Universidad Autnoma de Chiapas

Facultad de Ciencias Qumicas

Campus IV

LABORATORIO DE GENETICA APLICADA

PRACTICA NO. 4

CORRIMIENTO ELECTROFORTICO DE DNA DE E. COLI

CATEDRATICO:

DR. KARINA TRUJILLO MURILLO

TAPACHULA CHIAPAS A 05 DE NOVIEMBRE DEL 2009

 INTRODUCCION
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de
los cidos nucleicos y protenas. La electroforesis nos ayuda a observar los cidos
nucleicos y protenas al final del procedimiento.

El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a

travs de un gel, La agarosa que es un polisacrido, cuyas disoluciones (tpicamente
de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C
y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o
trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio
lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar
molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos, en el cual, por accin de un
campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao o peso molecular. Para
controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un
patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes.
Estos pasos facilitan la visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las
cuales sern posteriormente analizadas e interpretadas.

La electroforesis en gel de agarosa es de las ms utilizadas para analizar y

caracterizar cidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como
un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y
forma. As, molculas de DNA de diferente tamao van a emigrar de forma distinta en
una electroforesis en gel de agarosa. Adems, si en dicha electroforesis se aplican
marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamao conocido) se puede
calcular el tamao aproximado del DNA en estudio.

En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso

de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo
al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se
analizan tanto molculas de ADN como protenas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN.

DNA plasmidico

Dibujo esquemtico de un plsmido en una bacteria: en rojo, el ADN del

cromosoma; en azul, los plsmidos.
Los plsmidos, vectores o tambin llamados plasmidios, son molculas de ADN
extracromosmico circular o lineal que se replican y transcriben independientes
del ADN cromosmico. Estn presentes normalmente en bacterias, y en
algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras, aparecen en
el citoplasma de las bacterias. Su tamao vara desde 1 a 250 pb. El nmero
de plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta
algunos cientos por clula.

Determinan ciertos rasgos, que no son vitales, pero que de alguna manera
determinan la capacidad del organismo para adaptarse. Estas molculas de
ADN portan solamente unos pocos genes que en cierto modo estn ligados al
cromosoma bacteriano, de forma que se replican en nmeros fijos, junto con
los cromosomas.

Las molculas de ADN plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble hlice
al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran
fuera de los mismos. Se han encontrado plsmidos en casi todas las bacterias.
A diferencia del ADN cromosomal, los plsmidos no tienen protenas
asociadas.

Poseen informacin gentica importante para las bacterias. Por ejemplo, los
genes que codifican para las protenas que las hacen resistentes a los
antibiticos estn, frecuentemente, en los plsmidos.

Hay algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de

insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentneamente el
cromosoma y se sitan en su interior, con lo cual, automticamente la
maquinaria celular tambin reproduce el plsmido. Cuando ese plsmido se ha
insertado se les da el nombre de episoma.

Los plsmidos se utilizan en ingeniera gentica por su capacidad de

reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal como as tambin
por que es relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas secuencias
genticas. Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o
dos genes que les confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar
clones recombinantes, los basados en fluorescencia o en protenas que
destruyen las clulas sin uso de antibiticos. Los plsmidos a menudo
contienen genes o paquetes de genes que le confieren una ventaja selectiva lo
cual les da la habilidad de hacer a la bacteria, resistente a los antibiticos.

Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un
origen de replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del ADN), lo
cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN
cromosomal. Los plsmidos de la mayora de las bacterias son circulares, pero
tambin se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente
los cromosomas de la mayora de eucariotes.
 RESULTADOS

Se utiliz un marcador de peso molecular de 500 pb

Se utiliz muestras de DNA de la bacteria E. coli

Se prepar un gel de agarosa al 0.8% (preparado con anterioridad)

Se utiliz un buffer de carga o jugo azul (naranja g, azul de bromofenol, xilencianol y

glicerol ) ya preparado por el catedrtico

Ya que corrieron las muestras se expusieron a luz UV y este fue el resultado

C A R R I L E S

1 11 12

500 pb
Marcador
De
Peso
Molecular

Carril 11: en este carril fue donde depositamos la muestra de la primer practica de extraccin
de DNA de E. coli, en la cual no hubo mucho crecimiento bacteriano y lo cual se vio reflejado
en el corrimiento porque no se noto en el gel de agarosa.

Carril 12: en este carril fue donde depositamos la muestra de la segunda practica de extraccin
de DNA de E. coli, en la cual si hubo crecimiento bacteriano y lo cual se vio reflejado en el
corrimiento porque si se noto en el gel de agarosa.

En todos los carriles hubo corrimiento del DNA de E. coli extrado en la segunda practica. Solo
en el ltimo equipo hubo corrimiento del DNA de E. coli de las dos extracciones.
En el primer equipo el corrimiento (que es el carril 1) fue mas notable por el motivo que el
crecimiento bacteriano fue mayor.
 DISCUSION
El marcador de peso molecular estuvo constituido por 1 L del marcador y 1 L del
buffer de carga, su rango era de 500 Pb

Las muestras de DNA de la bacteria E. coli estaban constituidas por 1 L muestra y 1 L

de buffer de carga

El buffer de carga o jugo azul estaba constituido por: naranja g, azul de bromofenol,
xilencianol y glicerol, este buffer nos indica donde va nuestra muestra mientras corre
en la cmara de electroforesis.

Se introdujo el gel en la cmara de electroforesis y se sumergieron a un volumen

aproximado de 5 mm sobre el con TBE 1x
 En cada pocito se agrego 2 L de la muestra con mucho cuidado para que no se saliera
fuera de ella o se rompiera el gel con las puntillas de las micropipetas.

Esta plstico de color negro se utiliza como

Recurso para poder ver en que pocito se
. Colocaran las muestras y los Marcadores de
PM.

Ya que se terminaron de agregar todas las muestras en sus respectivos pozos, se

procedi a cerrar la cmara de electroforesis cuidando de que los electrodos fueran
bien colocadas, ya que recordemos que el DNA tiene carga elctrica negativa y correr
hacia el nodo.

CATODO ANODO

Ya que se cerr correctamente la cmara se procede a prender el equipo, seleccionar

el voltaje deseado. Esto es muy importante pues recordemos que esta tcnica es
mediante una carga elctrica controlada
 Despus de que corri la muestra hasta donde queremos (se ve gracias al buffer de
carga), apagamos el equipo y procedemos a destapar la cmara electrofortica.
Sacamos los geles

Y los colocamos en el revelador, en este caso bromuro de etidio y dejamos los geles
aproximadamente 5 minutos. Precaucin: El bromuro de etidio es un carcingeno y
debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la solucin o tener
contacto directo con esta

Po ltimo examinamos el gel bajo la lmpara de luz ultravioleta para determinar la

posicin de las bandas en el gel.
 CONCLUSION

Pudimos realizar el corrimiento electrofortico de cidos nucleicos extrados y

purificados de la bacteria E. coli

Aprendimos de nuevo a preparar la cmara electrofortica y como colocar los

electrodos pues ya que la molcula de DNA tiene carga negativa.

Pudimos meter el gel de agarosa en bromuro de etidio