PURIFICACIN, CARACTERIZACIN Y DETERMINACIN DE

PARMETROS CINTICOS PARA FRUCTOFURANOSIDASA DE

SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Orellana A., Ziga P.
Departamento de Bioqumica y Biologa molecular, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad de Concepcin,
Chile.

Resumen

-fructofuranosidasa, comnmente conocida como invertasa es una enzima presente en levaduras ubicada en el
espacio periplasmico de la clula. Esta glicloprotena tiene como principal funcin la ruptura de la sacarosa en
sus monosacridos que la componen, glucosa y fructosa. Para luego ser metabolizados al interior de la clula.
Se aisl, purific y caracteriz esta enzima a travs de mtodos clsicos, tales como cromatografa de
intercambio inico, electroforesis SDS-PAGE, western blot y absorciometricos. Se estudiaron factores
determinantes en el accionar de esta enzima como temperatura y pH ptimos a los que presenta mejor actividad
enzimtica. Adems se analiz el comportamiento a distintas concentraciones de inhibidor y de enzima.

Palabras claves: Invertasa, inhibidor enzimtico, purificacin, actividad enzimtica

razones similares los monosacridos comunes,

Introduccin
La invertasa es el nombre comn de la enzima que
cataliza la hidrolisis de la sacarosa en una mezcla
equimolar de fructosa y glucosa, la llamada azcar
invertida, que es mucho ms dulce. Es por esto
que la invertasa es un producto codiciado por la
pastelera y es por esto que ha sido
exhaustivamente caracterizada.
La sacarosa y la glucosa muestran un
comportamiento dextrorotatorio, lo que significa
que giran hacia la derecha el plano de la luz
polarizada. Mientras que las soluciones de fructosa
son levorotatoria y gira hacia la izquierda el plano
de la luz polarizada, La enzima invertasa cataliza la
reaccin que invierte el giro del plano de la luz
polarizada en soluciones de azcar invertida, por
glucosa y fructosa, son conocidos como dextrosa y
levulosa respectivamente.
En clulas de levaduras la invertasa est
clasificada como una glicoprotena extracelular
localizada entre la pared y la mmebrana de la
clula llamado espacio periplasmico. La enzima
posee una importante funcin biolgica en la
ruptura de la sacarosa en el exterior de la celula y
su posterior transporte al citoplasma (en forma de
monosacridos) y su posterior metabolismo.
Los estudios cinticos indican que en la forma
extracelular su pH ptimo es de 4.8 y la
temperatura de 40C. Km 5 mM con sacarosa.
Esta enzima tiene una masa molar de
aproximadamente 270 kDa, est conformada por
dos subunidades glicosiladas con una masa molar
de 135 kDa. El estudio de esta enzima se ve
facilitado porque puede ser fcilmente extrada y
aislada de las clulas, adems tiene un alto
contenido de oligosacridos que incrementa la
estabilidad de la enzima.
Entonces como se explica a continuacin, se realiza
una caracterizacin, purificacin comparando el
avance con distintas alcuotas (1 y 2) y la fraccin
con mayor actividad. Se estudiaron los parmetros
cinticos como el Km y Vmax mediante la
construccin de curva de progreso y curva de
saturacin. Se midi el efecto pH, temperatura y el
efecto inhibidor, determinando el tipo de inhibicin.
Materiales y Mtodos
Preparacin de extracto crudo
Se pesaron 0.60 g de levadura con 10 mL de
NaHCO3 0.1 M, la solucin se incub a 35C por
15 horas. El resultado fue centrifugado a 15.000
rpm por 30 min a 4C. Se midi el volumen de
sobrenadante obtenido y luego se tom una
alcuota de 500 ul para su anlisis posterior
(Alcuota 1)
Precipitacin fraccionada con etanol
Primera Precipitacin. El extracto crudo se trat
previamente con 3.06 ml de buffer fosfato, luego se
precipit con 4.90 ml de etanol para alcanzar un
29% v/v. Se agita suavemente y se centrifuga a
5.000 rpm por 10 min a 4C. Rescatar
sobrenadante y medir volumen.
Segunda Precipitacin. Se adicionan 4.5 ml de
etanol para alcanzar un 40% v/v. Se agit
suavemente y se mantuvo a temperatura ambiente
por 15 min. La solucin fue centrifugada a 5.000
rpm por 10 min a 4C. El pellet fue rescatado
eliminando el sobrenadante, luego fue
resuspendido en 4 ml de buffer fosfato 5 mM. Se
guarda una alcuota de 200 ul a 4C (Alcuota 2)
Cromatografa de intercambio inico (DEAE-
Celulosa)
La columna de DEAE-Celulosa fue equilibrada
lavando con 10 ml de tampn fosfato 5 mM, con un
flujo lento sin que la columna se secara. Se sembr
la muestra por 15 min colectando el volumen en un
tubo de vidrio y recargando del mismo volumen en
la columna. La columna fue lavada con 30 ml de
buffer fosfato 5ml colectando fracciones de 2 ml en
tubos eppendorf de 2 ml, obteniendo 15 tubos.
Luego se carg la columna con 20 ml de buffer de
elucin (tampn fosfato 5 mm con NaCl 50 mM)
colectando fracciones de 1 ml en tubos eppendorf
de 1.5 ml obteniendo 20 tubos. Sera bueno poner
en alguna parte del paper porque se usa el buffer
fosfato, dilucin enzima poner color de las weas?
O en resultados
Actividad enzimtica
La determinacin de la actividad enzimtica se
realiz mediante ensayo invertasa (mtodo DNS).
50 ul de extracto de enzima se incub a 55C por
10 min con agua, sacarosa 0.2 M y tampn acetato
0.1 M pH 5. Luego se tomaron 100 ul del tubo y se
traspasaron a un tubo de vidrio con 1 ml de
reactivo DNS. Se incub a 100C por 10 min,
finamente se dejaron enfriar primero en hielo, luego
a temperatura ambiente y se midi la absorbancia
a 570 nm, usando el blanco (sin enzima) para
calibrar el espectrofotmetro. (En todos los
ensayos se repiti el mismo protocolo con algunas
variaciones que sern especificadas en cada
procedimiento) poner volumenes
Anlisis de fracciones
Se seleccionaron fracciones de elucin y de lavado
para medir la actividad mediante ensayo invertasa
y determinar la fraccin con mayor actividad.
Determinacin de concentracin de protenas.
Mtodo de Bradford
Se prepar la curva de calibrado con soluciones
1.0-4.0-8.0-12.0-16.0-20.0 (ug/ml) a partir de una
solucin estndar de albumina de suero de bovino
100 ug/ml (BSA) anotar diluciones de extracto y
alcuotas y seguir. 595nm
Curva de Calibracin de glucosa
Para realizar la curva de calibrado se prepararon
tubos con las siguientes concentraciones de
glucosa: 2.0-4.0-6.0-8.0-10.0-20.0-30.0-40.0 (mM)
a partir de solucin stock de glucosa 40 mM. Luego
se tomaron 100 ul de cada tubo traspasndolos a
un tubo con 1 ml de reactivo DNS. La absorbancia
fue medida a 570 nm luego de incubar los tubos a
100C por 10 min.
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Se utiliz un equipo de gel de poliacrilamida MINI
PROTEAN II de BIO-RAD. Se utiliz una peineta
de 10 carriles. Primero se prepararon dos geles.
Gel concentrador 5%. 500 ul de acrilamida
/bisacrilamida (29:1) 30%, 380 ul de TRIS pH 6.8
1M, 30 ul de SDS 10%, 30 ul de PSA 10%, 3 ul de
TEMED y 2.1 ml de agua. Gel separador 8%. 1.6
ml de acrilamida/bisacrilamida (29:1) 30%, 2.25 de
TRIS pH 8.8 1M, 60 ul de SDS 10%, 2.4 ul de
TEMED 100% y 2 ml de agua. Para preparar las
alcuotas 1 y 2 se tomaron 5 ul de cada una y se le
aadi 1 ul de buffer 6x (Tris-HCl 0.06 M pH 6.8,
SDS 6%, glicerol 30%, azul de bromofenol 0.075%,
betamercaptoetanol 15%). Para la alcuota con
mayor actividad obtenida de la cromatografa se
tom 20 ul de la fraccin y se le aadi 4 ul de autoradiogrfico y se revele el film con liquido
buffer 6x. Las muestras fueron incubadas a 100C
por 5 min para posteriormente cargarlas, junto con
el marcador de peso molecular PageRuler
prestained Protein ladder Thermo scientific
N26616. Se corri el gel a 100 V hasta que cay el
frente de corrida, para posteriormente poner el gel
en la solucin fijadora (metanol 5%, cido actico
7%, agua) por 1 hora a temperatura ambiente en
constante agitacin. Luego de eliminar la solucin
fijadora se agreg al gel la solucin de tincin
(sulfato de amonio 17%, metanol 34%, acido
actico 0.5%, azul de coomassie g250 0.1%) por
alrededor de 15 horas. Despus de eliminar la
solucin de tincin se agrega la solucin de
destincin (metanol 50%. cido actico 10%) y se
mantiene en agitacin por 30 min. Se sac el gel
de la solucin de destincin y se lav con agua
hasta ver las bandas. Pner para que sirve cada
wea
Western Blot
Las protenas fueron transferidas desde el gel
SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa
mediante un kit de transferencia mini protean II
(BIO-RAD) procurando eliminar todas las burbujas.
Transferir a 250 mA por 1,5 horas, se verifica la
transferencia y luego la membrana se bloque con
leche al 5% con TBS Tween 20 al 0,05% a
temperatura ambiente con agitacin constante por
una hora.
Se incuba con el primer anticuerpo (yhh disuelto en
leche al 5% con TBS Tween 20 a 4C con agitacin
constante por 16 horas. La membrana se lav 5
veces por 5 min y se incuba con anticuerpo anti
IgG de conejo (1:5000) disuelto en leche al 5% con
TBS Tween 20 con agitacin constante por una
hora a 37C. Nuevamente se lava la membrana 5
veces por 5 minutos con TBS tween 20 al
0,05%con agitacin suave a temperatura ambiente.
La membrana se incuba con una solucin de
Enhanced luminol reagent y oxidizing reagent por
un minuto a temperatura ambiente, se elimina el
exceso y se expone la membrana con film
revelador pudiendo visualizar las bandas de
protenas.
Determinacin de la actividad invertasa
Se midi la absorbancia por el mtodo DNS para
las fracciones con mayor actividad. Se mezclaron
las dos fracciones de mayor absorbancia para
tener una mayor disponibilidad de enzima,
posteriormente se diluy 1/6 (una parte de enzima,
6 partes de buffer fosfato 5 mM) con el objetivo de
tener una absorbancia cercana a 0.5
Determinacin de pH y temperatura ptima
Efecto de pH. Se somete el extracto de enzima a
diferentes pH (3.6; 4.2; 5.0 con tampn acetato 0.1
M y 6.0; 7.0; 8.0 con tampn fosfato 0.1 M),
manteniendo los dems factores constantes. Se
procede a determinar la actividad por el mtodo
DNS. Efecto de temperatura. As mismo se somete
el extracto de enzima a diferentes temperaturas
(35; 45; 55; 65; 75 C) manteniendo los dems
factores constantes. Se procede a determinar la
actividad por el mtodo DNS.
Determinacin de parmetros cinticos
Curva de progreso. Para medir el progreso de la
reaccin se prepar un tubo de incubacin con
2000 ul de tampn acetato 0.1 M pH 5, 900 ul agua
destilada, 1000 ul de sacarosa 0.2 M, fue
preincubado a 55C por 5 min y luego se le aadi
100 ul de extracto de enzima manteniendo el tubo
a 55C. De forma paralela se prepararon 14 tubos
con 1 ml de DNS a los cuales se les fueron
aadiendo 100 ul del tubo de incubacin cada 5
min. Para luego medir la absorbancia por el
mtodo DNS. Curva de saturacin. Se procede a
realizar una curva de saturacin, con el objetivo de
determinar los parmetros Km y Vmax utilizando
los dobles recprocos. Para esto, se dispuso de 8
tubos con distintas concentraciones de sustrato,
manteniendo la cantidad de enzima constante. Se
midio la actividad enzimtica de estos tubos
mediante el metodo DNS.
Efecto de la concentracin de enzima.
Se analiz el efecto de la concentracin de enzima
sobre la actividad invertasa, para esto se prepar
una serie de 5 tubos, variando la concentracin de
enzima, a los cuales se les midio la absorbancia
por el mtodo DNS descrito en un apartado
anterior.
Efecto de inhibidores sobre actividad enzimtica.
Para evaluar el efecto de inhibidores, y que tipo de
inhibicin presentan sobre la actividad enzimtica,
se determin la actividad enzimtica en presencia
de sulfato de cobre, variando la concentracin de
este ltimo en 8 tubos de ensayo (sin variar
cantidad de enzima). Posteriormente, a estos tubos
se les midi la absorbancia por medio del mtodo
DNS. Adems, se realizaron dos ensayos en los
que se midi el efecto de inhibidor variando la
concentracin de sustrato y manteniendo constante
la concentracin de inhibidor (1 mM y 2 mM). Para
comparar los parmetros, tambin se realiz una
curva de saturacin sin inhibidor.
Resultados y Discusin
Anlisis de fracciones
Se recolectaron los tubos de elucin luego de la
cromatografa de intercambio inico. Se midi la
absorbancia de estos, resultando los tubos A
(A=0,824), B (A=1,201), y C (A=1,387) los de
mayor absorbancia, que fueron utilizados en los
ensayos posteriores.
 A B
0.7 1.400
0.6 A = 0.0307[ug/ml] + 0.002 1.200 A = 0.0295[mM]
0.5 R = 0.9883 1.000 R = 0.9989
0.4 0.800

A
A

0.3 0.600
0.2 0.400
0.1 0.200
0 0.000
0 10 20 30 0 10 20 30 40 50
Albumina [ug/ml] glucosa [mM]
Figura 2. Curva de calibrado glucosa (A) a 595 nm, Curva de calibrado glucosa (B) a 570 nm.

Determinacin de concentracin va mtodo de alcuotas, es decir, distintas etapas en el proceso

Bradford. de purificacin.

Mediante el mtodo de Bradford es posible Poner imgenes

determinar la concentracin de enzima invertasa
presente. Se realiza una curva de calibrado
conociendo la absorbancia del complejo protena
(patrn BSA) Reactivo de Bradford. sta reaccin
sigue la ley de Lambert Beer, por lo que se puede
relacionar proporcionalmente con la absorbancia
medida. La curva de calibrado se muestra en la
figura 2 Para las fracciones con mayor actividad se
obtuvieron los siguientes resultados: 5 (A=0.141), 6
(A=0.407) y 7 (A=0.247) y para las alcuotas 1 y 2
los valores son 0,236 y 0,267 con diluciones
1/16,6 y 1/10 respectivamente. Los resultados se
muestran en la tabla 1.
Actividad Invertasa y tabla de purificacin
Para medir la actividad de la enzima Invertasa se
utiliza el reactivo DNS con el mtodo descrito
previamente, la cual se realiza midiendo la
absorbancia a 570 nm. As se puede obtener la
cantidad de enzima que produce 1 mol de
glucosa por minuto, es decir, la actividad
enzimtica (UE). Se realiz este procedimiento
paras las alcuotas 1 y 2 y para las fracciones A, B
y C. Los resultados se muestran en la tabla 1
Dilucin de trabajo

Caracterizacin de las fracciones por electroforesis
en gel de poliacrilamida y Western Blot
Realizando una electroforesis en gel de
poliacrilamida y Western-Blot se pueden diferenciar
las diferentes protenas presentes en las distintas
Se mezclaron las fracciones 6 y 7 para tener una
mejor disponibiliadad de enzima, a esta mezcla se
le realizo una dilucin de 1/8 y se midi la
absorbancia obteniendo un valor muy bajo
(A=0.359), luego se realiz otra dilucin 1/6
obteniendo un valor de 0.512.
pH y temperatura ptima
Se puede estudiar el efecto que el pH tiene sobre
la actividad de la invertasa ya que una reaccin
catalizada por una enzima puede ser alterada por
el ambiente en el que est reaccionando ya que
poseen grupos disociables que pueden ser el sitio
de unin con el sustrato o el sitio especifico de la
catlisis. Lo mismo puede suceder con la
temperatura en que cambia la conformacin de la
protena. El pH ptimo fue de 5 y la temperatura
55C. poner graficos
Parmetros cinticos
La velocidad inicial de reaccin se puede
determinar mediante una curva de progreso para
glucosa, en donde se mide la concentracin de
producto en el tiempo. Para el anlisis de esta
enzima esta curva se obtiene midiendo los cambios
de la absorcin en funcin del tiempo, ya que los
cambios de actividad con el tiempo o Vi estn
directamente relacionados. Luego, se construy la
curva de saturacin para determinar los valores de
Km y Vmax utilizando la tabla, mediante la grfica
de dobles recprocos grfico, obteniendo los
siguientes valores: Km= 70,3 ; Vmax= 42,2
[gluc]/min.
Luego de llevar a cabo una serie de pasos
relativamente sencillos de purificacin, se pudo
obtener un enriquecido de invertasa con el cual se
realizaron estudios cinticos con el objetivo de
caracterizar a esta enzima. Durante el desarrollo
de los trabajos prcticos se comprob su actividad
invertasa. De nuestros resultados se concluye que
el mtodo de purificacin fue efectivo para los
estudios que se queran realizar, habindose
determinado valores de 0,043 mM para Km, un pH
y temperatura ptimos de 8 y sd para la actividad
enzimtica de invertasa. Finalmente se sugiere,
para generaciones posteriores, que se corroboren
las longitudes de onda de trabajo, determinar
dichas constantes de forma experimental. Adems,
se propone que realizando un mayor nmero de
mediciones por estudio, se podran obtener
resultados ms representativos y valores ms
exactos.
Bibliografa

Efecto de la concentracin de enzima

En la tabla se muestran los resultados del clculo

de velocidad para cada volumen de enzima. Estos
datos son necesarios para obtener el grafico de
velocidad v/s concentracin de enzima.

Efecto de inhibidores sobre actividad enzimtica

En base a las tablas presentadas en este apartado,

se realizaron dos grficas. La primera representa el
efecto del inhibidor v/s la actividad. La segunda
grfica recopila la informacin de la curva de
saturacin para los tres casos descritos en
materiales y mtodos: En ausencia de inhibidor, y
en concentraciones de 1mM y 2Mm.

Conclusiones