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1. AGLUTINACIN.
Son tcnicas ms sensibles que las anteriores que se usan para valorar la presencia de
Ac especficos en el suero. Se basan en la capacidad de los Ag particulados, unidos a
sus Ac complementarios, para aglutinarse dando lugar a un agregado que se ve a
simple vista.
d) Lectura de la prueba:
- REACCIN POSITIVA: no hay hemolisis porque el complemento se consumi en la
reaccin inicial. Indica que hay Ac en el suero problema.
- REACCIN NEGATIVA: hay hemolisis porque el complemento no se consumi en la
reaccin inicial. Indica la ausencia de Ac en el suero problema.
3. HISTOQUMICA Y CITOQUMICA
Histoqumica es el estudio qumico de los tejidos independientemente del mtodo de
anlisis empleado. En la prctica se emplea la palabra para designar el mtodo junto
con el auxilio de los microscopios pticos (MO) y electrnico (ME).
Esta tcnica permite la identificacin y localizacin de compuestos o radicales qumicos
en las clulas y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos
insolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME .
A. PRINCIPIOS BSICOS.
1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER
ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES.
Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por
medio de la fijacin del tejido.
- Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias
hidrosolubles como el glucgeno.
- Hay que evitar los fijadores cidos en las tcnicas de visualizacin del fosfato clcico.
Los fijadores ms utilizados son:
- Formaldehdo para el MO .
- Glutaraldehdo para el ME.
2. EL PRODUCTO DE LA REACCIN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusin .
3 .EL MTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO
QUMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. En algunas reacciones la intensidad del color
producido es proporcional a la concentracin de la sustancia analizada.En este caso se
puede medir dicha sustancia con un histofotmetro.
B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERS BIOLGICO DEMOSTRABLE
HISTOQUMICAMENTE.
1. IONES
IN DETERMINACIN
HIERRO - EL in frrico se demuestra por la reaccin con la mezcla de FERRO-
CIANURO POTSICO Y CIDO CLORHDRICO que forma un precipitado
azul oscuro de ferrocianuro frrico.
- Esta reaccin se usa para localizar los macrfagos del SRE y
diagnosticar enfermedades en las cuales hay depsitos de hierro en los
tejidos .
FOSFATO Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es
reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Esta reaccin
se usa para el estudio del hueso.
2. LPIDOS.
Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDAN
NEGRO.Los tejidos se sumergen en soluciones alcohlicas saturadas de colorantes muy
liposolubles y debilmente solubles en alcohol. Se usa para el diagnostico de
enfermedades metablicas que producen depsitos intracelulares.
3. CIDOS NUCLICOS.
CIDO DETERMINACIN
NUCLICO
DNA Se usa la reaccin de FEULGEN que consiste :
- Hidrlisis del DNA con cido clorhdrico para extraer las bases pricas
y dejar en libertad los grupos aldehdicos del azucar.
- El reactivo de SCHIFF (fuchsina bsica con anhdrido sulfuroso)
reacciona con el aldehdo y forma un precipitado rojo.
Esta reaccin presenta proporcionalidad entre la intensidad del color
producido y el contenido en DNA del ncleo.
RNA Tiene gran afinidad por los colorantes bsicos (basoflia) lo que hace
que se tia intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.
4. PROTENAS.
Su identificacin se basa en mtodos de deteccin de aminocidos.
- Reaccin de aminobenceno.
- Reaccin de Sakaguchi que detecta la arginina de las protenas bsicas como las
histonas y protaminas.
5. POLISACRIDOS.
Se encuentran unidos a protenas o en forma libre. En el caso de ser un polmero,
antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenoltico para que libere los
azucares.
La reaccin ms usada es la del PAS (cido peridico-schiff). El cido oxida a los
azucares en posicin 1-2 y deja grupos aldehdos libres que reaccionan con el reactivo
de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra la
presencia de:
- Glucgeno en el hgado y msculo.
- Depsito intracelular de glucgeno en enfermedades congnitas.
- Glucosaminoglicano o mucopolisacrido que forman parte de los proteoglicanos.
- Glucoprotenas.
Los azucares cidos tambin reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN.
6. CATECOLAMINAS. El formoaldehdo reacciona con las catecolaminas produciendo
compuestos fluorescentes.
7. ENZIMAS. Su localizacin se basa en la produccin de un precipitado fuertemente
coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimtica.
ENZIMA DETERMINACIN
FOSFATASA CIDA Se usa el mtodo de GOMORI que consiste en incubar cortes de
tejidos en una solucin que contengan GLICEROL FOSFATO
SDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 .
La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un
precipitado insoluble.Despus se aade sulfito de amonio que
da color negro y electro denso al precipitado.
Se usa para localizar lisosomas.
DESHIDROGENASAS Se usan cortes no fijados junto con un compuesto qumico
soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.El tetrazol es
reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN.
Se usa para detectar mitocondrias.
PEROXIDASA Promueve la reduccin de ciertos sustratos, transfiriendo iones
hidrgenos desde el perxido de hidrgeno al sustrato que se
reduce.
Como sustratos se usa el perxido de hidrgeno y el
tetraclorato 3,3-diamino-bencidina que cuando se reduce forma
un compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.
B. FLUORESCENCIA.
Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y
emite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopa se suele usar la excitacin
con luz ultravioleta.
1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.
- Compuestos naturales constituyentes de las clulas: vitamina A, riboflavina(B2) y las
porfirinas.
- Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina que
se une a los cidos nuclicos:
- DNA: fluorescencia verde amarillenta.
- RNA: fluorescencia roja amarillenta.
Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cncer (clulas ricas en RNA).
2. INMUNOCITOQUMICA (INMUNOFLUORESCENCIA).
Sirve para identificar protenas especificas. Se basa en la reaccin Ag-Ac. Al Ac se le
puede marcar con un compuesto fluorescente. Es la mtodo ms usado para la
deteccin de auto-anticuerpos en enfermedades autoinmunes.
PREPARACIONES PERMANENTES
Describiremos primero las preparaciones histolgicas permanentes (laminas) para el
estudio al microscopio ptico. Con este instrumento los objetos se examinan por
transparencia, siendo pocas las estructuras que se examinan directamente
(mesenterio, cola de renacuajo) y que pueden ser observadas in vivo, sin fijar y
teir, como sucede en las preparaciones permanentes.
Los pasos que se siguen para obtener una preparacin permanente son:
1. Fijacin
2. Inclusin
3. Corte con microtomo
4. Coloracin
A. FIJACIN.
- Se hace a fin de evitar la autolisis y destruccin celular.
- Los tejidos deben ser tratados inmediatamente despus de ser cortados.
- Tiene por fin endurecer los tejidos, volvindolos mas
resistentes a las etapas subsiguientes de la tcnica
histolgica.Hay que conservar la morfologa y la composicin qumica de los
componentes de los tejidos.
- Suele durar unas 12 horas.
La fijacin puede ser realizada por procesos:
MTODO CARACTERSTICAS
FSICO - Calor, como en bacteriloga.
- Fri, como en el criostato.
Este paso es ESENCIAL, puesto que las protenas son las principales responsables de la
estructura celular y se degrada despus de la muerte celular.
Habitualmente se hace una doble fijacin con una solucin tamponada de:
- Glutaraldehdo.
- Tetraxido de osmio.
B. INCLUSIN.
- Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes
suficientemente finos.
- Las sustancias ms usadas para este fin son:
- GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO.
- RESINA EPOXI para la ME.
Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la
inclusin:
TRATAMIENTO CARACTERSTICAS
DESHIDRATACIN Se extrae el agua de los tejidos con baos de
concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a
100%).
ACLARAMIENTO O Sustitucin del etanol por un liquido miscible en
DIAFANIZACIN etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que
dejan a la pieza translcida.
INCLUSIN O IMPREGNACIN - Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 C
en el interior de una estufa.
- Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los
espacios que dejan libre son ocupados por la
parafina.
- Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se
deja solidificar.
- Inconvenientes:
- Destruyen muchas enzimas
- Eliminan compuestos liposolubles
Hematoxilina Negro - - - -
frrica
Tricromo Fuchina-cida y - Rojo - - -
Masson Panceau
Verde luz - - Verde - -
RADIOAUTOGRAFIA
Se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotogrficas que contienen
bromuro de plata (microdetectores de radiactividad). Los cationes de plata que son
alcanzados por la radiacin se transforman en plata metlica que aparece negra al
microscopio ptico (MO).
Fases:
1. Inyectar el istopo radiactivo al rgano en estudio.
2. Poner un corte de rgano en contacto con la pelcula de emulsin fotogrfica.
3. Dejar un perodo de exposicin y revelar la pelcula. Los puntos negros que
aparecen corresponden a los sitios del rgano que contienen el istopo.
5. CITOMETRA DE FLUJO.
5.1. FUNDAMENTO
La Citometra de Flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparamtrico cuyo
fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas (generalmente
clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser focalizado. El
impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales que corresponden a
diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por distintos detectores. Estos
convierten dichas seales en seales electrnicas que posteriormente sern
digitalizadas para permitir la medida simultnea de varios parmetros en una misma
clula.
En el momento de realizar las mediciones en el citmetro de flujo, las clulas pueden
estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensin celular y en forma de clula
nica. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz lser mediante un flujo
continuo, cada clula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como
consecuencia de la excitacin lser a la que es sometida. Los parmetros que
tpicamente se miden de forma simultnea por cada clula son:
1. Dispersin frontal de la luz a 2 (forward scatter), valor proporcional al tamao
celular.
2. Dispersin de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de
estructuras granulares o complejidad de la clula.
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.
5.2. ESTRUCTURA BSICA DE UN CITMETRO DE FLUJO
Los citmetros de flujo estn formados por complejos sistemas:
A) El sistema fludico permite un enfoque hidrodinmico del flujo celular hasta
conseguir el alineamiento de las partculas o clulas, y en los separadores celulares o
cell sorters, se produce una rotura del flujo en gotas de tamao uniforme para
conseguir la separacin de clulas individuales.
B) Los sistemas pticos permiten el enfoque lser en un haz con un dimetro reducido
para impactar sobre el menor nmero de partculas posibles simultneamente.
B) Seales de Fluorescencia.
Los citmetros de flujo permiten detectar seales de fluorescencia procedentes de
complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una clula,
siendo la cantidad de seal de fluorescencia emitida igual a la proporcin de la
cantidad de componentes fluorescentes de la partcula.
5.4. ANLISIS DE DATOS
En general todos los citmetros presentan los datos en algunos formatos standard.
- Histograma: segn un parmetro.
6. REACCIONES INMUNOENZIMTICAS.
Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una
reaccin Ag-Ac especfica, en la que el complejo inmune formado se mide por una
reaccin colorimtrica catalizada por una enzima acoplada qumicamente a uno de los
reactivos, en presencia del sustrato adecuado.
6.1. ENZIMOINMUNOANLISIS
A1) Ventajas:
Ms precisos
A2) Desventajas:
B1) Ventajas :
B2) Desventajas :
Ms difciles de automatizar
2. Todas las placas son sometidas a un tapizado con gelatina o albmina srica bovina,
que recubre las zonas en las que no se ha fijado el primer componente de la reaccin
(Ag o Ac).
Los reactivos utilizados suelen ser los mismos (peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-
glucosidasa, glucosa oxidasa) para todos los ELIASAs, con la diferencia del sustrato de
la enzima utilizada:
- La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa y libera agua oxigenada que se detecta
por una mezcla de peroxidasa y un cromgeno. S queremos un precipitado, podemos
usar una sal de tetrazolio.
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos
que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, ) pero en las
que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen
controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antgeno buscado, o bien se le ha aadido).
Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la anterior. Los controles
positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos
: uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de sel debida a la
unin de dos o ms anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo ms
popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario
marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de
antgenos.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a
los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
7.1. ELECTROFORESIS.
Separacin de protenas del suero en funcin de su comportamiento en el campo
elctrico.
La velocidad de las particulas depende de:
TIPOS DE ELECTROFORESIS
EQUIPO DE ELECTROFORESIS
Fuente de alimentacin
o Cubeta y puente
o Reactivos
Se hace correr una alicuota de suero en un gel de agarosa y con tampn barbital (pH
8.4), en el que las Ig (con carga positiva) se desplazan hacia el ctodo. Despus de
correr el gel, ste es fijado en una solucin cido-alcohol y se tie con un colorante de
protenas, y por ultimo se hace un densitometrado. Es una tcnica CUALITATIVA.
Sirve para:
- Detectar hipergammaglobulinemias.
- Calcular la fraccin gamma.
- Detectar paraprotenas (componentes monoclonales) en el suero..
7.2. INMUNOELECTROFORESIS (IEF).
Prueba CUALITATIVA.
Mtodo combinado de precipitacin.
7.3. RADIOINMUNOELECTROFORESIS.
- Se marca radiactivamente los Ag y se hace una IEF; despus se hace una
autorradiografa de las bandas obtenidas (se visualizan mejor).
- Es una prueba CUALITATIVA y/o semicuantitativa.
7.4. ELECTROINMUNODIFUSIN.
Consiste en acelerar la formacin de la banda de precipitacin por la accin de un
campo elctrico. Con estas tcnicas se detectan [Ag] de 20 mgr/ml y [Ac] de 20
mgr/ml. Estas tcnicas se basan en que el Ag y el Ac tienen cargas diferentes al pH
seleccionado; puesto que la mayora de los Ag tienen un pI bajo y los Ac alto. Si las
cargas sobre el Ag y Ag apenas difieren, se puede modificar la molcula qumicamente.
- QUIMIOCONJUGADOS.
b) NO CONJUGADOS:
- ACCIN ANTITUMORAL
- ELIMINACIN DE CLULAS.
- Quimeras con regin Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble
- Prueba CUALITATIVA.
- Se vierte el gel de agarosa sobre portas y se deja gelificar (1-2% de agarosa a pH 7-
8.5).
- Se hacen dos pocillos y se deposita el Ag en uno de ellos y el Ac en el otro.
- Ag y Ac difunden y en el punto de encuentro de los dos, y s las concentraciones son
adecuadas, se produce una banda de precipitacin.
- Si en la solucin existen dos Ag reconocidos por el Ac, habr dos bandas.
- Se puede usar azul cromassie para teir las bandas.
10.3.3. INMUNODIFUSIN DOBLE TIPO II (IDD-
II) U OUCHTERLONY.
Tambin es conocida como Agar gel immunodiffusion test (AGID).