OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE PECTINA A PARTIR DE LA

CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma cacao L., SUBPRODUCTO DE

UNA INDUSTRIA CHOCOLATERA NACIONAL.

TRABAJO DE GRADO

Requisito parcial para optar al ttulo de:

QUMICO INDUSTRIAL.

Presentado por:

DIANA LUCA SUREZ ROZO.

DIANA MARCELA OROZCO GIRALDO.

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGA
ESCUELA DE QUMICA
PEREIRA
2014
 OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE PECTINA A PARTIR DE LA
CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma cacao L., SUBPRODUCTO DE
UNA INDUSTRIA CHOCOLATERA NACIONAL.

TRABAJO DE GRADO

Requisito parcial para optar al ttulo de:

QUMICO INDUSTRIAL.

Presentado por:

DIANA LUCA SUREZ ROZO.

DIANA MARCELA OROZCO GIRALDO.

Dirigido por:

phD. GLORIA EDITH GUERRERO ALVAREZ.

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGA
ESCUELA DE QUMICA
PEREIRA
2014
 NOTA DE ACEPTACION DEL TRABAJO DE GRADO

OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE PECTINA A PARTIR DE LA

CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma cacao L., SUBPRODUCTO DE
UNA INDUSTRIA CHOCOLATERA NACIONAL.

Presentado por:

DIANA LUCA SUREZ ROZO.

DIANA MARCELA OROZCO GIRALDO.

Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez
revisada la versin escrita y presenciando la sustentacin oral decidimos
otorgar:

La nota de: _____________________________

Con la connotacin: _____________________

Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy _________________

Director: __________________________
phD. Gloria Edith Guerrero lvarez
Doctora en Ciencias Qumica.

Jurado: ___________________________
Ing. Pablo Alejandro Pelez Marn.
Ingeniero Agrnomo.

3
DEDICATORIA

Volver a empezar no es fracasar,

Volver a empezar es concederse una
nueva oportunidad, retomar los sueos,
luchar por lo que se quiere, ser fiel a uno
mismo y buscar la felicidad.
No temas volver a empezar cada da es
una nueva oportunidad.
Maktub

4
 AGRADECIMIENTOS

Primero agradecemos a Dios por permitirnos concluir esta etapa tan importante de
nuestras vidas y poder aplicar todo el conocimiento adquirido en la carrera
profesional, en pro de contribuir a una industria sostenible amigable con el
ambiente.

A nuestras familias por su apoyo incondicional, contribucin financiera en estos

aos de formacin y motivacin continua.

A nuestra directora de trabajo de grado Gloria Edith Guerrero por brindarnos la

oportunidad de realizar el trabajo de grado dentro de su grupo de investigacin,
por el apoyo otorgado en este tiempo y participacin continua en la elaboracin del
estudio realizado.

A la industria chocolatera nacional por facilitarnos la cascarilla de cacao, producto

matriz de nuestro estudio.

A nuestro evaluador Pablo Alejandro Pelez por su colaboracin y aporte en

conocimiento.

Al profesor Carlos Humberto Montoya por permitirnos y facilitarnos el uso de

equipos e instalaciones necesarios para el estudio realizado.

A la Escuela de Tecnologa Qumica, profesores y administrativos, por los

conocimientos brindados y facilitarnos el espacio propicio para el desarrollo de
nuestra carrera.

5
 RESUMEN

En la presente investigacin se obtuvo y caracteriz la pectina de la cascarilla de

Theobroma Cacao L. procedente de una industria chocolatera de la regin. Se
establecieron los parmetros de extraccin adecuados aplicando un diseo
factorial 22. La extraccin de pectina se realiz mediante una hidrlisis cida con
cido ctrico a pH 3, a una temperatura de 70C y tiempo de 95 minutos. La
pectina obtenida present caractersticas qumicas de bajo metoxilo con 3.4%,
0,43meq/g de acidez Libre, 2335mg/meq peso equivalente y grado de
esterificacin del 71,8%. Se determin fenoles totales por Follin- Ciocalteu,
presentando un contenido de 9.68%, 42,03% de carbohidratos totales por el
mtodo de Dubois-Giles y 36.6% de cido D-Galacturnico por CLAE. Se le
realiz anlisis proximal y se estudi su capacidad de formar geles a pH bajo, alto
contenido de sacarosa y presencia de iones de calcio.

Palabras claves: Theobroma cacao L, Pectina, Metoxilo, cido D-Galacturnico,

Acidez Libre, Peso Equivalente, Anlisis Proximal, Esterificacin, Cromatografa
Liquida de Alta Eficiencia (CLAE).

6
 ABSTRACT

In the present investigation was obtained and characterized pectin husk

(Theobroma Cacao L.) from a chocolate industry in the region. The extraction
parameters using a factorial design 22. The pectin extraction was using hydrolysis
with acid citric acid to pH 3, at a temperature of 70 C and time of 95 minutes was
established. Pectin obtained had low methoxyl chemical characteristics with 3.4%
0,43meq /g of free acid, 2335mg / meq equivalent weight and degree of
esterification of 71.8%. Total phenolics were determined by Follin- Ciocalteu,
having a content of 9.68%, 42.03% g total carbohydrate by the method of Dubois-
Giles and 36.6% of D-galacturonic acid by HPLC. It was realized proximate
analysis and the ability to form gels at low pH, and high sucrose content presence
of calcium ions was studied.

Keywords: Theobroma cacao L, Pectin, methoxy, D-Galacturonic acid, free acid,

equivalent weight, proximal analysis, esterification, High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).

7
 TABLA DE CONTENIDO.

Pg.

NOTA DE ACEPTACION DEL TRABAJO DE GRADO ......................................... 3

DEDICATORIA ....................................................................................................... 4

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................ 5

RESUMEN.............................................................................................................. 6

TABLA DE CONTENIDO. ...................................................................................... 8

INDICE DE TABLAS ............................................................................................ 13

NDICE DE FIGURAS .......................................................................................... 14

NDICE DE ANEXOS ........................................................................................... 16

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................... 17

2. INTRODUCCIN. .......................................................................................... 18

3. OBJETIVOS. ................................................................................................. 21

3.1 OBJETIVO GENERAL. .................................................................................. 21

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS. ......................................................................... 21

4. MARCO DE ANTECEDENTES. .................................................................... 22

5. MARCO TEORICO. ....................................................................................... 24

5.1 GENERALIDADES DEL Theobroma Cacao L. ............................................. 24

5.1.1 FENOLOGA Theobroma cacao L. ........................................................... 24
5.1.1.1. El rbol. ............................................................................................ 24
5.1.1.2. Flores............................................................................................... 24
5.1.1.3. Fruto. ................................................................................................ 25
5.1.1.5. Semillas. .......................................................................................... 25

8
 5.1.2 TIPOS DE CACAO. .................................................................................. 25
5.1.2.1 Cacao Criollo. .................................................................................... 25
5.1.2.2 Cacao Forastero. ............................................................................... 26
5.1.2.3 Cacao Trinitario. ................................................................................ 26
5.1.3 PRODUCCIN DEL CACAO. .................................................................. 27
5.1.3.1 Produccin mundial de cacao. ........................................................... 27
5.1.3.2 Produccin del cacao en Colombia. ................................................... 28
5.1.4 PRODUCTOS DERIVADOS DEL Theobroma Cacao L. .......................... 29
5.1.5 DESECHOS DE LA PRODUCCIN DE DERIVADOS DEL CACAO. ....... 30
5.1.5.1 Cscara. ............................................................................................ 30
5.1.5.2 Cascarilla. ......................................................................................... 30

5.2 La PECTINA. ................................................................................................. 31

5.2.1 RESEA HISTRICA. ............................................................................. 31
5.2.2 LOCALIZACIN BIOLGICA DE LA PECTINA. ...................................... 32
5.2.3 ESTRUCTURA QUMICA DE LA PECTINA ............................................. 33
5.2.3.1 Cadenas principales de la pectina. .................................................... 34
5.2.3.1.1 La Homogalacturonana (HG)....................................................... 34
5.2.3.1.2 La Ramnogalacturonana I (RG-I). ............................................... 34
5.2.3.1.3 La Ramnogalacturonana II (RG-II)............................................... 35
5.2.3.2 Cadenas secundarias de la pectina. .................................................. 35
5.2.3.2.1 Arabinana (ARA). ........................................................................ 35
5.2.3.2.2 Xilogalacturona (XGA). ................................................................ 36
5.2.3.2.3 Arabinogalactana I (ARA-I) .......................................................... 36
5.2.4 CLASIFICACION DE LA PECTINA. ......................................................... 37
5.2.4.1 Pectinas de Bajo Metoxilo (LM). ........................................................ 37
5.2.4.2 Pectinas de Alto Metoxilo (HM). ......................................................... 38
5.2.4.3 Pectinas de Bajo Metoxilo Amidadas. ................................................ 39
5.2.5 CLASIFICACION DE LAS SUSTANCIAS PECTICAS. ............................ 39
5.2.5.1 Protopectinas. .................................................................................... 39
5.2.5.2 cidos Pectnicos............................................................................... 39
5.2.5.3 Pectinas. ............................................................................................ 40
5.2.5.4 cidos Pcticos. ................................................................................ 40
5.2.6 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LA PECTINA. ...................... 40
5.2.6.1 Solubilidad. ........................................................................................ 40
5.2.6.2 Viscosidad. ........................................................................................ 40
5.2.6.3 Acidez. ............................................................................................... 41
5.2.6.4 Poder de Gelificacin. ........................................................................ 41
5.2.6.5 Peso molecular. ................................................................................. 41
5.2.6.6 Accin de agentes qumicos, fsicos y bioqumicos. ........................... 41
5.2.6.6.1 Accin de los cidos. ................................................................... 42
5.2.6.6.2 Accin de las bases. ................................................................... 42
5.2.6.6.3 Accin de las enzimas. ............................................................... 42
5.2.7 IMPORTANCIA Y APLICACIN INDUSTRIAL DE LA PECTINA. ............ 43
5.2.7.1 Aplicaciones en la industria alimenticia. ............................................. 43

9
 5.2.7.2 Aplicaciones en la industria farmacutica. ......................................... 43

5.3 FUNDAMENTOS TERICOS DE LAS TCNICAS DE ANLISIS

APLICADAS. ........................................................................................................ 44
5.3.1. PESO EQUIVALENTE (PE) Y ACIDEZ LIBRE (AL). ............................... 44
5.3.2 PORCENTAJE DE METOXILO (ME), PORCENTAJE DE CIDO
ANHIDRIDO GALACTURNICO (AAG) Y GRADO DE ESTERIFICACIN (GE).
.......................................................................................................................... 45
5.3.2 CUANTIFICACIN DE FENOLES TOTALES POR EL MTODO DE
FOLIN CIOCALTEAU. ..................................................................................... 47
5.3.3 DETERMINACIN DE AZCARES. ........................................................ 47
5.3.3.1 Anlisis cualitativo por el mtodo de Fehling o Benedict. ................... 47
5.3.3.2 Anlisis cuantitativo por el mtodo de Fenol-Sulfrico. ...................... 48
5.3.4 CROMATOGRAFA. ................................................................................. 50
5.3.4.1 Cromatografa de Capa Delgada (CCD). ........................................... 50
5.3.4.2 Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (CLAE). .............................. 50
5.3.4.2.1 Tipos de separacin por Cromatografa Liquida. ......................... 50
5.3.6 ANALISIS ESTADSTICO. ....................................................................... 51
5.3.6.1 Anova de Dos Factores. .................................................................... 51
5.3.6.2 Media Aritmetica. ............................................................................... 52
5.3.6.3 Desviacin Estndar. ......................................................................... 52
5.3.6.4 Coeficiente De Correlacin (R2). ........................................................ 52

6. METODOLOGA ........................................................................................... 53

6.1 MATERIAL VEGETAL. .................................................................................. 53

6.1.1 PRETRATAMIETO DE LA MUESTRA. .................................................... 53
6.1.1.1 Desengrase de la cascarilla de cacao del Theobroma cacao L. ......... 53
6.1.1.2 Limpieza de la cascarilla de cacao del Theobroma cacao L............... 54

6.2 EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE PECTINAS DE LA CASACRILLA DE

CACAO DEL Theobroma Cacao L . ................................................................... 54
6.2.1 Extraccin de Pectina mediante hidrlisis cida. ...................................... 54
6.2.2 Purificacin y secado de la Pectina Del Theobroma Cacao L. .................. 56

6.3 CARACTERIZACIN QUMICA Y FSICA DE LA PECTINA DE LA

CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L....................................... 56
6.3.1 DETERMINACIN DEL PESO EQUIVALENTE (PE) Y ACIDEZ LIBRE
(AL). .................................................................................................................. 56
6.3.2 PORCENTAJE DE METOXILO (ME), GRADO DE ESTERIFICACIN
(GE) Y PORCENTAJE DE CIDO ANHIDRIDO GALACTURNICO (AAG). .... 57
6.3.3 GRADO DE GELIFICACIN (GG). .......................................................... 57
6.3.4 VISCOSIDAD DE LA PECTINA. ............................................................... 57

10
6.4 COMPOSICIN DE LA PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL
THEOBROMA CACAO L. .................................................................................... 58
6.4.1 DETERMINACIN DE FENOLES TOTALES POR FOLIN-CIOCALTEAU
DE LA PECTINA Theobroma Cacao L . ............................................................ 58
6.4.1.1 Tratamiento de la pectina para anlisis. ............................................. 58

6.4.2 DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS PRESENTES DE LA PECTINA

Theobroma Cacao L . ......................................................................................... 59
6.4.2.1 Determinacin cuantitativa de los carbohidratos totales por Dubois... 59
6.4.2.1.1 Tratamiento de la pectina para anlisis. ...................................... 59
6.4.2.2 Prueba de Fehling.............................................................................. 59
6.4.2.3 Identificacin cualitativa de carbohidratos por Cromatografa de Capa
Delgada (CCD). ............................................................................................. 60
6.4.2.4 Identificacin del cido D-Galacturnico presente de la pectina por
Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (CLAE). ......................................... 60
6.4.2.4.1 Anlisis cualitativo. ...................................................................... 60
6.4.2.4.2 Anlisis cuantitativo. .................................................................... 61
6.4.2.5 Identificacin de Grupos Funcionales por Espectroscopa Infrarroja
(IR). ............................................................................................................... 61

6.7 ANLISIS PROXIMAL. .................................................................................. 61

6.7.1 HUMEDAD (H). ........................................................................................ 61
6.7.2 CENIZAS.................................................................................................. 61
6.7.3 GRASAS. ................................................................................................. 62
6.7.4 FIBRA. .................................................................................................... 62
6.7.5 PROTENAS. ........................................................................................... 62

6.8 ANLISIS ESTADSTICO. ............................................................................. 62

7 RESULTADOS Y DISCUSION. ......................................................................... 63

7.1 DESCRIPCIN DE LA CASCARILLA DE Theobroma Cacao L.................. 63

7.2 EXTRACCIN DE PECTINA DEL CACAO DEL Theobroma Cacao L. ........ 64

7.2.1 ENSAYOS PRELIMINARES DE EXTRACCIN DE LA PECTINA DEL
CACAO DEL Theobroma Cacao L. ................................................................... 64
7.2.2 EXTRACCIN DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL
Theobroma Cacao L. APLICANDO DISEO FACTORIAL 22............................ 68
7.2.2.1 Prueba de Normalidad. ...................................................................... 70
7.2.2.2 ANOVA de dos factores. .................................................................... 71

7.3 ANLISIS CARACTERIZACIN QUMICA DE LA PECTINA EXTRADA DE

LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L. ................................. 76
7.3.1 ACIDEZ LIBRE (AL) Y PESO EQUIVALENTE (PE). ............................... 76

11
 7.3.2 CONTENIDO DE CIDO GALACTURNICO, METOXILO Y GRADO DE
ESTERIFICACIN. ........................................................................................... 77
7.3.3 ANLISIS DETERMINACIN DE FENOLES TOTALES POR EL MTODO
DE FOLLIN- CIOCALTEU DE LA PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO
DEL Theobroma Cacao L. ................................................................................. 78
7.3.4. ANLISIS CUANTITATIVO DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS
TOTALES POR EL MTODO DE DUBOIS-GILES. .......................................... 79
7.3.5 ANLISIS CUALITATIVO DE AZCARES REDUCTORES POR MEDIO
DE LA PRUEBA DE FEHLING. ......................................................................... 80
7.3.6 ANLISIS CUALITATIVO DE IDENTIFICACIN DE AZCARES POR
CROMATOGRAFA DE CAPA DELGADA (CCD) DE LA PECTINA DE
ESTUDIO. ......................................................................................................... 80
7.3.7 ANLISIS CUALITATIVO POR CLAE DE CIDO D-GALACTURNICO
DE LA PECTINA ............................................................................................... 81
7.3.8 ANLISIS CUANTITATIVO POR CLAE DE CIDO D-GALACTURNICO
DE LA PECTINA ............................................................................................... 82
7.3.8.1 Linealidad de la curva de calibracin del estndar de cido
galacturnico. ................................................................................................ 83
7.3.8.2 Precisin ........................................................................................... 83
7.3.8.3 Cuantificacin de cido D-Galacturnico presente en la pectina de la
cascarilla de cacao (Theobroma cacao L.). .......................................................... 84

7.4 ANLISIS INFRARROJO DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO

(Theorboma Cacao L.). ....................................................................................... 85

7.5 ANLISIS CARACTERIZACIN FSICA DE LA PECTINA EXTRADA DE LA

CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L........................................ 87
7.5.1 VISCOSIDAD RELATIVA DE LA PECTINA.............................................. 87
7.5.2 GELIFICACIN DE LA PECTINA. ........................................................... 88

7.6 ANLISIS PROXIMAL ................................................................................... 89

8 CONCLUSIONES .............................................................................................. 90

9 RECOMENDACIONES...................................................................................... 92

10 BIBLIOGRAFA. .............................................................................................. 93

ANEXOS. ........................................................................................................... 100

12
 INDICE DE TABLAS

Pg.

TABLA 1. PRODUCCIN NACIONAL DE CACAO . .......................................................... 28

TABLA 2 CONDICIONES DE SEPARACIN POR CLAE DEL CIDO D-
GALACTURNICO. ..................................................................................................... 60
TABLA 3 PRINCIPALES CARACTERSTICAS DE LA CASCARILLA DE Theobroma
Cacao L. ESTUDIADA. ................................................................................................ 63
TABLA 4. RESULTADOS DEL ANLISIS PRELIMINAR DE LA PECTINA EXTRADA DE
LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L........................................... 65
TABLA 5 RESULTADOS DE LAS CARACTERSTICAS QUMICAS EVALUADAS A LA
PECTINA EXTRADA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L.,
APLICANDO EL DISEO FACTORIAL 22. ................................................................. 69
TABLA 6. PRUEBA DE NORMALIDAD DE LAS DIFERENTES TEMPERATURAS DE
EXTRACCIN DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma
Cacao L. ....................................................................................................................... 70
TABLA 7. PRUEBA DE HOMOGENEIDAD DE VARIANZA. .............................................. 71
TABLA 8. ANOVA DE DOS FACTORES PARA CARACTERSTICAS QUMICAS EN LAS
CONDICIONES DE EXTRACCIN DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO
Theobroma Cacao L. ................................................................................................... 71
TABLA 9. CONTINUACIN ANOVA DE DOS FACTORES PARA CARACTERSTICAS
QUMICAS EN LAS CONDICIONES DE EXTRACCIN DE PECTINA DE LA
CASCARILLA DE CACAO Theobroma Cacao L. ....................................................... 72
TABLA 10 MEDIAS CARACTERSTICAS QUMICAS EN INTERACCIN ENTRE
TEMPERATURA-TIEMPO ........................................................................................... 74
TABLA 11. CORRELACIN ENTRE EL CONTENIDO DE METOXILO Y CONTENIDO DE
CIDO GALACTURNICO. ........................................................................................ 75
TABLA 12 ANLISIS DE ACIDEZ LIBRE Y PESO EQUIVALENTE DE LA PECTINA DE
LA CASCARILLA DE CACAO DEL Tehobroma Cacao L........................................... 76
TABLA 13 ANLISIS CONTENIDO DE CIDO GALACTURNICO, METOXILO Y
GRADO DE ESTERIFICACIN DE PECTINA. .......................................................... 77
TABLA 14 CONCENTRACIN DE FENOLES TOTALES DE LA PECTINA DE LA
CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L. ............................................... 78
TABLA 15 CONCENTRACIN CARBOHIDRATOS TOTALES DE LA PECTINA. ........... 79
TABLA 16 RF DE ESTNDARES Y PECTINA HIDROLIZADA. ....................................... 81
TABLA 17 RESUMEN MODELO DE REGRESIN LINEAL DEL ESTNDAR DE CIDO
GALACTURNICO POR CLAE. ................................................................................. 83
TABLA 18 REPETITIVIDAD DEL ESTNDAR DE CIDO D-GALACTURNICO. .......... 83
TABLA 19 REPRODUCIBILIDAD DEL ESTNDAR DE CIDO D-GALACTURNICO. .. 84
TABLA 20 CONCENTRACIN DEL CIDO D-GALACTURNICO PRESENTE EN LA
PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L.................... 84
TABLA 21. VISCOSIDAD Y PESO MOLECULAR DE LA PECTINA EXTRADA DE LA
CASCARILLA DE CACAO Theobroma Cacao L. ....................................................... 87
TABLA 22 RESULTADOS DEL GRADO DE GELIFICACIN DE LA PECTINA DE LA
CASCARILLA DE CACAO (Theobroma Cacao L.) ..................................................... 88
TABLA 23 RESULTADOS DE ANLISIS PROXIMAL DE LA PECTINA EXTRADA DEL
CACAO DEL Theobroma Cacao L. ............................................................................. 89

13
 NDICE DE FIGURAS

FIGURA 1 RBOL Theobroma Cacao L. ......................................................................................... 24

FIGURA 2 FLOR Theobroma Cacao L............................................................................................ 24
FIGURA 3 FRUTO Theobroma Cacao L. ......................................................................................... 25
FIGURA 4 SEMILLA Theobroma Cacao L. ...................................................................................... 25
FIGURA 5 CACAO CRIOLLO ......................................................................................................... 26
FIGURA 6 CACAO FORASTERO .................................................................................................... 26
FIGURA 7 CACAO TRINITARIO...................................................................................................... 26
FIGURA 8 PRODUCCIN DE CACAO EN AMRICA (2008-2013) ................................................ 27
FIGURA 9 DIAGRAMA DE PRODUCCIN DE LOS DERIVADOS DEL CACAO. ......................... 29
FIGURA 10 CASCARA DE CACAO DESECHADA. ........................................................................ 30
FIGURA 11 CASCARILLA DE CACAO. ........................................................................................... 31
FIGURA 12 ESTRUCTURA DE LA PARED CELULAR PRIMARIA ................................................. 33
FIGURA 13 ESTRUCTURA DEL CIDO -D-GALACTURNICO ................................................. 34
FIGURA 14 REPRESENTACIN SIMPLIFICADA DE LA ESTRUCTURA DE
RAMNOGALACTURONANAS ................................................................................................. 35
FIGURA 15 REPRESENTACIN SIMPLIFICADA DE LA ESTRUCTURA ...................................... 36
FIGURA 16 REPRESENTACIN SIMPLIFICADA DE LA ESTRUCTURA DE
ARABINOGALACTANAS I ...................................................................................................... 36
FIGURA 17 (A Y B) ALTERNATIVAS PARA REPRESENTAR LA CADENA PCTICA. ................. 37
FIGURA 18 PECTINAS DE BAJO NDICE DE METOXILO ............................................................ 38
FIGURA 19 PECTINA DE ALTO NDICE DE METOXILO (HM) ...................................................... 38
FIGURA 20. PECTINA DE BAJO METOXILO AMIDADA ................................................................ 39
FIGURA 21. REACCIN DE LA MOLCULA DE CIDO D-GALACTURNICO CON NAOH. ...... 44
FIGURA 22. REACCIN Y MECANISMO DE SAPONIFICACIN DEL CIDO D-
GALACTURNICO [53]. ......................................................................................................... 46
FIGURA 23. ESTRUCTURA DE LOS IONES TARTRARO Y CITRATO ......................................... 48
FIGURA 24. REACCIN DE AZCAR REDUCTOR CON REACTIVO DE FEHLING O BENEDICT
................................................................................................................................................ 48
FIGURA 25. A) Y B) REACCIONES DE DESHIDRATACIN Y CONDENSACIN DE HEXOSAS Y
PENTOSAS POR EL MTODO DE DUBOIS .......................................................................... 49
FIGURA 26 CASCARILLA DE CACAO DEL THEOBROMA CACAO L. .......................................... 53
FIGURA 27. CASCARILLA DE CACAO DEL THEOBROMA CACAO L. MOLIDA. ......................... 53
FIGURA 28. MONTAJE EXTRACCIN SOXHLET PARA DESENGRASE. .................................... 54
FIGURA 29 MONTAJE EXTRACCIN DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL
Theobroma Cacao L. MEDIANTE REFLUJO. ......................................................................... 55
FIGURA 30. PRECIPITACIN DE LA PECTINA CON ETANOL. .................................................... 55
FIGURA 31. SECADO POR CONVECCIN DE LA PECTINA. ....................................................... 56
FIGURA 32. VIRAJE EN EL COLOR DE LA SOLUCIN PCTICA. ............................................... 57
FIGURA 33 TRIPLICADO DE LA SOLUCIN PCTICA EN LA DETERMINACIN DE FENOLES
TOTALES. ............................................................................................................................... 58
FIGURA 34. PATRONES PARA CURVA DE DUBOIS. ................................................................... 59
FIGURA 35 CASCARILLA DE CACAO Theobroma Cacao L. ......................................................... 63
FIGURA 36 PECTINA OBTENIDA DEL CACAO (Theobrama Cacao L.), APLICANDO EL
PARMETRO DE EXTRACCIN A, TEMPERATURA DE 95C-100MINUTOS..................... 66
FIGURA 37. PECTINA OBTENIDA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobrama Cacao L.,
APLICANDO EL PARMETRO DE EXTRACCIN B, TEMPERATURA DE 95 C Y 95
MINUTOS. ............................................................................................................................... 66
FIGURA 38. PECTINA OBTENIDA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobrama Cacao L.
APLICANDO EL PARMETRO DE EXTRACCIN C, TEMPERATURA DE 80 C Y 85
MINUTOS. ............................................................................................................................... 67

14
FIGURA 39. PECTINA OBTENIDA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobrama Cacao L.,
APLICANDO EL PARMETRO DE EXTRACCIN D, TEMPERATURA DE 70 C Y 75
MINUTOS. FUENTE: AUTORAS ............................................................................................ 67
FIGURA 40 PRUEBA DE FEHLING PARA LA HIDROLISIS DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE
CACAO DEL Theobroma Cacao L. ......................................................................................... 80
FIGURA 41 CROMATOPLACA DE ESTNDARES DE AZCAR E HIDROLIZADO DE LA
PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L. ................................ 80
FIGURA 42 CROMATOGRAMA ESTNDAR DE CIDO D- GALACTURNICO. .......................... 81
FIGURA 43 CROMATOGRAMA MUESTRA DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO
(Theobroma Cacao L.)............................................................................................................. 82
FIGURA 44 A) Y B) ESPECTROS INFRARROJO DE PECTINA ESTUDIADA Y COMERCIAL. .... 86
FIGURA 45 RESULTADOS DEL ANLISIS DEL GRADO DE GELIFICACIN DE LA PECTINA
ESTUDIADA. ........................................................................................................................... 88
FIGURA 46 GELIFICACIN DE LA PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO (Theobroma
Cacao L.) EN PRESENCIA DE CALCIO. ................................................................................ 89

15
 NDICE DE ANEXOS

ANEXO 1 CURVA DE CALIBRACIN DE FENOLES TOTALES POR FOLIN-

CIOCALTEU. .............................................................................................................. 100
ANEXO 2 CURVA DE CALIBRACIN DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR DUBOIS-
GILES. ........................................................................................................................ 100
ANEXO 3 CURVA DE CALIBRACIN DEL CIDO D-GALACTURNICO POR CLAE. 101
ANEXO 4. TABLA CONSTANTES DEL BULBO C Y D DEL VISCOSMETRO OSTWALD.
.................................................................................................................................... 101
ANEXO 5 ECUACIN PARA CALCULAR EL PESO MOLECULAR DE UNA SUSTANCIA
PCTICA. ................................................................................................................... 101
ANEXO 6. RESULTADOS DE ANLISIS PROXIMAL DE LA PECTINA EXTRADA DE LA
CASCARILLA DE CACAO (Theobroma Cacao L.). .................................................. 102

16
 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

Las pectinas son productos qumicos que se obtienen de materias primas

vegetales, principalmente frutas, se usan en varias industrias, especialmente la de
alimentos, para darle propiedades de gel a los productos y como estabilizantes. La
pectina es un producto tecnolgicamente funcional de inters para la industria de
alimentos, debido a que sus propiedades reolgicas son favorables para la
elaboracin de diferentes productos aportando textura y consistencia [1]. Teniendo
en cuenta la importancia que tienen las pectinas y conociendo que la cascarilla de
cacao es el principal subproducto (en abundancia) de la industria productora de
chocolate, el cual representa el 10% por cada tonelada de semilla seca, adems
que los diferentes usos (como obtencin de fibra, componente para alimentos de
animales de granja, compostaje, entre otro) han sido limitados debido a
propiedades qumicas de las cascarillas, tales como el contenido de alcaloides,
siendo un grave problema para las industrias otorgarles una disposicin final , por
lo cual se plantea: Ser posible obtener pectinas de la cascarilla de cacao con
propiedades fsicas y qumicas aptas para la industria alimenticia que permitan
darle un valor agregado a este subproducto? [2].

17
 2. INTRODUCCIN.

La especie vegetal del cacao, ha sido llamado Theobroma cacao L. por el botnico
Caroulus Lineo quien fue el primero en clasificarla [3], es una planta de origen
americano, sin embargo debido al sistema nmada llevado a cabo por los
primeros habitantes de este continente, es prcticamente imposible decir cual fue
especficamente el lugar de origen; los estudios de Pound Cheesman 1, sugieren
que el cacao es originario de Amrica del Sur, en el rea del alto Amazonas,
comprendido por pases como Colombia, Ecuador, Per y Brasil, los cuales tras su
descubrimiento y colonizacin permitieron su distribucin a las dems reas
habitadas del planeta, comenzando su comercializacin y uso [4] .

Colombia, un pas de biodiversidad gracias a su ubicacin geogrfica y

caractersticas topogrficas, basa su economa especialmente en el sector
agropecuario. Este pas tropical, situado sobre la lnea ecuatorial presenta
condiciones incomparables para la siembra del cacao, en una interesante variedad
de sistemas agroecolgicos, otorgndole gran potencial para el desarrollo del
mismo, tales como temperaturas medias altas, entre los 23-28C, precipitaciones
distribuidas a lo largo del ao de 1500-2500mm, que otorgan una humedad
relativa entre el 70-80%, en zonas ubicadas entre 0 y 1000 m. sobre el nivel del
mar [5]. Hoy por hoy el sector cacaotero colombiano, de las 3.4 millones de
hectreas destinadas al sector agrcola [6], cuenta con unas 125 mil hectreas
para al cultivo de cacao, produciendo alrededor de 40 mil toneladas y exportando
2500 toneladas promedio anual [7]. Segn datos de La Fundacin Mundial del
Cacao, el sector cacaotero est en apogeo, por lo tanto se espera un crecimiento
en los prximos aos del 2,2% por ao, debido al aumento en el consumo de los
productos derivados del cacao, estipulando necesitar 80 mil toneladas anuales del
fruto para satisfacer la demanda otorgada por los consumidores [8].

El grano de cacao es materia prima para las industrias de confitera, productoras

de chocolate, cosmtico y farmacutico; su cadena de produccin est
comprendida bsicamente por tres tipos de bienes,:1-Primarios, constituidos por el
cacao en grano; 2-intermediarios, generados por la manteca (ampliamente
utilizado en los productos cosmticos debido a su capacidad humectante), polvo
(ingrediente de diferentes alimentos que requieran el sabor y olor del chocolate),
licor (usado para la produccin de chocolates y coberturas) y pasta de cacao; 3-
finales, constituido por el chocolate para mesa y confites [9]. A los productos
derivados del cacao se le atribuyen (adems de agradable olor y sabor) beneficios
como propiedades antioxidantes, disminuyen el colesterol LDL (el cual bloquea las
arterias desarrollando la aterosclerosis) gracias a su contenido en polifenoles,
adems posee un gran valor energtico [3], entre otros aspectos.

1
PAREDES, Alfredo; ENRIQUEZ, Gustavo (1983); EL CULTIVO DEL CACAO. Segunda Edicin. Tema I Historia del caco
y chocolate, p. 11

18
Toda agroindustria en el desarrollo de las etapas del proceso genera residuos, los
cuales algunos por sus propiedades fsicas y qumicas pueden ser usados como
insumos en la produccin de compuestos tiles en otros procesos industriales,
para lo cual deja de ser residuo y es denominado subproducto [10]. Hoy en da,
las cascarillas son el principal subproducto de la industria del cacao; en Colombia
estas representan un grave problema, debido a que otorgarles una disposicin
final resulta ser costoso para las industrias cacaoteras nacionales, aunque se ha
establecido su uso como compostaje en las plantaciones, aprovechando la
presencia de agentes antibacterianos en los extractos de la cascarilla [11],tambin
como alimento para el ganado, sin embargo el contenido de teobromina (alcaloide)
restringe la proporcin en la cual puede ser consumida, por lo que su uso ha sido
limitado (este alimento puede constituir el 20% de una racin para aves de corral,
de 30-50% para cerdos, y 50% para ovejas, cabras y ganado lechero), en
continentes como frica se le ha aprovechado el contenido de sales de potasio (3-
4% sobre base seca), usando las cenizas para fabricar jabn en pases como
Ghana y Nigeria, sin embrago no es atractivo para los consumidores occidentales
[2].
Cada tonelada de semilla seca representa cerca de 10 toneladas de cascarilla de
cacao [2], aunque se han establecido procesos para obtener utilidades de la
misma, las soluciones dadas no satisfacen en su totalidad, debido a la gran
cantidad de cascarilla generada, la cual va en aumento por las iniciativas de
consumo, en busca de otras alternativas se establece la obtencin de sustancias
como la pectina.

La pectina, es un polisacrido compuesto de una cadena lineal de molculas de

cido D-galacturnico, es un producto natural que est presente en la piel de
todos los vegetales, especialmente en las frutas, siendo el principal responsable
de su textura, posee propiedades de gelificacin en presencia de cidos y azcar
[1], por ende se utiliza principalmente en la industria alimenticia para la
preparacin de jaleas, mermeladas y otros productos [12], adems tambin es
ampliamente usada en la industria farmacutica, ya que posee propiedades
hidrocoloidales, teraputicas y aumentan la accin de los principios activos, se
caracteriza por ser antidiarreica, permitiendo la asimilacin de alimentos como los
lcteos por infantes, ya que cumple un papel de protector y regulador del sistema
gastrointestinal [13]. Las propiedades fsicas y qumicas de las pectinas, permiten
clasificarlas en alto o bajo Grado de Metilacin, el cual se refiere a la esterifiacin
de los grupos carboxilos por radicales metilo de acuerdo a su contenido en
metoxilo, es de mayor grado si supera al 7%, lo cual influye en el poder gelificante,
es decir, una pectina con un grado de metilacin alto posee mayor facilidad para
formar geles; el peso molecular de las pectinas es variable y depende del nmero
de molculas de cido D-galacturnico que la formen, interfiriendo en la
resistencia de los geles (a un mayor nmero se permite la formacin de geles ms
resistentes) [14], por otro lado las pectinas poco esterificadas necesitan valores
muy bajos de pH o presencia de calcio en el medio para poder gelificar [15].

19
Debido a la posibilidad de extraer 10 gramos de pectina por cada 100 gramos de
cascarilla de cacao [16], y mediante la evaluacin de las caractersticas fsicas y
qumicas de la pectina obtenida, se podra concebir el uso de la misma en la
industria alimenticia y farmacutica, permitiendo disminuir el volumen de
cascarilla, otorgndole una disposicin final viable a este subproducto y a su vez
darle un valor agregado, que beneficie ampliamente la economa de los
empresarios y cultivadores en pro de un desarrollo sostenible.

20
 3. OBJETIVOS.

3.1 OBJETIVO GENERAL.

Obtener y caracterizar pectina a partir de la cascarilla de cacao subproducto

generado en una industria chocolatera nacional, con el fin de contribuir al
desarrollo sostenible del sector y otorgarle un valor agregado.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS.

Implementar un mtodo de extraccin de pectina a partir de la cascarilla de

cacao generada por una industria cacaotera nacional.

Realizar el anlisis proximal (humedad, cenizas, grasas y protenas totales) de

la pectina obtenida, con el fin de estimar su valor nutricional.

Evaluar las principales caractersticas fsicas y qumicas de la pectina

obtenida, comparando resultados con reportes de otros autores.

21
 4. MARCO DE ANTECEDENTES.

Segn la revisin bibliogrfica realizada hasta la fecha, a nivel nacional se

encontraron algunas investigaciones en Colombia enfocadas hacia el anlisis y
caracterizacin de pectina de la cascarilla de cacao. De los que se citan los
siguientes estudios:

1. Determinacin del contenido de pectina en seis materiales de la cascara

de cacao. Caldas 2013 [17].

Se obtuvo pectina de diferentes cascarillas de cacao, la pectina fue evaluada por

medio de espectrometra infrarroja, y comparada con la pectina comercial de lo
cual se concluy que es posible extraer pectina de la cascarilla de cacao.

2. Extraccin de pectina a partir de los subproductos del beneficio del cacao.

Medellin 2009 [18].

Se extrajo pectina de la cascarilla y de la mazorca del cacao, con el fin de

determinar el rendimiento en cada extraccin. Obteniendo como resultado, un
mayor rendimiento de pectina de la mazorca de cacao que con la cascarilla de
cacao.

Y de los internacionales se encontr diferentes estudios realizados de la

extraccin de pectina de la cascarilla de cacao, de los cuales se citan los ms
recientes:

3. Effect of extraction conditions on the yield and chemical properties of

pectin from cocoa husks. Malaysia 2013 [19].

Al extraer pectina con cido ctrico se obtuvo una mejor pectina y un mejor
rendimiento que al hacer la extraccin con cido clorhdrico.

4. Extraction and characterization of pectin from cacao pod husks

(Theobroma cacao L.) with citric acid. Brasil 2012 [20].

Se realiz la extraccin de pectina con cido ctrico de lo cual se obtuvo una

pectina de bajo metoxilo pero con buen rendimiento, lo cual concluye que la
extraccin de pectina con cido ctrico es de los mejores mtodos de extraccin.

22
5. Estudio comparativo de la extraccin de pectina a partir de la cascara de
cacao (Theobroma cacao L) en el canton Quevedo. Ecuador 2012 [21].

Se hizo un estudio comparativo entre extraer pectina con cido clorhdrico y EDTA
0,5 % de lo cual se obtiene un mejor rendimiento y una mejor viscosidad muy
similar a la pectina comercial al utilizar EDTA 0,5% que con cido clorhdrico.

6. Optimization of nitric acid-mediated extraction of pectin from Cacao pod

Husks (Theobroma cacao L.) using response surface methodology Brasil
2011 [22].

Los resultados obtenidos fueron que la extraccin con cido ntrico caliente es
adecuada para la recuperacin de las pectinas de la cscara de vaina de cacao.

7. La cascara de cacao (Theobroma Cacao L.): una posible fuente comercial

de pectinas. Venezuela 2008 [23].

Se obtuvo como resultado que a partir de cscaras de cacao se pueden obtener

pectinas con caractersticas qumicas que podran ser de inters para uso
industrial, sin embargo, es necesario optimizar los parmetros de extraccin para
aumentar el rendimiento.

23
 5. MARCO TEORICO.

5.1 GENERALIDADES DEL Theobroma Cacao L.

5.1.1 FENOLOGA Theobroma Cacao L.

5.1.1.1. El rbol.

Es una rbol caulfloro (flores y frutos

nacen directamente del tallo y ramas)
(Figura 1.) Su tronco crece verticalmente
hasta formar el primer verticilo a unos 80
o 100 cm de altura, un rbol puede llegar
a formar hasta 10 vertilicios durante el
tiempo de crecimiento. Su corteza externa
es de color castao oscuro, spera
agrietada delgada, y comienza a rendir
frutos cuando tiene 4 o 5 aos. En un
ao, cuando madura, puede tener 6.000
flores pero slo 20 maracas [24] [25].
Figura 1 rbol Theobroma cacao L.
Fuente: autoras
5.1.1.2. Flores.

Las flores (Figura 2.) se producen en

racimos directamente en el tronco o
ramas principales del rbol, debajo de
las ramas frondosas, sostenidas por un
pedicelo de 1 a 3 cm; son pequeas, de
dimetro entre 1-2 cm, con el cliz
rosado. Los ptalos tienen colores que
varan desde blanco a rosa en las
distintas variedades. Se observan
grupos de flores pequeas de color rosa
y bayas en distintas etapas de
desarrollo a lo largo del tronco desnudo
del rbol maduro. Las flores del cacao
son polinizadas por las moscas
especies del gnero Forcipomyia [25, 26]

Figura 2 Flor Theobroma cacao L.

Fuente: autoras

24
 5.1.1.3. Fruto.

El fruto es una BAYA denominada maraca o

mazorca (Figura 3.), que tiene forma de
calabacn alargado, se vuelve roja o
amarillo purprea y pesa aproximadamente
450 g cuando madura. La fruta, tiene forma
de Vaina y es ovoide, mide 15-30 cm de
largo. Cada mazorca contiene en general
entre 30 y 40 semillas dispuestas en
placentacin axial e incrustada en una
masa de pulpa desarrollada en las capas
externas de la testa o cascarilla [26,27].

Figura 3 Fruto Theobroma cacao L.

Fuente: autoras
5.1.1.5. Semillas.

Las Semillas (Figura 4.) son grandes del tamao

de una almendra, color chocolate o purpreo, de
2 a 3 cm de largo y de sabor amargo (Figura 4.).
No tiene albumen y estn recubiertas por una
pulpa mucilaginosa de color blanco y de sabor
dulce y acidulado. Cada semilla contiene una
cantidad significativa de la grasa (40-50% como
manteca de cacao) [27, 28].

Figura 4 Semilla Theobroma cacao L.

Fuente: autoras
5.1.2 TIPOS DE CACAO.

5.1.2.1 Cacao Criollo.

Poseen un amargor suave, sabores cidos y afrutados. Sus frutos son y

cascara suave (figura 5.), Esta variedad de cacao se suele demandar para
chocolatera fina y elaboraciones ms selectas, los rboles de esta variedad
son ms delicados y propensos a plagas. Se cultiva generalmente en
Guatemala y Nicaragua, (en pequeas cantidades) Venezuela y Colombia,
entre otros pases [29].

25
 Figura 5 Cacao criollo
Fuente: autoras.
5.1.2.2 Cacao Forastero.

Se cultiva principalmente en: Per, Ecuador,

Colombia, Brasil. Se distingue porque tiene
frutos de cscara dura y ms o menos lisa
(figura 6.). Sus semillas o almendras son de
color morado y un sabor amargo [29,30].

Figura 6 Cacao forastero

Fuente: autoras.

5.1.2.3 Cacao Trinitario.

Surge del cruce del cacao Criollo y Forastero.

Las mazorcas suelen ser de muchas formas y
colores (Figura 7.); las semillas son ms
grandes que las del cacao criollo y forastero;
las plantas son fuertes, de tronco grueso y
hojas grandes.
En la actualidad la mayora de los cacaotales
que existen en el mundo son trinitarios
[29,30].

Figura 7 Cacao trinitario

Fuente: autoras

26
5.1.3 PRODUCCIN DEL CACAO.

5.1.3.1 Produccin mundial de cacao.

Durante los ltimos diez aos se ha apreciado una creciente concentracin

geogrfica en el cultivo de cacao, y la regin de frica se ha establecido
firmemente como principal proveedor. El incremento de la demanda de cacao
en grano se ha visto cubierto por el aumento de la produccin, principalmente
en los pases productores de frica Occidental [5]

La produccin en Amrica, sobretodo en Sur Amrica, tiene un crecimiento

constante (Figura 8), debido a los siguientes factores:

Inversin en proyectos agrcolas a gran escala debido a los altos precios de

los ltimos aos.
Plantaciones jvenes sembradas en los ltimos aos de precios altos en
estado de madurez estn produciendo mayores rendimientos.
Entidades Gubernamentales, ONGs y empresas privadas estn invirtiendo
en campaas de promocin del sector cacaotero, para incentivar la
rehabilitacin de plantaciones viejas y de esta manera aumentar los ingresos
de los pequeos agricultores [31].

Figura 8 Produccin de cacao en Amrica (2008-2013) [31].

27
5.1.3.2 Produccin del cacao en Colombia.

El cacao es uno de los productos que cuentan con ventajas comparativas en

Colombia derivadas de las condiciones naturales para su produccin, esto es,
de las caractersticas agroecolgicas en trminos de clima y humedad, y su
carcter de sistema agroforestal conservacionista del medio ambiente. La
industria chocolatera es una de las agroindustrias con ms tradicin en el
pas. Su participacin en la dcada de los noventa fue de ms del 2% en la
industria de alimentos [32].

Colombia produce cacaos comunes y de calidad Premium, ambos son finos

de sabor y aroma, y pertenecen al tercer grupo de productos con mayor
ventaja comparativa en el pas. El cacao es un cultivo tradicional de la
economa campesina cultivado en parcelas de tamao pequeo o mediano
con unidades productivas de 3,3 hectreas en promedio. Este se cultiva en
casi todo el territorio nacional, pero su cultivo se concentra bsicamente en
cuatro zonas agroecolgicas, montaa Santandereana, que comprende los
departamentos de Santander y Norte de Santander, valles interandinos secos
que comprende los departamentos de Huila, sur del Tolima y norte del
Magdalena, bosque hmedo tropical que comprende las zonas de Urab,
Tumaco, Catatumbo, Arauca, Meta y Magdalena , zona Cafetera Marginal
Baja, gran Caldas, suroeste de Antioquia, y Norte del Tolima [33].

En la siguiente tabla se muestra la produccin de cacao en algunos

departamentos del pas.

Tabla 1. Produccin nacional de cacao [33].

Produccin nacional (%)

Departamento 2008 2009 2010
Santander 48,2 47,82 45,86
Huila 8,81 8,33 10,01
Arauca 11,08 10,98 9,42
Antioquia 5,44 5,62 7,69
Tolima 5,6 5,7 6,83
Resto de
departamentos 20,87 21,54 20,18

28
 En la Tabla 1, se puede observar que el departamento de Santander es
donde se concentra cerca del 50% de la produccin nacional de cacao. Se
destacan tambin los departamentos de Huila, Arauca, Antioquia y Tolima. En
estos cinco departamentos se concentra cerca del 80% de la produccin
nacional, la cual se comercializa en sacos de fique de 60 kilos. Los destinos
principales son las ciudades donde ms se procesa el producto que son
Bogot, Medelln y Manizales [33].

5.1.4 PRODUCTOS DERIVADOS DEL Theobroma Cacao L.

Los derivados del cacao son una importante fuente de energa, que contienen
antioxidantes que contribuyen a evitar la oxidacin del colesterol. Entre sus
derivados se encuentran el licor del cacao, manteca de cacao y el cacao en
polvo. En la Figura 9. Se aprecia el diagrama de la produccin de los
derivados del cacao [32].

Figura 9 Diagrama de produccin de los derivados del cacao [32].

29
5.1.5 DESECHOS DE LA PRODUCCIN DE DERIVADOS DEL CACAO.

En el procesamiento industrial del Theobroma cacao L., se obtienen desechos

en cada una de las etapas para la fabricacin de los derivados del cacao.

5.1.5.1 Cscara.

Las cscaras (Figura 10.) son el 90% del fruto y son el principal producto de
desecho de la industria cacaotera. Por tanto representa un grave problema ya
que este desecho se convierte en una fuente significativa de enfermedades
cuando es usado como abono en las plantaciones. Las cscaras frescas o
secas pueden ser utilizadas como alimento para el ganado. Pero su contenido
de teobromina restringe la proporcin en la cual puede ser consumido, por lo
que su uso ha sido limitado [2,23].

Figura 10 Cascara de cacao desechada.

Fuente: autoras

5.1.5.2 Cascarilla.
Es el subproducto que se obtiene despus de secar el grano de cacao,
fermentarlo y tostarlo. La cascarilla de cacao (Figura 11.) nutricionalmente
aporta como todo alimento macronutriente (protenas, carbohidratos, lpidos)
y micronutrientes (vitaminas y minerales); a su vez contienen entre un 2.85 a
3.14% de grasa en relacin con el 30% a 50% del cacao [2,34].
La cascarilla de cacao contiene ms de 40% de fibra diettica, celulosa,
hemicelulosa y cido galacturnico. A su vez contiene protena, lignina,
minerales, lpidos, hidratos de carbono tales como almidones y azcares,
teobromina, y otros compuestos tales como polifenoles, taninos y cafena

30
 [34]. Tambin es un producto que se ha utilizado recientemente en
aplicaciones alimentarias y farmacuticas, pero de muy poco uso a nivel
industrial, por tanto la cascarilla de cacao es considerada como un producto
de desecho [35].

Figura 11 Cascarilla de cacao.

Fuente: autoras.

5.2 LA PECTINA.

5.2.1 RESEA HISTRICA.

En 1790, por primera vez se da a conocer las sustancias pcticas, gracias a los
aportes del naturista, farmacutico y qumico francs, Louis Nicolas Vauquelin,
quien observ una sustancia soluble de los zumos de fruta. Por consiguiente, el
cientfico Henri Braconnot, quin continu los trabajos de Vauquelin, la aisl y
describi en 1824. En su trabajo menciona el hallazgo en gran variedad de
tejidos vegetales, de una sustancia con propiedades de solubilidad media en
agua fra, la cual aumenta proporcionalmente con la temperatura, de fcil
precipitacin con etanol, adems describe su capacidad de coagularse en una
gelatina incolora y transparente, a pH bajos y presencia de azcares, que
posee un poder gelificante, siendo posible sugerir el nombre de cido pctico,
del griego peKtos que significa slido, denso, coagulado [13].

Desde 1848, se conocen las diferentes sustancias pcticas, las cuales varan
en solubilidad y extraccin, siendo Fremy quien report por primera vez la
existencia de un precursor pctico insoluble en agua, denominado
posteriormente protopectina por Tschirch [36].

En 1924, Smolenski, fue el primero en sugerir que la pectina era un polmero

complejo, en estructura comparable con el almidn, siendo el anlisis de rayos
X la afirmacin para esta hiptesis, lo cual le permiti identificar el componente

31
principal de las pectinas, el cido poligalacturnico [36]. En 1944, el Comit
para la Revisin de la Nomenclatura de Sustancias Pcticas, las defini como;
Sustancias coloidales que se encuentran en las plantas y contienen una gran
proporcin de cido galacturnico; los grupos carboxilo de estos cidos pueden
estar esterificados por metanol en una proporcin variable, y parcial o
completamente neutralizados por uno o varios cationes metlicos [13].

En 1951, la pectina fue definida por Kertesz, describiendo a los cidos

pectnicos como sustancias solubles en agua, de grado de metilacin variado
que son capaces de formar geles con azcar y cido, bajo condiciones
determinadas. Sin embargo, la terminologa desde entonces ha variado mucho.
Actualmente, se les consideran pectinas a los grupos heterogneos
polisacridos cidos complejos de naturaleza coloidal que contienen un
esqueleto de residuos de cido galacturnico [37,38].

5.2.2 LOCALIZACIN BIOLGICA DE LA PECTINA.

La pectina consiste en un conjunto de polisacridos que estn presentes en la

pared celular y son particularmente abundantes en las partes no leosas de las
plantas terrestres [13].

La pared celular vegetal es una matriz compleja que define las caractersticas
individuales de las clulas dentro de las plantas, caracterizndola
morfolgicamente y jugando un papel fundamental en la comunicacin entre
clulas, en esta se puede contener diferentes carbohidratos (celulosa,
hemicelulosa y polisacridos pcticos) as como, protenas, lignina y sustancias
incrustadas como cutina, suberina y compuestos inorgnicos [39].

Esta estructura compleja se presenta en las clulas vegetales de dos maneras,

por lo que tradicionalmente se ha dividido en dos tipos: una pared celular
primaria fina (Figura 12) y una secundaria ms gruesa [39]. Dos modelos
estructurales son propuestos para la pared celular primaria: tipo I, compuesto
principalmente de celulosa, xiloglucanos, extensina y pectina (20-35%) y de
tipo II, compuesto de celulosa, glucoarabinoxilanas, compuestos fenlicos y
una menor proporcin de pectina (10%). La pared secundaria, es una
estructura compleja adaptada a la funcin celular, est formada internamente
por una pared primaria no diferenciada. Entre las paredes primarias de dos
clulas contiguas, se encuentra una estructura llamada lmina media formada
principalmente por molculas de pectina de alta metoxilacin [39].

32
 Figura 12 Estructura de la pared celular primaria [36].

Estos polisacridos pcticos son importantes en el control de la porosidad de

la pared, la adherencia de las clulas subyacentes y para controlar el ambiente
inico de la pared celular. Otra funcin est ligada a los mecanismos de
defensa, debido a que el cido galacturnico (unidad bsica de la pectina) es
un componente esencial de elicitores activos de la pared celular, sustancias
que provocan o causan la acumulacin de fitoalexinas con propiedades
antibiticas en los sitios de infeccin de la planta [36].

5.2.3 ESTRUCTURA QUMICA DE LA PECTINA

Las pectinas son cido pectnicos que estn formadas por diecisiete
monosacridos diferentes, organizados en distintos polisacridos, a partir de
ms de veinte diferentes enlaces, formando una red que los une, agrupados en
diferentes tipos de cadena, constituido por cido urnico, hexosas, pentosas y
metilpentosas. Diversas unidades estructurales pueden estar sustituidas por
metanol, cido actico y cidos fenlicos. Los azcares pueden existir en
formas furanosdicas o piranosdicas y con diferentes anmeros ( o ), con
diversos tipos de enlaces entre los monmeros, tales como (14), (15),
(13), (14) y (16) [40].
Las pectinas estn clasificadas como de alto metoxilo y de bajo metoxilo segn
su grado de esterificacin, aportando propiedades y poder de gelificacin
diferentes a cada una de ellas [41].

33
5.2.3.1 Cadenas principales de la pectina.

5.2.3.1.1 La Homogalacturonana (HG).

Es el polisacrido pctico ms abundante en la pared celular, corresponde

cerca del 60-65% del total de la pectina. Este presenta unidades de cido -
D-galacturnico (Figura 13.) en enlaces 14 en un patrn lineal. Los
grupos carboxilos estn parcialmente metil esterificados. Las cadenas
pueden ser, dependiendo de la fuente vegetal, parcialmente O-acetiladas
en C-3 o en C-2 [40].

Figura 13 Estructura del cido -D-galacturnico [13].

5.2.3.1.2 La Ramnogalacturonana I (RG-I).

Presenta una configuracin en zig-zag, debido a que en la cadena de cido

-1,4-galacturnico aparecen residuos de 1,2-ramnosa, y cuando adems
est ramificada en C4, se origina una configuracin en Y (Figura 14.).Se
caracteriza por poseer una variedad de diferentes cadenas de glucanos
(principalmente arabinana y galactana) ligadas a las unidades de ramnosa.
En resumen, est compuesta por una cadena que representa el disacrido
[14--D-GalA-(12)--L-Rha-]n. La longitud de la cadena puede variar
considerablemente y la composicin de los azcares de RG - I puede ser
muy heterogneo. La Ramnogalacturonana I, representa el 20-35 % de la
pectina [40].

34
Figura 14 Representacin simplificada de la estructura de Ramnogalacturonanas
[13].

5.2.3.1.3 La Ramnogalacturonana II (RG-II).

Es un segmento estructuralmente ms complejo y compone el 10% de la

pectina. Esta estructura est presente en la mayor parte de las especies
vegetales; consiste en un esqueleto de un mnimo de ocho
homogalacturonana (probablemente ms unidades). Son monmeros que
contienen cadenas laterales de hasta 12 tipos diferentes de azcares ,
algunos muy peculiares como apiosa, cido acrico, cido 3-desoxi-lixo-2-
heptulosrico (DHA) y cido 3-desoxi-mano-2-octulosnico (KDO) [40].

5.2.3.2 Cadenas secundarias de la pectina.

5.2.3.2.1 Arabinana (ARA).

Consiste en un esqueleto de -L-Arabinofuranosas unidas por enlaces 1 5

con zonas altamente ramificadas en C3 y en menor cantidad en C2. Las
ramificaciones, fundamentalmente de -Arabinofuranosa, se hallan
homogneamente distribuidas a lo largo de la molcula (Figura 15) [40].

35
 Figura 15 Representacin simplificada de la estructura
de arabinanas [40].

5.2.3.2.2 Xilogalacturona (XGA).

Es un homogalacturona sustituido por xilosa en la posicin 3. El grado de

xilosidacin puede variar dependiendo del fruto. Es ms frecuente en los
tejidos reproductivos como frutos y semillas [40].

5.2.3.2.3 Arabinogalactana I (ARA-I)

Consta de un esqueleto -1,4-D-galactosa, con residuos de unidades de -

L-arabinosa, las cuales se conectan a la galactosa en la tercera posicin
(C3), unidas por enlace -1,5 (Figura 16.) [40].

Figura 16 Representacin simplificada de la estructura de

Arabinogalactanas I [40].

Los estudios han permitido plantear estructuras hipotticas de la pectina,

con breves modificaciones de acuerdo a las nuevas evidencia analticas. En
la representacin esquemtica de Willats, Knox y Mikkelsen se da el modelo
alternativo propuesto de la representacin convencional ms habitual
(Figura 17) [36].

36
 (a) Cadena pctica [36].

(b) Cadena pctica [36].

Figura 17 (a y b) Alternativas para representar la cadena pctica [36].

5.2.4 CLASIFICACION DE LA PECTINA.

5.2.4.1 Pectinas de Bajo Metoxilo (LM).

Este tipo de pectinas (Figura 18) poseen la mayora de los grupos carboxilo
libres. Son aquellas en las cuales menos del 50% de los grupos hidroxilo
estn esterificados con metanol, se estima que solo del 20% al 40% de los
grupos carboxilo estn esterificados. Por lo tanto, la mayora estn
disponibles para formar enlaces cruzados con iones divalentes como el calcio
[41]. En ste caso la formacin del gel ocurre por la formacin de enlaces
entre los cationes con molculas de pectina, formando una red tridimensional

37
con los grupos carboxilo de sta. Los geles se pueden obtener entre pH 1 a 7;
el pH no afecta la textura del gel ni el intervalo de slidos solubles, el cual
puede fluctuar entre 0 y 80%, pero la presencia de calcio (40 a 100mg) es el
factor predominante en la formacin del gel [41,42].

Figura 18 Pectinas de bajo ndice de metoxilo [41].

5.2.4.2 Pectinas de Alto Metoxilo (HM).

Estas pectinas (Figura 19) poseen la mayora de los grupos carboxilo

esterificados, normalmente entre el 50% al 58%. Por lo tanto, la mayora de
grupos cidos no estn disponibles para formar enlaces cruzados con iones
divalentes. Por lo tanto, estas pectinas no forman geles de esta manera. El
grado de esterificacin de las pectinas de alto metoxilo influye mucho sobre
sus propiedades, en particular, a mayor grado de esterificacin, mayor es la
temperatura de gelificacin. Estas pectinas son capaces de formar geles en
condiciones de pH entre 2.8 y 3.5, adems con un contenido de slidos
solubles (azcar) entre 60% y 70% [41].

Las pectinas de alto metoxilo pueden subdividirse en 2 grupos: las de

gelificacin rpida (Rapidset), o sea menor a 5 minutos con un grado de
esterificacin con metanol entre el 68 y el 75%. Y las de gelificacin lenta
(Slowset), es decir gelifican despus de 5 minutos y tienen entre 60 y 68% de
esterificacin con metanol [41].

Figura 19 Pectina de alto ndice de metoxilo (HM) [41].

38
 5.2.4.3 Pectinas de Bajo Metoxilo Amidadas.

Son pectinas de bajo ndice metoxilo, que se obtienen a partir de pectinas de

alto metoxilo mediante una desesterificacin alcalina en presencia de
amoniaco, por tanto sus grupos metoxilo son sustituidos por una amida
(Figura 20).Estas pectinas de bajo metoxilo se caracterizan en que no
requieren para gelificar adicin de calcio, es suficiente con el calcio presente
en los frutos, adems de que Forman geles termo reversibles [43].

Figura 20. Pectina de bajo metoxilo amidada [43].

5.2.5 CLASIFICACION DE LAS SUSTANCIAS PECTICAS.

Segn el nmero de grupos carboxlicos que se encuentran esterificados en la

cadena o polmero, se clasifica en:

5.2.5.1 Protopectinas.

Termino aplicado a las sustancias pcticas insolubles en agua, las cuales

bajo condiciones controladas de hidrlisis originan cidos pectnicos. Se
caracterizan por tener todos los carboxilos esterificados y se hallan en mayor
cantidad en los tejidos de los frutos no maduros o verdes [13, 41].

5.2.5.2 cidos Pectnicos.

Son los cidos poligalacturnicos coloidales que contienen una apreciable

proporcin de grupos metil-ster. Estos cidos, bajo condiciones adecuadas,
son capaces de formar geles con azcar y cido, o si presentan un bajo
contenido en metoxilo, con determinados iones metlicos. Las sales de los
cidos pectnicos se denominan pectinatos [13].

39
 5.2.5.3 Pectinas.

Son los cidos pectnicos solubles en agua caliente, con un contenido medio
de ster metlico y grado de neutralizacin. Su principal caracterstica es la
capacidad de formar geles en presencia de suficientes slidos solubles,
cidos o iones polivalentes [13,41].

5.2.5.4 cidos Pcticos.

Son aquellas sustancias pcticas constituidas principalmente por cidos

poligalacturnicos prcticamente libres de grupos metoxilo. Las sales de
estos cidos se denominan pectatos y reaccionan fcilmente con los iones
calcio de las clulas para producir compuestos insolubles en los jugos de
frutas, dando un precipitado visible comnmente en la separacin de fases o
abanderamiento en los nctares [13,41].

5.2.6 PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LA PECTINA.

Como polmeros del cido galacturnico, las pectinas tienen muchas

propiedades fsicas y qumicas nicas, debidas principalmente al grupo
carboxlico presente en las unidades de la cadena [44].

5.2.6.1 Solubilidad.

La pectina es casi completamente soluble en agua a 25C, pero a pesar de su

solubilidad forma grumos viscosos, por lo tanto para una dilucin ms rpida
se adicionan sales amortiguadoras, azcar o se humedece con alcohol [45].
La pectina tambin es soluble en formamida, dimetilformamida y glicerina
caliente e insoluble en solventes orgnicos, soluciones de detergentes
cuaternarios, polmeros, y protenas [43].
5.2.6.2 Viscosidad.

La pectina en agua forma soluciones viscosas dependiendo de su peso

molecular, grado de esterificacin, pH y concentracin electroltica de la
solucin. Las soluciones de pectina completamente esterificadas no cambian
apreciablemente su viscosidad al variar el pH, pero al disminuir el grado de
esterificacin la capacidad de formar geles se vuelve dependiente del pH. El
calcio y otros iones polivalentes aumentan la viscosidad de las soluciones de
pectinas y algunas pectinas de bajo metoxilo pueden gelificar si la
concentracin de calcio supera un cierto lmite [43].

40
5.2.6.3 Acidez.

El pH de las soluciones de pectina vara de 2.8 a 3.4 en funcin del grado de

esterificacin. Sin embargo, las pectinas son neutras en su estado natural.
Como polielectrolitos las pectinas tienen una constante de disociacin
aparente de 0.1 a 10x10-4 a 19C [46,47].

5.2.6.4 Poder de Gelificacin.

Un gel de pectina puede considerarse como un sistema en el cual el polmero

est en una forma entre completamente disuelto y precipitado. Segmentos de
la cadena molecular estn juntos por cristalizacin limitada para formar una
red tridimensional, en la cual el agua, el azcar y otros solutos se mantienen
unidos por los puentes de Hidrgeno; la aproximacin necesaria de las
cadenas pectnicas es posible por la accin deshidratante del azcar y por la
prdida de electronegatividad de las cadenas del cido pctico. El poder
gelificante de un cido pectnico, depende primeramente de su tamao
molecular, pero esta relacin no se conoce muy bien. No hay mucha
concordancia entre los pesos moleculares obtenidos por distintos mtodos, ni
tampoco es muy satisfactoria su relacin con el comportamiento coloidal. La
capacidad de gelificacin y caractersticas intrnsecas del gel tambin
dependen de la pureza [46,47].

5.2.6.5 Peso molecular.

Los pesos moleculares de las pectinas y su distribucin han sido estudiados

sistemticamente por viscosimetra, determinando que los pesos moleculares
variaban entre 20.000g/mol a 300.000g/mol. El peso molecular de la pectina,
est relacionado con la longitud de la cadena, es una caracterstica muy
importante de la que dependen la viscosidad de sus disoluciones y su
comportamiento en la gelificacin o formacin de jaleas. La determinacin
cuidadosa del peso molecular es difcil, debido a la extrema heterogeneidad
de las muestras y a la tendencia de las pectinas a agregarse, an bajo
condiciones no favorables a la gelacin [46,47].

5.2.6.6 Accin de agentes qumicos, fsicos y bioqumicos.

Otra propiedad importante de las pectinas es la degradacin que presentan

por agentes qumicos, fsicos y/o bioqumicos.

41
5.2.6.6.1 Accin de los cidos.

En medio cido, las pectinas sufren primero desmetoxilacin o

desesterificacin y despus la hidrlisis de los enlaces glicosdicos con la
consecuente ruptura de la cadena o depolimerizacin, la cual predomina
con el aumento de la temperatura [44]. Los cidos solubilizan la
protopectina, por esta razn se emplea un medio controlado en los
procesos de extraccin de la pectina; aceleran la separacin de los
metoxilos, si su efecto se contina se afectan los enlaces glicosdicos 1 4
y se pueden romper, y a un pH fuertemente cido, temperaturas altas y
tiempos largos, se presenta la decarboxilacin con formacin de CO 2 y
furfural [48]. A bajas temperaturas predomina la saponificacin y altas
temperaturas la depolimerizacin [49].

5.2.6.6.2 Accin de las bases.

Los medios alcalinos tambin actan sobre los grupos ester metlicos; estos
pueden ser eliminados a bajas temperaturas sin que ocurra necesariamente
la depolimerizacin. Esta propiedad es aprovechada en la produccin
comercial de pectinas de bajo metoxilo [44]. La adicin de hidrxido de
sodio permite obtener primero las sales cidas, luego los pectinatos neutros
y despus ocurre el fenmeno de desmetoxilacin o sea rompimiento de los
steres metlicos [48].

5.2.6.6.3 Accin de las enzimas.

Otra degradacin importante sufrida por las sustancias pcticas durante el

desarrollo, maduracin, transporte y deterioro mecnico de las frutas antes
del proceso, se da por accin de las enzimas pectinolticas presentes en
todas las frutas y hortalizas [50]. Sobre las pectinas pueden actuar la
pectinmetilesterasa (PME) y la poligaractunosa (PG). La primera ataca a los
grupos carboxilo esterificados con metanol, liberando los grupos cidos y el
metanol, y la poligaractunosa ataca las uniones de las unidades de cido
galacturnicos disminuyendo el peso molecular, cambiando as todas las
propiedades que dependen de stas caractersticas. Las enzimas
pectinolticas son producidas por hongos y bacterias, para fabricar
industrialmente pectinas con caractersticas especiales [51].

42
5.2.7 IMPORTANCIA Y APLICACIN INDUSTRIAL DE LA PECTINA.
5.2.7.1 Aplicaciones en la industria alimenticia.

En el sector industrial, los polisacridos pcticos promueven el aumento de la

viscosidad, actan como coloide protector y estabilizador en alimentos y
bebidas. Las bebidas de bajas caloras son muy claras (de textura), por lo
tanto no otorgan la adecuada sensibilidad a la boca, como los proporcionados
por el azcar en los refrescos convencionales. La pectina permite mejorar la
textura de tales productos, por ejemplo en las mermeladas y la gelatina, las
pectinas amidadas de bajo metoxilo, proporcionan la textura y el punto de
congelacin adecuados. En los sorbetes y helados, la pectina puede usarse
para controlar el tamao del cristal. La pectina de alto metoxilo preserva a los
productos lcteos de la agregacin de casena cuando se calienta a valores
de pH inferiores a 4.3. Este efecto se usa para estabilizar los yogurts lquidos
que tienen un tratamiento ultra-calor (UHT) y tambin para mezclas de leche
y zumos de fruta, a su vez estabiliza bebidas lcteas acidificadas con soja y
productos basados en el trigo [13,36], entre otros usos.

5.2.7.2 Aplicaciones en la industria farmacutica.

La pectina es el grupo ms grande de la fibra diettica, el cual incluye el

grupo de los polisacridos no amilceos, junto con almidones, hemicelulosas,
-glucanos, entre otros. Aunque estos compuestos no son degradados por
las enzimas humanas, puede ser la microflora natural, especialmente durante
el paso a travs del intestino [13]. La cadena de pectina se puede transformar
en cidos grasos de cadena corta (actico, propinico y butrico) y dixido de
carbono por la accin de las bacterias productoras de enzimas pectinolticas
de Aerobacillus gneros Lactobacillus, Micrococcus y Enterococcus; Por lo
tanto, la pectina tiene tendencia a ser poco laxante y estimula el crecimiento
de microorganismos en el colon (efecto prebitico) [36].

La accin antidiarrica, es la propiedad ms universalmente conocida, incluso

antes de descubrirse la molcula de pectina. Este efecto se acompaa
frecuentemente de una accin antivomitiva, permitiendo a los nios de corta
edad asimilar y tolerar mejor los alimentos, en particular leches y productos
lcteos, esto es consecuencia del papel protector y regulador del sistema
gastrointestinal [13].

Las pectinas de alto metoxilo asociadas a otros principios activos, tienen una
gran utilizacin en los tratamientos de gastritis y lceras, ya que al ser
ingerida cubre las paredes estomacales de una especie de pelcula ms o
menos gelificada, y la protege de hipersecreciones gstricas y biliares. Su
accin en la pared intestinal es anloga; adems, se aade una accin

43
 desintoxicante, debido al poder adsorbente de la macromolcula pctica, que
permite la inhibicin de toxinas [13].

5.3 FUNDAMENTOS TERICOS DE LAS TCNICAS DE ANLISIS

APLICADAS.

5.3.1. PESO EQUIVALENTE (PE) Y ACIDEZ LIBRE (AL).

Aplicando el mtodo de valoracin cido-base descrito por Owens [52], se

determina el peso equivalente de la pectina estudiada, al relacionar los
miligramos del componente cido (pectina) y los miliequivalentes de NaOH
gastados en la valoracin [52] (Ecuacin 1).

Ecuacin 1. Peso equivalente presente en la pcetina [52].

La estructura pctica est constituida principalmente por monmeros de cido

D-galacturnico, molcula que presenta el grupo funcional carboxilo (COOH),
por lo tanto el peso equivalente representa el nmero de carboxlicos libres, el
cual reacciona con la base adicionada, de tal forma que su grupo funcional
carboxilo COOH, quien otorga las caractersticas cidas a la molcula, sufre
separacin del protn debido a la accin de la base [53], (Figura 21).

Figura 21. Reaccin de la molcula de cido D-galacturnico con NaOH [53].

44
La Acidez Libre se determina aplicando la ecuacin 2, en la cual se relaciona
los meq de NaOH consumidos (que representan los carboxilos libres presentes
en el componente cido) y el peso de la pectina [52].

Ecuacin 2. Acidez libre presente en la pectina [52].

5.3.2 PORCENTAJE DE METOXILO (ME), PORCENTAJE DE CIDO

ANHIDRIDO GALACTURNICO (AAG) Y GRADO DE ESTERIFICACIN
(GE).

Las molculas de cido D-galacturnico que conforman la estructura molecular

de una sustancia pctica pueden presentar grupos Metil-Ester, la cantidad de
estos grupos funcionales permiten evaluar la facilidad de formar geles,
clasificarla como Bajo Metoxilo (LM), o de Alto Metoxilo (HM), adems de
determinar la sensibilidad de la pectina a la presencia de los cationes
polivalentes [54].

El porcentaje de Metoxilo se determina partiendo de la solucin empleada para

la determinacin del peso equivalente y acidez libre, luego de realizar la
saponificacin de la pectina con NaOH, (Figura 22), neutralizar el exceso de
base presente con HCl y titular [52]. Los miliequivalentes se relacionan en la
ecuacin 3.

Ecuacin 3. Porcentaje de metoxilo de la pectina [52].

-
Donde 31 es el peso molecular del metoxilo (CH3O ) expresado en mg/meq y
meq B son los meq de NaOH gastados en la determinacin del contenido de
metoxilo [52].

45
.

Figura 22. Reaccin y mecanismo de saponificacin del cido D-Galacturnico

[53].

El grado de esterificacin relaciona los carboxilos de urnicos esterificados y

los carboxilos totales de uronicos el cual se obtiene con la ecuacin 4 [49].

Ecuacin 4. Grado de esterificacin [52].

Dnde los meq A equivalen a los miliequivalentes de NaOH gastados en la

determinacin de la acidez libre y meq B son los miliequivalentes de NaOH
gastados en la determinacin del contenido de metoxilo [52].

El porcentaje de cido Anhdrido Galactuurnico (AAG), permite conocer el

grado de pureza de la sustancia pctica, debido a que la pectina es un
polisacrido constituido no solo por cido D-galacturnico, sino tambin en su

46
estructura el 10% o ms de la cadena pueden representar otros azcares,
como arabinosa, glucosa y ramnosa [54]. Su determinacin se fundamenta en
el mtodo de valoracin descrito para la determinacin de la acidez libre y
unidades metiladas, relacionndolos en la ecuacin 5 [52].

Ecuacin 5. Porcentaje de Acido Anhdrido Galacturnico de la pectina [52].

Donde 176 es el peso molecular del cido Anhdrido Galacturnico (AUA)

expresado en mg/meq [52].

5.3.2 CUANTIFICACIN DE FENOLES TOTALES POR EL MTODO DE

FOLIN CIOCALTEAU.

El reactivo est constituido por una mezcla de cido fosfotungstico

(H3PW 12O40) y cido fosfomolibdico (H3PMO12O40) que reduce, por la oxidacin
de los fenoles, en una mezcla de xidos azules de tungsteno (W 8 O23) y de
molibdeno (MO8O23). La coloracin azul producida posee una absorcin
mxima entorno a 765nm y esta es proporcional al porcentaje de compuestos
fenlicos. Por tanto la respuesta de este anlisis depende de la cantidad de
fenoles presentes [55].

5.3.3 DETERMINACIN DE AZCARES.

5.3.3.1 Anlisis cualitativo por el mtodo de Fehling o Benedict.

Tanto la solucin de Fehling como la de Benedict, son soluciones alcalinas de

Cu+2 complejado con iones tartrato (Fehling) o citrato (Benedict) [56].

47
 Figura 23. Estructura de los iones Tartraro y Citrato [56].

Ambas pruebas se basan en la capacidad de los azcares reductores de

reducir a los iones cpricos (Cu+2) al estado cuproso (Cu+), el cual al
calentarse precipita como xido cuproso (Cu2O), manifestndose con la
aparicin de un precipitado rojo [56].
.

Figura 24. Reaccin de azcar reductor con reactivo de Fehling o Benedict [56].

5.3.3.2 Anlisis cuantitativo por el mtodo de Fenol-Sulfrico.

Este mtodo espectrofotomtrico UV-visible propuesto por Dubois en 1956 se

fundamenta en que los azcares se deshidratan al reaccionar con cidos
fuertes originando furfurales que se condensan cuando reaccionan con fenol
dando un compuesto de color naranja amarillo muy estable, el cual varia su
intensidad proporcional a la cantidad total de azcares presentes [47, 57, 58].

48
a)

b)

Figura 25. a) y b) Reacciones de deshidratacin y condensacin de hexosas y

pentosas por el mtodo de Dubois [57,59].

49
5.3.4 CROMATOGRAFA.

La IUPAC define: La Cromatografa es un mtodo, usado primariamente para

la separacin de los componentes de una muestra, en la cual los componentes
se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras la otra
se mueve. La fase estacionaria puede ser un slido, un lquido retenido en un
slido o un gel, puede estar extendida como una capa o distribuida como una
pelcula, etc. La fase mvil puede ser lquida o gaseosa [60].

5.3.4.1 Cromatografa de Capa Delgada (CCD).

Es una tcnica de adsorcin slido-lquido que cuenta con la capacidad de

separar varias muestras simultneamente en una sola placa de vidrio
revestida con una capa delgada adherente de partculas finamente divididas.
La fase mvil se desplaza por la fase estacionar por accin capilar [61].

5.3.4.2 Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (CLAE).

La cromatografa liquida se basa en la combinacin de un alto intervalo de

posibles propiedades de la fase mvil, junto con la eleccin de numerosos
tipos de fases estacionarias, significativamente diferentes, as como una
amplia variedad de detectores [62]. En la CLAE el compuesto pasa por la
columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria mediante el bombeo
de lquido a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar se
inyecta en pequeas cantidades y sus componentes eluyen diferencialmente
dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria
a medida que pasan por la columna. El grado de retencin de los
componentes de la muestra depende de su naturaleza, afinidad hacia la fase
estacionaria y fase mvil; y la composicin de las mismas [62,63].

5.3.4.2.1 Tipos de separacin por Cromatografa Liquida.

En CLAE el mtodo dominante es la cromatografa de fase ligada que puede

clasificarse en fase normal (NP-BPC) y fase reversa de acuerdo a la polaridad
relativa de la fase mvil y de los grupos funcionales qumicamente ligados a
la matriz [64].

Cromatografa de fase normal. En esta cromatografa la fase estacionaria

es polar, utilizndose rellenos en los que R en la estructura del siloxano
puede ser un grupo ciano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH),
AMINO (-C3H6NH2) y dimetilamino (-C3H6N(CH3)2); La elucin se lleva a
cabo con solventes no polares como etilter, cloroformo o n-hexano. El

50
 componente menos polar eluye primero, debido a que es el ms soluble
en la fase mvil, y un aumento de la polaridad de sta hace disminuir el
tiempo de elucin [65].

Cromatografa en fase reversa. En esta tcnica la fase estacionaria es

menos polar que la fase mvil. La columna esta rellena de partculas de
slicagel unidas a cadenas C18 como Octadecilsilano (fase estacionaria
ms utilizada); a cadenas C8 octilsilano, ciclohexilo y grupos fenilo [66];
los componentes ms polares aparecen primero y al aumentar la polaridad
de la fase mvil aumenta el tiempo de retencin de los componentes [65].
La fase mvil est constituida por un solvente polar, mezcla de agua y un
modificador orgnico, a los que se les puede agregar aditivos, sales o
buffers. A mayor modificador orgnico, menor retencin y a mayor
proporcin de agua, mayor retencin. Los solventes de mayor empleo
adems de agua son: metanol, acetonitrilo, isopropanol y tetrahidrofurano
[64].

5.3.6 ANALISIS ESTADSTICO.

5.3.6.1 Anova de Dos Factores.

El anlisis de varianza es un mtodo general que puede ser extendido a ms

de dos muestras, es una prueba paramtrica usada para verificar si dos o
ms medias mustrales proceden de la misma poblacin [67]. Para hacer un
anlisis de varianza independientemente si es de uno, dos o ms factores se
deben tener en cuenta los siguientes parmetros:

1. Las muestras son aleatorias.

2. Las muestras son independientes.
3. La distribucin de la poblacin de donde fueron extradas es normal.
4. Sus varianzas son iguales

Un anlisis de varianza de dos factores permite estudiar simultneamente los

efectos de dos fuentes de variacin, por tanto se utilizan dos variables
independientes cualitativas [67]. (Ver Ecuacin 6).

yi j k= + i + j + ()ij + ijk modelo I

y = + Ai + Bj + (AB)ij + ijk modelo II
y i j k= + i + Bj + (B)ij + ijk modelo mixto

Ecuacin 6 Representacin del modelo matemtico de varianza de factor dos [68].

51
Donde es la media global, i o Ai el efecto del nivel i del 1 factor, j o Bj el
efecto del nivel j del 2 factor y ijk las desviaciones aleatorias alrededor de las
medias, que tambin se asume que estn normalmente distribuidas, son
independientes, tienen media 0 y varianza2. A los trminos ( )ij, (AB)ij,
(B)ij, se les denomina interaccin entre ambos factores y representan el
hecho de que el efecto de un determinado nivel de un factor sea diferente
para cada nivel del otro factor [68].

5.3.6.2 Media Aritmetica.

Es el estimador del valor central ms utilizado. Sea X una variable estadstica

discreta que toma los valores x1, x2, x3.xk, con frecuencias absolutas n1,
n2,,nk respectivamente. Se define la media aritmtica como se describe en
la ecuacin 7 [69].

Ecuacin 7. Media aritmtica [69].

5.3.6.3 Desviacin Estndar.

Es una medida de dispersin, que tiene en cuenta todos los datos de la

variable aleatoria, por tanto los centrales como las colas, el cual es utilizado
para presentacin de datos de tipo cuantitativo [69]. La desviacin estndar
se representa con la ecuacin 8:

Xi= datos
x= media
N=nmero de datos

Ecuacin 8 Desviacin Estndar [69].

5.3.6.4 Coeficiente De Correlacin (R2).

Es una medida del grado de linealidad entre X y Y, comprendido entre 1.

Cuanto ms prximo es a uno o menos uno, es mejor el ajuste entre los datos
y la recta de regresin, es decir indica un alto grado de linealidad, mientras
que los valores prximos a cero indican ausencia de linealidad [67].

52
 6. METODOLOGA

6.1 MATERIAL VEGETAL.

Se emple una mezcla de cascarilla de cacao Husk, suministrada por una

industria chocolatera de la regin. Esta muestra corresponde a una mezcla de
diferentes especies, la cual se conserva a una temperatura de 4C en bolsas
Zipploc. (Figura 25.).

Figura 26 Cascarilla de cacao del Theobroma cacao L.

Fuente: autoras

La cascarilla se moli en un molino de cuchillas y el polvo obtenido se conserv

en bolsas Zipploc a 4C, para su posterior anlisis, (ver figura 27).

Figura 27. Cascarilla de cacao del Theobroma cacao L. molida.

Fuente: autoras

6.1.1 PRETRATAMIETO DE LA MUESTRA.

6.1.1.1 Desengrase de la cascarilla de cacao del Theobroma cacao L.

53
 La cascarilla de cacao molida, fue sometida a un desengrase por medio de
soxhlet, utilizando hexano en relacin muestra-solvente 1:10 por un tiempo de
12 horas [70] (Ver Figura 28.).

Figura 28. Montaje extraccin soxhlet para desengrase.

Fuente: autoras

6.1.1.2 Limpieza de la cascarilla de cacao del Theobroma cacao L.

El polvo de cascarillas de cacao desengrasado se lav con Etanol en una

relacin 1:10 muestra solvente y se centrifug por 30 minutos a 2500 RPM,
posteriormente la cascarilla obtenida se sec, segn estudios previos [70,71].

6.2 EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE PECTINAS DE LA CASACRILLA DE

CACAO DEL Theobroma Cacao L .

6.2.1 EXTRACCIN DE PECTINA MEDIANTE HIDRLISIS CIDA.

La cascarilla de cacao del Theobroma cacao L. desengrasada y limpia, se

someti a hidrlisis cida, mediante reflujo a 2500 RPM con cido ctrico a pH
3, relacin 1:25, variando tiempo y temperatura de extraccin [20], (ver Figura
29.).

54
Figura 29 Montaje extraccin de pectina de la cascarilla de cacao del Theobroma
cacao L. mediante reflujo.
Fuente: autoras

Finalizado el reflujo, se someti a centrifugacin a 2500 RPM durante 30

minutos, se filtr y al hidrolizado obtenido se le realiz la precipitacin de los
polisacridos con etanol absoluto en relacin con la muestra 2:1, (ver Figura
30.), se dej reposar por 16 horas a 4C y se centrifug por 30 minutos a 2500
RPM, obteniendo la separacin de los polisacridos, basados en la
metodologa descrita por otros autores [20,72].

Figura 30. Precipitacin de la pectina con etanol.

Fuente: autoras

55
 6.2.2 PURIFICACIN Y SECADO DE LA PECTINA DEL Theobroma Cacao
L.

La pectina obtenida fue sometida a tres lavados con etanol absoluto en relacin
1:1, seguido de una centrifugacin por 20 minutos a 2500 RPM. Posteriormente
se decant el exceso de Etanol presente. La pectina fue secada por
conveccin en estufa Binder a 40C por 12 horas, segn las condiciones
descritas en otros estudios [20,72] (Figura 31).

Figura 31. Secado por conveccin de la pectina.

Fuente: autoras

6.3 CARACTERIZACIN QUMICA Y FSICA DE LA PECTINA DE LA

CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L.

6.3.1 DETERMINACIN DEL PESO EQUIVALENTE (PE) Y ACIDEZ LIBRE

(AL).

Se pes 500 mg de pectina en un matraz de 250 mL. Esta se humedeci con 5

mL de Etanol absoluto; posteriormente se adicion un volumen de 100 mL de
agua destilada libre de CO2 y 6 gotas del indicador rojo fenol. Se agit y se
titul con NaOH 0.1 N, hasta viraje de color amarillo a rosa, aplicando la
metodologa propuesta por Owens [52] (Figura 32).

56
6.3.2 PORCENTAJE DE METOXILO (ME), GRADO DE ESTERIFICACIN
(GE) Y PORCENTAJE DE CIDO ANHIDRIDO GALACTURNICO (AAG).

A la solucin empleada para la determinacin del peso equivalente y acidez

libre, se agregaron 25mL de hidrxido de sodio 0.25N y se dej en reposo por
30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se agregaron 25mL de
cido clorhdrico 0.25N. Luego de agitar, se titul con hidrxido de sodio 0.1N,
tomando como punto final de la titulacin pH 7.5 o color rojizo permanente por
20 segundos (Figura 32), segn metodologa descrita por otros autores [52, 73].

Figura 32. Viraje en el color de la solucin pctica.

Fuente: autoras

6.3.3 GRADO DE GELIFICACIN (GG).

Se pesaron en seis beakers de 200mL previamente rotulados de 0,4 a 1,4 g de

pectina. Posteriormente, se adicionaron a cada vaso 50 mL de agua destilada
y se llevaron a ebullicin hasta la disolucin completa de la pectina; luego se
agregaron 100 g de sacarosa, mediante agitacin y calor se homogeniz
completamente. Finalmente, se agreg agua destilada hasta peso de 150 g y
se adicion cido ctrico hasta obtener el pH adecuado (3,2 3,5). Estos geles
se dejaron reposar por 24 horas y luego se evaluaron las caractersticas de
cada uno de ellos en forma visual, determinando cual present la mayor
reduccin. Este proceso fue basado en la metodologa descrita por otros
autores [74].

6.3.4 VISCOSIDAD DE LA PECTINA.

S prepar una solucin en un matraz de 100mL, adicionando 0.1g de pectina,

0.8g de NaCl, 0.2g Hexametafosfato de sodio y finalmente aforando con agua
destilada. Posteriormente, este proceso se repiti para una solucin de

57
 composicin similar a la anterior pero sin pectina, basndose en el mtodo del
tiempo de escurrimiento en el viscosmetro de Ostwald [75].

6.4 COMPOSICIN DE LA PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL

Theobroma Cacao L.

6.4.1 DETERMINACIN DE FENOLES TOTALES POR FOLIN-CIOCALTEAU

DE LA PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao
L.

Se emple un espectrofotmetro de doble haz, marca Thermo Scientific UV

visible evolution 60s, a una absorbancia de 760nm. Se prepar una solucin
patrn de 800ppm de cido glico, de la cual se prepararon las siguientes
diluciones 400, 200, 100, 50, 25 ppm. Se tom 0.1 mL de cada una de las
soluciones patrn, de la pectina previamente tratada y del blanco, se adicion
3mL de agua, 0,5mL de reactivo de folin- ciocalteau, el cual se prepar en una
relacin 1:1 con agua destilada. Posteriormente, se adicion 1,5mL de Na2CO3
20%, la solucin se aforo a 10mL y se incubo durante 30 minutos en oscuridad
y a temperatura ambiente. Con base a la metodologa descrita por otros
autores [11,73].

6.4.1.1 Tratamiento de la pectina para anlisis.

Se pes 0,1g de pectina y se adicion 6mL de metanol-HCl 1%. Esta solucin

se someti a ultrasonido durante 10min, para posteriormente ser centrifugada
a 4000 RPM por 15 minutos. Nuevamente se repiti el proceso anterior
adicionando solamente 2mL de metanol-HCl 1%. Finalmente, se afor la
solucin obtenida a un volumen de 10mL. (Ver Figura 33).

Figura 33 Triplicado de la solucin pctica en la determinacin de fenoles

totales.
Fuente: autoras

58
6.4.2 DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS PRESENTES DE LA PECTINA
Theobroma Cacao L .

6.4.2.1 Determinacin cuantitativa de los carbohidratos totales por

Dubois.

Se us un espectrofotmetro de doble haz, marca Thermo Scientific UV

Visible Evolution 60s. Se prepar una solucin patrn de glucosa a 400 ppm y
se realizaron diluciones de 16, 20, 24, 28, 32 ppm. Para la obtencin del
derivado coloreado, se tom en un tubo de ensayo 1 mL de las diluciones y
de la pectina previamente tratada, se agreg 0,5 mL de fenol al 5% y 2,5 mL
H2SO4 95% (ver Figura 34). Finalmente se realiz la lectura a una longitud de
onda de 492nm. Se seleccion la curva que present mayor linealidad,
aplicando la metodologa descrita por otros autores [58,76].
6.4.2.1.1 Tratamiento de la pectina para anlisis.

Se pes 0,1g de pectina, se disolvi en 10mL de agua; a esta solucin se

adicion 0,5mL de sulfato de zinc 10%, y 0,5mL de NaOH 0,5N.
Posteriormente, se dej en reposo durante 15min y se centrifugo a 200
RPM, segn la metodologa descrita por otros autores [58,76].

Figura 34. Patrones para curva de Dubois.

Fuente: autoras

6.4.2.2 Prueba de Fehling.

En un tubo de ensayo se coloc 1mL del hidrolizado, luego se le adicion

1mL de la solucin del reactivo de Fehling, se calent la muestra al bao

59
 mara de 10 a 15 minutos, siendo positiva si se obtiene precipitado rojo
[76,77].

6.4.2.3 Identificacin cualitativa de carbohidratos por Cromatografa de

Capa Delgada (CCD).

Se realiz en placas de slica gel 60 F254MERCK empleando estndares de

azcares Ramnosa, Glucosa, Arabinosa y Galactosa (kit de carbohidratos
sigma aldrich), y cido D-Galacurnico; la muestra de hidrlisis de la pectina
se sembraron 20 veces al igual que los estndares por duplicado para
comprobar la repetibilidad del mtodo; el sistema de elucin usado fue
Butanol/cido Actico /Agua (2:1:1) y se revel con una mezcla de
Etanol/H2SO4/Agua en proporciones 2:1:2.
6.4.2.4 Identificacin del cido D-Galacturnico presente de la pectina
por Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (CLAE).

Con base en mtodos empleados en otros estudios [78], se implement un

mtodo de separacin con las condiciones descritas en la Tabla 2.

Tabla 2 Condiciones de separacin por CLAE del cido D-Galacturnico.

Equipo Agilen
Software AgilentHPLC ChemStation
Detector UV, =212 nm
Columna RP C-18
Flujo 0,4 mL/min
Fase mvil Solucin 0.02M KH2PO4(ajustado pH 2.35), al 3% Metanol
(Isocrtico)
Temperatura columna 30 C
Temperatura detector 35 C

Tiempo corrida 5 min

6.4.2.4.1 Anlisis cualitativo.

La identificacin del monosacrido cido en la muestra de anlisis se

realiz por comparacin con el tiempo de retencin del estndar (cido D-
Galacturnico) corrido en las condiciones de anlisis por CLAE descritas
en la Tabla 3., basados en metodologa descrita por [78].

60
 6.4.2.4.2 Anlisis cuantitativo.

La determinacin cuantitativa se llev a cabo por CLAE en las mismas

condiciones cromatografas que el anlisis cualitativo y se realiz por el
mtodo del estndar externo, se construy una curva de calibracin de
cinco puntos. Se prepar una mezcla de estndares de 2000ppm (solucin
patrn) a partir de la cual se hicieron las diluciones de concentracin entre
90 ppm y 1000 ppm por triplicado, usando como base los estudios previos
realizados por [79,64].

6.4.2.5 Identificacin de Grupos Funcionales por Espectroscopa

Infrarroja (IR).

Se pes 1 g de pectina, se tritur hasta obtener un polvo muy fino, de all se

tom una pequea cantidad y se deposit en el lente de anlisis del equipo
de espectroscopia infrarroja marca Agilent Technologies Cary 630 FTIR y se
procedi a la lectura, basados es metodologa descrita por otro autor [80].

6.7 ANLISIS PROXIMAL.

Todas las determinaciones se realizaron por triplicado en las mismas

condiciones.

6.7.1 HUMEDAD (H).

Se determin segn la norma NTC-512 [61]. Se pes 1 g de pectina en una

cpsula de porcelana previamente tarada, sta se llev a desecacin a la
estufa marca Binder a una temperatura de 105C por 4 horas, por ltimo se
dej en un desecador hasta alcanzar la temperatura ambiente y se pes
nuevamente. Este proceso se repiti hasta obtener un peso final constante
[81].

6.7.2 CENIZAS.

Se hizo segn el mtodo descrito en la NTC-518 [81]. Se pes

aproximadamente 1g de pectina en vidrio reloj. Las muestras de pectina se
colocaron en crisoles previamente tarados y se llevaron a una mufla a una
temperatura de 500C, durante 1h. Se dej enfriar en el desecador y se pes;
este proceso se realiz hasta tener un peso final constante.

61
 6.7.3 GRASAS.

Se realiz por el mtodo de extraccin Soxhlet, usando como solvente ter de

petrleo en relacin 1:10 durante 12 horas, aplicando la norma NTC-668 [81].

6.7.4 FIBRA.

Se realiz segn la norma NTC-668 [81]. A la muestra de pectina

desengrasada y seca, se adicion 200mL de cido sulfrico concentrado y se
someti a reflujo. Se filtr al vaco y sec a 100C, posteriormente se adicion
200mL de NaOH concentrado, se llev a ebullicin durante 30min, se filtr y
lav con agua, HCl y ter de petrleo. Finalmente, se coloc en un crisol
previamente tarado y se llev a la mufla durante 3 horas a 550C.

6.7.5 PROTENAS.

A la muestra de pectina se le realiz una digestin con H 2SO4 concentrado y

posteriormente se destil segn mtodo AOAC 920.87 [82], en un equipo VELP
SCIENTIFICA, el producto de destilacin se valor con HCL 0.00122N
utilizando como indicador mixto (rojo de metilo y azul de metileno).

6.8 ANLISIS ESTADSTICO.

Se realiz un anlisis de varianza (ANOVA de dos factores) con el cual se

evaluaron los parmetros de extraccin de la pectina de la cascarilla de cacao
del Theobroma cacao L, incluyendo pruebas especficas de Shapiro- Wilk,
Levene y el coeficiente de correlacin de Pearson.

Para garantizar los mtodos de identificacin y separacin por CLAE del cido
D-Galacturnico, se evaluaron los parmetros de linealidad, precisin y
reproducibilidad mediante el software InfoStat/E 2008.

62
 7 RESULTADOS Y DISCUSION.

7.1 DESCRIPCIN DE LA CASCARILLA DE THEOBROMA CACAO L.

En la Tabla 3 se presentan las principales caractersticas observadas de la

cascarilla estudiada.

Tabla 3 Principales caractersticas de la cascarilla de Theobroma cacao L.

estudiada.

CARACTERISTICAS DESCRIPCIN

Gama de colores desde marrn muy oscuro hasta

Color
tonalidades claras (Figura 35.).

Olor Aroma suave y dulce, semejante al chocolate.

Forma No presentan formas definidas, son irregulares (Figura 35.).

Figura 35 Cascarilla de cacao Theobroma cacao L.

Fuente: Autoras.

Las cascarillas usadas en este estudio fueron suministras por una industria
chocolatera de la regin cafetera y corresponden a una mezcla de materias
primas que le confiere una alta heterogeneidad a sus diferentes caractersticas
fsicas y qumicas.

63
7.2 EXTRACCIN DE PECTINA DEL CACAO DEL Theobroma Cacao L.

7.2.1 ENSAYOS PRELIMINARES DE EXTRACCIN DE LA PECTINA DEL

CACAO DEL Theobroma Cacao L.

Se establecieron ensayos preliminares de extraccin de pectina de la cascarilla

del cacao Theobroma cacao L. para obtener el mejor mtodo. Se aplicaron
diferentes parmetros de extraccin, a temperaturas de 95, 95, 80 y 70 C y
tiempos de 100, 95, 85 y 75 minutos. A cada una de estas extracciones se le
hall porcentaje de rendimiento, contenido de metoxilo, contenido de cido
galacturnico, peso equivalente, acidez libre y grado de esterificacin; tambin
se tuvo en cuenta las caractersticas fsicas como color y textura. En la Tabla 4
se muestran los resultados obtenidos en cada ensayo.

64
Tabla 4. Resultados del anlisis preliminar de la pectina extrada de la cascarilla de cacao del Theobroma Cacao L.

Peso Acidez Libre Contenido Contenido de

PARMETROS Numero Grado de
Temperatura Tiempo equivalente (meq de cido
DE de Rendimiento esterificacin
EXTRACCIN (C) (minutos) (mg Pectina/ carboxilos Metoxilo galacturnico
Ensayos (%) (%)
meq NaOH) libre/ g pectina) (%) (%)

1 24,2827 2914,39 0,34 2,78 72,36 21,85

2 26,7579 3014,79 0,33 2,54 71,19 20,26
A 95 100 3 26,7192 2884,30 0,35 2,76 72 21,79

PROMEDIO 25,92 2937,83 0,34 2,70 71,85 21,3

1 12,0311 2363,04 0,42 2,62 66,67 22,34

2 12,216 2475,25 0,40 2,82 69,23 23,11
B 95 95 3 12,379 2482,67 0,40 2,50 66,67 21,27

PROMEDIO 12,21 2440,32 0,41 2,65 67,52 22,24

1 9,5312 3175,74 0,31 2,81 74,19 21,48

2 9,7547 2832,78 0,35 2,43 68,97 20,02
C 80 85 3 9,5072 3101,49 0,32 2,87 74,19 21,99

PROMEDIO 9,6 3036,67 0,33 2,70 72,45 21,16

1 9,892 2073,02 0,48 2,93 66,2 25,12

2 11,89 2036,37 0,49 2,86 65,25 24,87
70 75
D 3 11,118 1997,62 0,50 2,92 65,28 25,37

PROMEDIO 11,00 2035,67 0,49 2,90 65,6 24,8

65
Segn los resultados obtenidos en la Tabla 4, la pectina obtenida aplicando los
parmetros de extraccin A, 95C y 100 minutos, present un porcentaje de
rendimiento mayor (25,92%), al resto de los ensayos realizados en este
estudio. Al igual que los resultados obtenidos por Vriesmann [20], se demostr
que a mayor temperatura y tiempo de hidrlisis aumentan el rendimiento de la
pectina, pero disminuye su calidad, lo cual se observa en el color oscuro,
textura laminosa y rgida de la pectina estudiada (Figura 36).

Figura 36 Pectina obtenida del cacao (Theobrama cacao L.), aplicando el

parmetro de extraccin A, temperatura de 95C-100minutos.
Fuente: Autoras

La extraccin de pectina a 95C-95min fue basada en la metodologa planteada

por Vriesmann [20]. A estas condiciones la pectina extrada present un menor
porcentaje de rendimiento en comparacin con la pectina obtenida a 95C-
100minutos, su contenido de metoxilo y de cido galacturnico fue muy similar,
pero su apariencia y color caf fue ms claro, al igual que su textura fue menos
rgida (ver figura N37).

Figura 37. Pectina obtenida de la cascarilla de cacao del Theobrama cacao L.,
aplicando el parmetro de extraccin B, temperatura de 95 C y 95 minutos.
Fuente: Autoras

66
La pectina obtenida aplicando los parmetros de extraccin de 80C- 85min,
presento un color ms claro y textura ms suave que las anteriores (ver figura
38.), el porcentaje de metoxilo de 2.7% la clasifica como de Bajo Metoxilo,
(menor de 7%) [23,83].

Figura 38. Pectina obtenida de la cascarilla de cacao del Theobrama cacao L.

aplicando el parmetro de extraccin C, temperatura de 80 C y 85 minutos.
Fuente: Autoras

Al realizar el ensayo a una temperatura de 70C por 75 minutos, se obtuvo una

pectina de apariencia parecida a la comercial (ver figura 39.), aunque tuvo un
rendimiento de 11.0% y un porcentaje de metoxilo de 2.90%, present el ms
alto porcentaje de cido D-galacturnico (24.8%), un referente de gran
importancia, que permite conocer el grado de pureza de la sustancia pctica,
debido a que la pectina es un polisacrido constituido en su mayora por cido
D-galacturnico, pero puede presentar otros azcares [54].

Figura 39. Pectina obtenida de la cascarilla de cacao del Theobrama cacao L.,
aplicando el parmetro de extraccin D, temperatura de 70 C y 75 minutos.
Fuente: Autoras

Concluyendo con los resultados obtenidos del anlisis preliminar de extraccin,

la temperatura y el tiempo que presentan los mejores resultados de las
condiciones ensayadas para la extraccin de pectina de la cascarilla de cacao
Theobroma cacao L., son los establecidos en el parmetro de extraccin D,
temperatura de 70C y tiempo de 75 minutos, la cual presenta caractersticas

67
fsicas de color y textura similar a la comercial, y porcentaje de metoxilo y cido
galacturnico superiores a las dems condiciones aplicadas.

7.2.2 EXTRACCIN DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO DEL

Theobroma Cacao L. APLICANDO DISEO FACTORIAL 22.

Se estableci un diseo factorial ANOVA factor 22 (Tabla 5), tomando las

temperaturas de 70C y tiempo de 75 minutos, basados en la discusin del
numeral 7.2.1, y una temperatura de 90C y tiempo de 95 minutos, parmetros
establecidos por Vriesmann [20].

68
Tabla 5 Resultados de las caractersticas qumicas evaluadas a la pectina extrada de la cascarilla de cacao del
Theobroma Cacao L., aplicando el diseo factorial 22.

Acidez libre Peso

Tiempo de AL (meq equivalente Contenido de Grado de Contenido de cido
Temperatura de %
extraccin carboxilos PE (mg Metoxilos esterificacin Galacturnico
extraccin (C) Rendimiento
(minutos) libre/ g Pectina/ meq %MET %EST %AG
pectina) NaOH)
9,89 0,48 2073,02 2,93 66,2 25,12
70 75 11,89 0,49 2036,37 2,86 65,25 24,87
11,12 0,5 1997,62 2,92 65,28 25,37
9,1 0,45 2220,52 3,43 71,05 27,38
70 95 8,02 0,4 2484,16 3,31 72,6 25,86
9,35 0,43 2299,86 3,47 72 27,33
7,94 0,24 4143,56 2,37 76 17,7
95 75 7,59 0,2 5124,75 2,42 80 17,17
7,6 0,22 4513,05 2,44 78 17,73
12,03 0,42 2363,04 2,62 66,67 22,34
95 95 12,22 0,4 2475,25 2,82 69,23 23,11
12,38 0,4 2482,67 2,5 66,67 21,27

69
7.2.2.1 Prueba de Normalidad.

Se sigui la prueba de normalidad de Shapiro- Wilk (Tabla 6.) el cual muestra

que los valores de significancia fueron mayores a 0,05. Con lo cual se
comprueba que las caractersticas qumicas para las diferentes temperaturas
y tiempos de extraccin se distribuyen en forma normal [48].

Tabla 6. Prueba de normalidad de las diferentes temperaturas de extraccin

de pectina de la cascarilla de cacao del Theobroma cacao L.

70
Tabla 7. Prueba de homogeneidad de varianza.

Otra condicin fue la homogeneidad de varianza mediante la prueba de

Levene (ver Tabla 7.), en la cual se puede observar que se tiene un valor de
significancia mayor a 0,05 de esta manera se puede constatar que todos los
datos tienen una homogeneidad de varianza normal [48].

7.2.2.2 ANOVA de dos factores.

Las diferencias estadsticas se comprobaron con ANOVA de dos factores,

empleando el estadstico F que refleja la comparacin entre las medias de las
caractersticas qumicas en cada extraccin de pectina.

Por lo tanto, para realizar el anlisis de ANOVA de dos factores se

establecieron 2 hiptesis:

1. Hiptesis nula Ho: las medias entre los grupos formados por los factores
tiempo y temperatura son iguales.

2. Hiptesis alterna H1: al menos en alguno de los grupos formados por el

factor tiempo y temperatura son diferentes.

Tabla 8. ANOVA de dos factores para caractersticas qumicas en las

condiciones de extraccin de pectina de la cascarilla de cacao Theobroma
cacao L.

71
 Suma de cuadrados tipo
Origen III gl Media cuadrtica F Sig.
Modelo Rendimiento (%) a
37,278 3 12,426 31,307 ,000
corregido (meq carboxilos libre/ g
,121 b 3 ,040 127,746 ,000
pectina)
(mg Pectina/ meq c
12411421,810 3 4137140,603 61,341 ,000
NaOH)
Contenido de Metoxilos
1,631 d 3 ,544 60,741 ,000
(%)
Grado de esterificacion e
273,065 3 91,022 51,374 ,000
(%)
Contenido de cido
149,444 f 3 49,815 113,134 ,000
Galacturnico (%)
Interseccin Rendimiento (%) 1182,663 1 1182,663 2979,626 ,000
(meq carboxilos libre/ g
1,786 1 1,786 5641,289 ,000
pectina)
(mg Pectina/ meq
97549075,031 1 97549075,031 1446,343 ,000
NaOH)
Contenido de Metoxilos
96,844 1 96,844 10820,560 ,000
(%)
Grado de esterificacion
60059,675 1 60059,675 33898,504 ,000
(%)
Contenido de cido
6313,547 1 6313,547 14338,651 ,000
Galacturnico (%)
Rendimiento (%)
,013 1 ,013 ,032 ,863

(meq carboxilos libre/ g

,063 1 ,063 199,184 ,000
pectina)
(mg Pectina/ meq
NaOH)
5321033,766 1 5321033,766 78,894 ,000
Tempextr

Contenido de Metoxilos
1,172 1 1,172 130,936 ,000
(%)
Grado de esterificacion
48,763 1 48,763 27,523 ,001
(%)
Contenido de cido
111,691 1 111,691 253,661 ,000
Galacturnico (%)
Rendimiento (%)
4,165 1 4,165 10,494 ,012

(meq carboxilos libre/ g

pectina)
,011 1 ,011 36,026 ,000

(mg Pectina/ meq

NaOH)
2578793,553 1 2578793,553 38,235 ,000

Tiempoextr
Contenido de Metoxilos
(%) ,407 1 ,407 45,476 ,000

Grado de
esterificacion(%) 13,042 1 13,042 7,361 ,027

Contenido de cido
Galacturnico (%)
31,137 1 31,137 70,716 ,000

Tabla 9. Continuacin ANOVA de dos factores para caractersticas qumicas

en las condiciones de extraccin de pectina de la cascarilla de cacao
Theobroma cacao L.

72
 Rendimiento (%) 33,100 1 33,100 83,394 ,000
(meq carboxilos libre/ g
pectina)
,047 1 ,047 148,026 ,000

(mg Pectina/ meq

4511594,490 1 4511594,490 66,893 ,000
NaOH)
Tempextr * Contenido de Metoxilos
(%) ,052 1 ,052 5,811 ,042
Tiempoextr

Grado de esterificacion
(%) 211,260 1 211,260 119,238 ,000

Contenido de cido
Galacturnico (%)
6,616 1 6,616 15,025 ,005

Error Rendimiento (%) 3,175 8 ,397

(meq carboxilos libre/ g
,003 8 ,000
pectina)
(mg Pectina/ meq
539562,788 8 67445,348
NaOH)
Contenido de Metoxilos
,072 8 ,009
(%)
Grado de esterificacion
14,174 8 1,772
(%)
Contenido de cido
3,523 8 ,440
Galacturnico (%)
Total Rendimiento (%) 1223,117 12
(meq carboxilos libre/ g
1,910 12
pectina)
(mg Pectina/ meq
110500059,629 12
NaOH)
Contenido de Metoxilos
98,547 12
(%)
Grado de esterificacion
60346,914 12
(%)
Contenido de cido
6466,514 12
Galacturnico (%)
Total Rendimiento (%) 40,454 11
corregida (meq carboxilos libre/ g
,124 11
pectina)
(mg Pectina/ meq
12950984,597 11
NaOH)
Contenido de Metoxilos
1,702 11
(%)
Grado de esterificacion
287,239 11
(%)
Contenido de cido
152,967 11
Galacturnico (%)

73
 Con base en los resultados de la prueba de normalidad y la prueba de
homogeneidad de varianzas, se habilita el anlisis de varianza (ANOVA) para
los factores tiempo y temperatura de extraccin, y su interaccin. Las tablas
8 y 9, muestran que los factores tiempo, temperatura y la interaccin
tiempo*temperatura, ejercen un efecto significativo (sig< 0,05) para todas las
variables de respuesta (rendimiento, acidez libre, peso equivalente, contenido
de metoxilo, grado de esterificacin y contenido de cido galacturnico).

Con base en lo anterior se analizaron las medias de las variables

dependientes de las interacciones tiempo * temperatura (Tabla 10.), se eligi
la mejor condicin de extraccin para obtener la mejor calidad de pectina,
con base en los mayores contenido de metoxilo y de cido galacturnico. De
igual forma el anlisis tuvo en cuenta el comportamiento de las grficas de
medias para cada una de las caractersticas qumicas en interaccin entre
Temperatura y tiempo (Ver Anexo 2), con lo cual se concluy que las mejores
condiciones de extraccin fueron: temperatura de 70C y por 95 minutos.

Tabla 10 Medias caractersticas qumicas en interaccin entre temperatura-

tiempo

INTERACCIN (meq Contenido de

TEMPERATURA carboxilos Contenido Grado de cido
- TIEMPO Rendimiento libre/ g (mg Pectina/ de Metoxilos Gelificacin Galacturnico
(%) pectina) meq NaOH) (%) (%) (%)

70C - 75' 10,97 0,49 2035,67 2,90 65,57 25,12

70C-95' 8,83 0,43 2334,85 3,40 71,89 26,86

95C-75' 7,71 0,22 4593,79 2,41 78,00 17,53

95C-95' 12,21 0,41 2440,32 2,65 67,52 22,24

74
Tabla 11. Correlacin entre el contenido de metoxilo y contenido de cido
galacturnico.

Contenido de Metoxilos Contenido de cido

(%) Galacturnico (%)
Correlacin **
1 ,920
de Pearson
Contenido de
Sig.
Metoxilos (%) ,000
(bilateral)
N 12 12

Una condicin que se puede utilizar para evaluar la condicin lineal entre el
contenido de metoxilo y de cido galacturnico es la correlacin de Pearson
(ver tabla 11), donde la relacin entre ambas fue de 0,920, lo cual muestra
que hay una correlacin positiva y muy fuerte entre ellas, lo que quiere decir
que a medida que aumenta el contenido de metoxilo aumenta el de cido
galacturnico. Esta tendencia puede apreciarse en la en la grfica 1.

Grfica 1 Correlacin de Pearson entre el contenido de metoxilo y cido

galacturnico de la pectina de cacao del Theobroma cacao L.

75
7.3 ANLISIS CARACTERIZACIN QUMICA DE LA PECTINA EXTRADA DE
LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L.

7.3.1 ACIDEZ LIBRE (AL) Y PESO EQUIVALENTE (PE).

Tabla 12 Anlisis de Acidez Libre y Peso Equivalente de la pectina de la

cascarilla de cacao del Tehobroma cacao L.

Peso
Temperatura Tiempo de equivalente Acidez libre AL
de extraccin extraccin PE (mg (meq carboxilos
(C) (minutos) Pectina/ meq libre/ g pectina
NaOH)
2220,52 0,45
70 95 2484,16 0,4
2299,86 0,43
Promedio 2334,84 0,426
Desviacin () 135,3 0,025

En la Tabla 12. se presentan los resultados por triplicado del anlisis de acidez
libre y peso equivalente de la pectina extrada, los cuales se determinaron
mediante una titulacin acido-base.

Segn la matriz y parmetros de extraccin, las pectinas presentan diferentes

caractersticas [13]. En el anlisis realizado en este estudio se obtuvo un
promedio de 2334,84mg/meq del peso equivalente, este valor es mayor al
obtenido por otro estudio que usa la cascarilla de cacao como matriz de
extraccin pero difieren las condiciones de pH, tiempo y solucin extractora,
reportando valores del peso equivalente entre 385,47 a 464,61 g/equivalente
[23], sin embargo es muy cercano al reportado por otro autor quien obtuvo
valores entre 2512,5 - 2583,33 mg/meq, usando como matriz la guayaba [84].

La pectina estudiada present un valor de 0,43 meq/g de Acidez Libre, la cual

representa los carboxilos libres en la cadena lineal de la pectina [52], el valor
reportado fue muy cercano al obtenido por otro autor quien analiz la pectina
de mango, reportando valores entre 0,1294 y 0,3734 meq/g [85]. Otros estudios
realizados en Ecuador, usando como matriz cascarilla de cacao (Theobroma
cacao L.), pero variando la solucin extractora (cido clorhdrico y EDTA 0,5 %)
reportaron 1,39 meq/g [21], un resultado mayor al obtenido en este estudio,
atribuido a las diferencias en los parmetros de extraccin de pectina.

76
 7.3.2 CONTENIDO DE CIDO GALACTURNICO, METOXILO Y GRADO DE
ESTERIFICACIN.

Tabla 13 Anlisis Contenido de cido Galacturnico, Metoxilo y Grado de

esterificacin de pectina.

Temperatur Contenido Contenido de

Tiempo de Grado de
a de de cido D-
extraccin esterificacin
extraccin Metoxilo Galacturnico
(minutos) %EST
(C) %MET % AG

3,43 27,38 71,05

70 95 3,31 25,86 72,6
3,47 27,33 72
Promedio 3,4 26,84 71,88
Desviacin () 0,083 0,864 0,782

En la Tabla 13. Se muestra el resultado de anlisis del contenido de metoxilo,

cido galacturnico, y grado de esterificacin. Obtenindose un promedio de
3,4% en contenido de metoxilo lo cual indica una extraccin de pectina de bajo
metoxilo, las cuales se caracterizan por un grado de metilacin menor al 7%
[23,83]. Se reporta un promedio en el grado de esterificacin de 71,88%, muy
similar a la literatura reportada por Adomako [86]. En el cual se obtienen
pectinas de la cascarilla de cacao con un contenido de metoxilo de 3,6 - 4,9 % y
un grado de esterificacin entre 60 y 76%. Segn la literatura la disminucin del
grado de esterificacin en pectinas de bajo metoxilo aumenta la habilidad de
formar geles, por ende se estima un porcentaje menor al 50% [87]. Sin embargo
se obtuvo un porcentaje mayor a lo esperado, debido a que podran existir
grupos carboxilo esterificados con otros grupos como etoxilo o amidas [88].

El contenido de cido D-galacturnico determina la pureza de la pectina extrada

lo cual hace que sea el parmetro ms importante para determinar su calidad, es
decir que entre mayor es el porcentaje mayor es la pureza [54]. En los resultados
se obtuvo 26,84% de contenido de cido galacturnico por tanto se tiene una
pectina con muchas impurezas, confirmando lo dicho en el contenido de
cenizas.

77
7.3.3 ANLISIS DETERMINACIN DE FENOLES TOTALES POR EL
MTODO DE FOLLIN- CIOCALTEU DE LA PECTINA DE LA CASCARILLA
DE CACAO DEL Theobroma Cacao L.

De la curva de calibracin para la cuantificacin de Fenoles totales se obtuvo la

ecuacin y = 0,001x + 0,0195 con un R = 0,999.

Tabla 14 Concentracin de Fenoles Totales de la pectina de la cascarilla de

cacao del Theobroma cacao L.

FENOLES TOTALES
ANALISIS
(g/100g)
1 9,45
2 9,75
3 9,85
Promedio 9,68
Desviacin () 0,208

En la Tabla 14. Se muestran los resultados de concentracin de fenoles totales

obtenindose un promedio de 9,68%, el cual es atribuido a la presencia de
compuestos polifenlicos, que se encuentran entre 14-20 % en la cascarilla y
el grano seco del cacao. Los principales compuestos polifenlicos que tienen
son las catequinas (3,0-6,0%), leucocianidinas (2,5%) y taninos (2,0-3,5%),
estos otorgan coloracin oscura y sabor astringente-amargo. La presencia de
estos compuestos fenlicos de la pectina afectan sus propiedades
organolpticas.

En el 2008, estudios de otros autores obtuvieron pectina de la cascarilla de

cacao usando HCl, obteniendo resultados del 0% de fenoles [89]. En el 2011,
un anlisis realizado a la pectina extrada de la cascarilla de cacao, usando
como solucin extractora cido ntrico a pH 1.5, 100C y 30 minutos, report
una concentracin de compuestos fenlicos igual a 3,9 % [22]. Por otro lado
estudios ms recientes, donde se us cido ctrico pH 3, 95C y 95 min, report
una concentracin de 9.4% [20], valor cercano al obtenido en este estudio.
Basados en el resultado obtenido (Tabla 14) y en los reportes bibliogrficos, se
infiere que los parmetros de extraccin afectan la concentracin de fenoles
totales de la pectina, sin embargo se requieren otros estudios para confirmar lo
expresado.

78
7.3.4. ANLISIS CUANTITATIVO DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS
TOTALES POR EL MTODO DE DUBOIS-GILES.

Se determin la concentracin de carbohidratos totales por el mtodo de

Dubois-Giles mediante la curva de calibracin ver anexo 4 que presento la
ecuacin y = 0,0186x - 0,1033 y un R = 0,9937, lo que indica que la curva de
calibracin es lineal.
.

Tabla 15 Concentracin carbohidratos totales de la pectina de la cascarilla

de cacao.
CARBOHIDRATOS
ANALISIS TOTALES
(g/100g)
1 42,18
2 41,13
3 42,60
Promedio 42,03
Desviacin () 0,62

La estructura pctica se encuentra conformada no solo por monmeros de

cido D-Galacturnico con o sin esterificacin, sino tambin se encuentra
monmeros de azcares como Ramnosa, Arabinosa, Galactosa y Glucosa [54].

En la Tabla 15, se muestra la concentracin de carbohidratos totales obtenidos

de la pectina extrada, reportando un promedio de 42,03 %, con una desviacin
estndar de 0,652 indicando que no hubo mucha dispersin en los datos
obtenidos con la pectina extrada de la cascarilla de cacao. El resultado
obtenido en este estudio es bajo al compararlo con otro estudio realizado en el
2012 por Vriesmann [20], usando pectina de cascarilla de cacao, quien report
64% de carbohidratos totales, frente a los resultados obtenidos en el 2011 por
Vriesmann, donde se emple una solucin extractora de cido ntrico a pH 1.5,
reportando un porcentaje de 69,9% de carbohidratos totales de la pectina de
cascarilla de cacao [22].

79
7.3.5 ANLISIS CUALITATIVO DE AZCARES REDUCTORES POR MEDIO
DE LA PRUEBA DE FEHLING.

Figura 40 Prueba de Fehling para la hidrolisis de pectina de la cascarilla de

cacao del Theobroma cacao L.

En la Figura 40, se observa el triplicado de la prueba de Fehling realizado a la

hidrlisis de la pectina de la cascarilla de cacao del Theobromca cacao L. Se
identific en los tres ensayos la presencia de un precipitado rojo debido al
xido cuproso (Cu2O) formado (Ver Figura 24), lo cual indica la existencia de
azcares reductores en la hidrlisis de la pectina capaces de reducir los iones
cprico (Cu+2) al estado cuproso (Cu+) [56].

7.3.6 ANLISIS CUALITATIVO DE IDENTIFICACIN DE AZCARES POR

CROMATOGRAFA DE CAPA DELGADA (CCD) DE LA PECTINA DE
ESTUDIO.

Figura 41 Cromatoplaca de estndares de azcar e hidrolizado de la pectina

de la cascarilla de cacao del Theobroma cacao L.

80
En la Figura 41, se observa la cromatoplaca que corresponde al anlisis
preliminar del producto hidrolizado. En la cromatoplaca (en orden de siembra),
se pudo evidenciar la presencia de los estndares de cido D-Galacturnico,
Galactosa, Ramnosa, Arabinosa, Glucosa y la presencia de dos compuestos
de la pectina hidrolizada.

POSICIN DE PECTINA
ESTANDAR Rf
SIEMBRA HIDROLIZADA
1 CIDO D- 0,178
GALACTURNICO
2 GALACTOSA 0,507
3 RAMNOSA 0,740 0,179 Y 0.781
4 ARABINOSA 0,589
5 GLUCOSA 0,548

Tabla 16 Rf de estndares y pectina hidrolizada.

Segn la Tabla 16, el hidrolizado de la pectina revel un compuesto con Rf =

0.179, el cual coincide con el estndar de cido D-Galacturnico que tiene un
Rf =0.178, infiriendo que podra tratarse de este compuesto. La pectina
hidrolizada tambin revel otro compuesto con un Rf=0.781, el cual es muy
cercano al presentado por el estndar de Ramnosa, deduciendo que podra
tratarse de este compuesto.

7.3.7 ANLISIS CUALITATIVO POR CLAE DE CIDO D-GALACTURNICO

DE LA PECTINA

Figura 42 Cromatograma estndar de cido D- Galacturnico.

81
Segn el perfil cromatogrfico del estndar de
cido D-galacturnico (mostrado en la Figura 42, este eluye a 1,890 minutos,
presentndose una buena resolucin.

Figura 43 Cromatograma muestra de pectina de la cascarilla de cacao

(Theobroma cacao L.).

En la Figura 43, se muestra el perfil cromatogrfico de la muestra de pectina

donde se puede observar el pico del cido D- Galacturnico eluyendo a 1,890
minutos, de esta manera queda identificado el estndar de cido D-
galacturnico en la muestra de pectina.

7.3.8 ANLISIS CUANTITATIVO POR CLAE DE CIDO D-

GALACTURNICO DE LA PECTINA

Se determin la concentracin de cido D-galacturnico de la muestra de

pectina mediante la curva de calibracin, que present la ecuacin y = 3949,7x
+ 948617 con un R = 0,999547.

82
7.3.8.1 Linealidad de la curva de calibracin del estndar de cido
galacturnico.

Para comprobar la linealidad del mtodo analtico por CLAE del estndar de
cido D- Galacturnico se analiz el coeficiente de correlacin de Person (R)
y el modelo de regresin lineal con el software Infostat versin 2008.

Tabla 17 Resumen modelo de regresin lineal del estndar de cido

galacturnico por CLAE.

cido
Estndar Galacturnico
Modelo 564424,63
correlacin de Person (R) 1
R cuadrado 1
R cuadrado corregida 1
Error de estimacin 255,37
cambio en F 6630,64
Gl 1
Sig. Cambi en F <0,0001

Al observar los valores en la tabla 17. De los coeficientes de correlacin de

Pearson (R), los coeficientes de determinacin normal y los coeficientes de
determinacin normal corregida de los estndares de cido galacturnico, se
puedo afirmar que existe una alta correlacin lineal entre ambas variables
(rea y concentracin) ya que los valores de los coeficientes son igual a 1, es
decir la mayora de los puntos estn sobre una lnea de pendiente positiva. Y
Como el valor de sig. Cambio en F fue menor que 0,05 se confirm que el
modelo de regresin lineal es vlido [90,91].

7.3.8.2 Precisin

Tabla 18 Repetitividad del estndar de cido D-Galacturnico.

Conc
Estndar (ppm) rea 1 rea 2 rea 3 % CV
90 1273157 1273157 1273153 1273155,67 0,0001481
cido 150 1593195 1589293 1587356 1589948 0,1527
Galacturnico 300 2135818 2137310 2153050 2142059,33 0,3639
600 3502523 3279663 3528460 3436882 3,2492
1000 5035702 4815946 5030105 4960584,33 2,0622

83
 En la Tabla 18. Se muestran los valores de coeficiente de variacin, los
cuales fueron inferiores al 5% indicando que el mtodo de cuantificacin por
CLAE present una buena repetitividad.

Tabla 19 Reproducibilidad del estndar de cido D-Galacturnico.

Conc (ppm) DIA 1 DIA 2 DIA 3

cido D-
Galacturnico AREA 1 AREA 2 AREA 3 AREA 1 AREA 2 AREA 3 AREA 1 AREA 2 AREA 3 %CV
90 1259239 1273157 1273157 1273090 1272269 1273060 1273151 1273157 1273153 1271493 0,341
150 1524360 1593195 1589293 1587222 1589012 1589125 1589015 1589073 1587356 1581961 1,291
300 2154431 2135818 2137310 2137211 2147602 2136020 2154870 2155080 2153050 2145710 0,393
600 3343658 3502523 3279663 3528562 3527390 3528112 3528392 3528452 3528460 3477246 2,592
1000 4638130 5035702 4815946 4972996 4940130 4870802 5022892 5027099 5030105 4928200 2,557

Para evaluar la reproducibilidad del mtodo se prepar el estndar de cido

D- Galacturnico en tres das diferentes por triplicado los resultados
obtenidos se observan en la Tabla 19, mostrando que los valores del
coeficiente de variacin fueron inferiores al 5% indicando que el mtodo de
cuantificacin del cido D-Galacturnico es reproducible en el tiempo.

7.3.8.3 Cuantificacin de cido D-Galacturnico presente de la pectina

de la cascarilla de cacao (Theobroma cacao L.).

En la tabla 20, se observan las concentraciones del cido D-Galacturnico

en la muestra de pectina estudiada.
.

Tabla 20 Concentracin del cido D-Galacturnico presente de la pectina

de la cascarilla de cacao del Theobroma cacao L.

Concentracin
Estndar rea %m/m
(ppm)
2100709 293.36
cido
D-Galacturnico 2099319 293.00 36.63%
2098820 292.87
2099616 293.08

Para la pectina obtenida, usando como solucin de extraccin cido ctrico pH

3, se obtuvo un porcentaje de cido D-Galacturnico igual a 36.63% (Tabla

84
 20.), mediante anlisis por CLAE. Otros autores, quienes estimaron este
porcentaje por medio del mtodo colorimtrico sulfamate/3-phenylphenol
obtuvieron 66.0% de cido urnico (usando cido ntrico como solucin
extractora) [22] muy similar al obtenido por Vriesmann, 65.1% [20], el cual
realiza la extraccin de la pectina con cido ctrico, estos porcentajes difieren
al obtenido en este estudio.

Por otro lado, mediante el mtodo de valoracin cido-base, se estim un

porcentaje del 26,84%(Tabla 16) inferior al obtenido mediante anlisis por
CLAE, siendo este ltimo el que arroja ms confiabilidad en la determinacin
del porcentaje de cido D-Galacturnico, debido a la sensibilidad del equipo,
sin embargo ambos mtodos arrojan un resultado inferior al reportado por
otros autores [22,20], lo cual indica que la pectina obtenida no se encuentra
conformada en su totalidad por monmeros de cido D-Galacturnico.

7.4 ANLISIS INFRARROJO DE PECTINA DE LA CASCARILLA DE CACAO

(Theorboma Cacao L.).

a) Espectro IR de la pectina de pectina extrada de la cascarilla de cacao del

Theobroma cacao L. a condiciones de (70C- 95min).

85
 b) Espectro de una pectina comercial extrada de la manzana [92].

Figura 44 a) y b) Espectros Infrarrojo de pectina estudiada y comercial.

El espectro infrarrojo de la pectina extrada a una temperatura de 70C y un

tiempo de 95 minutos fue tomado en el equipo de espectroscopa Infrarrojo marca
Agilent Technologies Cary 630 FTIR. Al comparar el espectro IR de la pectina
extrada a condiciones de 70C-95 minutos y el de una pectina comercial extrada
de la manzana (Figura 44), se aprecian diferencias especficamente en la regin
que corresponde a los grupos carboxlicos libres (COO-) y esterificados (COOR),
bandas ubicadas en la regin de 1600 cm-1 y 1750cm-1 respectivamente. La
ausencia de un alargamiento pronunciado en la banda de 1750cm-1, indica que las
molculas de cido D-Galacturnico de la estructura pctica no se encuentran en
su mayora esterificados por grupos metoxilos, ubicando esta pectina como de
bajo metoxilo [41], ratificando los resultados obtenidos en la determinacin del
contenido de metoxilo en el numeral 7.3.2. La pectina estudiada tambin present
una banda aproximadamente en los 3300 cm-1, la cual corresponde a los grupos
OH, y una banda en los 2900 cm-1 correspondiente a los enlaces C-H, Sp3 [93].
Las bandas observadas en el espectro IR de la pectina estudiada constituyen
normalmente la estructura pctica.

86
 7.5 ANLISIS CARACTERIZACIN FSICA DE LA PECTINA EXTRADA DE
LA CASCARILLA DE CACAO DEL Theobroma Cacao L.

7.5.1 VISCOSIDAD RELATIVA DE LA PECTINA

Tabla 21. Viscosidad y peso molecular de la pectina extrada de la cascarilla

de cacao Theobroma cacao L.

Temperatur
Tiempo en Bulbo C Tiempo en Bulbo D Densidad Viscosid
a de ensayo Viscosid
(Segundos) (Segundos) (g/ml) ad Peso
25C ad
dinmica Molecular
Nmero de relativa
1 1 3 Promedio 1 2 3 Promedio 1 1 3 Promedio (cP)
Ensayo
Blanco 1,00 1,00 1,02 1,01 1,19 1,18 1,18 1,18 1,03 1,03 1,03 1,03 0,0269
1,48 66851
Pectina 1,20 1,22 1,21 1,21 1,88 1,90 1,90 1,89 1,08 1,09 1,09 1,09 0,0398

La viscosidad est ligada a la capacidad de la pectina de formar geles

consistentes, la cual depende del peso molecular, grado de esterificacin, pH y
concentracin electroltica de la solucin pctica [43]. En la Tabla 21, se
reporta la viscosidad relativa igual a 1.48 de la pectina estudiada, el cual es un
valor cercano a pectinas extradas de la pulpa de nspero de la sierra y del
mesocarpio de la granadilla (1.49-1.85 respectivamente) [78]. Al igual a las
reportadas por Ferreira [77], de pectinas extradas de una variedad de frutos
ctricos, reportando valores que van desde 2,18 hasta 1,29 de viscosidad
relativa. En estudios realizados por Vrismann [20,22], a la pectina de la
cascarilla de cacao, se reportaron viscosidades intrnsecas, por ende no se
realiz comparacin con los resultados obtenidos en este estudio. El peso
molecular de la pectina se encuentra entre 20000 a 300000 y depende del
nmero de unidades de cido D-Galacturnico que forme la estructura pctica
[47]. Conociendo el contenido de cido D-Galacturnico presente de la pectina
estudiada, 36.63%(Ver tabla 23.) y la viscosidad relativa (Tabla 21) se calcul
el peso molecular de la pectina, el cual fue igual a 66851, este valor es
pequeo, por lo tanto afecta la capacidad de la pectina extrada de la cascarilla
Theobroma cacao L. para formar geles consistentes.

87
 7.5.2 GELIFICACIN DE LA PECTINA.

Figura 45 Resultados del anlisis del grado de gelificacin de la pectina

estudiada.

Tabla 22 Resultados del Grado de Gelificacin de la pectina de la cascarilla de

cacao (Theobroma cacao L.)

Ensayo Gramos de Pectina Grado de Gelificacin

1 0.4 250
2 0.6 166.7
3 0.8 125
4 1.0 100
5 1.4 71.4

Realizando todos los ensayos a un pH igual a 3.5, 650Brix y pectina dentro de los
lmites de 0,2 a 1,5% (Figura 45), de forma visual se estableci que el ensayo
nmero 5 present mejores resultados de gelificacin (mayor reduccin y
consistencia), correspondiente a 71.4 (Tabla 22), sin embargo ningunos de los
ensayos gelific de manera apropiada, esto se debe a que la pectina obtenida en
este estudio es de Bajo Metoxilo, por lo tanto se esperaba que la adicin Ca+2
permitiera la gelificacin, tal como se muestra en la Figura 46, sin embargo esta
no se dio, atribuyndolo a la cantidad de cido D-galacturnico esterificados de la
pectina estudiada (Tabla 20 )

88
 Figura 46 Gelificacin de la pectina de la cascarilla de cacao (Theobroma
cacao L.) en presencia de calcio.

7.6 ANLISIS PROXIMAL

Tabla 23 Resultados de anlisis proximal de la pectina extrada del cacao del

Theobroma Cacao L.

Resultados
Ensayo Mtodo utilizado (%)
grasas y/o aceite extraccin Soxhlet 0,24
Protena mtodo Kjendahl 7,13
Humedad 12,69
Fibra gravimtrico <0,1
Cenizas 15,04

En la tabla 23, se presentan los resultados del anlisis proximal de la pectina

extrada de la cascarilla de cacao. Obtenindose 0,24% de contenido de grasas
y/o aceites; este porcentaje podra encontrarse debido a que el grano de cacao
se caracteriza por contener un porcentaje de grasas superior al 54% [94]. Hasta
la fecha no se encontraron referentes bibliogrficos de grasas en pectinas por lo
que no se pudo comparar el resultado de la pectina estudiada con otros. Se
obtuvo un contenido de fibra menor al 0,1% este resultado puede ser asociado a
residuos de lignina en la pectina, ya que la pectina hace parte de la fibra dietara
de la cascarilla de cacao, y est ampliamente ligada a la lignina la cual es de
difcil de extraccin y separacin [95] de igual es necesario de otros estudios
para concluir que el porcentaje de fibra de la pectina es lignina. El contenido de
protena fue de 7,13% de protena, porcentaje bajo al compararlo con el
reportado por Vriesmann [20]. Quien obtuvo un 13,8% de protena de la pectina
de la cascarilla de cacao. El contenido de humedad fue de 12,69%, cercano a la
humedad mxima de una pectina comercial que es de un 12% [96], pero muy
superior al 2.7%reportado por Vriesmann [20]. Las cenizas fueron del 15% un
valor muy alto, ya que el valor mximo para una pectina comercial es del 1%
[96], por lo tanto se considera que la pectina extrada tiene minerales como
Calcio, Potasio, Sodio, entre otros, los cuales deben ser cualificados y
cuantificados por absorcin atmica.

89
 8 CONCLUSIONES

En el presente trabajo se logr obtener pectina de la cascarilla de cacao por

el mtodo de hidrlisis cida con cido ctrico a una temperatura de 70C y
tiempo de 95 minutos, presentando un porcentaje de rendimiento del 8.8 g/
100 g de cascarilla, lo cual indica que podra ser aprovechada por la
industria.

La composicin qumica de la pectina estudiada arroj valores de peso

equivalente igual a 2335mg/meq, 0,43meq/g de acidez libre, 3,4% de
metoxilo y 71,8% de esterificacin, lo cual la define como una pectina de
bajo metoxilo y alto grado de esterificacin, propiedades que dificultan su
capacidad de formar geles.

La composicin de azcares arroj valores de cido D-Galacturnico

determinado por CLAE en la cadena pctica igual a 36.6g/ 100g de pectina
y un porcentaje de azcares totales por el mtodo de Dubois-Giles de
42,03g/ 100g de pectina, lo cual indica que estructuralmente la pectina
extrada de la cascarilla de cacao en este estudio est constituida por pocos
monmeros de cido D-Galacturnico, adems de tener presencia de
azcares libres.

La pectina obtenida en este estudio present un color pardo, debido al

contenido de fenoles totales igual a 9.68% realizado mediante el mtodo
de Follin- Ciocalteu.

El anlisis de espectroscopia infrarroja mostr la ausencia de un

alargamiento pronunciado en la banda de 1750cm-1, lo cual indic que las
molculas de cido D-Galacturnico de la estructura pctica no se
encuentra totalmente esterificados por grupos metoxilo, ubicando esta
pectina como de bajo metoxilo.

Se encontr un porcentaje de grasas y/o aceites, y de fibra de 0,24% y <0,1

% respectivamente, concluyendo que se encuentran en la pectina debido al
grano de cacao, pero no se encontraron datos en pectina.

90
 La composicin de cenizas 15,04% demostr que la pectina extrada tuvo
un alto contenido de impurezas.

El contenido de humedad fue de 12,69%, valor cercano a la humedad

mxima de una pectina comercial.

91
 9 RECOMENDACIONES

Se debe realizar un anlisis de caracterizacin, cuantificacin y eliminacin

de fenoles de la pectina extrada de la cascarilla de cacao, con el fin de
conocer la influencia de estos en las caractersticas organolpticas de la
pectina.

Realizar una cualificacin y cuantificacin de los grupos que esterifican los

cidos carboxilos de la pectina obtenida con los parmetros de extraccin
aplicados en este estudio.

Ampliar el estudio sobre el mtodo de secado de la pectina y su influencia

en sus caractersticas qumicas y fsicas.

Aplicar un mtodo de cualificacin y cuantificacin de los azcares

presentes en la estructura pctica.

Estandarizar el mtodo de cuantificacin y cualificacin del cido D-

Galacturnico por Cromatografa de Alta Eficiencia (CLAE).

92
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99
 ANEXOS.

ANEXO 1 Curva de calibracin de Fenoles Totales por Folin- Ciocalteu.

CURVA DE CALIBRACIN FENOLES TOTALES

0,900
0,800
0,700
ABSORVANCIA (nm)

0,600
0,500
y = 0,001x + 0,0195
0,400 R = 0,9998
0,300
0,200
0,100
0,000
0 200 400 600 800 1000
CONCENTRACIN (ppm)

ANEXO 2 Curva de calibracin de Carbohidratos Totales por Dubois-Giles.

GRFICA AZCARES TOTALES

0,600

0,500
ABSORVANCIA (nm)

0,400

0,300
y = 0,0186x - 0,1033
R = 0,9937
0,200

0,100

0,000
0 10 20 30 40
CONCENTRACIN (ppm)

100
ANEXO 3 Curva de calibracin del cido D-Galacturnico por CLAE.

ANEXO 4. Tabla constantes del bulbo C y D del Viscosmetro Ostwald.

BULBO C BULBO D
TEMPERATURA
(mm2/s2) (mm2/s2)
(C)
cSt/s cSt/s
40 0,01345 0,01073
100 0,01354 0,01081

ANEXO 5 Ecuacin para calcular el peso molecular de una sustancia pctica.

Donde Nr es la viscosidad relativa de la pectina y c la concentracin en g/mL

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ANEXO 6. Resultados de anlisis proximal de la pectina extrada de la cascarilla de cacao (Theobroma cacao L.).

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