DETERMINACION COLORIMETRICA DE ALBUMINA SERICA BOVINA (ASB),
EN LECHE UTILIZANDO VERDE DE BROMOCRESOL
RESUMEN
Un mtodo colorimtrico para detectar
albmina humana en suero sanguneo
fue adaptado para determinar ASB en
leche. La tcnica modificada es como
sigue: 2.5 mi de reactivo diluido 1 :5,
(26 mI de NaOH al 10%, 30 mi de
cido lctico al 85%, 500 mg de verde
de bromocresol, 10 mi de tween 20,
aforado a 1 I de agua destilada y el
pH ajustado a 4.0 con NaOH) se
mezclan con 0.1 mi de suero de leche,
se agita, se deja reposar 5 min., a
temperatura ambiente y se leen en el
espectrofotmetro a 630 nm de longi
tud de onda. El rango de concentra
cin de, ASB detectable por este
mtodo fue de 0.2 a 6.4 mg/ml y el
coeficiente de correlacin en este
1 Coorck Reg. del Golfo. Sector Pecuario del
INIFAP, SARH, Apdo. Postal 1224. Veracruz,
Ver. Mx. C.P. 91700.
2 Depto. de Ruminologa Bsica. Sector
Pecuario del INIFAP, SARH. Km. 15.5 Carro
Mxico-Toluca, Mxico, D. F. C.P. 05110.
3 Depto. de Flslopatologa, Sector Pecuario
del INIFAP, SARH, Km. 15.5 carro Mxico
Toluca, Mxico, D. F., C.P. 05110
4 Direccin Gral. de Biolgicos y Reactivos.
Amores 1210, Col. del Valle, Mxico, D. F.
Tc. Peco Mx. 51 (1986)
AMADO GUZMAN A.1
MARCELO PEREZ D. 2
RENE MARQUEZ M. 3
JUAN GARZA R. 4
rango fue de 0.99. Este mtodo
resulta sencillo, econmico, sensible
y se recomienda para estudios de la
variacin de los niveles de esta
protena en leche bajo diferentes
condiciones de fisiopatologa de la
glndUla mamaria.
INTRODUCCION
El diagnstico de la mastitls bovina
est basado en tcnicas citolgicas y
bacteriolgicas principalmente (Glese
cke, 1974; Giesecke y Van Den Hee
ver, 1974; Kltchen,1981), sin embargo,
ocurren cambios en la concentracin
de algunos otros componentes de la
leche tales como algunas protenas,
enzimas y electrlitos, cuando existe
dao al tejido glandular (Schalm,
Carroll y Jain, 1971; Kitchen, 1981).
La composicin proteica de la leche
vara en caso de inflamacin de la
glndula mamaria y protenas sangu
neas que normalmente nO existen o
se encuentran presentes en la leche
en bajas concentraciones se elevan en
casos de mastitis (Haenlin, Schultz y
Zikakis, 1971; Randolph, Erwin y
Richter, 1974; Garza, Ros y Arriola.
9
1974). Entre estas protenas se en
cuentra la albmina srica bovina
(ASB) , cuya concentracin en leche
se eleva inmediatamente en inflama
ciones agudas de la glndula mamaria
provocadas experimentalmente (Shah
y Morse, 1964; Harmon el al., 1976;
Giesecke y Viljoen, 1974; Giesecke y
Van Den Heever, 1981; Fitzgerald,
Deeth y Kitchen, 1981), as como en
infecciones naturales demostradas
por la presencia de grmenes patge
nos y por altas cuentas celulares en
leche (Giesecke 1974; Smith el al.,
1979). Se ha sugerido que la medicin
de los niveles de esta protena en
leche pOdra ser til en el diagnstico
de mastitis, tal vez en conjuncin con
la cuenta celular (Giesecke y Viljoen,
1974; Giesecke 1974).
Para medir las concentraciones de
esta protena en leche se han utiliza
do tcnicas tales como inmunodifu
sin (Shah, Morse y Pitkin, 1963;
Viljoen, 1974), precipitacin por sales
de sulfato de amonio y electroforesis
en papel (Shah, Morse y Pitkin, 1963)
electroforesis en papel (Schalm, Ca
rrol y Lasmanis, 1963), electroforesis
en gel de almidn (Garza, Ros y
Arriola, 1974) electroforesis en gel de
poliacrilamida (Haenlin, Schultz y Zi
kakis, 1972; Randolph, Erwin y Rich
ter, 1974) y electroforesis de Laurell
(Smith, el al., 1979), sin embargo la
mayora de estas tcn icas son labo
riosas y tardadas que requieren de
mediciones densitomtricas.
La ASB posee capacidad de unirse
a diversos colorantes como el naranja
de acridina, cido 2-(4-hidroxiazoben
ceno)-benzoico (HABA) y el verde de
bromocresol (Tietz, i 976) y con base
en esta ltima caracterstica se han
desarrollado mtodos..para determinar
albmina en suero sanguneo de hu
mano, (Rodkey, 1965; Doumas, Wat
son y Biggs, 1971; Miyada el aL,
1972). La ASB posee una constante
10
de asociacin con el verde de bromo
cresol menor que la de la albmina
humana, lo que causa una reaccin ABSOI
colorimtrica de menor intensidad DE all
(Rodkey, 1965). Por otra parte, la R~ACl
concentracin de albmina en suero
sanguneo humano es mayor de 3.25
g/100 mi (Wintrobe el al., 1975)
mientras que la concentracin en
leche normal puede ser tan baja como
0.2 mglml (0.02 g/100 mI) (Kitchen,
1981), lo que impone otra dificultad
probable en la utilizacin de esta
tcnica para medir ASB en leche.
Gutirrez (1978) intent determinar
cantidades de esta protena en lech
utilizando verde de bromocresol sin
que lograra determinar concentracio
nes especficas de ASB pero, si
observ un incremento en la absor
bancia cuando se usaron leches pro LO
cedentes de vacas con mastitis expe -.(
rimental. El presente trabajo tiene
como objetivo el adaptar y evaluar un
~
mtodo colorimtrico para determinar <:
concentraciones de ASB en leche ;:.c
utilizando verde de bromocresol. -:;
o:)
ifJ
;p
MATERIAL Y METOOOS
< 5.0
Se utiliz el "reactivo de color para
albmina" producido por la Direccin
General de Biolgicos y Reactivos de
la Secretaria de Salud del Gobierno
Mexicano, el cual es utilizado para
realizar determinaciones de albmina j
srica humana en suero sanguneo.
La composicin de este producto J,
~
consiste en NaOH al 10% (26 mI),
cido lctico al 85% (30 mi), verde de
bromocresol (500 mg), tween 20 (10 G
mi) todo en agua destilada (a 1 litro) 0.2
y el pH ajustado a 4.0 con NaOH a
temperatura ambiente. El experimento
se dividi en 3 partes:
Parte 1. Establecimiento de la rela estudios de las
cin reactivo:muestra y el rango de protena en la h
concentracin detectable. El obje condiciones de
tivo de esta parte fue establecer el glndula mamari
~--~------ -------------------~.------~_.~-
rango de concentracin de ASB detec
table por este mtodo, as como
determinar la cantidad de reactivo y
de muestra a utilizar para realizar
determinaciones dentro de este rango
de concentracin. Se prepararon con
centraciones dobles de ASB (Fraccin
V, Sigma Chemical Co. St. Louis
Miss. USA), en agua destilada desde
0.2 hasta 25.6 mglml de las cuales se
utilizaron diferentes cantidades de
muestra y de reactivo de acuerdo al
Cuadro 1, por lo que se probaron las
siguientes relaciones de reactivo:mues
tra: 5:0.025, 5:0.05, 5:0.1, 2.5:0.1 y
1.25:0.1 (mI) (Tratamiento A, B, C, O
y E respectivamente). La mezcla de
muestra y reactivo se dej reposar por
5 minutos y posteriormente se ley en
un espectrofotmetro a una longitud
de onda de 630 nm. Las absorbancias
obtenidas para cada concentracin,
en cada relacin de reactivo: muestra,
se graficaron en un plano de coorde
nadas cartesianas, y en el rango
donde los puntos se mantuvieron
lineales, se calcularon los coeficien
tes de correlacin entre absorvancia j.I
concentracin (Snedecor y Cochran, '
1981).
Parte 11. Establecimiento del mto
do de preparacin de la leche. Obser
CUADRO 1.
CONCENTRACIONES DE ALBUMINA SERICA BOVINA (ASB) y RELACIONES REACTIVO:MUES
TRA ESTUDIADAS EN LA PARTE l.
Concentracin de ASB Cantidod de muestra
en las muestras (rng/ml) mi
(1 )
(3)
0.2 a 25.6 0.025
0.2 a 25.6 0.05
0.2 a 25.6 0.1
0 .. 2 Q 25.6 0.1
0.2 a
1) 3 repet ciones p:1ra cado concentracin.
2) el reactivo se diluy 1:5 en agua destilada.
3) se hicieron concentraciones dobles desde 0.02 g/HO mi hasta 2.56 g/lOO mi.
vaciones personales preliminares al
trabajo, as como observaciones reali
zadas por Gutirrez (1978) indicaron
que al tratar de determinar ASB en
leche utilizando el reactivo de verde
de bromocresol se formaban precipi
tados de caseina que impedan reali
zar las lecturas, por lo que se
procedi a definir en qu forma deba
ser procesada la leche para realizar
las determinaciones. La leche se
someti a 4 tratamientos A) leche
entera; B) leche semidescremada,
(por centrifugacin a 3500 rpm por 20
min); q suero de leche entera y D)
suero de leche semidescremada. El
suero se obtuvo con renina 1:10 000 a
razn de una gota por 10 mi de leche,
incubando por 15 min a 37C en bai'lo.
Mara y centrifugando a 3000 rpm por
20 mino A estas leches se les agreg
ASB a las siguientes concentraciones
0.25 y 0.5 g/100 mi utilizando 0.1 mi
como muestra y 2.5 mi de reactivo
(1:5) efectuando 3 repeticiones para
cada tratamiento. Se calcularon dife
rencias en las absorbancias produci
das en los diferentes tratamientos por
medio de un anlisis de varianza
(Snedecor y Cochran, 1981).
Parte 111. Establecimiento final de
Cantidod de reactivo Tratamierto
mi (2)
5 A
5 B
5 C
2.5 D
E
11
 CUADRO 2. RESULTADOS Y I
TRATAMIENTOS YCONCENTRACIONES DE ALBUMINA SERICA BOVINA (ASB) UTILIZADOS
DURANTE LA PARTE 111. Parte l. Las grfi(
ciones de ASB u'
bancias producid
Cantida~ (mi) de Concentraci6n de la Figura 1. Si
Tratamierto reactivo 3) muestro AS~,,)n las mues excepcin del trai
tras
los dems, lOS pl
lineales en el r,
B 5 0.05 0.2 a 6.4(2) mg I mI. Los COI
laclOn, de determ
C 5 0.1 0.2 a 6.4 =c para los ANO
D 2.5 0.1 0.2 a 6.4
nes de regresin
rango de conce
E 1.25 0.1 0.2 a 6.4 (Oraper y Smith, .
el Cuadro 3. Al
1) 5 re:eticiones paro coda concentraci6n
de reactivo:mues
2) se hicieron concentraciones dobles desde 0.2 hasta 6.4 mg/ml
(tratamiento O) ~
3) el reactivo se diluy6 previarrente 1:5.
coeficiente de e
la relacin reactivo:muestra y evalua diferencia entre la concentracin real y es por lo tanto
cin del mtodo. Utilizando el tipo de de ASB presente en el suero y la el rango de sel
muestra con mejor comportamiento concentracin determinada en las lec esta relacin ab:
en la parte 11 (suero de leche sin turas de cada tratamiento expresada mnima reportad~
descrema~ se prepararon concentra en porcentaje, tomando como 100% 0.2 mg/ml (Kitch
ciones dobles de 0.2 a 6.4 mg/ml y la concentracin real de la muestra margen amplio
se procesaron por cuatro tratamientos (diferencia porcentual). Se utiliz un ASB para real izar
(relaciones reactivo:muestra) B) 5:0.05 anlisis de varianza para un diseo en
C) 5:0.1, O) 2.5:0.1 y E) 1.25:0.1 mi de bloques (concentraciones) al azar, las Parte 11. Al pr
reactivo y muestra respectivamente diferencias entre tratamientos se de semidescremada
con 5 repeticiones como se indica en terminaron por la prueba de Tukey que se formaron
el Cuadro 2. Se calcularon los coefi (Gill, 1978). El valor de la diferencia
cientes de correlacin entre concen porcentual se transform al arcsen VX ABSORBANCIAS
tracin y absorbancia as como la para fines del anl isis estadstico. DIFERENTES CC
CUADRO 3.

COEFICIENTES DE CORRELACION y DE DETERMINACION DE CADA UNA DE LAS 5 DILUCIONES

PROIlA.DAS EN LA EL RANGO DE CONCENlRACION DE 0.2 a 6.4 mg DE AL8UMI Tipo de
NA SE RICA muestra
Cantido;:l (mi) Rango de

Trolomi enta Reactivo <le Muestra ,2

F.c Absorbencia
* Leche entera
A' 5 0.025

5
* Leche descren
0.05 0.9935 0.987 1150 0.004 a 0.163

C 5 0.1 0.9976 0.9953 2974 0.010 a 0.386 Suero de LE.

D 2.5 0.1 0.9995 0.9989 13735 0.20 a 0.723
Suero de L.D.
E 1.25 0.1 0.9983 0.9967 5373 0. 37 O 1.235

* No sensible para detectar concentraciones de 0.2 mg/l'll. * No fue posibl

12
RESULTADOS Y DISCUSION seina que arrastraron consigo ai colo
rante e impedan realizar las lecturas
Parte l. Las grficas de las concentra espectrofotomtricas, lo que concuer
ciones de ASe utilizadas y las absor da con lo informado por Gutirrez
bancias producidas se encuentran en (1978). Al utilizar el suero de leche,
la Figura 1. Se observ que con semidescremada o no, no se observa
excepcin del tratamiento A. en todos ron diferencias significativas en las
los dems, los puntos se mantuvieron absorbancias obtenidas con las dife
lineales en el rango de 0.2 a 6.4 rentes concentraciones de ASe (Cua
mg I mi. Los coeficientes de corre dro 4) por lo que se concluye, que
laciOn, de determinaciOn as como las util izar suero de leche entera es
~c para los ANDEVA de las ecuacio adecuado. La utilizacin del suero de
nes de regresin calculadas en este leche para poder determinar ASe en
rango de concentraciones de ASe la misma,es recomendada en diversas
(Draper y Smith, 1981) se muestran en tcnicas como electroforesis en papel
el Cuadro 3. Al utilizar una relacin (Carroll, Schalm y Lasmanis, 1963;
de reactivo:muestra de 2.5 ml:0.1 mi Shah y Morse, 1964) y electroforesis
(tratamiento D) se observ el mayor en gel de pOliacrilamida (Randolph,
coeficiente de correlacin (r)0.99), Erwin y Richter, 1974), mientras que
y es por lo tanto el mejor tratamiento, en otras no se requiere utilizar el
el rango de sensibilidad al utilizar suero de la leche, como la electrofo
esta relacin abarca la concentracin resis de Laurel! (Smith et al., 1979) y
mnima reportada en leche que es de la inmunodifusin radial (Viljoen,
0.2 mglml (Kitchen, 1981) y brinda un 1974) sin embargo, todas estas tcni
margen amplio de concentracin de cas son ms complejas y tardadas
ASe para realizar las lecturas. (16-48 h) <
Parte 1If. Las correlaciones entre
Parte 11. Al probar leche entera o concentracin de ASe y absorbancia,
semi descremada se pudo observar as como las medias de las desviacio
que se formaron precipitados de ca nes porcentuales de las lecturas obte
CUADRO 4.
ABSORBANCIAS OBTENIDAS EN LOS DIFERENTES TIPOS DE MUESTRAS PARA
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ALBUMINA SERICA BOVINA (ASB) EN
LA PARTE 11.

Tipo de Concentracin de ASB en la muestra

muestra o 0.25 0.5

* Leche entera (L. E.)

* Leche descremada (L. D;-

Suero de LE. .143 .272 .67

Suero de L.D. .142 .275 .71

* No fue posible la lectura.

13
 CUADRO 5.
rango de concen1
table por este
determinar la ca
MEDIAS DE LAS DESVIACIONES PORCENTUALES DE lOS
de muestra a I
DIFERENTES TRATAMIENTOS UTILIZADOS EN LA PAIUE
determi naciones
111. de concentracin
centraciones dob
V, Sigma Chen
Miss. USA), en
Tratamiento X de la desviacin r 0.2 hasta 25.6 m,
utilizaron difere
porcentual muestra y de re
Cuadro 1, por lo
siguientes relacic
tra: 5:0.025, 5:0
B 1.6627 (a) 0.9976 1.25:0.1 (mi) (Tri:
(6.4615) (1) y E respectivam
muestra y reactivo
(a) 5 minutos y postl
e 1.5624 0.9934 un espectrofotn
de onda de 630 r
(5.1998) obtenidas para
en cada relacin
o 1.2557 (b) 0.9993 se graficaron en
nadas cartesiam
(2.6003) donde los pun'
lineales, se calc
e 1.4449 (a) 0.9970 tes de correlaci
concentracin (Sr
(4.0113) 1981). .
Parte 11. Estat
a, b literales diferentes indican diferenciQ signifi.cativa do de preparaci
(P<' 0.05). CONCENTRACIOI
1) valores entre parentesis, son transformacin al valor TRA ESTUDIADAS

absol uto de la media presentada como arcsen Concentracin de

nidas en cada tratamiento se mues pueden ser almacenados por varias en los muestras {rr
(1 )
tran en el Cuadro 5. Al utilizar 2.5 mi semanas en congelacin sin que se
.' de reactivo (1:5) y 0.1 mi de suero de altere la concentracin de ASB . (3)
0.2 o 25.6
leche (tratamiento D) se obtiene una r
)0.99 as como la menor diferencia CONCLUSIONES 0.2 o 25.6
porcentual en las concentraciones
determinadas con respecto a las rea 0.2 a 25.6
Este mtodo colorimtrico para deter
les, (P<O.05), esta diferencia fue de minar ASB en leche presenta ventajas 0.2 a 25.6
aproximadamente 2.6% en el rango de economa, simplicidad y rapidez
de concentracin de 0.2 a 6.4 mg/ml sobre la mayora de los mtodos de
en el cual se produce una absorbancia determinacin de ASB en leche ante 1) 3 repeticion~
de 0.02 a 0.723 (Cuadro 3). Por otra riormente empleados. Por estas mis 2) el reactivo ~
parte se observ que los sueros mas razones puede ser utilizado para 3) se hicieron,

14
 FIG. 1,

ABSORBANCIA PRODUCIDA POR DIFERENTES CONCENTRACIONES

DE albmina srico bovina (ABS) EN LAS DIFERENTES RELACIONES

REACTIVO MUESTRA UTILIZADAS EN LA PARTE l. '

/
/
/
Contidad (mi) util j /
zodo de: /'
./
reoc muestro
tivo
1:5 /
5 0.025 /
----- B 5 0.05 /'/
e 50.1 . /
_ _ D 2.5 0.1 1/ ./
-'-'-'- (:; 1.250.1/ /

<
LO

;.)

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_---..-..-..
. ... .............................

G
?i
i

--
~ : : : : : : : : - . " lO" ~ .... .................... .

:................... .
""

0.2 lo 3.2 6.4 12.0

\SE \m:~irnl)

estudios de las variaciones de esta minar su importancia como un ndice

protena en la leche bajo diferentes del estado de salud de la misma, o
condiciones de fisiopatologa de la bien en estudios fisiolgico-metabli
glndula mamaria tendientes a deter- cos.

15

- - - - - - _... _~-_ ... _----_._--_ ..... __ .. ~ .~ .. _-_ ... _~ ... - - _..

SUMMARY
A colorimetric method using brom
cresol green used for the determina
tion of human serum albumin was
adapted for the determination of bovi
ne serum albumin (eSA) in milk. The.
method is a follows: 2.5 mi of 1:5
dilution of reagent (26 mi of NaOH at
10%, 30 mi of lactlc acid at 85%, 500
mg of bromcresol green, 10 mi of
tween 20, complete to 1 I with
distilled water, adjust pH to 4.0 with
NaOH) is mixed with 0.1 mi of whey,
shake well and left stand for 5
minutes at room temperature, after
wich the mixture is read in the
spectrophotometer at 630 nm. The de
tectable concentration range ustng
this method, is 0.2 to 6.4 mg/ml and
the correlation coeffcient in this
range was higher than r= 0.99. This
method is very simple, economicand
sensible and can be recommended for
studes on eSA levels in milk under
different physlologic and pathologic
conditions of the mammry gland.
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