PRUEBAS DE

IDENTIFICACION DE
LEVADURAS
 INTRODUCCION
1.- Levaduras

La levadura ms utilizada por el hombre es Saccharomyces

cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la
fabricacin de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes
industriales.
Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la
lactosa que se explota en pequea escala para la produccin de
alcohol a partir del suero de la leche.
Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de cido ctrico.
Trichosporum cutaneum desempea un importante papel en
los sistemas de digestin aerbica de aguas residuales debido a
su enorme capacidad de oxidacin de compuestos orgnicos,
includos algunos que son txicos para otras levaduras y
hongos, como los derivados fenlicos.

 METODO CLASICO DE
IDENTIFICACION
La identificacin suele puede realizarse sobre
una cepa pura, previamente aislada en un
medio slido.
Los criterios de identificacin de las levaduras
pueden dividirse en 3 grupos:
Caractersticas de reproduccin vegetativa.
Caractersticas sexuales
Caractersitcas bioqumicas y fisiolgicas.
 Caractersticas de Reproduccin
Vegetativa
La reproduccin vegetativa puede hacerse por
gemacin o escisin binaria o a veces una
combinacin de las dos.
La formacin de la yema comienza con una
evaginacin de la clula, despues la yema
aumenta de tamao antes de separarse de la
clula madre.
 La gemacin puede ser:
Polar

Bipolar
Nadsonia sp

Multilateral
Saccharomyces cerevisiae
Morfologa de las clulas vegetativas
Estas caractersticas se estudian sobre
preparaciones microscpicas efectuadas en
estado fresco a partir de cultivos en medios
lquido y sobre medio slido, tras la
incubacin a 28C durante 3 das o ms.
Crecimiento en medio lquido
Crecimiento en medio slido
Morfologa de las clulas vegetativas
CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO
Los cultivos se efectun en medios con extracto de
malta
Se anota el aspecto de los cultivos:
Formacin de sedimento en el fondo del tubo y
aspecto fino grueso.
Pelcula en la superficie
Formacin de gas.
Crecimiento en medio slido
Morfologa de las clulas vegetativas
CRECIMIENTO EN MEDIO SLIDO
Los cultivos anteriores se les agrega agar 2%.
La siembra se hace en estras
La observacin del cultivo define:
El tamao de las colonias.
Su forma (contornos ntidos o irregulares,
convexas o cncavas).
Su aspecto (mate o brillante)
Su pigmentacin.
Morfologa de las clulas vegetativas
CRECIMIENTO EN MEDIO SLIDO
Las clulas pueden ser esfricas, ovoides,
alargadas, elpticas, apiculadas (en forma de
limn) en forma de botella, triangulares, etc.
A veces la forma es caracterstica de un gnero
Forma de botella Malassezia
Triangular Trigonopsis
La forma y tamao pueden estar sujeto a
variacin (Sacharomyces cervisiae).
 IDENTIFICACION MEDIANTE
CRITERIOS MORFOLOGICOS
Los criterios morfolgicos pueden ser, a su vez, macro o
microscpicos.

1. Criterios macroscpicos
Estos criterios tienen en cuenta el aspecto de las colonias de
levaduras al crecer en los diferentes medios de cultivo.
La mayora de los organismos levaduriformes crecen
fcilmente en un gran nmero de medios de cultivo usados
rutinariamente en el laboratorio de Microbiologa (agar sangre,
agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el agar
glucosado de Sabouraud (SDA), con o sin antibiticos
aadidos, es el medio de aislamiento por excelencia para la
identificacin de levadura.
 IDENTIFICACION MEDIANTE
CRITERIOS MORFOLOGICOS
En el medio SDA las
colonias de levaduras
suelen ser completas,
ligeramente abombadas o
planas, de consistencia
mantecosa, lisas o rugosas
con olor dulzn
agradable, volvindose
ms pastosas a medida que
envejecen.
 IDENTIFICACION MEDIANTE
CRITERIOS MORFOLOGICOS
En el medio SDA las colonias de
levaduras no desarrollan micelio
areo, aunque en ocasiones
pueden aparecer prolongaciones
aracneiformes en la periferia de
las colonias.
Si se observa un micelio areo
definido puede ser un hongo
dimrfico o especies de levaduras
como Geotrichum, Trichosporon
o Blastoschizomyces.
 IDENTIFICACION MEDIANTE
CRITERIOS MORFOLOGICOS
Una colonia de aspecto y
consistencia mucoide sugiere
la formacin de cpsulas
Cryptococcus neoformans.
Las colonias de color rojo-
anaranjado o naranja por su
riqueza en carotenoides.
De aspecto cremoso o rugoso,
gnero Rhodotorula color
que manifiesta esta levadura
 IDENTIFICACION MEDIANTE
CRITERIOS MORFOLOGICOS
Las algas acloroflicas del
gnero Prototheca, tras
incubacin a 28 C durante 3-
4 das, desarrollan unas
colonias blancas cremosas
muy parecidas a las
producidas por el gnero
Candida.
 CRITERIOS MICROSCPICOS
Caractersticas microscpicas son
muy tiles para la identificacin de
algunas especies de levaduras.
Tenemos:

1. PRUEBA DEL TUBO

GERMINAL O
FILAMENTACIN PRECOZ
El tubo germinal es una extensin
filamentosa de la levadura, sin
estrechamiento en su origen, y su
longitud tres o cuatro veces mayor
que la clula madre
Slo C. albicans es capaz de
producir verdaderos tubos
germinales
 Morfologa microscpica de
levaduras
Sembrar en medios adecuados para la
esporulacin y o germinacin de los hongos.
Medios adecuados son a base de cereales
RC (rice-cream), CMA (cornmeal)
Incorporar Tween 80 para reducir la tensin
superficial y famorecer la germinacin,
filamentacin y esporulacin de las levaduras.
 Morfologa microscpica de
levaduras
Morfologa microscpica de levaduras
 Morfologa microscpica de
levaduras
1. MICELIO
2.BLASTOPORAS
3.CLAMIDOPORAS
4.ARTROSPORAS
 CRITERIOS
MICROSCPICOS
2. FORMACIN DE
HIFAS,
BLASTOCONIDIAS, Y
ARTROSPORAS
Las especies del gnero
Geotrichum tambin
producen blastoconidias a
partir del ngulo de la
artroconidia, pero, en este
caso, forman una estructura
denominada palo de
hockey
 CRITERIOS
MICROSCPICOS
2. FORMACIN DE HIFAS,
BLASTOCONIDIAS,
CLAMIDOSPORAS Y
ARTROSPORAS
C. tropicalis produce pequeas
cantidades de blastoconidias, muy
esparcidas o en pequeos grupos a
lo largo de las hifas.
C. parapsilosis, C. kefyr y C. krusei
se ordenan a lo largo de una
corriente de blastoconidias, que
permite su identificacin
 CRITERIOS
MICROSCPICOS
LAS CLAMIDOSPORAS son formas de
resistencia, redondas u ovales, de 6-12 m de
dimetro y pared gruesa, con aspecto de esporas
laterales o terminales.Su produccin es
caracterstica y diagnstica de C. albicans

HARINA DE MAIZ,
A este medio debe agregarse Tween 80
(polisorbato) a una concentracin final de
0,02% para reducir la tensin superficial y
aumentar la formacin de hifas

LECHE DILUIDA
Favorece la produccin de clamidosporas. el
medio de leche diluida (leche natural 170 ml,
agua destilada 1.000 ml, cloranfenicol 0,25 g).
.
Esquema de identificacin de
levaduras
 TINCIONES
El estudio microscpico de los
organismos levaduriformes o
microorganismos relacionados
(gnero Prototheca) se puede
llevar a cabo mediante tinciones,
Tinciones simples.
Tincin de Gram con esta tincin,
las levaduras suelen comportarse
como Gram positivas
Mediante estas tinciones tambin
se puede observar la formacin de
blastosporas, artrosporas, hifas,
pseudohifas o endosporas.
 CRITERIOS BIOQUMICOS
ENZIMTICOS
CHROMagar Candida
Sirve para identificar las especies del gnero Candida y
permite diferenciar C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, y
C. glabrata en funcin de los colores que desarrollan en
este medio.
Sembrar las placas e incubar a 30-37 C durante 48 h para
que las colonias de levaduras desarrollen completamente el
color.
C. albicans son lisas y de color verde esmeralda.
C. dubliniensis que desarrolla un color verde oscuro y es
incapaz de crecer a 45 C
C. tropicalis produce colonias azul oscuro con un halo
prpura-marrn en el agar que la rodea.
C. krusei forma colonias rugosas con el centro rosado y el
borde blanco.
C. glabrata manifiesta un color violeta morado.
Las dems especies desarrollan colores y tonalidades
diversas que no permiten su identificacin por este medio
C. parapsilosis (roscea-lisa),
Prototheca wickerhamii (crema).
 CRITERIOS BIOQUMICOS
ENZIMTICOS
CandiSelect
El medio CandiSelect (Bio-
Rad) es un medio selectivo que
permite la identificacin de C.
albicans mediante la hidrlisis
del sustrato cromognico
presente lo que origina el
desarrollo de un color azul
 CRITERIOS BIOQUMICOS
ENZIMTICOS
Sistemas enzimticos comercializados
BactiCard Candida albicans
Para detectar la presencia de las enzimas -galactosidasa

(MUGAL) y L-prolina aminopeptidasa (PRO).

La enzima MUGAL tiene la capacidad de hidrolizar el

sustrato 4-metilumbeliferil-N-acetil--D-galactosaminida
y producir
la liberacin de 4-metilumbeliferona que es una sustancia

fluorescente capaz de ser detectada al iluminarse con luz

ultravioleta de 365 nm.
La enzimaPRO hidroliza al sustrato L-prolina--

naftilamida y
reacciona con el Color Developer originando un color rojo
 CRITERIOS BIOQUMICOS
ENZIMTICOS
Identificacin de Cryptococcus
neoformans por mtodos enzimticos
Deteccin de ureasa
Una levadura con reaccin positiva a la

prueba de la ureasa es sugestiva de

pertenecer al gnero Cryptococcus.
Concretamente, las cepas de C.
neoformans que son grandes
productores de ureasa, comienzan a
provocar cambio de color a las 2 h de
 CRITERIOS BIOQUMICOS
ENZIMTICOS
Prueba de la enzima
Nitrato-reductasa
La capacidad de C.
neoformans de reducir
nitratos a nitritos es una
prueba de utilidad cuando
se pretende identificar esta
levadura
 CRITERIOS BIOQUMICOS
ENZIMTICOS
Prueba de la Fenol-Oxidasa
C. neoformans produce fenol-

oxidasa, una enzima necesaria para

el metabolismo de la 3,4-
dihidroxifenilanina (DOPA) y otros
compuestos fenlicos en la sntesis
de la melanina. Esto se evidencia
por la produccin de un pigmento
marrn oscuro o negro alrededor de
la colonia de C. neoformans
 Fermentacin de azcares
Es la degradacin de los
hidratos de carbono con
produccin de CO2.
Puede haber degradacin de
los hidrtaso de carbono con
produccin de cido , pero
esto no es un indicador de
fermentacin.
 Fermentacin de azcares
LEYES DE FERMENTACION DE
AZUCARES POR LAS LEVADURAS O
LEYES DE KLUYVER-DEKKER
1. Toda levadura que no fermenta glucosa no
fermenta ningn otro azcar.
2. Si fermenta glucosa tambin fermente
fructuosa y manosa
3. No puede fermentar a la vez maltosa y
lactosa
Fermentacin
de azcares
INTERPRETACIN
Positivo
Si hay presencia
de gas en el
interior de la
campana de
Durham
Negativo
Si hay ausencia de
gas en la campana
de Durham
Pruebas de fermentacin y otras
caractersticas de cultivo
 AUXONOGRAMA
ASIMILACIN DE NUTRIENTES
Es la capacidad de utilizar ciertos compuestos
orgnicos como nica fuente de carbono en
crecimiento aerobio.
Los compuestos carbonados pueden ser.
Azcares, cidos orgnicos, alcoholes.
Se denominan pruebas de asimilacin y se usa
para valorar la capacidad de levadura de usar
estos compuestos en aerobiosis.
 Identificacin basada en mtodos de
asimilacin de nutrientes
Auxonograma convencional
Medios de cultivo base:

1. Medio sin carbono: Sulfato amnico (5 g/l), Fosfato

monopotsico (1 g/l), Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20
g/l).
2. Medio sin nitrgeno: Glucosa (20 g/l), Fosfato monopotsico
(1 g/l), Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20 g/l).
Como fuente de carbono se puede ensayar todos los azcares y

alcoholes conocidos. Como substrato de nitrgeno se suele

emplear peptona, asparagina, urea, sulfato amnico, nitrato de
potasio aminocidos diversos.
 Auxanograma
Medio YNB
Carbohidratos:
Glucosa, maltosa,
lactosa, sacarosa,
rafinosa, trehalosa y
galactosa
Asimilacin de azcares
 Identificacin basada en mtodos de
asimilacin de nutrientes
AUXACOLOR
La galera Auxacolor es un sistema de
identificacin basado en la asimilacin
de 13 azcares que permite identificar
26 especies diferentes de levaduras. El
crecimiento de la levadura se visualiza
por el cambio de un indicador de pH.
La galera incorpora, adems, una
prueba de resistencia a la actidiona y
otra para la deteccin de la actividad
fenol-oxidasa de C. neoformans
 Identificacin basada en mtodos de
asimilacin de nutrientes
Sistema Uni-Yeast-Tek
Placa plstica con compartimentos con
agar para la asimilacin diferencial de
siete hidratos de carbono.
Cubeta central con agar harina de
maz-Tween 80 para el crecimiento
micelial y produccin de
clamidosporas.
Agar urea,
Agar para reduccin de nitratos
Caldo con extracto de carne al 2,6%
(con 0,05% de glucosa) para la prueba
del tubo germinal.
 Identificacin basada en mtodos de
asimilacin de nutrientes
API 20C AUX
Se compone de 20 cpulas con

sustratos deshidratados para 19

pruebas de asimilacin.
Las cpulas se inoculan con las

levaduras. Identifica 34 especies

La lectura de estas reacciones se

con un control de crecimiento.

La identificacin se obtiene, a partir

de un cdigo numrico, mediante

un catlogo analtico o un programa
informtico.
 Identificacin basada en mtodos de
asimilacin de nutrientes
LA GALERA ID 32 C
Se compone de 32 cpulas
Permite identificar 63 especies
29 sustratos carbonado
1 control negativo
Sensibilidad a la cicloheximida
Prueba colorimtrica para la
esculina.
 Identificacin basada en mtodos de
asimilacin de nutrientes
Sistema Vitek
Son tarjetas plsticas desechables con 30 celdillas:
26 pruebas bioqumicas
4 controles.
Identificar 36 especies
16 especies del gnero Candida,
6 Cryptococcus,
3 Rhodotorula,
2 Trichosporon,
3 Geotrichum,
2 Prototheca,
Hansenula anomala,
Pichia ohmeri,
Saccharomyces cerevisiae y
Yarrowia lipolytica
 Identificacin mediante criterios
inmunolgicos
Bichro-latex albicans
Es un mtodo para la identificacin rpida de
aislamientos C. albicans por aglutinacin de
partculas ltex utilizando un anticuerpo
monoclonal especfico de C. albicans
La prueba se realiza con dos reactivos:

a) bolas de ltex recubiertas con anticuerpos

monoclonales que reaccionan especficamente
con el antgeno de C. albicans localizado en
su pared celular, y
b) un agente disociante que permite la
exposicin al antgeno.
 Identificacin mediante criterios
inmunolgicos
Krusei-color
Es un mtodo para la
identificacin de aislamientos de
C. krusei por aglutinacin de
partculas de ltex, mediante un
anticuerpo monoclonal que
reacciona especficamente con el
antgeno localizado en su pared
 Identificacin mediante criterios
inmunolgicos
Identificacin de levaduras lipfilas
Debido a su requerimiento de cidos grasos, las

levaduras lipfilas no pueden ser identificadas con los

sistemas y medios habituales para otras levaduras, por
lo que su identificacin merece un comentario
diferenciado.
Durante mucho aos se ha venido utilizando el

binomio Malassezia furfur para designar la fase

micelial de las levaduras lipfilas.