivos se llevaron acabo en medio LB con 10 g/l de glucosa en
condiciones anaerbicas, realizndose un barrido de concentraciones de 0 a 3 g/l de
furfural y de 0 a 50 g/l de etanol. Las curvas de dosis respuesta para furfural y etanol se
presentan en las figuras 9.14 y 9.15 respectivamente.
72
_________________________________________________________________________________________________________
De acuerdo a los datos obtenidos, se observ para el caso del furfural que la respuesta
de inhibicin no es lineal, con un comportamiento similar en ambos tiempos y que a la
concentracin de 2.5 g/l de furfural se inhibe en un 100% el crecimiento de B subtilis
WB700CH2.
En el caso de etanol, los patrones de comportamiento fueron distintos para cada tiempo
evaluado, lo cual puede indicar, aparentemente, la presencia de un fenmeno de
adaptacin, ya que los valores de inhibicin aumentan conforme aumenta el tiempo de
cultivo (tabla 9.13). En este caso, la concentracin mnima inhibitoria (MIC) para inhibir
el crecimiento en un 100% fue de 50 g/l (figura 9.15).
100
Crecimiento Relativo (%)
24 h
80
30 h
60
40
20
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Furfural (g/l)
Figura 9.14 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis WB700CH2 con furfural.
73
_________________________________________________________________________________________________________
Crecimiento Relativo (%)

100 12 h
24 h
80 36 h
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50
Etanol (g/l)
Figura 9.15 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis con etanol.
Varios grupos de investigacin han reportado estudios de tolerancias realizados en

cepas de E. coli etanolognicas (KO11 y LYO1) y en diferentes levaduras. Estos
estudios muestran que la MIC de furfural para el caso de las cepas de E. coli KO11 y
LYO1 es de 3.0 g/l y 3.5 g/l respectivamente a 24 h de cultivo (Zaldivar et al., 1999).
Para Bacillus subtilis, no existen reportes de estudios de tolerancia a furfural, por ello,
comparando los datos obtenidos en el presente trabajo, con los trabajos reportados en
otros microorganismos podemos observar que B. subtilis WB700CH2 presenta una MIC
menor en un 20% a la de KO11 y en un 40% a la de LYO1. De igual forma, las IC50
obtenidas son menores que la reportada para LYO1 (IC50 =2.4 g/l; Zaldivar et al., 1999).
Lo anterior sugiere que B. subtilis es menos tolerante que E. coli al furfural.
Para el caso de la tolerancia a etanol en B. subtilis, Konopsek et al. (2000) reportaron

que a concentraciones de etanol cercanas de 40 g/l, los tiempos de duplicacin
aumentaron 4.5 veces en comparacin con cultivos realizados a 40C con cepas de B.
74
_________________________________________________________________________________________________________
subtilis 168 cuando el etanol fue agregado a la mitad de la fase de crecimiento

exponencial.
En comparacin con cepas de E. coli etanolognicas, B. subtilis WB700CH2 presenta

tolerancias similares de etanol (Zaldivar et al., 1999), pero, como era de esperarse,
mucho menores en comparacin a valores tpicos para levaduras (MIC = 100 g/l).
Tiempo de Concentracin inhibitoria (g/l)

Compuesto cultivo (h)
IC50 MIC
Etanol 12 24 50
24 37 50
36 42 50
Furfural 12 1.8 3.0
24 2.0 2.5
30 1.6 2.5
Tabla 9.13 Concentracin de etanol y furfural requerida para inhibir el crecimiento de B
subtilis WB700CH2.
75
CONCLUSIONES
_________________________________________________________________________________________________________
10 CONCLUSIONES
De acuerdo a la hiptesis planteada y con los resultados obtenidos, se puede
concluir que en condiciones aerbicas Bacillus subtilis metaboliza celobiosa con
eficiencia y velocidad similar a la glucosa. Adems B. subtilis WB700CH2 asimila y
metaboliza xilosa como nica fuente de carbono.
En condiciones aerbicas con glucosa, el flujo de carbono se dirige hacia la

formacin de biomasa y cido actico, principalmente, y con celobiosa y xilosa se
producen cantidades mnimas de actico.
B. subtilis metaboliza celobiosa en condiciones aerbicas y anaerbicas con

eficiencias similares a la glucosa.
La glucosa reprime catablicamente la utilizacin de celobiosa y xilosa en B. subtilis

WB700CH2. La velocidad de crecimiento y de consumo de azcar aumenta, por un
mecanismo desconocido, cuando se utilizan medios minerales con mezclas de
glucosa-celobiosa y glucosa-xilosa, tanto en condiciones aerbicas como
anerbicas.
Debido posiblemente a un desbalance energtico, B. subtilis presenta problemas de

crecimiento en condiciones anaerbicas en medios minerales. Esto puede ser
contrarrestado suplementando los medios con intermediarios metablicos, tales
como mezclas de aminocidos.
Con glucosa y celobiosa, en cultivos anaerbicos se observa un metabolismo

fermentativo homolctico, con rendimientos de conversin de glucosa en lctico
cercanos al 80% y con velocidades de formacin de lactato elevadas.
El lactato obtenido en condiciones anaerbicas es pticamente puro y de la forma L.
76
CONCLUSIONES
_________________________________________________________________________________________________________
B. subtilis WB700CH2 no es capaz de crecer en anaerobiosis utilizando xilosa como

nica fuente de carbono, probablemente por problemas de rendimiento energtico
y/o desbalance redox.
A concentraciones de 50 g/l de etanol y 2.5 g/l de furfural se inhibe en un 100% el

crecimiento anaerbico de B. subtilis WB700CH2.
Los resultados obtenidos permiten plantear el uso de B. subtilis WB700CH2 como

una alternativa biotecnolgica para la produccin de L-lctico pticamente puro a
nivel industrial, o para la obtencin de otros productos de fermentacin, a partir de
glucosa y celobiosa, mediante la modificacin de cepas por ingeniera de vas
metablicas.
77
PERSPECTIVAS
_________________________________________________________________________________________________________
11 PERSPECTIVAS
El equipo de fermentacin instalado ha permitido y permitir el desarrollo de
investigacin de parmetros ambientales, fisiolgicos y de estrategias de cultivo en
proyectos bsicos y de desarrollo tecnolgico.
Evaluar si B. subtilis tiene la capacidad de fermentar otros sustratos ms oxidados o

reducidos derivado de la glucosa: sorbitol, gluconato y glucoronato.
Evaluar si B. subtilis tiene la capacidad de fermentar sacarosa y otros azcares

presentes en los hidrolizados de materiales lignocelulosicos como arabinosa y
manosa.
El uso de xilosa en condiciones anaerbicas esta directamente relacionada con el

balance energtico de las clulas, sin embargo existen microorganismos capaces de
utilizar xilosa con buenas eficiencias, por ello, se podran generar cepas de B.
subtilis capaces de utilizar xilosa en dichas condiciones introduciendo los genes
necesarios para hacer ms eficiente el transporte y metabolismo de este azcar.
Basndose en el metabolismo presentado por B. subtilis utilizando celobiosa como

nica fuente de carbono, se podra utilizar en cultivos cuya fuente de carbono fuese
la celulosa, nicamente con la adicin al medio de endo o exo celulasas.
Evaluar la actividad especifica de la L-lactato deshidrogenasa, para nuevas

aplicaciones biotecnolgicas.
Es claro, que con investigaciones respecto a la produccin de cido lctico, tanto a

nivel de estrategias de cultivo, como mediante el uso de herramientas de biologa
molecular, se podran mejorar la concentracin, los rendimientos, as como la
productividad de L-lctico. Probablemente, producirlo a partir de xilosa o materiales
lignocelulsicos e implementar procesos de purificacin o mediante el desarrollo de
procesos de sacarificacin y fermentacin simltanea de celulosa, con adicin o
expresin heterloga de endo o exocelulasas.
78
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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86
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13 ANEXOS
13.1 Determinacin de peso seco de Bacillus subtilis.
El peso seco se determin en base al mtodo reportado por Martnez (1997).
Se llevaron a peso constante (24 h a 65C) membranas de tefln Osmonics INC. con
un corte nominal de 0.45 m. De un cultivo de B. subtilis WB700CH1 en medio mineral
con glucosa 10 g/l a una DO 600nm= 3.54, se realizaron diluciones para obtener 100 ml
de muestra con aproximadamente: 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8 unidades de densidad ptica.
Se filtraron al vaco utilizando las membranas de tefln y se secaron a 65C por 24 h.
Se pesaron y por diferencia de peso y de acuerdo al volumen de la muestra, se calcul
la concentracin celular en g/l.
Se relacion por medio de una regresin lineal las lecturas de densidad ptica con el
peso seco determinado. La relacin obtenida fue:
0.3
Peso seco de clulas
1 DO600nm = 0.35 g/l DWC

r2 = 0.995
0.2
(g/l)
0.1
0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
DO 600 nm
Figura 13.1 Curva de peso seco de clulas para B subtilis a 600 nm
87
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.2 Extraccin de ADN cromosomal.

La extraccin de ADN cromosomal se llev a acabo por el mtodo descrito por Wilson
(2001).
Se utiliz la cepa de B. subtilis BB80 (nprE glyB hisA; protrtrofa a triptfano) como
cepa donadora de ADN cromosomal.
Para llevar acabo la extraccin de ADN se utilizaron las siguientes soluciones:

amortiguador TE (Tris/EDTA), Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%, NaCl 5M,
proteinasa K 20 mg/ml, lisozima 10 mg/ml, solucin de cetiltrimetilamonio
bromido/cloruro de sodio (CTAB/NaCl), cloroformo/alcohol isoamlico 24:1,
Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamlico 25:24:1, isopropanol, etanol al 70%.
Se inocularon 5 ml de medio Luria con B. subtilis BB80 y se incub por 12 h a 37C y

300 rpm. Despus se centrifug durante 10 min a 5000 rpm, el paquete celular
obtenido se resuspendi en 567 l de amortiguador TE y se agregaron 5 l de
Lisozima, 30 l SDS al 10% y 3 l de proteinasa K 20 mg/ml, se mezclaron y se
incubaron durante 1 h a 37C. Transcurrido el tiempo se agregaron 100 l de NaCl 5M
y 80 l de una solucin de CTAB/NaCl, se mezclaron por inversin y se incub durante
10 min a 65C. Despus de este tiempo se agregaron 700 l de cloroformo/alcohol
isoamlico y se centrifug durante 5 min a 5000 rpm. Se removi la fase acuosa y se
transfiri a un tubo ependorf, se agreg un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol
isoamlico, se mezcl mediante vortex y se centrifug durante 5 min a 5000 rpm.
Nuevamente se removi la fase acuosa y se transfiri a un tubo ependorf y se agreg
0.6 volmenes de isopropanol, se agit suavemente por inversin y se centrifug
durante 10 min a 500 rpm. Una vez adicionado el isopropanol y despus de agitar
suavemente se pudo observar el ADN precipitado en forma de hebra. Se realizaron tres
lavados del ADN cromosomal con etanol al 70%. El paquete de ADN obtenido se
resuspendi en Amortiguador TE.
88
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.3 Operacin de un sistema de mini-fermentadores no aireados.

El sistema de mini-fermentadores o Fleakers consta de:
a) Un control de temperatura, el cual esta integrado por un bao de agua, un sensor de
temperatura y un termo-circulador de agua.
b) Un control de pH, el cual esta integrado por 6 electrodos, 6 controladores y 6
vlvulas (solenoides) de adicin.
c) Un sistema de agitacin o parrilla magntica para 6 magnetos (rango de 100-850
rpm)
d) 6 Mini-fermentadores o fleakers con un volumen nominal de 250 ml y de trabajo de
200 ml, cuyo sistema de agitacin consiste en un agitador magntico en forma de
cruz de 1 pulgada.
Este sistema se describe en la figura 13.2.
Los fleakers, previamente calibrados a 200 ml. se esterilizan por calor hmedo a 121C
durante 20 min, sin el medio de cultivo solo con la fuente de carbono disuelto en 100 ml
de agua destilada, preparados como se indica en la figura 12.3. Una vez estriles, se
adicionan 100 ml de medio 2X y se ajusta el volumen de trabajo con agua destilada
estril. Estos se inoculan de acuerdo a lo descrito en la seccin 6.4.3. Una vez
inoculados se colocan dentro del bao de agua, se enciende el sistema de agitacin, se
colocan los electrodos de pH y se encienden los controladores de pH.
Los electrodos de pH se esterilizan por un mtodo qumico y se calibran antes de

esterilizarse. La calibracin se realiza por mtodos estndares de calibracin utilizando
amortiguadores certificados de pH 7.0 y 4.0 respectivamente. Una vez calibrados, los
electrodos se lavan con agua destilada y se dejan sumergidos por al menos 12 horas
en una solucin de KCl 3M-Formaldehdo al 1%. Antes de utilizarse en los mini-
reactores (fleakers), se enjuagan tres veces con agua destilada estril y se colocan en
cada uno de los fleakers.
89
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
El bao de agua deber contener aprox. 20 l de agua destilada y el ajuste de

temperatura se realiza 2 horas antes de iniciar el cultivo.
Vlvulas de
adicin de base
Termocirculador
Controladores
de pH
Bao de agua
Fleakers
Parrilla magntica
Figura 13.2 Sistema de minifermentadores o fleakers.
90
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Toma de muestra
Venteo
Puerto para electrodo
de pH
Puerto para adicin
de base
Agitador
magntico
Figura 13.3 Preparacin de fleaker para esterilizacin.
91
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.4 Determinacin de azcares y cidos orgnicos por HPLC.

13.4.1 Preparacin del equipo
Todo el material utilizado para preparar las soluciones deber estar perfectamente limpio
y enjuagado abundantemente con agua grado bi-destilada.
Para la fase mvil (H2SO4 5 mM) se prepara una solucin patrn 10x, aforando 6.8 ml de
H2SO4 a 250 ml con agua grado bi-destilada recin recolectada y se filtra con membrana
de 0.45 m.
El equipo se deja equilibrando por un periodo de 6-12 h a un flujo de fase mvil de 0.2
ml/min, las temperaturas interna y externa de la columna debern ajustarse a 45 y 50C
respectivamente. Una vez transcurrido ese tiempo, se aumenta gradualmente el flujo de
fase mvil hasta 0.5 m/ml desde en controlador de la bomba (Waters 600 Controler) o con
la ayuda del software Milenium. Una vez alcanzado el flujo de trabajo, se enciende la
lmpara de UV (Water Photodiode array Detector 996) y se procede a trabajar con el
equipo.
El sobrenadante de las muestras a analizar se filtran con membrana de 0.45 nm y se

colocan en los viales especiales para el autoinyector. Las muestras se identifican y se se
inyectan automticamente con ayuda del autoinyector (Waters 717). El sistema es
controlado por el software para cromatografa de Waters denominado Milenium Versin
3.01
13.4.2 Preparacin de estndares

Para la determinacin de productos por HPLC se inyectaron estndares de cidos
orgnicos, alcoholes e intermediaros metablicos.
Los diferentes estndares se prepararon disolviendo la cantidad requerida de los

compuestos en agua desionizada.
92
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Los estndares inyectados fueron: ctrico (tiempo de elucin: 9.2 min), pirvico (11.4
min), succnico (14.65 min), lctico (14.8 min), frmico (17.48 min), actico (17.7 min),
acetoina (19.75 min) y propinico (22.32 min), todos estos determinados mediante el
detector de arreglo de diodos a 210 nm; y por ndice de refraccin: etanol (24.7 min),
butanodiol (22.7 min) y xilitol (12.9 min).
Se generaron curvas de calibracin con soluciones patrn de lactato, acetato, y con los
tres azcares empleados en este estudio: celobiosa (tiempo de retencin: 8.8 min),
glucosa (10.6 min) y xilosa (11.3 min), las cuales fueron analizadas bajo las mismas
condiciones descritas anteriormente para las muestras. La figura 13.4 y 13.5 muestran
las curvas de calibracin que se obtuvieron para la estimacin de cidos orgnicos por el
detector de arreglo de diodos y azcar por ndice de refraccin. Los datos obtenidos de
las concentraciones de cada uno de los compuestos medidos, se calcularon con un
mtodo de Calibracin-Interpolado del mismo software.
1.210 07
Glucosa: r2 =0.99991
Celobiosa: r2 =0.99998
8.010 06 Xilosa: r2 =0.99854
rea
4.010 06
0.010 -00
0 1 2 3 4 5
Concentracin (g/l)
Figura 13.4 Curva de calibracin de azcares por ndice de refraccin.
93
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Datos de la curva de calibracin de azcares:

Azcar Pendiente Ordenada al origen
Glucosa 20198519167.951 23215.1427757.135
Celobiosa 20403214285.688 118522.714214.02
Xilosa 186232835536.67 357706.5107592.6
2.010 07
07
Lctico: r2 =0.9994
1.510
Actico: r2 =0.9990
rea
1.010 07
5.010 06
0.010 -00
0 2 4 6 8 10
Concentracin (g/l)
Figura 13.5 Curva de calibracin de cidos orgnicos por el detector de arreglo de

diodos a 210 nm.
Datos de la curva de calibracin de cidos orgnicos:

cido orgnico Pendiente Ordenada al origen
Lctico 153463121672.20 265057.81110613.2
Actico 114514019923.38 196760.355821.03
94
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.5 Preparacin de Amortiguador y estndares para analizador enzimtico

YSI.
13.5.1 Amortiguador YSI 10x:
EDTA 5.88 g
Benzoato de Sodio 9.3 g
NaH2PO4 15.2 g
Na2HPO4 69.2 g
NaCl 27.4 g
Ajustar el pH a 7.3 con KOH o H3PO4 concentrado y aforar a 900 ml con

agua destilada.
13.5.2 Estndar de D-glucosa (2.5 g/l)

NaH2PO4 4.0 g
Na2HPO4 1.0 g
Glucosa 0.25 g
Aforar a 100 ml con agua destilada.

Intervalo de lectura: 0-25 g/l
13.5.3 Estndar de L-lctico (0.5 g/l)

Pesar 31.74 mg de L-lactato de sodio al 98% pticamente puro y disolver
en 50 ml de agua destilada.
Intervalo de lectura: 0-2.5 g/l
13.6 Clculos.
13.6.1 Estimacin de la velocidad especifica de crecimiento.
La velocidad de crecimiento especfica, fue calculada con la ayuda del software
GraphPad Prism 3.0 graficando el logaritmo de la biomasa (gDWC) vs el tiempo (h). La
velocidad especfica de crecimiento se obtuvo durante la fase de crecimiento
95
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
exponencial mediante clculo por regresin no lineal, utilizando la ecuacin de

crecimiento exponencial (X=X0expt)por el mtodo de mnimos cuadrados,
obtenindose en todos los casos analizados correlaciones mayores a 0.95
13.6.2 Correccin de biomasa por factor de dilucin.

La concentracin de biomasa, azcar consumida y productos obtenidos fueron
corregidos en funcin al volumen de base o cido adicionado a cada tiempo mediante
un factor de dilucin (FD).
Al tiempo (t) en que se toma la muestra, se mide el volumen de cido/base adicionado

( Vb ) al cultivo y se suma al volumen inicial del cultivo ( Vi ), con estos datos se calcula
el factor de correccin ( FD ) de la siguiente forma:
Vi + Vb
FD =
Vi
A partir del valor de FD obtenidos para cada tiempo, los datos fueron corregidos de la
siguiente manera:
Biomasa = Biomasa ( g / l ) a Tx FD a Tx
Concentracin de azcar = Azcar ( g / l ) a Tx FD a Tx
Producto = Pr oducto ( g / l ) a Tx FD a Tx
13.6.3 Clculo de rendimientos y velocidades de consumo de azcares

y formacin de productos.
Los rendimientos YX/S, YP/S y YX/P, durante la fase de crecimiento exponencial fueron
calculados de la siguiente manera:
XMAX = Biomasa producida durante la fase de crecimiento exponencial.

g de Biomasa producida ( XMAX )
YX/S =
g de azcar consumida
g de Pr oducto
YP/S =
g de azcar consumida
96
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
g de Pr oducto
YP/x =
g de Biomasa ( XMAX )
13.6.4 Clculo de la velocidad especifica de consumo de azcar y de

produccin de L-lactato.
La velocidad especifica de consumo de azcar y de produccin de lctico fueron
calculadas para las dos fases de los cultivos: La exponencial y la estacionaria.
Para la fase exponencial se calcul de la siguiente manera:

qS =
Y XS
qP = Y PS
En el caso de la fase estacionaria, se llev acabo de la siguiente manera: se eligi el

intervalo de tiempo a evaluar y se calcul la concentracin de biomasa promedio
( XPROM ) as como el consumo de azcar o la produccin de lactato en dicho intervalo
( T ), con los datos obtenidos, el calcul de qS y qP se llev acabo de la siguiente
manera:
azcar consumida
qS =
T (h) XPROM
lactato producido
qP =
T (h) XPROM
13.6.5 Clculo de la productividad volumtrica de L-lactato.
La productividad volumtrica se calcul de la siguiente manera:
g l de lactato producidos
QP =
T (h) total del cultivo
13.6.6 Clculo de la concentracin mnima inhibitoria de etanol y

furfural.
97
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Para calcular la concentracin mnima inhibitoria (MIC), es necesario conocer el

crecimiento relativo (en por ciento) de B subtilis: para cada concentracin de inhibidor
evaluada:
Primero es necesario evaluar el crecimiento ( Xn ) obtenido en cada tiempo y en cada

una de las concentraciones de inhibidor evaluadas, incluyendo el cultivo control (cultivo
sin inhibidor):
Xn = Biomasa a TX Biomasa inicial
A la concentracin de Biomasa del cultivo control se denominara Yn .

Una vez obtenido Xn para cada concentracin evaluada, entonces se calcula el
crecimiento relativo de la siguiente manera:
Xn
Crecimiento relativo (%) = 100
Yn
Una vez realizados todos los clculos para cada una de las concentraciones del
inhibidor, se grafican los valores del crecimiento relativo obtenidos vs la
concentracin de inhibidor evaluada correspondiente.
98

Claudia I Beth Hernandez

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INSTITUTO TECNOLGICO DE ZACATEPEC

CRECIMIENTO Y FORMACIN DE PRODUCTOS EN

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

ZACATEPEC MOR Septiembre, 2003

Para la realizacin del mismo se cont con el

A mis padres: Javier y Toa por todo el apoyo incondicional que

A Nancy por ser siempre el ejemplo a seguir

A mis chiquitas Dany y Lucy por ser siempre mi motivacin y

Y a una pequea personita que dio un giro importante en mi vida:

A todos gracias por creer en mi

A Q. Georgina Hernndez por todo el apoyo tcnico en el manejo y anlisis de

NDICE DE FIGURAS ................................................................................................... viii

8. INSTALACIN DE EQUIPO DE FERMENTACIN .................................................. 24

13.5.3 Estndar de L-lctico (0.5 g/l) ..................................................................... 95

Tabla 3.1 Caractersticas del genero Bacillus. ................................................................ 6

Para el desarrollo de este proyecto inicialmente se instalaron dos sistemas de

En aerobiosis, las velocidades de crecimiento y de consumo de azcar son menores

respectivamente. En el caso de celobiosa y xilosa, no se detectaron cantidades

En condiciones de fermentacin con xilosa, el crecimiento se reduce

Estos resultados muestran que la mutante de B. subtilis, obtenida en este trabajo,

La fraccin hemicelulsica est compuesta principalmente de pentosas (xilosa) y

Actualmente la biotecnologa moderna cuenta con herramientas que permiten

microorganismos, obteniendo de esta manera cepas para aplicaciones industriales con

Tabla 3.1 Caractersticas del genero Bacillus.

II Producen cidos a partir del metabolismo de una amplia variedad de

III Aerobios estrictos, no producen cidos a partir del metabolismo de

IV Producen esporas esfricas que pueden hinchar a la clula

V Especies termfilas, con temperaturas de crecimiento menores a

VI Especies termfilas y acidfilas con cidos grasos alicclicos en la

No B. benzoevorans, B. fastidiosus y B. naganoensis.

B. subtilis, despus de E. coli y Saccharomyces cerevisiae, es uno de los

ampliamente utilizado en la industria alimenticia por ser considerado (por la FDA),

3.2 Metabolismo de azcares

B. subtilis puede utilizar un intervalo amplio de carbohidratos (alrededor de 18

Tabla 3.2 Azcares catabolizados por B. subtilis.

ajustes en las rutas metablicas y en las velocidades de utilizacin de las fuentes de

La gliclisis juega un papel clave dentro del metabolismo energtico de los

E. coli es un microorganismo anaerobio facultativo, que en condiciones anaerbicas

tiempo como un microorganismo estrictamente aerobio, sin embargo en 1993, Priest

An se desconoce el sistema fermentativo de B. subtilis y varios grupos de

ricos con glucosa se reporta la presencia de lactato como nico producto de

Figura 3.1 Rutas metablicas de fermentacin propuestas para Bacillus subtilis.

3.4 Respiracin de Nitratos

4 PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO

Bacillus subtilis es un microorganismo del cual se conoce su habilidad para metabolizar

Cual es la eficiencia de B. subtilis para consumir y metabolizar celobiosa y xilosa

Si tiene la capacidad de fermentar glucosa, celobiosa y xilosa con medios ricos y,

Cuales son los principales productos que se obtiene en condiciones de

Determinar las velocidades especficas de crecimiento y de consumo de azcares,

Cmo es su crecimiento aerobio y anaerobio en mezclas binarias de glucosa-

6. OBJETIVOS DEL PROYECTO

Caracterizar a nivel fermentador parmetros cinticos de crecimiento y de formacin de

Instalar y realizar pruebas de arranque de control automtico de 6 fermentadores de

Evaluar el crecimiento, la velocidad especfica de crecimiento y de consumo de

Evaluar el potencial de Bacillus subtilis para fermentar glucosa.

Evaluar la tolerancia a etanol y furfural de Bacillus subtilis WB700CH2 en condiciones

Tabla 6.1 Cepas de Bacillus subtilis

Inicialmente se seleccion la cepa de B. subtilis WB700 debido a que tiene eliminados

7.2 Generacin de un banco de clulas.

7.3 Medios de cultivo.

En la evaluacin de crecimiento en mezclas de azcares se utiliz medio mineral con 5

Para la evaluacin de la tolerancia a etanol y furfural, los cultivos se llevaron acabo en

En condiciones anaerbicas, para algunos casos el medio mineral fue suplementado