Mtodo 8
Determinacin de los Coeficientes de Absorcin Espectral de las
Partculas y del Fitoplancton
Laurencia Guzmn y Ramn Varela
Introduccin
El tamao, naturaleza y abundancia de las partcu-
las en suspensin en el mar influyen en el clima de la
luz en el agua, lo cual afecta la actividad y distribucin
del plancton, e indirectamente las concentraciones de
algunos de los elementos qumicos que se encuentran
en la capa ftica. En sentido inverso, las propiedades
pticas inherentes pueden revelar las caractersticas y
cantidad de partculas en el mar. El procedimiento que
aqu se describe determina el coeficiente de absorcin
espectral tanto para las partculas en general, como
especfico para el fitoplancton. La tcnica, basada en
Kishino et al. (1985), mide la absorcin de la luz que
pasa por un filtro hmedo que contiene partculas.
Fundamentos del mtodo
El mtodo se fundamenta en el cambio que se ob-
serva en el espectro de absorcin de luz de un filtro
hmedo que retiene las partculas en suspensin de
una muestra de agua de mar en referencia a un filtro
blanco. Al filtro con la muestra se le mide el espectro
de absorcin antes y despus de la extraccin de los
pigmentos con metanol caliente (60 C). Esta tcnica
determina el coeficiente de absorcin total de partcu-
las, ap(), y el coeficiente de absorcin de detritus (par-
tculas sin pigmentos), ad(). La diferencia en la trans-
misin ptica entre ambos parmetros se relaciona
con el coeficiente de absorcin del fitoplancton aph().
Los resultados se expresan en m-1.
Advertencias analticas
1. En las mediciones se producen variaciones debido
a diferencias en las caractersticas de las partculas
en el agua, al equipo empleado (espectrofotmetro
o espectroradimetro) y al tipo de filtro utilizado.
Esta interferencia se corrige para cada caso en
particular aplicando un factor de amplificacin de
la longitud del paso de luz, (Kishino et al., 1985;
Mitchell y Kiefer, 1988; Bricaud y Stramski, 1990;
Mitchell, et al. 2002).
2. Si la extraccin de los pigmentos con el solvente
es incompleta, el coeficiente del material detrtico
se puede sobreestimar y afectar el coeficiente de
absorcin del fitoplancton. Es importante observar
que no haya una seal de absorcin del fitoplancton
en las mediciones de ad() hacia las longitudes de
onda ms largas (rojo).
3. La cantidad de material retenido por el filtro no
debe generar una densidad ptica (DO) mayor de
0,25 y menor de 0,05 cuando se mide a 675 nm o
menor a 0,4 a 440 nm (Mitchell et al, 2002). Cuando
la cantidad de material retenido en el filtro es muy
baja, es difcil apreciar un cambio de color en la
superficie del filtro. El volumen de agua que se filtra
debe estar en funcin de la cantidad de partculas
presentes en la muestra de manera de poder con-
trolar la intensidad del color en el filtro.
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Materiales
1. Filtros Whatman, GF/F, de 0,7 m, 25 mm de di-
metro.
2. Placas de Petri pequeas (plsticas).
3. Jeringa de plstico de 60 mL.
4. Manguera de 10 cm de largo que se conecta a la
punta de la jeringa.
5. Pipeta Pasteur de 5 mL con bulbo de goma.
6. Embudo para filtros de 25 mm de dimetro y capa-
cidad de 200 mL.
7. Cilindro graduado de 50 mL.
Equipos
1. Unidad de filtracin y bomba de vaco para la toma
de muestras as como para el laboratorio.
2. Equipo de medicin
a. Espectrofotmetro con capacidad para barridos
espectrales con un ancho de banda en el visible
de 380 a 800 nm, y una resolucin ptica del
instrumento menor de 4 nm. Para poder medir
la DO de los filtros en un espectrofotmetro se
requiere de un accesorio especial (no disponible
con todos los fabricantes) que ilumine por trans-
misin la totalidad del rea del filtro y que mida
la luz que pasa a travs de l.
b. Otra opcin es emplear un espectroradimetro.
Este tipo de instrumento mide los niveles de ra-
diancia en intervalos de longitud de onda estre-
chos en una regin espectral dada. El equipo
emplea una fibra ptica de ngulo de visin co-
nocido que enfoca justo el rea del filtro. El filtro
es iluminado totalmente en forma uniforme con
una lmpara incandescente de halgeno. En los
anlisis del proyecto CARIACO se emplea un
Spectrascan PR-650 de Photo Research y se
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usa una caja oscura con una fuente de luz que
sostiene e ilumina el filtro por transmisin, y que
sirve adems de soporte fijo para el enfoque de
la fibra ptica (Figura 8.1). Este tipo de equipo
descompone la luz incidente en diferentes longi-
tudes de onda en distintas direcciones angula-
res luego que esta pasa a travs de la muestra.
El elemento sensible es una serie de fotodiodos,
que miden las diferentes longitudes de onda. El
rango til de estas mediciones es entre 420 y
750 nm, ya que las longitudes de onda ms cor-
ta se registran a intensidades muy bajas debido
al tipo de fuente de luz, y a que la fibra ptica
usada las absorbe fuertemente.
3. Bao de agua a 60 C con una estabilidad de 0,5
C.
4. Se puede medir la cantidad de clorofila presente en
el extracto del metanol que lava el filtro, para lo cual
se debe utilizar un espectrofotmetro con cubetas
de 10-cm y seguir un procedimiento para anlisis
espectrofotomtrico de pigmentos (Strickland y
Parsons, 1972), o utilizar un fluormetro con lo cual
se puede medir la clorofila siguiendo el Mtodo 13
de este manual.
Reactivos
1. Metanol (CH3OH).
Captacin de muestras
1. Captar las muestras de agua de la roseta en botellas
de plstico oscuras de 2 L.
2. Filtrar el agua a travs de filtros Whatman GF/F
utilizando la bomba de vaco. Anotar el volumen
filtrado. El volumen a filtrar depende de la cantidad
de partculas en el agua lo cual es indicado por el
 grado de saturacin del filtro. En aguas con biomasa
moderada (de 0,5 a 1 mg m-3 de clorofila) como son
las aguas cercanas a la costa, un volumen medio
de 2 L es suficiente. En aguas con ms partculas
se debe reducir hasta 0,25 L. En aguas ocenicas
se requiere ms volumen hasta producir una colo-
racin apreciable en el filtro.
3. Guardar cada filtro sin doblar en placas de Petri de-
bidamente identificadas con la cara que retiene las
partculas hacia arriba.
4. Cubrir las placas con papel de aluminio para evitar
la exposicin a la luz.
5. Congelar los filtros colocando las placas en posi-
cin horizontal hasta el momento de realizar el an-
lisis.
Anlisis de muestras
Encender la fuente de luz 15 minutos antes de co-
menzar el anlisis para que estabilice.
1. Preparacin de muestras
a. Descongelar los filtros con la muestra.
b. Colocar papel absorbente, humedecido con
agua destilada, por debajo de los filtros dentro
de las placas de Petri para mantenerlos hme-
dos. Utilizar una esptula para levantar el filtro
de manera de no tocar la cara superior del mis-
mo, y mantener las placas tapadas con papel
aluminio todo el tiempo.
c. Preparar un filtro de referencia (blanco) de la mis-
ma manera que en el paso b.
2. Anlisis (usando un espectroradimetro)
a. Absorcin de luz por las partculas totales lavado con metanol caliente (Lmlv).
(ap):
i. Medir la radiancia del filtro blanco (Lb).
ii. Medir la radiancia del filtro con muestra
(Lm).
iii. Obtencin del espectro de absorcin
DOm() = log10 ( LmLb ) (1)
Nota: si se usa un espectrofotmetro la DOm
se obtiene directamente.
b. Absorcin debida al material detrtico (ad
extraccin con metanol caliente).
i. Colocar metanol en un frasco con la tapa
semi-abierta ligeramente enroscada.
ii. Calentar el metanol en un bao de agua
a una temperatura de 60 C. Realizar este
paso bajo campana de extraccin de gases
usando guantes y lentes de seguridad.
iii. Colocar el filtro con muestra en un embudo
de filtracin. (Figura 8.2).
iv. Con una pipeta Pasteur agregar metanol
caliente al filtro en alcuotas de 5 mL.
v. Filtrar lentamente hasta usar unos 50 mL de
metanol. La solucin una vez que pasa por
el filtro se recupera en un cilindro graduado.
(Figura 8.2).
vi. Anotar el volumen total filtrado en el cilindro.
Este volumen representa el extracto que se
puede emplear para determinar la concen-
tracin de clorofila.
vii. Medir de nuevo la radiancia del filtro blanco
(Lb).
viii. Medir la radiancia del filtro con la muestra
ix. Obtener el nuevo espectro de absorcin
DOmlv() con la frmula (1).
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 Para determinar la cantidad de clorofila a o calcu-
lar los ndices de pigmentos por espectrofotometra y/o
fluorometra, se debe mezclar primero el extracto de
pigmentos en metanol bombeando con una jeringa a la
cual se le coloca una pequea manguera en un extre-
mo, y con la misma se trasvasa el extracto a una celda
adecuada para realizar las mediciones.
Clculo y expresin de resultados
Los coeficientes de absorcin, en la banda del visi-
ble de 380 a 750 nm con una resolucin ptica
menor de 4 nm, se calculan mediante las siguientes
expresiones:
1. El coeficiente de absorcin de partculas totales se
calcula con la siguiente ecuacin:
ap()= A*
( * V)
(2,3 * DOp())
(2)
donde
ap () = coeficiente espectral de absorcin
por parte de las partculas (m-1).
A = rea utilizada del filtro = 3,63 x 10-4
m2 para filtros de 25 mm.
DOp() = densidad ptica corregida =
DOm() DO(750).
DO(750) = Ajuste = promedio de DO entre 752
nm y 780 nm, en donde la absorcin
por fitoplancton se asume como
cero.
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= 1,63 [(DOp)-0,22] (factor de amplificacin
del filtro; Mitchell y Kiefer, 1988;
Bricaud y Stramski, 1990).
V = volumen en m3 de agua filtrada.
2. El coeficiente de absorcin de detritus se calcula
con la siguiente ecuacin:
(2,3 * DOd())
ad()= A* (3)
( * V)
donde
ad() = coeficiente espectral de absorcin
detrtica debida a los restos
vegetales y otras partculas sin
clorofila (m-1).
DOd() = densidad ptica corregida =
DOmlv() DO(750).
Se realizan los mismos clculos que para ap(), pero
utilizando las absorbancias del filtro despus de la
extraccin con el metanol caliente.
3. El coeficiente de absorcin del fitoplancton se calcu-
la con la siguiente ecuacin:
aph () = ap () ad () (4)
donde
aph () = coeficiente espectral de absorcin de luz
debida a los pigmentos del fitoplancton
(m-1).