PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

CARRERA DE MICROBIOLOGA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA

NOMBRE: Shirley Arreaga. FECHA: 16/12/2016

PRCTICA: 6 GRUPO N 1
TEMA: IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS CON EL USO DE PRUEBAS BIOQUMICAS.

OBJETIVOS:
Realizar pruebas bioqumicas para obtener el perfil bioqumico de un microorganismo y su
posterior identificacin.
Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioqumicas para determinar la actividad
metablica de la bacteria a identificar.
Caracterizar mediante pruebas bioqumicas una bacteria aislada para determinar su gnero
y especie.

INTRODUCCIN:

La identificacin de microorganismo es de gran importancia para cualquier tipo de estudio que

se est elaborando. Para esto se conocen diferentes tcnicas que van desde la descripcin
morfolgica hasta la descripcin fenotpica (Ramos, Volke, Shirai & Ramrez, 2012).
Las pruebas bioqumicas se basan en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes
enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas enzimas
(catalasas, oxidasas, coagulasas, ureasas, peroxidasas, etc) involucradas en el metabolismo
bacteriano, pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que contienen los
substratos, sobre los cuales ellas actan. (Murcia, 2012).

La prueba de oxidasa es usada en microbiologa para determinar si una bacteria produce alguna
de las citocromo c oxidasas. La prueba hace uso de discos impregnados con el reactivo TMFD
o DMFD, el cual tambin es un indicador redox. El reactivo pasa de azul oscuro a granate al ser
oxidado, y se vuelve transparente al ser reducido. Las bacterias oxidasa positiva poseen
citocromo oxidasa o indofenol oxidasa (una hemoprotena) (Salgado, 2014) .

RESULTADOS:

A partir de la Muestra 7, se realizaron varias pruebas bioqumicas con el fin de identificar la

bacteria de importancia clnica. Las pruebas bioqumicas realizadas en el laboratorio de
Bacteriologa son las siguientes:

OXIDASA TSI CITRATO MALONATO REA SIM RM VP

Al finalizar las pruebas bioqumicas se comprob mediante Tablas estndar de Enterobacterias

que la Muestra 7 corresponde a Klebsiella pneumoniae.
 PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
CARRERA DE MICROBIOLOGA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA

Morfologa colonial

Klebsiella pneumoniae en medio de cultivo

Mac Conkey, las colonias se observan:
grandes planoconvexa, de color rosa,
mucoides, brillantes, forma irregular,
tambin se observan redondeadas, bordes
irregulares, lactosa positivo (consume el
carbohidrato lactosa lo cual acidifica el
medio y el indicador rojo de fenol cambia
rojo-rosado, por ello las colonias se ven de
ese color).

Figura 1. Klebsiella pneumoniae en agar

Mac Conkey.

Pruebas bioqumicas

Tabla 1. Resultado de pruebas bioqumicas para determinar Klebsiella pneumoniae

RESULTADO DE PRUEBAS BIOQUMICAS PARA Klebsiella pneumoniae

OXIDASA DESCRIPCIN
Citocromo c oxidasa:
Negativo (-). No hay
produccin del mismo.
Oxidacin de NNN'N',
tetrametil, 1-4,
fenilendiamina: Negativo (-).
TSI DESCRIPCIN
Glucosa: + (Amarillo)
Lactosa: + (Amarillo)
Sacarosa: + (Amarillo)
Gas (CO2 y H2): Positivo(+)
cido Sulfhdrico: Negativo -
Indicador de Ph: Rojo de
Fenol
Fuente de Azufre: Tiosulfato
de Sodio.
Indicador de H2S: Sulfato
Ferroso
Tiempo de incubacin: 24h
Temperatura: 37C
(Britanialab, 2012).
RESULTADO
Como Klebsiella pneumoniae
es una enterobacterias, es
tpica oxidasa negativa,
debido a que no present un
cambio de color en el disco a
rosado o violeta. Por tanto se
trata de un microorganismo
oxidasa negativo.
RESULTADO
Pico/Fondo: A/A. Es decir que
est acidificada la muestra.
Por tanto, el microorganismo
fermenta glucosa, lactosa y
sacarosa.
La presencia de burbujas, o
ruptura del medio de cultivo,
indica que el microorganismo
produce gas.
La produccin de H2S es
negativa debido a que no se
presenta ennegrecimiento en
el tubo.
 PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
CARRERA DE MICROBIOLOGA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA
CITRATO DESCRIPCIN:
Citrato permeasa: Positivo
(+) (azul).
Indicador de Ph: Azul de
Bromotimol.
Alcalinidad: + (azul).
Fuente de carbono: citrato
Fuente de Nitrgeno: sales
de amonio.
Tiempo de incubacin: 24h
Temperatura: 37C
(Britanialab, 2012).
UREA DESCRIPCIN
Indicador de pH: Rojo de
fenol.
Fuente de carbono: extracto
de levadura.
Enzima ureasa: Positiva (+)
(rojo).
Tiempo de incubacin: 24h
Temperatura: 37C
(Britanialab, 2012).
SIM DESCRIPCIN
Indol: Negativo (-) (amarillo)
cido Sulfhdrico: Negativo
(-) sin coloracin oscura.
Fuente de azufre: Tiosulfato
de Sodio.
Indicador de HS: Hierro
peptonado
Reactivo: Erlich, Kovacs
Tiempo de incubacin: 24h
Temperatura: 37C
(Britanialab, 2012).
MR DESCRIPCIN
Indicador de pH: Rojo de
metilo.
Reactivo: Rojo de metilo (+).
Crecimiento: Bueno
Tiempo de incubacin: 24h
Temperatura: 37C
(Britanialab, 2012).
RESULTADO
Citrato permeasa positivo a
razn de que el medio
cambia de color a azul en el
pico, debido al crecimiento y
desarrollo del
microorganismo, con la
consiguiente produccin de
alcalinidad.
RESULTADOS
Actividad uresica positiva,
lo cual se evidencia haciendo
virar el indicador rojo fenol
de amarillo a rojo, debido a
que el sustrato se alcaliniz.
RESULTADOS
Presencia de cepas inmviles,
debido a que el crecimiento
se observa solamente en la
lnea de siembra.
Cepa indol negativo ya que se
desarroll un anillo de color
amarillo, no se cambi a rojo
luego de agregar el reactivo
de Kovacs o de Erlich.
Cepa SH2 negativa ya que el
medio permanece sin cambio
de color en la lnea de
siembra.
RESULTADOS
El resultado para esta
prueba es positiva debido a
que se vir el color de
amarillo a rojo al colocar el
reactivo que es rojo de
metilo. Adems se observ
un buen crecimiento de la
bacteria en el medio.
 PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
CARRERA DE MICROBIOLOGA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA

VP DESCRIPCIN
Reactivos: KOH al 40% y
gotas de ALFA NAFTOL al 5%.
Negativo (-) permanece
amarillo.
Crecimiento: Bueno.
Tiempo de incubacin: 24h
Temperatura: 37C
(Britanialab, 2012).
RESULTADOS
El resultado de esta prueba
es negativa porque no hubo
viraje de color, el color
amarillo inicial se mantiene
aun colocndole los
reactivos pertinentes.
Adems se observ un buen
crecimiento de la bacteria en
el medio.

MALONATO DESCRIPCIN RESULTADOS

Indicador de Ph: Azul de La reaccin es positiva. La

bromotimol.
Fuente de energa: dextrosa.
Fuente de carbono: extracto
de levadura.
Crecimiento: Bueno.
Tiempo de incubacin: 24h
Temperatura: 37C
(Britanialab, 2012).
degradacin del malonato
origina alcalinizacin del
medio que se manifiesta por
vire del indicador de pH azul
de bromotimol de verde a
azul.

DISCUSIN:
Las pruebas bioqumicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia o
ausencia de una enzima en uno o ms microorganismos. Los productos terminales de la accin
enzimtica son detectados a travs de indicadores de PH o por el aparecimiento de pigmentos
que hacen virar el color del medio (Andrade, Rodrguez, Cevallos, 2015).

Al realizar una comparacin entre la Tabla 1 y la Tabla estndar de Enterobacterias, podemos

determinar que el microorganismo, correspondiente a la Muestra 7 pertenece efectivamente a
la Familia Enterobacteriaceae. Esto se debe a que varios autores como Andrade, Rodrguez y
Cevallos describen a esta familia como microorganismos capaces de fermentar Glucosa,
concepto que se dedujo a partir de la prueba bioqumica TSI, resultado que fue corroborado con
la prueba de Oxidasa en donde el resultado fue negativo, lo cual es tpico de Enterobacterias.

La prueba oxidasa es utilizada para la deteccin de la enzima citocromo-c-oxidasa. Los discos

contienen oxalato de dimetil-para-fenilendiamina, el cual es el sustrato de la enzima oxidasa.
Los microorganismos que producen la enzima oxidasa se evidencian porque en presencia de
oxgeno atmosfrico y citocromo c, se oxida el sustrato presente en los discos a un compuesto
de color rojo-fucsia. Sin embargo, el microorganismo utilizado no present tales caractersticas.
El sistema citocromo esta normalmente presente solo en los organismos aerobios capaces de
usar el oxgeno como aceptor final de hidrgeno. El producto final de este metabolismo puede
ser agua o perxido de hidrgeno (Torres, 2013).

En el Agar TSI mediante una puncin central hasta el fondo del tubo y estra en superficie se
determina la capacidad del microorganismo de para atacar los hidratos de carbono glucosa,
 PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
CARRERA DE MICROBIOLOGA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA

lactosa y/o sacarosa, con la produccin de gases (CO2 y H2) lo cual se evidenci en la ruptura
del agar, junto con la no produccin de cido sulfhdrico (H2S) (Murcia, 2012). Los resultados
obtenidos se detallan en la Tabla 1.

En el Agar Citrato de Simmons se sembr con asa recta, solamente en superficie. En Agar Citrato
de Simnons se determina la capacidad del microorganismo de emplear el citrato como nica
fuente de carbono en ausencia de fermentacin de azcares o de produccin de cido lctico.
Para la Muestra 7 el resultado fue positivo, debido a que el medio donde creca el
microorganismo se torn azul (Murcia, 2012).

En la prueba de Urea se sembr con asa recta, solamente en superficie. En agar Urea se
determina la capacidad de un microorganismo de producir ureasa y desdoblar la urea, formando
2 molculas de amoniaco. En la muestra 7 el resultado fue positivo, es decir hubo actividad
uresica, por lo que el medio cambi de color amarillo a rojo (Murcia, 2012).

En Agar SIM se sembr con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo. En Agar SIM
se determina la capacidad de un microorganismo de moverse (presencia e flagelos), de producir
INDOL y H2S (Murcia, 2012). Los resultados para la muestra 7 se detallan en la Tabla 1, donde
se deduce que: a) No es mtil, b) Indol negativo, c) No es productora de H2S.

En el caldo MR y VP se determina por qu va metablica fermenta la glucosa la bacteria (Murcia,

2012). Obtenindose resultados ptimos en la Tabla 1. Donde se resalta que el microorganismo
a identificar es VP negativo, y RM variable.

En la prueba demalonato para el microorganismo pertinente result positivo, detallado en la

tabla 1. En donde se observ un viraje de color de verde a azul.

A partir de estos resultados se sostiene que el microorganismo estudiado responde al perfil

metablico y morfolgico de Klebsiella pneumoniae sin ninguna discrepancia. Klebsiella
pneumoniae es la especie de mayor relevancia clnica dentro del gnero bacteriano Klebsiella,
compuesto por bacterias Gram negativas de la familia Enterobacteriaceae, que desempean un
importante papel como causa de las enfermedades infecciosas oportunistas. Est implicada
principalmente en infecciones nosocomiales. Es el agente causal de infecciones del tracto
urinario, neumonas, sepsis, infecciones de tejidos blandos, e infecciones de herida quirrgica
(Andrade, 2014).

CONCLUSIONES:

Se realizaron pruebas bioqumicas en las cules se conoci la actividad y caractersticas

metablicas de Klebsiella pneumoniae, la cual pertenece a la Familia Enterobacteriaceae, es
fermentadora de glucosa, lactosa y sacarosa, oxidasa negativa, productora de gas, tiene
actividad uresica y citrato permeasa y no es mtil.
Se sembr e interpret pruebas bioqumicas empleadas en el laboratorio como: TSI, SIM,
UREA, CITRATO, VP, MR para identificar la muestra 7, que correspondi a K. pneumoniae.
Se conoci el fundamento y principio de cada prueba bioqumica utilizada para caracterizar
la Enterobacteria utilizada en el laboratorio.
Se determin que una correcta tcnica de siembra segn el tipo de prueba bioqumica, es
relevante para obtener resultados ptimos y facilitar su interpretacin, adems de la
 PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
CARRERA DE MICROBIOLOGA
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA

importancia que tienen las tablas estndar que sirven de gua para la identificacin de un
microorganismo determinado.

Referencias
Andrade, Rodrguez, Cevallos, J. (2015). Uso de Pruebas Bioqumicas y Tcnicas Rpidas para la
Caracterizacin de Bacterias. Obtenido de UNAM:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica6.2PruebasBioquimicas_21633.p
df

Andrade, V. (2014). Caracterizacin de Klebsiella pneumoniae e productora de BLEE. Obtenido

de Salud Pblica de Mxico: http://www.scielosp.org/pdf/spm/v46n6/22565.pdf

Britanialab. (2012). Obtenido de SIM Medio:

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simedio.htm

Britanialab. (2012). MR-VP Medio. Obtenido de

http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mr-vpmedio.htm

Britanialab. (2012). Simmons Citrato Agar. Obtenido de

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simmonscitagar.htm

Britanialab. (2012). TSI Agar. Obtenido de

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm

Britanialab. (2012). Ureasa Medio para la prueba. Obtenido de

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/ureasamedprue.htm

Murcia, M. (2012). IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS. Obtenido de UNAM: http: /

www.Bact_identificacin_bioqumica_enterobacterias.pd

Salgado, M. (2014). Oxidasa. Obtenido de UNAM:

http://www.iib.unsam.edu.ar/php/docencia/licenciatura/biotecnologia/2008/MicroBi
ol/Pruebas%20Bioquimicas.pdf

Torres, E. (2013). Prueba oxidasa. Obtenido de Universidad de Valencia:

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioPruebasBioquimicas.htm
Ramos, M., Volke, T., Prado, L., Shirai, K y Ramrez, F. (2012) Manual de Prcticas del
Laboratorio de Microbiologa General. Recuperado de:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pdf