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ENZIMI

Importanza degli enzimi in Medicina

1. Chiave per capire errori del metabolismo


2. Importanti nelle reazioni di detossificazione
3. Targets di chemioterapia
4. Essenziali per formulare il razionale di un farmaco
5. Punto di riferimento nella diagnosi e nel monitoraggio terapeutico
6. Il ruolo primario delle vitamine svolto come cofattori di enzimi
Tutti gli enzimi sono proteine****

-hanno un peso molecolare tra 15 kDa 1000 kDa

-mostrano le stesse propriet fisiche e chimiche delle proteine:

1. denaturazione
2. precipitazione
3. sensibilit alle proteasi

**** alcuni RNA catalitici o ribozimi possono essere classificati come enzimi
Gli enzimi sono caratterizzati da tre propriet distintive:

1. CAPACITA CATALITICA

2. SPECIFICITA DI SUBSTRATO

3. REGOLAZIONE

I residui amminoacidici che formano il sito


di legame sono disposti in modo tale da
reagire specificamente con il substrato
mediante forze attrattive
Molti enzimi necessitano di componenti chimici
addizionali detti cofattori

ioni inorganici (Fe2+, Mg2+, Zn2+)

I cofattori possono essere


coenzimi (molecole organiche o
metallo-organiche)
I coenzimi legati covalentemente allenzima
sono chiamati gruppi prostetici

GRUPPO PROSTETICO + APOENZIMA = OLOENZIMA


Esempi di enzimi che contengono come cofattori ioni inorganici
Catalasi
Fe2+ o Fe3+
Perossidasi
Cu2+ Citocromo ossidasi
Anidrasi carbonica
Zn2+
Alcol deidrogenasi
Glucosio-6-fosfatasi
Mg2+
Piruvato chinasi
Mn2+ Ribonucleotide reduttasi
Ni2+ Ureasi
Mo Dinitrogenasi
Se Glutatione perossidasi
Esempi di enzimi e coenzimi che trasferiscono gruppi chimici

coenzima gruppi trasferiti enzimi

FAD atomi di idrogeno


deidrogenasi
NAD ione idruro

coenzima A gruppi acilici acil-transferasi

tiamina pirofosfato gruppi idrossialchil. decarbossilasi

piridossalfosfato gruppo amminico amminotransferasi

biotina CO2 carbossilasi

tetraidrofolato formil, metilen, metil transferasi C1


A P
(spontanea)

-d[A]
v= = K[A]
dt

La velocit proporzionale alla concentrazione di A e K la costante di


proporzionalit o costante di velocit

Poich v proporzionale ad A (unico reagente), la reazione A P


detta reazione di primo ordine (reaz. unimolecolare)

Invece nella reazione:


A+B C+D v= K[A] [B]

Poich v proporzionale al prodotto di due concentrazioni, la reazione di


secondo ordine.
Energia libera media (Energia richiesta
(stato iniziale) per aumentare lE
media di una mole
di reagenti)

La reazione A + B C + D si verifica perch ad ogni istante dato


sia A che B hanno lenergia necessaria per raggiungere una condizione
reattiva nota come stato di transizione.
Ci sono due modi per accelerare una reazione chimica: A P

aumento della temperatura: aggiunta di un catalizzatore:

aumenter lenergia media dei reagenti il catalizzatore abbassa il G


diminuendo cos lenergia necessaria a combinandosi temporaneamente con i
raggiungere lo stato di transizione. reagenti in modo da promuovere il loro
ingresso nella condizione reattiva dello
stato di transizione
CINETICA DELLE REAZIONI ENZIMATICHE

Il cambiamento nella velocit di reazione in funzione della variazione

nella concentrazione del reagente una delle misure principali

dellanalisi cinetica
Curva di saturazione del substrato per una reazione enzimatica

(A)

A bassa [S], v proporzionale a [S] (reazione di primo ordine)


Ad alta [S], v diviene indipendente da [S] e si avvicina ad un limite massimo. Il valore
di v a questo limite indicato come Vmax.

La reazione enzimatica obbedisce ora ad una cinetica di ordine zero, cio la velocit
indipendente dalla [reagente] e dipende direttamente dallenzima.

Quando v non aumenta anche se [S] aumenta, il sistema saturato dal substrato
Teoria generale di azione degli enzimi proposta da
Michaelis e Menten:

lenzima E ed il suo substrato S si associano


reversibilmente per formare un complesso ES.
Il prodotto si forma in un secondo stadio quando
ES si rompe per dare E+P

lo stadio precoce della reazione


mostrato in scala maggiore

K1 K2
E + S ES E+P
K-1 K-2
Lequazione di Michaelis-Menten

v
max S
v =
0
K m
+ [S ]

Km = costante di Michaelis-Menten
Vo = velocit iniziale
Vmax = velocit allo stato stazionario

La velocit di una reazione enzimatica v in qualsiasi istante


determinata dal rapporto fra due costanti Km e Vmax e la
concentrazione del substrato in quellistante.

Il valore di Km definito dalla concentrazione di substrato che d


una velocit pari alla met della velocit massima:
quando [S]= Km, v= Vmax/2
Significato della costante di Michaelis

Lequazione di Michaelis-Menten descrive una


curva chiamata iperbole rettangolare

Km anche una misura dellaffinit dellenzima per il suo substrato:


se un enzima ha un piccolo valore di Km, vuol dire che raggiunge la
massima efficienza catalitica a basse concentrazioni di substrato
(bassa Km = alta affinit)
La Commissione Internazionale sugli Enzimi definisce lUnit Internazionale di
Enzima come la quantit che catalizza la formazione di una micromole di
prodotto in un minuto.

Il numero di turnover di un enzima, Kcat, una misura della sua massima attivit
catalitica.

Kcat = numero di molecole di substrato convertite in prodotto per molecola di


enzima per unit di tempo quando lenzima saturato con il substrato
Lequazione di Michaelis-Menten descrive una
curva chiamata iperbole rettangolare

v
max S
v =
0
K m
+ [S ]

A causa della forma iperbolica del grafico di v in funzione di [S]


la determinazione precisa del valore di Vmax non possibile.
Dallequazione di Michaelis-Menten si possono ottenere grafici lineari:
prendendo i reciproci di entrambi i membri dellequazione di M-M
v
max S
v =
0
K m
+ [S ]
questa equazione descrive
una linea retta
Grafico dei doppi reciproci di Lineweaver-Burk

y=

x=
Il riconoscimento enzima-substrato e gli eventi catalitici che seguono sono
fortemente dipendenti dal pH

Loptimum di pH pu non coincidere con lambiente naturale in cui lenzima


si trova: risposta al pH = regolazione intracellulare dellattivit enzimatica
Effetti della temperatura sullattivit enzimatica

La diminuzione dellattivit a temperature


superiori a 50 dovuta alla denaturazione
termica.
Inibizione enzimatica

competitiva
inibizione reversibile
non competitiva
linibitore interagisce con lenzima attraverso reazioni non covalenti
di associazione/dissociazione

inibizione irreversibile

linibitore causa alterazioni covalenti stabili dellenzima

I due tipi di inibizione si possono distinguere dal particolare tipo di


andamento che si ottiene quando i dati cinetici sono analizzati in
diagrammi lineari di Lineweaver-Burk
INIBIZIONE REVERSIBILE

La Succinato deidrogenasi un esempio classico di inibizione competitiva


INIBIZIONE REVERSIBILE

inibizione competitiva
Il substrato e linibitore competono
per lo stesso sito di legame sullenzima
(sito attivo)
Laumento della [S] aumenta la probabilit che sia S a legarsi allenzima invece
dellinibitore. Alti valori di [S] possono annullare leffetto di I.

La caratteristica di questo tipo di


inibizione che Vmax non
influenzata da I (tutte le rette
mostrano la stessa intercetta
sullasse y)

Km aumenta Vmax invariata


INIBIZIONE REVERSIBILE

inibizione non competitiva


Linibitore ed il substrato si
legano a siti diversi dellenzima
e il legame di I non influenza il
legame di S
Linibizione non pu essere superata
aumentando la [S]

Km invariata Vmax diminuisce (diminuzione dellenzima attivo)


INIBIZIONE IRREVERSIBILE

- linibitore si lega irreversibilmente allenzima (per es. con un


legame covalente) .

-tipo di cinetica osservata: simile allinibizione non competitiva

- differenza: la diluizione non efficace a dissociare il complesso


E-I e non ripristina lattivit enzimatica
Substrati suicidi:
sono inibitori analoghi del substrato che si legano covalentemente allenzima
con specificit ed alta affinit.

la penicillina un inibitore irreversibile dellenzima


glicoproteina transpeptidasi che crea i legami crociati
nelle catene di peptidoglicano durante la sintesi della
parete cellulare batterica.
La specificit il risultato del riconoscimento molecolare

Il sito attivo dellenzima comprende solo


una parte della sua struttura, una speciale
tasca complementare alla struttura del substrato
Adattamento indotto
il complesso cataliticamente attivo enzima-substrato una struttura
interattiva:
-la forma del sito attivo dellenzima si modifica in seguito al legame di S
-lenzima induce il substrato ad adottare una forma che mimi lo stato
di transizione della reazione

processo di riconoscimento
dinamico fra E e S
Controllo dellattivit enzimatica

1. accumulo del prodotto (dimin. velocit di sintesi di P)


2. disponibilit del substrato
3. controllo genetico
4. modifica covalente
reversibile

irreversibile
5. isozimi
6. proteine modulatrici
7. enzimi allosterici
4.
Modificazioni covalenti reversibili:
Fosforilazione
Adenilazione
Uridililazione
ADP-Ribosilazione
Metilazione
Fosforilazione

Gli enzimi regolati mediante modifiche covalenti sono chiamati


enzimi interconvertibili
Modificazioni covalenti irreversibili:
Proteolisi (zimogeni)

insulina
enzimi proteolitici del tratto digestivo

Lattivazione proteolitica del chimotripsinogeno


coagulazione del sangue
Controllo dellattivit enzimatica

1. accumulo del prodotto


2. disponibilit del substrato
3. controllo genetico
4. modifica covalente
reversibile

irreversibile
5. isozimi
6. proteine modulatrici
7. enzimi allosterici
Gli isozimi della
5. Isozimi lattato deidrogenasi

(M4)

Numerosi enzimi esistono


in pi strutture quaternarie
che differiscono nelle
proporzioni di associazione
di due subunit A e B. (H4)
Enzimi di interesse clinico che si presentano in forme multiple

Enzima
Lattico deidrogenasi (infarto del miocardio, epatite virale)
Isocitrico deidrogenasi (epatiti virali)
Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (anemia)
Glutammico deidrogenasi (affezioni epatiche)
Aspartico transaminasi (infarto del miocardio)
Creatina chinasi (indice di infarto e distrofia muscolare)
Acetilcolinesterasi (anestesia)
Colinesterasi (indice di funzionalit epatica)
Fosfatasi alcalina (affezioni epatiche e dellapp. scheletrico)
Fattori che influenzano le attivit enzimatiche nel
plasma negli stati patologici:
lorgano o il tessuto interessato dalla malattia
la natura della lesione
la distribuzione degli enzimi nel tessuto interessato
effetti secondari su altri organi
la velocit del rilascio dellenzima da parte delle cellule
danneggiate
la scomparsa dellenzima dal circolo sanguigno
Controllo dellattivit enzimatica

1. accumulo del prodotto


2. disponibilit del substrato
3. controllo genetico
4. modifica covalente
reversibile

irreversibile
5. isozimi
6. proteine modulatrici
7. enzimi allosterici
6. Proteine modulatrici

La proteina chinasi AMP ciclico dipendente (PKA)


Controllo dellattivit enzimatica

1. accumulo del prodotto


2. disponibilit del substrato
3. controllo genetico
4. modifica covalente
reversibile

irreversibile
5. isozimi
6. proteine modulatrici
7. enzimi allosterici
7. Enzimi allosterici
la loro cinetica non obbedisce
allequazione di Michaelis-Menten

Grafico sigmoide di V in funzione di [S]


Il modello della regolazione enzimatica: la glicogeno fosforilasi

1. In condizioni normali, lattivit di questo enzima nel muscolo regolata


allostericamente da metaboliti che riflettono lo stato energetico cellulare
(AMP, ATP, glucosio 6 fosfato)

2. In caso di stress ladrenalina stimola una cascata di reazioni che culminano


nella fosforilazione (attivazione) dellenzima
La reazione della fosfoglucomutasi

muscolo: energia per la contrazione muscolare

fegato: glucosio che viene esportato agli altri tessuti


STRUTTURA DEL MONOMERO DIMERO DELLA
DELLA GLICOGENO FOSFORILASI GLICOGENO
FOSFORILASI
Curve di v in funzione di [S] per la glicogeno fosforilasi

b) LATP un inibitore a feed-back che influenza lattivit dellenzima per il substrato

c) LAMP effettore eterotropico positivo; si lega allo stesso sito dellATP (in
competizione) ed influenza laffinit dellenzima per il substrato

Livelli significativi di AMP indicano che lo stato di energia della cellula basso e che dovrebbe
essere prodotta pi energia (ATP).

I cambiamenti nelle concentrazioni cellulari di ATP e AMP e la loro competizione per il legame
allo stesso sito con effetti opposti assicura che la produzione di energia sia proporzionata
alle esigenze cellulari
1.
Meccanismo della modifica covalente
e della regolazione allosterica della
glicogeno fosforilasi

2.
La fosforilazione causa nella fosforilasi
un drastico cambiamento conformazionale
La glicogeno fosforilasi regolata da
cascate enzimatiche
Lattivazione ormonale delladenilato ciclasi
La reazione delladenilato ciclasi
MECCANISMI DI AZIONE DEGLI ENZIMI
I tipi di meccanismi catalitici utilizzati dagli enzimi sono stati
classificati come:

 catalisi acido-basica

 catalisi covalente

 catalisi favorita da ioni metallici

catalisi favorita da effetti di prossimit e di orientamento


catalisi acido-basica
(presente in quasi tutte le reazioni
enzimatiche): la velocit aumenta se
cambia il pH.

Esistono di 2 tipi di catalisi acido-basica:

catalisi acido-base specifica:


gli ioni H+ o OH- accelerano la reazione
(la concentrazione del tampone non ha
alcun effetto sulla reazione)

catalisi acido-base generale


un acido o una base, diversi da H+ o OH-
accelerano una reazione (il tampone pu
donare o accettare protoni, influenzando
cos la velocit di reazione)
Catalisi covalente: alcune reazioni enzimatiche devono gran parte dellaumento
della loro velocit alla formazione di legami covalenti fra E ed S

X= centro nucleofilo che


attacca un centro
elettrofilo
catalisi favorita da ioni metallici: alcuni enzimi richiedono ioni metallici per
svolgere la loro massima attivit catalitica
lalcol deidrogenasi epatica

uno ione zinco del sito attivo dellenzima


alcol deidrogenasi stabilizza la formazione
di una carica negativa sullatomo di ossigeno
dellacetaldeide, portando alla comparsa di
una parziale carica positiva indotta sullatomo
di carbonio carbonilico
catalisi favorita da effetti di prossimit e di orientamento

le reazioni chimiche avvengono pi velocemente quando i reagenti si


trovano in prossimit, cio vicini gli uni agli altri.

Gli enzimi non solo mantengono i substrati e i gruppi catalitici vicini gli uni agli
altri, ma li orientano in modo tale da favorire la catalisi
MECCANISMI ENZIMATICI

Serina proteasi

Aspartato proteasi
Serina proteasi

classe di enzimi proteolitici il cui meccanismo catalitico basato sulla


presenza di un residuo di serina nel sito attivo.

-tripsina enzimi digestivi sintetizzati nel pancreas e secreti


-chimotripsina nellapparato digerente come proenzimi inattivi o zimogeni
-elastasi
-trombina
-plasmina
-attivatore tissutale del plasminogeno

-acetil colinesterasi= non una proteasi ma una serina esterasi il cui


meccanismo dazione correlabile a quello delle serina proteasi. Essa
idrolizza il neurotrasmettitore acetilcolina nello spazio sinaptico
interneuronico.
Tripsina, chimotripsina ed elastasi catalizzano tutti la stessa reazione:
la scissione di una catena polipeptidica.

Tripsina: agisce su aa basici


(arginina, lisina)

Chimotripsina: agisce su aa
aromatici

Elastasi: agisce su piccoli


residui di aa neutri
Tre residui polari (His 57, Asp102, Ser195) formano la cosiddetta triade catalitica
in corrispondenza del sito attivo il quale costituito da una depressione sulla
superficie dellenzima.
Le proteasi a serina sono sensibili alla inibizione da parte di fluorofosfati organici

complesso covalente
enzima-inibitore

Il diisopropilfluorofosfato reagisce con i residui di serina del sito attivo delle


serina proteasi e delle serina esterasi (come lacetilcolinesterasi) causando una
inattivazione.
Acetilcolinesterasi: serina esterasi che degrada il neurotrasmettitore
acetilcolina nei neuroni.

DIFP: altamente tossico perch inibisce le acetilcolinesterasi.

Sarin: molecola simile al DIFP (1995, metropolitana di Tokyo)

Gas mortale VX: 10 volte pi tossico del Sarin (Inghilterra)


Aspartato proteasi
classe di enzimi proteolitici il cui meccanismo catalitico basato
sulla presenza di due residui di acido aspartico nel sito attivo.

Alcune aspartato proteasi rappresentative

Nome Sorgente Funzione

Pepsina Stomaco Digestione proteine della dieta

Catepsina D Milza, Fegato Digestione lisosomiale proteine

Renina Rene Regolazione pressione arteriosa

Proteasi HIV-1 Virus AIDS Maturazione delle proteine del


virus dellAIDS

A differenza delle serina proteasi, le aspartato proteasi non formano legami covalenti
con i loro substrati peptidici.
La proteasi del virus HIV-1 dellAIDS una aspartato proteasi

La proteasi HIV-1 scinde la poliproteina originando proteine diverse necessarie


alla crescita virale e allinfezione cellulare
Gli inibitori delle proteasi prolungano la vita dei pazienti affetti da AIDS
Terapia: inibitori proteasi + AZT
Farmaci progettati con un disegno strategico basato sulla struttura: la parte della struttura
contenente il gruppo -OH si inserisce fra i due gruppi carbossilici del sito attivo della
proteasi

Struttura dellAZT
inibitore della
trascrittasi inversa

CARATTERISTICHE DI UN FARMACO
Biodisponibilit: capacit di raggiungere nellorganismo il luogo di azione desiderato
Specificit: per la proteasi dellHIV nei linfociti e non per le altre proteasi
Novit: per contrastare i ceppi mutanti dellHIV resistenti agli inibitori delle
proteasi (ricerche ancora in corso)