Burkholderia tropica sp. Nov.

, Una novela Bacteria fijadora

de nitrgeno, asociada a plantas
En un estudio ecolgico de bacterias fijadoras de nitrgeno aisladas de la rizsfera y como
endfitos de plantas de caa de azcar, maz y teosinte en Brasil, Mxico y Sudfrica, se identific
un nuevo grupo filogenticamente homogneo de bacterias fijadoras de N2 dentro del gnero
Burkholderia. Este estudio taxonmico polifsico incluy la morfologa microscpica y de colonias,
pruebas de API 20NE y crecimiento en diferentes medios de cultivo a diferentes pH y
temperaturas, as como pruebas de asimilacin de fuentes de carbono y anlisis de patrones de
protenas de clulas enteras. Anlisis de 16S rRNA secuencias de genes mostr 99,2 - 99,9% de
similitud dentro de la nueva especie y el 97,2% de similitud con la ms cercana de las especies
relacionadas, Burkholderia sacchari. La nueva especie estaba compuesta de cuatro grupos de
anlisis de restriccin de rDNA 16S amplificados distintos. Los valores de reasociacin ADN-ADN
dentro de la nueva especie fueron mayores del 70% y menos del 42% para las especies
relacionadas ms cercanas, B. sacchari. Basndose en estos resultados y en muchas caractersticas
fenotpicas, se propone una nueva especie de fijacin de N2 para el gnero Burkholderia,
Burkholderia tropica sp. Nov., Con la cepa de tipo Ppe8T (= ATCC BAA-831T = LMG 22274T = DSM
15359T). B. tropica se aisl de plantas cultivadas en regiones geogrficas con climas que van de
subhmeda templada a hmeda caliente.

INTRODUCCIN
Hasta ahora se han descrito treinta especies diferentes de Burkholderia (Coenye & Vandamme,
2003). Durante mucho tiempo, la capacidad de fijacin de N2 en bacterias del gnero Burkholderia
slo se reconoci en la especie Burkholderia vietnamiensis (Gillis et al., 1995). Esta especie se aisl
de la rizsfera de plantas de arroz jvenes cultivadas en suelo vietnamita en condiciones de
laboratorio (Tran Van et al., 1994). Concomitante con la creacin del gnero Burkholderia a
principios de la dcada de 1990, las bacterias diazotrficas se obtuvieron en un estudio de
diaztropos asociados a la raz en la caa de azcar cultivada en Brasil, y la primera indicacin de
su afiliacin al gnero Burkholderia se obtuvo a partir de secuencias 23S de ARNr (Hartmann et
al., 1995). Sobre la base de los datos de la secuencia del gen rRNA 23S, se desarroll una sonda
oligonucleotdica (PPe8), que era caracterstica de estos aislados (Kirchhof et al., 1997). Entre los
aislamientos diazotrficos obtenidos a partir de la rizsfera de pltano y pia en Brasil, varios se
agruparon dentro del gnero Burkholderia utilizando tcnicas de sondaje de oligonucletidos del
gen del rRNA 23S y tcnicas fenotpicas (Weber et al., 1999). Dos aislamientos de pia mostraron
un patrn de anlisis de restriccin de ARN 16S amplificado (ARDRA) idntico al aislado de caa
de azcar Ppe8T (Cruz et al., 2001). Recientemente, el anlisis de bacterias fijadoras de N2
asociadas a plantas de maz y caf cultivadas en condiciones de campo revel la presencia de B.
vietnamiensis, as como la riqueza de nuevas especies bacterianas diazotrficas pertenecientes al
gnero Burkholderia (Estrada-de los Santos et al, 2001, Estrada et al., 2002). Estos aislados
fijadores de N2 exhibieron gran diversidad en los perfiles ARDRA. Adems, dos cepas noduladas
recuperadas de plantas leguminosas fueron recientemente asignadas al gnero Burkholderia de
acuerdo con sus secuencias de genes 16S rRNA (Moulin et al., 2001). Estas cepas han sido
formalmente descritas como Burkholderia tuberum y Burkholderia phymatum (Vandamme et al.,
2002).

En este estudio, se realiz un enfoque polifsico para determinar el estado taxonmico de los
aislados bacterianos recuperados de plantas de caa de azcar, maz y teocintle cultivadas en
diferentes regiones geogrficas y climticas de Brasil, Mxico y Sudfrica. El anlisis revel que
estos aislamientos pertenecen a una especie novedosa dentro del gnero Burkholderia, para lo
cual el nombre Burkholderia tropica sp. nov. esta propuesto.
MTODOS
Aislamiento y cultivo de cepas bacterianas diazotrficas.

Las fuentes de los 41 aislamientos de Burkholderia analizados se muestran en la Tabla 1. Los

aislamientos de Burkholderia fijadores de N2 se recuperaron utilizando tres estrategias
diferentes. En Mxico, los aislamientos diazotrficos fueron recuperados de la rizosfera, rizoplano
y tejidos internos de plantas de maz y teosinte utilizando el medio BAz semi - slido libre de
nitrgeno y las placas de agar BAc como se describi anteriormente (Estrada - de los Santos et al.,
2001). En Brasil, las bacterias diazotrficas se aislaron de la caa de azcar en medio semi - slido
LGI - P sin nitrgeno que contena jugo de caa (Reis et al., 1994). Se lavaron los tallos y las races
de las plantas de caa de azcar y luego se maceraron y se inocularon alcuotas en viales que
contenan medio semi - slido LGI - P. Despus de la incubacin durante 4 - 5 das a 30 C, se
form una fina pelcula subsuperficial. El contenido de viales que mostraban las pelculas se
transfiri a medio JMV semislido con la siguiente composicin (gl -1): 5,0 manitol, 0,6 K2HPO4,
1,8 KH2PO4, 0,2 MgSO4.7H2O, 0,1 NaCl, 0,02 CaCl2.2H2O, 0,05 extracto de levadura, 1,6 agar,
ajustado a pH 5,5 - 5,7. Se cre un nuevo crecimiento en medio slido JMV o LGI - P suplementado
con extracto de levadura (100 mg l - 1). Las colonias cultivadas se inocularon en medio JMV
semislido fresco y finalmente se transfirieron al medio slido LGI - P para caracterizacin.
Burkholderia cepas recuperadas en Sudfrica se aislaron de las races de la caa de azcar. Las
races se lavaron suavemente con agua del grifo y luego se mezclaron y se colocaron alcuotas en
medio PCAT (Burbage & Sasser, 1982). Despus de la incubacin durante 48 h, las colonias
bacterianas se transfirieron a placas de agar PCAT una vez ms y se purificaron en placas de agar
de soja trpticas.

Caracterizacin fenotpica.

Las cepas se cultivaron a 29 C a menos que se indique lo contrario. La presencia de cpsulas se

determin microscpicamente por la presencia de halos blancos que rodeaban a las bacterias
suspendidas en tinte de tinta negra (tinta negra, referencia Hering 12250). Para determinar otras
caractersticas fenotpicas, se prepararon clulas cultivando los aislados durante 12 h en medio
BSE (Estrada-de los Santos et al., 2001). Los cultivos se lavaron dos veces en MgSO _ {4} 10 mM,
se ajustaron a una OD de 0,2 (3 x 106 c.f.u. ml ^ -1) y cada cultivo se somet a rayas sobre medios
slidos. Los efectos de la temperatura y el pH en el crecimiento se determinaron en medio de agar
BSE. Tambin se evaluaron los efectos de la temperatura y el pH sobre el crecimiento y la actividad
nitrogenada de algunas cepas (Ppe5, Ppe6, Ppe7 y Ppe8T) en un medio JMV semislido libre de
nitrgeno. La temperatura ptima de crecimiento se determin indirectamente midiendo la
actividad de la nitrogenasa por el mtodo de reduccin de acetileno (Burris, 1972). El crecimiento
en placas MacConkey agar (Difco) as como en medio BCSA (Henry et al., 1997) se determin
despus de 72 h a 29 y 37C. Pruebas tales como oxidasa, catalasa e hidrlisis de gelatina y Tween
80 se realizaron por los mtodos de Smibert & Krieg (1981). Las cepas se analizaron con el API
20NE, API 50CH (bioMe'rieux) y Biolog MicroLog Systems. En el caso de los ensayos API 20NE y
API 50CH, la inoculacin se realiz segn las recomendaciones del fabricante (bioMe'rieux). Los
resultados para API 20NE se obtuvieron despus de 24 o 48 h de incubacin segn las
recomendaciones del fabricante y las galeras API 50CH se obtuvieron despus de 6 das de
incubacin. Cuando se utiliz el sistema Biolog, las cepas se incubaron en medio biolgico de
crecimiento universal (Biolog) a 30 C durante 24 h. Las microplacas GN2 se inocularon de acuerdo
con las instrucciones del fabricante y se incubaron a 30C durante 24 h. Los datos cuantitativos
de la utilizacin de la fuente de carbono por cada cepa se transformaron en categoras utilizando
el mdulo CategVar en el software ADE - 4 (Biolog).
SDS - PAGE de protenas de clulas enteras y produccin de siderforos.

La preparacin de protenas de clulas enteras, as como los ensayos de SDS-PAGE se realizaron

como se describi anteriormente (Estrada-de los Santos et al., 2001). Los siderforos se
detectaron utilizando los ensayos quimicos universales en placas de agar cromo - azaroil - S y en
solucin de cromo - azaroil - S como se describi anteriormente (Schwyn y Neilands, 1987). Se
identificaron siderforos de tipo hidroxamato utilizando la prueba de Czky (1948).

ARDRA y secuenciacin.

El ADN genmico se aisl a partir de clulas bacterianas usando protocolos publicados (Kirchhof
et al., 1997, Ausubel et al., 1987). Los cebadores fD1 y rD1 se utilizaron para la amplificacin del
gen 16S rRNA (Weisburg et al., 1991) usando condiciones de PCR descritas anteriormente
(Estrada-de los Santos et al., 2001). El amplificado 16S rRNA genes fueron restringidos con AluI,
DdeI, HaeIII, HhaI, HinfI, MspI y RsaI. Los fragmentos de restriccin se separaron por electroforesis
en geles de agarosa al 3% y se compararon los patrones. Cada uno de los aislados fue asignado a
uno de los genotipos ARDRA 16, 17 o 19 como se describi anteriormente (Estrada-de los Santos
et al., 2001). Para la cepa Ppe8T, se amplific un fragmento del gen rRNA 16S bacteriano de
longitud casi completa por PCR como se describe por Juretschko et al. (1998) y secuenciado por
Sequiserve (Vaterstetten, Alemania). Para las cepas MOc-725, MTo-672 y MTo-293, los productos
de PCR se clonaron primero en el vector pCRII (Invitrogen). 16S rRNA genes se restringieron en
pequeos fragmentos (0,3 - 0,8 kb) utilizando EcoRI y subcloned en el vector pUC18. 16S rRNA
secuenciacin de genes fue realizado por Medigenomix. Las secuencias de ambas cadenas se
determinaron usando cebadores universales para el vector pUC18.

Composicin de bases de ADN y anlisis de la relacin ADN-ADN.

El contenido medio de % en moles de G + C del ADN genmico se midi mediante la DSMZ. La

relacin ADN-ADN se bas en niveles relativos de hibridacin con ADN marcado con 32P como se
describi anteriormente (Estradade los Santos et al., 2001).

Primeros de PCR especficos de especies.

Disponible Burkholderia 16S rRNA secuencias de genes se alinearon para identificar las regiones
especficas de la nueva especie; Se identific una regin correspondiente a las posiciones 456 -
475 de Escherichia coli (nmero de acceso GenBank V00348). Esta regin se eligi para definir el
cebador directo 59 - TCCCTGGTCCTAATATG - 39. El cebador inverso (59 - CAACCCTCTGTTCCGA -
39) se identific en una regin del gen del ARNr 16S descrita anteriormente (Pallud et al., 2001).
Las condiciones de PCR fueron las siguientes: desnaturalizacin inicial durante 7 min a 95 C
seguido de 35 ciclos de desnaturalizacin de 1 min a 94 C, 1 min de hibridacin a 48 C y 1 min
de alargamiento a 72 C, seguido de un final de 15 min Elongacin a 72 C.
Consideraciones taxonmicas

Muchas caractersticas fenotpicas y todas las caractersticas genmicas descritas anteriormente

concuerdan con los criterios de similitud recomendados para la delineacin de especies
bacterianas (Vandamme et al., 1996). En consecuencia, consideramos que las cepas analizadas en
este trabajo pertenecen a una nueva bacteria asociada a la fijacin de N2 especies bacterianas
dentro del gnero Burkholderia y proponer el nombre de Burkholderia tropica sp. nov.

Descripcin de Burkholderia tropica sp. nov.

Las clulas son varillas ligeramente curvadas, de aproximadamente 1,5 - 1,6 m de largo y 0,7 -
0,8 m de ancho. Se producen por separado y poseen una cpsula. Son mviles por medio de uno
a cuatro flagelos polares. Los aislamientos son Gram negativos y la oxidasa y la catalasa son
positivas. En el medio slido LGI-P, se forman pequeas colonias con un centro amarillo y
mrgenes blancos. Las colonias en placas BAc son amarillentas, redondas, lisas y convexas con
mrgenes enteros. El crecimiento y la reduccin del acetileno al etileno se observan en medios
semislidos libres de nitrgeno. Las cepas tienen un metabolismo aerbico, pero fijan el nitrgeno
microaerobiamente. Crecen bien con amonio, y el nitrato se reduce a nitrito, pero el nitrito no se
reduce ms. Nitrato y amonio inhiben la fijacin de N2, pero pequeas cantidades de extracto de
levadura (100 mgl ^ -1) aumentan la fijacin de N2. Varias fuentes de carbono apoyan el
crecimiento, incluyendo azcares y cidos orgnicos. El crecimiento ocurre de 22 a 40 C y la
temperatura ptima es de 30 C. No se observa hidrlisis de almidn o gelatina, pero el Tween
40 y el Tween 80 se hidrolizan. Las caractersticas que diferencian a B. tropica de otras especies
de Burkholderia fijadoras de N2 se enumeran en las Tablas 2 y 3. B. tropica tambin puede
diferenciarse de otras especies de Burkholderia fijadoras de N2 y no fijadoras de N2 mediante
cebadores de PCR de ARNr 16S. La especie B. tropica comprende cuatro genotipos ARDRA
diferentes. Tiene un contenido de G + C de 63,5% en moles.

La cepa de tipo es la cepa Ppe8T (= ATCC BAA-831T = LMG 22274T = DSM 15359T), aislada de caa
de azcar var. SP 71-1406 cultivadas en los campos de la fbrica de azcar Cruangi ubicada en el
estado de Pernambuco, Brasil.