Corso UIC! - Unione Italiana Chimici Igienisti La gestione della Qualita nei laboratori di prova preposti al controllo ufficiale su matrici ambientali ed alimentari. Palermo 19-20 dicembre 2002 La validazione dei metodi analitici Graziano Bonacchi ARPAT DIREZIONE SISTEMA QUALITA” ‘Ager reginale per I protezione ambiental ela Toscana ‘Via Nott Porporan22 80144 FIRENZE “Tel 085:3206456- Fax 0553206410 E-mail: gonechi Garpat toscana“La Gestione della Qualita nei laboratori di prova preposti al controllo ufficiale di matrici ambientali ed alimentari” Palermo 19-20 dicembre 2002 “La validazione dei metodi analitici“ Relazione Dr. Graziano Bonacchi Responsabile Sistema Qualita dell’Agenzia regionale di protezione ambientale della Toscana (ARPAT) Introduzione La relazione affronta il tema della validazione dei metodi chimici nel quadro dell’applicazione della norma UNI CEI EN ISOMEC 17025: 2000! “ in relazione alle esigenze di progettazione legate allo sviluppo di un sistema qualita in linea con l'approccio ISO 9000”. Larelazione @ divisa in tre parti: 1° Parte(Pagg2-9) : Pianificazione della progettazione di un metodo di prova (Requisiti gestionali e tecnici) * Qualiti-Controllo della qualiti-Garanzia della qualita ‘+ La validazione dei metodi dentro il processo di pianificazione/progettazione di un servizio © Fasi della pianificazione della progettazione del metodo © Richiesta di introduzione/modifica di un metodo prova > studio di faribilita approvazione dello studio di fattibilita stesura del metodo sperimentazione ( validazione metodo intemo o verifica di applicabilita metodo normalizzato) -stesura del rapporto finale approvazione del metodo riesame del metodo eventuale rivalidazione del metodo. Parte ( Pagg 9-23): Scelta e validazione di un metodo di prova ( Requisiti tecnici) * Scelta dei parametri tecnici di validazione * Determinazione della precision * Ripetibilita intermedia:caso di un operatore che esegue almeno due prove in giomi diversi * Indicazioni relative all’accettabilith dei dati di precisione ‘+ Determinazione del!’esattezza Confronto con un materiale di riferimento Confronto con un metodo normalizzato Confronto interlaboratorio Accettabilita del valore dell’esattezza © Determinazione del limite di rivelabil * Determinazione del limite di quantificazione del metodo di prova ‘© Stima della robustezza del metodo * Stima dell’incertezza (argomento non sviluppato) 3° Parte : Esempi applicativi(Pagg23-28) = TPAneglioli sansa (Tecnica GC-MS) ; RvVVVVVVY vvvv 1a UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2000 “ Reguisiti general per la competenza dei laboratori di prova e ‘aratura”, che sostituisce la precedente UNI CEI EN 45001:1990 “ Criteri general pe il funzionamento dei laborator", sara i seguito indicata come ISO 17025,1° Parte : Pianificazione della progettazione di un metodo di prova (Requisiti gestionali e tecnici) a ‘ontrotlo del nzia della qualitd Per esaminare come ¢ quanto e perché l’applicazione delle “norme della qualita”, possa essere considerato uno strumento adeguato per I’ottenimento di buone prestazioni di laboratorio , anche ‘in rapporto alla validazione dei metodi, & necessario partire dalla definizione dei termini : qualita - controllo della qualita- garanzia della qualita , cosi come prevista dalle norme ° e cercare di ‘tadurme i significato nella realta dell’attiviti analitica, svolta peraltro in laboratori pubblici che prevalentemente eseguono controlli ufficiali su matrici ambientali alimentari quali sono, ad esempio, i laboratori delle Agenzie di protezione ambientale. Qualit “ L’insieme delle caratteristiche di un’entith che ne determinano Ia capacita di soddisfare esigenze espresse ed implicite” Lesigenza fondamentale del cliente , anche se in genere non esplicitata, @ sicuramente quella di avere un risultato ad un livello di accuratezza adeguato. ‘Allora, se 'accuratezza é “il grado di accordo tra il risultato di un procedimento analitico ed il valore di riferimento accettato “, definizione che tacchiude in sé sia il concetto di esattezza ({ntesa come accuratezza della media) che quello di precisione’, & possibile sostenere , in modo non ambiguo e scientificamente corretto, che la _conoscenza dell’accuratezza corrisponde al requisito fondamentale della qualita, “L’accuratezza dipende dalla combinazione di errori casuali e sistematici .E” preferibile esprimere Vaccuratezza di un risultato in termini della sua incertezza , definita per grandi linee come la valutazione dell"intervallo di valori entro cui 2 stimato che ricada il valore del misurando con un certo grado di confidenza”®, Le esigenze del cliente possono essere meglio soddisfutte da dati meno accurati, ma ottenuti con rapidita 0 a minor costo o con procedimenti pid sicuri per operatore e l’ambiente, ma, in ogni caso, Vaccuratezza deve essere conosciuta, come richiede esplicitamente la norma ISO 17025: “4 Laboratori i prova devono avere © devono applicare procedure per stimare Mincerte2za delle misure. In ceri casi fa satura dei mietodi di prova pub escludere il caleolo dellincerteza di misura rigoroso e valido da un punto di vista metrologico € statisticoIn questi casi il laboratorio deve almeno tentare di idemtficare tutte le. component el incertezza¢ fare una stima ragionevole ¢ deve garantie che I'espessione del risultto non forisea un’impressione rata dell'ncerteza. Una stima ragionevole deve essere basata sulla conoscenza del metodo e sulloseapo della misura deve far uso, per esempio, delle esperienze precedente della validazione del dat" Controllo della qualita: Le tecniche e le attiviti a carattere operativo messe in atto per soddisfare i requisiti della Qualita” 1 controllo della qualita corrisponde quindi a quelle operazioni (uso di metodi di prova adeguati; taratura e/o controllo del buon funzionamento delle apparecchiature; addestramento e formazione del personale; uso di soventi e/o reagenti di adeguata purezza; uso di materiali di riferimento UNI EN ISO 9001:1994“ Modello per lassicurazione della qualita nella progetiazion, sviluppo, fabbricazione, installazione ed assistenza” {gostiuita da : UNI EN ISO 9001:2000 “ Sistemi di gestion per la qualitt-Requisit’ > EN ISO 8402:1995 “Gestione per la qualita ed assicurazione della qualith. Termini e definizion!”; richiesta di introduzione/modifica di un metodo prova > studio di fattibilita > approvazione dello studio di fattiblita > stesura del metodo > sperimentazione ( validazione metodo interno o verifica di applicabilita metodo normalizzato) > stesura del rapporto finale > approvazione del metodo > riesame del metodo > eventuale rivalidazione del metodo. Nel caso il laboratorio scelga di impiegare un metodo normalizzato, il cui scopo e campo di applicazione sono giudicati adeguati per ’uso a cui & destinato, lo studio di fattibilita e la fase di sperimentazione sono semplificati, perché le caratteristiche del metodo sono ritenute validate dall’ente che lo ha emesso. Richiesta di introduzione/modifica del metodo La tichiesta deriva in genere da disposizioni di legge , ma pud essere promossa anche da organizzazioni pubbliche e/o private o da singoli clienti privati e pud arrivare anche dallintemo dell’ Agenzia sia da parte di operatori impegnati in compiti di controllo teritoriale istituzionale sia agli stessi operatori tecnici impegnati nell’attivith di prova . La tichiesta pud essere motivata per: estensione / modifica del campo di applicazione , estensione/ modifica del campo di misura, ‘modifica /intograzione parametri qualita del metodo, , determinare un nuovo analita mai ricercato nella matrice/ matrici indicate nel metodo, determinere un analita gia ricercato, ma in una diversa matrice, apportare modifiche a metodi (nommalizzati e non) impiegati per la determinazione di uno opiit analiti, utilizzare tecniche diverse. Ui responsabile dellattivith di prova , dopo aver valutato ed accettato, in via preliminare, le tichieste deve assumere, 0 assognate ad un collaboratore qualificato, il compito ¢ la Tesponsabilita di pianificare le attivita del progetto relative a : studio di fattibilit ; stesura del metodo intemo o delle eventuali modifiche di dettaglio da introdurre a quello normalizzato ( rocedura di prova integrativa) ; sperimentazione del metodo ( validazione del metodo non normalizzato e/o verifiea della capacitA di garantire le prestazioni del metodo normalizzato) ; predisposizione del rapporto; approvazione e autorizzazione. Tiresponsabile della pianificazione decidera a chi assegnare i compiti di ogni fase del progetto di introduzione di un nuovo metodo nell’uso del laboratorio ed informera il Responsabile della garanzia della qualita dell’andamento dell'intero processo. Studio di fartibititd Lo studio di fattibitita ha come presupposto la definizione dei requisiti che il metodo deve arantite per soddisfare la richiesta : sensibilita, specificit, precisione, esattezza, incertezza ecc, se applicabili ; ma anche, eventualmente tempi e costi di esecuzione . vyvvyvv v N presto di verific dll capaci el Iborstoro ed applicare rspetandone le specifiche, un metodo normalizato& dfinito ‘anche “validarione secondaria" (SO /TR 13843:2000 " Water qulity-Guidanceon validation of microbiological methods"),7 Sulla base dei requisiti individuati, dopo aver verificato Vesistenza o meno di metodi normalizzati o di letteratura scientifica adatti allo scopo, il responsabile dello studio precede con Ja scelta del metodo ossia valuta se utilizzare un metodo gid noto, oppure sviluppare un metodo ‘intemo, presentandone le caratteristiche tecniche ed operative di massima ed i parametri di validazione prescelti ( progetto di massima) . Durante lo studio di fattibilita pud anche essere necessario eseguire le prime indagini sperimentali, i cui risultati devono essere registrati . Lo studio di fattibilita deve comprendere anche un esame della sicurezza e della compatibilita ambientale riferibili all’impiego del nuovo metodo e deve concludersi con un: rapporto che documenta il lavoro fatto e che , se la valutazione conclusiva & positiva, comprenda anche Vindicazione dei tempi previsti per le fasi successive. Tirapporto deve presentare , ove possibile, anche pit proposte all’approvazione del Responsabile dell’ attivita di prova (RUO= Responsable dell’ Unita Operativa competent, nel caso di ARPAT), Approvazione dello studio di fattibilita. Il Responsabile dell’attivita di prova approva lo studio di fattibilitA del metodo, lo trasmette per conoscenza al Responsabile della garanzia della qualita, e lo presenta per J’approvazione congiunta al R responsabile del laboratorio (RD= Responsable del Dipartimento provinciale, net caso di ARPAT) , che si impegna cosi a rendere disponibili le risorse economiche per l’eventuale acquisto di apparecchiature © reattivi ( compresi i materiali di riferimenti certificati), per leventuale adeguamento dei locali e per lo stesso aggiomamento degli operatori. cliente deve essere informato dell’esito dello studio di fattibilita, anche nel caso in cui venga deciso di modificare gli obiettivi che lo studio stesso si era posto ( in particolare : requisiti e scelta del metodo ) e si proceda quindi eventualmente con un nuovo studio. ‘Stesura del metodo Il responsabile della stesura del metodo provvede. alla stesura_,in bozza , del metodo di prova'® , nel caso si intenda sperimentare un metodo intemo oppure della procedura di prova integrativa che dettagli, senza modificarlo sostanzialmente, il metodo normalizzato eventualmente prescelto. La stesura finale del metodo sara completata dopo la fase di sperimentazione e di controllo della sua applicabilita, ma , in ogni caso, la sperimentazione non deve essere iniziata senza che gli operatori abbiano disponibile la procedura scritta di prova. Devono essere stese Ie procedure operative eventualmente necessarie per il controllo di buon funzionamento delle apparecchiature necessarie all’esecuzione del metodo, Sperimentazione del metodo scelto Tutti i_metodi “non normalizzati” devono essere validati, ossia il laboratorio deve _verificare (validare) che i requisiti che si prefigge di raggiungere, sono soddisfatti applicando il metodo di Prova intemo cosi come progettato e steso. ‘Un metodo normalizzato @ considerato gia validato, ma deve in ogni caso essere sottoposto ad una verifica per controllare che i parametri di validazione riportati , che si rapportano con i requisiti della richiesta di prova , siano garantiti dal laboratorio applicando quel metodo. La sperimentazione del metodo prescelto deve prevedere le seguenti fasi: ‘+ Controllo dello stato di manutenzione e di taratura di tutte le apparecchiature utilizzate nella sperimentazione , compresi i frigoriferi , i termostati, le autoclavi ec ‘+ Informazione ¢ formazione degli operatori tecnici, sulle caratteristiche del metodo ¢ sul programma di validazione; + Verificaznel caso sia stato scelto un metodo normalizzato, se il laboratorio @ in grado di applicarlo garantendone le prestazioni ossia il rispetto dei parametri di validazione eventualmente in esso riportati (in particolare: ripetibilita , riproducibilita ed esattezza). Se il metodo non riporta i parametri di validazione significativi per la stima dell'incertezza, il laboratorio deve progettare uno studio adeguato nel caso sia richiesto di esprimere il risultato della prova con il dato dell” incertezza, * Lamont ISO 17025, ota al punts. 4.4, rporta senza presriveresleune ndicazion| ti8 * Verifica preliminare , nel caso sia scelto un metodo non normalizzato , della sua specificita e successivamente degli altri parametri di validazione indicati nel progetto di massima. Nel caso in cui Ia prima sperimentazione non abbia forito risultati in linea con gli obiettivi previsti si pud prevedere un riesame delle condizioni sperimentali e nuova stesura del metodo 0 delle procedure di prova integrative (PP); Al termine della sperimentazione e prima di stendere il rapporto finale, il responsabile del progetto deve, se applicabile, controllare che le prestazioni validate o verificate sono garantite nelle condizioni operative del Iaboratorio . ‘Stesura del rapporto finale delta sperimentazione Al termine della sperimentazione, nel caso si concluda positivamente, il responsabile del progetto procede alla valutazione della documentazione raccolta e provvede a redigere il rapporto finale. Al rapporto devono essere allegati: * Ia stesura definitiva del metodo intemo’ o la eventuale stesura definitiva delle procedure integrative di prova (PP) se viene scelto un metodo normalizzato; lastesura definitiva delle Procedure Operative per la manutenzione ed il controllo di buon funzionamento delle apparecchiature; ‘© ilriferimento alle schede di sicurezza relative a tutti i reattivi e/o apparecchiature utilizzate. Tl rapporto deve contenere in allegato tutta la documentazione tecnica che registra i risultati ottenuti compreso le prove preliminari eseguite per controllare che le prestazioni sono garantite nelle condizioni routinarie del laboratorio Titesto della stesura finale del metodo ed anche delle procedure integrative deve essere visionato dal RGQ ¢ trasmesso al RUO solo dopo che il RGQ lo ha firmato per convalidare’® che é stato redisposto in conformiti al Sistema Qualita. Approvazione ed autorizzatione del metodo di prova TRUO ha la responsabilita di approvare il rapporto finale della sperimentazione , che corrisponde all'approvazione del metodo interno e della sua applicabilita nelle condizioni del laboratori Nel caso si tratti di metodo normalizzato, Vapprovazione del rapporto corrisponde all’approvazione della verifica della sua applicabilita nelle condizioni di laboratorio. L’approvazione del metodo, come gia riferito, consegue alla dimostrazione, se applicabile ,che i requisitirichiesti sono garantiti nell'uso routinatio del metodo. Timetodo , una volta approvato dal RUO, viene sottoposto all’esame ed alla firma del RD , che ha Ja responsabilita di autorizzarne I’uso routinario 0 di limitame I’uso soltanto soddisfare la specifica richiesta, Le procedure di prova integrative sono approvate dal RUO , senza necessiti di autorizzazione del RD. Controlio di qualita ¢ riesame dei requisiti del metodo TH metodo nuovo introdotto nell’uso routinario deve essere sottoposto , come tutti gli altri metodi, al controllo qualita , che si tealizza , ad esempio, utilizzando le carte di controllo Le carte di controllo, soprattutto se sono costruite avvalendosi della disponibilita di un materiale i riferimento stabile nel tempo ( possibilmente certificato , ma comunque a valore noto del determinando ), consentono di verificare se le prestazioni di precisione e di esattezza (e quindi di incertezza) stimate nel processo di validazione o nella verifica di applicabilita di un metodo normalizzato, sono mantenute nel tempo, Triesame dei requisiti dei metodi di prova deve essere eseguito con una periodicita programmata, ° La firma di valiazione del RGQ non comport slcun supplemento di verificatenicn del metodo di prove, che compete al responsable della progetazioneRivalidazione del metodo La rivalidazione di un metodo interno deve essere fatta se : ¢ ilmetodo non viene impiegato da lungo tempo ; ‘+ vengono introdotte modificazioni significative quali ad esempio sostituzione di apparecchiature 0 modificazioni tecnologiche ( sostituzione di colonne,) , uso di reagenti diversi ece. La rivalidazione del metodo intemo deve essere eseguita anche quando T’esito negativo del riesame periodico non abbia trovato spiegazioni documentabili, sttacennennennnnneseteniint 2° Parte : Scelta ¢ validazione di un metodo di prova ( Requisiti tecnici) La prima operazione che il laboratorio deve compiere per corrispondere : > alla richiesta di determinare un analita mai prima considerato , > oppure gia considerato ma in una matrice diversa , oppure in un campo di misura diverso , gid riferito al punto 1 della relazione, nel verificare se _esistono _metodi vi iesto. Nel caso in cui esistano metodi utilizzabili, il aboratorio deve operate la scelta tenendo conto di dover privilegiare : '*| metodi prescritti da leggi, decreti, direttive CE, ( metodi di legge); © metodi emessi da enti normatori intemazionali ( ISO, CEN) o nazionali (UNI, DIN, AFNOR, BSI ecc.), anche come progetti di norma nella forma ‘sottoposta al voto finale (metodi normati); ‘* metodi emessi da organizzazioni pubbliche o private ( EPA, IRSA, UNICHIM, ISTISAN, APHA-Standard methods eco) (metodi ufficiali)””. ‘Se non esistono metodi normalizzati®, oppure il laboratorio non li valuta adeguati allo scopo , deve essere eseguita una ricerca bibliografica per verificare se esistono articoli pubblicati su riviste ( Bollettino dei Chimici Igienisti , Bollettino dei Biologi Italiani, Joumal of AOAC; Analytical Chemistry ecc.) che riportino metodi di prova utili come riferimento nella progettazione di metodi interni o per modificare gli stessi metodi normalizzati. Tparametri e gli schemi di validazione devono essere definiti al momento della scelta del metodo interno . Le istruzioni dei fomnitori delle apparecchiature e/o dei reattivi devono essere considerate metodi non normalizzati. 1 metodi proposti dal cliente ( ad esempio quelli proposti da un produttore , che commissiona prove di controllo dei suoi prodotti o degli intermedi di produzione) , non devono essere sottoposti al Processo di validazione , ma il laboratorio deve, in ogni caso , verificare di essere in condizione di applicarli garantendo le prestazioni indicate nella richiesta del cliente stesso. Scelta dei parametri tecnici di validazione "La defnizione di metodo ufficiale iponata in SINAL, panto 3.1.10 DT-0007 (wwsina i)10 “metodj normalizzati”"” non devono essere validati : tuttavia, prima di utilizzarii il laboratorio deve non solo valutare che le loro caratteristiche ( campo di applicazione, sensibilitA, specificita, precisione, limite di rivelabiliti esattezza ecc, ove riportate'® ) siano adeguate agli scopi richiesti ma deve anche verifieare " © dimostrare di essere in grado di applicarli in modo ‘completo, garantendo il rispetto delle loro caratteristiche. Nota : Se il metodo normalizzato non riporia i parametri di validazione significativi ( precisione, esattezza ) per la stima dell'incertezza, il laboratorio deve progettare uno studio adeguato nel caso sia richiesto di esprimere il risultato della prova con il dato dell’ incertezza, ‘L”_metodi non normalizzati”” devono essere validati , per cui , prima di impiegarli il laboratorio deve verificare (validare) che i requisiti che si prefigge di raggiungere, definiti a seguito dell’esame delle richieste e dello studio di fattibilita , sono soddisfatti applicando il metodo di Prova interno cosi come progettato e steso. Gli schemi di validazione ( vedi allegato 2) si differenziano in tapporto : ) alla natura del metodo ( metodi assoluti; metodi relativi ed anche metodi razionali e metodi empirici);”° ») al tipo di indagine richiesta (indagine chimica, microbiologica, fisica); €) al tipo di metodo ( prove di identificazione;ttli dei composti principal; prove rispetto a valore fissato, saggi di purezza; prove di comportamento);”" 4) alle tecniche strumentali sate (cromatografiche , spettrometriche, ecc.) ; ©) alle diverse matrici in cui si trova il determinando, La documentazione relativa alla determinazione dei parametri di validazione deve essere disponibile e rintracciabile. Per procedere alla validazione di un metodo di prova @ , in ogni caso, necessario che: * il metodo sia scritto in modo chiaro ¢ non ambiguo”™, in modo che esso possa essere eseguito allo o dagli operatori tecnici con identiche modaliti © iparametzi di validazione del metodo ed i livelli sui quali stimarli siano definit * i criteri di accettabilita della validazione siano definiti ( perché richiesti dalla normativa 0 previsti dall’accordo con il cliente) ; oppure, in mancanza di indicazioni, individuati per confronto con i criteri di accettabititA di un circuito interlaboratorio o con i risultati ottenuti con ‘un metodo di riferimento; * gli operatori tecnici siano ben istruiti ed esperti, per evitare il pit possibile gli errori “umani” di difficile rilevazione; * le apparecchiature di prova ¢ misura utilizzate siano state sottoposte al controllo di buon funzionamento secondo il programma di specifiche procedure operative; ‘+ imateriali ed i campioni di riferimento ed i reagenti siano adeguati e correttamente conservati; ‘* isingoli valori trovati_siano idonei ad essere elaborati statisticamente e siano quindi controllati utilizzando opportuni tests statistici ( ad esempio : test di Shapiro e Wilk per la verifica della normalita ¢ quello di Dixon per la verifica dei dati anomali); © In curva di taratura , ove prevista, sia definita nel campo di misura dichiarato dal metodo ¢ sia costruita con un numero adeguato di livelli di concentrazione per garantire che il contributo all'incertezza dei risultati,dovuto alla curva di taratura, sia sotto controllo.”*Viene in genere 'S Prima di aplicere un metodo normalizzato, i! laboratrio deve esegure prove di ripetbile verificame ove eppicile, ‘esauezea, pe to meno a vel rte (esempio limite di lege eo sperifcat dal cliente) anche sil metodo non i riper " mproceso i verifea dela capacith det laboratoio ad applicare ,rspetandonelespecifiche, un metodo normaizzato 8 definite anche Secondary validation” (vedi ISO /TR 13843-2000" Water qualiy-Gaidance on validation of microbiological methods")), 2 Manuale UNICHIMN.1790 (Ed, 1995) La classificazione ¢ ipo al punto 3 del Manvale al quale si rimanda. 2 La suddivisione del tipo di metodi in rapport ai parameti di vaidazione & quella proporta_ dil Gruppo di lavoro UNICHIM * ‘Yidaaione dei metod anal” rigor al Panto 3 ed in Tabella3 el Manuale UNICHIM 17900 (Ea, 1999), 2 Vedi ad esempio, not al punto 5.44 della norma 1S0 17025. ® 1SO 8466-1:1990. * Water quality Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performance characteristics”. Part.1 Statistical evaluation of the linear calibration function”12 ~ Pintervallo di concentrazioni da controllare & pit grande; ~ la diversiti degli “effetti matrice” & tale da complicare lo studio di validazione ; ~ raramente é disponibile il “bianco matrice”, con la conseguenza di dover spesso icorrere al metodo delle aggiunte per stimare l’esattezza ( e quindi il recupero) del ‘metodo; ~ ilimiti di legge sono definiti molto spesso a livelli molto lontani da quelli comunemente indagati nei controlli routinari Deve inottre essere considerato che la maggior parte dei metodi ufficiali non sono corredati da parametri di validazione ; ripetibiliti; iproducibilita; esattezza; limite di rivelabilita; e che , quando questi dati sono riportati , non sono correttamente evidenziate le modaliti con le quali sono stimati Non rientra negli scopi della relazione approfondire le questioni relative alla determinazione dei singoli parametri e, a questo scopo , si rimanda all’abbondante letteratura ( allegato 4) segnalando che ad inizio anno 2003 sara disponibile anche la “ Linea Guida per la validazione dei ‘metodi analitici “ predisposta dal Gruppo di lavoro ANPA-ARPA-APPA “Accreditamento e Certificazione “ ( Rapporto tecnico predisposto per la pubblicazione dal dott. Stefano De Martin). In ogni caso , quando si deve mettere a punto un metodo intemo di tipo chimico, dopo uno studio preliminare delle sue fasi principali ( specificita con prove di recupero dell’analita o degli analiti e ‘curve di taratura) si procede con la valutazione della qualita delle misure stimando la ripetibilita e la ‘sattezza del metodo su un punto significativo di concentrazione ( ad esempio un limite di legge) 0 meglio ancora nell’intervallo i concentrazione di interes Dalla determinazione dell’esattezza e della ripetibilita si ottiene la stima dell'accuratezza e quindi dell'incertezza da assegnare al risultato ottenuto. Naturalmente , mentre per la stima della ripetibilita non & necessario avere disponibile un campione di riferimento a valore noto, per la stima dell’esattezza & necessaria la disponibilita di un materiale 4iriferimento oppure di un metodo di riferimento , in modo da confrontare i risultati ottenuti con il ‘metodo sotto studio(da validare) con quelli ottenuti,sullo stesso campione , con il metodo gid noto € sperimentato. ‘modo pid efficace per stimare i parametri di esattezza e precisione di un metodo & quello di ‘organizzare un confronto interlaboratorio ( “collaborative trial”) , facendo eseguire ad un numero di laboratori, non inferiore a 8 , determinazioni (almeno in duplicato) sullo stesso campione valore noto, utilizzando il metodo da validare. Per affrontare le difficolta del processo di validazione di un nuovo metodo timanendo all’interno diun singolo laboratorio, IUPAC, ISO e AOAC INTERNATIONAL hanno emesso un “Technical Report” : “ Harmonised guidelines for single laboratory validation of methods of analysis” (Simposio sull ‘armonizzazione dell’assicurazione della qualita nei laboratori: Budapest novembre 1999) , preparato per la pubblicazione da Michael Thompson , Steven L.R. Ellison and Roger Wood. (Pure Appl.Chem., Vol.74,NoS,pp.835-855,2002) I1Prof. Herbert Muntau rappresenta I'talia nel gruppo di lavoro sull’armonizzazione degli schemi di assicurazione della qualita, Lo stesso gruppo di lavoro aveva gia elaborato , nel 1996, una linea guida altrettanto importante : “Harmonised Guidelines for the use of recovery information in analytical measurement”, con la quale vengono affrontati_argomenti trai pit controversi nel processo di validazione di un metodo di rova , soprattutto quando si opera all’interno di un laboratotio singolo: ‘+ Ia stima della significativita del recupero ( ossia dell'esattezza del metodo) ; ‘+ la decisione di inserire o meno il fattore di recupero nella formula di calcolo del tisultato; ‘* la stima dell’incertezza del recupero™’. 7 Le seguenti pubblicazion si confrontano con gi stssi problem, con lo stesso approceio:B ‘La Linea guida del 1999, che riporta in appendice le richieste delle caratteristiche di buon funzionamento di un metodo ( selettivita ; taratura; esattezza; limiti di rivelabilita e di quantificazione; sensibilita; robustezza; comrispondenza agli scopi; variazioni di matrice ; misura dell’incertezza) considera “cinque sorgenti di errore” che influenzano il risultato”®: * Terrore casuale all’intemo della sequenza di prove (Incertezza stimata dallo scarto tipo di ripetibilitA stretta) * lo scostamento da sequenza a sequenza ( Incertezza stimata dallo scarto tipo di ripetibilita intermedia) * lo scostamento tra laboratorio ( Incertezza stimata dallo scarto tipo di riproducibilita: collaborative trial) * lo scostamento del metodo * effetto matrice, Nel processo di validazione eseguito all'interno del singolo laboratorio, rileva la Linea Guida, gli ¢ffetti dovuti alle prime due cause possono essere stimati progettando un esperimento di ripetibilita intermedia facendo eseguire analisi replicate ( almeno in doppio quindi) sullo stesso campione in un numero di sequenze separate ( in giomi diversi ad esempio: carte di controllo del “range”). Iprimi tre fattori di errore sono considerati,, dalla linea guida, equivalenti e non dovrebbero quindi essere trascurati; in ogni caso “un metrologo” rileverebbe che, anche se l’analista decidesse di considerar zero uno dei tre contributi, , dovrebbe comunque stimare Pincertezza di tale assunzione ¢ considerarla nel budget dell’ incertezza, La variazione tra laboratori e quella tra metodi possono essere valutate da prove interlaboratorio , di tipo “ collaborative trial” e proficiency test “ rispettivamente. In ogni caso il laboratorio, sia che debba validare un metodo nuovo sia che debba applicare un ‘metodo normalizzato, mai prima utilizzato, deve stimare lo scarto tipo di ripetibilita stretia, per poter operare sia i controlli interni (carte di controllo) sia i confronti con i dati di ripetibilita riportati nei metodi normalizzati ecc. Determinazione della precisione ( ripetibilita e riproducibilita) Nella fase di verifica della precisione di un metodo si assume usualmente”** che ogni risultato X, ottenuto applicando il metodo indicato, risulti dalla somma di tre clementi: X=m+Bre ‘m_ 21a media generale”” ( denominata anche livello di prova); B_ éo scostamento della media del laboratorio rispetto alla media generale; eo scarto aleatorio iris i izioni di ripetibilita. ‘VAM Project 3.2.2: 1998 “ Evaluating Confidence in Analytical Measurement. Part(d): Lab-based studies of ‘measuremnt uncertainty contributions. Evaluating uncertainties associated with recovery” ‘VAM Project 3.2.1 :2000 “ Development and Harmonisation of Measurement Uncertainty Principles. Part (4) protocol for uncertainty evaluation from validation data” 25 Vedi anche M:Thompson; Analyst ,2000;125; 2020-2025 36 UNI 9225:1988 (3.8);Punto 5“ Modello statistico”. ; ISO 5725-2:1994 Punto 4. 7” Nella pratica dei laboratori dell’ Agenzia, le prove di stima della precisione devono , se applicabile ( 2 meno , ad csenpo hes alt i metod empiri essere exept vsando materiale nel quale sia nota Tagua isurande peril citferenza | ~ m= scostarmento sitemaico del metodo,4 * nel solo laboratorio che ha sviluppato il metodo intemo o sta applicando per la prima volta il metodo normalizzato; * in diversi laboratori disponibili a partecipare a questo controllo. ‘Nel primo modo il laboratorio otterra, da n ripetizioni del procedimento di prova , un valore medio E=m+B (da cui perd non potrd conoscere né m/e neppure B ) ed una serie di n scarti aleatori: e/, €2, €3,.. en, da cui potra ricavare lo scarto tipo di ripetibilita, Sy ,al livello m. con ¥=15" xi (media aritmetica) ; Xi = valore di prova singole ; n= numero prove. ng ‘Lo scostamento di laboratorio, B, costante, non @ stimabile in quanto & conglobato in, Naturalmente, a seconda delle condizioni impiegate nelle n ripetizioni del procedimento sullo stesso campione, questi parametri riguarderanno la ripetibilita stretta o la ripetibilita intermedia, Nel secondo modo, il livello m rappresenta la media delle medie di tutti i p laboratori artecipanti,, mentre la media delle n prove eseguite da ciascun laboratorio sara data da: x, m+B, dove lo scostamento Bj del singolo laboratorio diventa uno scarto aleatorio. Da questi scarti aleatori Bj & possibile calcolare la corrispondente varianza interlaboratorio™ S21, sulla base della relazione 2 8 sy -% in cui $2 é la varianza delle medie delle ‘1 prove eseguite da ciascun laboratorio : Le : She =) (%, ~ ¥) Mo fi (p-)) p= numero dei laboratori ; ¥ = media delle medie, ed 2; é la media delle varianze di ripetibilita : * La varianza interlaboratorio rappresenta Ia varianza del recupero la cui conoscenza & importante nel caso in cui \Vespressione del risutato di prova preveda di tener conto del fattore di recupero e si debba stimare lincertezza del risultato stesso tenendo conto dei contribu di tipo B.15 ‘equindi, tenendo conto delle relazioni precedenti: Si=S24 (Js n ‘Naturalmente, il lavoro sopra descritto per ottenere Sy e SR al livello m, va ripetuto per ciascuno dei livelli in cui é stato ripartito il campo di misura del metodo, se il laboratorio & interessato a fornire informazioni di precisione, desunte da Sr ,¢ di incertezza, desunte da SR_, in tutto Vintervallo ¢ ‘non soltanto sul punto m. La stima della precisione deve essere eseguita in ogni caso, sia che il metodo, ufficiale o normato, Tiporti i valori della ripetibilita e della riproducibilita , sia che non Ii riporti, sia , infine » che si debba validare un metodo interno™. ‘Il parametro della precisione deve essere stimato nelle condizioni ‘sperimentali ed ambientali del laboratorio ove le prove vengono eseguite. Se il metodo ufficiale e/o normato riporta il dato della ripetibilita , deve essere dimostrato che il laboratorio & in condizione di garantire che lo scarto tipo di ripetibilita (s Jottenuto dalle n prove eseguite per stimarlo sia allineato a quello riportato nel metodo (). Se il metodo ufficiale riporta soltanto il dato della riproducibilitt e non fomisce alcuna altra informazione, pud essere valutato, caso per caso, se eseguire il confronto considerando che, in molti casi, il rapporto tra ripetibilita e riproducibilita é pari a 2/3. Se il metodo @ intemno,deve essere ugualmente dimostrato che il laboratorio & in condizione di garantire che lo scarto tipo di ripetibilith (s Jottenuto dalle n prove eseguite per stimarlo sia allineato a quello prefissato ( che viene ancora indicato con a) In allegato $ & riportata la tabella 1 (Prospetto 2 del Manuale UNICHTM 179/1 rif.3.I)riportante i limiti di confidenza minimi (p=0,025) e massimi (p=0,975) del rapporto s/o in funzione dei gradi di liberta v = n-1, dove né il numero delle prove . 1 valote di scarto tipo stimato s & ritenuto soddisfacente se il rapporto s/o _rientra nell'intervallo indicato in tabella , con una percentuale di rischio del 5% ( 1=0,05) Dalla tabella si osserva che con 10 prove ( n=10) tale rapporto & compreso tra circa 0,55 e circa 1,45, ossia il valore stimato va da circa la metd a circa una volta ¢ mezzo quello effettivo. Raddoppiando il numero di prove (n=20) 'intervallo passa da 0,69 a 1,31 , ossia diminuisce , ma non di molto. stima dello scarto tipo di ripetibilita formisce_il dato dell'incertezza tipo di ipetbilita ( contributo di tipo A nella stima dellincertezza tipo combinata) La stima della riproducbilita fornisce immediatamente il dato dellincertezza combinata_(contribut di tipo A e B)16 La esecuzione di jero_di 10-12 pro sepuire stima della precisi ta un ef ‘com tra l'esigenza di cont i costi e quella di ayere una buona stima di o, Se il valore del rapporto s/o risulta inferiore al valore minimo indicato in tabella, il laboratorio prima di accettare per soddisfacente il valore di s stimato, deve motivare perché ha ottenuto un valore di ripetibilita migliore di quello riportato nel metodo ufficiale™, Ripetibilita intermedia : Caso di un operatote che esegue almeno due prove ogni volta in giorni diversi( Carte di controllo del “Range”) Questo caso consente di ricavare simultaneamente sia il parametro della ripetibilit che quello della ripetibilita intermedia. Le prove devono essere programmate in modo da garantime Vesecuzione nei tempi previsti, ( disponibilita di materiale, operatore , apparecchiature ). Per avere dei risultati affidabili , & sufficiente prevedere un minimo di 10 determinazioni da eseguire in doppio in almeno dieci giomi successivi. Liintervallo di tempo interposto tra le prove in duplicato deve essere mantenuto costante e, ove applicabile, le prove devono quindi essere eseguite in giomi successivi. Poiché si opera in duplicato (n=2) non sono necessari test di normaliti o anomalia su ciascun gruppo di dati, mentre & nevessario controllare Momogeneité di dispersione dei risultati dei diversi gruppi (procedendo con la verfica di ‘Cochran ¢ con quella della varianza minima) ¢ Vomogeneith dei valori medi dei risultti di ciascun gruppo di prove ( utlizzando la verifica di Huber ), ‘etifica secondo Cochran. L'ipotesi che regge la verifica secondo Cochran considera che l'eventuale non omogeneitd Selle varianze dei risoltati dei diversi gruppi sia dovuta al valore molto elevato di una di esse rispetto alle ale ¢ si ‘perano quindi gli opportuni confront. Dopo aver eventualmente eliminato un gruppo dai dieci programmati , non & ‘opportuno eliminame un secondo in seguito alla verifica fatta sui 9 rimanenti senza operare alcuna preliminare verifica, ‘ui motivi della doppia esclusione. Verifica della varianza minima : L'ipotesi che regge questa verifica & speculare rispetto a quella di Cochran e vale ‘quindi quanto prima affermato, Controllati i risultati, si procede ai calcoli degli scarti tipo di ripetibilita 5, di ripetibilita intermedia Sjqp, considerando che 1a vatianza di ripetibilita intermedia $4,, & definita dalla telazione : 2 2 2 1 Stay =SnatS, = 8} Lhe 2 Ss 2 r Stuer) = Siucry ~ 7 °° tisultato ottenuto pud essere la conseguenza di un programma di miglioramento del metodo ufficiale, perseguito per corrispondere ad esigenze del cliente 0 ad indicazioni di legge ed attuato ad esempio ed attuato qualificando il personale , oppure usando una apparecchiatura migliore, oppure tenendo sot controllo le condizioni ambientali eee.