Metodos Análisis OIV Vol 2

COMPENDIUM OF
INTERNATIONAL METHODS
OF WINE AND MUST ANALYSIS
INTERNATIONAL ORGANISATION
OF VINE AND WINE
ORGANISATION INTERNATIONALE DE LA VIGNE ET DU VIN
COMPENDIUM
OF INTERNATIONAL
MTHODS OF WINE
AND MUST ANALYSIS
EDITION 2006 VOLUME 2
INCLUDED :
Resolutions adopted in Paris (France)
3th A.G. 17 june 2005
O.I.V. - 18, RUE DAGUESSEAU - 75008 PARIS

COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS-OIV
Table of contents
General organization of the Compendium
Table of contents
Foreword
ANNEX A METHODS OF ANALYSIS OF WINES AND MUSTS
SECTION 1 DEFINITIONS AND GENERAL PRINCIPLES
SECTION 2 PHYSICAL ANALYSIS
SECTION 3 CHIMICAL ANALYSIS
SECTION 3.1 ORGANIC COMPOUNDS
SECTION 3.1.1 SUGARS

SECTION 3.1.2 ALCOHOLS
SECTION 3.1.3 ACIDS
SECTION 3.1.4 GAS
SECTION 3.1.5 OTHER ORGANIC COMPOUNDS
SECTION 3.2 NON ORGANIC COMPOUNDS
SECTION 3.2.1 ANIONS

SECTION 3.2.2 CATIONS
SECTION 3.2.3 OTHER NON ORGANIC COMPOUNDS
SECTION 4 MICROBIOLOGICAL ANALYSIS
SECTION 5 OTHER ANALYSIS
ANNEX B - CERTIFICATES OF ANALYSIS
ANNEX C - MAXIMUM ACCEPTABLE LIMITS OF VARIOUS SUBSTANCES
ANNEX D ADVICES
ANNEX E LABORATORY QUALITY ASSURANCE
MA-E-INT-00-TABMAT 2006 1
Table of contents
Table of contents ................................................ MA-E-INT-00-TABMAT
VOLUME 1
Foreword ........................................................... MA-E-INT-01-AVPROP

Layout and wording of OIV method of analysis ........ MA-E-INT-04-REDMET
ANNEX A METHODS OF ANALYSIS OF WINES AND MUSTS
SECTION 1 DEFINITIONS AND GENERAL PRINCIPLES

Definitions.......................................................... MA-E-AS1-01-DEFINI
General remarks ................................................. MA-E-AS1-02-REMGEN
Classification of analytical methods (oeno 9/2000) .. MA-E-AS1-03-CLASMA
Matrix effect for metals content analysis
(oeno 5/2000) .................................................... MA-E-AS1-04-EFFMAT
SECTION 2 PHYSICAL ANALYSIS

Density and Specific Gravity at 20oC (A 1).............. MA-E-AS2-01-MASVOL
Evaluation by refractometry of the sugar
concentration in grape musts, concentrated grape
musts and rectified concentrated grape musts ......... MA-E-AS2-02-SUCREF
Total dry matter (A 3).......................................... MA-E-AS2-03-EXTSEC
Ash (A 6) ........................................................... MA-E-AS2-04-CENDRE
Alkalinity of Ash (A 7) .......................................... MA-E-AS2-05-ALCCEN
Oxidation-reduction potential (oeno 3/2000) ........... MA-E-AS2-06-POTOXY
Chromatic Characteristics (A 0) ............................. MA-E-AS2-07-CARCHR
Wine turbidity (oeno 4/2000) ................................ MA-E-AS2-08-TURBID
Method for isotopic ratio 18O/16O (Oeno 2/96) ....... MA-E-AS2-09-MOUO18
Folin-Ciocalteu Index ........................................... MA-E-AS2-10-INDFOL
SECTION 3 CHIMICAL ANALYSIS
SECTION 3.1 ORGANIC COMPOUNDS
SECTION 3.1.1 SUGARS

Reducing sugars (A 4).......................................... MA-E-AS311-01-SUCRED
Glucose and fructose (enzymatic method)............... MA-E-AS311-02-GLUFRU
Dosage of sugars by HPLC (Oeno 23/2003) ............. MA-E-AS311-03-SUCRES
Stabilisation of musts to detect
Addition of sucrose (A 5) ...................................... MA-E-AS311-04-STAMOU
Detecting enrichment of musts, concentrated
grape musts, rectified concentrated grape
musts and wine by H-RMN .................................. MA-E-AS311-05-ENRRMN
SECTION 3.1.2 ALCOHOLS

Alcoholic strength by volume
- by pycnometer (oeno 8/2000)................ MA-E-AS312-01-TALVOL
Table of contents
- by frequency oscillator (oeno 8/2000) ..... MA-E-AS312-01-TALVOL

- by hydrostatic balance (oeno 24/2003) ... MA-E-AS312-01-TALVOL
- Tables of correction .............................. MA-E-AS312-02-TALVOL
Methanol (A 41) .................................................. MA-E-AS312-03-METHAN
Glycerol and 2,3- butanediol (A 21) ....................... MA-E-AS312-04-GLYBUT
Glycerol (enzymatic method) ................................ MA-E-AS312-05-GLYENZ
Determination of isotopic ratio of
ethanol (oeno 17/2001) ...................................... MA-E-AS312-06-ETHANO
SECTION 3.1.3 ACIDS

Total Acidity (A 10) ............................................. MA-E-AS313-01-ACITOT
Volatile Acidity (A 11) .......................................... MA-E-AS313-02-ACIVOL
Fixed Acidity (A 11) ............................................. MA-E-AS313-03-ACIFIX
Organic Acids : HPLC .......................................... MA-E-AS313-04-ACIORG
Tartaric Acid (A 12) ............................................ MA-E-AS313-05-ACITAR
Lactic Acid
- chemical method (A 27) ..................................... MA-E-AS313-06-ALACHI
- enzymatic method............................................. MA-E-AS313-07-ALAENZ
Citric Acid
- chemical method (A 29) ..................................... MA-E-AS313-08-ACICHI
- enzymatic method............................................. MA-E-AS313-09-ACIENZ
Total malic Acid: usual method (A 33) .................... MA-E-AS313-10-AMALTO
L-malic Acid: enzymatic method ............................ MA-E-AS313-11-ALMENZ
D-malic Acid: enzymatic method (oeno 6/98) .......... MA-E-AS313-12-ADMENZ
D-malic Acid: low concentrations
enzymatic method (oeno 16/2002) ........................ MA-E-AS313-12-ADMEZ2
L-ascorbic Acid (A 28) .......................................... MA-E-AS313-13-ALASCO
Sorbic Acid (A 30) ............................................... MA-E-AS313-14-ACISOR
pH .................................................................... MA-E-AS313-15-PH
Organic acid : ionic chromatography ...................... MA-E-AS313-16-ORGION
Shikimic acid (oeno 33/2004) ............................... MA-E-AS313-17-ACSHIK
SECTION 3.1.4 GAS

Carbon Dioxide (A 39 modified by Oeno 21/2003)).. MA-E-AS314-01-DIOCAR
Overpressure measurment of sparkling wines
(Oeno 21/2003) .................................................. MA-E-AS314-02-SUPRES
Determination of the carbon isotope ratio 13C/12C of
CO2 in sparkling wines (Oeno 7/2005) .................... MA-E-AS314-03-CO2MOU
VOLUME 2
SECTION 3.1.5 OTHER ORGANIC COMPOUNDS

Acetaldehyde (ethanal) (A 37) .............................. MA-E-AS315-01-ETHANA
Ethyl Acetate ...................................................... MA-E-AS315-02-ACEETH
Malvidin Diglucoside (A 18)................................... MA-E-AS315-03-DIGMAL
Ethyl Carbamate (oeno 8/98) ............................... MA-E-AS315-04-CARETH
Hydroxymethylfurfural (A 19) ............................... MA-E-AS315-05-HYDMFF
Cyanide Derivatives (oeno 4/94) ........................... MA-E-AS315-06-DERCYA
Table of contents
Artificial sweeteners (A 36) ................................... MA-E-AS315-07-EDUSYN

Artificial Colorants (A 43) ..................................... MA-E-AS315-08-COLSYN
Diethylene glycol................................................. MA-E-AS315-09-DIEGLY
Ochratoxin A ...................................................... MA-E-AS315-10-OCHRAT
HPLC-Determination of nine major Anthocyanins
in red and ros wines........................................... MA-E-AS315-11-ANCYAN
Plant proteins ..................................................... MA-E-AS313-12-PROVEG
SECTION 3.2 NON ORGANIC COMPOUNDS
SECTION 3.2.1 ANIONS

Total Bromide (A 23) ........................................... MA-E-AS321-01-BROTOT
Chlorides (A 15).................................................. MA-E-SA321-02-CHLORU
Fluorides (A 22) .................................................. MA-E-AS321-03-FLUORU
Total Phosphorus (A 16) ....................................... MA-E-AS321-04-PHOTOT
Sulfates (A 14) ................................................... MA-E-AS321-05-SULFAT
SECTION 3.2.2 CATIONS

Ammonium (A 20)............................................... MA-E-AS322-01-AMMONI
Potassium (A 8) .................................................. MA-E-AS322-02-POTASS
Sodium (A 25) .................................................... MA-E-AS322-03-SODIUM
Calcium (A 26).................................................... MA-E-AS322-04-CALCIU
Iron (A 9) .......................................................... MA-E-AS322-05-FER
Copper ............................................................. MA-E-AS322-06-CUIVRE
Magnesium (A 26) ............................................... MA-E-AS322-07-MAGNES
Zinc (A 45)......................................................... MA-E-AS322-08-ZINC
Silver ................................................................ MA-E-AS322-09-ARGENT
Cadmium ........................................................... MA-E-AS322-10-CADMIU
Lead (oeno 3/94) ................................................ MA-E-AS322-11-PLOMB
SECTION 3.2.3 OTHER NON ORGANIC COMPOUNDS
Arsenic (A 34) .................................................... MA-E-AS323-01-ARSENI

Arsenic - atomic absorption (Oeno 14/2002) ........... MA-E-AS323-01-ASSAA
Total nitrogen (A 40) ........................................... MA-E-AS323-02-AZOTOT
Total nitrogen - Dumas method (Oeno 13/2002)...... MA-E-AS323-02-AZOTDU
Boron (A 44) ...................................................... MA-E-AS323-03-BORE
Sulfur dioxide
- wine (A 17) ...................................................... MA-E-AS323-04-DIOSOU
- grape juice ...................................................... MA-E-AS323-05-SO2JUS
Mercury - atomic Fluorescence (Oeno 15/2002) ....... MA-E-AS323-06-MERCUR
SECTION 4 MICROBIOLOGICAL ANALYSIS

Microbiological Analysis (oeno 8/95) ...................... MA-E-AS4-01-ANMICR
Detection of preservatives and fermentation
inihibitors (A 35) ................................................. MA-E-AS4-02-RECANT
Table of contents
SECTION 5 OTHER ANALYSIS

Differentiation of fortified musts and
Sweet fortified wines ........................................... MA-E-AS5-01-DIFMIS
ANNEX B - CERTIFICATES OF ANALYSIS

Rules for the implementation of the analytical
methods ............................................................ MA-E-B1-01-REGAPL
Certificates of analysis ......................................... MA-E-B1-02-MODCER
ANNEX C - MAXIMUM ACCEPTABLE LIMITS OF VARIOUS SUBSTANCES

Maximum acceptable limits of various substances
Contained in wine................................................ MA-E-C1-01-LIMMAX
ANNEX D ADVICES
Gluconic Acid (oeno 4/91) .................................... MA-E-D1-01-ACIGLU
Characterization of wines resulting
from overpressing (oeno 5/91).............................. MA-E-D1-02-SURPRE
Level of sodium and chlorides ions in wines
(oeno 6/91)........................................................ MA-E-D1-03-TENION
ANNEX E LABORATORY QUALITY ASSURANCE

Validation Principle (oeno 7/98)............................. MA-E-AS1-05-PPEVAL
Collaborative Study ............................................. MA-E-AS1-07-ETCOL
Reliability of methods (oeno 5/99) ......................... MA-E-AS1-08-FIDMET
Protocol for the design, conducts and interpretation
of collaborative studies (oeno 6/2000).................... MA-E-AS1-09-PROPER
Estimation of the detection and quantification limits
of a method of analysis (oeno 7/2000) ................... MA-E-AS1-10-LIMDET
Harmonized guidelines for internal quality control
In analytical chemistry laboratories (Oeno 19/2002). MA-E-AS1-11-COQUAL
Practical guide for the Validation (oeno 10/05) ........ MA-E-AS1-12-PROVAL
Harmonised guidelines for single-laboratory
validation (oeno 8/05) ......................................... MA-E-AS1-13-PROVAL
Recommendations on measurement uncertainty
(oeno 9/05)........................................................ MA-E-AS1-14-PROVAL
COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS - OIV
Acetaldehyde
Acetaldehyde
1. Principle
Acetaldehyde (ethanal) in carbon decolorized wine, reacts with sodium
nitroferricyanide and piperidine and causes a green to violet color change whose
intensity is measured at 570 nm.
2. Apparatus
Spectrophotometer permitting measurement of absorbance at a wavelength of
570 nm with a 1 cm optical cell path.
3. Reagents
3.1 Piperidine solution, (C5H11N) 10% (v/v).
Prepare just before use by mixing 2 mL of piperidine with 18 mL of distilled
water.
3.2 Sodium nitroferricyanide solution, 0.4% (m/v).
In a 250 mL glass volumetric flask, dissolve 1 g of pulverized sodium
nitroferricyanide, Na2 [Fe(CN)5 NO].2H2O in distilled water and make up to
volume.
3.3 Activated carbon
3.4 Dilute hydrochloric acid, 25% (v/v)
3.5 Alkaline solution
Dissolve 8.75 g of boric acid in 400 mL sodium hydroxide solution, 1 M.
Make up to 1 L with distilled water.
4. Procedure
4.1 Sample
Place approx. 25 mL of wine in a 100 mL Erlenmeyer flask, add 2 g of
activated charcoal. Shake vigorously for a few seconds, allow to stand for 2
minutes and filter through a fluted slow filter to obtain a clear filtrate.
Place 2 mL of the clear filtrate into a 100 mL Erlenmeyer flask, add, while
shaking, 5 mL of the sodium nitroferricyanide solution (3.2) and 5 mL of the
piperidine solution (3.1). Mix and place the mixture immediately into a 1 cm
optical cell. The coloration produced, which varies from green to violet, is
measured with reference to air at a wavelength of 570 nm. This color change
increases then decreases rapidly; measure immediately and record the
maximum value of the absorbance that is obtained after about 50 seconds.
The concentration of acetaldehyde in the liquid analyzed is obtained using a
calibration curve.
MA-E-AS315-01-ETHANA 1
Acetaldehyde
Note: If the liquid analyzed contains excess free acetaldehyde, it will be necessary,
before beginning the total acetaldehyde determination, to first combine it with sulfur
dioxide. To achieve this, add a small amount of excess free SO2 to a portion of the
liquid to be analyzed and wait for an hour before proceeding.
4.2. Preparation of the calibration curve
4.2.1 Solution of acetaldehyde combined with sulfur dioxide
Prepare a solution of between 5 to 6% (m/v) sulfur dioxide and determine the
exact strength by titrating with 0.05 M iodine solution.
In a 1 L glass volumetric flask, add a volume of this solution which
corresponds to 1500 mg of sulfur dioxide. Introduce into the flask, using a
funnel, about 1 mL of acetaldehyde distillate recently distilled and collected in
a cooling mixture. Make up to 1 liter with distilled water. Mix and allow to
stand overnight.
The exact concentration of this solution is determined as follows:
Place in a 500 mL Erlenmeyer flask, 50 mL of the solution; add 20 mL of
dilute hydrochloric acid (3.4) and 100 mL water. Titrate the free sulfur
dioxide using a solution of 0.05 M iodine with starch as indicator, stopping at
a faint blue end point. Add 100 mL of the alkaline solution, and the blue
coloration will disappear. Titrate the combined sulfur dioxide and
acetaldehyde with 0.05 M iodine until a faint blue end point is reached: let n
be the volume used.
The acetaldehyde solution combined with SO2 contains 44.05 n mg of
acetaldehyde per liter.
4.2.2 Preparation of the calibration standards
In five 100 mL glass volumetric flasks, place respectively 5, 10, 15, 20 and
25 mL of the stock solution. Make up to volume with distilled water. These
solutions correspond to acetaldehyde concentrations of 40, 60, 120, 160 and
200 mg/L. The exact concentration of the dilutions must be calculated from
the acetaldehyde concentration of the stock solution (4.2.1) previously
determined.
Proceed with the determination of acetaldehyde on 2 mL of each of these
dilutions as indicated in 4.1. The graph of the absorbance of these solutions
as a function of acetaldehyde content is a straight line that does not pass
through the origin.
BIBLIOGRAPHY
REBELEIN H., Dtsch. Lebensmit. Rdsch., 1970, 66, 5-6.
MA-E-AS315-01-ETHANA 2
Ethyl Acetate
Ethyl Acetate
1. Principle of the methods

Reference method: Ethyl acetate is determined by gas chromatography on wine
distillate using an internal standard.
Usual method: Ethyl acetate is separated by distillation of wine brought to
pH 6.5. After saponification and suitable concentration in an alkaline
environment, the distillate is acidified and the vapor condensed to separate the
acetic acid liberated by saponification; the acid portion is titrated with the alkaline
solution.
2. Reference method
2.1 Apparatus (see chapter Volatile Acidity).
2.2 Procedure
Prepare an internal standard solution of 4-methyl-2-pentanol, 1 g/L, in
ethanol solution, 10% (v/v).
Prepare the sample solution to be determined by adding 5 mL of this internal
standard solution to 50 mL of wine distillate obtained as indicated in the
chapter on Alcoholic Strength.
Prepare a reference solution of ethyl acetate, 50 mg/L, in ethanol, 10% (v/v).
Add 5 mL of the internal standard to 50 mL of this solution.
Analyze 2 L of the sample solution and the reference solution using gas
chromatography.
Oven temperature is 90C and the carrier gas flow rate is 25 mL per minute.
2.3 Calculation
S = the peak area of ethyl acetate in the reference solution.
Sx = the peak area of the ethyl acetate in the sample solution.
I = the peak area of the internal standard in the sample solution.
I = the peak area of the internal standard in the reference solution.
The concentration of ethyl acetate, expressed in milligrams per liter, is given
by:
S
50 x I x
i S
MA-E-AS315-02-ACEETH 1
Ethyl Acetate
3. Usual Method
3.1 Reagents
3.1.1 Sodium hydroxide solution, 1 M
3.1.2 pH 6.5 Buffer solution
Potassium di-hydrogen phosphate, KH2PO4 .................... 5g
Sodium hydroxide solution 1 M ...................... 50 mL
Water to ........................................... 1L
3.1.3 Crystalline tartaric acid
3.1.4 Sodium hydroxide solution, 0.02 M
3.1.5 Neutral phenolphthalein solution, 1%, in alcohol, 96% (v/v).
3.2 Usual method
Into a 500 mL volumetric flask, place 100 mL of non-decarbonated wine
neutralized with n mL of 1 M sodium hydroxide solution, n being the volume
of sodium hydroxide solution, 0.1 M, used for measuring the total acidity of
10 mL of wine. Add 50 mL of pH 6.5 buffer solution and distill. The
distillation must be conducted using a tapered tube into a 500 mL round-
bottom flask containing 5 mL of 1 M sodium hydroxide solution, on which a
mark has been made indicating a volume of approximately 35 mL. Collect 30
mL of distillate.
Stopper the flask and allow to stand for one hour. Concentrate the contents of
the flask to approximately 10 mL by placing it in a boiling water bath and
blowing a rapid stream of air into the bowl of the flask. Allow to cool. Add
3 g tartaric acid (3.1.3). Eliminate carbon dioxide by shaking under a
vacuum. Transfer the liquid from the concentrating flask to the bubbling
chamber of a steam distillation apparatus and rinse the flask twice with 5 mL
of water. Steam distill and recover at least 250 mL of distillate.
Titrate with a 0.02 M sodium hydroxide solution, in the presence of
phenolphthalein.
3.3 Calculation
Let n be the number of milliliters of sodium hydroxide solution, 0.02 M
(3.1.4) used. 1 mL corresponds to 1.76 mg ethyl acetate.
The concentration of ethyl acetate in milligrams per liter is given by:
17.6 x n
BIBLIOGRAPHY
Usual method:
PEYNAUD E., Analyse et contrle des vins, Librairie Polytechnique Ch.-
Branger, 1958.
MA-E-AS315-02-ACEETH 2
COMPENDIUM OF INTERNATIOAL METHODS OF ANALYSIS - OIV
Malvidin diglucoside
REFERENCE METHOD
1. Principle
Malvidin diglucoside, oxidized by nitric acid, is converted to a substance that, in
an ammonium medium, emits a vivid green fluorescence in ultraviolet light.
The intensity of the fluorescence of the compound formed is measured by
comparison with the fluorescence of a solution titrated with quinine sulfate whose
intensity of fluorescence is standardized with the malvidin diglucoside reference.
Free sulfur dioxide, which attenuates the fluorescence, must previously be
combined with excess acetaldehyde.
2. Qualitative Examination
2.1 Apparatus
2.1.1 Ultraviolet lamp permitting measurement at 365 nm.
2.2 Reagents
2.2.1 Acetaldehyde solution
Crystallizable paraldehyde ..................................... 10 g
Ethanol 96% (v/v) ............................................ 100 mL
2.2.2 Hydrochloric acid, 1.0 M.
2.2.3 Sodium nitrate solution, 10 g/L.
2.2.4 Ethanol, 96% (v/v), containing 5% concentrated ammonia solution
(20 = 0.92 g/mL).
2.2.5 Control wine containing 15 mg of malvidin diglucoside per liter.
2.2.6 Wine containing no malvidin diglucoside.
2.3 Method
Into a test tube add:
- 10 mL of wine
- 1.5 mL of acetaldehyde solution
wait 20 minutes.
Into a 20 mL centrifuge tube place:
- 1 mL of wine reacted with acetaldehyde
- 1 drop of hydrochloric acid
- 1 mL sodium nitrate solution
Stir; wait 2 minutes (5 minutes maximum); add:
- 10 mL ammoniacal ethanol
Treat similarly 10 mL of wine containing 15 mg/L malvidin diglucoside (The
control wine). Stir. Wait 10 minutes and centrifuge.
MA-E-AS315-03-DIGMAL 1
Decant the clear liquids from the top into calibrated test tubes. Observe the
difference in green fluorescence between the test wine and the control wine
under ultraviolet light at 365 nm.
For rose wines, it is possible to increase the sensitivity using:
- 5 mL of wine treated with acetaldehyde (2.3)
- 0.2 mL hydrochloric acid, 1 M (2.2.2)
- 1 mL sodium nitrate solution, 10 g/L (2.2.3)
- 5.8 mL ammoniacal ethanol (2.2.4)
Treat the control wine in a similar manner.
2.4 Interpretation
Wines that do not fluoresce, or have a distinctly lower fluorescence, than the
control, may be considered to have no malvidin diglucoside. Those whose
fluorescence is slightly less than, equal to, or greater than the control should
have a quantitative determination.
3. Quantitative Determination
3.1. Apparatus
3.1.1. Equipment for measuring fluorescence:
- excitation wavelength 365 nm;
- wavelength of fluorescent radiation 490 nm.
3.1.2. Optical quartz cell (1 cm path length)
3.2 Reagents
3.2.1. See qualitative examination
3.2.2. 2 mg/L quinine sulfate solution
Prepare a solution containing 10 mg very pure quinine sulfate in 100 mL
sulfuric acid, 0.1 M. Dilute 20 mL of this solution to 1 liter with sulfuric
acid solution, 0.1 M.
3.3 Procedure
Treat the wine by the method described in Qualitative examination (2), except
that the aliquot of acetaldehyde treated wine is each case (red wines and
roses) 1 mL.
Place the 2 mg/L solution of quinine sulfate in the cell, adjust the fluorometer
to the full range (transmission T, equal to 100%) by adjusting the slit width or
the sensitivity.
Replace this tube with the one containing the test wine: this is the T1 value.
If the percentage of transmission, T1 is greater than 35, dilute the wine with
wine without malvidin diglucoside whose fluorescence must be less than 6%
(this should be ascertained by previous testing.)
Remarks:
1. Salicylic acid (sodium salicylate) added to the wine for stabilization before
analysis, causes a spurious fluorescence which can be eliminated by an
extraction with ether.
2. Spurious fluorescence is caused by the addition of caramel.
3.4 Calculation
A fluorescence intensity of 1, for wine without SO2, for the operating
conditions above with the exception of the acetaldehyde treatment,
corresponds to 0.426 mg malvidin diglucoside per liter of wine.
On the other hand, red and rose wines, containing no malvidin diglucoside,
give fluorescence corresponding to a T value of the order of 6%.
The amount of malvidin diglucoside in wine in milligrams per liter is
therefore:
11,5
(T1 6) 0,426 x = (T1 6) x 0,49
10
If the wine is diluted, multiply the result by the dilution factor.
3.5 Expression of the Results
The amount of malvidin diglucoside is expressed in milligrams per liter of
wine to the nearest whole number.
BIBLIOGRAPHY
DORIER P., VERELLE L., Ann. Fals. Exp. Chim., 1966, 59, 1.
GAROGLIO P.G., Rivista Vitic. Enol., 1968, 21, 11.
BIEBER H., Deutsche Lebensm. Rdsch., 1967, 44-46.
CLERMONT Mlle S., SUDRAUD P., F.V., O.I.V., 1976 n 586.
Ethyl carbamate
Ethyl Carbamate
(Resolution oeno 8/98)
Ethyl carbamate analysis in alcoholic beverages: selective detection method by
gas chromatography/mass spectrometry
(Applicable to the determination of ethyl carbamate concentrations between 10

and 200 g/l).
(Caution: respect safety measures when handling chemical products, ethanol,
acetone and carcinogenic products: ethyl carbamate and dichloromethane. Get rid
of used solvants in a suitable way, compatible with applicable environmental rules
and regulations).
1. Principle
Propyl carbamate is added to a sample as an internal standard, the solution is
diluted with water and placed in a 50 mL solid phase extraction column. Ethyl
carbamate and propyl carbamate are eluted with dichloromethane. The eluate is
concentrated in a rotary evaporator under vacuum. The concentrate is analyzed by
gas chromatography/mass spectrometry using selected ion monitoring mode.
2. Apparatus
2.1 Gas chromatograph/mass spectrometer (GC/MS). With selected ion
monitoring (SIM), and data handling system. An autosampler is desirable.
2.2 Capillary fused silica column: 30m* 0.25 mm int., 0.25 m of
Carbowax 20M type.
2.3 Operating conditions: injector 180C, helium carrier gas at 1 mL/min at
25C, splitless injection. Temperature program: 40C for 0.75 min, then
program 10C/min to 60C, then 3C**/min to 150C, post run: go up to
220C and maintain for 4.25 min at 220C. The retention time for ethyl
carbamate is 23-27 min., that of propyl carbamate is 27-31 min.
GC/MS interface: transfer line 220C. Mass spectrometer parameters set up
manually with perfluorotributylamine and optimized for a lower mass
sensitivity, SIM acquisition mode, solvent delay and time for the start of
acquisition 22 min., dwell time/ion 100 ms.
* For certain wines which are particularly rich, it may be desirable to use a 50m long
capillary column.
** For certain wines which are particularly rich, it may be desirable to carry out a
temperature program of 2C per minute.
MA-E-AS315-04-CARETH 1
Ethyl carbamate
2.4 Rotary evaporator under vacuum or concentration system similar to Kuderna

Danish. (Note: the recovery of the ethyl carbamate test sample, (3.7) must be
between 90-110% during the process).
2.5 Flask - pear-shaped, 300 mL, single neck, 24/40 standard taper joint.
2.6 Concentrator tube - 4 mL, graduated, with a standard taper 19/22 Teflon
coated joint and stopper.
3. Reagents
3.1 Acetone - HPLC quality. Note: Check each batch by GC/MS before use with
regard to the absence of response for m/z 62, 74 and 89 ions.
3.2 Dichloromethane - Note: Analyze each batch before use by GC/MS after 200
fold concentration to check the absence of response for m/z 62, 74 and 89
ions.
3.3 Ethanol - anhydrous
3.4 Ethyl carbamate (EC) standard solutions
- (1) Stock solution - 1.00 mg/mL. Weigh 100 mg EC ( 99% purity) in a
volumetric flask of 100 mL and dilute to mark with acetone.
- (2) Standard working solution- 10.0 g/mL. Transfer 1 mL of the EC stock
solution to a 100 mL volumetric flask and dilute with acetone to the mark.
3.5 n-Propyl carbamate (PC), standard solutions.
- (1) Stock solution - 1.00 mg/mL. Weigh 100 mg PC (reagent quality) in a
100 mL volumetric flask and dilute with acetone to the mark.
- (2) Standard working solution- 10.0 g/mL. Transfer 1 mL of the PC stock
solution to a volumetric flask of 100 mL and dilute with acetone to the
mark.
- (3) Internal standard solution PC - 400 ng/mL. Transfer 4 mL of the
standard PC working solution to a volumetric flask of 100 mL and dilute
with water to the mark.
3.6 EC - nPC standard calibration solutions - Dilute the standard working
solutions of EC, 3.4 (2), and PC 3.5 (2), with dichloromethane in order to
obtain:
(1) 100 ng EC and 400 ng nPC/mL,
(5) 1600 ng EC and 400 ng nPC/mL.
Ethyl carbamate
3.7 Practice sample - 100 ng EC/mL in 40 % ethanol. Transfer 1 mL of the

standard EC working solution, 3.4 (2) in a 100 mL volumetric flask and
dilute with 40 % of ethanol to the mark.
3.8 Solid phase extraction column - Disposable material, pre-packed with
diatomaceous earth, capacity 50 mL.
(Note: Before analysis, check each batch of extraction columns for the
recovery of EC and nPC and the absence of response for ions of m/z 62,74
and 89.) Prepare 100 ng EC/mL of test sample 3.7.
Analyze 5.00 mL of the test sample as described in 4.1, 4.2, 5, and 6. The
recovery of 90-110 ng of EC/mL is satisfactory. Adsorbents whose particle
diameter is irregular can lead to a slow flow that affects the recovery of EC
and nPC.
If, after several trials, 90-110 % of the test sample value is not obtained,
change the column or use a corrected calibration recovery curve to quantify
EC.
To obtain the corrected calibration curve, prepare standard solutions as
described in 3.6 by using 40 % ethanol instead of dichloromethane.
Analyze 1 mL of the standard calibration solution as described in 4, 5, and 6.
Establish a new standardization curve by using the EC/nPC ratio of the
extracted standards.
4. Preparation of the test sample
Place the test material in 2 separate 100 mL beakers using the following
quantities:
4.1 Wines containing over 14 % vol. alcohol: 5.00 mL 0.01 mL.
4.2 Wines containing maximum 14% vol. of alcohol: 20.00 mL 0.01 mL.
In each beaker, add 1 mL of internal standard PC solution, 3.5 (3) and
water, in order to obtain a total volume of 40 mL (or 40 g).
5. Extraction
(Note: Carry out the extraction under a fume hood with adequate ventilation.)
Transfer diluted test portion from 4 to the extraction column.
Rinse the beaker with 10 mL of water and transfer the rinsing water to the
column. Let the liquid be absorbed in the column for 4 minutes. Elute with 2
80 mL of dichloromethane.
Collect the eluate in a 300 mL pear-shaped flask.
Evaporate the eluate to 2 to 3 mL in a rotary evaporator in a water bath at 30C
(Note: do not let extract evaporate to dryness).
Transfer the concentrated residue to a 4 mL graduated concentrator tube, with a 9
in Pasteur pipette.
Ethyl carbamate
Rinse the flask with 1 mL of dichloromethane and transfer the rinsing liquid to
the tube.
Concentrate the sample to 1 mL under a slight nitrogen stream.
If an autosampler is used, transfer the concentrate to a vial for GC/MS analysis.
6. GC/MS Analysis
6.1 Calibration curve - Inject 1l of each calibration standard solution 3.6, into
GC/MS. Plot the graph of the EC-nPC area ratio for the response to m/z 62
ion on the y-axis and the quantity of EC in ng/mL on the x-axis (i.e., 100,
200, 400, 800, 1600 ng/mL).
6.2 EC quantification - Inject 1l of concentrated extract from 5 in the GC/MS
system and calculate the EC-nPC area ratio for m/z 62 ion. Determine the
concentration of EC (ng/mL) in the extract by using the internal standard
standardization curve. Calculate the EC concentration in the test sample
(ng/mL) by dividing the quantity of EC (ng/mL) in the extract by the test
sample volume 3.7.
6.3 Confirmation of EC identity. Determine if the response for m/z 62, 74 and
89 ions appear at the EC retention time. These responses characteristic
respectively of the main fragments (M - C2H3 )+ and (M - CH3 )+ and
molecular ion (M). The presence of EC is confirmed if the relative ratio of
these ions does not exceed 20% of the ratios of the EC standard. The extract
may need to be further concentrated in order to obtain a sufficient response
for the m/z 89 ion.
7. Method performance.
Sample Added EC, Mean EC Recovery sr SR RSDr % RSDR%

ng/g found, of added
ng/g EC, %
Wine over 14 0 40 1.59 4.77 4.01 12.02
% alcohol 45 80 89 3.32 7.00 4.14 8.74
(v/v) 135 162 90 8.20 11.11 5.05 6.84
Wine under 0 11 0.43 2.03 3.94 18.47
14% alcohol 15 25 93 1.67 2.67 6.73 10.73
( / )
Hydroxymethylfurfural
Hydroxymethylfurfural (HMF)

1.1 Colorimetric method
Aldehydes derived from furan, the main one being hydroxymethylfurfural,
react with barbituric acid and para-toluidine to give a red compound which is
determined by colorimetry at 550 nm.
Free sulfurous acid interferes with the determination. When its amount
exceeds 10 mg/L, it must be previously eliminated by combining it with
acetaldehyde whose excess does not interfere with the determination.
1.2 High-performance liquid chromatography (HPLC)
Separation through a column by reversed-phase chromatography and
determination at 280 nm.
Procedures described below are given as examples.
2. Colorimetric method
2.1 Apparatus
2.1.1 Spectrophotometer for making measurements between 300 and 700 nm.
2.1.2 Glass cells with optical paths of 1 cm.
2.2 Reagents
2.2.1 Barbituric acid solution, 0.5% (m/v)
Dissolve 500 mg of barbituric acid in distilled water by heating slightly over a
water bath at 100C. Make up to 100 mL with distilled water. This solution
keeps for about a week.
2.2.2 Para-toluidine solution, 10% (m/v).
Place 10 g of para-toluidine in a 100 mL volumetric flask; add 50 mL of iso-
propanol, CH3CH(OH)CH3, and 10 mL of glacial acetic acid, CH3COOH
(20 = 1.05 g/mL). Make up to 100 mL with iso-propanol. This solution
should be renewed daily.
2.2.3 Acetaldehyde (ethanal) solution, 1% (m/v).
Prepare just before use.
2.2.4 Hydroxymethylfurfural solution, 1 g/L.
Prepare dilutions of the above solution to containing 5, 10, 20, 30 and 40 mg
hydroxymethylfurfural/L. The 1 g/L solution and its dilutions must be
freshly prepared.
MA-E-AS315-05-HYDMFF 1
2.3 Procedure
2.3.1 Preparation of sample
- Free sulfur dioxide less than 10 mg/L:
Perform the analysis on 2 mL of wine or must. If necessary filter the wine
or must before analysis.
- Free sulfur dioxide greater than 10 mg/L:
15 mL of the test samples are placed in a 25 mL spherical flask with 2 mL
acetaldehyde solution (2.2.3). Stir. Wait 15 minutes. Bring to volume
with distilled water. Filter if necessary. Perform the analysis on 2 mL of
this solution.
2.3.2 Colorimetric determination
Into each of two 25 mL flasks, a and b, fitted with ground glass stoppers,
place 2 mL of the sample prepared as in 2.3.1. Place in each flask 5 mL of
para-toluidine solution (2.2.2); mix. Add 1 mL of distilled water to flask b
(control) and 1 mL barbituric acid (2.2.1) solution to flask a, shake to mix.
Transfer the contents of the flasks into spectrophotometer cells with optical
paths of 1 cm. Zero the absorbance scale at a wavelength of 550 nm using
the contents of flask b. Follow the variation in the absorbance of the contents
of flask a; record the maximum value A, which is reached after 2 to 5
minutes.
Samples with hydroxymethylfurfural concentrations above 30 mg/L must be
diluted before the analysis.
2.3.3 Preparation of the calibration curve
Place 2 mL of each of the hydroxymethylfurfural solutions of 5, 10, 20, 30
and 40 mg/L into two sets of 25 mL flasks, a and b, and treat them as
described in 2.3.2.
The graph representing the variation of absorbance with the
hydroxymethylfurfural concentration in mg/L should be a straight line passing
through the origin.
2.4 Expression of results
The hydroxymethylfurfural concentration is obtained by plotting on the
calibration curve the absorbance determined on the sample analyzed, taking
into account any dilution carried out.
The result is expressed in milligrams per liter (mg/L) to one decimal point.
3. High-performance liquid chromatography

3.1 Apparatus
3.1.1 High-performance liquid chromatograph equipped with:
- a loop injector, 5 or 10 L
- spectrophotometric detector allowing measurement at 280 nm
- column of octadecyl-bonded silica (e.g.Bondapak C18-Corasil, Waters Ass)
- a recorder, preferably an integrator
- Flow rate of mobile phase: 1.5 mL/minute
3.1.2 Membrane filtration system with a pore diameter of 0.45 m.
3.2 Reagents
3.2.1 Double distilled water
3.2.2 Methanol, distilled or HPLC quality
3.2.3 Acetic acid (20= 1.05 g/mL)
3.2.4 Mobile phase: water + methanol + acetic acid previously filtered
through a 0.45 m membrane filter, (40 mL + 9 mL + 1 mL)
The mobile phase must be prepared daily and degassed before using.
3.2.5 Hydroxymethylfurfural reference solution, 25 mg/L (m/v)
Into a 100 mL volumetric flask, place 25 mg of hydroxymethylfurfural
accurately weighed, and bring to volume with methanol. Dilute this solution
1/10 with methanol and filter through a 0.45 m membrane filter.
If the solution is kept refrigerated in a hermetically sealed brown glass bottle
it should keep for two to three months.
3.3 Procedure
Inject 5 (or 10) L of the sample prepared as described above and 5 (or 10)
L of hydroxymethylfurfural reference solution into the chromatograph.
Record the chromatogram.
The retention time of hydroxymethylfurfural is about six to seven minutes.
3.4 Expression of the Results
The hydroxymethylfurfural concentration is expressed in milligrams per liter
(mg/L) to one decimal point.
Cyanide derivatives
Cyanide Derivatives
1. Principle
Free and total hydrocyanic acid is liberated by acid hydrolysis and separated by
distillation. After reaction with chloramine T and pyridine, the glutaconic
dialdehyde formed is determined by colorimetry, due to the blue coloration it
gives with 1.3-dimethyl barbituric acid.
2. Equipment
2.1. Distillation apparatus: Use the distillation apparatus described for the
determination of alcohol in wine.
2.2. Round-bottomed 500 mL flask with standard taper joint.
2.3. Water bath, thermostated at 20 C.
2.4. Spectrophotometer permitting the measurement of absorbance at a
wavelength of 590 nm.
2.5. Glass cuvette or disposable cuvettes for one use only, with 20 mm optical
path.
3. Reagents
3.1. Phosphoric acid (H3PO4) at 25 p. 100 (w/v)
3.2. Solution of chloramine T (C7H7 ClNNaO2S.3H2O) 3% (w/v)
3.3. Solution of 1,3-dimethylbarbituric acid: dissolve 3.658 g of 1,3-
dimethylbarbituric acid (C6H8N2O3) in 15 mL of pyridine and 3 mL of
hydrochloric acid (20 = 1.19 g/mL) and bring to 50 mL with distilled
water.
3.4. Potassium cyanide (KCN)
3.5. Solution of potassium iodide (KI) 10% (w/v)
3.6. Solution of silver nitrate (AgNO3), 0.1 M
4. Procedure
4.1 Distillation:
In the 500 mL round-bottomed flask (2.2), place 25 mL of wine, 50 mL of
distilled water, 1 mL of phosphoric acid (3.1) and some glass beads.
Immediately place the round-bottomed flask on the distillation apparatus.
Collect the distillate through a delivery tube connected to a 50 mL volumetric
flask containing 10 ml of water. The volumetric flask is immersed in an iced
water bath. Collect 30-35 mL of distillate (a total of about 45 mL of liquid in
the volumetric flask). Wash the delivery tube with a few milliliters of
distilled water, bring the distillate to 20C and dilute with distilled water to
the mark.
MA-E-AS315-06-DERCYA 1
Cyanide derivatives
4.2 Measurement:
Place 25 mL of distillate in a 50 mL glass-stoppered Erlenmeyer flask, add
1 mL of chloramine T solution (3.2) and stopper tightly. After exactly
60 seconds, add 3mL of 1,3-dimethylbarbituric acid solution (3.3), stopper
tightly and let stand for 10 minutes. Then measure the absorbance relative to
the reference blank (25 mL of distilled water instead of 25 mL of distillate) at
a wavelength of 590 nm in cuvettes of 20 mm optical path.
5. Establishing the standard curve
5.1 Argentimetric titration of potassium cyanide.
In a 300 mL volumetric flask, dissolve about 0.2 g of KCN (3.4) precisely
weighed in 100 mL of distilled water. Add 0.2 mL of potassium iodide
solution (3.5) and titrate with the solution of 0.1 M silver nitrate (3.6) until
obtaining a stable yellowish color.
In calculating the concentration of KCN in the sample, 1 mL of 0.1 M silver
nitrate solution corresponds to 13.2 mg of KCN.
5.2 Standard Curve.
5.2.1. Preparation of the standard solutions:
Knowing the KCN concentration determined in accordance with 5.1, prepare
a standard solution containing 30 mg/L of hydrocyanic acid (30 mg HCN =
72.3 mg of KCN). Dilute this solution to 1/10.
Introduce 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, and 5.0 mL of the diluted standard solution in
100 mL volumetric flasks and bring to the mark with distilled water. The
prepared standard solutions correspond to 30, 60, 90, and 150 g/L of
hydrocyanic acid, respectively.
5.2.2. Determination:
Using 25 mL of the solutions, continue as indicated above in 4.1 and 4.2.
The values obtained for the absorbance with these standard solutions, reported
according to the corresponding levels of hydrocyanic acid, form a line passing
through the origin.
6. Expression of the results
Hydrocyanic acid is expressed in micrograms per liter (g/L) without decimal.
6.1. Calculation:
Determine the concentration of hydrocyanic acid from the standard curve. If a
dilution was done, multiply the result by the dilution factor.
Cyanide derivatives
Repeatability (r) and Reproducibility (R)

White wine: r = 3.1 g/L i.e. approximately 6% . Xi
R = 12 g/L i.e. approximately 25% . Xi
Red wine: r = 6.4 g/L i.e. approximately 8% . Xi
R = 23 g/L i.e. approximately 29% . Xi
Xi = average concentration of HCN in the wine.
BIBLIOGRAPHY
1) JUNGE C., Feuillet vert N 877 (1990)

2) ASMUS E. GARSCHLAGEN H., Z Anal. Chem. 138, 413-422 (1953)
3) WRDIG G., MLLER TH., Die Weinwissenschaft 43, 29-37 (1988)
Artificial sweeteners
Examination of artificial sweeteners

1.1 Reference method
Examination of saccharine (benzoic sulfimide), Dulcin (p-ethoxyphenylurea),
cyclamate (cyclohexylsulfamate) and P-4000 (5-nitro-2-propoxyaniline or
1propoxy-2-amino-4-nitrobenzene).
After concentration of the wine, the saccharine, Dulcin and P-4000 are
extracted in an acid medium with benzene; the cyclamate is extracted from
the wine after the benzene extraction using ethyl acetate (the order of
extraction is important). The residues after solvent evaporation are submitted
to thin layer chromatography.
Saccharine and cyclamate are identified by chromatography on cellulose
plates (solvent: acetone-ethyl acetate-ammonium hydroxide), the first the
benzene extract, the second in the extract by the ethyl acetate after
purification by washing with ether.
These sweeteners are developed by spraying with a solution of benzidine;
aniline; cupric acetate, and have the following Rf: 0.29 for cyclamate, 0.46
for saccharine.
The P-4000 and Dulcin from the benzene extract are separated by
chromatography on polyamide plates, (solvent: toluene; methanol; glacial
acetic acid). These sweeteners are developed by spraying a solution of p-
dimethylaminobenzaldehyde, and have the following Rf: 0.60 for Dulcin,
0.80 for P-4000.
1.2 Usual method
Examination of saccharine, Dulcin and cyclamate.
These sweeteners are extracted from wine using a liquid ion exchanger, then
re-extracted with dilute ammonia hydroxide, and are separated by thin layer
chromatography using a mixture of cellulose powder and polyamide powder
(solvent: xylene; n-propanol; glacial acetic acid; formic acid). These
sweeteners have a blue fluorescence on a yellow background under ultraviolet
light after spraying with a 2,7-dichlorofluorescein solution.
Subsequent spraying with 1,4-dimethylaminobenzaldehyde solution allows
differentiation of Dulcin, which gives only one orange spot, from vanillin and
the esters of phydroxybenzoic acid which migrate with the same Rf.
MA-E-AS315-07-EDUSYN 1
2. Reference method
Examination of saccharine, cyclamate, Dulcin and the P-4000.
2.1 Apparatus
2.1.1 Chromatography tank
2.1.2 Micrometry syringes or micropipettes
2.1.3 Separator tube 15 mm in diameter and 180 mm long, with a stopcock
2.1.4 Water bath at 100C
2.1.5 Regulatable oven, able to reach 125C
2.2 Reagents
2.2.1 Extraction solvent:
- Benzene
- Ethyl acetate
2.2.2 Chromatography solvents:
Mixture No.1:
Acetone ....................................................... 60 parts
Ethyl acetate .................................................... 30 parts
Ammonium hydroxide (20= 0.92 g/mL) .............. 10 parts
Mixture No 2.:
Toluene .......................................................... 90 parts
Methanol ........................................................ 10 parts
Glacial acetic acid (20= 1.05 g/mL) ..................... 10 parts
2.2.3. Chromatography plates (20 x 20 cm):
- with layer of cellulose powder (for ex., Whatman CC 41 or Macherey-
Nagel MN300)
- with layer of polyamide powder (for ex., Merck)
2.2.4 Indicating reagent for saccharine and cyclamate
Prepare:
- alcoholic solution of benzidine at 250 mg in 100 mL ethanol
- saturated solution of cupric acetate, Cu(C2H3O2)2.H2O
- freshly distilled aniline
Mix: 15 mL of benzidine solution, 1 mL of aniline and 0.75 mL saturated
cupric acetate solution.
This solution must be freshly prepared. It corresponds to the volume required
for development of a 20 x 20 cm plate.
2.2.5 Hydrochloric acid 50% (v/v),
2.2.6 Nitric acid solution, 25% (v/v),

2.2.7 Indicator reagent for the P-4000 and Dulcin: dissolve 1 g of 1,4-
paradimethylaminobenzaldehyde in 50 mL methanol; add 10 mL 25% nitric
acid; bring to 100 mL with methanol. Use 15 mL of this reagent for the
development of a 20 x 20 cm plate.
2.2.8 Cyclo-hexylsulfamic acid in water-ethanol solution, 0.10 g/100 mL
Dissolve 100 mg of the sodium or calcium salt of cyclo-hexylsulfamic acid in
100 mL of an equal part mixture of water and ethanol.
2.2.9 Saccharine aqueous solution, 0.05 g/100 mL
2.2.10 Dulcin, 0.05 g/100 mL of methanol.
2.2.11 P-4000, 0.05 g/100 mL of methanol.
2.3 Procedure
2.3.1 Extraction
100 mL of wine, placed in a beaker, are rapidly evaporated by boiling until
the volume is reduced to 30 mL, while directing a current of cold air to the
surface of the flask. Allow to cool. Acidify with 3 mL 50% hydrochloric
acid (v/v). Transfer to a 500 mL conical flask with a ground stopper, add 40
mL of benzene and stir with a mechanical stirrer for 30 min. Transfer to a
separating funnel to separate the organic phase. If an emulsion is formed, it
must be separated by centrifugation. Place the organic phase in a conical
flask with a ground glass stopper.
Decant the wine previously extracted with benzene, which corresponds to the
lower layer in the separating funnel, into a 500 mL conical flask with a
ground stopper containing 40 mL of ethyl acetate. Agitate for 30 minutes and
separate the organic phase as before taking care to recover only the organic
fraction and not the wine.
On a 100C water bath, evaporate each extraction solvent in 50-60 mm
diameter evaporation dishes, in small amounts while directing a stream of
cold air on the surface of the dishes. Continue the evaporation until the
residue has a syrupy consistency, stopping before the evaporation is complete.
Re-dissolve the benzene extract residue in the evaporation dish with 0.5 mL
ethanol-water (1:1) solution (it is advisable to re-dissolve the residue once
with 0.25 mL ethanol-water solution and then to rinse the dish with another
portion of 0.25 mL of the same solution). Place the ethanol-water extract into
a small tube with a ground stopper (extract B).
The residue of the dish in which the ethyl acetate (containing the cyclamate)
has been evaporated, is dissolved with 0.5 mL of water and is poured into a
small separator tube. Wash the dish with 10 mL ether and add the ether to
the contents of the separator tube. Mix vigorously for 2 minutes and separate
the lower layer into a small test tube that contains 0.5 mL ethanol. This
comprises a total of 1 mL of ethanol-water solution that contains the possible
cyclamate (extract A).
2.3.2 Chromatography
2.3.2.1 Saccharine and cyclamate
For examination of the saccharine and cyclamate, use a cellulose plate, with
half of the plate for the identification of cyclamate and the other half for
saccharine.
To do this, spot 5 to 10 L of extract A and 5L of the standard cyclamate
solution. On the second part of the plate spot 5 to 10 L of extract B and 5
L of the standard saccharine solution. Place the prepared plate in the
chromatography bath containing solvent No.1 (acetone; ethyl acetate;
ammonium hydroxide); allow to migrate until the solvent front reaches 10 to
12 cm. Remove the plate from the bath and dry with warm air. Spray the
plate evenly and gently with the benzidine reagent (17-18 mL for each plate).
Dry the plate with cold air. Place the plate in an oven maintained at
120-125C for 3 minutes. The spots appear dark gray on a light chestnut
background; they turn brownish with time.
2.3.2.2 P-4000 and Dulcin
Deposit 5 L of extract B and 5 L of the standard solutions of Dulcin and
P-4000 on a polyamide plate. Place the prepared plate in the chromatography
tank containing solvent No. 2 (toluene; methanol; acetic acid). Let the
solvent front reach a height of 10 to 12 cm.
Remove the plate from the tank; dry in cold air. Spray with 15 mL of the
pdimethylaminobenzaldehyde reagent, then dry with cold air until the
orange-yellow colored spots appear which correspond to Dulcin and P-4000.
2.3.2.3 Sensitivity
The benzidine reagent allows detection of spots corresponding to 2 g of
saccharine and 5 g of cyclamate. The p-dimethylaminobenzaldehyde reagent
reveals 0.3 g of Dulcin and 0.5 g of P-4000.
This method allows determination of (depending upon the efficiency of the
extractions):
Saccharine ...................................................... 2-3 mg/L
Cyclamate ................................................... 40-50 mg/L
DULCIN ..................................................... 1 mg/L
P-4000 ......................................................... 1-1.5 mg/L
3. Usual method
Examination of saccharine, cyclamate and Dulcin.
3.1 Apparatus
3.1.1 Apparatus for expression by thin layer
3.1.2 Glass plate 20 x 20 cm
Preparation of the plates: mix thoroughly 9 g of dry cellulose powder and 6 g
of polyamide powder. Add, while stirring, 60 mL methanol. Spread on the
plates to a thickness of 0.25 mm. Dry for 10 minutes at 70C. The
quantities prepared are sufficient for the preparation of 5 plates.
3.1.3 Water bath with a temperature regulator or a rotary evaporator,
3.1.4 UV lamp for examination of the chromatography plates.
3.2 Reagents
3.2.1 Petroleum ether (40-60)
3.2.2 Ion exchange resin, for example: Amberlite LA-2
3.2.3 Acetic acid diluted to 20% (v/v)
3.2.4 Ion exchange solution: 5 mL of ion exchanger is vigorously agitated
with 95 mL petroleum ether and 20 mL of 20% acetic acid. Use the upper
phase.
3.2.5 Nitric acid in solution, 1 M
3.2.6 Sulfuric acid, 10 % (v/v)
3.2.7 Ammonium hydroxide diluted to 25% (v/v)
3.2.8 Polyamide powder, for example: Macherey-Nagel or Merck
3.2.9 Cellulose powder, for example: Macherey-Nagel MN 300 AC
3.2.10 Solvent for chromatography:
Xylene ................................................................. 45 parts
n-Propanol ......................................................... 6 parts
Glacial acetic acid (20= 1.05 g/mL) ...................... 7 parts
Formic acid 98-100% ....................................... 2 parts
3.2.11 Developers:
- solution of 2,7-dichlorofluorescein, 0.2 % (m/v), in ethanol,
- solution of 1,4-dimethylaminobenzaldehyde: dissolve 1 g of dimethylamino-
benzaldehyde placed in a 100 mL volumetric flask with about 50 mL
ethanol. Add 10 mL of nitric acid, 25% (v/v), and bring to volume with
ethanol.
3.2.12 Standard solution:
- solution of Dulcin, 0.1 % (m/v), in methanol,

- solution of saccharine at 0.1 g per 100 mL in a mixture of equal parts
methanol and water,
- cyclamate solution: solution containing 1 g of the sodium or calcium salt of
cyclohexylsulfamic acid in 100 mL of a mixture of equal parts methanol and
water,
- solution of vanillin at 1 g /100 mL in a mixture of equal parts methanol and
water,
- solution of the ester of p-hydroxybenzoic acid at 1 g /100 mL in methanol.
3.3 Procedure:
50 mL of wine is placed in a separatory funnel, acidified with 10 mL dilute
sulfuric acid (3.2.6) and extracted with two aliquots of the ion exchange
solution using 25 mL each time. The 50 mL of ion exchange solution is
washed three times using 50 mL of distilled water each time, which is
discarded, then three times with 15 mL of dilute ammonium hydroxide
(3.2.7). The ammonia solutions recovered are then carefully evaporated at
50C until dry on a water bath or in a rotary evaporator. The residue is
recovered with 5 mL of acetone and 2 drops 1 M nitric acid solution, filtered,
and again evaporated dry at 70C on a water bath. It is necessary to avoid
heating for too long and above 70C. The residue is recovered with 1 mL of
methanol.
5 to 10 L of this solution and 2 L of the standard solutions are spotted on
the plate. Let the solvent migrate (xylene: n-propanol: acetic acid: formic
acid) (3.2.10) to a height of about 15 cm, which takes about 1 hour.
After air-drying, the dichlorofluorescein solution is thoroughly sprayed on the
plate. The saccharine and the cyclamate appear immediately as light spots on
a salmon colored background. Under examination in ultraviolet light (254 or
360 nm), the three sweeteners appear as a fluorescent blue on a yellow
background.
The sweeteners separate, from the bottom to the top of the plate, in the
following order: cyclamate, saccharine, Dulcin.
The vanillin and the esters of p-hydroxybenzoic acid migrate with the same
Rf as the Dulcin. To identify Dulcin in the presence of these substances, the
plate then must be sprayed with a solution of dimethylaminobenzaldehyde.
The Dulcin appears as an orange spot, whereas the other substances do not
react.
Sensitivity - The quantity limitation shown on the chromatography plate is 5
g for the three substances.
This method permits detection of:
Saccharin ...................................................... 10 mg/L

Cyclamate ......................................................... 50 mg/L
Dulcin ............................................................. 10 mg/L
BIBLIOGRAPHY
TERCERO C., F.V., O.I.V., 1968, n 277 and F.V., O.I.V., 1970, n 352.
Wine Analysis Commission of the Federal Health Department of Germany, 1969,
F.V., O.I.V., n 316.
International Federation of Fruit Juice Manufacturers, 1972, F.V., O.I.V., n 40.
SALO T., ALRO E. and SALMINEN K., Z. Lebensmittel Unters. u. Forschung,

1964, 125, 20.
Artificial colorants
Examination of artificial colorants

1. Principle
The wine is concentrated to 1/3 its original volume, made alkaline with a solution
of dilute sodium hydroxide and extracted with ether. The ether phase, after being
washed with water, is extracted with a dilute acetic acid solution; this acetic
solution, alkalinized with ammonia, is brought to boiling in the presence of a
piece of wool thread treated with aluminum sulfate and potassium tartrate. The
colorant, if any, is fixed on the wool. The wool on which it is fixed is then
placed in a dilute acetic acid solution. After evaporation of the acetic solution,
the residue is recovered with a water-alcohol solution and analyzed by thin layer
chromatography for characterization of the colorant.
The aqueous phase remaining after the ether extraction contains the acid colorants
that may be present. They are extracted by using their affinity for animal fibers
that markedly absorb the color: they are fixed on a wool plug in a mineral acid
medium.
To concentrate the coloring material, carry out a double fixation and/or several
successive fixations on increasingly smaller wool plugs.
Coloring of the wool plug indicates that an artificial colorant was added to the
wine; the colorant is then identified by thin layer chromatography.
2. Apparatus
2.1 20 x 20 glass plates covered with cellulose powder,
2.2 Chromatography tank
3. Reagents
3.1 Ethyl ether
3.2 Sodium hydroxide solution, 5% (m/v)
3.3 Glacial acetic acid (20= 1.05 g/mL)
3.4 Dilute acetic acid, containing one part glacial acetic acid to 18 parts water
3.5 Dilute hydrochloric acid: to one part hydrochloric acid (20 = 1.19 g/mL),
add 10 parts distilled water
3.6 Ammonium hydroxide (20 = 0.92 g/mL)
3.7 White wool threads, previously washed, degreased with ether and dried
3.8 White wool threads, previously washed, degreased with ether, dried and
acidified
Acidulant: Dissolve 1 g crystallized aluminum sulfate Al2(SO4).18H2O and
1.2 g acid potassium tartrate in 500 mL water. Place 10 g of the white wool
threads, previously washed, degreased with ether and dried in the solution
MA-E-AS315-08-COLSYN 1
and stir about 1 hour. Let stand 2 to 3 hours; drain, let dry at room
temperature.
3.9 Solvent No.1 for chromatography of colorants with basic characteristics:
n-Butanol ....................................................... 50 mL
Ethanol ........................................................... 25 mL
Acetic acid (20 = 1.05 g/mL) ............................... 10 mL
Distilled water .................................................. 25 mL
3.10 Solvent No.2 for chromatography of colorants with acidic characteristics:
n-Butanol ....................................................... 50 mL
Ethanol ........................................................... 25 mL
Ammonium hydroxide (20 = 0.92 g/mL) ................ 10 mL
Distilled water .................................................. 25 mL
4. Procedure
4.1 Examination of colorants with basic characteristics.
4.1.1 Extraction of the coloring materials.
Place 200 mL of wine in a 500 mL glass conical flask and boil until reduced
to 1/3 its volume.
After cooling, neutralize with 5% sodium hydroxide solution until the natural
color of wine shows a marked change.
Extract twice using 30 mL ether. The ether phases are recovered, containing
basic colorants to be determined; the extraction residue must be saved for the
analysis of acidic colorants.
Wash the extracted ether twice with 5 mL of water to eliminate the sodium
hydroxide; mix with 5 mL dilute acetic acid. The acidic aqueous phase
obtained is colored in the presence of a basic colorant.
The presence of the colorant may be confirmed by fixation on acidified wool.
Make the acidic aqueous phase obtained alkaline using 5% ammonia. Add
0.5 g acidified wool and boil for about 1 minute. Rinse the wool under
running water. If the wool is colored, the wine contains some basic colorant.
4.1.2 Characterization by thin-layer chromatography.
The aqueous acetic phase containing the basic colorant is concentrated to 0.5
mL. If the colorant is fixed on the acidic wool, the wool plug is treated by
boiling with 10 mL distilled water and a few drops of acetic acid (20 = 1.05
g/mL). Remove the wool fragment after wringing out liquid. Concentrate
the solution to 0.5 mL.
Deposit 20 L of this concentrated solution on the cellulose plate 3 cm from
the lateral edge and 2 cm from the lower edge of the plate.
Place the plate in the tank containing solvent No.1 so that the lower edge is
immersed in the solvent to a depth of 1 cm.
When the solvent front has migrated to a height of 15 to 20 cm, remove the
plate from the tank. Allow to air dry.
Identify the colorant by means of a solution of known artificial colorants of
basic characteristics deposited simultaneously on the chromatogram.
4.2 Examination of colorants with acidic characteristics
4.2.1 Extraction of the coloring material.
Use the residue from the wine used for examining colorants with basic
characteristics, concentrated to 1/3 and neutralized after extraction with ether.
If the first part of the procedure has not been conducted, start with 200 mL
wine, place in a conical flask, boil until reduced to 1/3.
In either case, add 3 mL of dilute hydrochloric acid and 0.5 g of white wool:
boil for 5 minutes, decant the liquid and wash the wool under running water.
In the conical flask which contains the wool, add 100 mL water and 2 mL
dilute hydrochloric acid; boil for 5 minutes, separate the acidic liquid and
repeat this procedure until the liquid used to wash is colorless.
After the wool has been thoroughly washed to eliminate the acid completely,
recover in a conical flask with 50 mL distilled water and a few drops of
ammonium hydroxide (20 = 0.92 g/mL): bring to a gentle boil for 10
minutes in order to dissolve any artificial coloring matter fixed on the wool.
Remove the wool from the flask, bring the liquid volume to 100 mL and boil
until the ammonia completely evaporates. Acidify with 2 mL of dilute
hydrochloric acid (check that the reaction of the liquid is definitely acidic by
placing 1 drop of this liquid on indicator paper).
Add to the flask 60 mg (about 20 cm of standard thread) of white wool and
boil for 5 minutes; remove the wool and rinse it under running water.
If, after this procedure, the wool is colored red, when it involves red wine, or
yellow if it pertains to white wine, the presence of artificial organic coloring
matter of an acidic nature is proven.
If the color is weak or uncertain, repeat the ammonia treatment and do a
second fixation using a 30 mg wool thread.
If, during the course of the second fixation a weak but distinct pink color is
obtained, assume the presence of an acidic colorant.
If necessary for a more definite determination, carry out new fixations-
elutions (up to 4 or 5) using a procedure identical to that used for the second
fixation until a faint but distinct pink color is obtained.
4.2.2 Characterization by thin layer chromatography.

The plug of colored wool is treated by boiling with 10 mL distilled water and
few drops of ammonium hydroxide (20 = 0.92 g/mL). Recover the piece of
wool after wringing. Concentrate the ammonium hydroxide solution to 0.5
mL.
Deposit 20 L of this solution on a cellulose plate to within 3 cm of the
lateral edge and 2 cm of the lower edge of the plate.
Put the plate in place in the tank so that the lower edge is immersed in the
solvent to a depth of 1 cm.
When the solvent front has migrated to a height of 15 to 20 cm, remove the
plate from the tank and let dry in the air.
Identify the colorant by means of known artificial coloring solutions deposited
simultaneously on the chromatogram.
BIBLIOGRAPHY
TERCERO C., F.V., O.I.V., 1970, n 356.

ARATA P., SAENZ-LASCANO-RUIZ, Mme I., F.V., O.I.V., 1967, n 229.
Diethylene glycol
Diethylene glycol
(2hydoxy-ethoxyethanol)
1. Objective
The detection of diethylene glycol, HOCH2CH2OCH2CH2OH, in wine where its
concentration is equal to or greater than 10 mg/L.
2. Principle
Separation of diethylene glycol from other constituents in wine by gas
chromatography using a capillary column, after extraction with ether.
Note: The operating conditions described below are provided as an example.
3. Apparatus
3.1 Gas chromatograph equipped with:
- split-splitless injector,
- flame ionization detector,
- capillary column coated with a film of polyethyleneglycol (Carbowax
20 M), 50 m x 0.32 mm I.D.
Operating conditions:
Injector temperature: 280C.
Detector temperature: 270C.
Carrier gas: hydrogen.
Flow rate of carrier gas: 2 mL/min.
Flow rate: 30 mL/min.
Injection: splitless.
Injection volume: 2 L.
Injection 35C - flow closed after 40 seconds.
Temperature program: 120C to 170C at 3C/min.
3.2 Centrifuge
4. Reagents
4.1 1,3-propanediol, 1 g/L, in alcohol, 20% (v/v), (internal standard).
4.2 Aqueous solution of diethyleneglycol 20 mg/L.
5. Procedure
Into a 50 mL flask, place:
- 10 mL of wine
- 1 mL of 1,3-propanediol solution
- 25 mL diethyl ether.
MA-E-AS315-09-DIEGLY 1
Diethylene glycol
Shake and add sufficient quantity of neutral potassium carbonate to saturate the
mixture. Shake. Separate the two phases by centrifugation.
Carry out a second extraction. Eliminate the diethyl ether by evaporation and
recover the residue with 5 mL ethanol.
The yield of the extraction must be at least 90%.
Carry out the chromatography according to the conditions given in 3.1.
6. Results
The diethylene glycol is identified by comparing its retention time to the time of
the reference solution, analyzed under the same conditions as the wine.
The amount is determined by comparison to the reference solution using the
internal standard method.
It is recommended, if the concentration is equal to or less than 20 mg/l, to
confirm the presence by mass spectrometry.
BIBLIOGRAPHY
BANDION F., VALENTA M. & KOHLMANN H., Mitt. Klosterneuburg, Rebe

und Wein, 1985, 35, 89.
BERTRAND A., Conn. vigne vins, 1985, 19, 191.
Laboratoire de la rpression des fraudes et du contrle de la qualit de

Montpellier, F.V., O.I.V., 1986, n 807.
MA-E-AS315-09-DIEGLY 2
Ochratoxin A
MEASURING OCHRATOXINE A IN WINE AFTER

GOING THROUGH AN IMMUNOAFFINITY
COLUMN AND HLPC WITH FLUORESCENCE
DETECTION
1. FIELD OF APPLICATION
This document describes the method used for determining ochratoxine A
(OTA) in red, ros, and white wines, including special wines, in
concentrations ranging up 10 g/l using an immunoaffinity column and
high performance liquid chromatography (HPLC) [1].
This method was validated following an international joint study in which
OTAs were measured in white and red wines during the analysis of
naturally contaminated wines and wines with toxins ranging from 0.01
g/l to 3.00 g/l.
This method can apply to semi-sparkling wines and sparkling wines as
long as the samples have been degassed beforehand, through
sonication, for example.
2. PRINCIPLE
Wine samples are diluted with a solution containing polyethylene glycol
and sodium hydrogen carbonate. This solution is filtered and purified on
the immunoaffinity column.
OTA is eluted with methanol and quantified by HPLC in inverse state
with fluorimetric detection.
3. REAGENTS
Unless otherwise indicated, use only those reagents known for the
quality of analysis, distilled water, or water with the EN ISO 3696.
Solvents must be HPLC quality.
3.1 Sodium chloride (NaCl)
3.2 Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)
3.3 Polyethylene glycol (PEG 8000)
3.4 Methanol (CH3OH)
3.5 Acetonitrile (CH3CN)
MA-E-AS315-10-OCHRAT 1
Ochratoxin A
3.6 Purified water for laboratories, for example EN ISO 3696 quality
(water for
analytical laboratory use - Specification and test method [ISO
3696:1987]).
3.7 Acetic acid 85% (CH3COOH)
3.8 Dilution solution (1% PEG + 5% NaHCO3)
Dissolve 10 g of PEG (3.3) and 50 g of NaHCO3 (3.2) in 950 ml of water
and fill up with water to the 1 litre mark.
3.9 Washing solution (2,5% de NaCl + 0,5 % NaHCO3)
Dissolve 25 g of NaCl (3.1) and 5 g of NaHCO3 (3.2) in 950 ml of water
and fill up with water to the 1 litre mark.
3.10 Mobile HPLC phase ( water: acetonitrile: glacial acetic acid,
99:99:2, v/v/v)
Mix 990 ml of water with 990 ml of acetonitrile (3.5) and 20 ml of glacial
acetic acid (3.7). Filter through a 0,45 m filter and degas, with helium
for example.
3.11 Toluene
3.12 Mixture of solvents (Toluene: a glacial acetic acid, 99:1, v/v).
Mix 99 parts in volume of toluene (3.11) with one part volume of glacial
acetic acid (3.7).
3.13 OTA stock solution
Dissolve 1 mg of OTA or the same content in a bulb, if the OTA was
obtained in the form of film after evaporation, in the solvent mixture
(3.12) to obtain a solution containing approximately 20 to 30 g/ml of
OTA.
To determine the exact concentration, record the absorption spectrum
between 300 and 370 nm in a quartz space with 1 cm of optical path
while using the solvent mixture (3.12) as a blank. Identify maximum
absorption and calculate the concentration of OTA (c) in g/ml by using
the following equation:
c = Amax M 100 /
In which:
Amax = Absorption determined by the longest maximum wave (about
333 nm)
M = OTA molecular mass = 403,8 g/mole
= coefficient d'extinction molaire de l'OTA dans le mlange de solvant
(3.12) ( = 544/mole)
= optical pathway (cm)
Ochratoxin A
This solution is stable at -18C for at least 4 years.

3.14 Standard OTA solution (2 g/ml in toluene: acetic acid, 99:1, v/v)
Dilute the stock solution (3.13) with the solvent mixture (3.12) to obtain
a standard solution of OTA with a concentration of 2 g/ml.
This solution can be stored at + 4 C in a refrigerator. The stability
should be tested regularly.
4. EQUIPMENT
Usual laboratory equipment and in particular, the following equipment:
4.1 Glass tubes (4 ml)

4.2 Vacuum pump to prepare the immunoaffinity columns.
4.3 Reservoir and flow tube adapted to immunoaffinity columns.
4.4 Fibre glass filters (for example Whatman GF/A).
4.5 Immunoaffinity columns specifically for OTA.
The column should have the total link capacity of at least 100 ng OTA.
This will allow for a purification yield of at least 85% when a diluted
solution of wine containing 100 ng OTA is passed through.
4.6 Rotating evaporator
4.7 Liquid chromatography, a pump capable of attaining a constant flow
of 1 ml/mn isocratic, as with the mobile phase.
4.8 Injection system must be equipped with 100 l loop.
4.9 Column of analytical HPLC in steel 150 4.6 mm (i.d.) filled with a
stationary phase C18 (5 m) preceded with a pre-column or a pre-filter
(0,5 m) containing an appropriate phase. Different size columns can be
used provided that they guarantee a good base line and background
noise enabling the detection of of OTA peaks, among others.
4.10 Fluorescence detector is connected to the column and the
excitation wavelength is set at 333 nm and the emitting wavelength at
460 nm.
4.11 Information retrieval system
4.12 U.V. spectrometer
5. PROCEDURE
5.1 Preparation of samples
Pour 10 ml of wine in a 100 ml conical flask. Add 10 ml of the dilution
solution (3.8). Mix vigorously. Filter through fibreglass filter (4.4).
Ochratoxin A
Filtration is necessary for cloudy solutions or when there is precipitation

after dissolving.
5.2 Purification by immunoaffinity column
Set up the by immunoaffinity column (4.5) to the vacuum pump (4.2),
and attach the reservoir (4.3).
Add 10 ml (equivalent to 5 ml of wine) of the diluted solution in the
reservoir. Put this solution through the immunoaffinity column at a flow
of 1 drop per second. The immunoaffinity column should not become
dry. Wash the immunoaffinity column with 5 ml of cleaning solution
(3.9) and then with 5 ml of water at a flow of 1 to 2 drops per second.
Blow air through to dry column. Elute OTA in a glass flask (4.1) with 2
ml of methanol (3.4) at the rate of 1 drop per second. Evaporate the
eluate to dryness at 50 C with nitrogen. Dissolve again immediately in
250 l of the HPLC mobile phase (3.10) and keep at 4 C until the HPLC
analysis.
5.3 HPLC analysis
Using the injection loop, inject 100 l of reconstituted extract
(equivalent to 2 ml of wine) in the chromatography.
Operating conditions
Flow: 1 ml /min.
Mobile phase: acetonitrile: water: glacial acetic acid
(99:99:2, v/v/v)
Fluorescence detector: Excitation wavelength = 333 nm
Emitting wavelength = 460 nm
Volume of injection: 100 l
6. QUANTIFICATION OF OCHRATOXINE A (OTA)

The quantification of OTA should be calculated by measuring the area or
the height of the peaks at the OTA retention time and compared to the
calibration curve
6.1 Calibration curve

Prepare a calibration curve dayly and every time chromatographical
conditions change. Measure out 0.5 ml of the standard OTA solution
(3.14) at 2 g/ml in a glass flask and evaporate the solvent using
nitrogen.
Dissolve again in 10 ml in the HPLC mobile phase (3.10) which was
previously filtered using a 0.45 m filter. This produces an OTA of 100
ng/ml solution.
Ochratoxin A
Prepare 5 HPLC calibration solutions in five 5 ml graduated flasks

following Table 1.
Complete each 5 ml standard solution with HPLC mobile phase. (3.10).
Inject 100 l of each solution in the HPLC.
Table 1
Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 5
l of mobile phase filtered HPLC (3.10) 4970 4900 4700 4000 2000
l of OTA solution at 100 ng/ml: 30 100 300 1000 3000

OTA concentration (ng/ml) 0.6 2.0 6.0 20 60
Injected OTA (ng) 0.06 0.20 0.60 2.00 6.00
NOTE:
1. If the quantity of OTA in the samples is outside the calibration range,
an appropriate dilution should occur or smaller volumes should be
injected. In these cases, the final (7) should be reviewed on a case by
case basis.
2. Due to the great variations in concentrations, it is recommended to
pass the linear calibration by zero in order to obtain an exact
quantification for low concentrations of OTA. (less than 0.1 g/l)
7. CALCULATIONS
Calculate the quantity of OTA in the aliquot of the solution testes and
injected in the HPLC column.
Calculate the concentration of OTA (COTA) in ng/ml (equivalent to g/l)
by using the following formula:
COTA = MA 2/V1 V3/V2
Where:
MA is the volume of ochratoxin A (in ng) in the aliquot part of the
template injected on the column and evaluated from the calibration
curve.
2 is the dilution factor
V1 is the sample volume to be analysed (10 ml)
V2 the volume of the solution tested and injected in the column (100 l)
V3 is the volume of solution used to dissolve the dry eluate (250 l)
Ochratoxin A
8. PERFORMANCES USING THIS METHOD IN LABORATORIES

Table 2 regroups performances of the method applied to white, ros and
red wines in laboratories participating in the validation of this method.
Table 2. Recovery of ochratoxin A from wines overweighted with different

concentrations of added ochratoxin A
Red wine Ros wine White wine
Addition Yield SD* RSD# Yield SD* RSD# Yield SD* RSD#
(g/l) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
0.04 96.7 2.2 2.3 94.1 6.1 6.5 91.6 8.9 9.7
0.1 90.8 2.6 2.9 89.9 1.0 1.1 88.4 0.2 0.2
0.2 91.3 0.6 0.7 88.9 2.1 2.4 95.1 2.4 2.5
0.5 92.3 0.4 0.5 91.6 0.4 0.4 93.0 0.2 0.2
1.0 97.8 2.6 2.6 100.6 .,5 2.5 100.7 1.0 1.0
2.0 96.5 1.6 1.7 98.6 1.8 1.8 98.0 1.5 1.5
5.0 88.1 1.3 1.5 - - - -
10,0 88,9 0,6 0,7 - - - -
Average of
92.8 3.5 3.8 94.5 5.2 5.5 94.5 4.1 4.3
averages
* SD = Spread type (Standard deviation) (n = 3 replicates) ;

#
RSD = Relative spread type (Variation percentage).
9. GROUP WORK
The method was validated by a group study with the participation of 16
laboratories in 8 countries, following the protocol recommendations
harmonised for validating the analysis methods. [2]. Each participant
analysed 10 white wines, 10 red wines, representing 5 random duplicate
wines; naturally contaminated or with OTA added. The performances of
the method which resulted from this work are found in appendixes I and
II.
Ochratoxin A
10. PARTICPATING LABORATORIES
Unione Italiana Vini, Verona ITALY

Istituto Sperimentale per lEnologia, Asti ITALY
Istituto Tecnico Agraria, S. Michele allAdige (TN) ITALY
Universit Cattolica, Piacenza ITALY
Institute for Health and Consumer Protection, JRC ITALY
Ispra ITALY
Neotron s.r.l., S. Maria di Mugnano (MO) ITALY
Chemical Control s.r.l., Madonna dellOlmo (CN) FRANCE
Laboratoire Toxicologie Hygine Applique, Universit FRANCE
V. Segalen, Bordeaux
SWEDEN
Laboratoire de la D.G.C.C.R.F. de Bordeaux, Talence
SWEDEN
National Food Administration, Uppsala
GERMANY
Systembolagets Laboratorium, Haninge
CYPRUS
Chemisches Untersuchungsamt, Trier
FINLAND
State General Laboratory, Nicosia
UNITED
Finnish Customs Laboratory, Espoo KINGDOM
Central Science Laboratory, York UNITED STATES
E.T.S. Laboratories, St. Helena, CA
11. REFERENCES
[1] A. Visconti, M. Pascale, G. Centonze. Determination of ochratoxin

A in wine by means of immunoaffinity column clean-up and high-
performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 864
(1999) 89-101.
[2] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, p. 23-
51.
Ochratoxin A
APPENDIX I
The following data was obtained in inter-laboratory tests, according to

harmonised protocol recommendations for joint studies in view of
validating an analysis method.
WHITE WINE Added OTA (g/l)

Sample White 0.100 1.100 2.000 n.c.
Inter-laboratory test year 1999 1999 1999 1999 1999
Number of laboratories 16 16 16 16 16
Number of laboratories
retained after eliminating 14* 13* 14 14 15
absurd findings
Number of eliminated
- 1 2 2 1
laboratories
Number of accepted results 28 26 28 28 30
Average value (g/l) <0,01 0,102 1,000 1,768 0,283
Spread-type/Repeatabilityr
- 0.01 0.07 0.15 0.03
(g/l)
Relative spread-type
(Variation percentage) - 10.0 6.6 8.5 10.6
/Repeatability RSDr (%)
Repeatability limit r (g/l) - 0.028 0.196 0.420 0.084
Spread-type/capacity of being
- 0.01 0.14 0.23 0.04
reproduced sR (g/l)
(variation percentage)
- 14.0 13.6 13.3 14.9
/capacity of being reproduced
RSDR (%)
Capacity of being reproduced
- 0.028 0.392 0.644 0.112
limit R (g/l)
Extraction yield % - 101.7 90.9 88.4 -
* 2 laboratories were excluded from the statistical 'evaluation due to
high detection limit (= 0,2 g/l).
n.c. = sample naturally contaminated
Ochratoxin A
APPENDIX II
The following data was obtained in inter-laboratory tests, according to

harmonised protocol recommendations for joint studies in view of
validating an analysis method.
RED WINE Added OTA (g/l)

samples White 0.200 0.900 3.000 n.c.
Inter-laboratory test year 1999 1999 1999 1999 1999
Number of laboratories 15 15 15 15 15
Number of laboratories
retained after eliminating 14* 12* 14 15 14
absurd findings
Number of eliminated
- 2 1 - 1
laboratories
Number of accepted results 28 24 28 30 28
1.69
Average value (g/l) <0.01 0.187 0.814 2.537
3
Spread-type/Repeatabilityr
- 0.01 0.08 0.23 0.19
(g/l)
(Variation percentage) - 5.5 9.9 8.9 10.9
/Repeatability RSDr (%)
0.53
Repeatability limit r (g/l - 0.028 0.224 0.644
2
Spread-type/capacity of
- 0.02 0.10 0.34 0.23
being reproduced sR (g/l )
(variation percentage)
- 9.9 12.5 13.4 13.4
/capacity of being
reproduced RSDR (%)
Capacity of being reproduced 0.64
- 0.056 0.280 0.952
limit R (g/l) 4
Extraction yield % - 93.4 90.4 84.6 -
* 1 laboratory was excluded from the statistical evaluation because of
high detection limits (= 0,2 g/l).
n.c. = naturally contaminated sample
Anthocyanins
HPLC-DETERMINATION OF NINE MAJOR

ANTHOCYANINS IN RED AND ROS WINE
(Type II Method)
(Resolution 22/2003)
The analytical method concerns the determination of the relative

composition of anthocyanins in red and ros wine. The separation is
performed by HPLC with reverse phase column and UV-VIS detection.
Many authors [3, 6-17] have published data on the anthocyanin

composition of red wines using similar analytical methods. For
instance Wulf et al. [18] have detected and identified 21
anthocyanins and Heier et al. [13] nearly 40 by liquid
chromatography combined with mass spectrometry. The anthocyanin
composition may be very complex, so it is necessary to have a simple
procedure. Consequently this method only determines the major
compounds of the whole anthocyanin fraction.
Member states are encouraged to continue research in this area to

avoid any non scientific evaluation of the results.
2. PRINCIPLE
Separation of the five most important non acylated anthocyanins (see

Figure 1, peaks 1-5) and four major acylated anthocyanins (see
Figure 1, peaks 6-9).
Analysis of red and ros wine by direct separation by HPLC by using
reverse phase column with gradient elution by water/formic
acid/acetonitrile with detection at 518 nm [1.2].
3 REAGENTS AND MATERIAL
Formic acid (p.a. 98 %) (CAS 64-18-6);

Water, HPLC grade;
Acetonitrile, HPLC grade (CAS 75-08-8);
HPLC solvents:
Solvent A: Water/Formic acid/Acetonitrile 87 : 10 : 3 (v/v/v)
Solvent B: Water/Formic acid/Acetonitrile 40 : 10 : 50 (v/v/v)
MA-E-AS315-11-ANCYAN 1
Anthocyanins
Membrane filter for HPLC solvent degassing and for sample

preparation to be analysed.
Reference products for peak identification.

The HPLC analysis of anthocyanins in wine is difficult to perform due
to the absence of commercially available pure products. Furthermore,
anthocyanins are extremely unstable in solution.
The following anthocyanin pigments are commercially available:
Cyanidol-3-glucoside (also couromanin chloride); M = 484.84 g/mol
Peonidol-3-glucoside; M = 498.84 g/mol
Malvidol-3-glucoside (also Oeninchloride); M = 528.84 g/mol
Malvidol-3,5-diglucoside (also Malvinchloride); M = 691.04 g/mol
4. APPARATUS
HPLC system with:

binary gradient pump, injection system for sample volumes ranging
from 10 to 200 l,
diode array detector or a UV detector with a visible range,
integrator or a computer with data acquisition software,
furnace for column heating at 40C,
solvent degassing system,
analytical column, for example:
LiChrospher 100 RP 18 (5 m) in LiChroCart 250-4 guard column: for

example RP 18 (30-40 mm) in a cartridge 2 mm in diameter x 20 mm
long
5. PROCEDURE
5.1 Preparation of samples
Clear wines are poured directly without any preparation into the
sample vials of the automatic sample changer. Cloudy samples are
filtered using a 0.45 m membrane filter for HPLC sample
preparation. The first part of the filtrate should be rejected.
Since the range of the linearity of absorption depending on the
concentration of anthocyanins is large, it is possible to modulate the
injection volumes between 10 and 200 l depending on the intensity
of the wine colour. No significant difference between the results
obtained for different injection volumes was observed.
Anthocyanins
5.2 Analysis
HPLC conditions
The HPLC analysis is carried out in the following conditions:
Injection Volume: 50 l (red wine) up to 200 l (ros wine)

Flow: 0.8 ml/minute
Temperature: 40C
Run time: 45 minutes
Post time: 5 minutes
Detection: 518 nm
Gradient elution: Time Solvent A Solvent B

(min) % (v/v) % (v/v)
0 94 6
15 70 30
30 50 50
35 40 60
41 94 6
To check the column efficiency, the number of theoretical plates (N)

calculated according to malvidol-3-glucoside should not be below
20,000, and the resolution (R) between peonidol-3-coumaryl
glucoside and malvidolin-3-coumaryl glucoside should not be lower
than 1.5. Below these values, the use of a new column is
recommended.
Anthocyanins
A typical chromatogram is given in Figure 1, where the following

anthocyanins are separated:
Peak-N
Group 1: delphinidol-3-glucoside 1
Nonacylated cyanidol-3-glucoside 2
anthocyanidin-3- petunidol-3-glucoside 3
glucosides: peonidol-3-glucoside 4
malvidol-3-glucoside 5
Group 2: Acetylated peonidol-3-acetylglucoside 6

anthocyanidin-3- malvidol-3-acetylglucoside 7
glucosides:
Group 3: peonidol-3- 8
Coumarylated coumarylglucoside 9
anthocyanidin-3- malvidol-3-
glucosides: coumarylglucoside
6. EXPRESSION OF RESULTS
Note that the values are expressed as relative amounts of the sum of
the nine anthocyanins defined in this method.
7. FIDELITY PARAMETERS
The repeatability (r) and the reproducibility (R) values for the nine
anthocyanins are given in Table 2 and depend on the amount of the
peak area. The uncertainty measurement of a particular peak area is
determined by the value of r and R which corresponds to the nearest
value given in Table 2.
The values made up of validation data can be calculated by following

the appropriate statistical rules. To calculate the total error (sr) for
example of the sum of acetylated anthocyanins, the variances (sr2)
of specific the total error of ratios, for example, that of acetylated to
coumarylated anthocyanins the square of relative errors (=sr/ai) are
to be added. By using these rules, all the fidelity values can be
calculated by using the data in Table 2.
Anthocyanins
Annex A
Bibliography
[1] Marx, R., B. Holbach, H. Otteneder; Determination of nine

characteristic Anthocyanins in Wine by HPLC; OIV, F.V.N 1104
2713/100200
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Rotweinanthocyane mittels
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(HPLC).Methodenvergleich und Vorstellung einer neuen
Methode. Mitt. Klosterneuburg (1990) 40: 68-75
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O.I.V. F.V.N 1130 (2001)
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Food Res. Technol. 2002, 215, 32-37
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Vera, M.; Abril, K.; Casp, A. Eur. Food Res. Technol. 2002,
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Ryan, J-M. Value of high-performance liquid chromatographic
analysis of anthocyanins in the differentiation of red grape
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hybrid grapes. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 4096-4102
[17] Otteneder, H.; Holbach, B.; Marx, R.; Zimmer, M.

Rebsortenbestimmung in Rotwein mittels Anthocyanspektrum.
Mitt. Klosterneuburg, 2002, 52, 187-194
[18] L.W. Wulf and C.W. Nagel; High-Pressure liquid

chromatographic separation of Anthocyanins of Vitis vinifera.
Am.J.Enol.Vitic 1978, 29, 42-49
Anthocyanins
Annex B
Statistical results
Method performance study and evaluation
17 laboratories from 5 European Nations participated in the validation

study of the method under the coordination of the German Official
State Laboratory for Food Chemistry in Trier. The participants are
listed in Table 3. An example of a chromatogram is presented in Figure
1 and the detailed results are given in Table 2.
The statistical evaluation followed the Resolution 6/99 and the
Standard ISO 5725-1944 [4.5].
The chromatograms sent back with the results sheets fulfilled all
requirements concerning the performance of the analytical column. No
laboratory had to be completely eliminated, for example, because of a
wrong peak identification.
The outlier values were searched using Dixon and Grubbs outlier
testing according to the procedure for Harmonised Protocol IUPAC
1994 and the OIV Resolution OENO 19/2002. The values of sr, sR, r
and R were calculated for 9 major anthocyanins at 5 content levels. For
analytical results, the values of the closest levels should be used.
In order to have a global vision of the method performance, all the

values RSDr- et RSDR- gathered are grouped by range of areas in the
following table:
Table 1: Summary of the results of the method performance study
Range of relative peak Range of RSDr Range of RSDR

areas*[%] [%] [%]
>0.4 1.0 6.8 - 22.4 20.6 - 50.9
>1.1 1.5 4.2 - 18.1 11.8 - 28.1
>1.5 3.5 2.1 7.7 10.6 - 15.6
>3.5 5.5 2.7 5.7 18.7 7.5
>5.5 7.5 2.4 3.9 6.5 - 10.0
>10 14 1.1 2.9 3.7 - 9.2
>14 17 1.0 - 3.9 3.2 - 5.4
>50 76 0.3 - 1.0 2.1 - 3.1
Anthocyanins
* independent of anthocyanin
This leads to the conclusion that repeatabilities and reproducibilities

depend on the total sum of the relative peak areas. The higher they
are, the better are RSDr and RSDR. For anthocyanin contents close to
the detection limit (e.g. Cyanidin-3-glucoside) with small relatives
areas (less than 1%) the RSDr et RSDR values can rise significantly.
For anthocyanin whose relative areas are more than 1%, the RSDr and
RSDR values are reasonable.
Figure 1: Separation of 9 anthocyanins in red wine
ANTHO13 #25 [modified by 4-98 UV_VIS_ WVL:518

55 gyn] 4039 1 nm
0 mA
Mv-3-
U
gl
50
0
45
0
40
0
35
0
30
0
25
De-3-
0
Pt-3-
gl
gl
20
0
15
Po-3-
0
gl
acgl Mv-3-
cuglMv-3-
acgl
cugl
10
Po-3-
Po-3-
0
Cy-3-
gl
5
0
0
mi
n
-
50 0, 2, 5, 7, 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 42, 45,
0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0
Anthocyanins
Table 2: Results of the method performance study
Anthocyanin sample 1 sample 2 sample 3 sample 4 sample 5

Delphinidol-3-glucoside
n 14 14 16 15 16
mean 6.75 14.14 3.45 16.68 3.54
sr 0.163 0.145 0.142 0.142 0.108
RSDr(%) 2.4 1.0 4.1 0.8 3.1
r 0.46 0.41 0.40 0.40 0.30
sR 0.544 0.462 0.526 0.704 0.490
RSDR(%) 8.1 3.3 15.2 4.2 13.8
R 1.52 1.29 1.47 1.97 1.37
Cyanidol-3-glucoside
n 16 17 16 15 14
mean 2.18 1.23 0.61 1.46 0.34
sr 0.086 0.053 0.043 0.110 0.031
RSDr(%) 4.0 4.3 7.1 7.5 9.2
r 0.24 0.15 0.12 0.31 0.09
sR 0.460 0.211 0.213 0.180 0.158
RSDR(%) 21.2 17.2 34.9 12.3 46.7
R 1.29 0.59 0.60 0.50 0.44
Petunidol-3-glucoside
n 15 17 16 14 15
mean 10.24 14.29 5.75 12.21 6.19
sr 0.233 0.596 0.157 0.097 0.196
RSDr(%) 2.3 4.2 2.7 0.8 3.2
r 0.65 1.67 0.44 0.27 0.55
sR 0.431 0.996 0.495 0.469 0.404
RSDR(%) 4.2 7.0 8.6 3.8 6.5
R 1.21 2.79 1.39 1.31 1.13
Peonidol-3-glucoside
n 16 15 17 17 16
mean 11.88 6.23 13.75 7.44 4.12
sr 0.241 0.166 0.144 0.232 0.174
RSDr(%) 2.0 2.7 1.0 3.1 4.2
r 0.68 0.47 0.40 0.65 0.49
sR 0.981 0.560 1.227 0.602 0.532
RSDR(%) 8.3 9.0 8.9 8.1 12.9
R 2.75 1.57 3.44 1.69 1.49
Malvidol-3-glucoside
n 16 15 17 16 16
mean 55.90 55.04 76.11 52.60 61.04
sr 0.545 0.272 0.251 0.298 0.377
RSDr(%) 1.0 0.5 0.3 0.6 0.6
r 1.53 0.76 0.70 0.83 1.06
sR 2.026 2.649 2.291 1.606 1.986
RSDR(%) 3.6 4.8 3.0 3.1 3.3
R 5.67 7.42 6.41 4.50 5.56
n = N of laboratories retained after eliminating outliers
sr = standard deviation of repeatability
RSDr(%) = relative standard deviation of repeatability
r = repeatability
sR = standard deviation of reproducibility
RSDR(%) = relative standard deviation of reproducibility
R = reproducibility
Anthocyanins
Table 2: Results of the method performance study
Anthocyanin sample 1 sample 2 sample 3 sample 4 sample 5

Peonidol-3-
acetylglucoside
n 14 16 14 16
mean 1.16 1.44 0.59 3.74
sr 0.064 0.062 0.059 0.215
RSDr(%) 5.5 4.3 10.1 5.8
0.18 0.17 0.17 0.60
sR 0.511 0.392 0.272 0.374
RSDR(%) 43.9 27.2 46.4 10.0
R 1.43 1.10 0.76 1.05
Malvidol-3-
acetylglucoside
n 16 17 17 16
mean 5.51 4.84 3.11 15.07
sr 0.176 0.167 0.088 0.213
RSDr(%) 3.2 3.4 2.8 1.4
r 0.49 0.47 0.25 0.60
sR 0.395 0.366 0.496 0.617
RSDR(%) 7.2 7.6 16.0 4.1
R 1.11 1.02 1.39 1.73
Peonidol-3-
coumarylglucoside
n 16 14 17 16
mean 1.26 0.90 0.89 1.32
sr 0.130 0.046 0.060 0.058
RSDr(%) 10.3 5.1 6.8 4.4
r 0.36 0.13 0.17 0.16
sR 0.309 0.109 0.204 0.156
RSDR(%) 24.5 12.2 23.0 11.8
R 0.86 0.31 0.57 0.44
Malvidol-3-
coumarylglucoside
n 17 17 17 16
mean 4.62 2.66 4.54 4.45
sr 0.159 0.055 0.124 0.048
RSDr(%) 3.4 2.1 2.7 1.1
r 0.45 0.15 0.35 0.13
sR 0.865 0.392 0.574 0.364
RSDR(%) 18.7 14.7 12.6 8.2
R 2.42 1.10 1.61 1.02
n = N of laboratories retained after eliminating outliers
sr = standard deviation of repeatability
RSDr(%) = relative standard deviation of repeatability
r = repeatability
sR = standard deviation of reproducibility
RSDR(%) = relative standard deviation of reproducibility
R = reproducibility
Anthocyanins
Table 3: List of participants
ABC Labor Dahmen, Mlheim/Mosel

D
Chemisches Landes- und Staatliches D
Veterinruntersuchungsamt Mnster
Institut fr Lebensmittelchemie Koblenz D
Institut fr Lebensmittelchemie Speyer D
Institut fr Lebensmittelchemie Trier D
Institut fr Lebensmittelchemie und Arzneimittel D
Mainz
Labor Dr. Haase-Aschoff, Bad Kreuznach D
Labor Dr. Klaus Millies, Hofheim-Wildsachsen D
Labor Heidger, Kesten D
Landesveterinr- und Lebensmitteluntersuchungsamt D
Halle
Staatliche Lehr- und Forschungsanstalt fr D
Landwirtschaft, Weinbau und Gartenbau,
Neustadt/Weinstrae
Staatliches Institut fr Gesundheit und Umwelt, D
Saarbrcken
Staatliches Medizinal-, Lebensmittel- und D
Veterinruntersuchungsamt, Wiesbaden
Laboratoire Interrgional de la D.G.C.C.R.F de
Bordeaux, Talence/France F
Unidad de Nutricion y Bromotologia, Facultad de

Farmacia, Universidad de Salamanca, E
Salamanca/Espana
University of Glasgow, Div. of Biochem. and Molek.
Biology UK
Hhere Bundeslehranstalt und Bundesamt fr Wein-

und Obstbau, Klosterneuburg A
17 Laboratories D (13); A (1); F (1); E (1); UK (1)
COMPENDIUM OF INTERNATIONAL ANALYSIS OF METHODS - OIV
Plant proteins
DETERMINATION OF PLANT PROTEINS IN WINES AND MUSTS

(Oeno 24/2004)
The technique developed below enables to determine the quantity of

proteins possibly remaining in beverages treated with proteins of plant
origin after racking.
1 PRINCIPLE
Wine and must proteins are precipitated with trichloroacetic acid,

then they are separated by electrophoresis in polyacrylamide gel in the
presence of dodecyl sodium sulphate (DSS). The addition of Coomassie
blue colours the proteins. The intensity of the colouration enables to
determine the protein content using a calibration curve made
beforehand with the known protein concentration solutions. The
antigenic capacity of musts and treated wines is determined by
immunoblotting testing.
2 PROTOCOL
2.1 Concentration of proteins by precipitation with

trichloroacetic acid (TCA)
2.1.1 Reagents
2.1.1.1 Pure trichloroacetic acid (TCA)
2.1.1.2 TCA at 0.1% prepared using 2.1.1.1: 0.1 g in

100 ml of water.
2.1.1.3 TCA at 100% prepared using 2.1.1.1: 100 g in

100 ml of water.
2.1.1.4 Sodium hydroxide 0.5 M
2.1.1.5 Buffer Tris/HCl 0.25 M pH=6.8

30.27 g of Tris-(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) are
dissolved in 300 ml of distilled water. The pH is adjusted to 6.8
with concentrated hydrochloric acid for analysis. The volume is
completed to 1 l with distilled water. The buffer is stored at 4C.
MA-E-AS315-12-PROVEG 1
Plant proteins
2.1.1.6 Pure glycerol
2.1.1.7 Pure dodecyl sodium sulphate (DSS)
2.1.1.8 Pure 2-mercaptoethanol
2.1.1.9 Buffer solution for samples: it is made up of

a buffer Tris/HCl 0.25 M, pH=6.8 (2.1.1.5); 7.5% of pure
glycerol (2.1.1.6); 2% of dodecyl sodium sulphate (DSS)
(2.1.1.7) and 5% of pure 2-mercaptoethanol (2.1.1.8). The
percentages of different reagents correspond to the final
concentration in the buffer solution.
2.1.2 Procedure
3 ml of trichloroacetic acid at 100% (2.1.1.3) and 24 ml of wine or must

(treated or untreated) are successively put in 50 ml centrifuge tubes.
The final concentration in TCA thus obtained is 11%.
After 30 minutes at 4C, the samples are centrifuged at 10,000
rpm for 30 minutes at 4C. The pellets are washed in an aqueous
solution of TCA at 0.1% (2.1.1.2), re-centrifuged and put again in
suspension in 0.24 ml mixture (1:1, v/v) of sodium hydroxide 0.5 M
(2.1.1.4) and buffer solution (2.1.1.9). The samples are heated at
100C in a water bath for 10 minutes.
2.2 Electrophoresis in Polyacrylamide Gel in the presence of DSS
2.2.1 Reagents

181.6 g of Tris-(hydroxymethyl)aminomethane are dissolved in
300 ml of distilled water. The pH is adjusted at 8.8 with concentrated
hydrochloric acid for analysis. The volume is completed to 1 l with
distilled water. The buffer is stored at 4C.
2.2.1.2 Mixture of acrylamide (30%)bis-acrylamide
(0.8%)glycerol (75%)
Slowly add 300 g of acrylamide and 8 g of bis-acrylamide to 600
ml of a glycerol solution at 75%. After dissolution, adjust the volume to
1 l with glycerol at 75%. The mixture is stored in the dark at room
temperature.
2.2.1.3 DSS at 10%
10 g of DSS are dissolved in 100 ml of distilled water.
Store at room temperature.
Plant proteins
2.2.1.4 N,N,N,N-tetramethylenediamine (TEMED)

for electrophoresis
2.2.1.5 Ammonium persulfate at 10%
1 g of ammonium persulfate is dissolved in 10 ml of
distilled water. Store at 4C.
2.2.1.6 Bromophenol blue solution
10 mg of bromophenol blue for electrophoresis are dissolved in
10 ml of distilled water.
2.2.1.7 Solution for the separation gel (15% of
acrylamide)
It is prepared just before use:
- 1.5 ml of Tris/HCl 1.5 M, pH=8.8 (2.2.1.1),
- 1.5 ml of distilled water,
- 3 ml of glycerol acrylamide mixture (2.2.1.2),
- 50 l of DSS 10% (2.2.1.3),
- 10 l of N,N,N,N-tetramethylenediamine (TEMED) for electrophoresis
(2.2.1.4),
- 20 l of ammonium persulfate (2.2.1.5).
- 1 drop of bromophenol blue (2.2.1.6)

60.4 g of Tris-(hydroxymethyl)aminomethane are dissolved in
400 ml of distilled water. The pH is adjusted to 6.8 with concentrated
hydrochloric acid for analysis. The volume is completed to 1 l with
distilled water. The buffer is stored at 4C.
2.2.1.9 Mixture of acrylamide (30%)bis-acrylamide
(0.8%)water
Slowly add 300 g of acrylamide and 8 g of bis-acrylamide to 300
ml of water. After dissolution, adjust the volume to 1 l with distilled
water. The mixture is stored in the dark at room temperature.
2.2.1.10 Concentration gel at 3.5% of acrylamide
It is prepared just before use:
- 0.5 ml of Tris/HCl 0.5 M pH=6.8 (2.2.1.8),
- 1.27 ml of distilled water,
- 0.23 ml of water acrylamide mixture (2.2.1.9),
- 20 l of DSS 10% (2.2.1.3),
- 5 l of N,N,N,N-tetramethylenediamine (TEMED) for electrophoresis
(2.2.1.4),
- 25 l of ammonium persulfate (2.2.1.5),
- 1 drop of bromophenol blue (2.2.1.6).
2.2.1.11 Migration buffer
30.27 g of Tris-(hydroxymethyl)aminomethane, 144 g of glycine
and 10 g of DSS are dissolved in 600 ml of distilled water. The pH
should be 8.8. If necessary, it is adjusted with concentrated hydrochloric
Plant proteins
acid for analysis. The volume is completed to 1 l with distilled water. The
buffer is stored at 4C. At the time of use, the solution is diluted to 1/10
in distilled water.
2.2.1.12 Colouring solution
Are successively mixed:
- 16 ml of ultra-pure Coomassie brilliant blue G-250 at 5% (5 g in 100
ml of distilled water),
- 784 ml from a 1 l solution where 100 g of ammonium sulphate and
13.8 ml of orthophosphoric acid at 85% were dissolved for analysis,
- 200 ml of absolute ethanol.
2.2.1.13 Discolouring solution
Are successively mixed:
- 100 ml of glacial acetic acid 100% for analysis,
- 200 ml of absolute ethanol for analysis.
- 700 ml of distilled water.
2.2.2 Procedure
The separation gel solution (2.2.1.7) is poured between
two glass plates of 7x10cm. The upper surface of the gel is levelled by
the addition of 2 drops of distilled water.
After polymerisation of the separation gel and the elimination of
water, 1 ml of concentration gel (2.2.1.10) is deposited on the
separation gel using a 1 ml pipette. Then the comb is set up whose
imprints will create deposit wells.
The samples necessary for the calibration range are prepared in
a mixture (1:1), v/v, 0.5% M sodium hydroxide (2.1.1.4) and the buffer
solution (2.1.1.9) in order for the calibration range be between 5 g/ml
and 50 g/ml.
20 to 30 l of wine and calibration solution are deposited in the wells.
After migration (at a constant voltage of 90 V) at room
temperature for about 3-4 hours, the gels are removed from the mould.
They are immediately plunged into 50 ml of an aqueous solution of TCA
20% for 30 minutes then in 50 ml of the colouring solution (2.2.1.12).
The proteins appear in the form of blue coloured bands. The gel
is then discoloured with 50 ml of discolouring solution (2.2.1.13). When
the bottom of the gel is transparent, it is placed in distilled water for
storage.
3. QUANTITATIVE ANALYSIS
The intensity of each spot is evaluated by using a scanner for gel

with an image analyser software. The quantity of protein on the gel is
determined by the calculation of the average density of the pixels of the
Plant proteins
band and by integration of the band width. The protein content of each
sample is obtained using a calibration curve. The points of this curve are
obtained by tracing the known concentration values of plant proteins
deposited on the gel depending on the corresponding integration area.
The detection and quantification limit is about 0.030 ppm for peas and
at 0.36 ppm for gluten, in an environment concentrated 100 times. The
coefficient of variation is always below 5%.
4 SEARCH BY IMMUNOBLOTTING OF THE ANTIGENIC

POTENTIAL OF WINES AND MUSTS TREATED
The antigenic capacity of proteins that could remain in the

beverages treated after racking is then evaluated.
4.1 PRINCIPLE
After electrophoresis, the gels are submitted to the immunoblotting
technique. The proteins are transferred to a membrane where they are
adsorbed. An antigenantibody complex is formed by the addition of a
plant anti-protein antibody (for example antigliadin antibodies if the
plant protein is gluten). The method is revealed by the addition of an
antibody directed against the plant anti-protein antibodies coupled with
phosphatase. In the presence of the chromogenic substrate of the
enzyme, a colouration whose intensity will be proportional to the
quantity of immunocomplexes will develop. This immunoreactivity will
be quantified using a calibration curve made with known concentration
plant proteins solutions.
4.2 PROTOCOL
4.2.1 : Reagents
4.2.1.1 Transfer buffer

3.03 g of Tris, 14.4 g of glycine (R), 200 ml of methanol (R) are
mixed and completed to 1 l with distilled water.
4.2.1.2 Gelatine 1%
8.77 g of sodium chloride (R), 18.6 g of
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for analysis, 6.06 g of Tris and
0.5 ml of Triton X are dissolved in 800 ml of distilled water. The pH is
adjusted to 7.5 with concentrated hydrochloric acid for analysis. 10 g of
gelatine are added and the volume is completed to 1 l.
4.2.1.3 Gelatine 0.25%
Plant proteins
8.77 g of sodium chloride (R), 18.6 g of

ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for analysis, 6.06 g of Tris and
0.5 ml of Triton X are dissolved in 800 ml of distilled water. The pH is
adjusted to 7.5 with concentrated hydrochloric acid for analysis. 2.5 g of
gelatine are added and the volume is completed to 1 l.
4.2.1.4 Polyclonal antibody solution
(marketed or described in the annex)
- 10 l of polyclonal plant anti-protein antibodies
- q.s.f. 10 ml with gelatine at 0.25% (4.2.1.3).
4.2.1.5 TBS buffer
29.22 g of sodium chloride for analysis and 2.42 g of tris are dissolved
in 1 l of distilled water.
4.2.1.6 Alkaline phosphatase buffer
5.84 g of sodium chloride (R), 1.02 g of magnesium chloride (R)
and 12.11 g of Tris are dissolved in 800 ml of distilled water. The pH is
adjusted to 9.5 with concentrated hydrochloric acid and the volume is
completed to 1 l.
4.2.1.7 Developer
15 g of bromochloroindol phosphate (BICP) and 30 g of nitro blue
tetrazolium (NBT) are dissolved in 100 ml of alkaline phosphatase buffer
(4.2.1.6).
4.2.2 Procedure
After electrophoresis, the proteins are transferred from
the gel to a membrane of polyvinylidene difluoride by electrophoretic
elution: 16 hours at 4C at 30 V in the transfer buffer (4.2.1.1). The
membranes are saturated with gelatine at 1% (4.2.1.2) and washed 3
times with gelatine at 0.25% (4.2.1.3). The gelatine becomes set on
free sites and inhibits non specific adsorption of immunological reagents.
The membrane is then plunged into 10 ml of the plant anti-protein
polyclonal antibody solution (4.2.1.4). For gluten, the anti-gliadin
antibodies are purchased. The other antibody types are prepared
according to the method provided for in the annex. The IgG-antigen
complex is detected by the addition of 10 l of anti-IgG rabbit antibodies
marked with alkaline phosphatase. The membranes are washed twice
with gelatine 0.25% (4.2.1.3) and once with the TBS buffer (4.2.1.5).
After incubation in the developer (4.2.1.7), a dark purple precipitate is
formed in the spot where the enzyme is attached.
4.3 QUANTITATIVE ANALYSIS

In order to calculate the quantity of residual immunoreactivity of
a marketed wine, a calibration curve is traced out: known
concentrations of plant proteins deposited on the gel (and transferred to
Plant proteins
a membrane) depending on the areas obtained by integration of the

intensity of the spots corresponding to the formation of immune-
complex. The analysis is done with the same equipment as for analysing
electrophoresis gels.
Plant proteins
ANNEX
Production of polyclonal anti-peas
Anti-peas polyclonal antibodies necessary for the determination

of antigenic capacity of pea proteins in wine and musts treated are
being carried out on animals.
1 Principle
Serums containing polyclonal antibodies are obtained from New

Zealand rabbits after an intradermal injection of antigen.
2 Protocol
2.1 Reagents
2.1.1 PBS pH=7.4 phosphate buffer: 8 g of NaCl, 200 mg of

KCl, 1.73 of Na2HPO4 H2O and 200 mg of KH2PO4 are dissolved in 300 ml
of distilled water. pH is adjusted to 7.4 with sodium hydrate 1 M. The
volume is brought to 1 l with distilled water.
2.1.2 Antigens:
10 mg of pea protein is dissolved in 5 ml of PBS
phosphate buffer (2.1.1). The solution is then filtered
under sterile conditions through 0.2 m and stored at
20C until the day of immunization.
2.2 Procedure
1 ml of 2.1.2. solution is mixed with 1 ml of Freund complete

adjuvant. 1 ml of this mixture is injected intradermically to a New
Zealand rabbit weighing approximately 3 kg. This injection is repeated
on day 15, day 30 and day 45.
60 days after the first injection, 100l of blood were withdrawn

from the auricular vein which was then tested for its capacity to react to
antigens. Immunoblotting was used for this evaluation as described in
Chapter 4.2 of the analysis method using a gel with a pea protein which
migrated on the gel.
After checking the formation of an antigen-antibody complex, 15 ml of

blood were withdrawn from the auricular vein. The blood is placed at
37C for 30 minutes. The serum containing the anti-pea polyclonal
antibodies is withdrawn after centrifuging the blood at 3000 rpm for 5
minutes.
Total bromide
Total Bromide
1. Principle
The wine is ashed at 525 oC in presence of an excess of soda lime. A solution of
the residue (at pH 4.65) is treated with chloramine T to liberate bromide. The
bromide is reacted with phenolsulfonephthalein to form phenoltetra-
bromophthalein-3-3-disulfonic acid, which is determined by spectrophotometer
at 590 nm.
2. Apparatus
2.1 Boiling water-bath 100C
2.2 Temperature-controlled electric furnace
2.3 Spectrophotometer capable of measuring absorbance at wavelengths between
300 and 700 nm
3. Reagents
3.1 Sodium hydroxide solution, 50% (m/m)
3.2 Calcium hydroxide suspension containing 120 g of CaO per liter
3.3 Phenolsulfonephthalein solution:
0.24 g of phenolsulfonephthalein (phenol red) are dissolved in 24 mL sodium
hydroxide solution, 0.1 M, and made up to the liter with distilled water.
3.4 pH 4.65 buffer solution:
Acetic acid, 2 M ................................... 500 mL
Sodium hydroxide, 2 M ............................... 250 mL
Distilled water to ...................................... 1L
3.5 Oxidizing solution:
Chloramine T ...................................... 2g
Distilled water to ................................ 1L
Prepare this solution 48 hours before use
Storage: two weeks at 4 oC
3.6 Reducing solution:
Sodium thiosulfate . 25 g/L.
Distilled water to .................................... 1L
3.7 Sulfuric acid, 10%(v/v): sulfuric acid (20 = 1.84 g/mL) diluted 1/10.
3.8 Sulfuric acid, 1%(v/v): sulfuric acid (20 = 1.84 g/mL) diluted 1/100.
3.9 Potassium bromide solution corresponding to 1 g of bromide per liter.
1.489g of potassium bromide, KBr, is dissolved in distilled water and made
up to one liter.
4. Procedure
4.1 How to obtain ash and ash solution
Place 50 mL of wine in a silica dish of 7 cm diameter, add 0.5 mL 50%
sodium hydroxide solution, (3.1), and 1 mL calcium hydroxide suspension
MA-E-AS321-01-BROTOT 1
Total bromide
(3.2). Check that the pH is at least pH 10. Leave the dish covered with a
watch glass for 24 hours. Evaporate the liquid until dry on a boiling water
bath. To accelerate the evaporation, a hot air current can be used in the final
stages.
Ash as follows: place the dish 30 minutes in a furnace (2.2) at 525C . After
cooling, mix the residue with a little distilled water. Evaporate on the boiling
water-bath. Ash again at 525C. Repeat the operation until the ash is
gray/white.
Mix the residue with 5 mL boiling distilled water. Add using a burette: first
10% sulfuric acid (3.7), then sufficient 1% sulfuric acid (3.8) to bring the pH
to between 4 and 5 as measured by indicator paper. Let X mL = the volume
added of sulfuric acid (3.7 & 3.8). Add 10.2-(X+5) mL of distilled water.
Crush the precipitated calcium sulfate with a glass rod. Transfer the content
of the dish to a centrifugation tube. Centrifuge for 10 min. Place 8 to 9 mL
of the clear supernatant into a test tube.
4.2 Qualitative test
This test is performed to determine if the bromide content of the wine is
between 0 and 1 mg/L, which would enable the determination to be
performed on the undiluted ash solution.
Place in a small test tube:
- 1 mL of ash solution
- 1 drop of pH 4.65 buffer solution
- 1 drop of phenolsulfonephthalein solution
- 1 drop of chloramine T solution
After exactly 1 minute, stop the reaction by adding 1 drop of sodium
thiosulfate solution.
If the coloration obtained is yellow, brownish yellow or greenish yellow, the
ash solution can be used undiluted.
If the obtained coloration is blue, purple or violet, the wine contains more
than 1 mg of bromide per liter and the ash solution must be diluted 1/12 or
1/5 until the coloration obtained corresponds to the conditions above.
4.3 Quantitative method
Place in a test tube:
- 5 mL of ash solution, diluted or undiluted, add:
- 0.25 mL of pH 4.65 buffer solution
- 0.25 mL of phenolsulfonephthalein solution
- 0.25 mL T chloramine solution
Wait exactly 1 minute and add:
- 0.25 mL of sodium thiosulfate
Total bromide
Measure using a spectrophotometer set at 590 nm with a 1 cm cell, the

difference in absorbance between the sample and the blank obtained by adding
the same quantities of reagents to 5 mL of distilled water.
Note: When the bromide content is low (yellow coloration, slightly greenish)
determine the absorbance in a cell of 2 cm optical path.
4.4 Preparation of the calibration curve
At the time of use, prepare a solution containing 10 mg of bromine per liter
by making 2 successive dilutions (1/10) of standard potassium bromide
solution, 1 g/L.
In a set of 8 test tubes, place 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 2.00 and
2.50 mL respectively of bromide standard, 1g/L (3.9) and make up to 5 mL
with distilled water. (The solutions are equivalent to 0.10, 0.20, 0.30, 0.40,
0.50, 0.60, 0.80 and 1 mg of bromine per liter of wine without dilution of the
ash solution). Continue as in 4.3 using the calibration solutions instead of the
ash solution. Determine the absorbance of these solutions and a blank, as in
4.3, using 5 mL of distilled water in the blank solution. The absorbance
obtained corresponding to the bromide concentration is plotted on a line that
curves slightly towards the origin.
5. Expression of results
5.1 Calculations
The bromide content in wine is obtained by plotting on the calibration curve,
the net absorbance of the ash solution (taking into account the thickness of the
cell used and any dilution of the ash solution) and interpolating the bromide
concentration. The total bromide content is expressed in milligrams per liter
(mg/L) to two decimal places.
BIBLIOGRAPHY
DAMIENS A., Bull. Sci. Pharmacologiques, 1920, 27, 609; Ibid, 1921, 28, 37,
85 et 105.
BALANTRE P., J. Pharm. Chem., 1936, 24, 409.
PERRONET M., ROCQUES Mme S., Ann. Fals. Fraudes, 1952, 45, 347.
CABANIS J.-C., Le brome dans les vins, Thse doct. Pharm., Montpellier, 1962.
JAULMES P., BRUN Mme S., Cabanis J.-C., Chim anal., 1962, 327.
STELLA C., Riv. Viticolt. Enol., Conegliano, 1967, 5.
Chloride
Chloride
1. Principle
Chloride is determined directly in the wine by potentiometry using an Ag/AgCl
electrode.
2. Apparatus
2.1 pH/mV meter graduated at intervals of at least 2 mV.
2.2 Magnetic stirrer.
2.3 Ag/AgCl electrode with a saturated solution of potassium nitrate as
electrolyte.
2.4 Microburette graduated in 0.01 mL.
2.5 Chronometer.
3. Reagents
3.1 Standard chloride solution: 2.1027 g of potassium chloride, KCl (max.
0.005% Br), dried before use, by leaving in a desiccator for several days, is
dissolved in distilled water and made up to one liter. 1 mL of this solution
contains 1 mg Cl-.
3.2 Silver nitrate solution: 4.7912 g of analytical grade silver nitrate, AgNO3, is
dissolved in ethanol solution, 10% (v/v) and made up to one liter. 1 mL of
this solution corresponds to 1 mg Cl-.
3.3 Nitric acid, not less than 65% (20 = 1.40 g/mL).
4. Procedure
4.1 Place 5.0 mL of standard chloride solution (3.1) into a 150 mL cylindrical
vessel placed on a magnetic stirrer (2.2), dilute with distilled water to
approximately 100 mL and acidify with 1.0 mL of nitric acid (3.3). After
immersing the electrode, add silver nitrate solution (3.2) with the
microburette, with moderate stirring using the following procedure: begin by
adding the first 4 mL in 1 mL fractions and read the corresponding millivolt
values. Add the next 2 mL in fractions of 0.20 mL. Finally, continue the
addition in fractions of 1 mL until a total of 10 mL has been added. After
each addition, wait for approximately 30 sec before reading the
corresponding millivolt value. Plot the values obtained on a graph against
the corresponding milliliters of titrant and determine the potential
corresponding to the equivalence point.
4.2 Place 5 mL of the standard chloride solution (3.1) in a 150 mL cylindrical
vessel with 95 mL of distilled water and 1 mL of nitric acid (3.3). Immerse
the electrode and titrate, while stirring, until the potential of the equivalence
point is obtained. This determination is repeated until a good degree of
MA-E-AS321-02-CHLORU 1
Chloride
agreement in the results is obtained. This check must be carried out before
each series of measurements of chloride in the samples.
4.3 Place 50 mL of wine into a 150 mL cylindrical vessel. Add 50 mL of
distilled water and 1 mL of nitric acid (3.3) and titrate using the procedure
described in 4.2.
5 Expression of results
5.1 Calculations
If n represents the number of milliliter of silver nitrate titrant, the chloride
content in the tested liquid, is given by:
20 n expressed as milligrams Cl per liter
0.5633 n expressed as milliequivalents per liter,
32.9 x n expressed as milligrams of NaCl per liter.
5.2 Repeatability (r): r = 1.2 mg Cl/L
r = 0.03 mEq/L
r = 2.0 mg NaCl/L
5.3 Reproducibility (R) R= 4.1 mg/L
R= 0.12 mEq/L
R= 6.8 mg NaCl/L
6. Note: For very precise determination.
Refer to the complete titration curve obtained during determination of the test
liquid (4.2).
a) Measure 50 mL of the wine to be analyzed into a 150 mL cylindrical vessel.
Add 50 mL of distilled water and 1 mL of nitric acid (3.3). Titrate using
silver nitrate solution (3.2), adding 0.5 mL at a time and recording the
corresponding potential in millivolts. Estimate from this first titration the
approximate volume of silver nitrate solution (3.2) required.
b) Repeat the determination adding 0.5 mL of titrant at a time until the volume
added is 1.5 to 2 mL less that the volume determined in (a). Thereafter add
0.2 mL at a time. Continue to add the solution beyond the estimated
equivalence point in a symmetrical manner, i.e. by adding 0.2 mL and then
0.5 mL at a time.
The end point of the measurement and the exact volume of silver nitrate
consumed are obtained:
either by drawing the curve and determining the equivalence point;
or by the following calculation:
E1
V = V + Vi
E1 + E 2
Chloride
Where:
V = volume of titrant at the equivalence point;
V = volume of titrant before the largest potential change;
Vi = constant volume of the increments of titrant, i.e. 0.2 mL;
E1 = second difference in potential before the largest potential change;
E2 = second difference in potential after the largest potential change.
Example:
Volume of AgNO3 E potential in Difference Second difference

titrating solution mV E E
0 204 4
0.2 208 4 0
0.4 212 6 2
0.6 218 6 0
0.8 224 0
6
1.0 230 2
8
1.2 238 4
12
1.4 250 10
22
1.6 272 22
1.8 316 44 10
2.0 350 34 8
2.2 376 26 6
2.4 396 20
In this example, the end point of the titration is between 1.6 and 1.8 mL: the
largest potential change ( E = 44 mV) occurs in this interval. The volume of
silver nitrate titrant consumed to measure the chlorides in the test sample is:
V = 1.6 + 0.2 22 = 1.74mL
22 + 10
BIBLIOGRAPHY
MIRANDA PATO C. de, F.V., O.I.V., 1959, no12.

HUBACH C.E., J. Ass. Off. Agric. Chem., 1966, 49, 498.
Fdration internationale des Producteurs de jus de fruits, F. O.I.V.,1968, no37.
JUNGE Ch., F.V., O.I.V., 1973, no440.
Fluoride
DETERMINATION OF FLUORIDE CONTENT IN WINE USING A

FLUORIDE SELECTIVE ION ELECTRODE, AND A STANDARD
ADDITION METHOD
(Oeno 22/2004)
1. SCOPE
This method is applicable to the analysis of fluoride in all wines.

With proper dilution, the range of detection is 0.1 mg/l to 10.0
mg/l.
2. PRINCIPLE
The concentration of fluoride in the sample is measured after

addition of a buffer, using a fluoride ion selective electrode. The
buffer provides a high, constant background ionic strength;
complexes iron and aluminium (which would otherwise complex
with fluoride); and adjusts the pH to a level that minimises the
formation of a HFHF complex. The matrix effects are then
minimised using standard addition.
3. REAGENTS
3.1 Deionized or distilled water
3.2 Sodium chloride 99.0% purity
3.3 Trisodic citrate 99.0% purity
3.4 CDTA (1,2-diaminocyclohexane-N,N,N,N- tetracetic

hydrate acid) 98.0% purity3.5 Sodium hydroxide to 98.0%
purity
3.6 Sodium hydroxide solution 32% (w/v) made from 3.5
3.7 Glacial acetic acid 99.0% purity
3.8 Sodium fluoride 99.0% purity
3.9 Commercial Total Ionic Strength Adjustment Buffer

(TISAB) (i.e. III-Orion Research Inc. Cat. # 940911) or equivalent
(See 4.2).
MA-E-AS321-03-FLUORU 1
Fluoride
Fluoride
3.10 Alternative TISAB:

3.10.1 To ca. 700 ml water (3.1) in a 1 l beaker (4.3), add
58.0 g 0.1 g sodium chloride (3.2) and 29.4 g 0.1 g
of tri-sodium citrate (3.3).
3.10.2 Dissolve 10.0 g 0.1 g of CDTA (1,2-

diaminocyclohexane-N,N,N,N-tetraacetic acid) (3.4) and
6 ml of 32% (w/v) sodium hydroxide (3.6) in
approximately 50 ml of distilled water. (3.1)
3.10.3 Mix the two solutions together then add 57 ml of

glacial acetic acid (3.7) and adjust pH to 5.5 with 32%
(m/v) sodium hydroxide (3.6). Cool to room temperature,
transfer to 1 l volumetric flask (4.10), and dilute to
volume with water (3.1).
3.11 Fluoride standard solutions
3.11.1 Fluoride stock standard solution (100 mg/l):

Weigh 221 mg 1 mg of sodium fluoride (3.8) (dried at
105C for 4 hours) into a 1 l polyethylene volumetric flask
(4.10) and make to volume with water. (3.1)
3.11.2 Fluoride calibration standards at 1.0 mg/l, 2.0 mg/l

and 5.0 mg/l : make 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, and 5.0 mg/l
calibration standards by pipetting 1 ml, 2 ml, and 5 ml of the
100 mg/l stock standard (3.11.1) into three polyethylene 100
ml volumetric flasks (4.10) respectively and diluting to
volume with water (3.1).
3.12 Wine blank : a wine known to be fluoride free is used as a

matrix blank
3.13 1 mg/l spiked wine standard - Place 10 ml (4.11) of 100 mg/l

fluoride stock standard solution(3.11.1)into a 1 l
volumetric flask (4.10) and bring to volume with fluoride
free wine (3.12).
Fluoride
4. APPARATUS
4.1 pH/ion analyser with standard addition capability (e.g. Corning

pH/ion Analyser 455, Cat. # 475344) or pH/ion analyser with
extended mV range.
4.2 Fluoride ion selective electrode and single junction reference

electrode or combination electrode (e.g., Corning Fluoride
Electrode Cat. # 34108-490).
4.3 Beakers - 150 ml, 1 l, polyethylene
4.4 Cylinder - 50 ml graduated, polyethylene,.pouring.
4.5 Magnetic stirrer
4.6 Magnetic stir bars, PTFE coated.
4.7 Plastic bottles with caps, 125 ml (Nalgene or equivalent)
4.8 Precision pipette, 500 l
4.9 Ultrasonic bath
4.10 Volumetric flasks, Class A, 50 ml, 100 ml, and 1 l
4.11 Volumetric pipettes, Class A, 1 ml, 2ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, and
25 ml
5. PREPARATION OF CALIBRATION STANDARDS
5.1 Place 25 ml (4.11) of 1.0 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, and 5.0 mg/l
standard solutions (3.11.2) respectively into three 150 ml beakers
(4.3), add 20 ml (4.11) of water (3.1) and (4.11) 5 ml of commercial
TISAB (3.9) to each. Mix with a magnetic stirring. (4.5 and 4.6).
5.2 If using alternative TISAB reagent (3.10) : place 25 ml (4.11) of

each standard solution (3.11.2) into three 150 ml beakers (4.3) and
add 25 ml (4.11) of alternative TISAB reagent (3.10) to each. Mix
with a magnetic stirrer. (4.5 and 4.6)
Fluoride
6. PREPARATION OF THE TEST SAMPLES
Mix the wine sample thoroughly before sampling. Sparkling wines should
be degassed before sampling by transferring to a clean beaker and
placing in an ultrasonic bath (4.9) until gas no longer evolves.
6.1 If using reagent (3.9), commercial TISAB : place 25 ml (4.11) of

wine sample into a 150 ml beaker (4.3) with 20 ml (4.11) of water (3.1)
and add 5 ml (4.11) of ommercial TISAB (3.9) solution. Mix with a
magnetic stirrer (4.5 and 4.6). Dilution factor (DF) = 1.
6.2 If using alternative TISAB reagent (3.10) : place 25 ml (4.11) of

wine sample in a 150 ml beaker (4.3) and add 25 ml (4.11) of
alternative TISAB reagent (3.10). Mix with a magnetic stirrer (4.5 and
4.6). Dilution factor (DF) = 1.
7. PROCEDURE
Measurement (all standard and wine sample solutions must be at the

same temperature).
7.1 Calibration standards
Measure the potential of each of the calibration solutions, using

the meter (4.1), fluoride selective electrode (4.2), and reference
electrode (4.2). The final reading must be taken when the
readings have stabilised (stability is obtained when the potential
varies by not more than 0.2 to 0.3 mV/ 3 minutes). Record the
readings for each of the calibration standards.
The log10 of each of the standard concentrations versus the
millivolt reading measured for each standard concentration is
plotted on graph paper in order to determine the slope of the
electrode.
7.2 Wine samples
Measure and record the potential expressed in mV (E1) of the

sample (6.1 or 6.2) after the readings have stabilised. Add 500 l
(4.8) of 100 mg/l fluoride standard (3.11.1) to the sample (6.1
or 6.2). After the readings have stabilised, read and record the
potential expressed in mV (E2) of the wine solution.
Fluoride
The final concentration must be at least double the fluoride

concentration in the sample solution. To make sure, if the
fluoride concentration in the test sample is above 2 mg/l on the
first determination, a second determination must be made after
dilution of the sample as follows (7.2.1 or 7.2.2).
7.2.1 When using the commercial TISAB buffer (3.9): pipette

(4.11) 25 ml of wine sample in a 50 ml volumetric flask (4.10)
and bring to volume with water. Take 25 ml (4.11) of this diluted
wine in a 150 ml cylindrical beaker (4.3) and add 25 ml of
commercial TISAB (3.9). Mix with a magnetic stirrer (4.5 and
4.6) and then proceed with measurement as in 7.02. Dilution
factor (DF) = 2.
7.2.2 When using the alternative TISAB buffer (3.9): pipette
(4.11) 25 ml of wine sample in a 50 ml volumetric flask (4.10)
and bring to volume with water. Pour 25 ml (4.11) of this diluted
wine in a 150 ml cylindrical beaker (4.3) and add 25 ml of
alternative TISAB buffer (3.10). Mix with a magnetic stirrer (4.5
and 4.6) and then proceed with measurement as in 7.2. Dilution
factor: (DF) = 2.
8 CALCULATION
The fluoride content of the sample solution expressed in mg/l is

obtained by using the following formula:
Va Ca 1
Cf =
Vo ((anti log E / S ) 1)
If the added standard solution V std is 1% of the volume

of the solution after the addition, so Va = Vo and
1
Cf = DF Ca
((anti log E / S ) 1)
Cf = fluoride concentration of the sample solution (mg/l)
DF = dilution factor. If it is necessary to dilute the sample

as in (7.2.1) or in (7.2.2), use the identical values for the dilution
and the sample. That is to say, DF = 2 for a diluted sample
(7.2.1) and (7.2.2) or DF = 1 if it is not as in (6.1) or (6.2)
Fluoride
Vo = initial volume of the sample solution before standard
addition (ml)
Va = volume of the solution after standard addition (ml)
E = difference between potentials E1 and E2 obtained in
(7.2) in mV.
S = slope of the calibration curve of the electrode.
Vstd C std
Ca =
Vsamp
where
Ca = concentration (in mg/l) of fluoride added to the sample volume (Vo )

obtained by multiplying the standard volume (3.11.1) added to the
solution (Vstd) by the concentration (Cstd) of standard (3.11.1) and
divided by the sample volume (25 ml) using (6.1) or (6.2)
Vstd = volume added standard (3.11.1) (0.5 ml)
Vsamp = sample volume used in (6.1) or (6.2), Vsamp = 25 ml
Cstd = standard concentration (3.11.1)
Calculation example:
(1) for a sample prepared as in (6.2) and measured as in (7.2)
DF = 1
Vstd C std 0.5 ml 100 mg / l
Ca = = = 2 mg /l
Vsamp 25 ml
E = 19.6 mV
S = -58.342
1
Cf = DF Ca
1
C f = 1 2 mg / l
((anti log 19.6 / 58.342) 1)
Fluoride
C f = 1 2 mg / l 0.856 = 1.71 mg / l of fluoride
(2) for a sample prepared as in (7.2.2), and measured as in (7.2)

DF = 2
Vstd C std 0.5 ml 100 mg / l
Ca = = = 2 mg /l
Vsamp 25 ml
E = 20.4 mV
S = -55.937
1
Cf = DF Ca
1
C f = 2 2 mg / L
((anti log 20.4 / 55.937) 1)
Cf = 2 x 2 mg / l x 0.760 = 3.04 mg / l of fluoride
9. PRECISION
The details of inter laboratory study are given in Annex B. the Horrat
(HoR) ranges from 0.30 to 0.97 and indicates a very good reproducibility
among participants.
The results of the statistical calculations are given in Annex B table 2.
The standard deviation of repeatability (RDSr) ranges from 1.94% to
4.88%. The standard deviation of reproducibility (RDSR) ranges from
4.15% to 18.40%. Average % recovery ranged between 99.8% and
100.3% of the mean target.
10. QUALITY ASURANCE AND MANAGEMENT
10.1 Analyse a standard solution from 1.0 mg/l (3.11.2) at the

beginning and end of each series of measurement. The results must be
1.0 0.1 mg/l.
10.2 Before each measurement series analyse a blank sample (3.12)

and for the internal quality control (CQI) a overloaded wine (3.13). The
blank sample must not be over 0.0 mg/l 0.1 mg/l. and the CQI must
not be over 1.0 mg/l 0.2 mg/l.
Fluoride
Annex A
References
1. AOAC International, AOAC Official Methods Program, Associate

Referees Manual On Development, Study, Review, and Approval
Process,1997
2. Postel, W.; Prasch, E., Wein-Wissenschoft, (1975) 30 (6), 320-326
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International Methods of Wine Analysis, 5/10/94, 255257
4. Gil Armentia, J. M.; Arranz, J. F.; Barrio, R. J.; Arranz, A., Anales de
Bromatologia, (1988) 40 (1) 71-77
5. Gran, G; Analyst (1952) 77, 661
6. Corning fluoride ion selective electrode Instruction Manual, 1994
7. Corning Instruction Manual pH/ion analyzer 455, 109121-1 Rev. A,

11/96
8. Horwitz,W.; Albert, R.; Journal of the Association of Official Analytical

Chemists, (1991) 74 (5) 718
Fluoride
Annex B
Inter laboratory Study
VALIDATION OF A FLUORIDE ION SELECTIVE ELECTRODE, STANDARD

ADDITION METHOD FOR THE MEASUREMENT OF FLUORIDE IN WINE
B.1 Introduction
The validation by collaborative trial of a fluoride selective ion electrode,

standard addition method for the determination of fluoride in wine is
described. The collaborative trial involved a total of twelve participants,
six European and six Americans, who took part in the study. The
collaborative study was performed using the AOAC, Youden protocol(1).
B2 Participants
The twelve participants of this validation consisted of laboratories from

Austria, France, Germany, Spain, and the United States and comprised
of the following: BATF Alcohol and Tobacco LaboratoryAlcohol Section,
SF, Walnut Creek, CA., United States; BATF, National Laboratory Ctr.,
Rockville, MD, United States; Bundesinstitut fr Gesundheitlichen
Verbraucherschutz, Berlin, Germany; Canandaigua Winery, Madera, CA,
United States; CIVC, Epernay, France; E. & J. Gallo Winery-Analytical
Services Laboratory, Modesto, CA, United States; E. & J. Gallo Winery-
Technical Analytical Services Laboratory, Modesto, CA, United States;
ETS Labs, St. Helena, CA, United States; Hhere Bundeslehranstalt &
Bundesamt fr Wein und Obstbau, Klosterneuburg, Austria; Institut
Catala de la Vinya i el Vi, Vilafranca del Penedes (Barcelona),Spain;
Laboratorio Arbitral Agroalimentario, Madrid, Spain; and Sutter Home
Winery, St. Helena, CA., United States.
B3 Samples used in the trial
The samples used in the trial are given in Appendix I. They were
distributed as twelve wine samples (six Youden pairs of samples
comprised of three red wines and three white wines).
Fluoride
Sample Sample description
1 White wine with no fortification (total of 0.6 mg/l F-)

2 White wine fortified with 0.3 mg /l (total of 0.9 mg/l F-)
3 White wine fortified with 0.9 mg /l (total de 1,5 mg/l F-)
7 Red wine with no fortification (total de 0,2 mg/l F-)
8 Red wine fortified with 0.3 mg /l (total de 0,5 mg/l F-)
8.4 Results
A summary of the results obtained by the twelve participants is given in
Table I. None of the laboratories reported any difficulties with the
analysis. One Youden pair from one laboratory was determined to be an
outlier, using the Cochrans test. These results are noted(c) in Table I,
and were not used in the statistical analysis.
Fluoride
Table 1
Collaborative data for the determination of fluoride in wine by fluoride
selective electrode, standard additiona
Lab White Wine Red Wine

Pair 1b Pair 2b Pair 3b Pair 4b Pair 5b Pair 6b
Number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 0.55 0.80 1.33 1.56 1.86 2.24 0.19 0.45 0.89 1.17 2.54 2.77
2 0.52 0.81 1.39 1.64 1.86 2.31 0.19 0.46 0.92 1.20 2.58 2.77
3 0.52 0.81 1.40 1.70 1.92 2.25 0.14 0.42 0.96 1.22 2.64 2.95
4 0.62 0.98 1.48 1.64 1.85 2.14 0.28 0.56 1.00 1.32 2.64 2.72
5 0.48 0.78 1.34 1.64 1.84 2.11 0.12 0.39 0.88 1.16 2.56 2.82
6 0.53 0.84 1.45 1.74 1.97 2.30 0.13 0.43 0.92 1.21 2.66 2.93
7 0.53 0.76 1.27 1.64 1.89 2.06 0.14 0.40 0.88 1.12 2.44 2.83
8 0.57 0.88 1.51 1.85 2.11 2.33 0.48c 0.48c 1.01 1.32 2.64 3.08
9 0.51 0.81 1.40 1.71 1.90 2.20 0.13 0.42 0.90 1.19 2.60 2.86
10 0.54 0.84 1.43 1.71 1.93 2.22 0.18 0.44 0.96 1.23 2.66 2.87
11 0.60 0.93 1.48 1.75 1.98 2.32 0.25 0.57 1.06 1.31 2.68 2.82
12 0.65 0.94 1.54 1.79 2.05 2.32 0.21 0.52 1.03 1.24 2.81 3.07
N of cases 12 12 12 12 12 12 11 11 12 12 12 12
Minimum 0.48 0.76 1.27 1.56 1.84 2.06 0.12 0.39 0.88 1.12 2.44 2.72
Maximum 0.65 0.98 1.54 1.85 2.11 2.33 0.28 0.57 1.06 1.32 2.81 3.08
Range 0.17 0.22 0.27 0.29 0.27 0.27 0.16 0.18 0.18 0.20 0.37 0.36
Mean 0.55 0.85 1.42 1.70 1.93 2.23 0.18 0.46 0.95 1.22 2.62 2.87
Median 0.54 0.83 1.42 1.71 1.91 2.25 0.18 0.44 0.94 1.22 2.64 2.85
Std Dev 0.050 0.069 0.079 0.079 0.084 0.091 0.052 0.063 0.061 0.065 0.090 0.114
a
Units are mg fluoride/L.
b
Youden pairs
c
Value was deleted from data set by Cochrans Test and was not included in the
statistical analysis
Fluoride
Table 2
Statistical data from the collaborative study on the analysis of fluoride in

wine by fluoride selective ion electrode, standard addition method
White Wine Red

Wine
STATISTIC Pair 1 Pair 2 Pair 3 Pair 4 Pair 6
Pair 5
Total # of Labs 12 12 12 11d 12 12
Number of "replicates 2 2 2 2 2 2
per lab
Mean (split levels) 0.55 1.42 1.93 0.18 0.95 2.62
0.85 1.70 2.23 0.46 1.22 2.87
Repeatability variance 0.0006 0.0015 0.0026 0.0002 0.0005 0.0049
Repeatability Standard 0.0235 0.0382 0.5106 0.0156 0.0211 0.0703
Deviation
Relative standard 3.35 % 2.45 % 2.45 % 4.88 % 1.94 % 2.55 %
deviation RSDr,
repeatability
Reproducibility 0.0039 0.0070 0.0089 0.0034 0.0042 0.0130
variance
Reproducibility 0.0625 0.0835 0.0945 0.0587 0.0647 0.1141
standard deviation
Relative standard 8.92 % 5.36 % 4.54 % 18.39 % 5.95 % 4.15 %
deviation RSDR,
reproducibility
Horwitz Equation 16.88 14.97 14.33 19.00 15.80 13.74
Applied (as RSDR)
HORRAT Value HoR 0.53 0.36 0.32 0.97 0.38 0.30
(RSDR
(measured)/RSDR
(Horwitz))
Average % recovery 93.1 94.6 96.7 91.0 94.4 96.4
d
One lab pair was deleted from data set by Cochrans Test
Total phosphorus
Total Phosphorus
1. Principle
After nitric oxidation and ashing, and dissolution in hydrochloric acid,
phosphoric acid is determined colorimetrically as the yellow phospho-
vanadomolybdate complex.
2. Apparatus
2.1 Boiling water-bath 100C
2.2 Hot plate
2.3 Temperature-controlled electric furnace.
2.4 Spectrophotometer measuring absorbance at wavelengths between 300 and
700 nm
3. Reagents
3.1 Nitric acid, (20 = 1.39 g/mL).
3.2 Hydrochloric acid, approx. 3 M; hydrochloric acid (20 = 1.15 - 1.18 g/mL)
diluted 1/4 with water.
3.3 Vanadomolybdate reagent:
Solution A: dissolve 40 g of ammonium molybdate, (NH4)6Mo7O24.4H2O,
in 400 mL water.
Solution B: dissolve 1 g of ammonium vanadate, NH4VO3, in 300 mL water
and 200 mL nitric acid (20 = 1.39g/L) (3.1). Leave to cool.
Vanadomolybdate reagent: place first solution B then solution A into a 1
liter flask, and make up to the mark with water. Reagent to be used within
8 days of preparation.
3.4 P2O5 solution, 0.1 g/L.
Prepare a P2O5 solution 1 g/L by dissolving 2.454 g of di-potassium
hydrogen phosphate, K2HPO4, in a liter of water. Dilute 10% (v/v).
4. Procedure
4.1 Ashing
Place 5 mL* wine or must in a platinum or silica dish and evaporate on a
boiling water-bath (2.1). When the residue is nearly dry add 1 mL nitric acid
(3.1), place the dish on a hot plate (2.2) for 1 hour then in a furnace (2.3) at
600-650 oC until the ash is white.
*
A 5 mL sample volume is suitable for P2O5 content, of between 100 and 500 mg/L.
Outside these concentration limits, increase or decrease the sample volume.
E-AS321-04-PHOTOT 1
Total phosphorus
4.2 Determination
Add 5 mL of hydrochloric acid, approximately 3 M (3.2) to the ash and
transfer the solution to a 100 mL volumetric flask. Rinse the dish with 50
mL distilled water and pour the washings into the flask. Add exactly 25 mL
of vanadomolybdate reagent, stir and leave for 15 to 20 min to allow the color
to develop. Determine the absorbance at 400 nm.
Simultaneously, prepare standard solutions. Place in five 100 mL volumetric
flasks, 5, 10, 15, 20 and 25 mL respectively of P2O5 solution, 0.1 g/L (3.4).
Make up to 50 mL with distilled water and add 25 mL vanadomolybdate
reagent. Leave for the exact same time as the samples, to allow the color to
develop. Make up to the mark with water and measure the absorbance at
400 nm.
In order to remain in the best absorbance zone do not reset to zero with
distilled water, but set the deviation of the spectrophotometer galvanometer
on a given absorbance for a determined concentration.
5.1 Calculation
The total phosphorous content expressed in milligrams per liter of phosphoric
anhydride, P2O5, is obtained by entering the absorbance of the wine sample on
the calibration graph and interpolating the total phosphorus concentration.
The total phosphorous content is expressed in milligrams per liter P2O5 to the
nearest whole number.
BIBLIOGRAPHY
A.F.N.O.R., Norme U, 42-246, Tour Europe, Paris.

SUDRAUD P., Bull. O.I.V., 1969, 462-463, 933.
E-AS321-04-PHOTOT 2
Sulfates
Sulfates
1. Principle
Gravimetric determination following precipitation of barium sulfate. The
barium phosphate precipitated at the same time is eliminated by washing the
precipitate in hydrochloric acid.
In the case of musts or wine rich in sulfur dioxide, prior de-sulfiting by
boiling in an airtight vessel is recommended.
1.2 Quick test method
Wines are classified into several categories using the so-called limits
method, based on the precipitation of barium sulfate using a barium ion
titrant.
2. Reference method
2.1 Reagents
2.1.1 Hydrochloric acid, 2 M.
2.1.2 Barium chloride solution, BaCl2.2H2O, 200 g/L.
2.2 Procedure
2.2.1 General procedure:
Introduce 40 mL of the sample to be analyzed into a 50 mL centrifuge tube;
add 2 mL hydrochloric acid, 2 M (2.1.1), and 2 mL of barium chloride
solution, 200 g/L (2.1.2). Stir with a glass stirrer; rinse the stirrer with a
little distilled water and leave to stand for five min. Centrifuge for five min,
then carefully decant the supernatant liquid.
Wash the barium sulfate precipitate as follows: add 10 mL hydrochloric acid,
2 M (2.1.1), place the precipitate in suspension and centrifuge for five min,
then carefully decant the supernatant liquid. Repeat the washing procedure
twice as before using 15 mL distilled water each time.
Quantitatively transfer the precipitate, with distilled water, into a tared
platinum capsule and place over a water bath at 100C until fully evaporated.
The dried precipitate is calcined several times briefly over a flame until a
white residue is obtained. Leave to cool in a desiccator and weigh.
Let m = mass in milligrams of barium sulfate obtained.
2.2.2 Special procedure: sulfited must and wine with a high sulfur dioxide
content.
Elimination of sulfur dioxide.
Measure 25 mL of water and 1 mL of concentrated hydrochloric acid (20=
1.15 to 1.18 g/mL) into a 500 mL conical flask equipped with a dropping
MA-E-AS321-05-SULFAT 1
Sulfates
funnel and an outlet tube. Boil the solution to remove the air and introduce
100 mL of wine through the dropping funnel. Continue boiling until the
volume of liquid in the flask has been reduced to about 75 mL and
quantitatively transfer, after cooling, to a 100 mL volumetric flask. Make up
to mark with water. Determine the sulfate in the 40 mL sample as indicated
in 2.2.1.
2.3. Expression of results
2.3.1 Calculations:
The sulfate content, expressed in milligrams per liter of potassium sulfate,
K2SO4 is given by:
18.67 x m
The sulfate content in musts or wine is expressed in milligrams per liter of
potassium sulfate, to the nearest whole number.
2.3.2 Repeatability (r):
up to 1000 mg/L: r = 27 mg/L
approx. 1500 mg/L: r = 41 mg/L
2.3.3 Reproducibility (R):
up to 1000 mg/L: R = 51 mg/L
approx. 1500 mg/L: R = 81 mg/L
3. Quick test method
3.1 Reagents
3.1.1 Barium chloride titrant
2.804 g of barium chloride, BaCl2.2H2O and 10 mL of hydrochloric acid (20 =
1.15 to 1.18 g/mL) are dissolved in enough water to obtain one liter of solution;
1 mL of this solution precipitates a quantity of sulfate ions equivalent to 2 mg of
potassium sulfate.
3.1.2 Dilute sulfuric acid 10%: sulfuric acid(20 = 1.84 g/mL) diluted 10%
(m/v).
3.2 Procedure
Measure 10 mL of must or wine into three test tubes; add to No 1: 3.5 mL, to No
2: 5 mL and to No 3: 10 mL of the barium chloride solution. Shake and bring to
the boil; leave to stand for one to two hours. The liquid in each tube is decanted,
filtered and divided into two parts. To one part, add several drops of dilute
sulfuric acid solution (3.1.2), to the other some drops of the barium chloride
solution (3.1.1). Examine each tube and note whether the liquid is clear or
cloudy. Interpretation of these observations is given in the table below.
Sulfates
Filtered wine +
Barium
Wine Diluted barium chloride
chloride
sulfuric acid solution
(mL) (mL)
cloudy clear
First test 10 3.5 less than 0.7 g K2SO4/L)
clear cloudy
(more than 0.7 g K2SO4/L)
cloudy clear
Second test 10 5 (less than 1 g K2SO4/L)
clear cloudy
(more than 1 g K2SO4/L)
cloudy clear
Third test 10 10 less than 2 g K2SO4/L)
clear cloudy
(more than 2 g K2SO4/L)
BIBLIOGRAPHY
Reference method:
DEIBNER L , BNARD P., Ind. alim. agric., 1954, 71, no1, 23; no5, 427; 1955,
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Quick test method:
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MARTY H., Ibid., 4e sr., 1877, 25, 272.
Ammonium
Ammonium
1. Principle
Retention of the ammonium cation on a weak cation exchange resin, elution using
an acidic solution, distillation of the eluent and determination of the ammonia in
the distillate by titration with a standardized solution of hydrochloric acid.
2. Apparatus
2.1 Cation exchange resin column
A 50 mL burette with a glass stopcock fitted with a glass wool plug
containing 25 g of weak cation exchange resin (e.g. Amberlite IR-50, 80-100
mesh).
Wash alternately with 1 M sodium hydroxide solution and 1 M hydrochloric
acid solution. Wash the resin with distilled water until a negative reaction of
chloride ion with silver nitrate is obtained. Pass 50 mL of neutral buffer
slowly through the glass column, rinse with distilled water until phosphates
begin to elute as detected using a saturated solution of lead acetate.
2.2 Distillation apparatus
Use the apparatus described in the chapter on Alcoholic Strength 3.1
The condensate is transferred to the conical flask through a drawn-out tube
touching the bottom of the vessel.
Alternatively, it is possible to use the steam distillation apparatus used in the
chapter on Volatile Acidity 4.1 or other apparatus that can be used for the
following experiments which check the purity of the reagents.
a) Place 40-45 mL of 30 % sodium hydroxide solution (v/v), 50 mL of
water and 50 mL hydrochloric acid, 1 M, in the distillation flask. Distil
half the volume and collect the distillate in 30 mL of boric acid solution,
40 g/L to which 5 drops of methyl red have been added. Adjust the
color to pink by the addition of 0.1 mL of 0.1 M hydrochloric acid.
b) A test (similar to that described in a) is conducted using, 10 mL 0.05 M
ammonium sulfate solution, containing 3.55 g/L of anhydrous
ammonium sulfate, (NH4)2SO4. In this case, between 10 and 10.1 mL
0.1 M hydrochloric acid must be used to obtain the change of color of
the indicator.
3. Reagents
3.1 Hydrochloric acid solution, 1 M.
3.2 Sodium hydroxide, 1 M.
MA-E-AS322-01-AMMONI 1
Ammonium
3.3 Neutral solution to wash the resin:

di-sodium hydrogen phosphate Na2PO4.12H2O ................ 15 g
potassium di-hydrogen phosphate KH2KO4 ................... 3.35 g
water to ........................................ 1000 mL
Verify pH is 70.2
3.4 Sodium hydroxide solution, 30% (m/m), = 1.33 g/mL
3.5 Hydrochloric acid solution, 0.1 M.
3.6 Phenolphthalein solution, 1% (m/v), in neutral ethanol, 96% (V/V)
3.7 Bromocresol green solution, 1% (m/v):
bromocresol green ........................................... 1g
dissolve in 0.1 M sodium hydroxide solution, ....... 14 mL
water to............................................................ 100 mL
3.8 Methyl red ethanol/water solution, 0.2% (v/v):
methyl red ...................................................... 0.2 g
alcohol, 95% (vol.) ........................................... 60 mL
water to ......................................................... 100 mL
3.9 Boric acid solution
Boric acid ........................................................ 40g
Water to .......................................................... 1000mL
Boric acid usually contains a small quantity of alkaline impurities and it is
possible to correct this by adding 5 drops of indicator to this solution and
adjusting to a pink color by means of few drops of 0.1 M hydrochloric acid (1
mL at most).
4. Procedure
Transfer 50 mL of the sample to be analyzed into a 250 mL beaker. Add a
quantity of sodium hydroxide, 1 M, equal to half of (n-0.5) mL, where n is the
volume sodium hydroxide solution, 0.1 M, used in the total acidity titration on 10
mL of wine. Pass this mixture through the cation exchange column (2.1) at a rate
of one drop every two seconds. The eluent pH should lie between 4 and 5.
Rinse the column with 50 mL of distilled water at the same flow rate.
Ammonium and other cations are quantitatively retained on the column. Amides,
oligopeptides and nearly all amino acids are eluted by the washing procedure.
Elute the cations retained on the resin with 50 mL of 1 M hydrochloric acid,
(3.1) and rinse with 50 mL distilled water.* The eluate and the water washings
are combined in a 1 liter round bottom distillation flask.
* The column should be washed with 50 mL of neutral buffer solution and rinsed with
water before using the column for another determination.
Ammonium
Add one drop of phenolphthalein, 1% (m/v), and sufficient quantity of 30%

sodium hydroxide solution (m/v)(3.4), to obtain a true alkaline reaction,
constantly cooling the flask during this addition.
Distil about half the volume of the liquid from the distillation flask, into 30 mL of
4% boric acid (m/v)(3.9).
The distillate is titrated with 0.1 M hydrochloric acid (3.5), in the presence of
bromocresol green or methyl red. Record the volume of hydrochloric acid used
(n).
The content of ammonium (NH4) ions is expressed in milligrams per liter to the
nearest whole number.
5.1 Calculation
The content of ammonium ions, expressed in milligrams per liter is:
36 x n
When wines with low ammonium content are analyzed, the determination is
conducted using 100 mL of wine. In this case the quantity of ammonium is given
by:
18 x n
BIBLIOGRAPHY
Usual Method:
JAULMES P., Analyse des vins, 1951, 220, Montpellier

KOURAKOU Mme S., Ann. Fals. Exp. Chim., 1960, 53, 337.
Potassium
Potassium
1. Principle
Potassium is determined directly in diluted wine by atomic absorption
spectrophotometry after the addition of cesium chloride to suppress ionization
of potassium.
1.2 Usual method
Potassium is determined directly in diluted wine by flame photometry.
Note: The gravimetric determination of potassium tetraphenylborate precipitated from
the solution of the ash of wine is a precise method for the determination of potassium
and is described in the annex.
2 Reference method
2.1 Apparatus
Atomic absorption spectrophotometer, equipped with an air-acetylene
burner
Potassium hollow cathode lamp
2.2 Reagents
2.2.1 Solution containing 1 g of potassium per liter.
Use a standard commercial solution containing 1 g of potassium per liter.
This solution may be prepared by dissolving 4.813 g of potassium hydrogen
tartrate (C4H5KO6) in distilled water and making up the volume to 1 liter with
water.
2.2.2 Matrix (model) solution:
citric acid monohydrate ....................................... 3.5 g
sucrose ........................................................... 1.5 g
glycerol .......................................................... 5.0 g
anhydrous calcium chloride, (CaCl2) .............. 50 mg
anhydrous magnesium chloride (MgCl2) ............ 50 mg
absolute alcohol ................................................. 50 mL
water to ............................................................ 500 mL
2.2.3 Cesium chloride solution containing 5% cesium:
Dissolve 6.33 g of cesium chloride, CsCl, in 100 mL of distilled water.
2.3 Procedure
Pipette 2.5 mL of wine (previously diluted 1/10) into a 50 mL volumetric
flask, add 1 mL of the cesium chloride solution and make up to the mark with
distilled water.
2.3.2 Calibration
MA-E-AS322-02-POTASS 1
Potassium
Introduce 5.0 mL of the matrix solution into each one of five of 100mL
volumetric flasks and add 0, 2.0, 4.0, 6.0 and 8.0 mL respectively of the 1
g/L potassium solution (previously diluted 1/10). Add 2 mL of the cesium
chloride solution to each flask and make up to 100 mL with distilled water.
The standard solutions contain 0, 2, 4, 6 and 8 mg of potassium per liter
respectively and each contains 1 g of cesium per liter. Keep these solutions in
polyethylene bottles.
2.3.3 Determination
Set the wavelength to 769.9 nm. Zero the absorbance scale using the zero
standard solution (2.3.2). Aspirate the diluted wine (2.3.1) directly into the
spectrophotometer, followed in succession by the standard solutions (2.3.2).
Record the absorbance for each solution and repeat.
2.4.1 Method of calculation
Plot a graph showing the variation in absorbance as a function of potassium
concentration in the standard solutions.
Record the mean absorbance obtained with diluted wine on this graph and
determine its potassium concentration C in milligrams per liter.
The potassium concentration, expressed in milligrams per liter of the wine to
the nearest whole number, is F x C, where F is the dilution factor (here 200).
2.4.2 Repeatability (r): r = 35 mg/L.
2.4.3 Reproducibility (R): R = 66 mg/L.
2.4.4 Other ways of expressing results
In milliequivalents per liter: 0.0256 x F x C.
In mg potassium hydrogen tartrate per liter: 4.813 x F x C.
3. Usual method
3.1 Apparatus
3.1.1 Flame photometer supplied with an air-butane mixture.
3.2 Reagents
3.2.1 Reference solution containing 100 mg potassium per liter
Absolute alcohol ............................................. 10 mL
Citric acid C6H8O7, H2O ........................... 700 mg
Sucrose .......................................................... 300 mg
Glycerol ......................................................... 1000 mg
Sodium chloride, NaCl . .................................... 50.8 mg
Anhydrous calcium chloride, CaCl2 ...................... 10 mg
Anhydrous potassium hydrogen tartrate ....... 481.3 mg
water to ......................................................... 1000 mL
Potassium
Dissolve the potassium hydrogen tartrate in 500 mL of very hot distilled

water, mix this solution with 400 mL of distilled water in which the other
chemicals have already been dissolved, and make up to one liter.
3.2.2 Dilution solution
Absolute alcohol .............................................. 10 mL
Citric acid anhydrous ........................................ 700 mg
Sucrose ........................................................ 300 mg
Glycerol ........................................................ 1000 mg
Sodium chloride, NaCl ....................................... 50.8 mg
Anhydrous calcium chloride, CaCl2 .................. 10 mg
Anhydrous magnesium chloride, MgCl2 .......... 10 mg
Tartaric acid ................................................... 383 mg
Water to .......................................................... 1000 mL
Preserve the solutions in polyethylene bottles by adding two drops of allyl
isothiocyanate (3-isothiocyanato-1-propene; CH2=CHCH2NCS).
3.3 Procedure
3.3.1 Calibration
Place 25, 50, 75 and 100 mL of the reference solution into a set of four 100
mL volumetric flasks and make up to 100 mL with the dilution solution to
give solutions containing 25, 50, 75 and 100 mg of potassium per liter
respectively.
3.3.2 Determination
Make measurements at 766 nm. and adjust the 100% transmission using
distilled water. Successively aspirate the standard solutions directly into the
burner of the photometer, followed by wine diluted 1/10 with distilled water
and note the readings. If necessary, the wine already diluted 1/10 may be
further diluted with the dilution solution (3.2.2).
Plot a graph of the variation in percentage transmission as a function of the
potassium concentration in the standard solutions. Record the transmission
obtained for the sample of diluted wine on this graph and determine the
corresponding potassium concentration C.
The potassium concentration in mg potassium per liter to the nearest whole
number will be:
FxC
where F is the dilution factor.
Potassium
3.4.2 Repeatability (r): r = 17 mg/L.

3.4.3 Reproducibility (R): R = 66 mg/L.
3.4.4 Other ways of expressing results:
In milliequivalents per liter: 0.0256 x F x C.
In mg potassium hydrogen tartrate per liter 4.813 x F x C.
ANNEX
Gravimetric determination of potassium using sodium tetraphenylborate
1. Reagents and material
1.1. Solution of sodium tetraphenylborate
Dissolve 3g of sodium tetraphenylborate in water to make 100 mL of
solution, add a few hundred milligrams of neutral aluminum oxide, Al2O3,
and filter. This solution should be renewed regularly.
1.2. Aqueous saturated solution of bromocresol green.
1.3. Sulfuric acid solution, 10%, (v/v)
1.4. Sodium hydroxide solutions, 1 M and 0.1 M, (potassium free)
1.5. Washing solution. Place 20 mL of sodium tetraphenylborate solution (1.1)
in a 1000 mL volumetric flask. Make up to the mark with distilled water.
1.6. Acetone
1.7. Programmable-temperature water-bath
1.8. Drying oven at 100-110oC
1.9. Ceramic filter number 4 porosity
1.10. Electric furnace with temperature control
2. Procedure
2.1 Preparation and dissolution of ash
Place 25 mL of wine in a silica or platinum crucible and evaporate over a
boiling water-bath and ash the residue at 525 25oC. After cooling,
dissolve the ash with approximately 20 mL of water acidified with 0.5 mL
sulfuric acid, (10%). Transfer this solution to a 25 mL volumetric flask,
rinsing the crucible with distilled water. Make to the mark with distilled
water, shake the flask to dissolve the contents and filter.
2.2 Gravimetric Determination
Potassium
Take 10 mL filtrate, add 2 drops bromocresol green solution and sufficient

1M sodium hydroxide, followed by sodium hydroxide, 0.1 M, to obtain a pH
between 4 and 5 (a green colored solution). Heat on a water bath at 50C
and add, dropwise with continuous mixing, 5 mL of the sodium
tetraphenylborate solution. After cooling, filter the white precipitate through
the ceramic filter and wash the crucible and precipitate with washing solution.
Dry the ceramic filter in the drying oven at 110C until a constant weight is
obtained; this value is p1 g. Wash the ceramic filter several times with
acetone to dissolve the precipitate. Dry the ceramic filter in the drying oven
and record the weight, p2 g.
3.1 Calculation method
The quantity of potassium, A, expressed in milligrams per liter, will be:
A = 10.91 x p
where:
p = p1 - p2
p = weight of potassium tetraphenylborate precipitate, expressed as mg/L.
3.2 Other forms of expression
the quantity of potassium in milliequivalents of potassium per liter will be:
0.28 x p
the quantity of potassium in milligrams of potassium bitartrate per liter will
be:
52.64 x p
Sodium
Sodium
1. Principle
1.1 Reference method:
Sodium is determined directly in the wine by atomic absorption
spectrophotometry after the addition of cesium chloride to suppress ionization
of sodium.
1.2 Usual method:
Sodium is determined directly in diluted wine (at least 1 mL:10 mL) by flame
photometry.
2. Reference method
2.1 Apparatus
Atomic absorption spectrophotometer equipped with an air-acetylene
burner.
Sodium hollow cathode lamp.
2.2 Reagents
2.2.1 Solution containing 1 g of sodium per liter:
The use of a commercial standard solution containing 1 g of sodium per liter
is preferred.
Alternatively, this solution may be prepared by dissolving 2.542 g of
anhydrous sodium chloride (NaCl) in distilled water and making up to a
volume of 1 liter.
Keep this solution in a polyethylene bottle.
2.2.2 Matrix (model) solution:
Citric acid monohydrate, (C6H8O7.H2O) ..................... 3.5 g
Sucrose ........................................................... 1.5 g
Glycerol ......................................................... 5.0 g
Anhydrous calcium chloride (CaCl2) ....................... 50 mg
Anhydrous magnesium chloride, (MgCl2) ................. 50 mg
Absolute alcohol ................................................ 50 mL
De-ionized water to ............................................. 500 mL
2.2.3 Cesium chloride solution containing 5% cesium
Dissolve 6.330 g of cesium chloride, CsCl, in 100 mL of distilled water.
2.3 Procedure
2.3.1 Preparation of the sample
Pipette 2.5 mL of wine into a 50 mL volumetric flask, add 1 mL of the
cesium chloride solution (2.2.3) and make up to the mark with distilled water.
2.3.2 Calibration
MA-E-AS322-03-SODIUM 1
Sodium
Place 5.0 mL of the matrix solution in each one of five 100 mL volumetric
flasks and add 0, 2.5, 5.0, 7.5 and 10 mL respectively of a 1:100 dilution of
the 1 g/L sodium solution. Add 2 mL of the cesium chloride solution (2.2.3)
to each flask and make up to 100 mL with distilled water.
The standard solutions prepared in this way contain 0.25, 0.50, 0.75 and 1.00
mg of sodium per liter respectively and each contains 1 g of cesium per liter.
Keep these solutions in polyethylene bottles.
2.3.3 Determination
Set the absorbance wavelength to 589.0 nm. Zero the absorbance scale using
the zero standard solution. Aspirate the diluted wine (2.3.1) directly into the
spectrophotometer, followed in succession by the standard solutions (2.3.2).
Record each absorbance and repeat each measurement.
Plot a graph of measured absorbance versus the sodium concentration in the
standard solutions.
Record the absorbance obtained with the diluted wine on this graph and
determine its sodium concentration C in milligrams per liter.
The sodium concentration in milligrams per liter of the wine will then be F x
C, expressed to the nearest whole number, where F is the dilution factor.
2.4.2. Repeatability (r): r = 1 + 0.024 xi mg/L.
xi = concentration of sodium in the sample in mg/L.
2.4.3. Reproducibility (R): R = 2.5 + 0.05 xi mg/L.
xi = concentration of sodium in the sample in mg/L.
3. Usual Method
3.1 Apparatus
3.1.1. Flame photometer supplied with an air-butane mixture.
3.2 Reagents
3.2.1 Reference solution containing 20 mg sodium per liter
Absolute alcohol ................................................................ 10 mL
Citric acid monohydrate (C6H8O7 H2O) ........................ 7 00 mg
Sucrose .......................................................................... 300 mg
Glycerol ...................................................................... 1000 mg
Potassium hydrogen tartrate ................................. 481.3 mg
Anhydrous calcium chloride, CaCl2 .......................... 10 mg
Anhydrous magnesium chloride, MgCl2 ...................... 10 mg
Dry sodium chloride, NaCl ................................... 50.84 mg
Water to ............................................................................ 1000 mL
Sodium
3.2.2 Dilution solution

Absolute alcohol .................................................. 10 mL
Citric acid monohydrate (C6H8O7.H2O) ................... 700 mg
Sucrose .......................................................... 300 mg
Glycerol ....................................................................... 1000 mg
Potassium hydrogen tartrate .................................... 481.3 mg
Anhydrous calcium chloride, CaCl2 ......................... 10 mg
Anhydrous magnesium chloride, MgCl2 ..................... 10 mg
Water to ....................................................... 1000 mL
To prepare 3.2.1 and 3.2.2, dissolve the potassium hydrogen tartrate in
approximately 500 mL of very hot distilled water, mix with 400 mL of
distilled water into which the other chemicals have already been dissolved,
and make up to one liter.
Preserve the solutions in polyethylene bottles by adding two drops of allyl
isothiocyanate to each.
3.3 Procedure
3.3.1 Calibration
Place 5, 10, 15, 20 and 25 mL of the reference solution in each of five 100
mL volumetric flasks and make up to 100 mL with the dilution solution to
give solutions containing 1, 2, 3, 4 and 5 mg of sodium per liter respectively.
3.3.2 Determination
Carry out measurements at 589.0 nm and adjust the 100% transmission using
distilled water. Successively aspirate the standard solutions directly into the
photometer, followed by the wine diluted 1:10 with distilled water and note
the percentage transmission of each. If necessary, the wine already diluted
1:10 may be further diluted with dilution solution.
3.4.1 Calculation method
Plot a graph of the percentage transmittance versus sodium concentration of
the standard solutions. Record the transmission obtained for the diluted wine
sample on this graph and note the concentration, C, of sodium in the wine.
The sodium concentration in mg of sodium per liter will be:
FxC
3.4.2 Repeatability (r)
r = 1.4 mg/L (except for liqueur wine)
r = 2.0 mg/L for liqueur wine.
3.4.3. Reproducibility (R)
R = 4.7 + 0.08 xi mg/L.
xi = sodium concentration in the sample in mg/L.
Calcium
Calcium
1. Principle
Calcium is determined directly on diluted wine by atomic absorption
spectrophotometry after the addition of an ionization suppression agent.
2. Apparatus
2.1 Atomic absorption spectrophotometer fitted with an air-acetylene burner.
2.2 Calcium hollow cathode lamp.
3. Reagents
3.1 Calcium standard solution 1 g/L. Use of a standard commercial calcium
solution, 1 g/L, is preferred.
Alternatively this solution may be prepared by dissolving 2.5 g of calcium
carbonate, CaC03, in sufficient hydrochloric acid (concentrated hydrochloric
acid diluted 1:10) to dissolve it completely and making up to one liter with
distilled water.
3.2 Dilute calcium standard solution, 50 mg/L
Note : Store the calcium solutions in polyethylene containers.
3.3 Dilute lanthanum standard solution, 50 g/L
Dissolve 13.369 g of lanthanum chloride, LaCl3.7H2O in distilled water; add
1 mL, of dilute hydrochloric acid (concentrated hydrochloric acid diluted
1/10) and make up to 100 mL with distilled water.
4. Procedure
4.1 Preparation of sample
Place 1 mL of wine and 2 mL of the lanthanum chloride solution (3.3) in a 20
mL volumetric flask and make up to the mark with distilled water. The
diluted wine contains 5 g lanthanum per liter.
Note: For sweet wines, 5 g lanthanum per liter is sufficient provided that the
dilution reduces the sugar content to less than 2.5 g/L. For wines with higher
concentrations of sugar, the lanthanum concentration should be increased to
10 g/L.
4.2 Calibration
Place 0, 5, 10, 15 and 20 mL, of dilute standard calcium solution (3.2)
respectively into each of five 100 mL volumetric flasks, followed by 10 mL
of the lanthanum chloride solution (3.3) and make up to 100 mL with distilled
water. The solutions prepared in this way contain 0, 2.5, 5.0, 7.5 and 10 mg
MA-E-AS322-04-CALCIU 1
Calcium
of calcium per liter respectively, and each contains 5 g of lanthanum per liter.
These solutions should be stored in polyethylene bottles.
4.3 Determination
the zero standard (4.2). Aspirate the diluted wine directly into the
spectrophotometer, followed in succession by the five standard solutions (4.2)
and record the absorbance. Repeat each measurement.
5.1 Method of calculation
Plot a graph showing the variation in absorbance as a function of the calcium
Record the mean value of the absorbance obtained with the sample of diluted
wine on this graph and read its calcium concentration C. The calcium
concentration in milligrams per liter of the wine to the nearest whole number
is given by:
20 x C.
5.2 Repeatability (r)

Concentration<60mg/L: r=2.7mg/L.
Concentration > 60 mg/L: r = 4 mg/L.
5.3 Reproducibility (R)

R mg/L = 0.114 xi - 0.5.
where xi = concentration in the sample in mg/L.
MA-E-AS322-04-CALCIU 2
Iron
Iron
1. Principle
After suitable dilution of the wine and removal of alcohol, iron is determined
directly by atomic absorption spectrophotometry.
1.2 Usual method
After digestion in hydrogen peroxide, 30%, the total iron, present as Fe (III) state,
is reduced to the Fe (II) and quantified by the formation of a colored
orthophenanthroline complex.
2. Reference method
2.1 Apparatus
2.1.1 Rotary evaporator with thermostatically controlled water bath.
2.1.2 Atomic absorption spectrophotometer equipped with an air-acetylene
burner.
2.1.3 Iron hollow cathode lamp.
2.2 Reagents
2.2.1 Concentrated standard iron solution containing 1 g Fe (III) per liter.
Use a standard commercial solution, 1 g/L. This solution may be prepared by
dissolving 8.6341 g of ferric ammonium sulfate, FeNH4 (SO4)2.12H20, in
distilled water slightly acidified with hydrochloric acid, 1 M, and making up to
one liter.
2.2.2 Dilute standard iron solution containing 100 mg iron per liter.
2.3 Procedure
Remove the alcohol from the wine by reducing the volume of the sample to
half its original size using a rotary evaporator (50 to 60 C). Make up to the
original volume with distilled water.
If necessary, dilute prior to analysis with distilled water.
2.3.2 Calibration
Place 1, 2, 3, 4 and 5 mL of the solution containing 100 mg iron per liter
(2.2.2) respectively into each of five 100 mL volumetric flasks and make up to
100 mL with distilled water. The solutions prepared in this way contain 1, 2, 3,
4 and 5 mg of iron per liter respectively. These solutions should be stored in
polyethylene bottles.
2.3.3 Determination
Set the absorption wavelength to 248.3 nm. Zero the absorbance scale using
distilled water. Aspirate the diluted sample directly into the spectrophotometer,
MA-E-AS322-05-FER 1
Iron
followed in succession by the five standards (2.3.2). Record the absorbance.

Repeat each measurement.
Plot a graph giving the variation in absorbance as a function of the iron
concentration in the standard solutions. Record the mean value of the
absorbance obtained with the diluted wine sample on this graph and read its
iron concentration C.
The iron concentration in milligrams per liter of the wine to one decimal place
is given by:
F x C where F is the dilution factor.
3. Usual method
3.1 Apparatus
3.1.1 Kjeldahl flask, 100 mL.
3.1.2 Spectrophotometer enabling measurements to be made at a wavelength of
508 nm.
3.2 Reagents
3.2.1 Hydrogen peroxide, H202, 30% (m/v), solution, iron free.
3.2.2 Hydrochloric acid, 1 M, iron free.
3.2.3 Ammonium hydroxide (20 = 0.92 g/mL).
3.2.4 Pumice stone grains, pretreated with boiling hydrochloric acid diluted 1/2
and washed with distilled water.
3.2.5 Hydroquinone solution, C6H602, 2.5%, acidified with 1 mL concentrated
sulfuric acid (20 = 1.84 g/mL) per 100 mL of solution. This solution must be
kept in an amber bottle in the refrigerator and discarded at the slightest sign of
darkening.
3.2.6 Sodium sulfite solution, Na2S03, 20%, prepared from neutral anhydrous
sodium sulfite.
3.2.7 ortho-phenanthroline solution, C12H8N2, 0.5%, in alcohol, 96% vol.
3.2.8 Ammonium acetate solution, CH3COONH4, 20% (m/v).
3.2.9 Fe (III) solution containing 1 g of iron per liter. Use of a commercial
solution is preferred. Alternatively, a 1000 mg/L Fe (III) solution can be
prepared by dissolving 8.6341 g of ferric ammonium sulfate, FeNH4
(SO4)2.12H20, in 100 mL of hydrochloric acid, 1 M, and making up the volume
to one liter with the hydrochloric acid, 1 M.
3.2.10 Dilute standard iron solution containing 100 milligrams of iron per liter.
MA-E-AS322-05-FER 2
Iron
3.3 Procedure
3.3.1 Digestion
3.3.1.1 For wines with sugar content below 50 g/L
Combine 25 mL of the wine, 10 mL of the hydrogen peroxide solution and a
few grains of pumice into the 100 mL Kjeldah1 flask. Concentrate the mixture
to a volume of 2 to 3 mL by heating. Allow to cool and add sufficient
ammonium hydroxide to make the residue alkaline thus precipitating
hydroxides while taking care not to wet the walls of the flask.
After cooling, carefully add hydrochloric acid, to the alkaline liquid to dissolve
the precipitated hydroxides and transfer the resulting solution to a 100 mL
volumetric flask. Rinse the Kjeldahl flask with hydrochloric acid, and
combined the solutions in the volumetric flask and make up to 100 mL.
3.3.1.2 For musts and wines with sugar content above 50 g/L
If the sugar content is between 50 and 200 g/L, the 25 mL wine sample is
treated with 20 mL of hydrogen peroxide solution. Continue as in 3.3.1.1.
If the sugar content is greater than 200 mg/L, the samples of wine or must
should be diluted 1/2 or possibly 1/4 before being treated with 20 mL of
hydrogen peroxide solution. Continue as in 3.3.1.1.
3.3.2 Blank experiment
Carry out a blank trial with distilled water using the same volume of hydrogen
peroxide solution as the amount used for the mineralization, following the
experimental protocol described in 3.3.1.1.
i3.3.3 Determination
Introduce 20 mL of the hydrochloric acid wine digest solution and 20 mL, of
the hydrochloric acid solution obtained from the 'blank experiment' into two
separate 50 mL volumetric flasks. Add 2 mL of hydroquinone solution, 2 mL
of sulfite solution and 1 mL of ortho-phenanthroline. Allow to stand for 15
minutes, during which time Fe (III) is reduced to Fe (II). Then add 10 mL of
ammonium acetate solution, make each up to 50 mL with distilled water and
shake the two volumetric flasks. Use the solution originating from the blank
experiment to zero the absorbance scale at 508 nm and measure the absorbance
of the wine solution at the same wavelength.
3.3.4 Calibration
Place 0.5, 1, 1.5 and 2 mL of the 100 mg of iron per liter solution into each of
four 50 mL volumetric flasks, and add 20 mL of distilled water to each. Carry
out the procedure described in 3.3.3 to measure the absorbance of each of these
standard solutions, which contain 50, 100, 150 and 200 micrograms of iron
respectively.
MA-E-AS322-05-FER 3
Iron

Plot a graph giving the variation in absorbance as a function of the iron
concentration in the standard solutions. Record the absorbance of the test
solution and read off the iron concentration C in the hydrochloric acid
digestion solution, i.e. in 5 mL of the wine being analyzed.
The iron concentration in milligrams per liter of the wine to one decimal place
is given by:
200 C
If the wine (or must) has been diluted, the iron concentration in milligrams per
liter of the wine to one decimal place is given by:
200 F C
MA-E-AS322-05-FER 4
Copper
Copper
1. Principle
The method is based on the use of atomic absorption spectrophotometry.
2. Apparatus
2.1 Platinum dish.
2.2 Atomic absorption spectrophotometer.
2.3 Copper hollow cathode lamp.
2.4 Gas supplies: air-acetylene or nitrous oxide/acetylene.
3. Reagents
3.1 Metallic copper.
3.2 Nitric acid (20 = 1.38 g/mL), 65%.
3.3 Nitric acid (3.2), diluted 1/2 (v/v) with water.
3.4 Solution containing 1g of copper per L.
Use of a standard commercial copper solution is preferred. Alternatively this
solution may be prepared by weighing 1.000 g of metallic copper and
transferring it without loss to a 1000 mL volumetric flask. Add just enough
dilute nitric acid to dissolve the metal, add 10 mL of concentrated nitric acid
and make up to the mark with double distilled water.
3.5 Solution containing copper at 100 mg/L
Transfer 10 mL, of the 1 g/L solution 3.4. into a 100 mL volumetric flask,
and make up to the mark with double-distilled water.
3.6 Double-distilled water
4. Procedure
4.1 Preparation of sample and determination of copper
Place 20 mL sample in a 100 mL volumetric flask and make up to 100 mL
with double-distilled water. Modify the dilution if necessary to obtain a
response within the dynamic range of the detector.
Measure the absorbance at 324.8 nm. Set the zero with double distilled
water.
4.2 Constructing a standard curve
Pipette 0.5, 1 and 2 mL of copper solution into each of three 100 mL
volumetric flasks and make to the volume with double distilled water; the
solutions contain 0.5, 1 and 2 mg of copper per liter respectively. Measure
the absorbance of standard solutions and the sample prepared in and repeat
each measurement. Plot a graph showing the variation in absorbance as a
function of the copper concentration in the standard solutions.
MA-E-AS322-06-CUIVRE 1
Copper
5 Expression of results
Using the measured absorbance of the samples read off the concentration C in
mg/L from the calibration curve.
If F is the dilution factor, the concentration of the copper present is given in
milligrams per liter by:
F C.
It is quoted to two decimal places.
Notes:
a) Select a sample dilution appropriate to the sensitivity of the apparatus to be

used and the concentration of the copper present in the sample.
b) Proceed as follows when very low copper concentrations are expected in the
sample to be analyzed: Place 100 mL of the sample in a platinum dish and
evaporate on a water bath at 100 C until it becomes syrupy. Add 2.5 mL of
concentrated nitric acid drop wise, covering the bottom of the dish completely.
Carefully ash the residue on an electric hotplate or over a low flame; then
place the dish in a muffle furnace set at 500 25C and leave for about one
hour. After coo1ing, moisten the ash with 1 mL of concentrated nitric acid
while crushing it with a glass rod; allow the mixture to evaporate and ash
again as before. Place the dish in the muffle furnace again for 15 min; repeat
the treatment with nitric acid at least three times. Dissolve the ash by adding 1
mL of concentrated nitric acid and 2 mL of double distilled water to the dish
and transfer to a 10 mL flask. Wash the dish three times using 2 mL of double
distilled water each time. Finally, make to volume with double distilled water.
Proceed to analyze the sample as in 4.1 but use 10 mL of solution. Take into
account the change in dilution factor when calculating the results.
MA-E-AS322-06-CUIVRE 2
Magnesium
Magnesium
1. Principle
Magnesium is determined directly on diluted wine by atomic absorption
spectrophotometry.
2. Apparatus
2.1 Atomic absorption spectrophotometer fitted with an air-acetylene burner.
2.2 Magnesium hollow cathode lamp.
3. Reagents
3.1 Concentrated magnesium standard solution containing 1 g/L
Use of a standard commercial magnesium solution (1 g/L) is preferred.
Alternatively, this solution may be prepared by dissolving 8.3646 g of
magnesium chloride, MgC12.6H2O, in distilled water and making up to
1 liter.
3.2 Dilute magnesium standard solution, 5 mg/L.
Note: Keep the standard magnesium solutions in polyethylene bottles.
4. Procedure
The wine is diluted 1/100 with distilled water.
4.2 Calibration
Place 5, 10, 15 and 20 mL of the dilute standard magnesium solution into
each one of a set of four 100 ml. volumetric flasks and make up to 100 mL
with distilled water. The standard solutions prepared in this way contain 0.25,
0.50, 0.75 and 1.0 mg of magnesium per liter respectively. These solutions
should be kept in polyethylene bottles.
4.3 Determination
Set the absorption wavelength to 285 nm. Zero the absorbance scale using
distilled water. Aspirate the diluted wine directly into the spectrophotometer,
followed in succession by the standard solutions (4.2).
Record the absorbance of each solution and repeat each measurement.
Plot a graph showing the variation in absorbance as a function of the
magnesium concentration in the standard solutions.
MA-E-AS322-07-MAGNES 1
Magnesium
Record the mean value of absorbance with the diluted sample of wine on this
graph and read off the magnesium concentration C in milligrams per liter.
The magnesium concentration in milligrams per liter of the wine to the
nearest whole number is given by:
100 x C
5.2 Repeatability (r): r = 3 mg/L.
5.3 Reproducibility (R): R = 8 mg/L.
MA-E-AS322-07-MAGNES 2
Zinc
Zinc
1. Principle
After removal of alcohol, zinc is determined directly in the wine by atomic
absorption spectrophotometry.
2. Apparatus
2.1 Rotary evaporator and thermostatically controlled water bath.
2.2 Atomic absorption spectrophotometer equipped with an air-acetylene burner.
2.3 Zinc hollow cathode lamp.
3. Reagents
The water used must be double distilled in borosilicate glass apparatus or of an
equivalent degree of purity.
3.1 Standard solution containing zinc, 1 g/L
Use of a commercial standard zinc solution is preferred. Alternatively this so-
lution may be prepared by dissolving 4.3975 g of zinc sulfate, ZnS04.7H20,
in water and making up the volume to one liter.
3.2 Dilute standard solution containing 100 mg of zinc per liter.
4. Procedure
Remove the alcohol from 100 mL of wine by reducing the volume of the
sample to half its original value using a rotary evaporator (50 to 60 C).
Make up to the original volume of 100 ml, with double distilled water.
4.2 Calibration
Place 0.5, 1, 1.5 and 2 ml, of the solution containing 100 mg zinc per liter
into each one of four 100 mL volumetric flasks and make up to the mark with
double distilled water. The solutions prepared in this way contain 0.5, 1, 1.5
and 2 mg of zinc per liter respectively.
4.3 Determination
double distilled water. Aspirate the wine directly into the burner of the
spectrophotometer, followed in succession by the four standard solutions.
Record the absorbance and repeat each measurement.
Plot a graph giving the variation in absorbance as a function of zinc
concentration in the standard solutions. Record the mean value of the
absorbance obtained with the diluted wine sample on this graph and determine
its zinc concentration to one decimal place.
MA-E-AS322-08-ZINC 1
Silver
Silver
1. Principle
The method is based on the use of atomic absorption spectrophotometry after
ashing the sample.
2. Apparatus
2.1 Platinum dish.
2.2 Water bath, thermostatically controlled to 100 C
2.3 Furnace set at 500 to 525 C.
2.4 Atomic absorption spectrophotometer.
2.5 Silver hollow cathode lamp.
2.6 Gas supplies: air, acetylene.
3. Reagents
3.1 Silver nitrate, AgN03.
3.2 Nitric acid, (20 = 1.38 g/mL), 65%.
3.3 Nitric acid, diluted 1/10 (v/v) with distilled water.
3.4 Solution containing 1 g of silver per L.
Use of a standard commercial silver solution is preferred. Alternatively this
solution may be prepared by dissolving 1.575 g of silver nitrate in dilute
nitric acid and making up to a volume of 1,000 mL with dilute nitric acid
(3.3).
3.5 Solution containing 10 mg of silver per L.
Take 10 mL of the 1 mg/L solution and make up to 1 L with dilute nitric acid.
4. Procedure
Place 20 mL of the sample in a platinum dish and evaporate to dryness over a
boiling water bath. Ash in the furnace at a temperature of 500 to 525 C.
Moisten the white ash with 1 mL of concentrated nitric acid (3.2). Evaporate
over a boiling water bath, repeat the addition of 1 mL nitric acid (3.2) and
evaporate a second time. Add 5 mL of dilute nitric acid (3.3) and heat gently
until dissolved.
4.2 Calibration
Pipette 2, 4, 6, 8, 10 and 20 mL of solution (3.5) respectively into each of
size 100 mL volumetric flasks and make up to the mark with dilute nitric acid
(3.3): the solutions contain 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.0 and 2.0 mg of silver
per liter respectively.
MA-E-AS322-09-ARGENT 1
Silver
4.3 Set the absorbance wavelength to 328.1 nm. Adjust zero using double
distilled water. Measure the absorbance directly of successive standard
solutions (4.2) and carry out in duplicate.
Plot a graph showing the variation in absorbance as a function of the silver
Using the measured absorbance of the sample read the concentration C in mg/L
from the calibration curve.
The concentration of silver in the wine is given in milligrams per liter by
0.25 x C.
It is quoted to two decimal places.
Note: Select the concentration of the solutions for the preparation of the
calibration curve. The volume of sample taken and the final volume of the liquid
should be appropriate for the sensitivity of the apparatus to be used.
MA-E-AS322-09-ARGENT 2
Cadium
Cadmium
1. Principle
Cadmium is determined directly in the wine by graphite furnace atomic
absorption spectrophotometry.
2. Apparatus
All the glassware must be washed in concentrated nitric acid prior to use, heated
to 70 to 80 C and rinsed in double distilled water.
2.1 Atomic absorption spectrophotometer equipped with a graphite furnace,
background correction and a recorder.
2.2 Cadmium hollow cathode lamp
2.3 5 l micropipettes with special tips for atomic absorption measurement.
3. Reagents
The water used must be double distilled prepared using borosilicate glass
apparatus, or water of a similar purity. All reagents must be of recognized
analytical reagent grade and, in particular, free of cadmium.
3.1 Phosphoric acid (20 = 1.71 g/mL), 85%.
3.2 Phosphoric acid solution obtained by diluting 8 mL of phosphoric acid with
water to 100 mL.
3.3 0.02 M Ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA) solution.
3.4 pH 9 buffer solution: dissolve 5.4 g of ammonium chloride in a few
milliliters of water in a 100 mL volumetric flask, add 35 mL of 25% (v/v)
ammonium hydroxide solution. Ammonium hydroxide solution, 20 = 0.92
g/mL, diluted to 25% (v/v) and made up to 100 mL with water.
3.5 Eriochrome black T, 1% (m/m) solution in sodium chloride.
3.6 Cadmium sulfate, 3CdSO4.8H20.
The concentration of the cadmium sulfate must be verified using the
following method:
Weigh exactly 102.6 mg of the cadmium sulfate sample into a beaker with
some water and shake until dissolved; add 5 mL of the pH 9 buffer solution
and approximately 20 mg of Eriochrome black T. Titrate with the EDTA
solution (3.3) until the indicator begins to turn blue.
The volume of EDTA added must be equal to 20 mL. If the volume is
slightly different, correct the weighed test portion of cadmium sulfate used
in the preparation of the reference solution accordingly.
MA-E-AS322-10-CADMIU 1
Cadium
3.7 Cadmium reference solution at 1 g per liter.

Use of a standard commercial solution is preferred. Alternatively this
solution may be prepared by dissolving 2.2820 g of cadmium sulfate in
water and making up to one liter. Keep the solution in a borosilicate glass
bottle with a ground glass stopper.
4. Procedure
4.1 Preparation of the sample
The wine is diluted 1/2 (v/v) with the phosphoric acid solution (3.2).
4.2 Preparation of calibration standards
Using the cadmium reference solution, prepare successive dilutions 2.5, 5,
10 and 15 g of cadmium per liter respectively.
4.3 Determination
4.3.1 Furnace Programming (for guidance only):
Dry at 100C for 30 seconds
Mineralize at 900 C for 20 seconds
Atomize at 2250 C for 2 to 3 seconds
Nitrogen flow (flushing gas): 6 liters/minute
Note: At the end of the procedure, increase the temperature to 2700 C to
clean the furnace.
4.3.2 Atomic absorption measurements
Select an absorption wavelength of 228.8 nm. Set the zero on the absorbance
scale with double distilled water. Using a micropipette, introduce into the
furnace three 5 l portions of each of the solutions in the calibration range
and the sample solution to be analyzed. Record the absorbance measured.
Calculate the mean absorbance value from the results for the three portions.
Draw the absorbance variation curve as a function of the concentration of
cadmium in the solutions in the calibration range. The curve is linear. Enter
the mean absorbance value of the sample solution on the calibration curve
and obtain the cadmium concentration C. The cadmium concentration
expressed in micrograms per liter of wine is equal to 2C.
BIBLIOGRAPHY
MEDINA B., Application de la spectromtrie d absorption atomique sans
flamme au dosage de quelques mtaux dans les vins, Thse Doct. en nologie,
Bordeaux II, 1978.
MEDINA B. and SUDRAUD P., FV O.I.V 1979, n 695.
MA-E-AS322-10-CADMIU 2
Lead
Lead
Resolution oeno 3/94
1. Principle of the method

Lead is determined directly in wine by flameless atomic absorption
spectrophotometry.
2. Equipment
All the glassware must be washed in advance with warm concentrated nitric acid
(70-80C) and rinsed with double distilled water.
2.1. Atomic absorption spectrophotometer equipped with a graphite furnace, a
non specific absorption corrector and a potentiometric recorder.
2.2. Lead hollow cathode lamp.
2.3. 5l micropipettes fitted with special tips for atomic absorption
measurements.
3. Reagents
All the reagents must be of recognized analytical purity and, in particular must be
free of lead. The water used must either be double-distilled water in a borosilicate
glass apparatus or be of an equivalent purity.
3.1. Phosphoric acid of 85 % (20 = 1.71g/mL).
3.2. Phosphoric acid solution obtained by diluting 6 mL of phosphoric acid to 100
mL with water.
3.3. Nitric acid (20 = 1.38 g/mL)
3.4. Lead solution at 1 g/L.
Preferably use a commercial standard solution. This solution may also be
obtained by dissolving 1.600 g of lead nitrate II, Pb(NO3)2 in nitric acid
diluted to 1% by volume and adjusting the volume to 1 liter. Store the
solution in a borosilicate glass flask with a ground stopper.
3.5. Solution of nitric acid diluted to 1% by volume.
3.6. Solution obtained by diluting the 6 % phosphoric acid solution in half with
the 1% nitric acid solution.
4. Procedure
4.1. Preparation of the sample
Add to the wine to be analyzed an equal volume of the solution (3.6.) of nitric
and phosphoric acids. Determine its absorbance. If it is higher than 0.6,
further dilute the wine (a 1:5 dilution suffices in most cases).
Prepare the solution to be determined by adding to the diluted wine to be
analyzed, an equal volume of the solution of phosphoric and nitric acids.
MA-E-AS322-11-PLOMB 1
Lead
4.2. Preparation of solutions for the calibration scale

Starting with the lead reference solution, prepare dilutions containing the
50% solution of nitric and phosphoric acids (3.6). The concentration levels
of the standard solutions depend on the sensitivity of the apparatus. For
example, prepare solutions containing 10 - 20 - 30 - micrograms of lead per
liter.
4.3. Determination
4.3.1. Program of the furnace:
Stage Temperature Time Nitrogen(1) Reading
(C) (seconds) L/min
1 75 2.0 3.0
2 95 20.0 3.0
3 140 15.0 3.0
4 300 8.0 3.0
5 450 7.0 3.0
6 480 10.0 3.0
7 900 20.0 3.0
8 900 1.0 0.0
9 2 250 0.7 0.0 *
10 2 250 1.0 0.0 *
11 2 250 2.0 3.0
(1)
Argon could be substituted for nitrogen, subject to similar results.
4.3.2. Measurements
Select a wavelength of 283.3 nm. Set zero absorbance with double-distilled
water. With a micropipette or an automatic sample injector, make triplicate
5 microliter injections of each of the standard solutions and of the sample to be
analyzed. Record the absorbance measurements. Calculate the average value of
the absorbance based on the results of the 3 injections. Absorbencies are
measured at peak values.
5. Expression of the results
5.1. Calculation
Plot the curve of the absorbance variations as a function of lead concentrations
of the standard solutions. The variation is linear. Write out the average value of
the absorbance of the sample solution from the standard curve, deducing from
it the concentration C of lead. The lead concentration expressed in micrograms
per liter of wine is equal to: C x F.
F = the dilution factor.
Lead
5.2. Repeatability r = 9.4 g/L

5.3. Reproducibility R = 15 g/L
BIBLIOGRAPHY
MEDINA B. Application de la spectromtrie d'absorption atomique sans flamme

au dosage de quelques mtaux dans les vins. Thse Doc. en Oenologie, Bordeaux,
11, 1978.
MEDINA B & SUDRAUD P., Green Paper O.I.V. 1979, n 695.
O.I.V. Compendium of International Methods of Analysis of Wines and Musts, lead

233-234; O.I.V., 11 rue Roqupine, Paris (1990).
TEISSEDRE P.L., CABANIS M.T., CABANIS J.C., Comparaison de deux

mthodes de minralisation en vue du dosage du plomb par spectromtrie
d'absorption atomique lectrothermique.
Application des chantillons de sols, feuilles de vigne, raisins, mots et lies.
Analysis in press (1993).
Arsenic
Arsenic
1. Principle
1.1 Reference Method
After mineralization, using sulfuric and nitric acids, arsenic V is reduced to
arsenic III by means of potassium iodide in hydrochloric acid and the arsenic
is transformed into arsenic III hydride (H3As) using sodium borohydride.
The arsenic III hydride formed is carried by nitrogen gas and determined by
flameless atomic absorption spectrophotometry at high temperature.
1.2 Usual method
After mineralization using sulfuric and nitric acids, arsenic V is reduced to
arsenic III using tin II chloride. The arsenic is then converted into arsenic III
hydride by the action of the hydrogen produced. Arsenic III hydride is
detected by reaction with mercury II bromide (limit sample).
Quantification of arsenic is achieved by measuring the absorption of a red
colored complex at 520 nm, formed by the addition of silver
diethyldithiocarbamate to arsenic III hydride.
This method is applicable for the determination of between 2 and 20
micrograms of arsenic.
2. Reference Method
2.1 Apparatus
2.1.1 Kjeldahl flask (borosilicate glass)
2.1.2 Atomic absorption spectrophotometer equipped with arsenic hollow
cathode lamp, hydride generator, background corrector and a chart recorder.
The hydride generator includes a reaction flask (which can eventually be put
onto a magnetic stirrer) connected by a tube to a nitrogen gas supply (flow
rate: 11 L/min) and by a second tube, to a quartz cell which can be brought
to a temperature of 900 oC. The reaction flask also has an opening for the
introduction of the reagent (borohydride).
2.2 Reagents
All reagents must be of recognized analytically pure quality, and in particular
free of arsenic. Double distilled water prepared using a borosilicate glass
flask or water of similar purity should be used.
2.2.1 Sulfuric acid (20 = 1.84 g/mL) arsenic free
2.2.2 Nitric acid (20 = 1.38 g/mL) arsenic free
2.2.3 Hydrochloric acid (20 = 1.19 g/mL), arsenic free
2.2.4 10% (m/v) Potassium iodide solution
MA-E-AS323-01-ARSENI 1
Arsenic
2.2.5 2.5% (m/v) Sodium borohydride solution obtained by dissolving 2.5 g

of sodium borohydride in 100 mL of 4 % (m/v) of sodium hydroxide
solution. This solution must be prepared at the time of use.
2.2.6 Arsenic reference solution 1 g/L. Use of a commercial standard
arsenic solution is preferred.
Alternatively this solution can be prepared in a 1000 mL volumetric flask, by
dissolving 1.320 g of arsenic III trioxide As2O3 in a minimal volume of 20
% (m/v) sodium hydroxide. The solution is then acidified with hydrochloric
acid, diluted 1/2, and made up to 1 liter with water.
2.3 Procedure
2.3.1 Mineralization
Place 20 mL of wine in a Kjeldahl flask, boil and reduce the volume by half
to eliminate alcohol. Allow to cool. Add 5 mL sulfuric acid, and slowly add
5 mL nitric acid and heat. As soon as the liquid turns brown, add just enough
nitric acid, dropwise, to lighten the liquid while simmering. Continue until
the color clears and white sulfur trioxide fumes are formed above the
solution.
Allow to cool, add 10 mL distilled water, bring back to the boil and simmer
until nitrous oxide and sulfur trioxide fumes are no longer produced. Allow
to cool and repeat the operation.
Allow to cool and dilute the sulfuric acid residue with a few milliliters of
distilled water. Quantitatively transfer the solution into a 40 mL flask, and
rinse the flask with water, combine with the diluted residue and make up to
the mark with distilled water.
2.3.2 Determination
2.3.2.1 Preparation of the solution
Place 10 mL of the mineralization solution (2.3.1) into the hydride generator
reactor flask. Add 10 mL hydrochloric acid, 1.5 mL potassium iodide
solution, then switch on the magnetic stirrer and the nitrogen gas (flow rate:
11 L/minute). After 10 sec, add 5 mL of sodium borohydride solution. The
hydride vapor obtained is immediately carried to the measurement cell (at a
temperature of 900C) by nitrogen carrier gas, where dissociation of the
compound and arsenic atomization occurs.
2.3.2.2 Preparation of standard solutions
From the arsenic reference solution (2.2.6), prepare dilutions having
concentrations of 1, 2, 3, 4 and 5 micrograms of arsenic per liter
respectively. Place 10 mL of each of the prepared solutions into the reactor
flask of the hydride generator and analyze according to 2.3.2.1.
Arsenic
2.3.2.3 Measurements
Select an absorption wavelength of 193.7 nm. Zero the spectrophotometer
using double distilled water and carry out all determinations in duplicate.
Record the absorbance of each sample and standard solution. Calculate the
average absorbance for each of these solutions.
2.4.1 Calculation
Plot the curve showing the variation in absorbance as a function of the
arsenic concentration in the standard solutions. The relationship is linear.
Note the average absorbance of the sample solutions on the graph and read
the arsenic concentration C.
The arsenic concentration in wine, expressed in micrograms per liter is given
by: 2 C.
3. Usual method
3.1 Apparatus
3.1.1 Mineralization
500 mL Kjeldahl flask (borosilicate glass)
3.1.2 Limit test
The apparatus (fig.1) consists of a 100 mL conical flask provided with a tube
200 mm long and 5 mm internal diameter fitted with a matching ground glass
socket. The lower part of the tube is tapered until the internal diameter
becomes 1 mm. The tube has a lateral opening of 2-3 mm in diameter
(anti-priming device), 30 mm above the tapered end of the tube. The other
end has a flat ground glass joint perpendicular to the tube axis. This is
connected to another glass tube of the same internal diameter and 300 mm in
length that has a similar ground glass flange. The ground glass flanges are
placed together and kept in place by two springs.
3.1.3 Quantitative determination
3.1.3.1 Apparatus to determine arsenic
The apparatus (fig.2) consists of a 100 mL conical flask with a ground glass
stopper provided with a 6 mm internal diameter glass tube bent at 90 degrees
to the main axis. The lower part of the tube is tapered and pierced by a
lateral aperture (anti-priming device). The other end has a spherical ground
glass joint, which is joined to another tube of same diameter, with a
corresponding joint, bent at right angles and tapered at the end. A steam
receiver is made from a 10 mL measuring cylinder, graduated by 0.1 mL
increments, to hold the tapered tube.
3.1.3.2 Spectrophotometer set to measure absorbance at 520 nm using cells
of 1 cm path length.
Arsenic
B
Glass wool
A
= 6 mm
Fig.1: Apparatus used in the limit

80 mm
test of arsenic
Fig 2: Apparatus used in the determination of

arsenic
Arsenic
3.2 Reagents
All reagents must be recognized analytical quality and in particular free of
arsenic. Use double distilled water produced using borosilicate glass
apparatus or equivalent pure water.
3.2.1 Sulfuric acid (20 = 1.84 g/mL) arsenic free
3.2.2 Nitric acid (20 = 1.38 g/mL) arsenic free
3.2.3 Platinized zinc
Pure zinc, free of arsenic, in a granular or cylindrical form. Place all of the
zinc in a round bottom flask, pour platinum chloride solution, 0.05 g/L, to
cover the zinc. Leave for 30 minutes, wash with distilled water, dry the
platinized zinc on square of blotting paper folded in several layers. Dry and
store in dry containers. The platinized zinc must be subjected to the
preliminary test (3.3.1.2).
3.2.4 Glass wool impregnated with lead acetate
Place cotton wool in a mixture of 10 volumes of lead acetate solution,
0.25 M, and 1 volume of acetic acid solution, approximately 2 M. Squeeze
the cotton wool under several layers of blotting paper. Allow to dry. Store
in sealed containers.
3.2.5 Mercury II bromide paper
2
Place a white filter paper (density 80 g/m , filtration speed 40 to 60 sec)
15 x 200 mm folded in half, into a rectangular tub containing mercury II
bromide solution at 5 g/100 mL of ethanol. Leave to dry in a dark room on
a non-metallic line. Cut 1 cm off each end. Cut the rest of the paper into
squares measuring 15 x 15 mm. Keep wrapped in black paper in a ground
glass stoppered container.
3.2.6 Tin II chloride solution (SnCl2.2H20)
Treat 20 g of cold granulated tin with 100 mL of concentrated hydrochloric
acid (20 = 1.19 g/mL). Store over metallic tin in an airtight jar fitted with
safety valve (to avoid excessive pressure).
3.2.7 Aqueous solution of potassium iodide 10 g/100 mL.
3.2.8 Concentrated reference solution of arsenic V, 1 g/L.
Use of a standard commercial solution, 1 g/L, is preferred. Alternatively
this solution can be prepared by dissolving 264 mg of pure and dry arsenic
trioxide, As2O3, into 10 mL of 1 M sodium hydroxide. Make up to 100 mL
with water, add 15 mL of 1 M hydrochloric acid and 2 drops of bromine.
Bring to boil to get rid of excess bromine, cool, transfer quantitatively into a
200 mL volumetric flask and make up to the mark with water. This solution
contains 1 g of arsenic V per liter. It is very stable.
Arsenic
3.2.9 Diluted reference arsenic V solution, 10 mg/L.

Place 10 mL of solution 3.2.8 in a 1 L volumetric flask. Make up to 1 liter
with water. This solution contains 10 mg arsenic V per liter.
3.2.10 Potassium hydroxide in granular form
3.2.11 Chloroform
3.2.12 L-ephedrine
3.2.13 Silver diethyldithiocarbamate
3.2.14 Silver diethyldithiocarbamate solution
Dissolve 0.4 g of L-ephedrine in approximately 200 mL of chloroform, add
0.6 g of silver diethyldithiocarbamate, shake for 15 to 20 min., filter and
make up to 250 mL with chloroform.
This reagent can be stored in amber, ground glass stoppered flasks, in
darkness, in a refrigerator for up to two weeks.
3.3 Procedure
3.3.1 Limit test
This test is to check that the wine or must contains less than 0.2 g per liter of
arsenic.
3.3.1.1 Preparation of the apparatus (3.1.2)
Place a cotton plug of lead acetate weighing 50 to 60 g in the lower part of
the exit tube (A) (fig. 1) and a square mercury II bromide paper between the
two ground surfaces of the tube (B).
3.3.1.2 Preliminary test: check zinc reaction
Place 35 mL of distilled water into a conical flask and add 0.2 mL of diluted
reference solution (3.2.9). Add 5 mL of sulfuric acid, 2 drops of tin II
chloride and 5 mL potassium iodide solution. Leave for 15 min. Add 5g of
platinized zinc. Immediately connect the 2 parts of the apparatus together
and immerse the flask in a cold water-bath. Leave in darkness for at least
2 hours. A very distinct yellow stain will appear on the mercury II bromide
reagent paper.
3.3.1.3 Limit test
3.3.1.3.1 Mineralization
Place 10 mL of wine and 5 mL sulfuric acid into a 500 mL Kjeldahl flask
and bring to a boil to remove the alcohol. Leave to cool. Add 10 mL nitric
acid and bring to a boil again. When the liquid starts to turn brown, add
drop by drop just enough nitric acid to lighten the liquid while simmering.
Continue until the solution clears and concentrated white fumes appear above
Arsenic
the liquid. Cool, add 10 mL of distilled water, and bring to a boil and
continue heating until nitrous oxide and sulfur trioxide vapors are no longer
visible. Cool, repeat the operation and cool again. Dilute the sulfuric
residue with a few milliliters of distilled water. Transfer quantitatively to a
40 mL volumetric flask, rinse the reaction flask with water, combine the
rinsings and initial solution and make up to 40 mL with water.
3.3.1.3.2 Test
Place all of the mineralization solution (3.3.1.3.1) (40 mL) into a conical
flask, add 2 drops of tin II chloride solution (3.2.6), 5 mL potassium iodide
solution (3.2.7) and proceed according to the procedure described in 3.3.1.2.
No stain should appear on the mercury II bromide paper or the yellow stain
should be of a lesser intensity to the one produced in sample test (3.3.1.2).
3.3.2 Quantitative Determination.
3.3.2.1 Preparation of apparatus:
Place glass wool at the bottom of the exit tube described in 3.1.3.1. and add
a layer of potassium hydride tablets 6 to 8 cm high. Fit the second part of
the exit tube and the steam receiver containing 4 mL of silver
diethyldithiocarbamate. Cool the reagent by immersing the steam receiver in
a water-bath.
3.3.2.2 Preliminary test: check zinc and silver diethyldithiocarbamate
reaction.
Place in the conical flask (3.1.3.1), approximately 35 mL of distilled water
and 0.5 mL of diluted arsenic V reference solution (3.2.9). Add 5 mL
sulfuric acid (3.2.1), cool and add 2 drops of tin II chloride solution (3.2.6),
followed by 5 mL of potassium chloride solution. Leave for 15 min. Add
5 g of platinized zinc and immediately fit the exit tube. Immerse the conical
flask in a cold water-bath. Place the entire apparatus in darkness. Leave for
at least 1 hour. Remove the exit tube and readjust the silver
diethyldithiocarbamate volume in the steam tube to 4 mL. Mix thoroughly.
Measure the absorbance of the steam receiver solution at 520 nm in
comparison to the sample solution of silver diethyldithiocarbamate. The
absorbance should at least be equal to 0.12.
3.3.2.3 Determination.
3.3.2.3.1 Mineralization.
Proceed as described in 3.3.1.3.1. but use 5, 10 or 20 mL of wine according
to the stain intensity observed in the limit test (3.3.1.3.2.). The volume of
wine used must contain between 2 and 20 micrograms of arsenic.
Arsenic
3.3.2.3.2 Determination.
Place in a conical flask the total volume (40 mL) of mineralization solution
(3.3.2.3.1), add 2 drops of tin II chloride solution, then 5 mL of potassium
iodide and proceed as described in 3.3.2.2.
Plot the measured absorbance using the procedure described in 3.3.2.2 using
successively 0.5, 1, 1.5 and 2 mL of diluted arsenic V reference solution
(3.2.9) which correspond to 5, 10, 15 and 20 mg of arsenic.
3.3.2.4 Expression of results.
The content of arsenic in milligrams per liter of wine is given by:
m/v
m = arsenic mass expressed in micrograms read on calibration curve
v = volume of wine in mL
BIBLIOGRAPHY
JAULMES P. et HAMELLE G., Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1967, 27, no 3,

213-225.
JAULMES P., F.V., O.I.V., 1967, no 238
MEDINA B et SUDRAUD P., F.V., O.I.V., 1983, no 770.
Arsenic - Atomic absorption
DETERMINATION OF ARSENIC IN WINE

BY ATOMIC ABSORPTION SPECTROMETRE
(Resolution Oeno 14/2002)
1. PRINCIPLE
After evaporating ethyl alcohol and reducing the arsenic V in arsenic III, wine
arsenic is measured by hydride generation and by atomic absorption
spectrometry.
2. EQUIPMENT
2.1. Glass ware:
2.1.1. Graduated flask 50, 100 ml (class A)
2.1.2. Graduated pipettes 1, 5, 10, 25 ml (class A)
2.2. Water bath at 100C
2.3. Filters without ashes
2.4. Spectrophotometer :
2.4.1. Atomic absorption spectrophotometer
2.4.2. Instrumental parameters
2.4.2.1. Air-acetylene oxidising flame
2.4.2.2 Hollow cathode lamp (arsenic)
2.4.2.3. Wave length: 193.7 nm
2.4.2.4. Split width: 1.0 nm
2.4.2.5. Intensity of hollow cathode lamp: 7 mA
2.4.2.6. Correction of non-specified absorption with a deuterium
lamp
2.5. Accessories:
2.5.1. Hydride absorption cell, placed on an air-acetylene burner.
2.5.2. Vapour generator (liquid gas separator)
2.5.3. Neutral gas (argon)
MA-E-AS323-01-ASSAA 1
Hydride absorption cell

Placed on an air acetylene burner
Optical path through hollow cathode lamp
Drying tube Reaction Peristaltic

loop pump
Liquid gas Reference or sample

separator Hydrochloric acid Sodium 10%
borohydride
Towards sink
Flow controller Neutral gas (argon)
Figure 1. Hydride generator.
3. REAGENTS
3.1. Ultra-pure demineralised water

3.2. Ultra-pure 65% nitric acid
3.3. Potassium iodide (KI)
3.4. 10% . Potassium iodide (m/v)
3.5. Concentrated hydrochloric acid (R)
3.6. 10% Hydrochloric acid (R)
3.7. Sodium borohydride (NaBH4)
3.8. Sodium hydroxide (NaOH)
3.9. 0.6% Sodium borohydride (containing sodium hydroxide: 0.5% (m/v))
3.10. Calcium Chloride CaCl2 (used as a drying agent)
3.11. 1 g/l Arsenic stock solution prepared in the following manner :
dissolve 1.5339 g of AS2O5 in demineralised water, adjust to 1 l.
3.12. 10 mg/l Arsenic solution: place 1 ml of stock solution (3.11.) in a

100 ml flask (2.1.1.) ; add 1 % nitric acid (3.2.) ; fill up to volume with
demineralised water (3.1.).
3.13. 100 g/l Arsenic solution: place 1 ml of 10 mg/l arsenic solution

(3.12.) in a 100 ml flask (2.1.1.) ; fill up to volume with demineralised
water (3.1.).
3.14. Set of callibration standards: 0, 5, 10, 25 g/l

Successively place 0, 5, 10, 25 ml of 100 g/l arsenic solution (3.13.) in 4
100 ml flasks (2.1.1.) ; add 10 ml of 10% potassium iodide to each flask
(3.4.) and 10 ml of concentrated hydrochloric acid (3.5.) ; leave for 1 hour,
fill up to 100 ml with demineralised water.
4. SAMPLE PREPARATION
25 ml of water is evaporated over a 100 C water bath. This is then brought to 50
ml in the presence of 5 ml of 10% potassium iodide and 5 ml of concentrated
hydrochloric acid; leave for 1 hour; filter on an ashless filter.
Make a blank reference sample.
5. DETERMINATION
The peristaltic pump sucks in the borohydride solution, the 10% hydrochloric acid
solution and the sample solution.
Present the calibration standards in succession (3.14.); take an absorbency reading
for 10 seconds; take two readings; the operating software establishes a calibration
curve (absorbency according to concentration of arsenic in g/l).
Then present the samples (4) ; the software establishes the samples arsenic
concentration in g/l; deduct the arsenic concentration in the wine in g/l taking
into account that the solution be diluted by 1 / 2 .
6. QUALITY CONTROL
Quality control is assured by placing a control sample of internal quality (*) in a
regular manner in 5 samples, or after the set of calibration solutions, or in the
middle of a series or at the end the measurement.
Two deviation types are accepted compared to known value.
(*) Samples from the Bureau Communautaire de Rfrence (Community Bureau of
reference): red wine, dry white wine and sweet white wine.
7. BIBLIOGRAPHY
Varian Techtron, 1972. Analytical methods for flame spectroscopy.
Hobbins B., 1982. Arsenic Determination by Hydride Generation. Varian

Instruments at Work.
Le Houillier R., 1986. Use of Drierite Trap to Extend the Lifetime of Vapor
Generation Absorption Cell. Varian Instruments at Work.
Varian, 1994. Vapor Generation Accessory VGA-77.
Total nitrogen (Dumas method)
QUANTIFICATION OF TOTAL NITROGEN

ACCORDING TO THE DUMAS METHOD
(Musts and Wines)
(Rsolution Oeno 13/2002)
1 - FIELD OF APPLICATION
This method can be applied to the analysis of total nitrogen in musts and
wine within the range of 0 to 1000 mg/l.
2 - DESCRIPTION OF THE TECHNIQUE

2.1 - Principle of the Dumas method
The analysis of total nitrogen in an organic matrix can be carried out using
the Dumas method (1831). This involves a total combustion of the matrix
under oxygen. The gases produced are reduced by copper and then dried,
while the CO2 is trapped. The nitrogen is then quantified using a universal
detector.
2.2 - Principle of the analysis (Figure n 1)

- Injection of the sample and oxygen in the combustion tube at 940C (1) ;
- Flash Combustion (2) ;
- The combustion of the gathering ring (3) brings the temperature
temporarily up to 1800C ;
- Complementary oxidation and halogen trappings on silver cobalt and
granular chromium sesquioxide (4) ;
- Reduction of nitrogen oxides in N2 and trapping sulphur components and
excess oxygen by copper at 700C (5) ;
- Gases in helium include: N2, CO2 and H2O (6) ;
- Trapping unmeasured elements: H2O using anhydrone (granular anhydrous
magnesium perchlorate) (7) and CO2 by ascarite (sodium hydroxide on silica)
(8) ;
- Chromatography separation of nitrogen and methane possibly present
following very large trial uptake (9) ;
- Catharometer detection (10) ;
- Signal gathering and data processing (11).
MA-E-AS323-02-AZOTDU 1
111
6
He
11
110
22
77
33
55
88
99
44
Figure 1 : Diagram of analysis principle
3 Reagents and preparation of reactive solutions
3.1 - Nitrogen (technical quality) ;

3.2 - Helium (purity 99.99994%) ;
3.3 Chromium oxide (chromium sesquioxide me in granules) ;
3.4 Cobalt Oxide (silver granule cobalto-cobaltic oxide ) ;
3.5 Quartz wool ;
3.6 - Copper (reduced copper in strings) ;
3.7 - Ascarite (sodium hydroxide on silica) ;

3.8 - Anhydrone (granular anhydrous magnesium perchlorate) ;
3.9 - Oxygen (purity 99.995%) ;
3.10 - Atropine ;
3.11 Glumatic-hydric chloride acid;
3.12 Demineralised water;
3.13 Tin boat.
4 - Apparatus
4.1 - Centrifuge with 25 ml pots;
4.2 Nitrogen analyser;
4.3 Metallic crucible;
4.4 - Quartz reaction tube (2) ;
4.5 Precision balance between 0.5 mg and 30 g at 0.3 mg ;
4.6 Boat carrier;
4.7.- Furnace;
4.8 Apparatus for folding boats;
4.9 Sample changer;
4.10 Computer and printer.
5 - SAMPLING
Degas by nitrogen bubbling (3.1) for 5 to 10 mn, sparkling wine. The musts
are centrifuged (4.1) for 10 mn at 10C, at 4200 g.
6 OPERATING INSTRUCTIONS
- Open the apparatus programme (4.2 and 4.10) ;
- Put the heating on the apparatus (4.2).
6.1 Principle analytical parameters

Nitrogen analyser (4.2) under the following conditions:
gas carrier: helium (3.2) ;
metallic crucible (4.3) to be emptied every 80 analyses ;
oxidation tube (4.4), heated to 940 C, containing chromium oxide (3.3) and
cobalt oxide(3.4) held back by quartz wool (3.5). The tube and reagent set
must be changed every 4000 analyses ;
reduction tube (4.4), heated to 700 C, containing copper (3.6) held

back by the quartz wool (3.5). The copper is changed every 450
analyses;
absorption tube, containing 2/3 of ascarite (3.7) and 1/3 anhydrone
(3.8). the ascarite which is taken in block is eliminated and replaced
every 200 analyses. The absorbers are completely changed once a
year.
The more organic matter to be burned, the more oxygen is needed:
the oxygen sampling valve (3.9) is 15 seconds for musts and 5
seconds for wine.
NOTE : The metals are recuperated and sent to a centre for

destruction or specialised recycling.
6.2 - Preparation of standard scale

Prepare two samples of atropine (3.10) between 4 to 6 mg. Weigh
them (4.5) directly with the boat. The calibration scale goes through 3
points (origin = empty boat).
6.3 Preparation of internal standards

Internal standards are used regularly in the beginning and in the middle of
analyses.
Internal checks are carried out using glumatic acid in the form of
hydrochloride at 600 mg N/l in demineralised water (3.12).
Molar mass of glumatic acid = 183.59

Molar mass of nitrogen = 14.007
. 0.6
18359
14.007 = 7.864 g/l
Weigh (4.5) 7.864 g of glumatic acid (3.11) and dilute in
demineralised water (3.12) qsp/l, to obtain a 600 mg N/l solution.
This solution is diluted by 50% to obtain a 300 mg N/l solution,
which is diluted by 50% again to obtain 150 mg/l solution.
6.4 - Preparation of samples:

6.4.1 In a boat (3.13), weigh (to the nearest 0.01 mg) 20 l of must or
200 l of wine with a precision balance (4.5). Repeat this
procedure three times per sample;
6.4.2 Write down the mass
6.4.3 Place the boats progressively in the boat carrier (4.6) ;
6.4.4 Place the boats in the furnace (4.7) set at ~ 60 C, until the liquid
has completely evaporated (this requires at least one hour) ;
6.4.5 Fold and crush the boats with an appropriate apparatus (4.8), put
them in the changer (4.9) in number order.
7 - EXPRESSION OF RESULTS
Results are expressed in g/l to the fourth decimal.
8 CHECKING RESULTS
Splicing by mass, temperature, and volume.
9- PERFORMANCE CHARACTERISTICS OF THE METHOD
Number of
Average contents Repeatability Reproductibility
laboratories
11 591 mg/l 43 mg/l 43 mg/l
10 - BIBLIOGRAPHY
Dumas A. (1826) : Annales de chimie, 33,342.

Buckee G.K. (1994) : Determination of total nitrogen in Barley, Malt and Beer
by Kjeldahl procedures and the Dumas combustion method. Collaborative
trial. J. Inst. Brew., 100, 57-64.
Total nitrogen
Total Nitrogen
1. Principle
The sample is wet ashed using sulfuric acid in the presence of a catalyst. The
ammonia liberated by sodium hydroxide is determined titrimetrically.
2. Apparatus
2.1 Digestion apparatus
300 mL Kjeldahl flask. Place on a metal heating mantle. Appropriate stand to
hold this apparatus, the neck bent at 45 degrees.
2.2 Distillation apparatus
1 liter round bottomed flask, fitted with a small rectifying column 30 cm long
by 2.5 cm diameter or any other equivalent apparatus. The vapor emitted
from the end of this apparatus enters into the top part of the cylindrical
condenser, held vertically, of 30 cm length and 1 cm internal diameter. The
condensed liquid is brought to the receiving conical flask by a drawn-out tube
placed at the bottom alternatively one can use a steam distillation apparatus
such as described in Volatile Acidity, or any other apparatus relating to the
test described in paragraph "Blank tests or sample tests".
3. Reagents
3.1 Sulfuric acid free of ammonia (20 = 1.83 - 1.84g/mL)
3.2 Benzoic acid
3.3 Catalyst:
Copper sulfate, CuSO4, ................................................. 10 g
Potassium sulfate, K2SO4, ............................................. 100 g
3.4 30%Sodium hydroxide solution. Sodium hydroxide (20 =1.33 g/mL) diluted
30% (m/m).
3.5 0.1 M Hydrochloric acid solution
3.6 Indicator:
Methyl red .............................................. 100 mg
Methylene blue ......................... 50 mg
Ethanol (50%) ............................................. 100 mL
3.7 Boric acid solution:
Boric acid ................................................ 40 g
Water to ......................................... 1000 mL
This solution will become pink by adding 5 drops of methyl red and 0.1 mL
or more 0.1 M hydrochloric acid solution.
3.8 Ammonium sulfate solution:
Ammonium sulfate (NH4) 2SO4 ............ 6.608 g
Water to ...................................................... 1000 mL
MA-E-AS323-02-AZOTOT 1
Total nitrogen
3.9 Tryptophan, C11H12O2N2, (this substance contains in theory 13.72 g of

nitrogen per 100 g)
4. Procedure
Place in the 300 mL Kjeldahl flask (2.1), 25 mL of wine, 2 g benzoic acid (3.2)
and 10 mL sulfuric acid (3.1). Add 2 to 3 g of catalyst. With the flask placed on
a metal disc mantle (2.1) and with the neck inclined at 45 degrees, heat until a
clear color is obtained. Then heat for another 3 minutes.
After cooling, carefully transfer the contents of the Kjeldahl flask to a 1 liter
round bottomed flask containing 30 mL water. Rinse the Kjeldahl flask several
times with water and add washings to the round-bottomed flask. Cool the flask;
add 1 drop of 1% phenolphthalein solution and a sufficient quantity of 30%
sodium hydroxide solution (3.4) to ensure the solution is alkaline (40 mL
approximately) making sure to cool the flask constantly during this addition.
Distil 200 - 250 mL into a flask containing 30 mL of 40 g/L boric acid solution.
Titrate the distilled ammonia in the presence of 5 drops of indicator (3.6) using
0.1 M hydrochloric acid solution.
Note: A control trainer by vapor can be used as described in the Chapter on
volatile acidity to obtain a quick ammonia distillation. In this case, successively
place 40 to 45 ml of 30% sodium hydroxide liquor and 50 to 60 ml of previously
diluted for 10 minutes contents of the Kjeldahl flask before introducing into the
mixer.
5. Calculation
The total nitrogen, in g/L, contained in the wine is given by: 0.56 x n where n is
the volume of 0.1 M hydrochloric acid.
6. Blank tests and sample tests
All distillation apparatus used to determine ammonia must satisfy the following tests:
a) Place in a distillation flask 40 - 45 mL of sodium hydroxide solution, 50 mL
water, 2 g benzoic acid, 5 g potassium sulfate and 10 mL sulfuric acid diluted
to 50 mL. Distil 200 mL and collect the distillate in 30 mL of 40 g/L boric
acid solution, to which 5 drops of indicator (3.6) are added. A change of
color of the indicator must be obtained by adding 0.1 mL of 0.1 M
hydrochloric acid solution.
b) Under similar conditions distill 10 mL of 0.1 M ammonium sulfate solution.
In this case, between 10.0 and 10.1 mL of 0.1 M hydrochloric acid solution,
must be used to change the color of the indicator.
c) The complete method (wet ashing and distillation) is checked using 200 mg
tryptophan as the initial sample. Between 19.5 to 19.7 mL of 0.1 M
hydrochloric acid must be used to obtain the change of color.
MA-E-AS323-02-AZOTOT 2
Boron
Boron
Rapid Colorimetric Method
1. Principle
The alcohol content of the wine is removed by reducing the volume by half by
rotary evaporation. The wine is then passed through a column of
polyvinylpolypyrrolidone, which retains the coloring agents. The eluate is
collected quantitatively and the boron concentration determined by complexation
with azomethine H at pH 5.2 followed by spectroscopic analysis at 420 nm.
2. Apparatus
2.1. Rotary evaporator
2.2. Spectrophotometer capable of measuring absorbance wavelengths between
300 and 700 nm
2.3. Cells of 1 cm optical path
2.4. Glass column of 1 cm internal diameter and 15 cm in length containing an
8 cm layer of polyvinylpolypyrrolidone.
3. Reagents
3.1. Azomethin H (4-hydroxy-5-(2-hydroxybenzylideneamino)-
2,7-napthalenedisulfonic acid)
3.2. Azomethin H solution
Place 1 g of azomethin H and 2 g of ascorbic acid in a 100 mL volumetric
flask and add 50 mL double distilled water. Warm slightly to dissolve and
make up to the mark with double distilled water. The reagent is stable for
2 days if kept cold.
3.3. Buffer solution pH 5.2
Dissolve 3g of EDTA (disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid) in
150 mL of double distilled water. Add 125 mL acetic acid (20 = 1.05
g/mL) and 250 g of ammonium acetate, NH4CH3COO, and dissolve. Check
the pH with a pH meter and adjust if necessary to pH 5.2.
3.4. Boron stock standard solution, 100 mg/L
Use of a commercial standard solution is preferable. Alternatively this
solution can be prepared by dissolving 0.571 g of boric acid, H3BO3, dried
beforehand at 50 oC until constant weight, in 500 mL double distilled water
and made up to 1 liter.
3.5. Boron standard solution, 1 mg/L
Dilute the stock solution, 100 mg/L (3.4) 1/100 with double distilled water.
3.6. Polyvinylpolypyrrolidone or PVPP (see International Enological Codex)
MA-E-AS323-03-BORE 1
Boron
4. Procedure
Eliminate alcohol from 50 mL of wine by concentration to half the original
volume in a rotary evaporator at 40oC and make up to 50 mL with double
distilled water.
Take 5 mL of this solution and pass it through the PVPP column (2.4). The
coloring agents are completely retained. Collect the eluate and the rinsing waters
from the column and place in a 50 mL volumetric flask and make up to the mark
with water.
The colorimetric determination is performed in a volume of 5 mL of eluent
placed in a 25 mL volumetric flask; dilute to approximately 15 mL with double
distilled water and add the following (stirring after each addition):
5 mL of azomethin H solution (3.2)
4 mL of pH 5.2 buffer solution (3.3)
Make up to 25 mL with double distilled water.
Wait 30 min and determine the absorbance As, at 420 nm. The zero of the
absorbance scale is set using distilled water.
Use a blank consisting of 5 mL of azomethin H solution and 4 mL of pH 5.2
buffer solution in 25 mL of double distilled water. Wait 30 min and read the
absorbance Ab under the same conditions. The absorbance must be between 0.20
and 0.24; a higher absorbance demonstrates boron contamination in the water or
the reagents.
Preparation of the calibration curve
In 25 mL volumetric flasks, place 1 to 10 g of boron, corresponding to 1 to 10
mL of boron standard solution 1 mg/L (3.5) and continue as indicated in 4.0.
The calibration graph representing the net absorbance (As-Ab) in relation to the
concentration is a straight line passing through the origin.
Where: As = absorbance of sample
Ab = absorbance of blank
5. Calculations
The g of boron contained in 5 mL of eluate, (corresponding to 0.5 mL of wine)
obtained from interpolating the net absorbance values of (As - Ab) on the
calibration graph is E. The content, B, in milligrams of boron per liter is given by:
B mg/L = E
0.5
BIBLIOGRAPHY
WOLF B., Soil Science and Plant Analysis, 1971, 2(5), 363-374 et 1974, 5(1), 39-44.
CHARLOT C. and BRUN S., F.V., O.I.V., 1983, no771.
MA-E-AS323-03-BORE 2
Sulfur dioxide
Sulfur dioxide
1. Definitions
Free sulfur dioxide is defined as the sulfur dioxide present in the must or wine in
the following forms: H2SO3, HSO3, whose equilibrium as a function of pH and
temperature is:
H2SO3 H+ + HSO3
H2SO3 represents molecular sulfur dioxide.
Total sulfur dioxide is defined as the total of all the various forms of sulfur
dioxide present in the wine, either in the free state or combined with their
constituents.
2. Free and Total Sulfur Dioxide
2.1 Principle
Reference Method
Free sulfur dioxide is carried over by a stream of air or nitrogen and is fixed
and oxidized by bubbling through a dilute and neutral solution of hydrogen
peroxide. The sulfuric acid formed is determined by titration with a standard
solution of sodium hydroxide. Free sulfur dioxide is purged from the wine by
entrainment at low temperature (10 C).
Total sulfur dioxide is purged from the wine by entrainment at high
temperature (approximately 100 C).
Rapid Method Determination
Free sulfur dioxide is determined by direct titration with iodine. The
combined sulfur dioxide is subsequently determined by iodometric titration
after alkaline hydrolysis. When added to the free sulfur dioxide, it gives the
total sulfur dioxide.
2.2 Reference Method
2.2.1 Apparatus
The apparatus to be used should conform to the diagram overleaf, especially
with regard to the condenser (see Fig 1).
The gas supply tube to the bubbler B ends in a small sphere of 1 cm diameter
with 20 holes 0.2 mm in diameter around its largest horizontal circumference.
Alternatively, this tube may end in a sintered glass plate that produces a large
number of very small bubbles and thus ensures good contact between the
liquid and gaseous phases.
The gas flow through the apparatus should be approximately 40 L/h. The
bottle situated on the right of the apparatus is intended to restrict the pressure
reduction produced by the water pump to 20 30 cm water. In order to
regulate the flow rate, a flow meter with a semi-capillary tube should be
installed between the bubbler and the bottle.
MA-E-AS323-04-DIOSOU 1
Sulfur dioxide
To water vacuum pump

120
35
150
200
130
75
20
B
60
20
150
150
250 mL A 100 mL
FIGURE 1: The dimensions are given in millimeters. The internal diameters of the
4 concentric tubes making up the condenser are: 45, 34, 27 and 10 mm.
2.2.2 Reagents
2.2.2.1 Phosphoric acid 85%: phosphoric acid (20 =1.71 g/mL), diluted to 85%
2.2.2.2 Hydrogen peroxide solution, 9.1 g H2O2/L (3 volumes)
2.2.2.3 Indicator reagent:
Methyl Red ......................................... 100 mg
Methylene Blue .................................... 50 mg
Ethanol 50% (v/v) ................................ 100 mL
2.2.2.4 0.01 M Sodium hydroxide solution
2.2.3 Determination of free sulfur dioxide content.
The wine must be maintained at 20C in a full and stoppered flask for 2 days
before determination if a very precise determination is desired.
Sulfur dioxide
2.2.3.1 Procedure
- Place 50 mL of the sample and 15 mL of phosphoric acid into the 250 mL
flask (A) of the entrainment apparatus. Connect the flask into the
apparatus.
- In the bubbler (B), place 2 or 3 mL of hydrogen peroxide solution, two
drops of the indicator reagent and neutralize the hydrogen peroxide solution
with the 0.01 M sodium hydroxide solution. Connect the bubbler to the
apparatus.
Bubble air (or nitrogen) through the apparatus for 15 minutes. Free sulfur
dioxide carried over is oxidized to sulfuric acid. Remove the bubbler from
the apparatus and titrate the acid which has formed with the 0.01 M sodium
hydroxide solution.
Let n mL be the volume used.
2.2.3.2 Expression of results
The liberated sulfur dioxide is expressed in mg/L to the nearest whole
number.
2.2.3.2.1 Calculation
If n is the number of mL of 0.01 M sodium hydroxide solution, used, the
amount of free sulfur dioxide in milligrams per liter is given by: 6.4 n
2.2.4 Determination of total sulfur dioxide content.
2.2.4.1 Procedure
Samples having a SO2 content 50 mg/L of total SO2:
Place 50 mL of the sample and 15 mL of phosphoric acid into the 250 mL
round-bottom vacuum flask (A). Connect the flask to the apparatus.
Remark: In the case of must, proceed with the method of operation described
in the 1978 edition of the Compendium (see page 367).
Samples with a content 50 mg/L of total SO2:
Place 20 mL of the sample and 5 mL phosphoric acid into the 100 mL round-
bottom vacuum flask A. Connect the flask to the apparatus.
Place in the bubbler B, 2 or 3 mL of the hydrogen peroxide solution,
neutralized as before, and bring the wine in the flask A to a boil using a small
flame of 4 or 5 cm height which should directly touch the bottom of the flask.
Do not place the flask on a metal cloth, but on a mantle with a hole 30 mm in
diameter in it. This is to avoid overheating substances extracted from the wine
that are deposited on the walls of the flask.
Maintain boiling while passing a current of air (or nitrogen). Within 15
minutes the total sulfur dioxide is carried over and oxidized. Determine the
sulfuric acid formed by titration with 0.01 M sodium hydroxide solution.
Let n be the volume used.
Sulfur dioxide
2.2.4.2 Expression of results.

2.2.4.2.1 Calculation
Total sulfur dioxide in milligrams per liter:
- Samples low in sulfur dioxide (50 mL test sample): 6.4 n
- Other samples (20 mL test sample): 16 n
2.2.4.3 Repeatability (r):
(< 50 mg/L) 50 mL test sample, r = 1 mg/L
(> 50 mg/L) 20 mL test sample, r = 6 mg/L
2.2.4.4 Reproducibility (R):
(< 50 mg/L) 50 mL test sample, R = 9 mg/L
(> 50 mg/L) 20 mL test sample, R = 15 mg/L
2.3 Rapid Method
2.3.1 Reagents
2.3.1.1 EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid, di-sodium salt
2.3.1.2 4 M Sodium hydroxide solution (160 g/L).
2.3.1.3 Dilute sulfuric acid: 10% sulfuric acid (20 = 1.84 g/mL) diluted
10% (v/v).
2.3.1.4 Starch solution, 5 g/L.
Mix 5 g starch with approx. 500 mL water. Bring to a boil stirring
continuously and keep boiling for 10 minutes. Add 200 g of sodium chloride.
Cool and make to 1 liter.
2.3.1.5 0.025 M Iodine solution
2.3.2 Free sulfur dioxide
Place in a 500 mL conical flask place:
- 50 mL of wine
- 5 mL starch solution
- 30 mg EDTA
- 3 mL H2SO4
Immediately titrate with 0.025 M iodine, until the blue color persists clearly
for 10 to 15 seconds. Let n mL be the volume of iodine used.
2.3.3 Combined sulfur dioxide
Add 8 mL of 4 M sodium hydroxide solution, shake the mixture once and
allow to stand for 5 minutes. Add, with vigorous stirring and in one
operation, the contents of a small beaker in which 10 mL of sulfuric acid have
been placed. Titrate immediately with the 0.025 M iodine solution; let n' be
the volume used.
Add 20 mL of sodium hydroxide solution, shake once and allow to stand for
5 minutes. Dilute with 200 mL of ice-cold water.
Sulfur dioxide
Add, while stirring vigorously and in one operation, the contents of a test
tube in which 30 mL sulfuric acid has previously been placed. Titrate the
free sulfur dioxide immediately with the 0.025 M iodine, and let n" be the
volume of iodine used.
2.3.4 Expression of the results
2.3.4.1 Calculation
Free sulfur dioxide in milligrams per liter is given by:
32 n
Total sulfur dioxide in milligrams per liter is given by:
32 (n + n' + n")
Remarks:
1. For red wines with low SO2 concentrations, the 0.025 M iodine may be
diluted (for example: 0.01 M). In this case, replace the coefficient 32 by
12.8 in the above formula.
2. For red wines, it is useful to illuminate the wine from below with a beam
of yellow light from an ordinary electric light bulb shining through a
solution of potassium chromate or from a sodium vapor lamp. The
determination should be carried out in a dark room and the transparency of
the wine observed: it becomes opaque when the starch endpoint is reached.
3. If the quantity of sulfur dioxide found is close to or exceeds the legal limit,
the total sulfur dioxide should be determined with the reference method.
4. If the determination of free sulfur dioxide is specifically required, carry out
a determination on a sample kept under anaerobic conditions for two days
at 20 C before analysis. Carry out the determination at 20 C.
5. Because certain substances are oxidized by iodine in an acid medium, the
quantity of iodine used in this way must be assessed for more accurate
determinations. To achieve this, combine the free sulfur dioxide in an
excess of ethanal or propanal before beginning the titration with iodine.
Place 50 mL of wine into a 300 mL conical flask, add 5 mL of 7 g/L
ethanol solution or 5 mL of a 10 g/L propanal solution.
Stopper the flask and allow to stand for at least 30 minutes. Add 3 mL of
sulfuric acid and sufficient iodine, 0.025 M, to cause the starch to change
color. Let n''' mL be the volume of iodine used. This must be subtracted
from n (free sulfur dioxide), and from n + n' + n'' (total sulfur dioxide).
n''' is generally small, from 0.2 to 0.3 mL of 0.025 M iodine. If ascorbic
acid has been added to the wine, n''' will be much higher and it is
possible, at least approximately, to measure the amount of this substance
from the value of n''' given that 1 mL of 0.025 M iodine will oxidize 4.4
mg ascorbic acid. By determining n''', it is possible to detect quite easily
the presence of residual ascorbic acid in amounts greater than 20 mg/L, in
wines to which it has been added.
Sulfur dioxide
3 Molecular Sulfur Dioxide

3.1 Principle of the Method
The percentage of molecular sulfur dioxide, H2SO3, in free sulfur dioxide, is
calculated as a function of pH, alcoholic strength and temperature.
For a given temperature and the alcoholic strength:
H2SO3 H+ + HSO3
[H2SO3] = L (1)
(pH pk M )
10 +1
where
L = [H2SO3] + [HSO3]
A I
pkM = pkT
I+ B I
I = ionic strength
A & B = Coefficients which vary according to temperature and alcoholic
strength.
kT = Thermodynamic dissociation constant; the value of pkT is given in Table
1 for various alcoholic strengths and temperatures.
kM = Mixed dissociation constant
Taking a mean value 0.038 for the ionic strength I, Table 2 gives the values
of pkM for various temperatures and alcoholic strengths.
The molecular sulfur dioxide content calculated by the relationship given in
(1) is presented in Table 3 for various values of pH, temperature and
alcoholic strength.
3.2 Calculations
Knowing the pH of wine and its alcoholic strength, the percentage of
molecular sulfur dioxide is given in Table 3 for a temperature t C. Let this
be X %.
The amount of molecular sulfur dioxide in mg/L is given by:
XC
C = the free sulfur dioxide in mg/L
Sulfur dioxide
Table I
Values of the thermodynamic constant pkT
Alcohol Temperature oC
% by volume 20 25 30 35 40
0 1.798 2.000 2.219 2.334 2.493
5 1.897 2.098 2.299 2.397 2.527
10 1.997 2.198 2.394 2.488 2.606
15 2.099 2.301 2.503 2.607 2.728
20 2.203 2.406 2.628 2.754 2.895
Table II
Values of the Mixed Dissociation Constant pkM (I= 0.038)
Alcohol Temperature C
% by volume 20 25 30 35 40
0 1.723 1.925 2.143 2.257 2.416
5 1.819 2.020 2.220 2.317 2.446
10 1.916 2.116 2.311 2.405 2.522
15 2.014 2.216 2.417 2.520 2.640
20 2.114 2.317 2.538 2.663 2.803
Sulfur dioxide
Table III
Molecular Sulfur Dioxide as a Percentage of Free Sulfur Dioxide (I=0.038)
T = 20 oC
Alcohol % by volume
pH 0 10 15 20
2.8 7.73 9.46 11.55 14.07 17.09
2.9 6.24 7.66 9.40 11.51 14.07
3.0 5.02 6.18 7.61 9.36 11.51
3.1 4.03 4.98 6.14 7.58 9.36
3.2 3.22 3.99 4.94 6.12 7.58
3.3 2.58 3.20 3.98 4.92 6.12
3.4 2.06 2.56 3.18 3.95 4.92
3.5 1.64 2.04 2.54 3.16 3.95
3.6 1.31 1.63 2.03 2.53 3.16
3.7 1.04 1.30 1.62 2.02 2.53
3.8 0.83 1.03 1.29 1.61 2.02
T = 25 oC
2.8 11.47 14.23 17.15 20.67 24.75
2.9 9.58 11.65 14.12 17.15 22.71
3.0 7.76 9.48 11.55 14.12 17.18
3.1 6.27 7.68 9.40 11.55 14.15
3.2 5.04 6.20 7.61 9.40 11.58
3.3 4.05 4.99 6.14 7.61 9.42
3.4 3.24 4.00 4.94 6.14 7.63
3.5 2.60 3.20 3.97 4.94 6.16
3.6 2.07 2.56 3.18 3.97 4.55
3.7 1.65 2.05 2.54 3.18 3.98
3.8 1.32 1.63 2.03 2.54 3.18
T = 30 oC
2.8 18.05 20.83 24.49 29.28 35.36
2.9 14.89 17.28 20.48 24.75 30.29
3.0 12.20 14.23 16.98 20.71 25.66
3.1 9.94 11.65 13.98 17.18 21.52
3.2 8.06 9.48 11.44 14.15 17.88
3.3 6.51 7.68 9.30 11.58 14.75
3.4 5.24 6.20 7.53 9.42 12.08
3.5 4.21 4.99 6.08 7.63 9.84
3.6 3.37 4.00 4.89 6.16 7.98
3.7 2.69 3.21 3.92 4.95 6.44
3.8 2.16 2.56 3.14 3.98 5.19
Sulfur dioxide
Table III (continued)

Molecular Sulfur Dioxide as a Percentage of Free Sulfur Dioxide (I=0.038)
T=35 oC
pH Alcohol % by volume
0 5 10 15 20
2.8 22.27 24.75 28.71 34.42 42.18
2.9 18.53 20.71 24.24 29.42 36.69
3.0 15.31 17.18 20.26 24.88 31.52
3.1 12.55 14.15 16.79 20.83 26.77
3.2 10.24 11.58 13. 82 17.28 22.51
3.3 8.31 9.42 11.30 14.23 18.74
3.4 6.71 7.63 9.19 11.65 15.49
3.5 5.44 6.16 7.44 9.48 12.71
3.6 4.34 4.95 6.00 7.68 10.36
3.7 3.48 3.98 4.88 6.20 8.41
3.8 2.78 3.18 3.87 4.99 6.80
o
T = 40 C
2.8 29.23 30.68 34.52 40.89 50.14
2.9 24.70 26.01 29.52 35.47 44.74
3.0 20.67 21.83 24.96 30.39 38.85
3.1 17.15 18.16 20.90 25.75 33.54
3.2 14.12 14.98 17.35 21.60 28.62
3.3 11.55 12.28 14.29 17.96 24.15
3.4 9.40 10.00 11.70 14.81 20.19
3.5 7.61 8.11 9.52 12.13 16.73
3.6 6.14 6.56 7.71 9.88 13.77
3.7 4.94 5.28 6.22 8.01 11.25
3.8 3.97 4.24 5.01 6.47 9.15
BIBLIOGRAPHY
Reference method
PAUL F., Mitt. Klosterneuburg, Rebe u. Wein, 1958, ser. A, 821.
Rapid method:
RIPPER M., J. Prakt. Chem., 1892, 46, 428.
JAULMES, P., DIEUZEIDE J.-C., Ann. Fals. Fraudes, 1954, 46, 9; Bull.
O.I.V., 1953, 26, n 274, 52.
KIELHOFER E., AUMANN H., Mitt. Klosterneuburg, Rebe u. Wein, 1957, 7, 289.
JAULMES P., HAMELLE Mme G., Ann. Fals. Exp. Chim., 1961, 54, 338
Molecular sulfur dioxide:
BEECH F.W. & TOMAS Mme S., Bull. O.I.V., 1985, 58, 564-581.
USSEGLIO-TOMASSET L. & BOSIA P.D., F.V., O.I.V., 1984, n 784.
Sulphur dioxide
Sulphur dioxide
Reference method: Procedure for grape juice
1. Apparatus:
See 2.2.1., from E-AS321-01-DIOSOU
2. Reagents:
Phosphoric acid (20 =1.71 g/ml) diluted at 25% (m/v).
For other reagents, see 2.2.2., from E-AS321-01-DIOSOU
3. Procedure:
Introduce 50 ml of grape juice and 5 ml of phosphoric acid diluted 25% (m/v)
in a 250 ml balloon A control trainer. Set up the balloon.
Continue as indicated as in 2.2.4.1., from the F-AS321-01-DIOSOU form.
4. Calculation:
Given n as the number of milliliters of 0.01 M sodium hydroxide solution
used, the total sulphur dioxide content of grape juice in milliliters per liter:
6.4 x n
MA-E-AS323-05-SO2JUS 1
Mercury - Atomic Spectrofluorimetry
DETERMINATION OF MERCURY IN WINE

BY VAPOUR GENERATION AND ATOMIC
SPECTROFLUORIMETER
This method applies to the analysis of mercury in wines with a concentration range
between 0 to 10 ug/l.
2. DESCRIPTION OF TECHNIQUE
2.1. Principle of the method

2.1.1 Mineralisation of wine takes place in an acid environment: heating
under reflux;
mineralisation is achieved with a potassium permanganate.
2.1.2. Reduction of non-consumed permanganate by hydroxylamine
hydrochlorate
2.1.3. Reduction in mercury II (metal mercury by stannous chloride (II).
2.1.4. Mercury pick up by an argon current at ambient temperature
2.1.5. Dosage of mercury in monoatomic vapour state by atomic
flourescence spectometre with wavelength of 254 nm. Mercury atoms
are excited by a mercury vapour lamp; the atoms thus excited emit a
radiation called flourescent which allows the quantification of
mercury present using a photonics detector to obtain good linearity
while eliminating memory effects.
2.2 Principle of analysis (figure 1)

The peristaltic pump absorbs the stannous chloride solution, the blank solution
(demineralised water containing 1% nitric acid) and the sample of mineralised
wine.
The mercury metal is taken up in a gas-liquid separator by a current of argon.
After going through a drying tube, the mercury is detected by florescence.
Then, the gaseous current goes through a permanganate potassium solution in
order to capture the mercury.
MA-E-AS323-06-MERCUR 1
Peristaltic pump
peristaltic
perist
Air
Stannous chloride
peristaltic
c
Blank
Reference or Hygroscopic
Sample Stannous
Valve open membrane
chloride
Upon sample Towards Florescence
position sink
Argon detector
Gas-liquid
flowmeter separator
Analytic Chain for dosage of mercury
3. REAGENTS AND PREPARATION OF REACTIVE SOLUTIONS
3.1 Ultra-pure demineralised water
3.2 Ultra-pure 65% nitric acid
3.3 White: demineralised water (3.1) containing 1% of nitric acid (3.2)
3.4 Nitric acid solution 5.6 M (3.1):

Put 400 ml of nitric acid (3.2) into a 1000 ml flask; fill with
demineralised water (3.1).
3.5 Sulphuric acid (d= 1.84)
3.6 Sulphuric acid solution 9M:

Put 200 ml of demineralised water (3.1), 50 g of potassium
permanganate (3.7) into a 1000 ml flask; fill with demineralised water
(3.1).
3.7 Potassium permanganate KMnO4
3.8 5% Potassium permanganate solution:

Dissolve 50 g of potassium permanganate (3.7) with demineralised
water (3.1), in a 1000 ml flask. Fill with demineralised water (3.1).
3.9 Hydroxylamine hydrogen chloride NH2OH, HCl
3.10 Reducing solution:

Weigh 12g of hydroxylamine hydrogen chloride (3.9) and dissolve in
100 ml of demineralised water (3.1).
3.11 Stannous chloride (SnCl2, 2 H2o)
3.12 Concentrated hydrochloric acid
3.13 Stannous chloride solution:

Weigh 40 g of stannous chloride (3.11) and dissolve in 50 ml of
hydrochloric acid (3.12). Fill with 200 ml of demineralised water
(3.1).
3.14 Mercury standard solution at 1g/l
prepared by dissolving 1708 g of Hg (NO3). H2O in an aqueous nitric
acid solution at 12% prepared from metal mercury.
3.15 Reference mercury solution at 10 mg/l :
Place 1 ml of mercury standard solution (3.14) in a 100 ml volumetric
flask, add 5 ml of nitric acid, fill will demineralised water (3.1)
3.16 Mercury solution at 50 mg/l:
Place 1 ml of 10 mg/l (3.15) solution in a 200 ml flask. Add 2 ml of
nitric acid (3.2). Fill with demineralised water (3.1).
4. APPARATUS
4.1 Glass ware

4.1.1 Volumetric flasks 100, 200, and 1000 ml (class A)
4.1.2 Volumetric pipette 0.5,1.0, 2.0, 5, 10 and 20 ml (class A)
4.1.3 Precautionary action: Before using, the glass ware must be
washed with 10% nitric acid, leave in contact 24 hours, then
rinse with demineralised water.
4.2 Mineralisation apparatus (figure 2)
4.3 Temperature controlled heating mantle
4.4 Squeeze pump
4.5 Cold vapour generator

4.5.1 Liquid gas separator
4.6 Desiccant (Hygroscopic membrane) covered by an air current

(supplied from a compressor) and placed before the detector
4.7 Spectrofluorimeter
4.7.1 Mercury vapour lamp regulated to 254 nm wave length
4.7.2 Atomic fluorescence specific detector
4.8 Computer
4.8.1 Software which regulates the parameters of the vapour generator
and the atomic fluorescence detector and enables calibration and
usage of the results.
4.8.2 Printer which stores results
4.9 Neutral gas bottle (argon)
5. PREPARATION OF CALLIBRATION SOLUTIONS AND SAMPLES
5.1 SET OF CALLIBRATION SOLUTIONS: 0; 0.25; 0.5; and 1.0 ug/L

Introduce : 0; 0.5; and 1.0 and 2.0 ml of the mercury solution to 50 ug/l
(3.16.) in 4 100 ml flasks; add 1 % nitric acid (3.2.); fill with demineralised
water (3.1.).
5.2. Preparation of samples (figure 2)

Wine is mineralised in a glass pyrex apparatus made up of three parts
joined by spherical honing: a 250 ml balloon, a vapour recuperation
chamber, a refrigerant.
Using a pipette put 20 ml of wine in a 250 ml reaction flask; assemble the
mineralisation apparatus.
Add 5 ml of sulphuric acid (3.6.) and 10 ml of nitric acid (3.4.) slowly;
leave overnight.
Heat slowly under reflux until the nitrous vapours disappear ; leave to
cool. Recover the condensed vapours in the reaction flask. Rinse the
recipient with demineralised water. Pour the contents of the reaction flask
into a 100 ml volumetric flask. Add potassium permanganate solution
(3.8.) until the colour remains. Solubilize the precipitate (MnO2) with a
reducing solution (3.10.). Fill with demineralised water (3.1.).
Carry out a blank test on demineralised water.
Refrigerant
with balls
Circulation
cold water
Vapour
Recuperation Introduction
chamber of wine
and reagents
Reaction Balloon
(wine + sulphuric acid
+ nitric acid)
Heating mantle
Mineralisation apparatus
6. OPERATING PROCEDURE
6.1 Analytical measurement

Turn on the fluorimeter; the apparatus is stable after 15 minutes. The
squeeze pump absorbs the white (3.3), the stannous lead II (3.13) and the
sample calibrations (5.1) or (5.2.) Verify that bubbling occurs in the liquid
gas separator. Present the calibration samples successively (5.1); set off
the vapour generator program. The computer software establishes a
calibration curve (percentage of fluorescence according to concentration
of mercury ug/l). Then present the samples (5.2).
6.2 Automatic checks

A blank analysis and a calibration are analysed every five tests to correct
any possible spectrofluorimeter derivitives.
7. EXPRESSION OF RESULTS
Results are provided by the computer software and expressed in ug/l. Deduct
the mercury concentration in wine in ug/l keeping into account 1/5 dilution.
8. CHECKING RESULTS
Quality control is carried out by placing reference material in which the
mercury content is known, following the set of calibrations and every 5
samples. Following the analytical series, the reference material is red wine, dry
white wine or sweet white wine.
The check card is set for each reference material used. The check limits are set
at: +/- 2SR intra (2SR intra : reproducibility spread-type)
The uncertainly calculation, carried out on check cards, resulted in a red wine
reference of: 3.4 +/- 0.8 ug/l and for reference dry white wine : 2.8+/-0.9 ug/l.
9. BIBLIOGRAPHY
CAYROL M., BRUN S., 1975. Dosage du mercure dans les vins. Feuillet Vert de
lO.I.V. n371.
REVUELTA D., GOMEZ R., BARDON A., 1976. Dosage du mercure dans le vin
par la mthode des vapeurs froides et spectromtrie dabsorption atomique. Feuillet
Vert de lO.I.V. n494.
CACHO J., CASTELLS J.E., 1989. Determination of mercury in wine by flameless
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SANJUAN J., COSSA D., 1993. Dosage automatique du mercure total dans les
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fluorescence atomique. XPT 90-113-2.
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continu et spectrofluorimtrie. Feuillet Vert de lO.I.V. n1070.
Microbiological analysis of wines and musts
Microbiological Analysis of Wines and Musts

Detection, Differentiation and Counting of Micro-organisms
Objective:
Microbiological analysis is aimed at following alcoholic fermentation and/or
malolactic fermentation and detecting microbiological infections, and allowing the
detection of any abnormality, not only in the finished product but also during the
different phases of manufacture.
Comments:
All experiments must be carried out under normal microbiological aseptic
conditions, using sterilized material, close to a Bunsen burner flame or in a
laminar flow room and flaming the openings of pipettes, tubes, flasks, etc.
Before carrying out microbiological analysis, it is necessary to ensure that the
samples to be analyzed are taken correctly.
Field of application:
Microbiological analysis can be applied to wines, musts, mistelles and all similar
products even when they have been changed by bacterial activity.
Microbiological analysis techniques:
Microbiological analysis may be undertaken using the following techniques:
1. Quality tests
1.1. Air quality tests
1.2. Incubator quality tests
2. Detection, differentiation of micro-organisms and direct counting of yeasts
2.1. Microscopic examination of liquids or deposits
2.2. Staining with methylene blue
2.3. Gram staining
2.4. Catalase Test
2.5. Direct counting of yeasts by microscope
3. Counting of micro-organisms by culture
3.1. Culture in or on solid media
3.1.1. Plate culture
3.1.2. Membrane culture after filtration
3.2. Culture in liquid environment - "Most Probable Number" (MPN).
MA-E-AS4-01-ANMICR 1
Equipment:
Laminar flow room
Microscope
Incubator - for incubation between 20 and 35C, with thermometer
Oven - for dry sterilization, thermostatically controlled at 180C, with
thermometer
Incubator - in CO2 or in airtight jars with a CO2 generator, or other devices
which produce an atmosphere rich in CO2
pH-meter - calibrated in pH units with a precision of 0.1 unit
Autoclave - allowing steam sterilization of equipment and culture media
Centrifuge
Water bath
Gas burner
Balance - with a precision of 0.1 mg
Haemacytometer - Neubauer or equivalent
Sterilizing filtration devices - with sterilized filtering membranes of 13 mm or 25
mm in diameter, of 0.22 m porosity, in cellulose ester or polyvinylidene
fluoride or equivalent, with hydrophobic edges
Bunsen burner
Volumetric flasks - 100 and 1000 mL
Conical (Erlenmeyer) flasks - 100, 150, 300, and 1000 mL stopped with cotton
wool, sterilized
Graduated cylinders - 50, 100, 300, 500 and 1000 mL
Pipettes - 1, 10, 15, 20 and 25 mL sterilized
Centrifuge tubes - sterilized
Autoclavable tubes - glass, rimless, dimensions 160 x 16 mm and 180 x 18 mm,
stopped with cotton wool, or equivalent, before sterilization
Slides
Cover glasses
Pasteur Pipettes - sterilized
Wire loop - sterilized
Filter paper
Immersion oil
Alcohol - 70 and 95% by volume
Hydrogen peroxide 3%
Comment: Other pieces of equipment serving the same functions can be used.
Techniques for the taking of samples:
It is necessary that samples be representative. Pipettes can be used for casks and
long glass tubes for tanks. The samples must be taken in a sterilized area to
avoid external contamination that could give false positives. Thus, to take
samples from the "tasting taps" of casks or tanks, it is necessary first to allow
several liters of sample flow. Surfaces in contact must be disinfected, for
example with 70% alcohol or by flame.
Samples must be analyzed as quickly as possible after they have been taken. They
must be kept cool (4 to 5C) during transportation and storage, if the microbial
flora is to be stabile.
1. Quality tests
Objective:
These tests are aimed at detecting the risk of microbial infection in advance.
Principle:
This technique is based on organoleptic changes (clouds, films, deposits, unusual
colors) shown by wine when subjected to certain aeration and temperature
conditions which can bring about bacterial activity. The nature of the changes
should be confirmed by microscopic examination.
Operating method:
1.1. Air quality tests
A 50 mL wine sample after filtration on coarse sterile filter paper is placed in
a 150 mL sterile conical flask stoppered with cotton and left at an ambient
temperature for at least 3 days. The clarity, color and possible presence of
clouds, deposits and films are examined over this time. A microscopic
examination is carried out in the case of cloud, deposit or film or a color
change.
1.2. Incubator quality tests
A 100 mL wine sample, after filtration on coarse sterilized filter paper, is
placed in 300 mL sterile conical flask stopped with cotton, put in an
incubator at 30C and examined after at least 72 hours. Organoleptic
changes can be indicative of microbial development. A microscopic
examination must therefore be made.
2. Detection, differentiation of micro-organisms and direct counting of yeasts
2.1 Microscopic examination of liquids or deposits
Objective:
Microscopic examination under cool conditions is aimed at detecting and
differentiating the yeasts from the bacteria that might be present. However,
microscopic observation cannot distinguish between viable and non-viable
microorganisms.
Comment:
With staining, an estimation of the viable yeasts can be made.
Principle:
This technique is based on the magnification made by a microscope that
allows the observation of micro-organisms, whose size is on the order of a
micron.
Operation method:
Microscopic examination can be carried out directly on the liquid or on the
deposit.
Direct observation of the liquid will only be useful when the population is
sufficiently high (more than 5 x 105 cells/mL).
When wine shows a lower microorganism population, it is necessary to
concentrate the sample. Thus, about 10 mL of homogenized wine is
centrifuged at 3000 - 5000 rpm for 5 to 15 minutes. After decanting the
supernatant, the deposit is re-suspended in the liquid remaining at the bottom
of the centrifuge tube.
To carry out the microscopic observation, a drop of the liquid sample or the
homogenized deposit is placed on a clean glass slide with a Pasteur pipette or
a sterilized wire. It is covered with a cover glass and placed on a slide on
the stage of the microscope. Observation is made in a clear field, or
preferably in phase contrast, which allows a better observation of detail. A
magnification of 400 - 1000 is generally used.
2.2. Vital Staining with methylene blue
Objective:
Vital staining with methylene blue is used to differentiate between viable and
non-viable yeast cells.
Principle:
This coloration is based on the presence of viable cells which reduce the
color. For example, methylene blue is reduced to leuco-derivatives by viable
cells which remain colorless. Dead cells absorb the color, appearing blue.
Reagent:
Methylene blue solution of 0.1%
Preparation: Dissolve 0.1g of methylene blue with 100 mL of distilled water
in a conical flask. Filter through paper. The solution must be freshly
prepared.
Operating method:
Place a drop of sample and a drop of stain on a slide. Mix together with a
wire; after 5 minutes observe through a microscope in a clear field.
Results:
The viable cells remain colorless and the dead cells appear blue.
Comments:
These staining methods are not completely reliable and are only used for
approximate enumeration. They are not recommended for bacteria.
To differentiate between viable and non-viable micro-organisms (both yeasts
and bacteria) more elaborate techniques can also be employed, such as those
using an epifluorescence microscope.
2.3. Gram staining
Objective:
Gram staining is used to differentiate between lactic bacteria (Gram positive)
and acetic bacteria (Grams negative) and also to observe their morphology.
Comments:
It must be remembered that Gram staining is not conclusive, as other bacteria
apart from lactic and acetic bacteria may be present.
Principle:
This color is based on the difference between Gram positive and Gram
negative bacteria due to the differences in structure and chemical composition
of their cell walls. In Gram negative bacteria, the cell walls that are rich in
lipids have a much reduced quantity of peptidoglycan which allows the
penetration of alcohol which dissolves the gentian-violet-iodine complex,
forming when the colorless cell is left, which will then be re-colored in red
by saffron. Conversely, the cell walls of Gram positive bacteria contain a
large quantity of peptidoglycan and a low concentration of lipids. Thus, the
thick peptidoglycan wall and the dehydration caused by the alcohol do not
allow the alcohol to penetrate the cell, which maintains the violet or dark
blue coloring of the gentian-violet-iodine complex.
There are several modifications to the Gram staining technique. It loses its
usefulness if it is performed on a culture that is too old. Thus, the strain
must be in an exponential growth phase within 24 to 48 hours.
Solutions:
The water used must be distilled.
1. Gentian violet solution
Preparation: Weigh 2g of gentian violet (or crystal violet), and put into a 100
mL conical flask and dissolve in 20 mL of 95% vol. alcohol. Dissolve 0.8g
of ammonium oxalate in 80 mL of distilled water. Mix the two solutions
together and only use after a period of 24 hours. Filter through paper at time
of use. Keep out of light in a dark flask.
2. Lugol solution
Preparation: Dissolve 2g of potassium iodide in a minimal quantity of water
(4 to 5 mL) and dissolve 1g of iodine in this saturated solution. Make the
volume up to 300 mL with distilled water. Keep out of light in a dark flask.
3. Saffranin solution:
Preparation: Weigh 0.5g of saffranin in a 100 mL conical flask, dissolve
with 10 mL of 95% vol. alcohol and add 90 mL of water. Stir. Keep out of
light in a dark flask.
Operating method:
Smear preparation
Make a subculture of the bacteria in liquid or solid medium. Collect the
young culture bacteria from the deposit (after centrifugation of the liquid
culture) or directly from the solid medium with a loop or wire and mix in a
drop of sterilized water.
Make a smear on a slide, spreading a drop of the microbial suspension. Let
the smear dry, and then carry out fixation, rapidly passing the slide 3 times
through the flame of a Bunsen burner, or equivalent. After cooling, perform
staining.
Staining
Pour a few drops of gentian violet solution onto the fixed smear. Leave to
react for 2 minutes and wash off with water.
Pour in 1 to 2 drops of lugol solution. Leave to react for 30 seconds. Wash
with water and dry with filter paper.
Pour on 95% vol. alcohol, leave for 15 seconds. Rinse with water and dry
with filter paper.
Pour on a few drops of saffranin solution, leave to react for 10 seconds.
Wash with water and dry with filter paper.
Place a drop of immersion oil on the smear.
With the immersion objective, observe through a microscope in clear field.
Results:
Lactic bacteria remain violet or dark blue colored (Gram positive). Acetic
bacteria are red colored (Gram negative).
2.4. Catalase Test.
Objective:
This test is aimed at making a distinction between acetic and lactic bacteria.
The yeasts and acetic bacteria have a positive reaction. Lactic bacteria give a
negative catalase.
Comments:
It must be taken into account that the catalase test is not conclusive as other
bacteria apart from lactic and acetic bacteria may be present.
Principle:
The catalase test is based on the property that aerobic micro-organisms have
of decomposing hydrogen peroxide with release of oxygen:
catalase
2H2O2 2H2O + O2
Reagent:
3 Volume hydrogen peroxide solution
Preparation: Measure 10 mL of 30% by volume hydrogen peroxide in a 100
mL calibrated flask and fill with freshly boiled distilled water. Stir and keep
in the refrigerator in a dark flask. The solution must be freshly prepared.
Operating method:
Place a drop of 3% by volume hydrogen peroxide on a slide and add a small
sample of young colony. If gas is released, it can be concluded that the
culture contains catalase. It is sometimes difficult to observe gas clearing
immediately, particularly with bacterial colonies. It is therefore advisable to
examine the culture through a microscope (objective x10).
2.5. Direct counting of the yeast cells with a microscope
Objective:
Direct counting with a microscope is aimed at evaluating the total yeast cell
population (viable and non-viable)
Comment:
This technique is only recommended for the counting of yeasts. Enumeration
of bacterial cells is both difficult and approximate due to their small size and,
more importantly, because of the presence of colloidal particles. This
technique can be used to estimate numbers of viable cells that are stained by
methylene blue.
Principle:
The technique is based on the counting of microorganisms in a sample of
known volume through a microscope. Special slides of the haemacytometer
or cell counting type are used to measure this volume.
Comment:
The slides consist of a restricted square surface, which, when covered by a
thick, optically flat cover glass, contain a sample of known volume. There
are various cell counters. For example, the Neubauer cell counter,
considered here, consists of a central cavity 0.1 mm deep and 1 mm2 in
surface area, of which the base is divided into 400 small squares. Thus, the
volume of a sample corresponding to a small square is 1/400 mm3.
Operating method:
Place a drop of the homogenized sample on the central plane of the chamber,
avoiding spillage. Cover with a thick cover glass, avoiding gas bubbles.
Leave to stabilize for a few minutes.
The concentration must be neither too concentrated nor too dilute. Where
very dense populations are concerned, the sample must be diluted.
Conversely, where the number of cells to be counted is small, a
concentration must be made by centrifugation.
Count the micro-organisms through a microscope at random so that the total

is between 200 and 500. Avoid counting the same cell twice. To obtain a
representative figure, count the cells in different areas. Thus, for example,
five large squares can be counted (each consisting of 16 small squares), 1 in
the center and 4 on the edges of the square plane or 5 large squares on the
diagonal.
It is advisable to perform the counting twice. Find the mathematical average
of the two counts, record the results of the 400 small squares, and multiply
by 104 to express the result in cells/mL. If the sample has been concentrated
or diluted, the concentration or dilution factor must be taken into account.
3. Counting of micro-organisms by culture
Objective:
The purpose of counting of microorganisms by culture is to evaluate the level
of contamination of the sample, that is to say, to estimate its microbial
stability since only viable microorganisms are capable of changing the
product. According to the culture media used and the culture conditions,
three types of microorganisms can be counted, namely, yeasts, lactic bacteria
and acetic bacteria.
3.1. Culture in solid medium
Principle:
This method is based on the pre-supposition that a viable micro-organism,
cultivated in or on specific solid nutritive media and in suitable conditions,
multiplies giving rise to a colony visible to the naked eye.
3.1.1. Petri dish culture
Objective:
This technique is aimed at counting microorganisms by dilution when the
microbial concentration is high.
Equipment:
Apart from the equipment already mentioned, the following is required.
Petri dishes (plates) - 57 cm2 (plastic) or 65 cm2 (borosilicate glass).
Diluents and solid culture media (see annexes 4 and 5)
Operating method:
Enumeration in Petri dishes can be performed by inoculation in or on the
surface of the appropriate medium after suitable incubation.
Preparation of dilutions:
Successive, decimal and increasing dilutions must be made in such a way that
the appropriate number is obtained (between 30 and 300 colonies) for the
counting and differentiation of colonies, as the microbial concentration is not
known in advance. An estimation of the dilutions can be made using a
microscope. Thus, starting with an homogenized sample, prepare a series of

decimal dilutions (1:10) in the diluent.
Take a 1 mL sample and add to 9 mL of diluent in the first tube. Mix
thoroughly. Take 1 mL of this dilution and add to 9 mL of diluent in the
second tube. Continue this dilution protocol until the last suitable dilution,
according to the presumed microbial population, using sterilized pipettes for
each dilution (see diagram 1 of Annex 1).
Preparation of inoculations by incorporation in agar media
Prepare Petri dishes in such a way that a dilution giving counts of between 30
and 300 colonies can be obtained.
Inoculate 1 mL of sample and 1 mL of each of the dilutions prepared and
chosen according to the presumed microbial population, mixed at the time, in
two separate Petri dishes using different sterilized pipettes or automatic
pipettes with autoclavable hydrophobic tips. Then pour 15 mL of
appropriate agar culture medium, at 42 to 45C, liquefied beforehand in a
boiling water bath (or in microwave oven or on a heated magnetic gyratory
shaker), avoiding prolonged heating. Mix thoroughly immediately, gently
making circular movements in both directions, avoiding spillage and the
formation of air bubbles. Leave to cool on a level surface until solidified.
Preparation of inoculations on the surface of the agar medium
Place 0.1 to 0.2 mL of chosen sample dilutions, on the surface of the agar
that has no excessive liquid that would cause uneven spreading. Dilutions 10
times more concentrated than in the incorporation method must be used. A
homogeneous distribution is made on the surface of the medium, having been
placed and solidified in plates with a glass spreader sterilized with alcohol
and flamed. Incubate the inverted plates in incubator:
yeasts - 20 to 25C, for 3 to 10 days, under aerobic conditions.
(Comment: for the counting of yeasts, 3 days incubation is usually
sufficient.
If the presence of Dekkera Brettanomyces is suspected, the incubation must
be for 7 to 10 days)
lactic bacteria - 25C, 4 to 10 days, under anaerobic or microaerophilic
conditions.
acetic bacteria - 25 to 30C for 2 to 4 days, under aerobic conditions.
Count the colonies with the naked eye or with a magnifying glass or a
colony counter. If there is any doubt, confirm the identity of the colonies
(yeast or bacteria) with a microscope.
Test the sterility of the medium, the diluent and the equipment by making a
blank test with a sample of sterilized water for each series of tests.
Results:
Express the results in Colony Forming Units/mL - CFU/mL (rather than
microorganisms/mL, since each colony can be the result of a microorganism
or a cluster), in scientific notation with a decimal (for example 1100 would
be reported as "1.1 x 103 CFU/mL").
When the number of colonies is calculated by estimation, the results are
expressed as ECFU/mL (E - estimated).
Count the plates containing between 30 and 300 colonies.
Calculate the CFU/mL by multiplying the mathematical average of the
colonies affected by the dilution factor.
Specify incubation time.
Rules for calculating the CFU by counting and by estimation
1. Examine the dish of each of the dilutions containing between 30 and 300
colonies and calculate the mathematical average.
2. If only one of the two prepared dishes contains between 30 and 300
colonies, calculate the mathematical average of the two dishes
corresponding to this dilution.
3. If two consecutive dilutions show dishes containing between 30 and 300
colonies, calculate the mathematical average, provided that the larger
number is not more than double the smaller one. When the larger number
is more than twice the smaller one, only use the smallest count (for
example: 150 (dilution 10-1) and 350 (dilution 10-2); the ratio 350/150 is
greater than 2. Thus, use the lower number, i.e. 150, and calculate the
CFU/mL by multiplying by the dilution factor).
4. If all the dishes have less than 30 colonies, consider only the dishes in
which the dilution is the lowest (least diluted). Calculate the mathematical
average and report the results as estimates.
5. If none of the dilution dishes contain colonies and there are no inhibiting
substances present, consider the counts as "< 1.0" times the lowest
dilution factor and report the results as estimates. For example, if there
are no colonies in the 10-2 dilution (lowest), the result will be reported as
"< 1.0 x 102 ECFU/mL".
6. If all the dishes contain more than 300 colonies, consider the count closest
to 300 as an estimate. Thus, only consider dishes with the highest
dilution, i.e. the most diluted, and report the results as estimated.
7. If the number of colonies significantly exceeds 300, report the result as
"TNTC" (too numerous to count). If there are less than 10 colonies per
cm2 on the surface of the media, count in 13 squares (when using a colony
counter) having a representative distribution of colonies. Determine the
mathematical average by square and multiply by the appropriate factor to
calculate the estimated colonies per dish. Similarly, when there are more
than 10 colonies/cm2, count 4 representative squares, calculate the
mathematical average per square and calculate as indicated previously.
The factor is 57 for dishes with a surface area of 57 cm2 and 65 for dishes
with a surface area of 65 cm2.
8. When there is overpopulation in the dishes (more than 100 colonies/cm2)
report the results as estimates. For the calculation, multiply 5700 or 6500
by the highest dilution factor. For example, for a dilution of 10-3, the
ECFU will be reported as "> 5.7 x 106 ECFU/mL" or "> 6.5 x 106
ECFU/mL".
3.1.2. Membrane filtration method
Objective:
The purpose of this technique is to count the microorganisms when the
microbial population is low. A concentration of microorganisms remaining
on a membrane filter of suitable porosity is made after filtration of a sample
of given volume.
Equipment:
In addition to equipment previously referred to, the following are required:
Vacuum pump - or equivalent device;
Filtration unit (support-filter and funnel) - for membranes 47 mm diameter.
Can be made of stainless steel, borosilicate glass or autoclavable/sterile non-
autoclavable plastic;
Filtration manifold or vacuum flask;
Trap - to be inserted between the flask and the vacuum pump;
Tongs - for fixation;
Tongs with rounded sides - for membranes;
Pincers - to take hold of the filtration unit during sterilization (by flaming or
by immersion in boiling water);
Stainless steel pot - for sterilization of the filtration unit in boiling water.
Filtering membranes - cellulose esters of 47 mm diameter with hydrophobic
sides, preferably white and square with a porosity of 0.2 m, 0.45 m or 0.8
m. Preferably, use membranes in proprietary individual sterile packages.
Otherwise, sterilize them by autoclave for 10 min. at 121C.
Petri dishes - made of borosilicate glass or 60 mm sterilized plastic;
Sterilized absorbent stoppers.
Culture medium (see annex 5)
Operating method:
1. Preparation of plates
Prepare the necessary number of Petri dishes with the appropriate culture
medium. The membrane filter can be placed on a suitable gel medium or on

a solid stand - absorbent pad soaked with suitable liquid in a nutritive
medium.
a) Petri dishes with suitable gel media (see annex 5)
Deposit into 60 mL Petri dishes about 6 mL of solid medium, pre-liquefied
in a water bath or similar, and allowed to cool to 45C. Leave to solidify
on a level surface. Invert the dishes and leave for at least 2 to 3 hours
before use.
The prepared dishes can be used when they are free of contamination but
not completely dry.
b) Petri dishes with suitable liquid medium (see annex 5)
If a liquid nutritive medium is preferred, deposit the membrane on an
absorbent pad soaked with the liquid medium in Petri dishes.
For the preparation of dishes with liquid medium, open the Petri dishes
and place sterilized absorbent pads inside (there are sterilized dishes with
sterilized absorbent pads commercially available).
Generally, vials of 2 mL of sterilized liquid nutritive media or equivalent
are used. These are also available commercially.
Open a 2 mL vial of appropriate liquid medium and pour about 1.8 mL
onto an absorbent pad, spreading over the whole surface.
2. Filtration of the sample
Use autoclavable filtration equipment at the start of a series of filtrations.
Between filtrations, for steel or borosilicate glass units, sterilize with alcohol
and flame in a Bunsen burner flame or immerse in boiling water bath for 5
min. For plastic equipment, alternative sterilization methods can be used,
such as UV radiation with a two-minute exposure or other appropriate
chemical or physical agents.
Insert a trap between the vacuum flask and the vacuum pump. Attach the
filtration unit onto the vacuum flask. Fix the funnel on the filter stand with
appropriate tongs. Introduce a few milliliters of sterile water to ensure a
sound contact between the membrane and the filter support, and leave to
drain completely.
Remove the membrane filter of suitable porosity from its sterile individual
pack with flamed tongs which have been first allowed to cool. On the base of
the filter support, place the membrane filter, which must be centered with the
square facing upwards. Introduce an appropriate volume of homogenized
sample, according to the presumed population. The figure considered for the
colony count is between 20 and 200. However, for a good differentiation,
the number of colonies should not exceed 60 - 80.
Turn on the vacuum. After filtration, break the vacuum carefully to avoid a
backward surge. (The filtration volume varies, generally, from 25 to 500
mL. A sample of known volume must always be poured. If the volume of
the sample is less than 20 mL, pour enough sterilized water into the funnel to
cover the membrane and then, with a sterilized pipette, introduce the sample
to be filtered.)
Remove the funnel and take hold of the membrane with the cooled flamed
tongs and place on the culture medium in the Petri dish with the square
facing upwards. Avoid the formation of air bubbles between the membrane
and the medium, since they would prevent homogeneous contact and,
consequently, a correct microbial growth. Invert the dish and incubate in an
incubator for a suitable time and in suitable conditions according to the type
of microorganisms to be detected.
For yeasts:
Use membrane filters of 0.45 m or 0.8 m porosity, YEPD gel medium
(see annex 5) and incubate under aerobic conditions, between 20 and 25C,
for 3 to 10 days. (Comment: for the counting of yeasts, incubation for 3 days
is usually sufficient. If the presence of Dekkera/Brettanomyces is suspected,
incubation must be for 7 to 10 days)
For lactic bacteria:
Use membrane filters of 0.2 m or 0.45 m porosity, suitable gel culture
medium (see annex 5) and incubate under anaerobic or microaerophilic
conditions, at 25C. The length of incubation can be 10 days.
For acetic bacteria:
Use membrane filters of 0.2 m or 0.45 m porosity, suitable gel culture
medium (see annex 5) and incubate under aerobic conditions between 25 and
30C for 2 to 4 days. Count the developed colonies with the naked eye, with
a magnifying glass or in a colony counter. Confirm the identity of the
colonies (yeasts or bacteria) with a microscope if there are any doubts.
Test the sterility of the media, the membrane filters and the equipment by
performing a blank with a sample of sterilized water for each series of tests.
Results:
Express the results in Colony Forming Units/mL - CFU/mL (instead of
microorganisms/mL, since each colony can be the result of a microorganism
or a cluster).
When a large volume of wine is filtered, even if there are insufficient
numbers of developed colonies, the results can be presented relative to the
volume used.
If there is no colony development and there are no inhibiting substances

present, report the results as "< 1.0 CFU" by the highest volume of wine
filtered.
Count all the colonies on the membrane when there are 1 to 2 colonies per
square. If too many colonies per square have been obtained, the analysis of
the sample should be repeated if possible with a smaller quantity of sample.
If the number of colonies is too high (above 200), estimates can be made
when the colonies are not agglomerated and the distribution is representative.
If this is not possible, report the results as "TNTC" (too numerous to count).
Refer to the porosity of the membrane used and the incubation period.
3.2. Culture in liquid medium- "Most Probable Number" (MPN)
Objective:
The purpose of this technique is to evaluate the number of viable
microorganisms in wines having high contents of solid particles in suspension
and/or high incidence of plugging.
Principle
This technique is based on the estimation of the number of viable
microorganisms in liquid medium, starting from the principle of its normal
distribution in the sample.
Diluents and liquid culture media (see annexes 4 and 5)
Operating method:
Several quantitative and successive solutions are prepared and following this,
after incubation, a certain proportion of tests will not lead to any growth
(negative tests), while others will begin to grow (positive tests). If the
sample and the dilutions are homogeneous, and if the number of dilutions is
sufficiently high, it is possible to treat the results statistically, using suitable
tables (tables based on McCrady's probability calculations), and to
extrapolate this result to the initial sample.
Preparation of dilutions:
Starting from a sample of homogenized wine, prepare a series of decimal
1
dilutions ( /10) in the diluent.
Take 1 mL of wine and add to 9 mL of diluent in the first tube. Homogenize.
Take 1 mL of this dilution to add to 9 mL of diluent in the second tube.
Continue this dilution protocol until the last suitable dilution, according to the
presumed microbial population, using sterilized pipettes for each dilution.
The dilutions must be made until extinction, i.e. the absence of development
in the lowest dilutions (see the diagram to annex 2).
Preparation of inoculations:
Inoculate 1 mL of wine and 1 mL of each of the prepared dilutions, mixed at
the time, in, respectively, 3 tubes with the appropriate culture medium (see
annex 5). Mix thoroughly.
Incubate the inoculated tubes in the incubator at 25C for yeasts (3 days, up
to 10 days), under aerobic conditions, and for lactic bacteria, under
anaerobic or microaerophilic conditions (8 days, up to 10 days), making
periodic observations up to the last day of incubation.
Results:
All those tubes that show a microbial development leading to the formation
of a whitish deposit, more or less evident and/or with a more or less marked
disturbance are considered as positive. The results must be confirmed by
observation through a microscope. Specify the incubation period.
The reading of the tubes is made by noting the number of positive or
negative tubes in each combination of three tubes (in each dilution). For
example, "3-1-0" signifies: 3 positive tubes in the 100 dilution (wine), 1 in
the 10-1 dilution and zero in the 10-2 dilution.
For a number of dilutions higher than 3, only 3 of these results are
significant. To select the results allowing for the determination of the
"MPN", it is necessary to determine the "typical number" according to the
examples in the following table:
Calculation of the Most Probable Number (MPN)
Taking account of the typical number obtained, the MPN is determined
through Table A (Annex 3) based on McCrady's probability calculations,
considering the dilution made. If the dilution series is 100 ; 10-1 ; 10-2 the
reading is direct. If the dilution series is 101; 100; 10-1 the reading is 0.1
times this value. If the dilution series is 10-1; 10-2; 10-3; the reading is 10
times this value.
Comment:
If there is a need to increase the sensitivity, a concentration 101 of wine can
be used. To obtain this concentration of microorganisms in 1 mL, centrifuge
10 mL of wine and take 1 mL of deposit (after having taken 9 mL of excess
liquid) and inoculate according to the previously described method.
Expression of Results:
The microorganism content of wine must be expressed in cells per mL, in
scientific notation to one decimal place. If the content is lower than 1.0 cells
per mL, the result must be presented as "<1.0 cells per/mL".
(See annexes on following pages)
BIBLIOGRAPHY
- ANDREWS, W. et MESSER, J. (1990). Microbiological Methods. in :

AOAC Official Methods of Analysis, 15th edition, 1, 425-497, Association of
Analytical Chemist, Washington.
- BIDAN, P. (1992). Analyses Microbiologiques du Vin. F.V. O.I.V. n 910,
Paris.
- BOURGEOIS, C.M. et LEVEAU, J.Y. (1991). Techniques d'analyse et de
contrle dans les industries agro alimentaires, 2me dition, 3. Le Contrle
Microbiologique Lavoisier, Tec. & Doc., APRIA Ed. Paris.
- CARR, J. G. (1959). Acetic acid bacteria in ciders. Ann. Rep. Long Ashton
Res. Sta., 160.
- DE MAN, J. C. (1975). The probability of most probable number. European
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- LAFON-LAFOURCADE, S. et al. (1980). Quelques observations sur la
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- MAUGENET, J. (1962). Les Actobacter du cidre. Identification de quelques
souches. An. Technol. Agric., 11, 1, 45-53.
- PLARIDIS et LAFON-LAFOURCADE, S. (1983). Contrle microbiologique
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- RIBREAU-GAYON, J. et PEYNAUD, E. (1961). Trait d'Oenologie,
Tome 2, Librairie Polytechnique CH. Branger, Paris et Lige.
- Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1976).
14th edition, American Public Health Association, Incorporated, New York.
- Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1985).
16th edition, American Public Health Association, DC 20005, Washington.
- VAZ OLIVEIRA, M., BARROS, P. et LOUREIRO, V. (1995). Analyse
microbiologique du vin. Technique des tubes multiples pour l'numration de
micro-organismes dans les vins - "Nombre le plus probable" (NPP), F.V.
O.I.V. n 987, Paris.
- VAZ OLIVEIRA, M. et LOUREIRO, V. (1993). L'numration de micro-
organismes dans les vins ayant un indice de colmatage lev, Compte rendu
des travaux du groupe d'experts "Microbiologie du Vin" de l'O.I.V., 12me
session, annexe 2, Paris.
- VAZ OLIVEIRA, M. et LOUREIRO, V. (1993). L'numration de micro-
organismes dans les vins ayant un indice de colmatage lev, 2me partie,
Doc. Travail du groupe d'experts "Microbiologie du Vin" de l'O.I.V., 13me
session, Paris.
Annex 2
Preparation of dilutions and inoculations
Annex 3 - (OENO 8/95)

TABLE A
Most Probable Number (MPN) for 1 mL sample utilizing 3 tubes
with 1 mL, 0.1 mL et 0.01 mL
Positive tubes Positive tubes Positive tubes
1 0,1 0,01 MPN 1 0,1 0,01 MPN 1 0.1 0,01 MPN
mL mL mL 1 mL mL mL mL 1 mL mL mL mL 1 mL
0 0 0 0,0 2 0 2 2,0 1 1 1 7,5
0 0 1 0,3 2 1 0 1,5 3 1 2 11,5
0 1 0 0,3 2 1 1 2,0 3 1 3 16,0
0 1 1 0,6 2 1 2 3,0 3 2 0 9,5
0 2 0 0,6 2 2 0 2,0 3 2 1 15,0
1 0 0 0,4 2 2 1 3,0 3 2 2 20,0
1 0 1 0,7 2 2 2 3,5 3 2 3 30,0
1 0 2 1,1 2 2 3 4,0 3 3 0 25,0
1 1 0 0,7 2 3 0 3,0 3 3 1 45,0
1 1 1 1,1 2 3 1 3,5 3 3 2 110,0
1 2 0 1,1 2 3 2 4,0 3 3 3 >140,0
1 2 1 1,5 3 0 0 2,5
1 3 0 1,6 3 0 1 4,0
2 0 0 0,9 3 0 2 6,5
2 0 1 1,4 3 1 0 4,5
Adapted from the Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1976)
Annex 4
Diluents:
Diluents are indicated by way of example. The water to be used must be distilled,
double distilled or deionized, with no traces of metals, inhibitors or other anti-
microbial substances.
1. Physiological water
Preparation: Weigh 8.5g of sodium chloride in a 1000 mL calibrated flask.
After it has dissolved in the water, adjust the reference volume. Mix thoroughly.
Filter. Distribute 9 mL in the test tubes. Stop with cotton wool and autoclave
for 20 min at 121C.
Ringer's solution 1/4
Preparation: Weigh 2.250g of sodium chloride, 0.105g of potassium chloride,
0.120g of calcium chloride (CaCl2.6H2O) and 0,050g of sodium hydrogen
carbonate in a 1000 mL calibrated flask. After it has dissolved in water, make up
to the mark. Mix thoroughly. Distribute 9 mL in the test tubes. Stop with
cotton wool and autoclave for 15 min at 121C. (This solution is available
commercially)
Annex 5
Culture media
Culture media and antimicrobials are indicated by way of example.
The water to be used must be distilled, double distilled or deionized with no
traces of metals, inhibitors or other antimicrobial substances.
1. Solid culture media
1.1. For yeasts
YEPD medium (Yeast Extract, Peptone, Dextrose), agar medium +
chloramphenicol
Preparation: Weigh 10g of yeast extract (Difco or equivalent), 20g of
peptone, 20g of glucose and 100 mg of chloramphenicol1) in a 1000 mL
Erlenmeyer flask. Dissolve in 450 mL of water.
Then separately dissolve 20g of agar medium with 500 mL of water, in a
1000 mL Erlenmeyer, in boiling water bath, stirring frequently, avoiding
prolonged heating. After it has completely dissolved, add to the other
solution and complete the 1000 mL volume with water and mix together.
Distribute portions of 15 mL (for enumeration in plates) and 6 mL (for
enumeration by membrane filtration) in the test tubes. Stop with cotton wool
and autoclave for 15 min at 121C.
Instead of chloramphenicol, penicillin, 20U/mL, and streptomycin, 40U/mL,
can be added on the plate when the portions of media are poured onto the
plates.
1.2. For lactic bacteria
Medium of Lafon-Lafourcade et al, agar medium + actidione
Preparation: Weigh 5g of yeast extract, 10g of meat extract, 15g of trypsic
peptone, 5g of sodium acetate, 2g of ammonium citrate, 0.05g of manganese
sulfate, 0.2g of magnesium sulfate, 20g of glucose and 50 mg of actidione2)
in a 1000 mL Erlenmeyer. Dissolve in 400 mL of water and correct the pH
to 5.4 with 1N sodium hydroxide or 1N hydrochloric acid. Add 1 mL of
Tween 80.
1000 mL Erlenmeyer, in a boiling water bath, stirring frequently, avoiding
prolonged heating. After it has completely dissolved, add the other solution
and complete the 1000 mL volume with water. Mix completely and distribute
15 mL (for enumeration in plates) or 6 mL (for enumeration by membrane
filtration) in the test tubes. Stop with cotton wool and autoclave for 20 min at
121C.
1) To inhibit the growth of most of the bacteria

2) To inhibit the growth of most of the yeasts
Dubois Medium (Medium 104), agar medium + actidione

Preparation: Weigh 5g of yeast extract (Difco), 5g of peptone, 3g of L-
malic acid, 0.05g of magnesium sulfate, 0.05g of manganese sulfate and 50
mg of actidione in a 1000 mL Erlenmeyer. Dissolve in 200 mL of water.
Add 250 mL of tomato juice and correct the pH to 4.8 with 1N sodium
hydroxide or 1N hydrochloric acid solution. Add a drop of Tween 80.
1000 mL Erlenmeyer, in boiling water bath, stirring frequently, avoiding
solution and make up the 1000 mL volume with water. Homogenize and
distribute 15 mL (for enumeration in plates) or 6 mL (for enumeration by
membrane filtration) in the test tubes. Stop with cotton wool and autoclave
for 20 minutes at 121C.
TJB medium (Tomato Juice Broth), agar medium + actidione
Preparation: Weigh 5g of glucose, 2g of tryptone (Difco), 5g of peptone
(Difco), 5g of yeast extract (Difco), 1g of liver extract, and 50 mg of
actidione in a 1000 mL Erlenmeyer. Dissolve in 400 mL of tomato juice.
Correct the pH to 5.5 with 1N sodium hydroxide or a 1N hydrochloric acid.
Add a drop of Tween 80.
Then separately dissolve 20g of agar medium with 500 mL of tomato juice,
in a 1000 mL Erlenmeyer, in a boiling water bath, stirring frequently,
avoiding prolonged heating. After it has completely dissolved, add to other
solution and make up to 1000 mL volume with tomato juice. Homogenize
and distribute 15 mL (for enumeration in plates) or 6 mL (for enumeration
by membrane filtration) in the test tubes. Stop with cotton wool and
autoclave for 20 minutes at 121C.
Comment: The tomato juice used is diluted 4.2 times and filtered on Whatman
No.1 (1000 mL).
1.3 For acetic bacteria
G2 medium, agar medium + actidione
Preparation: Weigh 1.2g of yeast extract, 2g of ammonium phosphate and
50 mg of actidione in a 1000 mL Erlenmeyer flask. Add 500 mL of cider
and correct the pH to 5 with 1N sodium hydroxide or 1N hydrochloric acid.
Then separately dissolve 20g of agar medium in 450 mL of water in a 1000
mL Erlenmeyer, in boiling water bath, stirring frequently, avoiding
solution and complete the 1000 mL volume with water. Homogenize and
for 20 minutes at 121C.
Carr medium, agar medium + actidione
Preparation: Weigh 30g of yeast extract and 50 mg of actidione in a 1000
mL Erlenmeyer. Dissolve in 500 mL of water. Add 1 mL of 2.2%
bromocresol green.
Then separately dissolve 20g of agar medium in 450 mL of water, in a 1000
mL Erlenmeyer, in boiling water bath, stirring frequently, avoiding
solution and make up the 1000 mL volume with water. Mix completely and
for 15 min at 121C. At the time of liquefaction and cooling to 45C, add to
the agar medium 20 mL per liter of alcohol sterilized by filtration
(polyvinylidene fluoride membrane) and mix.
2. Liquid culture media
2.1. For yeasts
YEPD medium (Yeast Extract, Peptone, Dextrose) + chloramphenicol
Preparation: Weigh 10.0g of yeast extract (Difco or equivalent), 20g of
peptone, 20g of glucose and 100 mg of chloramphenicol. Dissolve, make up
to 1000 mL volume with water and mix.
Distribute 5 mL portions of this medium in the test tubes and autoclave for
15 minutes at 121C.
2.2. For lactic bacteria
MTJ medium (50% MRS medium "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe
Broth" + 50% TJB medium "Tomato Juice Broth") + actidione
Preparation: Weigh 27.5g of MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe
Broth" (Difco or equivalent). Add 500 mL of water, heat to boiling to
permit complete dissolution and add 20.5g of TJB "Tomato Juice Broth"
(Difco or equivalent). Add 50g of actidione. Dissolve with water in order to
obtain 1000 mL of solution having first corrected the pH to 5 with 1N
hydrochloric acid and mix.
Distribute 10 mL portions of this medium3) in the tubes and autoclave for 15
minutes at 121C.
3) The 10 mL volume is used instead of the 5 mL volume as

with yeasts, due to the greater sensitivity of lactic
bacteria to oxygen.
Detection of preservatives and fermentation inhibitors

1. Fermentability Test
1.1 Objective
To show without specifying their nature, the possible presence of one or
several substances which act as fermentation inhibitors in wine.
1.2 Principle
The wine, whose free sulfur dioxide has been bound by addition of an
aqueous solution of acetaldehyde, is brought to 10% (v/v) alcohol. Glucose is
added in order for the sugar concentration to be between 20 and 50 g/L in the
nutrient solutions.
After inoculation with a yeast strain resistant to alcohol, the fermentation is
followed by weighing the quantity of carbon dioxide released.
The fermentation rate is compared to that of an authentic natural wine similar
in make up to the wine analyzed, and also to that of the test wine whose pH
has been adjusted to 6 (the majority of the mineral and organic acids are not
active in fermentation at this pH). These two reference wines are inoculated
in the same manner as the test wine.
1.3 Apparatus
90 mL flask sealed with a rubber stopper with a hole into which is placed a
narrow tube tapered at the uppermost portion.
1.4 Reagents and media
1.4.1 Aqueous acetaldehyde solution:
Solution prepared from acetaldehyde obtained by distillation of metaldehyde
or paraldehyde, in the presence of sulfuric acid, and standardized by the
method using sodium sulfite. Adjust the concentration of the solution to 6.9 g/L.
1 mL of this solution fixes 10 mg of sulfur dioxide.
1.4.2 Nutrient Solutions:
Ammonium Sulfate, (NH4)2 SO4 ...................... 25 g/L
Asparagine .................................................. 20 g/L
These solutions must be stored in the refrigerator.
1.4.3 Culture Medium:
Solid medium: malt agar.
Powdered malt ......... .................................. 3 g
Glucose ..................................................... 10 g
Pancreatic peptone .......................................... 5 g
Powdered yeast extract ..................................... 3 g
Agar .......................................................... 20 g
Water .................................................. 1 L
pH .............................................................. 6
Sterilize for 20 min. at 118 C.
MA-E-AS4-02-RECANT 1
This mixture exists in a commercial prepared form.

Liquid medium (an option):
Divide the grape juice containing 170 to 200 g/L of sugar, in tubes
stoppered with cotton, at a rate of 10 mL per tube; sterilize in a water
bath at 100 C for 15 min.
Liquid malt: same medium as the solid medium, but without agar.
1.4.4 Culture and maintenance of the Saccharomyces bayanus strain and
preparation of the yeast.
a) Culture and maintenance of the strain on solid medium: From a collection
strain, inoculate in lines (streak) onto tubes of solid medium. These tubes
are put in an incubator at 25C until the culture is very visible (about 3
days); the tubes can be stored in the refrigerator. This is sufficient for 6
months.
b) Preparation of the yeast:
One of the tubes of the liquid medium is inoculated in accordance with
proper microbiological techniques from the strain cultivated on solid
medium; after growth (24 to 48 h), repeat 2 times successively into the
same medium enriched with 10% alcohol (v/v), to acclimate the strain.
The second culture when actively fermenting will contain about 50 million
yeast per milliliter. This culture will serve to inoculate the wine to be
5
studied. Perform a count and inoculate at a rate of 10 yeast/mL.
1.5 Procedure
- Preparation of the wine:
100 mL of wine is treated with the necessary quantity of acetaldehyde
calculated in accordance with the amount of free sulfur dioxide (44 mg of
aldehyde binds 64 mg of sulfur dioxide). Wait 24 hours and check that the
wine contains less 20 mg free sulfur dioxide per liter.
If the alcoholic strength is greater than 10% (v/v), the wine should be diluted
with one of the solutions of glucose and water in amounts calculated to result
in a sugar concentration between 20 and 50 g/L, and to reduce the strength to
about 10% (v/v). For wines containing less than 10% vol., add solid glucose
to bring without dilution the amount of sugar between these values, so the
fermentation rate is not altered by the amount of sugar.
- Fermentability test:
In a 90 mL flask, place 60 mL of wine prepared as above, 2.4 mL of
ammonium sulfate solution and 2.4 mL of asparagine solution. Inoculate with
3 drops of a 3 day old culture of Saccharomyces bayanus, to obtain an initial
5
population close to 10 yeast/mL. Install the stopper with the pointed tube,
weigh the assembly to the nearest 10 mg and place in an oven at 25C.
Weigh daily for at least 8 days.
Run each time concurrently, a wine of comparable make up and origin which
does not contain any preservative along with the test wine which has been
adjusted to pH 6.
A flask of non-inoculated wine indicates loss by evaporation.
1.6 Interpretation
In most cases, the fermentation begins within 48 hours and the daily liberation
of gas is greatest between the 3rd and the 5th day.
One can confirm the presence of a fermentation inhibitor only in the
following conditions:
a) If the fermentation does not begin or is delayed at least 2 days compared to
one of the 2 controls. When the delay is brief, it is difficult to ascertain the
presence because there may be "false positive" results, since certain natural
sweet wines sometimes behave as if they contained traces of inhibitors (in
particular sweet wines made from grapes having noble rot).
b) If the maximum daily release has not taken place between the 3rd and 5th
day, but after the 7th day, this release must be greater than or equal to 50
mg for 60 mL of wine.
c) Plotting the fermentation curve and the curve of daily release of CO2 as a
function of time can facilitate the interpretation in a difficult case.
2. Detection of the following acids: sorbic, benzoic, p-chlorobenzoic, salicylic,
phydroxybenzoic and its esters
2.1 Thin layer chromatography
2.1.1 Principle
The preservatives are extracted with ether from the previously acidified wine.
After separation by thin layer chromatography with polyamide powder, they
are located and characterized by examining the chromatogram under
ultraviolet light.
2.1.2 Apparatus
Chromatography bath.
20 x 20 cm glass plates.
Preparation of the plates - Mix thoroughly 12 g of dry polyamide powder

with 0.3 g fluorescent indicator; add, while stirring, 60 mL of methanol;
spread on plates to a thickness of 0.3 mm. Dry at normal temperature.
Note: Commercially prepared plates can be used.
2.1.3 Reagents
Diethyl ether
Methanol
Ethanol, 96% (v/v).
Sulfuric acid diluted to 20% (v/v)
Anhydrous sodium sulfate

Polyamide powder for chromatography (e.g., Macherey-Nagel or Merck).
Fluorescent indicator (F254 Merck or equivalent).
Solvent:
n-Pentane .................................................. 10 vol.
n-Hexane .................................................... 10 vol.
Glacial acetic acid ......................................... 3 vol.
Standard solutions:
Prepare standard solutions containing 0.1 g/100 mL of 96% ethanol (v/v)
of the following acids: sorbic, p-chlorobenzoic, salicylic, p-
hydroxybenzoic and its esters.
Prepare a solution of 0.2 g benzoic acid per 100 mL of 96% ethanol (v/v).
2.1.4 Procedure
Place 50 mL of wine in a separatory funnel; acidify with dilute 20% sulfuric
acid (2.1.3.4), and extract 3 times using 20 mL diethyl ether (2.1.3.1) per
extraction. Combine the washed solutions in a separatory funnel and wash
with a few milliliters of distilled water. Dry the ether with the anhydrous
sodium sulfate (2.1.3.2). Evaporate the ether dry using a 100C water bath,
or a rotary evaporator. If the evaporation is accomplished on a water bath, it
is advisable to hasten the evaporation using a mild current of air until 2 or 3
milliliters remain, then finish the evaporation cold.
Dissolve the residue in 1 mL ethanol, deposit 3 to 5 L of this solution on the
polyamide plate, as well as 3 to 5 L of the various preservative standard
alcoholic solutions (2.1.3.9). Place the plate in a chromatography tank, and
saturate with solvent vapors. Let the solvent migrate to a height of about 15
cm, which takes from 1.5 to 2.5 hours.
Remove the plate from the tank and allow to dry at normal temperature.
Examine in ultraviolet light, at a wavelength of 254 nm. The preservatives
appear from the bottom of the plate upward in the following order: p-
hydroxybenzoic acid, esters of p-hydroxybenzoic, salicylic acid, p-
chlorobenzoic acid, benzoic acid, sorbic acid.
With the exception of salicylic acid, which has a light blue fluorescence,
other preservatives give dark spots on a fluorescent yellow-green background.
Sensitivity - This technique allows determination of the following minimum
quantities of the miscellaneous preservatives expressed in milligrams per liter:
Salicylic acid .............................................. 3
Sorbic acid ............................................... 5
Esters of p-hydroxybenzoic acid ...................... 5
p-Hydroxybenzoic acid ................................ 5-10
p-Chlorobenzoic acid .................................... 5-10
Benzoic acid ............................................. 20
2.2 High performance liquid chromatography

2.2.1 Procedure
The method is performed directly on the wine, without sample preparation. It
is necessary to dilute red wines before injecting them in order to preserve the
column.
Using this method, the detection threshold of preservatives in the solution
analyzed is about 1 mg/L.
2.2.2 Operating conditions
Conditions which are appropriate are the following:
A. For the determination of sorbic and benzoic acid
Column:
Reverse phase C18, 5 m
Length: 25 cm, inside diameter: 4 mm
Mobile phase:
Solution of ammonium acetate, 0.01 M + methanol (60:40)
pH: 4.5 - 4.6 (adjusted with glacial acetic acid)
Flow rate: 1.2 mL/min.
Volume injected: 10 L
Detector: UV, 235 nm
Temperature: ambient
B. For the determination of p-chlorobenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid and
its esters
Column: see A
Mobile phase:
Solution of ammonium acetate, 0.01 M + methanol (60 : 40)
pH: 4.5 - 4.6
Flow rate: see A
Injected volume: see A
Detector: UV, 254 nm
Temperature: see A
BIBLIOGRAPHY
JUNGE Ch., Zeits. Unters. Lebensmit., 1967, 133, 319
3 Detection of the monohalogen derivatives of acetic acid

3.1 Principle
The monohalogen derivatives of acetic acid are extracted with ether from
acidified wine. The ether is then extracted using a 0.5 M sodium hydroxide
solution. The extraction solution must have the alkalinity maintained between
0.4 and 0.6 M. After the addition of thiosalicylic acid, the synthesis of the
thioindigo is implemented by the following steps:
a) Condensation of the monohalogen derivative with thiosalicylic acid and
formation of ortho-carboxylic phenylthioglycolic acid;
b) Cyclization of the acid formed in a heated alkaline medium, with the
formation of thioindoxyl;
c) Oxidation of the thioindoxyl with potassium ferricyanide in an alkaline
medium with formation of thioindigo, soluble in chloroform, in which it
gives a red color.
3.2 Apparatus
Water bath at 100C.
Mechanical stirrer.
Oven with a temperature of 200 2C.
3.3 Reagents
Diethyl ether.
Hydrochloric acid solution diluted to 1/3 (v/v). Mix one part pure
hydrochloric acid, 20 = 1.19 g/mL, with 2 parts of distilled water.
Anhydrous sodium sulfate.
Thiosalicylic acid solution: thiosalicylic acid 3 g in 100 mL sodium
hydroxide solution, 1.5 M.
Sodium hydroxide solution, 0.5 M
Potassium ferricyanide solution containing 2 g of K3Fe(CN)6 per 100 mL of
water.
Chloroform.
3.4 Procedure
Place 100 mL of test wine in an extraction flask with a ground glass stopper;
add 2 mL hydrochloric acid (3.3.2) and 100 mL diethyl ether (3.3.1). Shake
the contents vigorously for a few seconds by hand, then for 1 h with a
mechanical stirrer (3.2.2). Transfer to a separating funnel, allow to separate
and recover the ether layer.
Shake the ether extract with 8 to 10 g of anhydrous sodium sulfate (3.3.3) for
a few seconds.
Transfer the extract to the separating funnel, add 10 mL sodium hydroxide
solution, 0.5 M (3.3.5); shake for 1 min. Allow to settle.
Remove 0.5 mL of the alkaline extract and check, by titration with sulfuric
acid, 0.05 M, so that the strength falls between 0.4 and 0.6 M. Transfer the
alkaline extract contained in the separating funnel into a test tube containing 1
mL of thiosalicylic acid solution. Adjust, if necessary the strength of the
alkaline extract in order to bring it to the limits indicated, using a stronger
sodium hydroxide solution of known strength. Shake the contents of the test
tube for 30 seconds and transfer to an evaporating dish.
Place the dish on a water bath at 100C blowing its surface with a current of
cold air. Maintain the dish on the water bath at 100C for exactly 1 hour; the
residue may become practically dry in a shorter amount of time. If a crust
forms on the surface of the residue during the evaporation, it is advisable to
break or grind it up with a thin glass rod to facilitate the evaporation.
Place the dish in an oven maintained at 200 2C for exactly 30 minutes.

After cooling, recover the contents of the dish with 4 mL of water; transfer
into a separation funnel, add to the dish 3 mL of potassium ferricyanide
solution to fully dissolve any remaining residue and add to the separating
funnel. Shake for 30 seconds to facilitate oxidation. Add 5 mL chloroform,
mix using 3 to 4 inversions. Allow to separate.
A pink or red color (according to the quantity of thioindigo formed) indicates

the presence of monohalogen derivatives of acetic acid.
Sensitivity - The method allows detection of 1.5 to 2 mg monochloroacetic

acid per liter of wine and corresponding quantities of the other derived
monohalogens. Since the yield of miscellaneous extractions is not
quantitative, this method cannot be used for determining the amount of these
monohalogen derivatives in the wines.
BIBLIOGRAPHY
FRIEDLANDER, Ber. Deutsch. Chem. Gesell., 1906, 39, 1062.

RAMSEY L.L., PATTERSON W.I., J. Ass. Off. Agr. Chem., 1951, 34, 827.
PERONNET M., ROCQUES S., Ann. Fals. Fraudes, 1953, 21-23.
Trait de chimie organique, edited by V. Grignard, 1942, 19, 565-566.
Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists,
11th dition, publie par l'Association of Official Analytical Chemists,
Washington, 1970, 340-341.
TERCERO C., F.V., O.I.V., 1967, n 224.
4. Examination and determination of ethyl pyrocarbonate (diethyl

dicarbonate)
4.1 Principle
The diethyl carbonate formed by degradation of ethyl pyrocarbonate (diethyl
ester of pyrocarbonic acid) in the presence of ethanol is extracted from wine
using carbon disulfide and the quantity determined by gas chromatography.
Either of the procedures described below may be used.
4.2 Apparatus
4.2.1 Gas chromatography with flame ionization detector.
4.2.2 Columns:
- Capillary column coated with Carbowax 1540
Column length: 15.24 m
Inside diameter: 0.51 mm
- Polypropyleneglycol on Celite 545 (15:100), 60-100 mesh
Column length: 2 m
Interior diameter: 3 mm
4.3 Reagents
4.3.1 Anhydrous sodium sulfate
4.3.2 Carbon disulfide
The carbon disulfide must contain no impurities in the critical retention zone
(5 to 7 min.) for maximum sensitivity in accordance with the conditions of
gas chromatography as indicated in paragraph 4.4.2.
4.4 Procedure
4.4.1 Use of the capillary column.
Place 100 mL wine in a 250 mL separating funnel with 1 mL of carbon
disulfide (4.3.2). Mix vigorously for 1 min. The carbon disulfide phase
separated is rapidly centrifuged, then dried with anhydrous sodium sulfate
(4.3.1).
Inject 10 l of the clear liquid supernatant into the chromatograph.
Chromatography conditions:
Detector gases:
hydrogen: 37 mL/min.
air: 250 mL/min.
Gas flow:
nitrogen: 40 mL/min.
A 1/10 splitter sends to the detector the gas mixture with a flow rate of 3 to 5
mL/min.
Temperature:
injector: 150 C; oven: 80 C; detector: 150 C
Detection limits:
0.05 mg/L of wine
4.4.2 Use of the column for polypropyleneglycol.

Add 20 mL of wine and 1 mL of carbon disulfide (4.3.2) into a conical
centrifuge tube with a stopper. Agitate vigorously for 5 minutes, then
centrifuge for 5 minutes applying a centrifugal force of 1000 to 1200 g. The
liquid supernatant produced is aspirated by a thin-tipped pipette; the carbon
disulfide phase is dried with a small quantity of anhydrous sodium sulfate,
added while stirring with a glass rod. Inject 1 L of the clear liquid into the
gas chromatograph.
Chromatography conditions.
Detector gas:
hydrogen: 35 mL/min.
air: 275 mL/min.
Carrier gas flow:
nitrogen: 25 mL/min.
Temperature:
injector: 240 C
oven: 100 C
detector: 240 C
Sensitivity range:
12 x 10- A to 3 x 10- A
11 11
Chart speed:
1 cm/min.
Detection limit:
0.10 - 0.05 mg/L of wine
Under these exact conditions, diethyl carbonate displays a retention time of
about 6 min.
The calibration of the apparatus is carried out using solutions of 0.01 and
0.05% (m/v) diethyl carbonate in carbon disulfide (4.3.2).
4.5Calculation
Quantitative determination of diethyl carbonate is carried out preferably using the
internal standard method, referring to the peaks of the iso-butyl alcohol or iso-
amyl alcohol which are close to that of diethyl carbonate.
Prepare two samples of test wine: one of wine with 10 mL 10% ethanol (v/v)
added, the other the same wine to which has been added 1 mg diethyl carbonate
per liter using 10 mL of a 100 mg/L solution of diethyl carbonate in 10% ethanol
(v/v).
Treat these two samples according to one or the other of the techniques above
according to the column used.
Let:
S = the peak area of the diethyl carbonate in the spiked wine
Sx = the peak area of the diethyl carbonate in the wine,
i = the peak area of internal standard in the wine,
I = the peak area of internal standard in the spiked wine .
The concentration of diethyl carbonate in mg/L of wine is:
S
S x i S
I
In the case where standardization is carried out using a pure standard solution of
diethyl carbonate, it is necessary to predetermine the yield of the extraction with
carbon disulfide in accordance with the procedure utilized. This yield is
expressed by the extraction factor F, with a decimal number less than or equal to
1 (yield 100%).
Let:
Sx = the peak area of diethyl carbonate given by the wine,
Se = the peak area given by the injection of the same volume of a standard
solution of diethyl carbonate of concentration C in mg/L,
Vx = the volume of wine used in the extraction with carbon disulfide,
Vs = the volume of carbon disulfide used for the extraction,
Ee = the sensitivity for the recording of Sx,
The concentration of diethyl carbonate in mg/L of wine is:
C x S x E x Vs
Se x Ee x F x V
If the concentration of the two solutions injected in the chromatograph is similar,

the response is the same for the recording of Sx and of Se; the formula is
simplified and becomes:
C x S x Vs
Se x F x V
BIBLIOGRAPHY
KIELHOFER E., WURDIG G., Dtsch. Lebensmit. Rdsch., 1963, 59, 197-200 &
224-228.
PRILLINGER F., Weinberg u. Keller, 1967, 14, 5-15.
REINHARD C., Dtsch. Lebensmit. Rdsch., 1967, 5, 151-153.
BANDION F., Mitt. Klosterneuburg, Rebe u. Wein, 1969, 19, 37-39.
5. Examination of dehydroacetic acid

5.1 Principle
Wine acidified with sulfuric acid is extracted with a mixture of equal parts of
diethyl ether and petroleum ether. After evaporation of the solvent, the
extract, recovered with a small quantity of 96% ethanol (v/v) is deposited on a
thin layer of polyamide and silica gel with fluorescent indicator and subjected
to the action of the mobile solvent (benzene-acetone-acetic acid). The
dehydroacetic acid is identified and characterized by ultraviolet examination
of the chromatogram.
5.2Apparatus
5.2.1 Equipment for thin layer chromatography
5.2.2 Oven
5.2.3 Rotary evaporator
5.2.4 UV lamp 254 nm.
5.3 Reagents
5.3.1 Diethyl ether
5.3.2 Petroleum ether (boiling point 40 C)
5.3.3 Methanol
5.3.4 Sulfuric acid, 20% (v/v)
5.3.5 Anhydrous sodium sulfate.
5.3.6 Ethanol, 96% (v/v) .
5.3.7 Chromatographic separation layer: 10 g polyamide powder with
fluorescent indicator(e.g. polyamide DC II UV254 from Macherey-Nagel)
mixed vigorously with 60 mL methanol. Add while stirring, 10 ml of water
and 10ml of silica gel (with fluorescent indicator), e.g. Kiesselgel GF254
Merck. Spread this mixture on 5 plates (200 x 200 mm) to a thickness of
0.25 mm. Dry the plates at room temperature for 30 minutes, then place in a
70C oven for 10 min.
5.3.8 Migration solvent:
Crystallizable benzene .............................. 60 vol.
Acetone .............................................. 3 vol.
Crystallizable acetic acid .......................... 1 vol.
5.3.9 Reference solutions:
Dehydroacetic acid and benzoic acid, 0.2%, in alcoholic solution.
Sorbic acid, p-chlorobenzoic acid, salicylic acid, p-hydroxybenzoic acid and
its propyl, methyl and ethyl esters, 0.1 % (m/v), in alcoholic solution.
5.4Procedure
Acidify 100 mL of wine using 10 mL of 20% sulfuric acid (5.3.3), then proceed
to extract 3 times using 50 mL of a (50:50) diethyl ether-petroleum ether mixture
for each extraction. Remove the clear aqueous phase leaving an aqueous emulsion
and the ether phase. Mix again the remaining liquid in the separation flask
composed of an emulsion and the ether phase. The remaining aqueous phase
usually separates clearly from the ether phase. If there is any residual emulsion,
it should be eliminated by the addition of a few drops of ethanol.
The diethyl ether-petroleum ether phases recovered are washed with 50 mL
water, dried using sodium sulfate, then evaporated by rotary evaporator, at 30 -
35 C. The residue is recovered with 1 mL of ethanol.
Deposit 20 L of this solution on the starting line in a 2 cm wide band, or 10 L
in a circular spot. For a comparison standard, deposit 5 L of each of the
reference solutions described above. After the chromatography (ascending height
of migration 15 cm, duration 1 hour 15 min. to 1 hour 45 min., at normal
saturation of the chamber), the plate is dried at room temperature. Any
dehydroacetic acid and other preservatives present show up under a UV lamp at
254 nm.
When the examination of the chromatogram has revealed the presence of para-
chlorobenzoic acid, the propyl or methyl esters of para-hydroxybenzoic acid
which are only partly separated by this method may be identified consequently on
the extract above, following the method described in Examination of Sorbic,
Benzoic, Parachlorobenzoic Acids, 2.1. Thin layer chromatography.
BIBLIOGRAPHY
HALLER H.E., JUNGE Ch., F.V., O.I.V., 1972, n 397, Mitt. Bl. der Gd CH,
Fachgruppe, Lebensmitt. u. gerichtl. Chem., 1971, 25, n 5, 164-166.
6. Sodium Azide
6.1 Method by high performance liquid chromatography
6.1.1 Principle
Hydrazoic acid isolated in wine using double distillation is identified after
derivatization with 3,5-dinitrobenzoyl chloride, by high performance liquid
chromatography. Detection is carried out by ultraviolet absorption
spectrophotometry at 240 nm.
6.1.2 Apparatus
6.1.2.1 Distillation apparatus (distillation apparatus for determination of
alcoholic strength); the end of the condenser terminating in a tampered tube
6.1.2.2 500 mL spherical flasks with ground glass necks
6.1.2.3 10 mL flask with a ground glass stopper
6.1.2.4 Apparatus for HPLC

Operating conditions:
Column: C18, 25 cm long.
Mobile Phase: acetonitrile-water (50:50)
Flow rate: 1 mL/min.
Volume injected: 20 L
Detector: ultraviolet absorption spectrophotometer at 240 nm
Temperature: ambient
6.1.3 Reagents
6.1.3 Sodium hydroxide, 5% (m/v).
6.1.3.2 Sulfuric acid solution, 10% (m/v).
6.1.3.3 Indicator reagent: methyl red 100 mg, and methylene blue 50 mg,
100 mL alcohol, 50% (v/v).
6.1.3.4 Acetonitrile for chromatography.
6.1.3.5 Derivatizing reagent: 3,5-dinitrobenzoyle chloride, 10% (m/v), in
acetonitrile.
6.1.3.6 Buffer solution of sodium acetate, pH 4.7: mix 1 volume of sodium
acetate solution, NaC2H3O2.3H2O, 1 M, with 1 volume acetic acid solution,
1 M.
6.1.3.7 Sodium azide, NaN3.
6.1.4 Procedure
6.1.4.1 Preparation of the sample.
Into a spherical flask with a ground glass neck, place 100 mL of wine, distill
by plunging the end of the condenser in 10 mL of 5% sodium hydroxide
solution (6.1.3), to which are added a few drops of reagent indicator. Distill
until 40-50 mL of distillate is recovered.
Transfer the distillate into another spherical flask (6.1.2.2), rinse the flask
twice with 20 mL of water and add water to bring to 100 mL. To eliminate
the ethanol, attach the flask to the distillation apparatus and eliminate about
50 mL of distillate (reduce the volume by half).
Cool the flask completely. Acidify with 10% sulfuric acid. Distill, recover
the distillate into a 10 mL flask with a ground glass stopper containing 1 mL
of water, and immerse in an iced bath. Stop the distillation when the total
volume reaches 10 mL.
6.1.4.2 Derivitization
Mix 1 mL distillate (6.1.4.1), 0.5 mL of acetonitrile, 0.2 mL buffer solution
and 30 L of derivatizing reagent and stir vigorously; leave for five minutes.
6.1.4.3 Chromatography
Inject 20 L in accordance with the conditions specified, the hydrazoic acid
derivative has a retention time of about 11 minutes. Detection limit: 0.01
mg/L.
Note: Sometimes another substance not derivatized can simulate hydrazoic

acid. It is necessary to verify a positive result as follows: inject 20 L of
distillate directly; a disappearance of the peak indicates the presence of
hydrazoic acid.
6.1.5 Calculation
To determine the concentration of sodium azide, compare the sample response
to that of the standard solution after derivatization. Take into account the
concentration factor 10 of the sample of wine at the time of analysis.
6.2 Colorimetric method
6.2.1 Principle
Hydrazoic acid, which is very volatile, is separated by double distillation,
permitting the elimination of ethanol, acetic acid and sulfur dioxide. Then the
amount is determined colorimetrically after forming a colored complex with
ferric chloride (maximum absorbance at 465 nm).
6.2.2 Apparatus
6.2.2.1 Simple distillation apparatus, consisting of a 500 mL flask with a
ground glass neck and a condenser ending in a pointed tube
6.2.2.2 Spectrophotometer with optical glass cells 1 cm path length
6.2.3 Reagents
6.2.3.1 Sodium hydroxide solution, 1 M
6.2.3.2 Sulfuric acid, 1 M
6.2.3.3 Hydrogen peroxide, 3% (v/v), whose strength must be adjusted just
before use using a solution of potassium permanganate, 0.02 M; where p mL
equals the volume which oxidizes 1 mL of the hydrogen peroxide solution,
3%
6.2.3.4 Ferric chloride solution at 20 g per liter of Fe III: (weigh 96.6 g of
FeCl3.6H2O, or more as this salt is very hygroscopic; control the
concentration of Fe III of the solution and adjust if necessary to 20 0.5 g
per liter)
6.2.3.5 Stock solution of sodium azide, NaN3, at 1 g per liter in distilled
water
6.2.3.6 200 mg per liter sodium azide solution prepared by dilution of the
solution at 1 g per liter
6.2.4. Procedure
a) Into a 500 mL flask with a ground glass neck, place 200 mL of wine,
distill, recover the distillate in a 50 mL volumetric flask, containing 5 mL
water, which is immersed in an iced bath. Stop the distillation when the
total volume reaches about 50 mL.
b) Transfer quantitatively the distillate into another 500 mL flask with a
stopper and rinse the 50 mL flask twice with 20 mL of water.
Neutralize using 1 M sodium hydroxide solution (6.2.3.1) (using pH

indicator paper).
Acidify using 10 mL 1 M sulfuric acid (6.2.3.2), mix, then oxidize the
sulfur dioxide by adding 3% hydrogen peroxide solution (6.2.3.3.).
If the wine contains S mg per liter of sulfur dioxide, and if p mL is the
volume of 0.02 M potassium permanganate solution necessary to oxidize 1
mL of 3% hydrogen peroxide solution, then for 200 mL of wine use the
following calculation:
S = S mL of H2O2 solution
5 x 3.2p 16p
Bring the volume to about 200 mL by addition of distilled water.
Distill, recover the distillate in a 50 mL glass flask containing 5 mL
distilled water, which is immersed in an ice bath; stop the distillation
before the measurement line, bring back to ambient temperature and adjust
the volume to 50 mL.
c) Add 0.5 mL (measured exactly) of ferric chloride solution, mix and
measure immediately (maximum delay 5 min.) the absorbance at 465 nm
in a 1 cm cell; the zero of the apparatus is set using a blank composed of
50 mL of water added to 0.5 mL of ferric chloride solution.
d) Preparation of the standard curve.
Into each of five 50 mL volumetric flasks add 1, 2, 3, 4, and 5 mL of 200
mg/L sodium azide solution respectively, bring the volume to 50 mL with
distilled water, add 0.5 mL of ferric chloride solution and measure the
absorbance at 465 nm.
These solutions contain 4, 8, 12, 16, 20 mg of sodium azide per liter. The
corresponding concentrations are 1, 2, 3, 4, and 5 mg per liter of wine.
The typical curve of absorbance variation as a function of concentration is
a straight line passing through the origin.
6.2.5 Calculation
Plot the absorbance read for the sample analyzed on the straight line and
interpolate the concentration of sodium azide in mg/L of wine.
BIBLIOGRAPHY
HPLC method:
SEARIN S.J. & WALDO R.A., J. Liquid. Chrom., 1982, 5(4), 597-604.
BATTAGLIA R. & MITISKA J., Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1986, 182, 501-502.
Colorimetric method:
CLERMONT S. & CHRETIEN D., F.V., O.I.V., 1977, n 627.
Differentiation of fortified musts and sweet fortified wines
Differentiation of Fortified Musts

and Sweet Fortified Wines
1. Principle of the method
1.1 Method of screening
The product definitions given by the O.I.V. (International Code of Enological
Practices) imposes for fortified wines, a minimum of 4% acquired alcohol
derived naturally by fermentation; and allows, for fortified musts, a
maximum of 1% acquired alcohol. Consequently, these products may be
differentiated by identifying their fermentation by-products via gas
chromatography.
This method is applicable only if, as the definition anticipates, the alcohol
used for production of the fortified musts is neutral.
1.2 Scientific investigation of citramalic acid by thin layer chromatography.
The presence of citramalic acid characterizes sweet fortified wines. Its
identification is carried out by thin layer chromatography after separation of
the sugars with the use of an ion exchange column.
2. Method of screening
2.1 Apparatus
Gas chromatograph with:
Flame ionization detector,
3 m stainless steel column, 2 mm interior diameter,
Stationary phase: Carbowax 20 M 20%,
Support: Chromosorb W 60/80 mesh.
Chromatography conditions:
temperatures:
injector: 210C
detector: 250C
oven: isothermal at 70C for 6 minutes; then programmed at
6C/minute; upper temperature limit: 170C
Other types of columns can be used.
The procedure described below is given as an example.
2.2 Procedure
2.2.1. Sample preparation
Carry out a separation according to the following conditions: To 25 mL of
sample (fortified must or sweet fortified wine) are added to 7 mL ethanol and
15 g of ammonium sulfate, (NH4)2SO4, agitate. Allow to settle to obtain
separation of the phases.
MA-E-AS5-01-DIFMIS 1
Inject 2 L of the organic phase and carry out the chromatography in
accordance with the conditions indicated above.
The chromatogram of the fortified wine is differentiated by the presence of
the peaks of the secondary products of alcoholic fermentation.
3. Investigation of citramalic acid by thin layer chromatography.
3.1 Apparatus
3.1.1 Glass column about 300 mm in length and 10-11 mm interior diameter
supplied with a flow regulator (stopcock)
3.1.2 Rotary vacuum evaporator
3.1.3 Oven at 100 C
3.1.4 Chromatography developing chamber
3.1.5 Micrometric syringe or micropipette
3.2 Reagents
3.2.1 Formic acid solution, 4 M, containing 150.9 mL formic acid (20 =
1.227 g/mL) per liter.
3.2.2 Plates for chromatography ready to use with a layer of cellulose
powder (for example MN 300) (20 x 20 cm).
3.2.3 Solvent:
iso-Propyl alcohol containing 1 g/L bromophenol blue .... 5 vol.
Eucalyptol ...................................................... 5 vol.
Formic acid (20= 1.227 g/mL) ............................. 2 vol.
Saturate the solvent with water and allow to stand for 24 hours before use.
3.2.4 Standard solutions.
Prepare an aqueous solution of:
Citramalic acid ................................................. 0.25 g/L
Lactic acid ........................................................ 0.5 g/L
Citric acid ...................................................... 0.5 g/L
Tartaric acid ..................................................... 1.0 g/L
Malic acid ...................................................... 1.0 g/L
3.3 Procedure
3.3.1 Preparation of the ion exchange column.
See chapter on Tartaric acid, usual method in 3.3.1.
3.3.2 Isolation of the organic acid of citramalic acid
Proceed as indicated in the chapter Tartaric acid, usual method in 3.3.2. for
the fixation of organic acids on the ion exchanger.
Then elute the fixed acids using the 4 M formic acid solution (100 mL),
collecting the eluate in a 100 mL volumetric flask.
Concentrate the eluate dry in a rotary evaporator at 40C recovering the
residue with 1 mL of distilled water.
The cellulose plate must be activated by placing it in the oven at 100C for 2
hours.
Deposit on the starting line of the cellulose plate in a band 2 cm wide, 10 L
of this solution as well as 10 L of the standard solutions of citramalic acid
and the other organic acids.
Place the plate in the chromatography bath, above the solvent, for 45 minutes.
Proceed with the development and let the solvent migrate to a height of 15
cm.
3.3.4 Development of the chromatogram
Maintain the plate at ambient temperature under an air current, until the
formic acid of the solvent is eliminated. Yellow spots appear on a blue
background, indicating the presence of the acids.
Detect the presence or absence of citramalic acid in the product analyzed by
comparing the spots of this chromatogram to the spots of standard solutions of
citramalic acid and the other organic acids.
BIBLIOGRAPHY
Method of Screening:
HARVALIA A., F.V., O.I.V., 1980, n 728 bis.
Chromatography of citramalic acid:
DIMOTAKI-KOURAKOU V., Ann. Fals. Exp. Chim., 1960, 53, 149.
DIMOTAKI-KOURAKOU V., C. R. Ac. Sci., Paris 1962, 254, 4030.
CARLES J., LAMAZOU-BETBEDER M. & PECH M., C. R. Ac. Sci., Paris
1958, 246, 2160.
CASTINO M., Riv. Vit. Enol., 1967, 6, 247.
KOURAKOU V., F.V., O.I.V., 1977, n 642.
JUNGE Ch F.V., O.I.V., 1978, n 679.
ROUEN J., F.V., O.I.V., 1979, n 691.
RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV
Annexe B
Modles de certificats danalyse
MA-F-ANNEXE-B
COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS -OIV
Rules for the implementation of the analytical methods
Rules for the implementation of the analytical methods
The control of the quality of wines should always allow, on one hand, a sensory
examination and, on the other hand, the determination of the essential
characteristic elements of their composition.
Sensory analysis has not been studied in the present book; it is left to the
evaluation of the various countries, but is required in every case.
With regard to the elements of the composition of wines, three types of
determinations can or must be performed:
1. The determinations that serve to identify the wines and can serve as basis of
commercial transactions (Certificate no. 1);
2. The determinations that permit us to ascertain satisfactorily the qualities and
characteristics of a wine and which, in this manner, correspond to trade
practices (Certificate no. 2).
Determinations other than anticipated in the Certificates numbers 1 and 2 can
be required within a contractual framework.
3. A third Certificate (no. 3) can be considered which would contain specific
determinations that are only carried out on an exceptional or special basis.
Resorting to the determinations aimed at Certificate no. 2 could be such as to
exonerate the operators from liability.
The recourse to the determinations of the Certificate no. 3 could be such as to
exonerate importers from liability.
When the public health is involved, other determinations can be required either
by the OIV, the public authorities, or by all interested parties when serious
doubts appear in the industry or among consumers.
The public health exception may be submitted, by all parties interested, to the
special group of scientific experts of the Office according to an emergency
procedure.
The analytical determinations are performed, when they exist, according to the
methods described in the present book.
MA-E-B1-01-REGAPL 1
Certificates of analysis
Certificates of Analysis
Certificate No. 1
- Color
- Clarity
- Specific gravity at 20C
- Alcoholic content at 20C
- Total dry extract g/L
- Sugar g/L
- Total sulfur dioxide mg/L
- pH
- Total acidity meq/L
- Volatile acidity meq/L
- Test for malvidin diglucoside
- Over pressure measurement of carbon dioxide in sparkling wines
- Differentiation of very sweet wine and fortified must in the case of
sweet wines
Certificate No. 2
Certificate No. 1 is completed and the following determinations are added:

- Ash and alkaline ash g/L
- Potassium g/L
- Iron mg/L
- Copper mg/L
- Free sulfur dioxide mg/L
- Sorbic acid mg/L
- Verification of malolactic fermentation
- Citric acid mg/L
- Tartaric acid g/L
- Folin-Ciocalteu Index
- Chromatic Indexes
The following determinations are optional:
- Excess sodium mg/L
- Calcium, magnesium mg/L
- Sulfates mg/L
- Test of fermentability
- Test for artificial colorants
MA-E-B1-02-MODCER 1
Annexe C
Limites maximales acceptables

de divers lments
MA-F-ANNEXE-C
COMMENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS-OIV
Maximum acceptable limits of various substances contained in wine
Maximum acceptable limits of various substances

contained in wine
Citric acid: 1 g/L
Volatile acidity: 20 milliequivalents/L

The volatile acidity of various specially fortified old
wines (wines subject to special legislation and
controlled by the government) may exceed this
limit.
Arsenic: 0.2 mg/L
Boron: 80 mg/L (expressed as boric acid)
Bromine: 1 mg/L (limit exceeded by way of exception in

wines from certain vineyards with a brackish
subsoil).
Cadmium: 0.01 mg/L
Copper: 1 mg/L
Diethylene glycol: 10 mg/l, to the quantification limit
Malvidol diglucoside: 15 mg/L (determined by the quantitative method

diglucoside described in the Compendium)
MA-E-C1-01-LIMMAX 1
Total sulfur dioxide at the time of sale to the consumer: (oeno 9/98)
150 mg/L for red wines containing a maximum
of 4 g/L of reducing substances.
200 mg/L for white and ros wines containing a
maximum of 4 g/L of reducing substances.
300 mg/L: red, ros and white wines containing
more than 4 g/L of reducing substances.
400 mg/L: in exceptional cases some sweet white
wines.
Ethanediol /Ethylene glycol: 10 mg/l
Fluoride: (oeno 8/91) 1 mg/L except for wines coming from vineyards
treated in conformity with national law, with
cryolite in which case, the level of fluoride must not
exceed 3 mg/L.
Methanol: 400 mg/L for red wines

(oeno 19/2004) 250 mg/L for white and ros wines
Ochratoxin A : 2 g/L (for wines obtained as from the 2005 harvest)

(CST 1/2002)
Lead: (oeno 1/96) 0.2 mg/L
Propan-1,2-diol/propylene Still wines : = 150 mg/L

glycol
Sparkling wines : = 300 mg/L
(oeno 20/2003)
Excess sodium: 60 mg/L (2.6 milliequivalents/L) (limit exceeded in

exceptional cases in wines produced in vineyards
recognized as such by the official agencies)
MA-E-C1-01-LIMMAX 2
Sulfates: 1 g/L
(expressed as potassium However this limit is raised to:
sulfate)
- for wines which have undergone a
maturing period in casks for at least 2
years
- for sweetened wines
1.5

- for wines obtained by the addition to g/L
the musts or wine of alcohol or potable
spirit
- for wines with added concentrated
musts 2.0
- for naturally sweet wines g/L
- for wines obtained under a film "sous 2.5
voile"
g/L
Zinc 5 mg/L
MA-E-C1-01-LIMMAX 3
Annexe D
Avis
MA-F-ANNEXE-D
Gluconic acid
Gluconic acid
Gluconic acid is always present in musts and wines.
In wines derived from a sound, mature harvest, its level does not exceed 200
300 mg/L.
Gluconic acid increases through overripening by raisining and especially by the

intervention of Botrytis cinerea.
Its presence at higher levels in wines other than wines infected with noble rot
of which gluconic acid is a characteristic constituent cannot be considered a
sign of bad quality linked to a harvest seized with gray rot, which must be
demonstrated by other means. ln fact, by appropriate vinification techniques, it is
possib1e to obtain wines of quality in this case.
As to fraud by addition of gluconic acid, this is not a factor to be taken into

account since there is no reason for it.
MA-E-D1-01-ACIGLU 1
Characterization of wines resulting from overpressing
Characterization of wines resulting from overpressing

NOTICE
In view of the results of the discussions concerning the tests on DESCRIPTIVE

CHARACTERISTICS OF WINES RESULTING FROM OVERPRESSING, the
experts have confirmed that, for the group of tests done, the behavior of wines is
very different depending on the variety. This renders immpossib1e all
interpretation concerning wines coming from several varieties.
Moreover, the effects of the different methods of pressing and of vinification

techniques, such as prefermentation maceration, must be taken into account.
Studies must be pursued to show wines resulting from overpressing and a

definition of overpressing sought after.
MA-E-D1-02-SURPRE 1
The level of sodium and chloride ions in wines
The level of sodium and chloride ions in wines

NOTICE
The level of Chloride and sodium ions in wines essentially depends on the
geographic, geologic and climatic conditions of vine culture.
As a general rule, the levels of these ions are low.
the content of these elements is increased in wines coming from vineyards which
are near the sea coast, which have brackish subsoil or which have arid ground
irrigated with salt water and the molar ratio cf Cl/Na+ therefore varies
significantly and can even have a value close to one (1) which could imply the
addition of salt (NaCl) to the wine.
When wine contains excess sodium (excess sodium is equal to the content of
sodium ions less the content of chloride ions expressed as sodium), it is generally
less than 60 mg/L, a limit which may be exceeded in exceptional cases.
The laboratories and official control agencies, confronted with elevated levels of
Cl and/or Na+, must take the above conclusions into account and possib1y make
inquiries to the official agencies of the country of origin before expelling these
wines.
MA-E-D1-03-TENION 1
Annexe E
Assurance qualit
dans les laboratoires
MA-F-ANNEXE-E
RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV
Principe de validation - Mthodes usuelles Mthodes de rfrence
Principe de validation des mthodes usuelles

par rapport aux mthodes de rfrence
Rsolution oeno 7/98
LOIV reconnat lexistence, ct des mthodes danalyse des vins dcrites dans
le Recueil des mthodes internationales danalyse des vins et des mots, de
mthodes usuelles le plus souvent automatises. Ces mthodes sont
conomiquement et commercialement importantes car elles permettent dassurer un
encadrement analytique complet et efficace autour de la production et de la mise en
march des vins. Par ailleurs, ces mthodes permettent la mise en oeuvre des
moyens modernes danalyse et le dveloppement et ladaptation des techniques
danalyse.
Afin de permettre aux laboratoires dutiliser ces mthodes et dassurer leur

raccordement aux mthodes dcrites dans le Recueil, lOIV dcide la mise en place
dun protocole dvaluation et de validation par un laboratoire dune mthode
usuelle alternative, automatise ou non par rapport une mthode rfrentielle
dcrite dans le Recueil des mthodes internationales danalyse des vins et des
mots.
Ce principe, qui sera adapt au cas particulier de lanalyse des vins et des mots
sinspirera des normes internationales en vigueur et permettra au laboratoire
dvaluer et de valider sa mthode alternative.
MA-F-AS1-05-PPEVAL 1
Etude collaborative
tude collaborative
Ltude collaborative a pour but de donner une indication quantitative sur
lexactitude dune mthode danalyse, exprime par la rptabilit r et la
reproductibilit R.
La rptabilit reprsente la valeur au-dessous de laquelle est situe, avec une
probabilit spcifie, la valeur absolue de la diffrence de deux rsultats
individuels obtenus partir de mesures effectues dans les mmes conditions
(mme oprateur, mme appareil, mme laboratoire, et un court intervalle de temps).
La reproductibilit reprsente la valeur au-dessous de laquelle est situe, avec une
probabilit spcifie, la valeur absolue de la diffrence de deux rsultats
individuels obtenus dans des conditions diffrentes (oprateurs diffrents,
appareillages diffrents, et/ou laboratoires diffrents, et/ou poques diffrentes).
Le terme rsultat individuel est la valeur obtenue lorsquon applique, une fois et
compltement, la mthode dessai normalise sur un seul chantillon. En labsence
dindication, la probabilit est de 95%.
Principes gnraux
La mthode soumise lessai doit tre normalise, cest--dire choisie parmi les
mthodes existantes comme convenant le mieux pour tre applique
ultrieurement de faon gnrale.
Le protocole doit tre clair et prcis.
Le nombre des laboratoires participant doit tre de 10 au moins.
Les essais doivent tre effectus sur des lots prlevs dans un lot homogne du
matriau.
Les teneurs en substance analyser doivent couvrir les concentrations
gnralement rencontres.
Les participants doivent avoir une bonne exprience de la technique employe.
Toutes les expriences doivent tre effectues lintrieur dun mme laboratoire
par le mme analyste.
La mthode doit tre suivie de faon aussi rigoureuse que possible. Toute
dviation de la mthode dcrite doit tre indique.
Les valeurs exprimentales doivent tre dtermines dans des conditions
strictement identiques : sur le mme type dappareil, etc.
Elles doivent tre dtermines indpendamment les unes des autres, lune
immdiatement aprs lautre.
Les rsultats doivent tre exprims par tous les laboratoires avec la mme unit,
le mme nombre de chiffre aprs la virgule, savoir un chiffre de plus qu
lordinaire.
Il faut dterminer cinq valeurs exprimentales exemptes de valeurs aberrantes.
Sil y a une valeur exprimentale aberrante selon le test de Grubbs, il faut refaire
trois mesures supplmentaires.
MA-F-AS1-07-ETCOL 1
Etude collaborative
Modle statistique
Les mthodes statistiques exposes dans ce document sont donnes pour un niveau
(concentration, chantillon). Sil y a diffrents niveaux, lvaluation statistique doit
se faire sparment pour chaque niveau.
Si lon trouve une relation linaire (y = bx or y = a + bx) entre la rptabilit (r) ou
la reproductibilit (R) et la concentration ( x), une rgression de r (ou R) en
fonction de x peut tre effectue.
Les mthodes statistiques donnes ci-dessous prsupposent des valeurs alatoires
normalement distribues.
Les tapes suivre sont les suivantes :
A/ limination des valeurs aberrantes au sein dun mme laboratoire par le test de
Grubbs. Les valeurs aberrantes sont celles qui scartent si fortement des autres
valeurs exprimentales que ces carts ne peuvent tre considrs comme
fortuits et que les causes de ces carts ne peuvent tre dtermines.
B/ Examiner si tous les laboratoires travaillent avec la mme prcision en
effectuant une comparaison des variances par le test de Bartlett et le test de
Cochran. liminer les laboratoires pour lesquels on obtient des valeurs
statistiquement aberrantes.
C/ Dpister les erreurs systmatiques des laboratoires restants par une analyse de
variance et prciser par le test de Dixon les valeurs extrmes aberrantes. liminer les
laboratoires pour lesquels on obtient des valeurs statistiquement aberrantes.
D/ A partir des rsultats restants, calculer lcart-type de rptabilit sr et la
rptabilit r, lcart-type de reproductibilit SR et la reproductibilit R.
Notation :
Les dsignations suivantes ont t choisies.
M Nombre de laboratoires
i(i = 1, 2... m) Indice (n. du laboratoire)
ni Nombre des valeurs individuelles du i-me laboratoire
m
N = n i Nombre total des valeurs individuelles
i =l
x(i = 1, 2... ni) Valeur individuelle du ime laboratoire

1 ni
xi =
ni
x
i =1
i
Valeur moyenne du ime laboratoire
m
1 ni
x=
N i =1 i =1
xi Valeur moyenne totale
si =
1 ni
xixi
n i-1 i =1
( )
2
Ecart-type du ime laboratoire
MA-F-AS1-07-ETCOL 2
Etude collaborative
A/ Vrification des valeurs aberrantes au sein dun laboratoire

Aprs avoir dtermin 5 valeurs individuelles x , on excute au laboratoire le test
i
de Grubbs pour dpister les valeurs aberrantes.
On teste lhypothse nulle selon laquelle la valeur exprimentale ayant le plus
grand cart absolu par rapport la moyenne nest pas une observation aberrante.
x*i xi
On calcule PG =
si .
x*
i = valeur suspecte.
On compare PG avec la valeur correspondante indique au tableau 1 pour P = 95%.
Si PG < valeur lue, la valeur x* nest pas une valeur aberrante et on peut calculer s .
i i
Si PG > valeur lue, la valeur x* est probablement une valeur aberrante et on refait
i
trois dterminations supplmentaires.
On calcule nouveau pour x* le test de Grubbs avec les huit dterminations.
i
Si PG > valeur correspondante pour P = 99%, on considre x* comme une valeur
i
aberrante et on calcule s sans x*.
i i
B/ Comparaison des variances entre les diffrents laboratoires
- Test de Bartlett
Le test de Bartlett permet dexaminer aussi bien les grandes variances que les
petites. Il sert tester lhypothse nulle de lgalit des variances dans tous les
laboratoires par opposition avec lhypothse alternative selon laquelle les variances
sont ingales pour quelques laboratoires au moins.
Il a pour condition quil y ait au moins 5 valeurs individuelles par laboratoire.
On calcule la statistique du test :
m

PB = 1 (N m ) ln s 2I
C f
i =1
i ln si2

m
1 1
fi N m
C= i =1
+1
3 (m1)
m
fs 2
i I
sI = i =1
*
N m
fi = ni - 1 degrs de libert de si.
MA-F-AS1-07-ETCOL 3
Etude collaborative
On compare PB avec la valeur indique au tableau 2 la distribution de x2 avec m

- 1 degrs de libert.
Si PB > la valeur du tableau, il y a des diffrences entre les variances.
A laide du test de Cochran, on peut vrifier que la variance dun laboratoire est
plus grande que celle dautres laboratoires.
2
max
PC = sim
s
i =1
2
i
On compare PC avec la valeur indique au tableau 3 pour m et n P = 99%.

i
Si PC > la valeur du tableau, la variance est significativement plus grande que les
autres.
Sil y a un rsultat significatif du test de Bartlett ou du test de Cochran, on peut
liminer la variance aberrante et calculer le test statistique nouveau.
A dfaut dune mthode statistique approprie au test simultan de plusieurs
valeurs aberrantes, lapplication rpte des tests est propose comme un moyen
utile. Cependant, les tests nont pas t prvus dans cet objectif et il faut prendre
beaucoup de prcautions lors des conclusions.
Si les laboratoires prsentent des variances divergeant fortement les unes des
autres, il faut effectuer une analyse pour en dtecter les causes et dcider si les
valeurs exprimentales trouves par ces laboratoires doivent tre limines ou non.
Dans cette ventualit, il faut tudier la question de la reprsentativit des
laboratoires restants.
Si le rsultat indique quil y a des variances diffrentes, ceci montre que les
laboratoires ont excut mthodes avec une prcision diffrente. De grandes
dispersions peuvent tre dues par exemple linsuffisance de pratique ou aussi au
manque de clart ou linsuffisance de la description de la mthode danalyse.
C/ Erreurs systmatiques
On examine si les laboratoires ont fait des erreurs systmatiques par la mthode
danalyse de variance selon R.A. Fischer ou par le test de Dixon.
Analyse de variance selon R. A. Fischer
Ce test sapplique aux valeurs exprimentales restantes des laboratoires ayant une
variance identique.
On teste si la dispersion des valeurs moyennes des laboratoires est fortement plus
grande que celle des valeurs individuelles exprimes par la variance entre les
laboratoires ( s2Z ) et la variance au sein des laboratoires ( s2I ).
MA-F-AS1-07-ETCOL 4
Etude collaborative
2
PF = s Z2
sI
n (x x)
m 2
s Z = m1-1
2
i i
i=1
(x x )
m ni
2
2
sI = 1
i
N m i=1 i=1
i
On compare PF avec la valeur correspondante indique dans le tableau

(distribution de F) avec fi = fZ = m - 1 et f2 = f1 = N - m degrs de libert.
Si PF > la valeur du tableau, on peut conclure la prsence de diffrences entre
les moyennes, cest--dire la prsence derreurs systmatiques.
Test de Dixon
Ce test permet de vrifier que la moyenne dun laboratoire est plus grande ou plus
petite que celle des autres laboratoires.
Soit une srie de donnes Z(h), h = 1,2,3...H, ranges par ordre croissant.
Z (2 )Z (1) Z (H )Z (H 1)
37 Q10= ou
Z (H )Z (1) Z (H ) Z (1)
Z (2 )Z (1) Z (H )Z (H 1)
8 12 Q11= ou
Z (H 1) Z (1) Z (H ) Z (2 )
Z (3) Z (1) Z (H )Z (H 2 )
13 ou plus Q 22= ou
Z (H 2) Z (1) Z (H ) Z (3)
On compare la valeur plus grande de la fonction Q avec les valeurs critiques

indiques dans le tableau 5.
Si la statistique est > la valeur du tableau P = 95%, la moyenne xi examine peut
tre considre comme valeur aberrante.
Sil y a un rsultat significatif dans lanalyse de variance selon R.A. Fischer ou au
test de Dixon, on limine lune des valeurs extrmes et on calcule la statistique du
MA-F-AS1-07-ETCOL 5
Etude collaborative
test de nouveau par les valeurs restantes. En ce qui concerne lapplication rpte
des tests : voir les explications du paragraphe B.
Si les laboratoires font des erreurs systmatiques, les valeurs exprimentales
correspondantes en cause ne doivent en aucun cas tre prises en considration dans
les calculs ultrieurs. Il faut analyser les causes de lerreur systmatique.
D/ Calcul de la rptabilit (r) et de la reproductibilit (R).

A partir des rsultats restants aprs limination des valeurs aberrantes, on calcule
lcart-type de rptabilit sr et la rptabilit r, ainsi que lcart-type de
reproductibilit sR et la reproductibilit R, qui sont indiqus comme valeurs
caractristiques de la mthode danalyse.
m
sr = 1
N m fs
i =1
2
i i r =s r2 2
[
s R = a1 s Z + (a 1)s I
2 2
] R =s R2 2
m
ni
2
a = 1 N
m1 i =1

n
Sil ny a pas de diffrence entre les moyennes des laboratoires, il ny a pas non
plus de diffrence entre sr et sR et entre r et R. Cependant, si lon a constat des
carts entre les moyennes des laboratoires, qui peuvent toutefois tre tolrs pour
des considrations dordre pratique, il faut indiquer sr et sR, r et R.
MA-F-AS1-07-ETCOL 6
Etude collaborative
BIBLIOGRAPHIE
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SACHS L., Statistische Auswertungsmethoden, Springer Verlag, Berlin,

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MA-F-AS1-07-ETCOL 7
Etude collaborative
Tableau 1 - Valeurs critiques pour le test de Grubbs

ni P = 95% P 99%
3 1,155 1,155
4 1,481 1,496
5 1,715 1,764
6 1,887 1,973
7 2,020 2,139
8 2,126 2,274
9 2,215 2,387
10 2,290 2,482
11 2,355 2,564
12 2,412 2,636
Tableau 2 Valeurs critiques pour le test de Bartlett (P = 95%)

f(m - 1) X2 f(m - 1) X2
1 3,84 21 32,7
2 5,99 22 33,9
3 7,81 23 35,2
4 9,49 24 36,4
5 11,07 25 37,7
6 12,59 26 38,9
7 14,07 27 40,1
8 15,51 28 41,3
9 16,92 29 42,6
10 18,31 30 43,8
11 19,68 35 49,8
12 21,03 40 55,8
13 22,36 50 67,5
14 23,69 60 79,1
15 25,00 70 90,5
16 26,30 80 101,9
17 27,59 90 113,1
18 28,87 100 124,3
19 30,14
20 31,41
MA-F-AS1-07-ETCOL 8
Etude collaborative
Tableau 3 Valeurs critiques pour le test de Cochran

ni = 2 ni = 3 ni = 4 ni = 5 ni = 6
m 99% 95% 99% 95% 99% 95% 99% 95% 99% 95%
2 - - 0,995 0,975 0,979 0,939 0,959 0,906 0,937 0,877
3 0,993 0,967 0,942 0,871 0,883 0,798 0,834 0,746 0,793 0,707
4 0,968 0,906 0,864 0,768 0,781 0,684 0,721 0,629 0,676 0,590
5 0,928 0,841 0,788 0,684 0,696 0,598 0,633 0,544 0,588 0,506
6 0,883 0,781 0,722 0,616 0,626 0,532 0,564 0,480 0,520 0,445
7 0,838 0,727 0,664 0,561 0,568 0,480 0,508 0,431 0,466 0,397
8 0,794 0,680 0,615 0,516 0,521 0,438 0,463 0,391 0,423 0,360
9 0,754 0,638 0,573 0,478 0,481 0,403 0,425 0,358 0,387 0,329
10 0,718 0,602 0,536 0,445 0,447 0,373 0,393 0,331 0,357 0,303
11 0,684 0,570 0,504 0,417 0,418 0,348 0,366 0,308 0,332 0,281
12 0,653 0,541 0,475 0,392 0,392 0,326 0,343 0,288 0,310 0,262
13 0,624 0,515 0,450 0,371 0,369 0,307 0,322 0,271 0,291 0,246
14 0,599 0,492 0,427 0,352 0,349 0,291 0,304 0,255 0,274 0,232
15 0,575 0,471 0,407 0,335 0,332 0,276 0,288 0,242 0,259 0,220
16 0,553 0,452 0,388 0,319 0,316 0,262 0,274 0,230 0,246 0,208
17 0,532 0,434 0,372 0,305 0,301 0,250 0,261 0,219 0,234 0,198
18 0,514 0,418 0,356 0,293 0,288 0,240 0,249 0,209 0,223 0,189
19 0,496 0,403 0,343 0,281 0,276 0,230 0,238 0,200 0,214 0,181
20 0,480 0,389 0,330 0,270 0,265 0,220 0,229 0,192 0,205 0,174
21 0,465 0,377 0,318 0,261 0,255 0,212 0,220 0,185 0,197 0,167
22 0,450 0,365 0,307 0,252 0,246 0,204 0,212 0,178 0,189 0,160
23 0,437 0,354 0,297 0,243 0,238 0,197 0,204 0,172 0,182 0,155
24 0,425 0,343 0,287 0,235 0,230 0,191 0,197 0,166 0,176 0,149
25 0,413 0,334 0,278 0,228 0,222 0,185 0,190 0,160 0,170 0,144
26 0,402 0,325 0,270 0,221 0,215 0,179 0,184 0,155 0,164 0,140
27 0,391 0,316 0,262 0,215 0,209 0,173 0,179 0,150 0,159 0,135
28 0,382 0,308 0,255 0,209 0,202 0,168 0,173 0,146 0,154 0,131
29 0,372 0,300 0,248 0,203 0,196 0,164 0,168 0,142 0,150 0,127
30 0,363 0,293 0,241 0,198 0,191 0,159 0,164 0,138 0,145 0,124
31 0,355 0,286 0,235 0,193 0,186 0,155 0,159 0,134 0,141 0,120
32 0,347 0,280 0,229 0,188 0,181 0,151 0,155 0,131 0,138 0,117
33 0,339 0,273 0,224 0,184 0,177 0,147 0,151 0,127 0,134 0,114
34 0,332 0,267 0,218 0,179 0,172 0,144 0,147 0,124 0,131 0,111
35 0,325 0,262 0,213 0,175 0,168 0,140 0,144 0,121 0,127 0,108
36 0,318 0,256 0,208 0,172 0,165 0,137 0,140 0,119 0,124 0,106
37 0,312 0,251 0,204 0,168 0,161 0,134 0,137 0,116 0,121 0,103
38 0,306 0,246 0,200 0,164 0,157 0,131 0,134 0,113 0,119 0,101
39 0,300 0,242 0,196 0,161 0,154 0,129 0,131 0,111 0,116 0,099
40 0,294 0,237 0,192 0,158 0,151 0,126 0,128 0,108 0,114 0,097
MA-F-AS1-07-ETCOL 9
Etude collaborative
Tableau 4 Valeurs critiques pour le F-Test (P=99%)

f1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
f2
1 4052 4999 5403 5625 5764 5859 5928 5981 6023 6056 6083 6106 6126 6143 6157
2 98,5 99,0 99,2 99,3 99,3 99,3 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4
3 34,1 30,8 29,4 28,7 28,2 27,9 27,7 27,5 27,3 27,2 27,1 27,1 27,0 26,9 26,9
4 21,2 18,0 16,7 16,0 15,5 15,2 15,0 14,8 14,7 14,5 14,5 14,4 14,3 14,2 14,2
5 16,3 13,3 12,1 11,4 11,0 10,7 10,5 10,3 10,2 10,1 9,96 9,89 9,82 9,77 9,72
6 13,7 10,9 9,78 9,15 8,75 8,47 8,26 8,10 7,98 7,87 7,79 7,72 7,66 7,60 7,56
7 12,2 9,55 8,45 7,85 7,46 7,19 6,99 6,84 6,72 6,62 6,54 6,47 6,41 6,36 6,31
8 11,3 8,65 7,59 7,01 6,63 6,37 6,18 6,03 5,91 5,81 5,73 5,67 5,61 5,56 5,52
9 10,6 8,02 6,99 6,42 6,06 5,80 5,61 5,47 5,35 5,26 5,18 5,11 5,05 5,01 4,96
10 10,0 7,56 6,55 5,99 5,64 5,39 5,20 5,06 4,94 4,85 4,77 4,71 4,65 4,60 4,56
11 9,64 7,20 6,21 5,67 5,31 5,07 4,88 4,74 4,63 4,54 4,46 4,39 4,34 4,29 4,25
12 9,33 6,93 5,95 5,41 5,06 4,82 4,64 4,50 4,39 4,30 4,22 4,16 4,10 4,05 4,01
13 9,07 6,70 5,74 5,21 4,86 4,62 4,44 4,30 4,19 4,10 4,02 3,96 3,90 3,86 3,82
14 8,86 6,51 5,56 5,04 4,69 4,46 4,28 4,14 4,03 3,94 3,86 3,80 3,75 3,70 3,66
15 8,68 6,36 5,42 4,89 4,56 4,32 4,14 4,00 3,89 3,80 3,73 3,67 3,61 3,56 3,52
16 8,53 6,23 5,29 4,77 4,44 4,20 4,03 3,89 3,78 3,69 3,62 3,55 3,50 3,45 3,41
17 8,40 6,11 5,18 4,67 4,34 4,10 3,93 3,79 3,68 3,59 3,52 3,46 3,40 3,35 3,31
18 8,29 6,01 5,09 4,58 4,25 4,01 3,84 3,71 3,60 3,51 3,43 3,37 3,32 3,27 3,23
19 8,18 5,93 5,01 4,50 4,17 3,94 3,77 3,63 3,52 3,43 3,36 3,30 3,24 3,19 3,15
20 8,10 5,85 4,94 4,43 4,10 3,87 3,70 3,56 3,46 3,37 3,29 3,23 3,18 3,13 3,09
21 8,02 5,78 4,87 4,37 4,04 3,81 3,64 3,51 3,40 3,31 3,24 3,17 3,12 3,07 3,03
22 7,95 5,72 4,82 4,31 3,99 3,76 3,59 3,45 3,35 3,26 3,18 3,12 3,07 3,02 2,98
23 7,88 5,66 4,76 4,26 3,94 3,71 3,54 3,41 3,30 3,21 3,14 3,07 3,02 2,97 2,93
24 7,82 5,61 4,72 4,22 3,90 3,67 3,50 3,36 3,26 3,17 3,09 3,03 2,98 2,93 2,89
25 7,77 5,57 4,68 4,18 3,85 3,63 3,46 3,32 3,22 3,13 3,06 2,99 2,94 2,89 2,85
26 7,72 5,53 4,64 4,14 3,82 3,59 3,42 3,29 3,18 3,09 3,02 2,96 2,90 2,86 2,81
27 7,68 5,49 4,60 4,11 3,78 3,56 3,39 3,26 3,15 3,06 2,99 2,93 2,87 2,82 2,78
28 7,64 5,45 4,57 4,07 3,75 3,53 3,36 3,23 3,12 3,03 2,96 2,90 2,84 2,79 2,75
29 7,60 5,42 4,54 4,04 3,73 3,50 3,33 3,20 3,09 3,00 2,93 2,87 2,81 2,77 2,73
30 7,56 5,39 4,51 4,02 3,70 3,47 3,30 3,17 3,07 2,98 2,91 2,84 2,79 2,74 2,70
40 7,31 5,18 4,31 3,83 3,51 3,29 3,12 2,99 2,89 2,80 2,73 2,66 2,61 2,56 2,52
50 7,17 5,06 4,20 3,72 3,41 3,19 3,02 2,89 2,78 2,70 2,62 2,56 2,51 2,46 2,42
60 7,07 4,98 4,13 3,65 3,34 3,12 2,95 2,82 2,72 2,63 2,56 2,50 2,44 2,39 2,35
70 7,01 4,92 4,07 3,60 3,29 3,07 2,91 2,78 2,67 2,59 2,51 2,45 2,40 2,35 2,31
80 6,96 4,88 4,04 3,56 3,25 3,04 2,87 2,74 2,64 2,55 2,48 2,42 2,36 2,31 2,27
90 6,92 4,85 4,01 3,53 3,23 3,01 2,84 2,72 2,61 2,52 2,45 2,39 2,33 2,29 2,24
100 6,89 4,82 3,98 3,51 3,21 2,99 2,82 2,69 2,59 2,50 2,43 2,37 2,31 2,27 2,22
200 6,75 4,71 3,88 3,41 3,11 2,89 2,73 2,60 2,50 2,41 2,34 2,27 2,22 2,17 2,13
500 6,69 4,65 3,82 3,36 3,05 2,84 2,68 2,55 2,44 2,36 2,29 2,22 2,17 2,12 2,07
6,63 4,61 3,78 3,32 3,02 2,80 2,64 2,51 2,41 2,32 2,25 2,18 2,13 2,08 2,04
MA-F-AS1-07-ETCOL 10
Etude collaborative
Tableau 4 Valeurs critiques pour le F-Test (P=99%) (Suite)

f1
f2
16 17 18 19 20 30 40 50 60 70 80 100 200 500
1 6169 6182 6192 6201 6209 6261 6287 6303 6313 6320 6326 6335 6350 6361 6366
2 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,3 99,5 99,5
3 26,8 26,8 26,8 26,7 26,7 26,5 26,4 26,4 26,3 26,3 26,3 26,2 26,2 26,1 26,1
4 14,2 14,1 14,1 14,0 14,0 13,8 13,7 13,7 13,7 13,6 13,6 13,6 13,5 13,5 13,5
5 9,68 9,64 9,61 9,58 9,55 9,38 9,29 9,24 9,20 9,18 9,16 9,13 9,08 9,04 9,02
6 7,52 7,48 7,45 7,42 7,40 7,23 7,14 7,09 7,06 7,03 7,01 6,99 6,93 6,90 6,88
7 6,28 6,24 6,21 6,18 6,16 5,99 5,91 5,86 5,82 5,80 5,78 5,75 5,70 5,67 5,65
8 5,48 5,44 5,41 5,38 5,36 5,20 5,12 5,07 5,03 5,01 4,99 4,96 4,91 4,88 4,86
9 4,92 4,89 4,86 4,83 4,81 4,65 4,57 4,52 4,48 4,46 4,44 4,41 4,36 4,33 4,31
10 4,52 4,49 4,46 4,43 4,41 4,25 4,17 4,12 4,08 4,06 4,04 4,01 3,96 3,93 3,91
11 4,21 4,18 4,15 4,12 4,10 3,94 3,86 3,81 3,77 3,75 3,73 3,70 3,65 3,62 3,60
12 3,97 3,94 3,91 3,88 3,86 3,70 3,62 3,57 3,54 3,51 3,49 3,47 3,41 3,38 3,36
13 3,78 3,74 3,72 3,69 3,66 3,51 3,42 3,37 3,34 3,32 3,30 3,27 3,22 3,19 3,17
14 3,62 3,59 3,56 3,53 3,51 3,35 3,27 3,22 3,18 3,16 3,14 3,11 3,06 3,03 3,00
15 3,49 3,45 3,42 3,40 3,37 3,21 3,13 3,08 3,05 3,02 3,00 2,98 2,92 2,89 2,87
16 3,37 3,34 3,31 3,28 3,26 3,10 3,02 2,97 2,93 2,91 2,89 2,86 2,81 2,78 2,75
17 3,27 3,24 3,21 3,19 3,16 3,00 2,92 2,87 2,83 2,81 2,79 2,76 2,71 2,68 2,65
18 3,19 3,16 3,13 3,10 3,08 2,92 2,84 2,78 2,75 2,72 2,70 2,68 2,62 2,59 2,57
19 3,12 3,08 3,05 3,03 3,00 2,84 2,76 2,71 2,67 2,65 2,63 2,60 2,55 2,51 2,49
20 3,05 3,02 2,99 2,96 2,94 2,78 2,69 2,64 2,61 2,58 2,56 2,54 2,48 2,44 2,42
21 2,99 2,96 2,93 2,90 2,88 2,72 2,64 2,58 2,55 2,52 2,50 2,48 2,42 2,38 2,36
22 2,94 2,91 2,88 2,85 2,83 2,67 2,58 2,53 2,50 2,47 2,45 2,42 2,36 2,33 2,31
23 2,89 2,86 2,83 2,80 2,78 2,62 2,54 2,48 2,45 2,42 2,40 2,37 2,32 2,28 2,26
24 2,85 2,82 2,79 2,76 2,74 2,58 2,49 2,44 2,40 2,38 2,36 2,33 2,27 2,24 2,21
25 2,81 2,78 2,75 2,72 2,70 2,54 2,45 2,40 2,36 2,34 2,32 2,29 2,23 2,19 2,17
26 2,78 2,75 2,72 2,69 2,66 2,50 2,42 2,36 2,33 2,30 2,28 2,25 2,19 2,16 2,13
27 2,75 2,71 2,68 2,66 2,63 2,47 2,38 2,33 2,29 2,27 2,25 2,22 2,16 2,12 2,10
28 2,72 2,68 2,65 2,63 2,60 2,44 2,35 2,30 2,26 2,24 2,22 2,19 2,13 2,09 2,06
29 2,69 2,66 2,63 2,60 2,57 2,41 2,33 2,27 2,23 2,21 2,19 2,16 2,10 2,06 2,03
30 2,66 2,63 2,60 2,57 2,55 2,39 2,30 2,25 2,21 2,18 2,16 2,13 2,07 2,03 2,01
40 2,48 2,45 2,42 2,39 2,37 2,20 2,11 2,06 2,02 1,99 1,97 1,94 1,87 1,85 1,80
50 2,38 2,35 2,32 2,29 2,27 2,10 2,01 1,95 1,91 1,88 1,86 1,82 1,76 1,71 1,68
60 2,31 2,28 2,25 2,22 2,20 2,03 1,94 1,88 1,84 1,81 1,78 1,75 1,68 1,63 1,60
70 2,27 2,23 2,20 2,18 2,15 1,98 1,89 1,83 1,78 1,75 1,73 1,70 1,62 1,57 1,54
80 2,23 2,20 2,17 2,14 2,12 1,94 1,85 1,79 1,75 1,71 1,69 1,65 1,58 1,53 1,49
90 2,21 2,17 2,14 2,11 2,09 1,92 1,82 1,76 1,72 1,68 1,66 1,62 1,55 1,50 1,46
100 2,19 2,15 2,12 2,09 2,07 1,89 1,80 1,74 1,69 1,66 1,63 1,60 1,52 1,47 1,43
200 2,09 2,06 2,03 2,00 1,97 1,79 1,69 1,63 1,58 1,55 1,52 1,48 1,39 1,33 1,28
500 2,04 2,00 1,97 1,94 1,92 1,74 1,63 1,56 1,52 1,48 1,45 1,41 1,31 1,23 1,16
2,00 1,97 1,93 1,90 1,88 1,70 1,59 1,52 1,47 1,43 1,40 1,36 1,25 1,15 1,00
Etude collaborative
Tableau 5 Valeurs critiques pour le test de Dixon
Critres du test Valeurs critiques
m 95% 99%
3 0,970 0,994
Q10 = Z(2) Z(1) ou Z(H) Z (H 1) 4 0,829 0,926
Z(H) Z(1) Z(H) Z(1) 5 0,710 0,821
La plus grande de ces deux valeurs 6 0,628 0,740
7 0,569 0,680
8 0,608 0,717
Q11 = Z(2) Z(1) ou Z(H) Z (H 1) 9 0,564 0,672
Z(H 1) Z(1) Z(H) Z(2) 10 0,530 0,635
12 0,479 0,579
13 0,611 0,697
Q22 = Z(3) Z(1) ou Z(H) Z (H 2) 14 0,586 0,670
Z(H 2) Z(1) Z(H) Z(3) 15 0,565 0,647
17 0,529 0,610
18 0,514 0,594
19 0,501 0,580
20 0,489 0,567
21 0,478 0,555
22 0,468 0,544
23 0,459 0,535
24 0,451 0,526
25 0,443 0,517
26 0,436 0,510
27 0,429 0,502
28 0,423 0,495
29 0,417 0,489
30 0,412 0,483
31 0,407 0,477
32 0,402 0,472
33 0,397 0,467
34 0,393 0,462
35 0,388 0,458
36 0,384 0,454
37 0,381 0,450
38 0,377 0,446
39 0,374 0,442
40 0,371 0,438
Etude collaborative
Tableau 6 Feuille de rsultats dtude collaborative
Analyse Echantillon
Lab Valeurs individuelles x1

n 1 2 3 4 5 6 7 8 n1 x1 s1 s21
1 548 556 558 553 542 5 551 6,47 41,8
2 300 299 304 308 300 5 302 3,83 14,7 x1, < x
3 567 558 563 532* 560 560 563 567 7 563 3,51 12,3
4 557 550 555 560 551 5 555 4,16 17,3
5 569 575 565 560 572 5 568 5,89 34,7

14,9 222,
6 550 546 549 557 588 570 576 568 8 563 s1 > s1
2 6
7 557 560 560 552 547 5 555 5,63 31,7
8 548 543 560 551 548 5 550 6,28 39,5
9 558 563 551 555 560 5 556 5,63 31,7
10 554 559 551 545 557 5 553 5,5 30,2
Donnes statistiques : Test de Bartlett :
Au sein de laboratoires : s1= 5.37 1 = PB = 3.16 < 15.51 (95%; = 8)

34
Entre les laboratoires : sz = 13.97 z = 7 Lanalyse de variance :
sr = 5.37 r = 15 sR = 7.78 R = 22 PF = 6.76 > 3.21 (99%; 1 = 7; 2 = 34)
Fidlit des mthodes analytiques

(Rsolution oeno 5/99)
Les donnes concernant la fidlit des mthodes analytiques dtermines par des
tudes collaboratives sont applicables dans les cas suivants :
1) Vrification de l'acceptabilit des rsultats obtenus par un Laboratoire avec une
mthode de rfrence.
2) valuation des rsultats analytiques dmontrant qu'une limite lgale a t dpasse.
3) Comparaison des rsultats obtenus par deux ou plusieurs laboratoires, et
comparaison des ces rsultats avec une valeur de rfrence.
4) Evaluation des rsultats obtenus avec des mthodes non valides.
1) Vrification de l'acceptabilit des rsultats obtenus avec une mthode de
rfrence.
La validit des rsultats d'une analyse dpend des points suivants :
- Le laboratoire devra accomplir les analyses dans les conditions d'un systme
d'assurance qualit appropri, couvrant la structure, lorganisation, les
responsabilits, les procdures, etc.
- Faisant partie du systme d'assurance qualit, le laboratoire devra oprer avec une
procdure de Contrle de Qualit interne.
- Les rsultats devront avoir t obtenus sous les critres d'acceptabilit dcrits dans la
procdure de Contrle de Qualit interne.
Le Contrle de Qualit interne sera tabli suivant les normes internationalement
reconnues comme par exemple, celles figurant dans le document IUPAC "Harmonized
Guidelines for International Quality Control in Analytical Laboratories".
Le Contrle de Qualit implique lanalyse de matriels de rfrence.
Les matriels de rfrence sont constitus de la mme matrice que les chantillons
analyser, et ils contiennent une concentration approprie et connue de lanalyte,
semblable celle trouve dans l'chantillon.
Les matriels de rfrence seront autant que possible des matriels certifis par une
organisation internationalement reconnue.
Cependant, pour beaucoup d'analyses, les matriels de rfrence certifis appropris
n'existent pas. Dans ce cas, on peut utiliser, par exemple, un matriel analys par
plusieurs laboratoires dans un essai de comptence, en considrant la moyenne des
rsultats comme la valeur assigne pour l'analyte.
On peut aussi prparer un matriel de rfrence par formulation (solution modle
de composition connue), ou en ajoutant une quantit connue de l'analyte un
matriel qui ne le contient pas, ou encore, en faisant un essai de rcupration (ajout
dos) sur un des chantillons analyser.
MA-F-AS1-08-FIDMET 1
Le Contrle de Qualit est mis en oeuvre en insrant dans chaque srie

dchantillons, des matriels de rfrence, et en analysant des doubles, soit des
matriels de rfrence, soit des chantillons essai. C'est une vrification de
lexcution correcte de la mthode, elle doit tre indpendante de la calibration et
du protocole analytique, puisque son but est de les vrifier.
On entend par srie un nombre d'chantillons analyss sous conditions de
rptabilit. Le contrle interne sert vrifier que le niveau d'incertitude appropri
n'est pas dpass.
Si lon considre les rsultats analytiques pour le matriel de contrle comme faisant
partie d'une population normale de moyenne m et d'cart type s, seulement autour de
0,3% des rsultats seront hors des limites m 3s. Lorsque l'on obtient des rsultats
aberrants ( hors des limites), le systme est considr hors de contrle statistique
(donnes non fiables)
Le contrle est effectu graphiquement avec les Cartes de Contrle de Shewhart. Pour
obtenir ces graphiques, les valeurs mesures pour le matriel de rfrence sont portes
sur l'axe vertical, et le numro de srie sur l'axe horizontal. La carte comporte
galement des lignes horizontales, reprsentant la moyenne, m, m 2s (limites
d'attention, s = cart type) et m 3s (limites d'action).(Figure 1).
Pour estimer l'cart type, un matriel de contrle doit tre analys en double, au moins
12 reprises. Chaque double analyse doit tre faite sous conditions de rptabilit,
insre de manire alatoire dans une srie d'chantillons. Des analyses seront
dupliques des jours diffrents pour reflter les changements raisonnables d'une srie
l'autre. Les variations peuvent avoir plusieurs causes : la modification de la
composition des ractifs, les recalibrations des instruments, et ventuellement le travail
doprateurs diffrents. Aprs avoir limin les donnes aberrantes au moyen du Test
de Grubbs, on peut calculer l'cart type pour construire les graphiques de Shewhart.
Cet cart type est compar avec celui de la mthode de rfrence. Si l'on n'arrive pas
la prcision publie pour la mthode de rfrence, les causes devront tre recherches.
Les limites de prcision du laboratoire doivent tre rvises priodiquement, en
rptant la procdure indique.
Une fois que la Carte de Contrle est construite, on porte sur le graphique les donnes
obtenues dans chaque srie pour le matriel de contrle.
Une srie est considre hors de contrle statistique lorsque :
I) Une valeur dpasse la limite d'action.
II) La valeur actuelle et la prcdente sont hors de la limite d'attention, tout en tant
situes lintrieur de la limite d'action.
III) Neuf valeurs successives se trouvent du mme cot de la moyenne.
Le laboratoire doit rpondre une condition de hors de contrle, en rejetant les
rsultats de la srie, en faisant des essais pour identifier les causes et en prenant des
actions pour les remdier.
Une Carte de Contrle de Shewhart peut tre faite galement pour les diffrences
entre doubles analyses d'un mme chantillon, spcialement quand des matriels de
rfrence n'existent pas. Dans ce cas, la diffrence absolue entre deux analyses d'un
mme chantillon, est porte sur le graphique. La ligne infrieure de la carte est 0,
la limite d'attention est 1,128 Sw, et la limite d'action est 3,686 Sw, pour Sw = cart
type dans une srie.
Ce type de graphique ne rend compte que de la rptabilit. Elle ne doit pas tre
suprieure la rptabilit publie pour la mthode.
En absence de matriels de contrle, il faut, de temps en temps, vrifier que la limite de
reproductibilit de la mthode de rfrence n'est pas dpasse par comparaison des
rsultats analytiques avec les rsultats obtenus sur le mme chantillon par un
laboratoire expriment :
On fait une double dtermination dans chaque laboratoire, et on applique la formule :
2 r2
C r D95 ( y1 - y 2 ) = 2
R -
2
CrD95 = Diffrence critique (P=0,95)
y1 = Moyenne de deux rsultats obtenus par le laboratoire 1
y2 = Moyenne de deux rsultats obtenus par le laboratoire 2
R = Reproductibilit de la mthode de rfrence.
r = Rptabilit de la mthode de rfrence.
Si la diffrence critique est dpasse on doit en trouver la cause, et l'exprience sera
rpte dans un dlai d'un mois.
2) Evaluation des rsultats analytiques dmontrant qu'une limite lgale a t
dpasse.
Quand un rsultat analytique montre qu'une limite a t dpasse, on applique la
procdure suivante :
1) Lorsque il s'agit d'un rsultat individuel, faire une seconde analyse dans des
conditions de rptabilit. S'il n'est pas possible de faire une seconde analyse sous
conditions de rptabilit, mettre en oeuvre une double analyse sous conditions de
rptabilit et utiliser ces dernires donnes pour valuer la diffrence critique.
2) Dterminer la valeur absolue de la diffrence entre la moyenne des rsultats
obtenus sous conditions de rptabilit et la limite lgale. Une valeur absolue de la
diffrence plus grande que la diffrence critique montre que l'chantillon ne s'ajuste
pas aux spcifications.
C r D95 ( y - m0 ) = 2 1 R -r nn-1
2 2 2
2
La diffrence critique est calcule par la formule :

y = Moyenne des rsultats obtenus
m0 = Limite
n = Nombre d'analyses
R = Reproductibilit
r = Rptabilit
Autrement dit, si c'est une limite maximale, la moyenne des rsultats ne doit pas tre
suprieure
m0 + CrD95 (y - m0)
Si la limite est un minimum, la moyenne des rsultats ne doit pas tre infrieure
m0 - CrD95 (y - m0)
3) Comparaison des rsultats obtenus par deux ou plusieurs laboratoires et
comparaison de ces rsultats avec une valeur de rfrence.
Pour dcider si les donnes provenant de deux laboratoires sont en accord, on calcule
la diffrence absolue entre les deux rsultats et on compare avec la diffrence critique
1 1
C r D95 ( y1 - y 2 ) = 2 R2 - r 2 (1- - )
2 n1 2 n2
y1 = Moyenne des rsultats au laboratoire n 1
y2 = Moyenne des rsultats au laboratoire n 2
n1 = Nombre d'analyses/chantillon au laboratoire n 1
n2 = Nombre d'analyses/chantillon au laboratoire n 2
R = Reproductibilit
r = Rptabilit
Si les rsultats sont la moyenne de deux dterminations, la formule se simplifie :
r2
2
C r D95 ( y1 - y 2 ) = R -
2
2
Si les donnes sont des rsultats individuels, la diffrence critique est R.
Si la diffrence critique n'est pas dpass, on conclut que les rsultats des deux
laboratoires sont en concordance.
- Comparaison des rsultats obtenus par plusieurs laboratoires avec une valeur de
rfrence.
Supposons p laboratoires, ayant fait n1 dterminations, de moyenne yi pour chaque
laboratoire, et avec une moyenne totale
1
y= yi
p
La moyenne de tous les laboratoires est compare avec la valeur de rfrence. Si la

diffrence absolue dpasse la diffrence critique, calcul selon la formule suivante, on
conclut que les rsultats ne sont pas en accord avec la valeur de rfrence.
1 1 1
C r D95 ( y - m0 ) = 2 R2 - r 2 (1 - )
2 2p p n1
CrD95 = Diffrence critique, calcule comme indiqu au point 2, pour la mthode de

rfrence.
La valeur de rfrence peut tre, par exemple, la valeur assigne un matriel de
rfrence, ou la valeur obtenue par un autre ou le mme Laboratoire avec une mthode
diffrente.
4) Evaluation des rsultats analytiques obtenus avec des mthodes non valides.
Une valeur provisoire de la reproductibilit pour une mthode non valide peut tre
tablie par comparaison avec un second laboratoire :
2 r2
R prov = 2 ( y1 - y 2 ) +
2
y1 = Moyenne des rsultats obtenus par le laboratoire n 1
y2 = Moyenne des rsultats obtenus par le laboratoire n 2
r = Rptabilit provisoire dtermine dans le laboratoire
La reproductibilit provisoire peut tre utilise pour calculer la diffrence critique.
Si la reproductibilit provisoire est infrieure a deux fois la rptabilit, elle devra tre
fixe 2r.
Une reproductibilit suprieure trois fois la rptabilit ou deux fois la valeur
calcule par l'quation de Horwitz, n'est pas acceptable.
quation de Horwitz :
RSD R % = 21-0,5 log10 C
RSDR % = Ecart type relatif de la reproductibilit
(exprim comme pourcentage de la moyenne).
C = Concentration exprime comme fraction dcimale : exemple
10g/100g=0,1
Cette quation fut obtenue empiriquement partir de plus de 3000 tudes
collaboratives comprenant une grande diversit d'analytes, matrices et techniques de
mesure. En absence dautre information, des valeurs de la RSDR infrieures ou gales
la RSDR calcule par l'quation de Horwitz peuvent tre considres comme
acceptables.
Valeurs de RSDR % calcules par l'quation de Horwitz

Concentration RSDR %
-9
10 45
10-8 32
10-7 23
10-6 16
10-5 11
10-4 8
10-3 5,6
10-2 4
10-1 2,8
1 2
Si un rsultat analytique obtenu avec une mthode non valide est proche d'une limite
spcifie par la lgislation, la limite de dcision considre sera, pour le cas d'une
limite suprieure :
S = m0 + {(Rrout/Rref)-1} CrD95
et pour une limite infrieure :
S = m0 - {(Rrout/Rref)-1} CrD95
S = limite de dcision
m0 = limite lgale
Rrout = Reproductibilit provisoire estime pour la mthode non valide.
Rref = Reproductibilit de la mthode de rfrence.
CrD95 = Diffrence critique, calcule comme indiqu au point 2, pour la mthode
de rfrence.
Un rsultat dpassant la limite de dcision doit tre remplac par un rsultat final
obtenu avec la mthode de rfrence.
Diffrences critiques pour les niveaux de probabilit autres que 95%
Ces diffrences peuvent tre obtenues en multipliant les diffrences critiques au niveau
95% par les coefficients donns dans la table 1.
Table 1 - Coefficients multiplicateurs permettant de calculer les diffrences critiques
pour des niveaux de probabilit autres que 95%
Niveau de probabilit P Coefficient multiplicateur
90 0,82
95 1,00
98 1,16
99 1,29
99,5 1,40
CARTE DE CONTROLE DE SHEWHART
BIBLIOGRAPHIE
- "Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in Analytical Chemistry

Laboratories". IUPAC. Pure and App. Chem. Vol 67, n 4, 649-666, 1995
- "Shewhart Control Charts" ISO 8258. 1991.
- "Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a
standard test method by inter-laboratory tests". ISO 5725, 1994.
- "Draft Commission Regulation of establishing rules for the application of reference and
routine methods for the analysis and quality evaluation of milk and milk products".
Commission of the European Communities, 1995.
- "Harmonized protocols for the adoption of standardized analytical methods and for the
presentation of their performance characteristics". IUPAC. Pure an App. Chem., Vol. 62,
n 1, 149-162. 1990.
Protocole dtudes collaboratives de performance
Protocole pour la planification, la conduite et linterprtation

des tudes de performance des mthodes danalyse
INTRODUCTION
Aprs un certain nombre de rencontres et d'ateliers, un groupe de reprsentants de
27 organisations a adopt par consensus un "Protocole pour la planification, la
conduite et l'interprtation des tudes collaboratives", publi dans Pure & Appl.
Chem. 60, 855-864, (1998). Un certain nombre d'organisations ont accept et
utilis ce protocole. En se basant sur leur exprience et les recommandations du
"Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling" (programme commun
FAO/WHO pour Food Standards. Rapport de la Dix huitime Session, 9-13
Novembre 1992; FAO, Rome, Italie, ALINORM 92/93, sections 34-39), il a t
recommand d'inclure 3 rvisions mineures au protocole original. Ce sont : (1)
Enlever le plan avec double division des niveaux de teneurs (en anglais : double
split level) parce que le terme d'interaction qu'il gnre dpend du choix des
niveaux et si l'interaction a une signification statistique, elle ne peut pas tre
interprte d'un point de vue physique (2). Dvelopper la dfinition de "matriau"
(3). Faire passer de 1 2,5 % le critre utilis pour liminer un rsultat aberrant.
Le protocole rvis qui inclut ces changements est reproduit ci-dessous. Quelques
rvisions dans la rdaction ont aussi t faites pour amliorer la lecture. Le
vocabulaire et les dfinitions du document "Nomenclature des Etudes Inter-
laboratoires (Recommandations 1994)" [publi dans Pure Applied Chem., 66,
1903-1911 (1994)] ont t inclus dans cette rvision, ainsi que, autant que possible,
les termes appropris de l'International Organization for Standardization (ISO)
modifis pour les appliquer la chimie analytique.
PROTOCOLE
1. Travail prliminaire
Les tudes (collaboratives) de performance des mthodes exigent un effort
considrable et devraient tre entreprises seulement pour des mthodes qui ont
reu ou subi un test prliminaire adquat. Ce test interne au laboratoire, devrait
inclure si possible (quand cela est applicable), l'information sur les points
suivants :
1.1. Estimation prliminaire de la fidlit
Estimation de l'cart-type total des rsultats analytiques intralaboratoire sur
l'intervalle de concentration intressant, tudi au moins la limite suprieure
et la limite infrieure de l'intervalle de concentration, avec une insistance
particulire sur la valeur standard ou la valeur de la spcification.
MA-F-AS1-09-PROPER 1
NOTE 1 : L'cart-type total intralaboratoire est une mesure du manque de

fidlit plus globale que celle de l'cart-type de rptabilit de l'ISO, 3.3 ci-
dessous. Cet cart-type reprsente la variation intralaboratoire la plus grande
qui peut tre attendue des performances de la mthode; elle inclut au moins la
variabilit entre jours diffrents et aussi de prfrence entre droites
d'talonnage diffrentes. Elle inclut les variations entre-sries (entre-lots) et
intra-srie, (intra-lot). En ce sens elle peut tre considre comme une mesure
de la reproductibilit l'intrieur du laboratoire. Si cette valeur est vraiment
dans les limites acceptables, il ne faut pas s'attendre ce que l'cart type entre
laboratoires (cart-type de reproductibilit) soit meilleur. Cette fidlit n'est
pas estime partir de l'tude minimum dcrite dans ce protocole.
NOTE 2 : L'cart-type total intralaboratoire peut aussi tre estim partir
d'essais de robustesse qui indiquent avec quelle rigueur les facteurs
exprimentaux doivent tre contrls et quelles sont les limites de variations
autorises. Ces limites dtermines exprimentalement devraient tre incluses
dans la description de la mthode.
1.2. Erreurs systmatique (biais)
Estimations de l'erreur systmatique des rsultats analytiques sur l'intervalle de
concentration et pour les substances analyser, tudies au minimum aux
limites suprieure et infrieure de l'intervalle de concentration, avec une
insistance particulire sur la valeur standard ou de la valeur de la spcification.
Les rsultats obtenus en appliquant la mthode aux matriaux de rfrence
adquats doivent tre nots.
1.3. Recouvrement
Recouvrement d ajouts effectus sur des matriaux vrais, sur des extraits,
sur les solutions de digestion, ou d'autres solutions issues de leur traitement.
1.4. Domaine d'application
Possibilit qu'a la mthode d'identifier et de mesurer les formes physiques et
chimiques de l'analyte susceptibles d'tre prsentes dans les matriaux, en
tenant compte des effets de matrice.
1.5. Interfrence
Effet des autres constituants qui sont susceptibles d'tre prsents des
concentrations apprciables dans les matrices considres et qui peuvent
interfrer sur le dosage.
1.6. Comparaison de mthode
Rsultats de comparaison de la mthode des mthodes existantes testes et
destines des usages similaires.
1.7. Procdures d'talonnage
Les procdures spcifies pour l'talonnage et la correction de blanc ne doivent
pas introduire de biais important dans les rsultats.
1.8. Description de mthode

La mthode doit tre crite de faon claire et sans ambigut.
1.9. Chiffres significatifs
Le laboratoire qui initie l'tude devrait indiquer le nombre de chiffres
significatifs qui doit tre report en se basant sur les donnes sortant de
l'instrument de mesure.
NOTE : En faisant des calculs statistiques partir des donnes, il faut utiliser
pleinement la puissance du calculateur ou de l'ordinateur et ne pas arrondir ou
tronquer les rsultats avant de donner la moyenne finale ou les carts-type.
Arriv ce stade, les carts-type sont arrondis deux chiffres significatifs et
les moyennes et dviations correspondantes sont arrondies pour fournir les
chiffres significatifs de l'cart-type. Par exemple, si sR = 0,012, x est report
comme 0,147 et non pas comme 0,1473 ou 0,15 et le coefficient de variation
donn est 8,2 % (les symboles sont dfinis dans l'Appendice 1). Si les calculs
d'carts-type doivent tre tablis manuellement par tapes avec transfert des
rsultats intermdiaires, le nombre de chiffres significatifs retenir pour les
nombres au carr devrait tre au moins 2 fois le nombre de chiffres fournis par
les donnes plus 1.
2. Plan d'tude de performance de la mthode
2.1. Nombre de matriaux
Pour un type unique de substance, il faut utiliser au moins 5 matriaux
(matriaux d'essai); ce nombre minimum peut tre rduit 3, seulement si un
niveau unique est spcifi pour une matrice unique. Pour ce paramtre du plan
d'expriences, les deux parties provenant d'un niveau de teneurs (en anglais :
split level) divis et les deux parties individuelles de rpliques effectues en
aveugle (en anglais : blind duplicate) par laboratoire, sont considres comme
un matriau unique.
NOTE 1 : Un matriau est une combinaison "analyte/matrice/concentration"
laquelle s'appliquent les paramtres de performance de la mthode. Ce
paramtre dtermine l'applicabilit d'une mthode. Pour appliquer la mthode
un certain nombre de substances diffrentes, un nombre suffisant de matrices
et de niveaux devrait tre choisi pour tenir compte des interfrences
potentielles et de la concentration la plus utilise.
NOTE 2 : Les matriaux d'essai rpliqus en "aveugle" ou en "non aveugle" en
nombre gal ou suprieur 2 constituent d'un point de vue statistique un seul
matriau (ils ne sont pas indpendants).
NOTE 3 : Un niveau divis une fois (paire de Youden) analys en statistique
comme une paire constitue un seul matriau; si l'analyse statistique est
effectue et reporte en considrant que les chantillons sont indpendants, ils
constituent 2 matriaux. De plus, la paire peut tre utilise pour calculer

l'cart-type intralaboratoire sr :
sr = (di 2 ) / 2n (pour essais dupliqus, en aveugle ou non)
sr = (di 2 ) / 2(n1) (pour paire de Youden)
o di est la diffrence entre 2 valeurs individuelles partir du niveau divis

pour chaque laboratoire et n le nombre de laboratoires. Dans ce cas particulier
l'cart-type entre laboratoires sR est seulement la moyenne des deux valeurs de
sR calcules partir des composantes individuelles du niveau divis et est
utilis seulement pour vrifier les calculs.
NOTE 4 : Le blanc ou contrle ngatif peut tre un matriau ou non selon la
finalit de l'analyse. Par exemple, dans l'analyse de traces o il y a des niveaux
trs faibles (proches de la limite et quantification), les blancs sont considrs
comme des matriaux et sont ncessaires pour dterminer les "limites de
mesure". Cependant si le blanc est seulement un contrle de procdure en
macro analyse (par ex., la matire grasse dans le fromage) il ne serait pas
considr comme un matriau.
2.2. Nombre de laboratoires
Au moins 8 laboratoires doivent reporter les rsultats pour chaque matriau;
dans le cas o il n'est pas possible d'obtenir ce nombre (par ex., appareillage
trs cher ou laboratoires spcialiss requis) l'tude peut tre conduite avec un
nombre moins important de laboratoires, mais avec un minimum de
5 laboratoires. Si l'tude est ralise pour une utilisation internationale de la
mthode, les laboratoires de diffrents pays doivent y participer. Dans le cas
de mthodes exigeant l'utilisation d'appareils spcialiss, l'tude pourrait
inclure l'ensemble des laboratoires disponibles. Dans de tels cas, "n" est utilis
au dnominateur pour calculer l'cart-type au lieu de "n-1". Les laboratoires
qui participent par la suite l'tude doivent dmontrer qu'ils peuvent raliser
les analyses aussi bien que les laboratoires participants d'origine.
2.3. Nombre de rpliques
Les paramtres de rptabilit doivent tre estims en utilisant l'une des
combinaisons suivantes (listes dans l'ordre approximatif de prfrence) :
2.3.1. Niveau divis
Pour chaque niveau qui est divis et constitue seulement un matriau unique
d'un point de vue plan et analyse statistique, utiliser 2 matriaux d'essai
presque identiques diffrant seulement lgrement dans leur concentration en
analyte (par exemple de moins de 1 5 %). Chaque laboratoire doit analyser
chaque matriau d'essai une fois et seulement une fois.
NOTE : Le critre statistique qui doit tre satisfait pour qu'une paire
d'chantillons analyser constitue un niveau divis est que l'cart-type de
reproductibilit des 2 parties du niveau divis une fois doit tre gal.
2.3.2. Combinaison de rpliques en aveugle et de niveau divis
Utiliser des niveaux diviss pour quelques matriaux et des rpliques en
aveugle pour d'autres matriaux dans la mme tude (valeurs uniques pour
chaque matriau d'essai soumis).
2.3.3. Rpliques en aveugle
Pour chaque matriau, utiliser des rpliques en aveugle identiques; quand les
donnes ne peuvent tre censures (par ex., entre, calcul et impression
automatique), il est possible d'utiliser des rpliques identiques non ralises en
aveugle.
2.3.4. Rpliques connues
Pour chaque matriau, utiliser des rpliques connues (au moins 2 analyses de
prises d'essai issues d'un mme matriau d'essai), mais seulement lorsque
l'utilisation de l'un des plans prcdents n'est pas pratique.
2.3.5. Analyses indpendantes
Utiliser seulement une prise d'essai unique de chaque matriau (c'est--dire, ne
pas raliser des analyses multiples) dans l'tude, mais compenser
l'impossibilit de calculer les paramtres de rptabilit par l'tude des
paramtres de contrle de qualit ou les autres donnes intralaboratoires
obtenues indpendamment de l'tude de performance de la mthode.
3. Analyse statistique (voir diagramme, A.4.1.)
Pour l'analyse statistique des donnes, les procdures statistiques requises
listes ci-dessous doivent tre ralises et les rsultats reports. Les procdures
supplmentaires, additionnelles, ne sont pas cartes.
3.1. Donnes valides
Seuls les rsultats valides devraient tre reports et soumis au traitement
statistique. Les donnes valides sont les donnes rsultant de performance
normale des analyses de laboratoire; elles ne sont pas entaches par des
dviations de mthode, de mauvais fonctionnement des instruments,
d'vnements inattendus pendant la ralisation de la mthode ou par des
erreurs d'criture, de typographie et d'arithmtique.
3.2. Analyse de variance un facteur
L'analyse de variance un facteur et le traitement des valeurs aberrantes
doivent tre appliqus sparment chaque matriau (matriau d'essai) pour
estimer les composantes de la variance et les paramtres de rptabilit et
reproductibilit.
3.3. Estimation initiale

Calculer la moyenne x (= la moyenne des moyennes des laboratoires), le
coefficient de variation de rptabilit, RSDr, et le coefficient de variation de
reproductibilit, RSDR sans enlever les valeurs aberrantes, mais en utilisant
seulement les donnes valides.
3.4. Traitement des valeurs aberrantes
Les paramtres estims de fidlit qui doivent tre aussi reports sont bass sur
les donnes initiales dbarrasses de toutes les valeurs aberrantes signales par
la procdure harmonise de 1994 d'limination des valeurs aberrantes. Cette
procdure consiste essentiellement appliquer les tests de Cochran et de
Grubbs (au seuil de probabilit P de 2,5 %, unilatral pour le Cochran et
bilatral pour le Grubbs) jusqu' ce qu'il n'y ait plus de valeurs aberrantes
indiques, ou jusqu' ce que le nombre initial des laboratoires fournissant des
rsultats valides chute de 22,2 % (= 2/9).
NOTE : Une consultation rapide du laboratoire qui reporte des valeurs
suspectes peut permettre de corriger des fautes ou de dcouvrir les conditions
qui ont conduit aux donnes invalides, 3.1. Il est prfrable de reconnatre des
fautes et des rsultats invalides per se que de se baser sur des tests statistiques
pour enlever des valeurs qui s'cartent.
3.4.1. Test de Cochran
D'abord appliquer le test de Cochran des rsultats aberrants (test unilatral
P = 2,5 %) et enlever tout laboratoire dont la valeur critique excde la valeur
tabule pour le nombre de laboratoires et de rpliques considres, Appendice
A.3.1,3.4.2.
3.4.2. Tests de Grubbs
Appliquer le test de Grubbs bilatral aux valeurs uniques et enlever tout
laboratoire aberrant. Si aucun laboratoire n'est signal aberrant, appliquer alors
les tests de Grubbs pour les valeurs par paire (bilatral), P = 2,5 % au total.
Enlever tout(s) laboratoire(s) signal(s) par ces tests dont la valeur critique
excde la valeur tabulaire donne dans la colonne approprie de la table,
Appendice A.3.3. Arrter quand l'application suivante du test signale plus de
22,2 % (2 sur 9) des laboratoires comme aberrants.
NOTE : Les tests de Grubbs doivent tre appliqus sur un matriau la fois,
aux sries des moyennes rpliques de tous les laboratoires, et non aux valeurs
individuelles obtenues partir de plans rpliqus, parce que la distribution de
toutes les valeurs prises ensemble est multimodale, non Gaussienne, c'est--
dire que leurs diffrences partir de la moyenne gnrale pour ce matriau ne
sont pas indpendantes.
3.4.3. Estimation finale

Recalculer les paramtres comme dans le 3.3. aprs avoir enlev les
laboratoires signals par le calcul prcdent. Si aucune des donnes aberrantes
n'a t enleve par la squence Cochran-Grubbs terminer le test. Sinon,
appliquer nouveau la squence Cochran-Grubbs aux donnes dbarrasses
des rsultats aberrants signals, jusqu' ce qu'il n'y en ait plus de signals ou
jusqu' ce que plus de 22,2 % (2 laboratoires sur 9) soient enlevs dans le
cycle suivant. Voir le diagramme A.3.4.
4. Rapport final
Le rapport final doit tre publi et inclure tous les rsultats valides. Les autres
informations et les paramtres doivent tre reports dans un format similaire
(pour chaque sujet report) celui indiqu ici, quand cela est possible.
Tests de performance de mthode [x] raliss au niveau international en
[anne(s)] par [organisation] dans laquelle [y et z] laboratoires ont particip,
chacun ralisant [k] rpliques, ont donn les rsultats statistiques suivants :
TABLEAU DES PARAMETRES DE PERFORMANCE DES METHODES
Analyte; Rsultats exprims en [units]
Matriau [Description et liste en colonnes dans un tableau par ordre croissant
de grandeur des moyennes]
Nombre de laboratoires retenus aprs limination des rsultats aberrants.
Nombre de laboratoires aberrants
Code (ou dsignation) des laboratoires aberrants
Nombre de rsultats accepts
Moyenne
Valeur vraie ou accepte comme vraie, si connue
Ecart-type de rptabilit (sr)
Coefficient de variation de rptabilit (RSDr)
Limite de rptabilit, r (2,8 x sr)
Ecart-type de reproductibilit (sR)
Ecart-type de reproductibilit (RSDR)
Ecart-type de reproductibilit, R (2,8 x sR)
4.1. Symboles
Une srie de symboles utiliser dans les rapports et publications est jointe
dans l'Appendice 1 (A.1.).
4.2. Dfinitions
Une srie de dfinitions utiliser dans les rapports d'tude et les publications
est donne dans l'Appendice 2 (A.2.).
4.3. Divers
4.3.1. Recouvrement
Le recouvrement d'un analyte ajout pour contrler la mthode ou le biais d'un
laboratoire doit tre calcul comme indiqu ici :
Recouvrement [Marginal], % =
(Analyte total trouv - analyte prsent originellement) x 100/(analyte ajout)
Bien que l'analyte puisse tre exprim en concentration ou en quantit, les
units doivent tre partout identiques. Quand la quantit d'analyte est
dtermine par analyse, elle doit tre dtermine partout de la mme manire.
Les rsultats analytiques pour le recouvrement doivent tre reports sans
correction. Reporter les recouvrements sparment.
4.3.2. Quand sL est ngatif
Par dfinition sR est plus grand ou gal sr dans les tudes de performance de
la mthode; il peut arriver parfois que l'estimation de sr soit suprieure
l'estimation de sR (la variance des rpliques est suprieure la variance entre
2
laboratoires et la valeur calcule sL est alors ngative). Quand cela arrive,
mettre sL = 0 et sR = sr.
5. Rfrences
Horwitz, W. (1988) Protocol for the design, conduct, and interpretation of
method-performance studies. Pure & Appl. Chem. 60, 855-864.
Pocklington, W.D. (1990) Harmonized protocol for the adoption of
standardized analytical methods and for the presentation of their performance
characteritics. Pure and Appl. Chem. 62, 149-162.
International Organization for Standardization. International Standard 5725-
1986. Under revision in 6 parts; individual parts may be available from
National Standards member bodies.
A. Apendices
APPENDICE 1. - SYMBOLES
Utiliser les sries de symboles et termes suivants pour dsigner les paramtres
dvelopps par une tude de performance de mthode.
Moyenne (des moyennes de laboratoires) x

Ecarts-type s (estimation)
Rptabilit sr
"Pur" interlaboratoire sL
Reproductibilit sR
2
Variances : s (avec les indices r, L et R)
2 2 2
sR = sL + sr
Coefficient de variation RSD (avec les indices r, L et R)

Diffrences maximales
(comme dfinies par l'ISO 5725-1986) ;
Voir A.2.4. et A.2.5.)
Limite de rptabilit r = 2,8 x Sr)
Limite de reproductibilit R = (2,8 x SR)
Nombre de rpliques par laboratoire k (gnral)

Nombre moyen de rpliques par laboratoire i ki (pour un plan quilibr )
Nombre de laboratoires L
Nombre de matriaux (matriaux d'essai) m
Nombre total de rsultats d'essai n (= kL pour un plan quilibr)
Nombre total de valeurs pour une tude donne N (=kLm pour un plan totalement
quilibr).
_____________________
Si d'autres symboles sont utiliss, il faut expliquer totalement leur relation

avec les symboles recommands.
APPENDICE 2. - DEFINITIONS
Utiliser les dfinitions suivantes. Les trois premires dfinitions utilisent le
document de l'IUPAC "Nomenclature of Interlaboratory Studies" (approuv pour
publication en 1994). Les deux dfinitions suivantes sont issues des donnes de
l'ISO 3534-1 : 1993. Tous les rsultats des essais sont supposs tre indpendants
c'est--dire, "obtenus sans avoir subi l'influence d'un rsultat quelconque prcdent
sur le mme matriau ou sur un matriau d'essai similaire. Les mesures
quantitatives de fidlit dpendent de faon critique des conditions stipules. Les
conditions de rptabilit et de reproductibilit constituent des ensembles
particuliers de conditions extrmes stipules".
A.2.1. Etude de performance de mthode
Une tude interlaboratoire dans laquelle tous les laboratoires suivent le
mme protocole crit et utilisent le mme mthode tester pour mesurer une
quantit dans les sries d'articles identiques tester [chantillons, matriaux
d'essai]. Les rsultats reports sont utiliss pour estimer les caractristiques
de performance de la mthode. Habituellement ces caractristiques sont la
fidlit intralaboratoire et interlaboratoire, et si ncessaire et possible,
d'autres caractristiques pertinentes comme l'erreur systmatique, le
recouvrement, les paramtres du contrle interne de qualit, la sensibilit, la
limite de quantification, et le domaine d'application.
A.2.2. Etude de performance du laboratoire
Une tude interlaboratoire qui consiste en un nombre d'analyses ou de
mesures suprieur un, ralis en utilisant la mthode choisie ou utilise par
chaque laboratoire. Les rsultats reports sont compars ceux d'autres
laboratoires ou une valeur connue ou assigne comme rfrence, avec en
gnral l'objectif d'valuer ou d'amliorer la performance d'un laboratoire.
A.2.3. Etude de la certification d'un matriau
Une tude interlaboratoire qui assigne une valeur de rfrence ("valeur
vraie") une quantit (concentration ou proprit) dans un article tester,
en indiquant habituellement une incertitude dclare.
A.2.4. Limite de rptabilit (r)
Quand la moyenne des valeurs obtenues partir de deux dterminations
indpendantes avec la mme mthode sur des articles identiques dans le
mme laboratoire par le mme oprateur utilisant le mme appareil dans un
court intervalle de temps se situe dans l'intervalle des valeurs moyennes
cites dans le Rapport Final, 4.0., la diffrence absolue entre deux rsultats
d'essais devrait tre infrieure ou gale la limite de rptabilit (r) = [2, 8 x
sr] qui peut tre gnralement dduite par interpolation linaire de sr partir
du Rapport.
NOTE : Cette dfinition, et la dfinition correspondante de limite de

reproductibilit, ont t obtenues partir de cinq termes dcoulant les uns
de autres; ces dfinitions ont t tendues pour permettre de les appliquer
par interpolation un article tester dont la moyenne n'est pas la mme que
celle utilise pour tablir les paramtres d'origine, ce qui est le cas habituel
quand on applique ces dfinitions. Le terme "limite de rptabilit
[et reproductibilit]" est appliqu spcifiquement une probabilit de 95 %
et est pris comme 2,8 x sr [ ou sR]. Le terme gnral pour ce concept
statistique appliqu toute mesure de tendance (par exemple, la mdiane) et
avec d'autres probabilits (par exemple, 99%) est "diffrence critique de
rptabilit [et reproductibilit]".
A.2.5. Limite de reproductibilit (R)
Quand la moyenne des valeurs obtenues partir de deux dosages uniques
avec la mme mthode sur des articles tester identiques dans diffrents
laboratoires avec diffrents oprateurs utilisant un quipement diffrent, se
situe dans l'intervalle des valeurs moyennes cites dans le Rapport Final,
4.0., la diffrence absolue entre deux rsultats d'essai doit tre infrieure ou
gale la limite de reproductibilit (R) [=2,8 x sR] qui peut tre
gnralement dduite par l'interpolation linaire sR partir du Rapport.
NOTE 1 : Quand les rsultats du test interlaboratoire le permettent, les
valeurs r et R peuvent tre indiques comme des valeurs relatives (par
exemple, pourcentage de la valeur moyenne dtermine) au lieu de valeurs
absolues.
NOTE 2 : Quand le rsultat final report dans l'tude est une moyenne
obtenue partir de plus d'une valeur, c'est--dire k plus grand que 1, la
valeur de R doit tre ajuste selon la formule suivante avant d'utiliser R pour
comparer les rsultats d'analyse de routine ralises en simple exemplaire
entre deux laboratoires :
R' = {R2 + r2 (1 - [1/k])}1/2
Il faut raliser des ajustements similaires dans le cas de rsultats rpts
constituants les valeurs finales pour sR et RSDR s'ils doivent tre des
paramtres reports pour le contrle de qualit.
NOTE 3 : La limite de rptabilit, r, peut tre interprte comme le degr
d'accord l'intrieur duquel deux rsultats d'essai individuels d'un
laboratoire doivent se trouver dans 95 % des cas. La limite de
reproductibilit, R, peut tre interprte comme le degr d'accord
l'intrieur duquel deux rsultats d'essai individuels raliss dans diffrents
laboratoires doivent se trouver dans 95 % des cas.
NOTE 4 : Les estimations de sR peuvent tre obtenues seulement partir

d'une tude de performance de mthode planifie et organise; les
estimations de sr peuvent tre obtenues partir du travail de routine dans un
laboratoire en utilisant des cartes de contrle. Pour des analyses
occasionnelles, en l'absence de carte de contrle, la fidlit intralaboratoire
peut tre value approximativement comme la moiti de sR (Pure and Appl.
Chem., 62, 149-162 (1990), Sec. I.3. Note.).
A.2.6. Analyse de variance un facteur
L'analyse de variance un facteur est le procd statistique pour obtenir des
estimations de la variabilit intralaboratoire et interlaboratoire, matriau par
matriau. Des exemples de calculs pour les plans niveau unique et
niveau unique divis une fois peuvent tre trouvs dans la norme ISO 5725-
1986.
APPENDICE 3. - VALEURS CRITIQUES

A.3.1. Valeurs critiques pour le rapport maximum des variances de Cochran au
niveau de rejet 2,5 % (test unilatral), exprim en pourcentage de la
variance la plus haute par rapport la variance totale ; r = nombre de
rptitions.
Nombre de lab. r=2 r=3 r=4 r=5 r=6
4 94.3 81.0 72.5 65.4 62.5
5 88.6 72.6 64.6 58.1 53.9
6 83.2 65.8 58.3 52.2 47.3
7 78.2 60.2 52.2 47.3 42.3
8 73.6 55.6 47.4 43.0 38.5
9 69.3 51.8 43.3 39.3 35.3
10 65.5 48.6 39.9 36.2 32.6
11 62.2 45.8 37.2 33.6 30.3
12 59.2 43.1 35.0 31.3 28.3
13 56.4 40.5 33.2 29.2 26.5
14 53.8 38.3 31.5 27.3 25.0
15 51.5 36.4 29.9 25.7 23.7
16 49.5 34.7 28.4 24.4 22.0
17 47.8 33.2 27.1 23.3 21.2
18 46.0 31.8 25.9 22.4 20.4
19 44.3 30.5 24.8 21.5 19.5
20 42.8 29.3 23.8 20.7 18.7
21 41.5 28.2 22.9 19.9 18.0
22 40.3 27.2 22.0 19.2 17.3
23 39.1 26.3 21.2 18.5 16.6
24 37.9 25.5 20.5 17.8 16.0
25 36.7 24.8 19.9 17.2 15.5
26 35.5 24.1 19.3 16.6 15.0
27 34.5 23.4 18.7 16.1 14.5
28 33.7 22.7 18.1 15.7 14.1
29 33.1 22.1 17.5 15.3 13.7
30 32.5 21.6 16.9 14.9 13.3
35 29.3 19.5 15.3 12.9 11.6
40 26.0 17.0 13.5 11.6 10.2
50 21.6 14.3 11.4 9.7 8.6
Les tableaux A.3.1. et A.3.3. ont t calculs par R. Albert (Octobre 1993) par
simulation l'ordinateur avec plusieurs passages d'environ 7000 cycles chacun
pour chaque valeur, et ont t ensuite lisss. Bien que le tableau A.3.1. ne soit
strictement applicable qu' un plan quilibr (mme nombre de rptitions pour
tous les laboratoires) il peut tre appliqu un plan non quilibr sans trop
d'erreurs, s'il y a seulement quelques dviations.
A.3.2. Calcul du rapport de variance maximum de Cochran pour rejeter les rsultats
aberrants
Entrer dans l'ordinateur la variance intralaboratoire pour chaque laboratoire
et diviser la plus grande de ces variances par la somme de toutes les
variances et multipliez par 100. Le quotient rsultant est la statistique de
Cochran qui indique la prsence d'un rsultat aberrant retirer si ce quotient
excde la valeur critique indique dans la table de Cochran donne ci-dessus
pour le nombre de rptitions et laboratoires spcifis.
A.3.3. Valeurs critiques pour les tests des rsultats aberrants de Grubbs au niveau
de rejet 2,5 % (test bilatral), 1,25 % (test unilatral), exprim par le
pourcentage de diminution des cart-type rsultant de l'enlvement de la
(des) valeurs(s) suspectes.
Nombre de Une valeur, la plus Deux valeurs, les Une valeur la plus
haute ou la plus plus hautes ou les haute et une la plus
Laboratoires basses plus basses basse
4 86.1 98.9 99.1
5 73.5 90.9 92.7
6 64.0 81.3 84.0
7 57.0 73.1 76.2
8 51.4 66.5 69.6
9 46.8 61.0 64.1
10 42.8 56.4 59.5
11 39.3 52.5 55.5
12 36.3 49.1 52.1
13 33.8 46.1 49.1
14 31.7. 43.5 46.5
15 29.9 41.2 44.1
16 28.3 39.2 42.0
17 26.9 37.4 40.1
18 25.7 35.9 38.4
19 24.6 34.5 36.9
20 23.6 33.2 35.4
21 22.7 31.9 34.0
22 21.9 30.7 32.8
23 21.2 29.7 31.8
24 20.5 28.8 30.8
25 19.8 28.0 29.8
26 19.1 27.1 28.9
27 18.4 26.2 28.1
28 17.8 25.4 27.3
29 17.4 24.7 26.6
30 17.1 24.1 26.0
40 13.3 19.1 20.5
50 11.1 16.2 17.3
A.3.4. Calcul des valeurs du test de Grubbs

Pour calculer la statistique du test de Grubbs pour les valeurs uniques, entrer
dans l'ordinateur la moyenne de chaque laboratoire et calculer l'cart-type
(SD) de ces L moyennes (dsign par s l'origine). Calculer l'cart-type de
l'ensemble des moyennes en enlevant la moyenne la plus haute (sH) ; calculer
l'cart-type de l'ensemble des moyennes en enlevant la moyenne la plus
basse (SL). Le calcul de la diminution de l'cart-type en pourcentage, pour
les deux est :
100 x [1 - (sL/s] et 100 x [1 - sH/s]
La diminution la plus forte obtenue pour ces deux calculs est la statistique de
Grubbs pour les valeurs uniques, qui signale la prsence d'un rsultat
aberrant qu'il faut enlever pour un niveau P = 2,5 %, en test bilatral, si sa
valeur excde la valeur critique tabule dans la colonne 2 de la table A.3.3.,
pour le nombre de moyennes de laboratoire utilis pour calculer la valeur
d'origine s.
Pour calculer la statistique dans le test de Grubbs pour les paires, calculer le
pourcentage de diminution de l'cart-type en enlevant les deux moyennes les
plus hautes, et aussi les plus basses, comme ci-dessus. Comparer le
pourcentage de changement de l'cart-type le plus lev avec les valeurs
tabules de la colonne 3 et procdez selon (1) ou (2) :
(1) Si la valeur tabule est dpasse, enlevez la paire responsable.
Recommencer le cycle en partant au dbut avec le test de Cochran de
variance extrme, le test de Grubbs de la valeur extrme, et le test de Grubbs
de la valeur extrme pour les paires.
(2) Quand les valeurs suivantes ne sont plus enleves, calculer le
pourcentage de changement de l'cart-type obtenu en rejetant la fois et
ensemble la valeur extrme la plus haute et la valeur extrme la plus basse et
comparer avec les valeurs tabules de la dernire colonne de A.3.3. Si la
valeur tabule est dpasse, enlevez la paire haute-basse des moyennes, et
recommencer le cycle avec le test de Cochran jusqu' ce que des valeurs
suivantes ne soient plus enleves. Dans tous les cas, arrter le test des
rsultats aberrants lorsque plus de 22,2 % (2/9) des moyennes sont enleves.
APPENDICE 4
A.4.1. Diagramme pour enlever les valeurs aberrantes
IUPAC 1994 PROCEDURE STATISTIQUE HARMONISE
Estimation de la limite de dtection et de quantification

d'une mthode d'analyse
1 - Objet : tablir la limite de dtection et la limite de quantification dune

mthode.
Remarque : Le calcul propos tablit des valeurs limites de dtection et de
quantification relatives la rponse instrumentale. Pour une mthode
donne, le calcul final de ces valeurs doit prendre en compte les facteurs
provenant de la prparation de lchantillon
2 - Dfinitions :
- la limite de dtection est la plus petite concentration ou teneur de lanalyte
pouvant tre dtecte, avec une incertitude acceptable, mais non quantifie dans les
conditions exprimentales dcrites de la mthode ;
- la limite de quantification est la plus petite concentration ou teneur de lanalyte
pouvant tre quantifie, avec une incertitude acceptable, dans les conditions
exprimentales dcrites de la mthode.
3 - Logigramme de dcision
MA-F-AS1-10-LIMDET 1
4 - Mthodologie
4 1. Approche "rsultats"
Quand la mthode d'analyse ne fournit pas un enregistrement graphique, mais
seulement des valeurs chiffres (ex colorimtrie); la limite de dtection (LD) et la
limite de quantification (LQ), sont estimes laide dune des deux mthodes ci-
dessous.
4.1.1. Mthode 1 :
Lecture directe de n mesures (rponse ou grandeur de l'analyte) de blancs d'analyse
indpendants sur des chantillons contenant l'ensemble des constituants,
l'exception de la substance rechercher.
LD = mblanc + 3 Sblanc, et
LQ = mblanc + 10 Sblanc, avec
o mblanc et Sblanc la moyenne et l'cart-type sur les n mesures de blancs.
Note : Le facteur multiplicatif 3 correspond un risque de 0,13 % de conclure la

prsence de la substance recherche alors qu'elle est absente ; celui de 10,
0,5/oo.
4.1.2 - Mthode 2 :
Utilisation de la droite d'talonnage : Y = a + b X
La limite de dtection est la plus petite concentration que l'on peut distinguer du
blanc avec un risque de 0,13 % de garder des chantillons ne contenant rien. C'est-
-dire la valeur partir de laquelle un test statistique de comparaison de la rponse
la valeur 0 devient significatif avec un risque d'erreur de 0,13 %. D'o :
YLD = a + 3 Sa
XLD = (a + 3 Sa) / b
avec Sa l'cart-type sur l'ordonne l'origine de la droite de rgression. Le
raisonnement est le mme pour LQ o le facteur de mutiplication est 10 (risque a de
0,5/oo).
4.2 - approche "graphique"
Pour la mthode d'analyse qui fournit un enregistrement graphique (ex :
chromatographie) ; la limite de dtection est estim partir du bruit de fond de
l'enregistrement de blanc d'analyse sur un chantillon.
LD = 3 h R (le rique associ reste infrieur 0,13 %), et
LQ = 10 h R (le rique associ reste infrieur 0,5/oo), avec
h l'amplitude moyenne ou maximum du signal sur une fentre correspondant
10 largeurs du pic mi-hauteur de part et d'autre du temps de rtention selon la
stabilit.
R le facteur de rponse quantit/signal, exprime en quantit matire/hauteur.

A chaque fois, trois sries de trois injections sont ralises sur des blancs
plusieurs jours d'intervalle.
4.2.1 - mthode du hmax
agrandir au maximum le bruit de fond (figure 1 ci-dessus) ;

centrer sur le temps de rtention du produit (RT) ;
dessiner une fentre de 10 largeurs du pic mi-hauteur (W ) de part et d'autre
du RT;
tracer deux parallles passant l'une par le sommet du pic le plus lev, lautre par
la base de la valle la plus profonde;
valuer la hauteur hmax ;
calculer le facteur de rponse (facteur R) ;
LDmax = 3 hmax R.
LQmax = 10 hmax R
4.2.2 - mthode du hmoyen
agrandir au maximum le bruit de fond (figure 2 ci-dessus) ;

centrer sur le temps de rtention du produit (RT);
prendre une fentre de 10 largeurs de pic mi-hauteur de part et d'autre du RT;
dcouper en 20 tranches gales (x) ;
tracer deux parallles, dans chaque bloc, l'une passant par le sommet du pic le
plus lev, l'autre par la base de la valle la plus profonde ;
mesurer les hauteurs y ;
calculer la moyenne ( y = hmoyen) ;
calculer le facteur de rponse (Facteur R) ;
LDmoy = 3 hmoy R.
LQmoy = 10 hmoy R.
Ces estimations peuvent elles-mmes tre valides en injectant des quantits de
solut proches des limites calcules (Figures n3 et 4).
Figure n3 : validation des calcul de limitesconcentration du compos proche du H moy

NOTE : La ligne pointille correspond la valeur relle injecte.
Figure n4 : validation des calcul de limites concentration du compos comprise

entre le H moy et le Hmax
NOTE : La ligne pointille correspond la valeur relle injecte.
Contrle interne de qualit
RECOMMANDATIONS HARMONISEES POUR LE

CONTROLE INTERNE DE QUALITE DANS LES
LABORATOIRES D'ANALYSE
CONTENU
1. INTRODUCTION
1.1 Concepts de base
1.2. Domaine d'application de ce document
1.3. CIQ et incertitude
2. DEFINITIONS
2.1. Dfinitions internationales
2.2. Dfinitions de termes spcifiques ce document
3. PRATIQUES DE L'ASSURANCE DE QUALITE ET DU CONTROLE

INTERNE DE QUALITE
3.1. Assurance de qualit
3.2. Choix de la mthode analytique
3.3. Contrle de qualit et tests d'aptitude
4. PROCEDURES DE CONTROLE INTERNE DE QUALITE

4.1. Introduction
4.2. Approche gnrale. Contrle statistique
4.3. CIQ et adquation au but recherch
4.4. Nature des erreurs
5. CIQ ET FIDELITE INTRA-SERIE

5.1. Fidlit et duplication
5.2. Interprtation de donnes dupliques
6. MATERIAUX DE CONTROLE DANS LE CIQ

6.1. Introduction
6.2. Rle des matriaux de rfrence certifis
6.3. Prparation des matriaux de contrle
6.4. Dtermination des blancs
6.5. Traabilit des surcharges et vrification des recouvrements
MA-F-AS1-11-COQUAL 1
7. RECOMMANDATIONS
8. CONCLUSIONS
9. REFERENCES
APPENDICE 1. CARTES DE CONTROLE DE SHEWHART
1. INTRODUCTION
1.1 Concepts de base.

Ce document donne des recommandations permettant de mettre en oeuvre
le contrle interne de qualit (CIQ) dans les laboratoires d'analyse. Le CIQ
est l'une des mesures parmi un ensemble de mesures que les analystes
peuvent prendre pour s'assurer que les rsultats produits dans le laboratoire
conviennent l'usage auquel ils sont destins. En pratique, cette adquation
l'usage est dtermine en comparant l'exactitude obtenue dans un
laboratoire un temps donn au niveau requis d'exactitude. Le contrle
interne de qualit comprend donc les procdures pratiques de routine qui
permettent l'analyste d'accepter un rsultat ou un groupe de rsultats
comme adapt l'usage, ou de rejeter les rsultats et rpter l'analyse.
Ainsi, le CIQ est un facteur important de la qualit des rsultats d'analyse
et reconnu en tant que tel par les organismes d'accrditation.
Le CIQ est ralis en incluant des matriaux de rfrence particuliers, ici

appels "matriaux de contrle" dans la squence analytique et en
dupliquant les analyses. Les matriaux de contrle devraient, si possible,
tre reprsentatifs des matriaux analyser d'un point de vue composition
de la matrice, tat de prparation physique et tre situs dans la gamme de
concentration de l'analyte. Comme les matriaux de contrle sont traits
exactement de la mme manire que les matriaux analyser, ils sont
considrs comme des substituts qui peuvent tre utiliss pour caractriser
la performance du systme analytique, la fois un temps donn et sur des
priodes de temps plus longues.
Le CIQ est une vrification finale de l'excution correcte de toutes les

procdures (y compris l'talonnage) qui sont prescrites dans le protocole
d'analyse et de toutes les autres mesures d'assurance de qualit qui sous
entendent une bonne pratique d'analyse. Le CIQ est donc ncessairement
rtrospectif. Il est aussi exig qu'il soit autant que possible indpendant du
protocole analytique et en particulier de l'talonnage qu'il a pour but de
tester.
De faon idale, les matriaux de contrle et ceux utiliss pour l'talonnage

devraient tre tous deux raccords des matriaux de rfrence certifis
appropris ou une mthode de rfrence base sur l'exprience. Quand
cela n'est pas possible, les matriaux de contrle devraient tre raccords
au moins un matriau de puret garantie ou tout autre matriau bien
caractris. Mais, les deux voies de raccordement ne doivent pas se
rejoindre une tape trop lointaine dans le processus analytique. Par
exemple, si les matriaux de contrle et les talons taient prpars partir

d'une seule solution mre d'analyte, le CIQ ne dtecterait pas une
inexactitude provenant d'une prparation incorrecte de la solution mre.
Il est commun d'analyser plusieurs ou peut-tre de nombreux matriaux

d'essais similaires ensemble et d'inclure des matriaux de contrle dans la
srie. Souvent les dosages seront dupliqus en analysant des prises d'essai
du mme matriau. Dans ce document, un tel groupe de matriaux sera
appel "srie" analytique. (Les mots "squence", "ensemble" ou "lot" ont
t aussi utiliss comme synonymes de "srie"). Ces sries sont considres
comme si elles taient analyses dans des conditions effectivement
constantes. Les lots de ractifs, rglages de l'appareillage, l'analyste et
l'environnement du laboratoire resteront dans des conditions idales,
inchanges au cours de l'analyse d'une srie. Les erreurs systmatiques
devraient donc rester constantes ainsi que les valeurs des paramtres qui
dcrivent les erreurs alatoires, pendant l'analyse d'une srie. Tant qu'il
s'agit de suivre ces erreurs, la "srie" est l'unit oprationnelle de base du
CIQ.
On considre qu'une srie est effectue dans des conditions de rptabilit,

c'est--dire que les erreurs alatoires de mesure sont de l'ordre de grandeur
de celles qui seraient rencontres dans une courte priode de temps. En
pratique, l'analyse d'une srie peut prendre suffisamment de temps pour que
de petites erreurs systmatiques se produisent. Par exemple, les ractifs
peuvent se dgrader, les appareils peuvent driver, des ajustages mineurs
des valeurs instrumentales peuvent tre ncessaires, ou la temprature du
laboratoire peut s'lever. Cependant, ces effets systmatiques sont dans le
cadre du CIQ englobs dans les variations de rptabilit. En plaant les
matriaux constituant une srie dans un ordre alatoire les effets de la
drive sont transforms en erreur alatoire.
1.2 Domaine d'application de ce document.

Ce document est une harmonisation des procdures de CIQ qui se sont
dveloppes dans divers domaines de l'analyse, notamment en biochimie
clinique, gochimie et dans les tudes environnementales, l'hygine
professionnelle et l'analyse alimentaire(3-9). Il y a beaucoup de points de
base communs dans les procdures utilises dans ces divers domaines. La
chimie analytique recouvre d'ailleurs un domaine d'activits encore plus
large et les principes de base du CIQ devraient tre capables de les
englober toutes. Ce document fournit les recommandations qui seront
applicables dans la plupart des cas. Cette politique exclut ncessairement
un certain nombre de pratiques rserves des secteurs particuliers de la

communaut analytique. De plus, dans quelques secteurs il est commun de
combiner le CIQ tel qu'il est dfini ici avec d'autres aspects de la pratique
de l'assurance de qualit. Il n'y a pas de danger dans une telle combinaison,
mais les aspects essentiels du CIQ doivent rester clairs.
Pour raliser une harmonisation et fournir un guide de base sur le CIQ,

quelques types d'activit analytique ont t exclus de ce document. Les
points spcifiquement exclus sont :
(i) Le contrle de qualit de l'chantillonnage. Tandis qu'il est reconnu que

la qualit du rsultat analytique peut tre infrieure celle de l'chantillon,
le contrle de qualit de l'chantillonnage constitue un sujet spar et dans
beaucoup de domaines n'est pas pleinement dvelopp. De plus, dans de
nombreux cas, les laboratoires d'analyse n'ont pas de contrle sur la
pratique et la qualit de l'chantillonnage.
(ii) L'analyse en ligne et suivi continu. Dans ce type d'analyse il n'est pas
possible de rpter la mesure, et le concept de CIQ tel qu'il est utilis dans
ce document n'est pas applicable.
(iii) Le CIQ multivari. Les mthodes multivaries en CIQ sont encore un

sujet de recherche et ne peuvent tre considres comme suffisamment
tablies pour tre incluses ici. Le document actuel considre les donnes
"multianalyses" comme exigeant une srie de tests de CIQ univaris. Il
faudra faire attention l'interprtation de ce type de donnes pour viter un
rejet frquent inappropri des donnes.
(iv) Exigences statutaires et contractuelles.
(v) Les mesures d'assurance de qualit telles que les vrifications de la

stabilit des instruments avant et pendant l'analyse, l'talonnage en
longueur d'onde, l'talonnage de la balance, les tests de rsolution des
colonnes chromatographiques et le diagnostic
des problmes ne sont pas inclus. Dans le cadre envisag, ils sont
considrs comme faisant partie du protocole d'analyse, et le CIQ teste leur
efficacit en mme temps que les autres aspects de la mthodologie.
1.3 CIQ et incertitude.

Un pr-requis de la chimie analytique est de reconnatre l'adquation au but
recherch, le niveau d'exactitude requis pour une utilisation efficace des
donnes analytiques. Ce niveau est atteint en considrant les usages prvus
des donnes, bien qu'il soit rarement possible de prvoir la totalit des
applications potentielles futures des rsultats analytiques. Pour cette raison
et pour viter une interprtation inapproprie, il est important que les
rsultats analytiques soient accompagns de leur incertitude ou qu'elle soit
facilement disponible pour ceux qui veulent utiliser les donnes.
A strictement parler, un rsultat d'analyse ne peut pas tre interprt sauf

s'il est accompagn de son incertitude associe un niveau de confiance
donn. Un simple exemple dmontre ce principe. Supposons qu'il y ait une
exigence statutaire disant qu'un aliment ne doit pas contenir plus que 10
g.g-1 d'un constituant particulier. Un fabricant analyse un lot et obtient
un rsultat de 9 g.g-1 de ce constituant. Si l'incertitude du rsultat
exprime en demi-intervalle (en prsumant qu'il n'y a pas d'erreur
d'chantillonnage) est de 0,1 g.g-1 (c'est--dire que le rsultat se situe
avec une probabilit leve dans l'intervalle 8,9 - 9,1), on peut alors
supposer que la limite lgale n'est pas dpasse. Si au contraire l'incertitude
est de 2 g.g-1 il n'y a pas une telle assurance. L'interprtation et l'usage
qui peuvent tre faits de la mesure dpendent de l'incertitude qui lui est
associe.
Les rsultats analytiques devront donc tre accompagns d'une incertitude

si on doit leur attacher un sens dfini ou si on doit faire une interprtation
documente. Si cette exigence ne peut pas tre satisfaite, l'utilisation des
rsultats est limite. Il faudra aussi tester que l'incertitude de mesure
requise est atteinte en routine, la qualit des donnes pouvant varier la
fois dans un mme laboratoire au cours du temps et entre diffrents
laboratoires. Le CIQ inclut le processus de vrification que l'incertitude
exige est accomplie dans une srie.
2. DEFINITIONS
2.1. Dfinitions internationales.
Assurance de qualit : toutes les actions planifies et systmatiques

ncessaires pour fournir la confiance adquate qu'un produit ou service
satisfera aux exigences donnes de qualit(10).
Justesse : troitesse de l'accord entre la valeur moyenne obtenue partir

d'une grande srie de rsultats exprimentaux d'un test et une valeur
accepte comme valeur de rfrence(11).
Fidlit : troitesse de l'accord entre les rsultats d'essais indpendants

obtenus dans des conditions prescrites(12).
Biais : diffrence entre l'esprance de rsultats d'essai et une valeur

accepte comme rfrence.
Exactitude : troitesse d'accord entre le rsultat d'un mesurage et une

valeur vraie du mesurande(13).
Note 1. L'exactitude est un concept qualitatif.

Note 2. Le terme "prcision" ne doit pas tre utilis pour "exactitude".
Erreur : rsultat d'un mesurage moins une valeur vraie du mesurande(13).
Conditions de rptabilit : conditions o des rsultats d'essai sont

obtenus avec la mme mthode sur des chantillons d'essai identiques dans
le mme laboratoire par le mme oprateur utilisant le mme appareillage,
dans un court intervalle de temps(11).
Incertitude de mesure : paramtre, associ avec le rsultat d'une mesure,

qui caractrise la dispersion des valeurs qui pourraient tre
raisonnablement attribues au mesurande(14).
Note 1. Le paramtre peut tre, par exemple un cart-type (ou un multiple

de celui-ci) ou la demi-largeur d'un intervalle un niveau de confiance
dtermin.
Note 2. L'incertitude de mesure comprend en gnral plusieurs

composantes. Certaines peuvent tre values partir de la distribution
statistique des rsultats d'une srie de mesurages et peuvent tre

caractrises par des carts-types exprimentaux. Les autres composantes
qui peuvent aussi tre caractrises par des carts-types, sont values
partir de distributions prsumes de probabilit bases sur l'exprience
acquise ou sur d'autres informations.
Note 3. Il est entendu que le rsultat d'un mesurage est la meilleure

estimation de la valeur d'un mesurande et que toutes les composantes de
l'incertitude, y compris celles qui proviennent d'effets systmatiques, telles
que les composantes associes aux corrections et aux talons de rfrence,
contribuent la dispersion.
Traabilit : proprit du rsultat d'un mesurage ou d'un talon tel qu'il

puisse tre reli des rfrences dtermines, gnralement des talons
nationaux ou internationaux par l'intermdiaire d'une chane ininterrompue
de comparaisons ayant toutes des incertitudes dtermines.
Matriau de rfrence : matriau ou substance dont une ou plusieurs

valeurs de la (des) proprit(s) est (sont) suffisamment homogne(s) et
bien dfinie(s) pour permettre de l'utiliser pour l'talonnage d'un appareil,
l'valuation d'une mthode de mesurage, ou l'attribution de valeurs aux
matriaux.
Matriau de rfrence certifi : matriau de rfrence, accompagn d'un

certificat, dont une (ou plusieurs) valeur(s) de la (des) proprit(s) a une
ralisation exacte de l'unit dans laquelle les valeurs de proprit sont
exprimes et pour laquelle chaque valeur certifie est accompagne d'une
incertitude un niveau de confiance indiqu.
2.2 Dfinitions de termes spcifiques ce document.
Contrle interne de qualit : ensemble de procdures entreprises par le

personnel du laboratoire pour suivre en continu les oprations et les
rsultats de mesurages afin de dcider si les rsultats sont suffisamment
fiables pour tre dlivrs.
Matriau de contrle : matriau utilis pour le contrle de qualit interne

et soumis tout ou partie de la mme procdure de mesurage que celle
utilise pour les matriaux analyser.
Srie (srie analytique) : ensemble de mesurages raliss dans des

conditions de rptabilit.
Adquation l'usage : degr auquel les donnes produites par un

processus de mesurage permet l'utilisateur de prendre des dcisions
correctes d'un point de vue technique et administratif pour un usage
indiqu.
Systme analytique : ensemble de circonstances qui contribuent la

qualit des donnes analytiques, y compris l'appareillage, les ractifs,
procdures, matriaux d'analyse, personnel, environnement et mesure de
l'assurance qualit.
3. PRATIQUES DE L'ASSURANCE DE QUALITE ET DU CONTROLE

INTERNE DE QUALITE
3.1 Assurance de qualit

L'assurance de qualit est l'infrastructure d'organisation essentielle qui
assure que toutes les mesures analytiques sont fiables. Elle a pour rle de
raliser des niveaux de qualit appropris dans des domaines comme la
formation et la gestion du personnel, l'adquation de l'environnement du
laboratoire, la scurit, le stockage, l'intgrit et l'identit des chantillons,
la conservation des enregistrements, la maintenance et l'talonnage des
instruments, et l'utilisation de mthodes techniquement valides et
convenablement documentes. Une dfaillance dans l'un de ces secteurs
pourrait anantir des efforts importants faits par ailleurs pour atteindre la
qualit dsire des donnes. Ces pratiques ont t rcemment codifies et
reconnues formellement comme essentielles. En effet la prdominance de
ces circonstances favorables ne permet en aucun cas d'assurer que la qualit
des donnes a t atteinte, moins que le CIQ ne soit effectu.
3.2 Choix de la mthode analytique.

Il est important que les laboratoires limitent leur choix aux mthodes qui
ont t caractrises comme adaptes la matrice et l'analyte considr. Le
laboratoire doit possder la documentation dcrivant les caractristiques de
performance de la mthode, estimes dans des conditions appropries.
L'emploi d'une mthode ne garantit pas en lui-mme que les

caractristiques de performances tablies soient acheves. Une mthode
donne a seulement un potentiel pour atteindre un certain degr de fiabilit
quand la mthode est applique dans un ensemble particulier de
circonstances. C'est l'ensemble de ces circonstances, appel "systme
analytique" qui est responsable de l'exactitude des donnes analytiques. Il
est donc important de suivre le "systme analytique" pour qu'il ait un
fonctionnement adapt l'usage. C'est le but des mesures du CIQ
entreprises dans un laboratoire.
3.3 Contrle de qualit et test d'aptitude.

Le test d'aptitude est une vrification priodique de la performance de
laboratoires individuels ou de groupes de laboratoires. Il est ralis par un
organisme spcialis indpendant qui distribue des matriaux types des
participants pour qu'ils les analysent sans supervision(2). La participation
des tests d'aptitude, bien qu'elle soit importante ne saurait se substituer
des mesures de CIQ ou vice versa.
Les tests daptitude peuvent tre regards comme normaux mais les
contrles sur les erreurs analytiques sont relativement rares. Sans le
support dun bon systme de CIQ, la valeur de la participation un test
daptitude est insignifiante. Il est probable que leffet bnfique principal
des tests daptitude est quil encourage les participants installer des
systmes de contrle de qualit. Il a t prouv que les laboratoires avec
des systmes de CIQ avaient de meilleurs rsultats dans les tests daptitude.
4. PROCEDURES DE CONTROLE INTERNE DE QUALITE
4.1. Introduction.
Le contrle interne de qualit implique les tapes pratiques entreprises pour
s'assurer que les erreurs dans les donnes analytiques sont d'un ordre de
grandeur appropri leur utilisation. La pratique du CIQ dpend de
l'utilisation de 2 stratgies : l'analyse de matriaux de rfrence pour suivre
la justesse et le contrle statistique, et la duplication pour suivre la fidlit.
L'approche de base vers le CIQ implique l'analyse de matriaux de contrle

paralllement aux matriaux d'essais analyser. Le rsultat des analyses de
contrle forme la base de la dcision d'accepter les donnes de l'essai.
Deux points cls doivent tre nots dans ce contexte.
(i) L'interprtation des donnes du contrle doit tre base sur des critres
documents, objectifs, et sur des principes statistiques quand cela est
possible.
(ii) Les rsultats des analyses de contrle doivent tre considrs en

premier lieu comme des indicateurs de la performance du systme
analytique, et seulement ensuite comme un guide vers les erreurs associes
aux rsultats d'essais individuels. Des changements substantiels dans
l'exactitude des dosages du contrle peuvent quelquefois tre pris comme
indicateurs de changements similaires dans les donnes des matriaux
d'essai analyss en parallle mais ne peuvent tre accepts pour corriger
des donnes analytiques.
4.2. Approche gnrale. Contrle statistique.

L'interprtation des rsultats des analyses du CIQ dpend beaucoup du
concept de contrle statistique, qui correspond la stabilit de l'ensemble
de l'opration. Le contrle statistique implique qu'un rsultat x de CIQ peut
tre considr de manire indpendante et alatoire comme provenant d'une
population normale de moyenne et de variance 2.
Avec ces contraintes, seulement 0,27 % des rsultats (x) se situeraient en

dehors des limites 3. Quand on rencontre ces rsultats extrmes, on
considre qu'ils sont "hors contrle" et que le systme analytique
commence se comporter diffremment. La perte du contrle implique que
l'exactitude des donnes produites par le systme n'est pas connue et que
l'on ne peut se baser sur ces donnes. Le systme analytique doit tre
examin et doit tre soumis une action correctrice avant de raliser
d'autres analyses. La maitrise du contrle statistique peut tre suivie

graphiquement avec les cartes de contrle de Shewhart (voir appendice 1).
Il est aussi possible d'utiliser une approche numrique quivalente, qui
consiste comparer les valeurs de z = (x-)/ aux valeurs appropries de
l'cart-type normal.
4.3 CIQ et adquation au but recherch.

Le processus du CIQ est en grande partie bas sur une description en terme
de paramtres statistiques d'un systme d'analyse fonctionnant dans des
conditions opratoires normales. Les limites de contrle sont donc bases
sur les valeurs estimes de ces paramtres plutt que sur des mesures
drives de considrations d'adquation l'emploi. Les limites de contrle
doivent tre plus troites que les exigences de l'adquation l'emploi sinon
l'analyse serait vaine.
Le concept de contrle statistique n'est cependant pas appropri quand

l'analyse dite ad hoc doit tre entreprise. Dans l'analyse ad hoc les
matriaux d'essai peuvent ne pas tre familiers ou peuvent tre rarement
rencontrs, et les sries sont souvent constitues seulement de quelques
matriaux d'essai. Dans ce cas, il n'y a pas de base statistique pour
construire des cartes de contrle. L'analyste doit utiliser les critres
d'adquation l'emploi, les rsultats historiques ou la conformit d'aspect
du matriau d'essai pour juger de l'acceptabilit des rsultats obtenus.
De toutes faons, il serait souhaitable d'avoir des mthodes agres pour

tablir des critres quantitatifs permettant de caractriser l'adquation
l'emploi. Malheureusement, c'est un des aspects les moins dvelopps du
C.I.Q. Dans des domaines d'application spcifiques, des recommandations
peuvent merger par consensus. Par exemple, dans les tudes de
l'environnement il est gnralement reconnu que des incertitudes relatives
infrieures 10 % en concentration d'analyte trace portent rarement
consquence. En analyse alimentaire, la courbe d'Horwitz(16) est
quelquefois utilise comme approprie pour tablir le critre d'adquation
l'usage. De tels critres ont t dfinis pour l'analyse clinique(17, 18). Dans
quelques domaines de gochimie applique, une approche systmatique a
permis d'tablir des critres d'adquation l'emploi pour les fidlits
d'chantillonnage et d'analyse. Cependant, il n'est pas possible de donner
ici des recommandations dans ces domaines, et d'avancer des principes
gnraux rpondant des applications spcifiques.
4.4 Nature des erreurs.

On reconnait deux catgories principales d'erreurs analytiques, les erreurs
alatoires et les erreurs sur une longue priode de temps qui affecte tous les
rsultats. Il est important de classer ces erreurs en catgories car elles ont
des origines, des remdes et des consquences diffrentes pour interprter
les donnes.
Les erreurs alatoires dterminent la fidlit des mesurages. Elles peuvent

causer des dviations alatoires positives et ngatives des rsultats autour
de la valeur moyenne sous-jacente. Les erreurs systmatiques
correspondent l'cart entre la valeur moyenne d'un grand nombre de
dterminations et la valeur vraie. En ce qui concerne le CIQ, 2 niveaux
d'erreurs systmatiques doivent tre considrs :
(i) Le biais persistant qui affecte le systme analytique (pour un type

donn de matriau d'essai) sur une longue priode de temps et affecte tous
les rsultats. Un biais, s'il est petit par rapport l'erreur alatoire, peut tre
identifi seulement si le systme analytique a fonctionn pendant
longtemps. On peut tolrer un biais s'il reste dans des limites prescrites.
(ii) L'effet de srie qui peut tre mis en vidence par exemple par une
dviation du systme analytique pendant une srie particulire. Cet effet,
quand il est suffisamment grand, sera identifi par le contrle de qualit,
quand il se produit , comme une condition hors contrle.
La division conventionnelle des erreurs entre erreurs alatoires et erreurs

systmatiques dpend de l'chelle de temps sur laquelle on examine le
systme. Les effets de srie d'origine inconnue peuvent tre regards long
terme comme la manifestation d'un processus alatoire. La mme variation
pourra tre considre court terme comme un changement assimilable
un biais qui affecte une srie particulire.
Le modle statistique utilis pour le CIQ dans ce document est le suivant1.

La valeur de mesurage (x) dans une srie particulire est donne par :
x = valeur vraie + biais persistant + effet de srie + erreur alatoire (+

erreur grossire).
1 Le modle pourrait tre tendu si ncessaire pour inclure d'autres traits caractristiques du
systme analytique.
2
La variance de x ( x ) en l'absence d'erreurs grossires est donne par :
2 = 2 + 2
x 0 1
avec
2 = variance de l'erreur alatoire (intra-srie)
0
2 = variance de l'effet de srie
1
Les variances de la valeur vraie et du biais persistant sont toutes deux

nulles. Un systme analytique sous contrle est entirement dcrit par 20 ,
12 et la valeur du biais persistant. Les erreurs grossires sont impliques
quand le systme analytique ne correspond pas ces conditions.
5. CIQ ET FIDELITE INTRA-SERIE
5.1 Fidlit et duplication.
Un contrle limit de la fidlit intra-srie est effectu en dupliquant les

mesures faites sur les matriaux d'essai dans une squence. L'objectif est de
s'assurer que les diffrences entre des paires de rsultats sont cohrentes ou
meilleures que le niveau impliqu par la valeur 0 utilise par un
laboratoire pour le CIQ2. Ce test alerte l'utilisateur sur l'ventualit d'une
fidlit intra-srie faible et fournit une information supplmentaire pour
interprter les cartes de contrle. La mthode est utile en particulier pour
les analyses ad hoc o l'attention est concentre sur une srie unique et o
l'information obtenue partir des matriaux de contrle n'est probablement
pas compltement satisfaisante.
Comme approche gnrale, tous les matriaux d'essai ou une slection

alatoire de ces matriaux, sont analyss en double. Les diffrences
absolues | d | = | x1 - x2 | entre les rsultats analytiques dupliqus x1 et x2
sont tests par rapport une limite suprieure de contrle base sur une
valeur approprie de 0. Par contre, si les matriaux d'essai dans la srie
2 Il n'est pas envisag ici d'estimer l'cart-type de rptabilit r , partir des donnes du CIQ
ou de comparer les estimations : il y aurait en gnral trop peu de rsultats pour un
aboutissement satisfaisant. Si une telle estimation est ncessaire la formule sr =

d2 / 2 n
peut tre utilise.
couvrent un grand intervalle de concentration en analyte, une valeur unique

de 0 ne peut tre tablie (19).
Les essais dupliqus pour le CIQ doivent reflter autant que possible la
gamme de variation de la srie. Ils ne doivent pas tre analyss cte cte
dans la srie, car ils mettraient en vidence seulement la plus petite mesure
de variabilit analytique. La meilleure faon de placer les essais dupliqus
est de les rpartir de faon alatoire dans chaque srie. La duplication
ralise pour le CIQ exige l'analyse complte et indpendante (de
prfrence en aveugle) de prises d'essai de l'chantillon du matriau d'essai;
une duplication de la mesure instrumentale d'une seule solution d'essai
serait inefficace parce que les variations introduites par le traitement
chimique prliminaire du matriau d'essai ne sont pas incluses.
5.2 Interprtation de donnes dupliques.
5.2.1 Intervalle troit de concentration.

Dans la situation la plus simple, les matriaux d'essai dans la srie
recouvrent un petit intervalle de concentration d'analyte de telle sorte qu'un
cart-type commun 0 intra-srie peut tre appliqu.
Une valeur de ce paramtre doit tre estime pour fournir une limite de
contrle. La limite suprieure de |d| pour 95 % est de 2 2 0 et en
moyenne seulement 3 rsultats sur 1000 devraient dpasser 3 2 0. Un
groupe de n rsultats dupliqus peuvent tre interprts de diffrentes
faons.
Par exemple, la diffrence standardise
zd = d / 2 0
devrait avoir une distribution normale avec une moyenne gale zro et un
cart-type gal l'unit. La somme d'un groupe de n rsultats aurait un
cart type n , et seulement 3 sries sur 1000 produiraient une valeur | zd
| > 3 n . Alternativement un groupe de n valeurs de zd partir d'une srie
peut tre combin pour former z 2d et le rsultat interprt comme un
chantillon issu d'une distribution de 2 avec n degrs de libert, ( 2n ). Il
faut cependant utiliser ce type de statistique avec prcaution car elle est
insensible aux rsultats aberrants.
5.2.2 Large intervalle de concentration.

Si les matriaux d'essai constituant une srie couvrent un large intervalle de
concentration en analyte, un cart-type commun de fidlit (0) ne peut
tre estim; 0 doit tre exprim comme une relation qui dpend de la
concentration. Pour un matriau particulier, la valeur de concentration
utilise est prise comme gale (x1 + x2)/2, et une valeur approprie de
0 est obtenue partir de la relation fonctionnelle, dont les paramtres
doivent tre estims l'avance.
6. MATERIAUX DE CONTROLE DANS LE CIQ
6.1. Introduction.
Les matriaux de contrle sont des substances caractrises qui sont
insres dans la squence ct des matriaux d'essais et soumis
exactement au mme traitement. Un matriau de contrle doit contenir une
concentration approprie de l'analyte, et une valeur de cette concentration
doit tre attribue au matriau. Les matriaux de contrle agissent comme
des substituts pour les matriaux d'essai et doivent tre donc reprsentatifs,
c'est--dire devraient tre soumis aux mmes sources potentielles d'erreur.
Pour tre totalement reprsentatif, un matriau de contrle doit avoir la
mme matrice en terme de composition globale, y compris les constituants
mineurs qui peuvent avoir une influence sur l'exactitude. Il devrait tre
dans une forme physique c'est--dire tat de division similaire aux
matriaux d'essais. Il y a d'autres caractristiques essentielles pour un
matriau de contrle. Il doit tre suffisamment stable sur la priode de
temps considre. Il doit pouvoir tre divis en portions rellement

identiques pour l'analyse. Il est souvent requis en grande quantit pour
permettre son utilisation sur une priode de temps tendue.
Les matriaux de rfrence en CIQ sont utiliss en association avec les

cartes de contrle qui permettent de rendre compte la fois du biais
persistant et des effets de srie. Le biais persistant est mis en vidence par
une dviation significative de la ligne centrale par rapport la valeur
assigne. La variation due l'effet de srie peut tre prdite en terme
d'cart-type quand le systme est sous contrle statistique, et cet cart-type
est utilis pour dfinir les limites d'action et d'alerte partir d'un certain
loignement de la valeur vraie.
6.2 Rle des matriaux de rfrence certifis.

Les matriaux de rfrence certifis (MRC) tels qu'il sont dfinis dans la
section 2 (c'est--dire, avec indication de l'incertitude et de la traabilit),
quand ils sont disponibles et de composition approprie, constituent les
matriaux de contrle idaux parce que, d'un point de vue de traabilit, ce
sont les talons ultimes de justesse(20). Dans le pass les MRC taient
considrs seulement des fins de rfrence et non pour un usage de
routine. Une approche plus actuelle est de les traiter comme produits de
consommation et donc adapts au CIQ.
Un tel emploi des MRC est cependant sujet de nombreuses contraintes.
(i) Malgr un ventail sans cesse croissant de MRC disponibles, il n'existe

pas de MRC disponibles bien adapts pour la majorit des analyses.
(ii) Bien que le cot des MRC ne soit pas prohibitif par rapport au cot
total des analyses, il peut tre impossible pour un laboratoire ayant un
grand ventail d'activits d'avoir en stock toutes les sortes de matriaux de
rfrence ncessaires.
(iii) Le concept de matriau de rfrence n'est pas applicable aux matriaux

si la matrice ou l'analyte sont instables.
(iv) Les MRC ne sont pas ncessairement disponibles en quantit suffisante

pour approvisionner le CIQ sur de longues priodes de temps.
(v) Il doit tre rappel que tous les matriaux de rfrences apparemment
certifis n'ont pas une qualit gale. Il est recommand d'tre prudent
quand l'information porte sur le certificat est inadquate.
Si pour une des raisons voques ci-dessus l'emploi d'un MRC n'est pas
appropri, il incombe aux laboratoires individuels ou des groupes de
laboratoires de prparer leurs propres matriaux de contrle et leur assigner
des valeurs de concentration en analyte traables3 . Ces matriaux sont
quelques fois appels "matriaux de rfrence maison" (MRM). Une liste
de suggestions pour prparer ces MRM est indique dans la section 6.3.
Toutes les moyens dcrits ne sont pas applicables toutes les situations
analytiques.
6.3 Prparation des matriaux de contrle
6.3.1 Assignement d'une valeur vraie par analyse. En principe une valeur
de travail peut tre assigne un matriau de rfrence stable simplement
en effectuant une analyse soigneuse. Il sera ncessaire de prendre des
prcautions pour viter que la valeur assigne soit biaise. Cela ncessite
une forme quelconque de vrification indpendante, par exemple l'analyse
des matriaux par un certain nombre de laboratoires et l'utilisation si
possible de mthodes bases sur des principes physico-chimiques
diffrents. Le manque d'attention une validation indpendante de
matriaux de contrle a t soulign comme une faiblesse des systmes de
CIQ(15).
Un moyen d'tablir une valeur assigne traable pour un matriau de

contrle est d'analyser avec rptition et dans un ordre alatoire une srie
comprenant le matriau candidat et une slection de MRC adapts. Ce type
d'action n'est appropri que si des quantits limites de MRC sont
disponibles. La composition de la matrice et les concentrations en analyte
des MRC doivent tre appropries. Les MRC sont utilissdirectement pour
talonner la procdure analytique et analyser le matriau de contrle. Une
mthode d'analyse approprie est un pr-requis pour cette approche. Il
serait dangereux, par exemple, qu'une fraction mineure et variable de
l'analyte soit extraite pour la mesure. Il faut aussi considrer l'incertitude
introduite dans la valeur assigne.
3
Quand un MCR n'est pas disponible la traabilit seulement une mthode de rfrence ou
un lot de ractif fourni par un fabricant peut tre ncessaire.
6.3.2 Des matriaux valids dans un test d'aptitude constituent une source
valable de matriaux de contrle. Ils correspondent des matriaux
analyss par de nombreux laboratoires utilisant diverses mthodes. Sauf
contre-indications, telles qu'un biais vident ou une distribution de
frquence des rsultats inhabituelle, le consensus des laboratoires pourrait
tre considr comme une valeur assigne valide laquelle il est possible
d'attacher une incertitude fonde. (Il est possible que le consensus puisse
souffrir d'un biais significatif, mais cette potentialit est toujours prsente
dans des valeurs de rfrence). Il y aurait un problme thorique pour
tablir la traabilit d'une telle valeur, mais cela ne retire pas la validit de
la procdure propose. L'ventail de tels matriaux disponibles serait limit
mais les organisateurs de tests d'aptitude pourraient assurer un
approvisionnement important en prparant des lots de matriaux dpassant
les exigences immdiates de l'analyse circulaire. Il faudrait prouver que les
exigences normales de stabilit seront respectes.
6.3.3 Assignement d'une valeur vraie par formulation. Dans des cas
favorables un matriau de contrle peut tre prpar simplement par
mlange des constituants de puret connue en quantits pr dtermines.
Cette approche serait par exemple souvent satisfaisante dans le cas o le
matriau de contrle est une solution. Des problmes sont souvent
rencontrs dans la formulation pour produire des matriaux de contrle
solides dans un tat physique satisfaisant ou pour assurer que la spciation
et la distribution physique de l'analyte dans la matrice sont ralistes. Il faut
dmontrer que les constituants sont mlangs de faon adquate.
6.3.4 Matriaux de contrle dops.

Le "dopage" est un moyen de crer un matriau de contrle dans lequel une
valeur est assigne en combinant formulation et analyse. Cette mthode est
faisable quand un matriau d'essai dpourvu totalement d'analyte est
disponible. Aprs des vrifications analytiques exhaustives pour s'assurer
que le niveau bruit de fond est suffisamment bas, le matriau est dop avec
une quantit connue d'analyte. L'chantillon de rfrence ainsi prpar a la
mme matrice que les matriaux d'essais analyser et a un niveau d'analyte
connu; l'incertitude dans la concentration qui lui est assigne est limite
seulement par l'erreur de dosage de l'chantillon non dop. Cependant, il
peut tre difficile de s'assurer que la spciation, la liaison et la forme
physique de l'analyte sont identiques celles de l'analyte sous sa forme
native et que le mlange est adquat.
6.3.5. Vrification de recouvrement.

Si l'emploi d'un matriau de rfrence n'est pas ralisable, il est possible
d'utiliser un test de recouvrement pour vrifier de faon limite le biais.
Ceci est particulirement utile quand les analytes ou matrices ne peuvent
pas tre stabiliss ou quand l'analyse ad hoc est excute. Une portion du
matriau d'essai est dope avec une quantit connue de l'analyte et analyse
ct du matriau d'essai d'origine. Le recouvrement d'analyte ajout
(appel "recouvrement marginal") est la diffrence entre les deux mesures
divise par la quantit ajoute. Les avantages vidents sont que la matrice
est reprsentative et que l'approche est largement applicable - la plupart des
matriaux d'essais peuvent tre dops par un moyen quelconque.
Cependant la vrification du recouvrement souffre du dsavantage dj
not concernant la spciation, liaison et distribution physique de l'analyte;
en outre, l'hypothse d'un recouvrement quivalent de l'analyte ajout par
dopage et de l'analyte natif peut ne pas tre valide. On peut cependant
normalement supposer qu'une mauvaise performance dans une vrification
de recouvrement indique fortement une performance similaire ou plus
mauvaise pour l'analyte natif dans le matriau d'essai.
Les tests de dopage et de recouvrement comme mthode du CIQ doivent

tre distingus de la mthode des ajouts doss qui est un procd de
mesure; une seule surcharge pour le dopage ne peut tre utilise pour
remplir les rles la fois de mesure et de CIQ.
6.4 Dtermination des blancs
La dtermination des blancs constitue presque toujours une partie

essentielle du processus d'analyse et peut tre effectue sans inconvnient
paralllement au protocole de CIQ. La forme la plus simple du blanc est le
"blanc ractif" o la procdure d'analyse est excute entirement
l'exception de l'addition de l'chantillon. Ce type de blanc, en fait, teste
plus que la puret des ractifs; il peut par exemple dtecter la
contamination du systme analytique quelle que soit son origine, (par
exemple celle due la verrerie et l'atmosphre); il est donc mieux dcrit
comme un "blanc de la procdure". Dans quelques cas, les dterminations
du blanc sont mieux ralises en utilisant un matriau d'essai simul. Le
simulant pourrait tre un matriau d'essai rel connu pour tre
virtuellement dpourvu d'analyte, ou un substitut (par exemple, un papier
filtre sans cendre utilis au lieu d'un matriau vgtal). Quand il peut tre
pratiqu, le meilleur type de blanc est le "blanc de terrain" qui est une
matrice type avec une concentration nulle en analyte.
Une srie incohrente de blancs dans une squence suggre une

contamination sporadique et peut tre un argument de poids
supplmentaire qui s'ajoute aux donnes du CIQ, suggrant le rejet de
rsultats. Quand un protocole d'analyse prescrit la soustraction d'une valeur
de blanc, la valeur du blanc doit tre galement soustraite des rsultats des
matriaux de contrle avant de les utiliser en CIQ.
6.5 Traabilit des surcharges et vrification des recouvrements
Il faut se protger des problmes potentiels de traabilit des ractifs

utiliss pour les surcharges et vrifications de recouvrement. Quand les
MRC ne sont pas disponibles, la traabilit peut souvent tre tablie
seulement sur le lot d'analyte fourni par le fabricant. Il faut alors confirmer
l'identit et vrifier la puret avant utilisation. Une prcaution
supplmentaire est que les talons et la surcharge ne soient pas raccords
la mme solution mre d'analyte ou au mme analyste. S'il existait une telle
traabilit commune, les sources d'erreur correspondantes ne seraient pas
dtectes par le CIQ.
7. RECOMMANDATIONS
Les recommandations suivantes reprsentent des approches intgres au CIQ

qui conviennent beaucoup de types d'analyse et domaines d'application. Les
directeurs de systme de qualit du laboratoire devront adapter ces
recommandations leurs propres exigences particulires. Cette adaptation
pourrait consister, par exemple, ajuster le nombre d'chantillons dupliqus et
de matriaux de contrle insrs dans une srie, ou inclure des mesures
supplmentaires pour un champ d'application particulier. La procdure
finalement choisie et les rgles de dcision qui l'accompagnent doivent tre
codifies dans un CIQ qui est spar du protocole du systme analytique.
L'approche pratique du contrle de qualit est dtermine par la frquence de

ralisation du mesurage et la taille et nature de chaque srie. Les
recommandations suivantes sont donc faites. L'emploi de cartes de contrle et
de rgles de dcision sont donnes dans l'Appendice 1.
Dans chacun des cas suivants l'ordre dans lequel les divers matriaux sont
analyss dans la squence doit tre alatoire si possible. Un manquement cet
ordre alatoire peut donner lieu une sous-estimation des diverses composantes
de l'erreur.
(i) Sries courtes (par exemple , n < 20) et frquentes de matriaux similaires.
Ici l'intervalle de concentration d'analyte dans la srie est relativement faible,
aussi une valeur commune d'cart-type peut tre prsume.
Insrez un matriau de contrle au moins une fois par srie. Portez soit les
valeurs individuelles obtenues soit la valeur moyenne, sur une carte de contrle
approprie. Analysez en double au moins la moiti des matriaux d'essais,
choisis au hasard. Insrez au moins une dtermination de blanc tous les dix
chantillons d'essai.
(ii) Sries plus longues (par exemple n > 20) et frquentes de matriaux
similaires. Un cart type commun est galement prsum.
Insrez les matriaux de contrle une frquence d'environ 1 pour 10 matriaux

d'essai. Si la taille de la srie risque de varier d'une srie l'autre il est plus
facile de standardiser avec un nombre fixe d'insertions par srie et de porter la
valeur moyenne sur une carte de contrle de moyennes. Sinon reportez les
valeurs individuelles. Analysez en double au moins 5 des matriaux d'essais
choisis au hasard. Insrez une dtermination de blanc tous les dix matriaux
d'essai.
(iii) Sries frquentes contenant des matriaux similaires mais ayant un grand
intervalle de concentration en analyte. Ici nous ne pouvons pas prsumer qu'une
valeur unique d'cart-type est applicable.
Insrez les matriaux de contrle en nombre total approximativement gal

ceux recommands ci-dessus. De plus, il doit y avoir au moins deux niveaux
d'analyte reprsents, un proche du niveau mdian des matriaux d'essai type, et
l'autre situ environ plus ou moins 10 % selon le cas. Entrez les valeurs pour
les deux matriaux de contrle sur des cartes de contrle spares. Analysez en
double au moins cinq matriaux d'essai et insrez un blanc procdure pour dix
matriaux d'essai.
(iv) Analyse ad hoc. Ici le concept de contrle statistique n'est pas applicable. Il
est suppos cependant que les matriaux dans la srie sont d'un seul type, c'est-
-dire suffisamment similaires pour tirer des conclusions gnrales similaires
sur les erreurs.
Ralisez les analyses en double sur tous les matriaux d'essais. Ralisez des
surcharges ou des tests de recouvrement ou utilisez un matriau de contrle
formul, avec un nombre appropri d'insertions (voir ci-dessus) et avec
diffrentes concentrations d'analyte si appropri. Ralisez des dterminations de
blanc. Comme des limites de contrle ne sont pas disponibles, comparez le biais
et la fidlit l'adquation aux limites pour l'usage vis ou pour d'autres critres
tablis.
8. CONCLUSION
Le CIQ est un aspect essentiel pour s'assurer que les rsultats donns par un
laboratoire conviennent leur usage. Si elles sont convenablement excutes,
les mthodes de contrle de qualit peuvent suivre les divers aspects de contrle
des donnes de srie--srie. Dans les sries o la performance tombe en dehors
des limites acceptables, les donnes produites peuvent tre rejetes et, aprs
avoir apport une action curative au systme analytique, l'analyse peut tre
rpte.
Il doit tre soulign cependant que le CIQ n'est pas l'abri de drglement
mme s'il est excut convenablement. Bien entendu il est sujet des "erreurs
de deux types", c'est--dire que les sries sous contrle seront
occasionnellement rejetes et les sries non contrles seront occasionnellement
acceptes.
Il est plus important de noter que le CIQ ne peut pas habituellement identifier
des erreurs grossires sporadiques ou des anomalies court terme dans le
systme analytique qui affectent les rsultats pour des matriaux d'essai
individuels. De plus, les conclusions bases sur les rsultats du CIQ sont
applicables seulement aux matriaux d'essai qui tombent dans l'objectif de la
validation de mthode d'analyse. En dpit de ces limitations, que l'exprience
professionnelle et la diligence peuvent allger un certain point, le CIQ est le
principal recours disponible pour s'assurer que seules des donnes de qualit
convenable sont dlivres par un laboratoire. Quand il est correctement excut
il est trs efficace.
Finalement, il faut se rendre compte qu'une excution de pure forme de

n'importe quel systme de contrle de qualit ne garantit pas la production de
donnes de qualit adquate. Il faut documenter et agir sur les procdures
correctes de retour, d'action corrective et de motivation du personnel. En
d'autres mots, il faut qu'il y ait une implication la source dans la qualit
l'intrieur d'un laboratoire pour que le programme de CIQ russisse, c'est--dire

qu'il faut que le CIQ constitue une part d'un systme d'organisation de la qualit
totale.
9. REFERENCES
1 "Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method

Performance Studies", Edited W. Horwitz, Pure Appl. Chem., 1988, 60,
855-864 (Revision in press).
2 "The International Harmonised Protocol for the Proficiency Testing of
(Chemical) Analytical Laboratories", Edited M. Thompson and R. Wood,
Pure Appl. Chem., 1993, 65, 2123-
2144. (Also published in J. AOAC International, 1993, 76, 926-940.
3 "IFCC approved recommendations on quality control in clinical chemistry.
Part 4 : internal quality control", J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1980, 18,
534-541.
4 S. Z. Cekan, S. B. Sufi and E. W. Wilson, "Internal quality control for
assays of reproductive hormones : Guidelines for laboratories". WHO,
Geneva, 1993.
5 M. Thompson, "Control procedures in geochemical analysis", in R J
Howarth (Ed), "Statistics and data analysis in geochemical prospecting",
Elsevier, Amsterdam, 1983.
6 M. Thompson, "Data quality in applied geochemistry : the requiremetns
and how to achieve them", J. Geochem. Explor., 1992, 44, 3-22.
7 Health and Safety Executive, "Analytical quality in workplace air
monitoring", London, 1991.
8 "A protocol for analytical quality assurance in public analysts'
laboratories", Association of Public Analysts, 342 Coleford Road,
Sheffield S9 5PH, UK, 1986.
9 "Method evaluation, quality control, proficiency testing" (AMIQAS PC
Program), National Institute of Occupational Health, Denmark, 1993.
10 ISO 8402 : 1994. "Quality assurance and quality management -
vocabulary".
11 ISO 3434 - 1 : 1993 (E/F). "Statistics, vocabulary and symbols - Part I :
Probability and general statistical terms".
12 ISO Guide 30 : 1992. "Terms and definitions used in connections with

reference materials"
13 "International vocabulary for basic and general terms in metrology", 2nd
Edition, 1993, ISO, Geneva.
14 "Guide to the expression of uncertainty in measurement", ISO, Geneva,
1993.
15 M. Thompson and P. J. Lowthian, Analyst, 1993, 118, 1495-1500.
16 W. Horwitz, L. R. Kamps and K. W. Boyer, J. Assoc. Off. Anal. Chem.,
1980, 63, 1344.
17 D. Tonks, Clin. Chem., 1993, 9, 217-223.
18 G. C. Fraser, P. H. Petersen, C. Ricos and R. Haeckel, "Proposed quality
specifications for the imprecision and inaccuracy of analytical systems for
clinical chemistry", Eur. J. Clin. Chem. 1992, 30, 311-317.
19 M. Thompson, Analyst, 1988, 113, 1579-1587.
20 ISO Guide 33 : 1989, "Uses of Certified Reference Materials", Geneva.
APPENDICE 1. CARTES DE CONTROLE DE SHEWHART.
1. INTRODUCTION
La thorie, la construction et l'interprtation de la carte(1) de Shewhart sont
dtailles dans de nombreux textes sur le processus du contrle de qualit et
statistiques appliques, et dans plusieurs standards ISO(2-5). Il y a beaucoup de
littrature sur l'utilisation de la carte de contrle en chimie clinique(6, 7). Westgard
et ses collaborateurs ont formul de multiples rgles pour interprter ces cartes de
contrle(8) et la puissance de ces rsultats a t tudie en dtail(9-10). Dans cet
appendice les cartes de Shewhart simples sont seulement considres.
Dans le CIQ, une carte de contrle de Shewart est obtenue quand les valeurs de
concentration mesures sur un matriau de contrle dans des sries successives
sont portes sur un axe vertical en fonction du nombre de sries sur l'axe
horizontal. Si dans une srie plusieurs analyses d'un matriau de contrle
particulier sont effectues, soit les rsultats individuels x ou valeur moyenne x
peuvent tre utiliss pour former une carte de contrle. La carte est complte par
des lignes horizontales drives de la distribution normale N(,2) qui est utilise
pour dcrire les variations alatoires dans les valeurs portes. Les lignes choisies
pour le contrle sont 2 et 3. Diffrentes valeurs de sont ncessaires
pour les cartes des valeurs individuelles et des moyennes. Pour un systme sous
contrle statistique, en moyenne environ une valeur sur vingt tombent en dehors
des lignes 2, appeles des "limites d'alerte" et seulement trois sur mille
tombent en dehors des lignes 3 appeles " limites d'action". En pratique, les
valeurs estimes et s des paramtres et sont utilises pour construire la carte.
Un biais persistant est indiqu par une diffrence significative entre et la valeur
assigne.
2. ESTIMATION DES PARAMETRES et
Un systme analytique sous contrle montre deux sources de variations alatoires,

la variation intra-srie caractrise par la variance 20 et la variation entre-sries
caractrise par la variance 12 . La grandeur de ces deux variances est souvent
comparable. L'cart type x utilis dans une carte des valeurs individuelles est
donn par :
1/2
x = ( 20 + 12 )
tandis que pour une carte de contrle de valeurs moyennes, l'cart type est donn
par :
x = ( 0 / n + 1 )
2 2 1/ 2
Avec n nombre de mesures de contrle dans une srie partir de laquelle la

moyenne est calcule. La valeur de n donc doit tre constante d'une srie l'autre,
sinon les limites de contrle seraient impossibles dfinir. S'il n'est pas possible de
garantir une valeur fixe de rptitions d'un matriau de contrle par srie (par
exemple si les longueurs de sries taient variables) les cartes de valeurs
individuelles doivent tre utilises. De plus, l'quation indique que x ou
doivent tre soigneusement estimes. Si une estimation tait ralise sur des valeurs
rptes partir d'une seule srie, des limites trop troites de contrle seraient
obtenues.
Les valeurs estimes doivent donc inclure la composante entre-sries de la

variance. Si l'emploi d'une valeur particulire de n peut tre dtermine au dpart,
peut tre estim directement partir des
n
moyennes de m i= x
j =1
ij /n
(i = 1, ....., m), des n rptitions dans chacune des m sries successives. Donc la
valeur estime de est: x = xi / m i
et la valeur estime de est :
(x x) 2
s = i i
m1
x
Si la valeur de n n'est pas dtermine l'avance, il est possible d'obtenir des

estimations spares de o and 1 par une analyse de variance unilatrale. Si les
carrs moyens intra et inter-groupes sont MSw et MSb respectivement,
20 est estim par MSw et

12 est estim par (MSb - MSw) / n
Souvent en pratique, il est ncessaire de commencer une carte de contrle avec les
donnes collectes partir d'un petit nombre de sries, qui peuvent ne pas tre
reprsentatives un certain degr, car les valeurs estimes des carts-types sont trs
variables sauf si un grand nombre d'observations est utilis. De plus, pendant la
priode initiale, il est plus probable d'avoir des conditions hors contrle qu'en
temps normal, ce qui produit des valeurs aberrantes. De telles valeurs biaiseraient
et augmenteraient s. Il est donc conseill de recalculer et s aprs une priode
d'installation.
L'une des mthodes pour viter les effets des valeurs aberrantes dans le calcul
consiste rejeter ces valeurs aprs avoir appliqu le test de Dixon Q ou Grubbs(11)
et ensuite d'utiliser les statistiques classiques donnes ci-dessus. Il est galement
possible d'appliquer aux donnes les mthodes de statistiques robustes (12, 13).
3. L'INTERPRETATION DES CARTES DE CONTROLE
Les rgles simples suivantes peuvent tre appliques aux cartes de contrle des
rsultats individuels ou des moyennes.
Carte de contrle unique. Une condition hors contrle dans le systme analytique
est signale si un des faits suivants se produit.
(i) La valeur actuelle reporte tombe en dehors des limites d'action.

(ii) La valeur actuelle et la valeur prcdente reporte tombent en dehors
des limites d'alerte mais l'intrieur des limites d'action.
(iii) Neuf valeurs successives reportes tombent du mme ct de la ligne
moyenne.
Deux cartes de contle. Quand deux matriaux de contrle diffrents sont utiliss
dans chaque srie, les cartes de contrle respectives sont considres en mme
temps. Ceci augmente la chance d'une erreur de type 1 (rejet d'une srie fonde)
mais diminue la chance d'une erreur de type 2 (acceptation d'une srie errone).
Une condition hors contrle est indique si l'un des faits suivants se produit.
(i) Au moins l'une des valeurs reportes tombe en dehors des actions
limites.
(ii) Les deux valeurs reportes sont en dehors des limites d'alerte.
(iii) La valeur actuelle et la valeur prcdente reportes sur la mme carte
de contrle tombent toutes deux en dehors des limites d'alerte.
(iv) Les cartes de contrle montrent toutes les deux la fois que quatre
valeurs successives reportes sont du mme ct de la ligne moyenne.
(v) Une des cartes montre neuf valeurs successives portes tombant du
mme ct que la ligne moyenne.
Un traitement plus complet de la carte de contrle peut tre obtenu en appliquant

dans leur totalit les rgles de Westgard illustres dans la figure 2.
L'analyste devrait rpondre une condition hors contrle en arrtant l'analyse en

attendant les tests de diagnostic et l'action curative, puis en rejetant les rsultats de
la srie et en procdant une nouvelle analyse des matriaux d'essai.
4. REFERENCES
1 W. A. Shewhart, "Economic control of quality in manufactured product",

Van Nostrand, New York, 1931.
2 ISO 8258 : 1991. "Shewhart control charts".
3 ISO 7873 : 1993."Control charts for arithmetic means with warning
limits".
4 ISO 7870 : 1993. "Control charts - general guide and introduction".
5 ISO 7966 : 1993. "Acceptance control charts".
6 S. Levey and E. R. Jennings, Am. J. Clin. Pathol., 1950, 20, 1059-1066.
7 A. B. J. Nix, R. J. Rowlands, K. W. Kemp, D. W. Wilson and K. Griffiths,
Stat. Med., 1987, 6, 425-440.
8 J. O. Westgard, P. L. Barry and M. R. Hunt, Clin. Chem., 1981, 27, 493,
501.
9 C. A. Parvin, Clin. Chem., (in press).
10 J. Bishop and A. B. J. Nix, Clin. Chem., 1993, 39, 1638-1649.
11 W. Horwitz, Pure Appl. Chem., (in press).

12 Analytical Methods Committee, Analyst, 1989, 114, 1693-1697.
13 Analytical Methods Committee, Analyst, 1989, 114, 1699-1702.
----------------------------
Rapport technique rsultant du Symposium sur l'Harmonisation des Systmes d'Assurance Qualit
pour les Laboratoires d'Analyse, Washington DC, USA, 22-23 Juillet 1993 sponsoris par l'IUPAC,
l'ISO et AOAC International
Prpar pour publication par MICHAEL THOMPSON1 et ROGER WOOD2
1Department of Chemistry, Birkbeck College (University of London), London WC1H OPP, UK
2MAFF Food Science Laboratory, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UQ, UK
Groupe de Travail de 1991-95 :
Chairman : M. Parkany (Suisse) ; Membres : T. Anglov (Danemark) ; K. Bergknut (Norvge et
Sude) ; P. De Bive (Belgique) ; K.-G. von Boroviczny (Allemagne) ; J.M. Christensen (Danemark)
; T.D. Geary (South Australia) ; R. Greenhalgh (Canada) ; A.J. Head (Royaume Uni) ; P.T. Holland
(Nouvelle Zlande) ; W. Horwitz (USA) . A. Kallner (Sude; J. Kristiansen (Danemark) ; S.H.H.
Olrichs (Pays Bas) ; N. Palmer (USA) . M. Thompson (Royaume Uni) ; M.J. Vernengo (Argentine) ;
R. Wood (Royaume Uni).
Guide de validation Contrle qualit
Guide pratique pour la validation, le contrle qualit, et

lestimation de lincertitude dune mthode danalyse
nologique alternative
Sommaire
1. OBJET ..........................................................................................................................5
2. PREAMBULE ET CHAMP DAPPLICATION ...................................................5
3. VOCABULAIRE GENERAL ...................................................................................6
4. PRINCIPES GENERAUX ......................................................................................12

4.1. METHODOLOGIE 12
4.2. DEFINITION DE LERREUR DE MESURE 13
5. VALIDATION DUNE METHODE .....................................................................14
5.2. PREMIERE ETAPE : CHAMPS DAPPLICATION DE LA METHODE 15
5.2.1. Dfinition des matrices analysables 15
5.2.2. Limite de dtection et de quantification 16
5.2.2.1. Dfinition normative 16
5.2.2.2. Documentation de rfrence 16
5.2.2.3. Application 16
5.2.2.4. Mode opratoires 17
5.2.2.4.1. Dtermination sur blanc 17
5.2.2.4.1.1. Champs dapplication 17
5.2.2.4.1.2. Protocole de base et calculs 17
5.2.2.4.2. Approche par ltude de linarit 18
5.2.2.4.3. Approche graphique issue du bruit de fond de lenregistrement 20
5.2.2.4.3.2. Protocole de base et calcul 20
5.2.2.4.4. Vrification dune limite de quantification prdtermine 21
5.2.2.4.4.2. Protocole de base et calcul 21
5.2.3. Robustesse 23
5.2.3.1. Dfinition 23
5.2.3.1. Dtermination 23
5.3. ECONDE PARTIE : ETUDE DE LERREUR SYSTEMATIQUE
S 24
5.3.1. Etude de linarit 24
MA-F-AS1-12-GUIVAL 1

5.3.1.2. Documents de rfrence 24
5.3.1.4. Approche type ISO 11095 25
5.3.1.4.1. Protocole de base 25
5.3.1.4.2. Calculs et rsultats 26
5.3.1.4.2.1. Dfinition du modle de rgression 26
5.3.1.4.2.2. Estimation des paramtres 27
5.3.1.4.2.3. Reprsentations graphiques 27
5.3.1.4.2.4. Test de lhypothse de linarit 29
5.3.1.4.2.4.1. Dfinitions des erreurs lies ltalonnage 29
5.3.1.4.2.4.2. Test de Fischer-Snedecor 31
5.3.1.5. Approche ISO 8466 32
5.3.1.5.1.Protocole de base 32
5.3.1.5.2.Calculs et rsultats 33
5.3.1.5.2.1. Dfinition du modle de rgression linaire 33
5.3.1.5.2.2. Dfinition du modle de rgression polynomial 33
5.3.1.5.2.3. Comparaison des carts types rsiduels 35
5.3.2. Spcificit 36
5.3.2.3. Modes opratoires 37
5.3.2.3.1. Test des ajouts doss 37
5.3.2.3.1.1. Champ dapplication 37
5.3.2.3.1.2. Protocole de base 37
5.3.2.3.1.3. Calculs et rsultats 38
5.3.2.3.2. Etude de linfluence dautres composs sur le rsultat
du mesurage 41
5.3.2.3.2.1. Champ dapplication 41
5.3.2.3.2.3. Interprtation 42
5.3.3. Etude de la justesse de la mthode 43
5.3.3.1. Prsentation de ltape 43
5.3.3.1.1. Dfinition 43
5.3.3.1.2. Principes gnraux 44
5.3.3.1.3.Documents de rfrence 44
5.3.3.2. Comparaison de la mthode alternative la mthode de rfrence OIV44
5.3.3.2.1. Champs dapplication 44
5.3.3.2.2. Justesse de la mthode alternativepar rapport la mthode de
rfrence 45
5.3.3.2.2.1. Dfinition 45
5.3.3.2.2.2. Domaine dapplication 45
5.3.3.2.2.4. Interprtation 46
5.3.3.3. Comparaison par essais interlaboratoires 48
5.3.3.3.1. Domaine dapplication 48

5.3.3.3.2.Protocole de base et calculs 48
5.3.3.3.3. Interprtation 49
5.3.3.4. Comparaison des matriaux de rfrence 50
5.3.3.4.1. Domaine dapplication 50
5.3.3.4.2. Protocole de base et calculs 50
5.3.3.4.3.Interprtation 51
5.4. TROISIEME PARTIE : ETUDE DE LERREUR ALEATOIRE 52
5.4.1. Principe gnral 52
5.4.2. Documents de rfrence 53
5.4.3. Fidlit de la mthode 53
5.4.3.1. Dfinition 53
5.4.3.2. Champs dapplication 53
5.4.3.3. Cas thorique gnral 54
5.4.3.3.1.1. Calculs avec plusieurs matriaux dessai 54
5.4.3.3.1.2. Calculs avec 1 matriau dessai 56
5.4.3.4. Rptabilit 57
5.4.3.4.1. Dfinitions 57
5.4.3.4.3.1.Cas gnral 58
5.4.3.4.3.2. Cas particulier applicable 1 seule rptition 58
5.4.3.4.4. Comparaison des rptabilits 60
5.4.3.4.4.1. Dtermination des rptabilits des deux mthodes 60
5.4.3.4.4.2. Test de Fischer-Snedecor 60
5.4.3.5. Reproductibilit intralaboratoire 61
5.4.3.5.1.Dfinition 61
6. CONTROLE QUALITE DES METHODES DANALYSE (CIQ) ..................64
6.1. DOCUMENTS DE REFERENCE 64
6.2. PRINCIPES GENERAUX 64
6.3. LES MATERIAUX DE REFERENCE 64
6.4. CONTROLE DES SERIES ANALYTIQUES 66
6.4.1. Dfinition 66
6.4.2. Contrle de justesse partir de matriaux de rfrence 66
6.4.3. Fidlit intrasrie 66
6.4.4. Etalon interne 67
6.5. CONTROLE DU SYSTEME DANALYSE 67
6.5.1. Dfinition 67
6.5.2.Carte de Shewhart 67
6.5.2.1. Acquisition des donnes 67
6.5.2.2. Prsentation des rsultats et dfinition des limites 68
6.5.2.3. Exploitation de la carte de Shewhart 69

6.5.3. Comparaison interne des systmes danalyse 70
6.5.4. Comparaison externe du systme danalyse 70
6.5.4.1. Chane danalyse de comparaison interlaboratoires 70
6.5.4.2. Comparaison des matriaux de rfrence externes 70
6.5.4.2.1. Incertitude type du matriau de rfrence 71
6.5.4.2.2. Dfinition des limites de validit dun mesurage du matriau de
rfrence 71
7. ESTIMATION DE LINCERTITUDE DE MESURE .......................................72
7.1. DEFINITION 72
7.2. DOCUMENTS DE REFERENCE 72
7.3. DOMAINE DAPPLICATION 73
7.4.1. Dfinition du mesurande, et description de la mthode danalyse
quantitative 74
7.4.2. Analyse critique du processus de mesure 74
7.4.3. Calculs destimation de lincertitude type (dmarche intralaboratoire) 75
7.4.3.1. Principe 75
7.4.3.2. Calcul de lcart type de reproductibilit intralaboratoire 78
7.4.3.3. Estimation de sources derreurs systmatiques typiques non prises en
compte dans les conditions de reproductibilit 78
7.4.3.3.1. Erreur de calibrage (ou dtalonnage) 78
7.4.3.3.1.1. Mode opratoire 78
7.4.3.3.1.2.Calculs et rsultats 79
7.4.3.3.1.3. Estimation de lincertitude type associe la droite
de calibrage (ou dtalonnage) 80
7.4.3.3.2. Erreur de biais 81
7.4.3.3.2.1. Mthodes ajustes avec seul un matriau de rfrence certifi81
7.4.3.3.2.2. Mthodes ajustes avec plusieurs matriaux rfrents
(gammes de calibrages) 81
7.4.3.3.3. Effet matrice 82
7.4.3.3.3.1 .Dfinition 82
7.4.3.3.4. Effet chantillons 84
7.4.4. Estimation de lincertitude type par essais interlaboratoires 84
7.4.4.1. Principe 84
7.4.4.2. Utilisation de lcart type de reproductibilit interlaboratoire et
intramthode SRinter(mthode) 85
intermthode SRinter 86
7.4.4.4. Autres composantes au budget dincertitude 86
7.5. EXPRESSION DE LINCERTITUDE ELARGIE 86
1. Objet
Le prsent guide a pour but daccompagner les laboratoires dnologie pratiquant

lanalyse en srie dans leurs dmarches de validation, de contrle qualit interne et
destimation de lincertitude des mthodes alternatives quils mettent en uvre.
2. Prambule et champ dapplication
La norme internationale ISO 17025, dfinissant les prescriptions gnrales

concernant la comptence des laboratoires dtalonnages et dessais , prcise que
les laboratoires accrdits doivent, lorsquils mettent en uvre une mthode
analytique usuelle, sassurer de la qualit des rsultats obtenus. Pour cela, elle
indique plusieurs tapes. La premire consiste dfinir les exigences de la clientle
concernant le paramtre considr, afin de dterminer, par la suite, si la mthode
utilise rpond bien celles-ci. La seconde tape intgre, pour des mthodes non
normalises, modifies ou dveloppes par le laboratoire, une validation initiale.
Une fois la mthode mise en application, les laboratoires doivent employer des
moyens de contrle et de raccordement qui permettent de surveiller la qualit des
rsultats obtenus. Enfin, ils doivent estimer lincertitude associe aux rsultats
obtenus.
Afin de rpondre ces exigences, les laboratoires disposent d'un rfrentiel

important constitu de nombreux guides et normes internationaux. Cependant, dans
la pratique, l'application de ces textes s'avre dlicate car, s'adressant toutes les
catgories de laboratoires d'talonnage et d'essais, ils restent trs gnralistes et
supposent, de la part du lecteur, des connaissances approfondies des rgles
mathmatiques sappliquant au traitement statistique des donnes.
Le prsent guide a t rdig partir de ce rfrentiel international en prenant en

compte les particularits propres aux laboratoires dnologie pratiquant, en
routine, des analyses sur des sries dchantillons de vin ou de mot. Le champ
dapplication tant ainsi dlimit, un choix adapt et pertinent a pu tre fait afin de
ne conserver que les outils les plus adapts celui-ci. Le guide, issu du rfrentiel
international, reste donc strictement en conformit avec celui-ci. Le lecteur aura
cependant toute possibilit, dapprofondir tel ou tel point du guide en se rfrant
aux normes et guides internationaux dont les rfrences sont donnes dans chaque
chapitre.
Les rdacteurs ont choisi de regrouper les diffrents outils permettant de rpondre
aux exigences de la norme ISO 17025 car il existe une vidente solution de
continuit dans leur application et les donnes obtenues par les uns, peuvent
souvent tre utilises pour les autres. En outre les moyens mathmatiques mis en
uvre sont souvent proches.
Les diffrents chapitres incluent des exemples dapplications, pris dans des
laboratoires dnologie utilisant ces outils.
Il est important de prciser que ce guide na pas la prtention dtre exhaustif. Il

vise seulement prsenter, de faon aussi claire et applicable que possible, le
contenu des exigences de la norme ISO 17025 et des moyens de base pouvant tre
mis en uvre dans un laboratoire de routine pour y rpondre. Chaque laboratoire
reste parfaitement libre de complter ces outils ou de les remplacer par dautres
quil jugerait plus performants ou plus adapts.
Enfin, il convient dattirer lattention des utilisateurs sur le fait que les outils
prsents ne constituent pas une fin en soi et que leur utilisation, de mme que
linterprtation des rsultats auxquels ils conduisent doivent toujours faire lobjet
dune approche critique. Ce nest que dans ces conditions que leur pertinence sera
assure et que le laboratoire pourra les utiliser comme outils de progrs de la
qualit des analyses quil ralise.
3. Vocabulaire gnral
Les dfinitions indiques ci-dessous sont lusage de ce document et sont issues

des rfrences normatives donnes en bibliographie.
Analyte
Objet de la mthode d'analyse
Blanc
Essai ralis en l'absence de matrice (blanc ractif) ou sur une matrice qui ne
contient pas l'analyte (blanc matrice).
Biais
Diffrence entre lesprance de rsultats dessai et une valeur accepte comme
rfrence.
Budget dincertitude
Liste des sources dincertitude et de leurs incertitudes types associes, tablie en
vue dvaluer lincertitude type compose associe un rsultat de mesure.
Calibrage (dun instrument de mesure) (Gauging en anglais)

Positionnement matriel de chaque repre (ventuellement de certains repres
principaux seulement) dun instrument de mesure en fonction de la valeur
correspondante du mesurande.
NOTE Ne pas confondre calibrage et talonnage
Condition de rptabilit
Conditions o les rsultats d'essai indpendants sont obtenus par la mme mthode
sur des individus d'essai identiques dans le mme laboratoire, par le mme
oprateur, utilisant le mme quipement et pendant un court intervalle de temps.
Condition de reproductibilit (intralaboratoire)

Conditions o les rsultats d'essai sont obtenus par la mme mthode sur des
individus d'essais identiques, dans le mme laboratoire, avec le mme ou diffrents
oprateurs et utilisant des calibrages diffrents, des jours diffrents.
Ecart type exprimental

Pour une srie de n mesurages du mme mesurande, grandeur s caractrisant la
dispersion des rsultats, donne par la formule :
n
(xi x )
2
s= i =1
n1
xi tant le rsultat du ime mesurage et x la moyenne arithmtique des n rsultats

considrs.
Ecart-type de rptabilit
Ecart-type de nombreuses rptitions obtenues dans un seul laboratoire par un
mme oprateur sur un mme instrument, c'est--dire dans des conditions de
rptabilit.
Ecart-type de reproductibilit interne (ou variabilit intralaboratoire totale)

Ecart-type de rptitions obtenues dans un seul laboratoire avec la mme mthode,
en faisant intervenir plusieurs oprateurs ou instruments et, en particulier, en
effectuant les mesures des dates diffrentes, c'est--dire, dans des conditions de
reproductibilit.
Erreur alatoire
Rsultat dun mesurage moins la moyenne dun nombre infini de mesurages du
mme mesurande, effectus dans les conditions de rptabilit.
Erreur de mesure
Rsultat dun mesurage moins une valeur vraie du mesurande.
Erreur systmatique
moyenne qui rsulterait dun nombre infini de mesurages du mme mesurande,
effectus dans des condition de rptabilits, moins une valeur vraie du mesurande.
NOTE La notion derreur est une notion toute thorique dans la mesure o elle fait appel des
grandeurs qui ne sont pas accessibles dans la pratique, notamment les valeurs vraies des
mesurandes. Par principe lerreur est inconnue
Esprance mathmatique
Pour une srie de n mesurages du mme mesurande, si n tend vers linfini, la
moyenne x tend vers lesprance E(x).
n
x i
E(x)=n
lim
i =1
n
Etalonnage (Calibration en anglais)

Ensemble des oprations tablissant dans des conditions spcifies, la relation entre
les valeurs de la grandeur indique par un appareil de mesure ou un systme de
mesure, ou les valeurs reprsentes par une mesure matrialise, ou par un
matriau de rfrence, et les valeurs correspondantes de la grandeur ralises par
des talons.
Evaluation intralaboratoire d'une mthode d'analyse

Action de soumettre une mthode d'analyse une tude statistique intralaboratoire,
fonde sur un protocole normalis et/ou reconnu, et apportant la preuve que dans
son domaine d'application, la mthode d'analyse satisfait des critres de
performance prtablis.
Dans le cadre du prsent document, lvaluation d'une mthode s'appuie sur une
tude intralaboratoire qui comprend la comparaison une mthode de rfrence.
Fidlit
Etroitesse d'accord entre des rsultats d'essai indpendants obtenus sous des
conditions stipules
NOTE 1 La fidlit dpend uniquement de la distribution des erreurs alatoires et n'a aucune relation
avec la valeur vraie ou spcifie.
NOTE 2 La mesure de fidlit est exprime partir de l'cart type des rsultats d'essais.
NOTE 3 Le terme "rsultats d'essai indpendants" signifie des rsultats obtenus d'une faon non
influence par un rsultat prcdent sur le mme matriau d'essai ou similaire. Les mesures
quantitatives de la fidlit dpendent de faon critique des conditions stipules. Les conditions de
rptabilit et de reproductibilit sont des ensembles particuliers de conditions extrmes.
Grandeur (mesurable)
Attribut dun phnomne, dun corps ou dune substance, qui est susceptible dtre
distingu qualitativement et dtermin quantitativement.
Incertitude de mesure
Paramtre associ au rsultat dun mesurage, qui caractrise la dispersion des
valeurs qui pourraient raisonnablement tre attribues au mesurande.
Incertitude type (u(xi))

Incertitude du rsultat dun mesurage exprime sous la forme dun cart type.
Justesse
Etroitesse de l'accord entre la valeur moyenne obtenue partir d'une large srie de
rsultats d'essais et une valeur de rfrence accepte.
NOTE La mesure de la justesse est gnralement exprime en termes de biais.
Limite de dtection
Plus petite quantit d'un analyte examiner dans un matriau dessai, pouvant tre
dtecte et considre comme diffrente de la valeur du blanc (avec une probabilit
donne), mais non ncessairement quantifie. En fait, il faut prendre en compte
deux risques :
le risque de considrer la substance prsente dans le matriau dessai alors que sa

grandeur est nulle ;
le risque de considrer absente une substance alors que sa grandeur n'est pas
nulle.
Limite de quantification
Plus petite grandeur d'un analyte examiner dans un matriau dessai pouvant tre
dtermine quantitativement dans des conditions exprimentales dcrites dans la
mthode avec une variabilit dfinie (coefficient de variation dtermin).
Linarit
Capacit d'une mthode d'analyse, l'intrieur d'un certain intervalle, fournir une
valeur dinformation ou des rsultats proportionnels la quantit en analyte doser
dans le matriau dessai pour laboratoire.
Cette proportionnalit s'exprime au travers d'une expression mathmatique dfinie
priori.
Les limites de linarit sont les limites exprimentales de grandeurs entre
lesquelles un modle d'talonnage linaire peut tre appliqu avec un niveau de
confiance connu (gnralement pris gal 1 %).
Matriau dessai
Matriau ou substance sur lequel peut tre appliqu un mesurage avec la mthode
danalyse considre.
Matriau de rfrence
Matriau ou substance dont une ou plusieurs valeurs de la (des) proprit(s) est
(sont) suffisamment homogne(s) et bien dfinie(s) pour permettre de lutiliser
pour ltalonnage de lappareil, lvaluation dune mthode de mesurage, ou
lattribution de valeurs aux matriaux.
Matriau de rfrence certifi

Matriau de rfrence, accompagn dun certificat, dont une (ou plusieurs)
valeur(s) de la (des) proprit(s) a une ralisation exacte de lunit dans laquelle les
valeurs de proprit sont exprims et pour laquelle chaque valeur certifie est
accompagne dune incertitude un niveau de confiance indiqu.
Matrice
Ensemble des constituants du matriau dessai autres que l'analyte.
Mthode d'analyse
Procdure crite dcrivant l'ensemble des moyens et modes opratoires ncessaires
pour effectuer l'analyse de l'analyte, c'est--dire : domaine d'application, principe
et/ou ractions, dfinitions, ractifs, appareillage, modes opratoires, expression
des rsultats, fidlit , rapport d'essai.
AVERTISSEMENT Les expressions "mthode de dosage" et "mthode de

dtermination" sont parfois employes comme synonymes de l'expression
"mthode d'analyse". Ces deux expressions ne doivent pas tre employes dans ce
sens.
Mthode d'analyse quantitative

Mthode d'analyse permettant de mesurer la quantit d'analyte prsente dans le
matriau dessai pour laboratoire.
Mthode d'analyse de rfrence (mthode de type I ou de type II)

Mthode qui donne la valeur de rfrence accepte de la grandeur de lanalyte
mesurer.
Mthode danalyse alternative (non classifie)

Mthode d'analyse de routine utilise par le laboratoire et non considre comme
mthode de rfrence.
NOTE Une mthode d'analyse alternative peut consister en une simplification de la mthode de
rfrence.
Mesurage
Ensemble doprations ayant pour but de dterminer une valeur dune grandeur.
NOTE Le droulement des oprations peut tre automatique.
Mesurande
Grandeur particulire soumise au mesurage.
Moyenne
Pour une srie de n mesurages du mme mesurande, valeur moyenne, donne par
la formule :
n
x i
x= i =1
n
xi tant le rsultat du ime mesurage.
Rsultat dun mesurage

Valeur attribue un mesurande, obtenue par mesurage
Sensibilit
Rapport de la variation de la valeur dinformation de la mthode d'analyse la
variation de la grandeur en analyte.
La variation de la grandeur en analyte est gnralement obtenue en prparant
diffrentes solutions talons, ou en effectuant des ajouts de l'analyte dans une
matrice.
NOTE 1 Il convient d'viter de dfinir, par extension, la sensibilit d'une mthode comme sa capacit
dtecter de faibles grandeurs.
NOTE 2 Une mthode est dite sensible si une faible variation de la grandeur ou de la quantit
d'analyte entrane une variation importante de la valeur dinformation.
Signal de mesure
Grandeur qui reprsente le mesurande, et qui lui est fonctionnellement li.
Spcificit
Proprit d'une mthode d'analyse de convenir exclusivement la dtermination de
la grandeur de l'analyte considr, avec la garantie que le signal mesur provient
seulement de l'analyte.
Tolrance
Ecart par rapport la valeur de rfrence, dfini par la laboratoire pour un niveau
donn, dans lequel une valeur mesure dun matriau de rfrence sera accepte.
Valeur dune grandeur

Expression quantitative dune grandeur particulire, gnralement sous la forme
dune unit de mesure multiplie par un nombre.
Valeur vraie dune grandeur

Valeur compatible avec la dfinition dune grandeur particulire donne.
NOTE 1 Cest une valeur quon obtiendrait par un mesurage parfait

NOTE 2 Toute valeur vraie est par nature indtermine
Valeur de rfrence accepte

Valeur qui sert de rfrence, agre pour une comparaison, et qui rsulte :
a) d'une valeur thorique ou tablie, fonde sur des principes scientifiques ;

b) d'une valeur assigne ou certifie, fonde sur les travaux exprimentaux
d'une organisation nationale ou internationale ;
c) d'une valeur de consensus ou certifie, fonde sur un travail exprimental
en collaboration et plac sous les auspices d'un groupe scientifique ou technique ;
Dans le cadre particulier du prsent document, la valeur de rfrence accepte (ou
valeur conventionnellement vraie) du matriau dessai est fournie par la moyenne
arithmtique des valeurs de mesures rptes selon la mthode de rfrence.
Variance
Carr de lcart type.
4. Principes gnraux
4.1. Mthodologie
Lors de la mise en place dune nouvelle mthode usuelle, le laboratoire met en

uvre un protocole qui comprend plusieurs tapes. La premire tape, applique
une seule fois de faon initiale, ou de faon priodique, est la validation de la
mthode. Celle-ci est suivie dun contrle qualit permanent. Lensemble des
donnes acquises lors de ces deux tapes permettent dvaluer la qualit de la
mthode. Les donnes acquises lors de ces deux tapes sont utilises pour
lestimation de lincertitude de mesure. Celle-ci, value rgulirement,
constitue un indicateur de la qualit des rsultats obtenus par la mthode
concerne.
Dveloppement ou adoption dune

mthode
Etape de validation initiale
Estimation de lincertitude
Mise en uvre et application du

systme de contrle qualit
Toutes ces tapes sont lies et constituent une dmarche globale qui permet
dvaluer et de contrler les erreurs de mesure.
4.2. Dfinition de lerreur de mesure
Tout mesurage ralis laide de la mthode tudie donne un rsultat. Celui-ci est
invitablement associ une erreur de mesure, dfinie comme la diffrence entre le
rsultat obtenu et la valeur vraie du mesurande. Dans la pratique, la valeur vraie
du mesurande est inaccessible, et on est amen utiliser une valeur
conventionnellement accepte comme telle.
Lerreur de mesure comprend deux composantes :
Erreur de mesure
Valeur vraie = Rsultat de lanalyse + Erreur systmatique + Erreur alatoire
Lerreur systmatique se traduit en pratique par un biais par rapport la valeur

vraie, lerreur alatoire est lensemble des erreurs qui accompagnent lapplication
de la mthode.
La reprsentation de ces erreurs peut se faire graphiquement de la faon suivante :
Dispersion gaussienne des

rsultats
fidlit
Erreur
Erreur systmatique Erreur alatoire
Valeur vraie Moyenne dun Rsultat dune analyse

nombre infini de
rsultats
Les outils de validation et de contrle qualit permettent dvaluer les erreurs

systmatiques et les erreurs alatoires, et de surveiller leurs volutions dans le
temps.
5. Validation dune mthode
5.1. Mthodologie
La mise en uvre de la validation passe par 3 tapes, dans lesquelles figurent des
objectifs. Pour remplir ces objectifs, le laboratoire dispose doutils de validation.
Ces outils sont parfois multiples pour un objectif donn, et sont adapts
diffrentes situations. Il incombe au laboratoire de faire le choix pertinent des
outils, les plus adapts la mthode valider.
Etapes Objectifs Outils de validation
Champs
dapplication
-Dfinir les matrices analysables
-Dfinir la gamme analysable Limite de dtection et de
quantification
Etude de robustesse
Erreur
systmatique
ou biais -Rponse linaire dans lchelle de Etude de linarit
valeurs analysables
-Spcificit de la mthode Etude de spcificit
-Justesse de la mthode Comparaison une mthode
de rfrence
Comparaison des
matriaux de rfrence
Comparaison interlaboratoire
Erreur
alatoire
-Fidlit de la mthode Etude de rptabilit
Etude de reproductibilit
intralaboratoire
5.2. Premire tape : champs dapplication de la mthode
5.2.1. Dfinition des matrices analysables
La matrice est lensemble des constituants du matriau dessai autres que l'analyte.
Dans le cas o ces constituants peuvent avoir une influence sur le rsultat dun
mesurage, il convient que le laboratoire dfinisse les matrices sur lesquelles la
mthode est applicable.
Par exemple, en nologie, le dosage de certains paramtres peut tre influenc par
les diverses matrices possibles (vins, mots, vins liquoreux).
En cas de doute sur un effet matrice, des tudes plus approfondies pourront tre
ralises dans le cadre de ltude de spcificit.
5.2.2. Limite de dtection et de quantification
Cette tape nest videmment pas applicable, et pas ncessaire pour les mthodes
dont la limite basse ne tend pas vers 0, par exemple le titre alcoomtrique
volumique dans les vins, lacidit totale dans les vins, le pH
5.2.2.1. Dfinition normative
La limite de dtection est la plus petite quantit du compos doser pouvant tre
dtecte mais non ncessairement quantifie comme exacte. La limite de dtection
est un paramtre des essais limites.
La limite de quantification est la plus petite quantit du compos pouvant tre dos
par la mthode.
5.2.2.2. Documentation de rfrence
Norme NF V03-110, procdure de validation intralaboratoire dune mthode

alternative par rapport une mthode de rfrence.
Recueil international des mthodes danalyse OIV, Estimation de la limite de
dtection et de quantification dune mthode danalyse (Rsolution oeno 7/2000).
5.2.2.3. Application
Le plus souvent dans la pratique, la limite de quantification est plus pertinente que
la limite de dtection, cette dernire tant par convention 1/3 de la premire.
Il existe plusieurs approches permettant destimer les limites de dtection et de

quantification :
- Dtermination sur blanc

- Approche par ltude de linarit
- Approche graphique
Ces mthodes sadaptent diverses situations, mais il sagit dans tous les cas
dapproches mathmatiques donnant des rsultats nayant quune valeur
informative. Il apparat important, lorsque cela est possible, dintroduire une
vrification de la valeur obtenue, par lune de ces approches, ou estime
empiriquement, en utilisant le protocole de vrification dune limite de
quantification prdtermine.
5.2.2.4. Mode opratoires
5.2.2.4.1. Dtermination sur blanc
5.2.2.4.1.1. Champs dapplication
Cette mthode peut sappliquer quand lanalyse de blancs donne des rsultats
prsentant un cart type non nul. Loprateur pourra juger de lopportunit
dutiliser des blancs ractifs, ou des blancs matrice.
Si le blanc, pour des raisons lies un prtraitement non matris du signal, est
parfois non mesurable ou n'offre pas de variation enregistrable (cart type de 0),
la dmarche peut tre effectue sur une trs faible concentration en analyte,
proche du blanc.
5.2.2.4.1.2. Protocole de base et calculs
Procder lanalyse de n matriaux dessai assimils des blancs, n tant

suprieur ou gal 10.
- Calculer la moyenne des rsultats xi obtenus :
n
x i
xblanc = i =1
n
- Calculer lcart type des rsultats xi obtenus :
n
(xi xblanc)
2
Sblanc = i =1
n1
- A partir de ces rsultats on dfinit conventionnellement la limite de dtection par

la formule :
Ld = xblanc +(3.Sblanc)
- A partir de ces rsultats on dfinit conventionnellement la limite de quantification

par la formule :
Lq = xblanc +(10.Sblanc)
Exemple : Le tableau ci-dessous donne quelques rsultats obtenus lors de la

dtermination de la limite de dtection pour le dosage usuel du Dioxyde de soufre
libre.
N du matriau X
dessai (en mg/l)
1 0
2 1
3 0
4 1.5
5 0
6 1
7 0.5
8 0
9 0
10 0.5
11 0
12 0
Les valeurs calcules sont les suivantes :
q = 12
Mblanc = 0,375
Sblanc = 0,528 mg/l
LD = 1.96 mg/l
LQ = 5.65 mg/l
5.2.2.4.2. Approche par ltude de linarit
Cette mthode peut sappliquer dans tous les cas, et obligatoirement quand la
mthode danalyse ne prsente pas de bruit de fond. Elle utilise les donnes
calcules lors de ltude de linarit.
NOTE Cette approche statistique peut tre biaise et donner des rsultats pessimistes lorsque la
linarit est calcule sur une chelle trs large de valeurs de matriaux de rfrence, et dont
les rsultats des mesures prsentent des carts types variables. Dans un tel cas, une tude de
linarit restreinte une chelle de valeurs basses, proche de 0 et de dispersion plus
homogne permettra une estimation plus pertinente.
Utiliser les rsultats obtenus lors de ltude de linarit qui ont permis de calculer
les paramtres de la fonction dtalonnage y = a+ b.x
Les donnes rcuprer de ltude de linarit sont (voir chapitre 5.3.1, tude de
linarit) :
- pente de la droite de rgression :

n
(x M )(y M )
i x i y
b= i =1
n
(xi M x)
2
i =1
- cart type rsiduel :

n p
(yi, j yi, j)
2
i =1 j =1
Sres =
pn2
- cart type sur lordonne lorigine ( calculer) :

2
Sa = Sres 1 + n Mx
np 2

i =1
p (xi M x)
Les estimations de la limite de dtection LD, et de la limite de quantification LQ se

calculent selon les formules suivantes :
LD = 3Sa Limite de dtection estime

b
LQ =10Sa Limite de quantification estime
b
Exemple : Estimation des limites de dtection et de quantification du dosage de
lacide sorbique par lectrophorse capillaire, partir de donnes de linarit
acquises sur une gamme de 1 20 mg.L-1.
X (ref) Y1 Y2 Y3 Y4
1 1.9 0.8 0.5 1.5
2 2.4 2 2.5 2.1
3 4 2.8 3.5 4
4 5.3 4.5 4.7 4.5
5 5.3 5.3 5.2 5.3
10 11.6 10.88 12.1 10.5
15 16 15.2 15.5 16.1
20 19.7 20.4 19.5 20.1
Nombre de matriaux de rfrence

n=8
Nombre de rpliques
p=4
Droite (y = a + b*x)
b = 0.9972
a = 0.51102
cart type rsiduel:
Sres = 0.588
Ecart type sur lordonne lorigine
Sa = 0.1597
La limite de dtection estime est LD = 0.48 mg.L-1

La limite de quantification estime est LQ = 1.6 mg.L-1
5.2.2.4.3. Approche graphique issue du bruit de fond de lenregistrement
Cette dmarche peut sappliquer pour les mthodes danalyse qui fournissent un
enregistrement graphique (chromatographie) prsentant un bruit de fond. Les
limites sont estimes partir dune tude du bruit de fond.
5.2.2.4.3.2. Protocole de base et calcul
Procder lenregistrement de blancs ractifs en procdant par 3 sries de 3

injections plusieurs jours dintervalle.
Dterminer les valeurs suivantes :
hmax plus grand cart damplitude en ordonne du signal observ entre deux points
dacquisition, hors drive, sur une distance gale vingt fois la largeur mi-
hauteur du pic correspondant la substance rechercher, centre sur le temps de

rtention du compos tudi.
R le facteur de rponse quantit / signal, exprim en hauteur.
La limite de dtection LD, et la limite de quantification LQ se calculent selon les

formules suivantes :
LD = 3 hmax R LQ = 10 hmax R
5.2.2.4.4. Vrification dune limite de quantification prdtermine
Cette approche permet de valider une valeur de quantification obtenue par

approche statistique, ou ventuellement empiriquement.
Cette mthode permet de vrifier quune limite de quantification donne a priori

est acceptable. Elle est applicable quand le laboratoire a la capacit de disposer
dau moins 10 matriaux dessai comportant des quantits danalyte connues, se
situant au niveau de la limite de quantification estime.
Dans le cas de mthodes au signal spcifique, non sensibles aux effets matrice, ces
matriaux pourront tre des solutions synthtiques dont la valeur de rfrence est
obtenue par formulation.
Dans les autres cas, il sera utilis des vins (ou des mots), dont la valeur du
mesurande, obtenue par mthode de rfrence, sera gale la limite tudier. Il va
de soit que dans ce cas, la limite de quantification de la mthode de rfrence doit
tre infrieure cette valeur.
5.2.2.4.4.2. Protocole de base et calcul
Analyser n matriaux dessai indpendants dont la valeur accepte est gale la

limite de quantification vrifier, n doit tre au moins gal 10.
- Calculer la moyenne des n mesurages :
n
x i
xLQ = i =1
n
- Calculer lcart type des n mesurages :
n
(xi xLQ)
2
SLQ = i =1
n1
avec xi rsultats du mesurage du ime matriau dessai.
Les deux conditions suivantes doivent tre respectes :
a) Sassurer que la grandeur moyenne mesure xLQ nest pas diffrente de la limite
de quantification prdtermine LQ :
Si LQ x LQ < 10 alors la limite de quantification LQ est juge valable.
S LQ
n
NOTE 10 est une valeur purement conventionnelle relative au critre de la LQ.
b) Sassurer que la limite de quantification est diffrentes de 0 :

Si 5 sLQ < LQ alors la limite de quantification est diffrente de 0.
La valeur 5 correspond une valeur approche dlargissement de lcart type en

tenant compte du risque et du risque pour sassurer que la LQ est diffrente de
0.
Cela revient vrifier que le coefficient de variation pour LQ est infrieur 20%.
NOTE1 Il est rappel que la limite de dtection est obtenue en divisant la limite de quantification par 3.
NOTE2 Il convient de vrifier que la valeur de SLQ nest pas trop grande (ce qui
produirait un test artificiellement positif), et correspond effectivement un cart
type raisonnable de la variabilit des rsultat au niveau considr. Cest au
laboratoire quil incombe de faire cette apprciation critique de la valeur de SLQ.
Exemple : Vrification de la limite de quantification du dosage de lacide malique

par mthode enzymatique.
Limite de quantification estime : 0.1 g.L-1
Vin Valeurs
1 0.1
2 0.1
3 0.09
4 0.1
5 0.09
6 0.08
7 0.08
8 0.09
9 0.09
10 0.08
Moyenne :0.090
Ecart type :0.008
Premire condition : LQ x LQ La limite de quantification

=3.87<10
S LQ
n
0.1 est juge valable.
Seconde condition : 5.S LQ =0.04<0.1 La limite de quantification
est juge significativement diffrente de 0.
5.2.3. Robustesse
5.2.3.1. Dfinition
La robustesse est la capacit, pour une mthode, de donner des rsultats proches en
prsence de faibles changements de conditions exprimentales susceptibles de se
produire dans lutilisation de la procdure.
5.2.3.1. Dtermination
Si un doute existe sur linfluence de la variation de paramtres opratoires, le

laboratoire mettra en uvre lapplication scientifique des plans dexprience qui
permettra de faire jouer ces paramtres opratoires critiques dans le champ de
variation susceptible dtre rencontr dans les conditions de la pratique. Ces tests
sont dans la pratique lourds mettre en oeuvre.
5.3. Seconde partie : tude de lerreur systmatique
5.3.1. Etude de linarit
La linarit dune mthode est sa capacit l'intrieur d'un certain intervalle,

fournir une valeur dinformation ou des rsultats proportionnels la quantit en
analyte doser dans le matriau dessai.
5.3.1.2. Documents de rfrence

Norme ISO 11095, Etalonnage linaire utilisant des matriaux de rfrence.
Norme ISO 8466-1 Qualit de leau Etalonnage et valuation des mthodes
danalyse et estimation des caractres de performance
Ltude de linarit permet de dfinir un domaine de linarit, et de le valider.
Cette tude est possible lorsque le laboratoire peut disposer de matriaux de

rfrence stables dont les valeurs acceptes ont t acquises avec certitude (en
thories ces valeurs devraient avoir une incertitude gale 0). Il pourra donc sagir
de matriaux de rfrence interne doss avec du matriel talonn, de vins ou de
mots dont la valeur est donne par la moyenne dau moins 3 rptitions de la
mthode de rfrence, de matriaux de rfrence externes, ou de matriaux de
rfrence externes certifis.
Dans ce dernier cas, et uniquement dans ce cas, cette tude permet galement le
raccordement de la mthode. Le plan dexprience men ici pourra alors tre
considr comme un talonnage.
Dans tous les cas, il convient de sassurer que la matrice du matriau de rfrence
est compatible avec la mthode.
Enfin, les calculs doivent tre mis en uvre avec le rsultat final du mesurage, et
non pas avec la valeur du signal.
Deux approches sont proposes ici :
Approche type ISO 11095 dont le principe consiste comparer lerreur rsiduelle
lerreur exprimentale grce un test de Fischer. Cette dmarche est surtout
valable pour des gammes de travail relativement troite (o le mesurande ne varie

pas plus dun facteur 10). Dautre part, dans des conditions exprimentales
gnrant une erreur de reproductibilit faible, le test deviendra excessivement
svre. A contrario, dans le cas de conditions exprimentales mdiocres, le test sera
facilement positif et perdra galement sa pertinence. Cette approche demande une
bonne homognit du nombre des mesures sur toute la gamme tudie.
Approche type ISO 8466, dont le principe consiste comparer lerreur rsiduelle
produite par la rgression linaire, lerreur rsiduelle produite par une rgression
polynomiale (dordre 2 par exemple) ralise partir des mmes donnes. Si le
modle polynomial donne une erreur rsiduelle significativement plus faible on
pourra conclure la non linarit. Cette approche est indique notamment lorsquil
existe un risque de grande dispersion exprimentale lune des deux extrmits du
domaine. Elle est donc naturellement bien adapte aux mthodes danalyse des
traces. Il nest pas utile de travailler avec une homognit du nombre de mesure
sur toute la gamme de travail, et il est mme recommand de renforcer le nombre
de mesures aux extrmits du domaine.
5.3.1.4. Approche type ISO 11095
5.3.1.4.1. Protocole de base
Il convient de mettre en uvre un nombre n de matriaux de rfrence. Ce nombre

sera suprieur 3, il nest cependant pas ncessaire daller au-del de 10. Les
matriaux de rfrence seront mesurs p fois, dans des conditions de
reproductibilit, p sera suprieur 3, un nombre de 5 tant gnralement
conseill. Les valeurs acceptes de matriaux de rfrence devront tre rparti de
faon rgulire sur lchelle de valeurs tudie. Le nombre de mesure doit tre le
mme pour tous les matriaux de rfrence.
NOTE Il est important que les conditions de reproductibilit fassent intervenir le maximum de sources
potentielles de variabilit, au risque que le test conclue la non-linarit de faon excessive.
Les rsultats sont consigns dans un tableau de la forme suivante :
Matriaux Valeur accepte Valeurs mesures

de rfrence du matriau de
rfrence Rplique 1 Rplique j Rplique p
1 x1 y11 y1j y1p
i xi yi1 yij yip
n xn yn1 ynj ynp
5.3.1.4.2. Calculs et rsultats
5.3.1.4.2.1. Dfinition du modle de rgression
Le modle calculer et tester est le suivant :
yij = a + b.xi + ij
o
yij est la jime rplique du iime matriau de rfrence.

xi est la valeur accepte du iime matriau de rfrence.
b est la pente de la droite de rgression.
a est lordonne lorigine de la droite de rgression.
a+b.xi reprsente lesprance de la valeur du mesurage du iime matriau

de rfrence.
ij est lcart entre yij et lesprance de la valeur du mesurage du iime

matriau de rfrence.
5.3.1.4.2.2. Estimation des paramtres
Les paramtres de la droite de rgression sont obtenus partir des formules

suivantes :
p
1
- moyenne des p mesurages du i me
matriau de rfrence yi =
p yij
j =1
- moyenne de toutes les valeurs acceptes des n matriaux de rfrence

n
1
Mx =
n xi
i =1
n
1
- moyenne de tous les mesurages My =
n yi
i =1
n
( xi M x )( yi M y )
i =1
- estimation pente b b=
n
( xi M x )
2
i =1
- estimation ordonne lorigine a a = M y b M x
- valeur de rgression associe au ime matriau de rfrence yi yi = a + b xi
- rsidu eij eij = yij y i
5.3.1.4.2.3. Reprsentations graphiques
Les rsultats peuvent tre prsents et analyss sous forme graphique. Deux types
de reprsentations graphiques sont utiliss.
-Le premier type de graphique est la reprsentation des valeurs mesures en

fonction des valeurs acceptes de matriaux de rfrence. Il est galement port la
droite de recouvrement calcule.
Droite de recouvrement
10,00
8,00
y=x
Valeurs mesures
yi^(rgression)
6,00 replique 1
replique2
replique3
4,00
replique4
2,00
0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
Valeurs acceptes des matriaux de rfrence
- Le second graphique ralis est la reprsentation des valeurs rsiduelles en

fonction des valeurs estimes des matriaux de rfrence ( y ) par la droite de
recouvrement.
Ce graphique est un bon indicateur de lcart par rapport lhypothse de linarit :
le domaine de linarit est valide si les valeurs rsiduelles sont quitablement
rparties entre les valeurs positives et les valeurs ngatives.
Valeurs rsiduelles par rapport aux valeurs ajustes:

cas d'une mthode linaire
0,2
0,15
0,1
Valeurs rsiduelles
0,05
replique 1
replique2
0
replique3
0 2 4 6 8 10 12
replique4
-0,05
-0,1
-0,15
-0,2
Valeurs ajustes y^
V a le urs r s idue lle s pa r ra ppo rt a ux v a le urs a jus t e s :

c a s d' une m t ho de no n lin a ire
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2 replique 1
replique2
0,1
replique3
0 replique4
0 2 4 6 8 10 12
- 0,1
-0,2
-0,3
-0,4
V aleur s ajust es y^
En cas de doute sur la linarit de la rgression, un test de Fischer-Snedecor peut

tre appliqu pour tester lhypothse : Le domaine de linarit nest pas valide ,
en plus de lanalyse graphique.
5.3.1.4.2.4. Test de lhypothse de linarit
Il convient dabord de dfinir plusieurs valeurs derreurs lies ltalonnage, que

lon pourra estimer partir des donnes acquises au cours de lexprience. A partir
de ces rsultats il est mis alors en uvre un test statistique permettant de tester
lhypothse de non validit du domaine de linarit : il sagit du test de Fischer-
Snedecor.
5.3.1.4.2.4.1. Dfinitions des erreurs lies ltalonnage
Ces erreurs sont donnes sous la forme dun cart type, constitu de la racine
carre dun rapport entre une somme de carre et un degr de libert.
Erreur rsiduelle
Lerreur rsiduelle correspond lerreur entre les valeurs mesures et la valeur

donne par la droite de rgression.
La somme des carrs de lerreur rsiduelle est la suivante :

n p 2
Qres = ( yij y i )
i =1 j =1
Le nombre de degrs de libert est np-2.
Lcart type rsiduel est alors estim par la formule :
n p 2
( yij y i )
i =1 j =1
S res =
np 2
Erreur exprimentale
Lerreur exprimentale correspond lcart type de reproductibilit de

lexprimentation.
La somme des carrs de lerreur exprimentale est la suivante :
n p
( yij yi )
2
Qexp =
i =1 j =1
Le nombre de degrs de libert est np-n.
Lcart type exprimental (reproductibilit) est alors estim par la formule :
n p
( yij yi )
2
i =1 j =1
Sexp =
np n
NOTE Cette grandeur est parfois note galement SR.
Dfaut dajustement
Lerreur du dfaut dajustement est lerreur rsiduelle retranche de lerreur

exprimentale.
La somme des carrs du dfaut dajustement est :
Qdef =Qres Qexp
ou encore
n p n p
( y ij y i ) ( yij yi )
2 2
Qdef =
i =1 j =1 i =1 j =1
Le nombre de degrs de libert est n-2
Lcart type du dfaut dajustement est estim par la formule :
Qres Qexp
S def =
n2
ou encore
n p 2 n p
( yij y i ) ( yij yi )
2
i =1 j =1 i =1 j =1
S def =
n2
5.3.1.4.2.4.2. Test de Fischer-Snedecor
Le rapport
S def suit la loi de Fischer-Snedecor avec les degrs de libert
Fobs = 2
S exp
n-2, np-n.
La valeur exprimentale calcule Fobs est compare la valeur limite : F1-(n-2,np-

n), tire de la table de la loi de Snedecor. La valeur de gnralement utilise en
pratique est de 5%.
Si Fobs F1- lhypothse de non validit du domaine de linarit est accepte (avec
un risque derreur de 5%).
Si Fobs < F1- lhypothse de non validit du domaine de linarit est refuse
Exemple : Etude de linarit du dosage de lacide tartrique par lectrophorse

capillaire. 9 matriaux de rfrence sont utiliss, il sagit de solutions synthtiques
dacide tartrique, titres partir dune balance raccorde des masses talon.
Matriau
Ti (ref) Y1 Y2 Y3 Y4
ref.
1 0.38 0.41 0.37 0.4 0.41
2 1.15 1.15 1.12 1.16 1.17
3 1.72 1.72 1.63 1.76 1.71
4 2.41 2.45 2.37 2.45 2.45
5 2.91 2.95 2.83 2.99 2.95
6 3.91 4.09 3.86 4.04 4.04
7 5.91 6.07 5.95 6.04 6.04
8 7.91 8.12 8.01 8.05 7.9
9 9.91 10.2 10 10.09 9.87
Droite de rgression
Droite (y = a + b*x)
b = 1.01565
a = - 0.00798
Erreurs lies ltalonnage

Ecart type rsiduel Sres= 0.07161
Ecart type reproductibilit exprimentale Sexp = 0.07536
Ecart type du dfaut d'ajustement Sdef = 0.0548
Interprtation, test de Fischer-Snedecor

Fobs = 0.53 < F1- = 2.37
Lhypothse de non validit du domaine de linarit est refuse
5.3.1.5. Approche ISO 8466
5.3.1.5.1.Protocole de base

matriaux de rfrence seront mesurs plusieurs fois, dans des conditions de
reproductibilit, ce nombre de mesures peut tre faible au centre du domaine de
ltude (minimum = 2) et doit tre plus lev aux extrmits du domaine o un
nombre de 4 minimum est gnralement conseill. Les valeurs acceptes de

matriaux de rfrence devront tre rparties de faon rgulire sur lchelle de
valeurs tudie.
NOTE Il est important que les conditions de reproductibilit fassent intervenir le maximum de
sources potentielles de variabilit.
Matriaux Valeur accepte du Valeurs mesures

de matriau de Rpliqu Rpliqu Rplique j Rplique p
rfrence rfrence e1 e2
1 x1 y11 y12 y1j y1p

i xi yi1 yi2

n xn yn1 ynj ynp
5.3.1.5.2.Calculs et rsultats
5.3.1.5.2.1. Dfinition du modle de rgression linaire
Calculer le modle de rgression linaire selon les calculs prcdemment dtaills.
Il sera ensuite calcul lcart type derreur rsiduelle du modle linaire Sres, selon
les calculs indiqus au 5.3.1.4.2.4.1
5.3.1.5.2.2. Dfinition du modle de rgression polynomial
Est ici donn le calcul du modle polynomial dordre 2
Il convient de dterminer les paramtres du modle de rgression polynomial

dordre 2 applicable aux donnes du plan dexprience.
y=a x
2
x
+b +c
Il sagit de dterminer les paramtres a, b, et c. Cette dtermination est

gnralement automatisable dans les tableurs et logiciels de statistiques.
Les formules destimation de ces paramtres sont les suivantes :
2

3 2 2
xi y xi xi
N
xi N xi yi xi yi + xi xi yi xi yi xi
2 2
i
i
i
i

i i i i i i i i i
a=
2 2

3
x xi xi xi N xi xi x xi xi xi x i2
4 2 3 2 + 2 3
N
i i
i i
i

i i i i i i

i
i

4 2 2
xi N xi yi xi yi xi yi N xi xi xi + xi yi xi xi yi xi
2 3 2 3
b= i i i i i i i i i i i i i
2 2
2 3

3
x xi xi xi N xi xi xi + x xi xi x i2
4 3 2 2
N
i i
i i
i

i i i i i i i
i

4 3
xi xi yi xi xi y xi xi yi xi xi y xi y xi xi xi2
2 3 2 + 2 3
i i i
i i i i i i i i i i i i i
i

c=
2 2
3
3
xi N xi xi xi N xi xi xi + xi xi xi xi2
4 2 3 2 2
i i
i i i i i i i

i
i
Une fois le modle tabli on calculera les valeurs suivantes :
- valeur de rgression associe au ime matriau de rfrence

y i
y i = a x
2
+b +c x
- rsidu eij
eij = yij yi
Lcart type rsiduel du modle polynomial

n p
( y ij y i )
2
i =1j =1
S res = np 2
5.3.1.5.2.3. Comparaison des carts types rsiduels
On calcule
S res ( N 3) S res
2 2 2
DS = ( N 2)
Puis
2
PG = DS
S res
2
La valeur PG est compare la valeur limite F1- donne par la table de Fischer-
Snedecor pour un niveau de confiance 1- et pour degr de libert 1 et (N-3).
NOTE En gnral le risque utilis est 5%. Le test dans certains cas peut tre
optimiste et un risque de 10 % pourra savrer plus raliste.
Si PG F1- : la fonction dtalonnage non linaire ne donne pas un ajustement

amlior ; par exemple, la fonction dtalonnage est linaire.
Si PG > F1- : ltendue de travail doit tre rduite le plus possible pour obtenir une
fonction dtalonnage linaire : sinon, les valeurs dinformation provenant des
chantillons analyss doivent tre valus en utilisant une fonction dtalonnage
non linaire.
Exemple : Cas thorique.
Ti
Y1 Y2 Y3 Y4
(ref)
1 35 22,6 19,6 21,6 18,4
2 62 49,6 49,8 53
3 90 105,2 103,5
4 130 149 149,8
5 205 203,1 202,5 197,3
6 330 297,5 298,6 307,1 294,2
Modle linaire et modle polynomial, mthode : Cas thorique
350
300
250
Moyenne valeurs mesures
200 y=x
yi^(reg lin)
yi'^(reg poly)
150 yi (moyenne)
100
50
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Valeurs acceptes des matriaux de rfrence
Rgression linaire
y = 1.48.x 0.0015
Sres = 13.625
Rgression polynomiale
y= - 0,0015x + 1,485x - 27,2701
S'res=7,407
Test de Fischer
PG=10,534 > F(5%)=10,128
PG>F la fonction d'talonnage linaire ne peut tre retenue
5.3.2. Spcificit
La spcificit dune mthode est sa capacit ne mesurer que le compos

recherch.
Sil existe un doute sur la spcificit de la mthode teste, le laboratoire pourra

mettre en uvre des plans dexprience visant vrifier la spcificit. Sont ici
proposs deux types dexpriences complmentaires qui pourront rpondre un
grand nombre de cas rencontrs en oenologie.
-Le premier test est le test des ajouts doss. Il permet de vrifier que la
mthode mesure lintgralit de lanalyte.
-Le second test permet de vrifier linfluence dautres composs sur le
rsultat du mesurage.
5.3.2.3. Modes opratoires
5.3.2.3.1. Test des ajouts doss
5.3.2.3.1.1. Champ dapplication
Ce test permet de vrifier que la mthode mesure lintgralit de lanalyte.

Le plan dexprience se base sur des ajouts doss du compos recherch. Il ne peut
sappliquer que sur les mthodes ntant pas sensibles aux effets matrices.
5.3.2.3.1.2. Protocole de base
Il sagit de retrouver de faon significative les grandeurs ajoutes sur des matriaux
dessai analyss avant et aprs les ajouts.
Effectuer des ajouts doss variables sur n matriaux dessai. La concentration

initiale en analyte des matriaux dessai, et les ajouts doss sont choisis de faon
couvrir le domaine d'application de la mthode. Ces matriaux dessais doivent tre
constitus des types de matrices appeles tre analyses en routine. Il est
conseill dutiliser au minimum 10 matriaux dessai.
Matriau Grandeur Grandeur Grandeur Grandeur

dessai avant ajout ajoute aprs ajout retrouve
(x) (v) (w) (r)
1 x1 v1 w1 r1 = w1 x1
... ... ... ... ...
i xi vi wi ri = wi xi
... ... ... ... ...
n Xn Vn wn rp = wn xn
NOTE 1 Un ajout est ralis avec une solution talon pure. Il est conseill
de choisir cet ajout du mme ordre que la grandeur du matriau dessai sur lequel il
est effectu. C'est pourquoi les matriaux dessai les plus concentrs doivent tre
dilus pour rester dans le domaine d'application de la mthode.
NOTE 2 Il est conseill de prparer les ajouts partir de solutions talons
indpendantes, de faon viter toute erreur systmatique.
NOTE 3 La qualit des valeurs x et w peuvent tre amliores en utilisant
plusieurs rptitions.
5.3.2.3.1.3. Calculs et rsultats
Le principe de la mesure de la spcificit consiste tudier la droite de rgression r

= a + b.v et vrifier que la pente b est quivalente 1 et que lordonne lorigine
a est quivalente 0.
Etude de la droite de rgression r = a + b.v

suivantes :
n
vi
i =1
- moyenne des grandeurs ajoutes v v=
n
n
ri
i =1
- moyenne des grandeurs retrouves r r=
n
n
(vi v)(ri r )
i =1
n 2
(vi v)
i =1
- estimation ordonne lorigine a a = r b.v
- valeur de rgression associe au ime matriau de rfrence yi

ri = a + b vi
n
(ri ri )2
i =1
- cart type rsiduel S res =
n2

1
S b = S res
- cart type sur la pente n

2
(v i v )

i =1

1 v
2
- cart type sur lordonne lorigine S a = S res +
n n

2
(v i v )

i =1
5.3.2.3.1.3.2. Exploitation des rsultats
Il sagit de conclure l'absence d'interfrences et une spcificit acceptable. Ceci

est vrai si la droite de recouvrement r = a + bv est quivalente la droite y=x.
Pour cela, deux tests sont raliss :
-Test de lhypothse de la pente b de la droite de recouvrement quivalente 1.
-Test de lhypothse de lordonne lorigine a quivalente 0.
Ces hypothses sont testes laide dun test de Student associ au risque derreur
de 1% en gnral. Un risque de 5 % peut dans certains cas se rvler plus raliste.
Soit Tcritique, bilatrale[ ddl ; 1%] correspondant une variable bilatrale de Student
associ au risque derreur de 1% pour un nombre ddl de degrs de libert.
Etape 1 : calculs
b1
Calcul du critre de comparaison sur la pente 1 Tobs =
Sb
a
Calcul du critre de comparaison sur lordonne lorigine 0 T'obs =
Sa
Calcul de la valeur critique de Student : Tcritique, bilatrale[ p-2 ; 1%]
Etape 2 : interprtation
Si Tobs est infrieur Tcritique alors la pente de la droite de rgression est quivalente
1
Si Tobs est infrieur Tcritique alors l'ordonne l'origine de la droite de rgression
est quivalente 0.
Si les deux conditions sont vrifies alors la droite de recouvrement est quivalent
= y=x, et la mthode est considre spcifique.
NOTE 1 partir de ces rsultats, un taux de recouvrement moyen

permettant de quantifier la spcificit pourrait tre calcul. En aucun cas, il ne peut
tre employ pour "corriger" les rsultats. En effet, si un biais significatif est mis
en vidence, la mthode alternativene peut pas tre valide par rapport un
rendement de 100%.
NOTE 2 Puisque le principe du test consiste calculer une droite, il est
important de prendre au moins trois niveaux d'ajout et de choisir correctement leur
valeur afin dobtenir un talement optimal des points.
5.3.2.3.1.3.3. Reprsentation graphique de la droite de recouvrement
Exemple de spcificit
La spcificit est accepte La spcificit n'est pas accepte
9 10
Relation estime entre la teneur ajoute et la teneur retrouve
8
Y = X 9
7 8
7
Y: Teneur retrouve
Y: Teneur retrouve
6
6
5
5
4
4
3 Y = X
Relation estime entre la 3
2
teneur ajoute et la teneur
retrouve 2
1 1
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
X : Teneur ajoute X : Teneur ajoute
5.3.2.3.2. Etude de linfluence dautres composs sur le rsultat du mesurage
5.3.2.3.2.1. Champ dapplication
Dans le cas o le laboratoire suspecte linteraction de composs autres que celui

analys, un plan dexprience pourra tre mis en place pour tester linfluence de
diffrents composs. Le plan dexprience propos ici permet la recherche de
linfluence de compos dfinis a priori : par sa connaissance du process analytique,
et son savoir faire, la laboratoire doit tre mme de dfinir un certain nombre de
composs susceptibles de se retrouver dans le vin, et pouvant influencer le rsultat
analytique.
Analyser n vins en double, avant et aprs lapport du compos suspect davoir une
influence sur le rsultat analytique, n doit tre au moins gal 10.
On calculera les valeurs moyennes Mxi des 2 mesures xi et xi effectues avant

apport et les valeurs moyennes Myi des 2 mesures yi et yi effectues aprs apport,
puis la diffrence di entres les valeurs Mxi et Myi.
Les rsultats de lexprience pourront tre consigns dans le tableau suivant :
x : Avant apport y : Aprs apport Moyennes Diffrence

Echantillons Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 x y d
1 x1 x1 y1 y1 Mx1 My1 d1=Mx1-My1

i xi xi yi yi Mxi Myi di=Mxi-Myi

n xn xn yn yn Mxn Myn dn= Mxn-Myn
n
1
La moyenne des rsultats avant apport Mx Mx =
n Mxi
i =1
n
1
La moyenne des rsultats aprs apport My My =
n Myi
i =1
n
d
Calculer la moyenne des diffrences Md Md = ni = My Mx
i =1
n
(di M d )
2
i =1
Calculer lcart type des diffrences Sd Sd =
n 1
Md
Calculer le Z-score Z score =
Sd
5.3.2.3.2.3. Interprtation
Si Zscore est infrieur ou gal 2, on peut considrer avec un risque de 5% que

linfluence du compos ajout est ngligeable sur le rsultat danalyse.
Si Zscore est suprieur 2, on peut considrer avec un risque de 5% que le compos
ajout a une influence sur le rsultat danalyse.
NOTE Linterprtation du Zscore est possible dans la mesure o il est fait

lhypothse que les carts suivent une loi normale avec 95% de confiance.
Exemple : Etude de linteraction de composs susceptibles de se trouver dans les

chantillons, sur le dosage du glucose fructose dans les vins par un calibrage
infrarouge transforme de Fourier (IRTF).
+ 250 mg.L-1 + 1 g.L-1

Avant apport sorbate de acide Diffrences
potassium salicylique
diff
vin rep1 rep2 rep1 rep2 rep1 rep2 diff sorbate
salicylique
1 6.2 6.2 6.5 6.3 5.3 5.5 0.2 -0.8
2 1.2 1.2 1.3 1.2 0.5 0.6 0.05 -0.65
3 0.5 0.6 0.5 0.5 0.2 0.3 -0.05 -0.3
4 4.3 4.2 4.1 4.3 3.8 3.9 -0.05 -0.4
5 12.5 12.6 12.5 12.7 11.5 11.4 0.05 -1.1
6 5.3 5.3 5.4 5.3 4.2 4.3 0.05 -1.05
7 2.5 2.5 2.6 2.5 1.5 1.4 0.05 -1.05
8 1.2 1.3 1.2 1.1 0.5 0.4 -0.1 -0.8
9 0.8 0.8 0.9 0.8 0.2 0.3 0.05 -0.55
10 0.6 0.6 0.5 0.6 0.1 0 -0.05 -0.55
Sorbate de potassium Md = 0.02

Sd = 0.086
Zscore = 0.23 <2
Acide salicylique Md = -0.725

Sd = 0.282
Zscore = 2.57 >2
En conclusion, on peut dire que le sorbate de potassium ninfluence

pas le dosage du glucose fructose par le calibrage IRTF tudie ici. Par
contre, lacide salicylique prsente une influence, et il conviendra de
veiller ce que les chantillons ne contiennent pas dacide salicylique,
pour rester dans le cadre de validit de le calibrage tudi.
5.3.3. Etude de la justesse de la mthode
5.3.3.1. Prsentation de ltape
5.3.3.1.1. Dfinition
Etroitesse de l'accord entre la valeur moyenne obtenue partir d'une large srie de
rsultats d'essais et une valeur de rfrence accepte
5.3.3.1.2. Principes gnraux
Lorsque la valeur de rfrence est issue dun systme certifi, ltude de justesse
pourra tre considre comme un raccordement. Il sagira notamment de deux cas
prcis :
-Raccordement des matriaux de rfrence certifis : dans ce cas, cette

tude de justesse pourra tre mene conjointement avec ltude de linarit et
dtalonnage, en utilisant le plan dexprience dcrit pour cette dernire tude.
-Raccordement une chane certifie danalyse de comparaison
interlaboratoire.
Les autres cas qui utilisent des rfrences non issues de systmes certifis, sont les
plus courants dans les laboratoires dnologie de routine. Il conviendra alors de
parler de comparaisons :
-Comparaison une mthode de rfrence
-Comparaison aux rsultats dune chane non certifie danalyse de
comparaison interlaboratoires.
-Comparaison des matriaux de rfrence internes, ou externes non
certifis
5.3.3.1.3.Documents de rfrence
Norme NF V03-110, Procdure de validation intralaboratoire dune mthode

Norme NF V03-115, Guide pour lutilisation des matriaux de rfrence.
Norme ISO 11095, Etalonnage linaire utilisant des matriaux de rfrence.
Norme ISO 8466-1, Qualit de leau Etalonnage et valuation des mthodes
danalyse et estimation des caractres de performance
Norme ISO 57025, Exactitude des rsultats et mthodes de mesure
5.3.3.2. Comparaison de la mthode alternative la mthode de rfrence OIV
5.3.3.2.1. Champs dapplication
Cette mthode sappliquera dans le cas o le laboratoire pratique la mthode de

rfrence OIV, ou ventuellement une mthode, raccorde, valide, et dont la
qualit des performances sont connues et rpondent aux besoins des clients du
laboratoire.
Pour tudier la justesse entre les deux mthodes, il convient au pralable de

sassurer de la qualit de la rptabilit de la mthode valider et la comparer la
mthode de rfrence. La mthodologie pour raliser la comparaison des

rptabilit est dcrite dans le chapitre traitant de la rptabilit.
5.3.3.2.2. Justesse de la mthode alternativepar rapport la mthode de rfrence
5.3.3.2.2.1. Dfinition
La justesse sera dfinie comme ltroitesse de laccord entre les valeurs obtenues
par la mthode de rfrence et celle obtenue par la mthode usuelle,
indpendamment des erreurs de fidlit des deux mthodes.
5.3.3.2.2.2. Domaine dapplication

La justesse de la mthode alternativepar rapport la mthode de rfrence stablit sur un
domaine dapplication o les rptabilits des deux mthodes sont constantes.
Dans la pratique, il conviendra donc souvent de diviser la gamme de valeurs analysable en

plusieurs tronons ou niveaux de gamme (2 5), dans lesquels il pourra tre
raisonnablement estim que les rptabilits des mthodes sont assimilables une
constante.
Dans chaque niveau de gamme, la justesse sera dtermine partir dune srie de n
matriaux dessai prsentant des valeurs de concentration en analyte couvrant le
niveau de gamme considr. Un nombre minimum de 10 matriaux dessai est
ncessaire pour obtenir des rsultats significatifs.
Chaque matriau dessai sera analys en double par les deux mthodes dans des
conditions de rptabilit.
On calculera les valeurs moyennes Mxi des 2 mesures xi et xi effectues par la

mthode alternativeet les valeurs moyennes Myi des 2 mesures yi et yi effectues
par la mthode de rfrence, puis la diffrence di entres les valeurs Mxi et Myi.
Les rsultats de lexprience pourront tre consigns dans le tableau suivant :
x : Mthode usuelle y : Mthode de Moyennes Diffrence

Matriau
rfrence
dessai
Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 x y d
1 x1 x1 y1 y1 Mx1 My1 d1=Mx1 - My1

i xi xi yi yi Mxi Myi di=Mxi - Myi

n xn xn yn yn Mxn Myn dn= Mxn - Myn
Les calculs suivants seront mis en uvre
n
1
- La moyenne des rsultats de la mthode alternative Mx Mx =
n Mxi
i =1
n
1
- La moyenne des rsultats de la mthode de rfrence My My =
n Myi
i =1
n
d
- Calculer la moyenne des diffrences Md Md = ni = Mx My
i =1
n
(di M d )
2
i =1
- Calculer lcart type des diffrences Sd Sd =
n 1
Md
- Calculer le Zscore Z score =
Sd
5.3.3.2.2.4. Interprtation
- Si Zscore est infrieur ou gal 2.0, on peut conclure que la justesse dune
mthode par rapport lautre est satisfaisante, dans le niveau de gamme considr,
avec un risque derreur = 5%.
- Si Zscore est suprieur 2.0, on peut conclure que la mthode nest pas juste par
rapport la mthode de rfrence, dans le niveau de gamme considr, avec un
risque derreur = 5%.

Exemple : Etude de la justesse dun calibrage IRTF pour le dosage du glucose et

fructose par rapport la mthode enzymatique. Le premier niveau de gamme
couvre lchelle de 0 5 g.L-1 et le second niveau de gamme couvre une chelle de
5 20 g.L-1.
Vin IRTF 1 IRTF2 Enz 1 Enz 2 di

1 0 0.3 0.3 0.2 -0.1
2 0.2 0.3 0.1 0.1 0.2
3 0.6 0.9 0.0 0.0 0.7
4 0.7 1 0.8 0.7 0.1
5 1.2 1.6 1.1 1.3 0.2
6 1.3 1.4 1.3 1.3 0.0
7 2.1 2 1.9 2.1 0.0
8 2.4 0 1.1 1.2 0.1
9 2.8 2.5 2.0 2.6 0.3
10 3.5 4.2 3.7 3.8 0.1
11 4.4 4.1 4.1 4.4 0.0
12 4.8 5.4 5.5 5.0 -0.2
Md 0.13
Sd 0.23
Zscore 0.55 < 2
Vin IRTF 1 IRTF2 Enz 1 Enz 2 di

1 5.1 5.4 5.1 5.1 0.1
2 5.3 5.7 5.3 6.0 -0.2
3 7.7 7.6 7.2 7.0 0.6
4 8.6 8.6 8.3 8.5 0.2
5 9.8 9.9 9.1 9.3 0.6
6 9.9 9.8 9.8 10.2 -0.1
7 11.5 11.9 13.3 13.0 -1.4
8 11.9 12.1 11.2 11.4 0.7
9 12.4 12.5 11.4 12.1 0.7
10 16 15.8 15.1 15.7 0.5
11 17.7 18.1 17.9 18.3 -0.2
12 20.5 20.1 20.0 19.1 0.7
Md = 0.19
Sd = 0.63
Zscore = 0.30 < 2
Pour les deux niveaux de gamme, le Zscore est infrieur 2. Le calibrage IRTF pour
le dosage du glucose fructose tudie ici, peut tre considre comme juste par
rapport la mthode enzymatique.
5.3.3.3. Comparaison par essais interlaboratoires
5.3.3.3.1. Domaine dapplication
Les essais interlaboratoire sont de deux types :
1. Les tudes collaboratives qui sont relatives une seule mthode. Ces
tudes sont ralises pour la validation initiale dune nouvelle mthode
afin den dfinir principalement lcart type de reproductibilit
interlaboratoire SRinter(mthode). La moyenne m pourra galement tre
donne.
2. Les chanes de comparaison interlaboratoire, ou essais daptitude. Ces

essais sont raliss pour la validation dune mthode adopte par le
laboratoire, et le contrle qualit en routine (voir 5.3.3.3). La valeur
fournie est la moyenne interlaboratoire m, ainsi que lcart type de
reproductibilit interlaboratoire et intermthode SRinter.
Dans le cadre de sa participation une chane danalyse, ou dans une tude

collaborative, le laboratoire peut exploiter les rsultats pour tudier la justesse
dune mthode afin dassurer initialement sa validation, et son contrle qualit en
routine.
Si les essais interlaboratoire se font dans le cadre dune organisation certifie, ce

travail de comparaison pourra permettre le raccordement de la mthode.
5.3.3.3.2.Protocole de base et calculs
Pour obtenir une comparaison suffisante, il convient dutiliser un nombre minimum

de 5 matriaux dessai sur la priode.
Pour chaque matriau dessai, sont fournis deux rsultats :
-La moyenne de tous les laboratoires ayant produits des rsultats

significatifs m
-Lcart type de reproductibilit interlaboratoire

SR-inter
Les matriaux dessai sont analyss avec p rpliques par le laboratoire, ces
rpliques tant ralises dans des conditions de rptabilit. p doit tre au moins
gal 2.
Dautre part, le laboratoire pourra vrifier que la variabilit intralaboratoire

(reproductibilit intralaboratoire) est infrieure la variabilit interlaboratoire
(reproductibilit interlaboratoire) donne par la chane danalyse.
Pour chaque matriau dessai, le laboratoire calcule le Zscore, donn par la formule
suivante :
mlab m
Z score =
S R int er
Les rsultats pourront tre consigns dans le tableau suivant :
Matria Moyen
Rep Rep Rep Moyenne Ecart-
u ne Zscore
1 j p labo type
dessai chane
p
x1 j SR- mlab1 m1
j =1
1 x11 x1j x1p mlab1 = m1 Z score1 =
p inter(1) S R int er (1)
xij SR- mlabi mi

i xi1 xij xip mlabi = j =1 mi Z scorei =
p inter(i) SR int er(i)
xnj SR- Z scoren =

mlabn mn
n xn1 xnj xnp mlabn = j =1 mn SR int er(n)
p inte(n)
5.3.3.3.3. Interprtation
Si tous les Zscore sont infrieurs 2, les rsultats de la mthode tudie pourront tre
jugs identiques ceux obtenus par les laboratoires ayant donn des rsultats
significatifs.

Exemple : Une chane danalyse interlaboratoire rend les rsultats suivants pour le
paramtre dioxyde de soufre libre, sur deux chantillons.
Moyenne Moyenne Ecart-

Echantillons x1 x2 x3 x4 Zscore
labo chane type
1 34 34 33 34 33.75 32 6 0.29 <2
2 26 27 26 26 26.25 24 4 0.56 <2
On peut conclure que sur ces deux chantillons, la comparaison la chane danalyse est satisfaisante.
5.3.3.4. Comparaison des matriaux de rfrence
5.3.3.4.1. Domaine dapplication
Dans les situations o il nexiste pas de mthode de rfrence (ni dautres

mthodes) pour un paramtre donn, et que ce paramtre nest pas trait par les
chanes danalyse, la seule possibilit restante est la comparaison des rsultats de la
mthode valider avec les valeurs acceptes de matriaux de rfrence internes ou
externes.
Les matriaux de rfrence pourront par exemple tre des solutions synthtiques
tablies avec une verrerie de classe A, et/ou du matriel de mtrologie talonn.
Dans le cas de matriaux de rfrence certifis, la comparaison aura valeur de

raccordement, et pourra tre mene de pair avec ltude dtalonnage et de
linarit.
5.3.3.4.2. Protocole de base et calculs
Il convient de disposer de n matriaux de rfrence pour un niveau de gamme

donn, dans lequel il pourra tre raisonnablement estim que la rptabilit est
assimilable une constante, n doit tre au moins gal 10.
Analyser en double chaque matriau de rfrence.
On calculera les valeurs moyennes Mxi des 2 mesures xi et xi effectues par la

mthode usuelle.
On dfinit Ti la valeur accepte du ieme matriau de rfrence.
Les rsultats pourront tre consigns dans le tableau suivant :
x : Mthode usuelle T: Valeur accepte Diffrence

Matriau de Rep1 Rep2 Moyenne x du matriau de d
rfrence rfrence
1 x1 x1 Mx1 T1 d1=Mx1-T1

i xi xi Mxi Ti di=Mxi-Ti

n xn xn Mxn Tn dn= Mxn-Tn
n
1
La moyenne des rsultats de la mthode alternative Mx Mx =
n Mxi
i =1
La moyenne des valeurs acceptes des matriaux de rfrence MT

n
1
MT =
n Ti
i =1
n
d
Calculer la moyenne des diffrences Md Md = ni = Mx M T
i =1
n
(di M d )
2
i =1
Calculer lcart type des diffrences Sd Sd =
n 1
Md
Calculer le Z-score Z score =
Sd
5.3.3.4.3.Interprtation
- Si Zscore est infrieur ou gal 2.0, on peut conclure que la justesse de la mthode
alternative par rapport aux valeurs acceptes du matriau de rfrence est bonne sur
le niveau de gamme considr.
- Si Zscore est suprieur 2.0, on peut conclure que la mthode alternative nest pas
juste par rapport aux valeurs acceptes des matriaux de rfrence dans le niveau
de gamme considr.

Exemple : Il nexiste pas de mthode de rfrence pour comparer les rsultats de
lanalyse du Ethyl-4 Phnol (4-EP) par Chromatographie en Phase Gazeuse
couple la spectromtrie de masse (GC-MS). Les rsultats sont compars aux
valeurs acceptes de matriaux de rfrence constitus par des solutions
synthtiques formules par du matriel raccord.
Matriau
Ti (ref) Y1 Y2 Y3 Y4 My di
dessai
1 4.62 6.2 6.56 4.9 5.7 5.8 1.2
2 12.3 15.1 10.94 12.3 11.6 12.5 0.2
3 24.6 24.5 18 25.7 27.8 24.0 -0.6
4 46.2 48.2 52.95 46.8 35 45.7 -0.5
5 77 80.72 81.36 83.2 74.5 79.9 2.9
6 92.4 97.6 89 94.5 99.5 95.2 2.8
7 123.2 126.6 129.9 119.6 126.9 125.8 2.6
8 246.4 254.1 250.9 243.9 240.4 247.3 0.9
9 385 375.8 366.9 380.4 386.9 377.5 -7.5
10 462 467.5 454.5 433.3 457.3 453.2 -8.9
Md = -0.7
Sd =. 4.16
Zscore = 0.16
A la vue de ces rsultats, les valeurs obtenues par la mthode danalyse du 4-EP par GC-MS peuvent
tre considres comme juste par rapport aux valeurs acceptes des matriaux de rfrence.
5.4. Troisime partie : tude de lerreur alatoire
5.4.1. Principe gnral
Lerreur alatoire est approche partir des tudes de fidlit. La fidlit est
calcule selon une mthodologie pouvant sappliquer dans diverses conditions
exprimentales, comprises entre celles de la rptabilit, et celles de la
reproductibilit, qui constituent les conditions extrmes de sa mesure.
Ltude de fidlit est un des lments indispensable ltude de lincertitude de
mesure.
5.4.2. Documents de rfrence
Norme ISO 5725, Exactitude des rsultats et mthodes de mesure

5.4.3. Fidlit de la mthode
5.4.3.1. Dfinition
Etroitesse d'accord entre des rsultats d'essai indpendants obtenus sous des
conditions stipules.
NOTE 1 La fidlit dpend uniquement de la distribution des erreurs alatoires et n'a aucune relation
avec la valeur vraie ou spcifie.
NOTE 2 La mesure de fidlit est exprime partir de l'cart type des rsultats d'essais.
NOTE 3 Le terme "rsultats d'essai indpendants" signifie des rsultats obtenus d'une faon non
influence par un rsultat prcdent sur le mme matriau d'essai ou similaire. Les mesures
quantitatives de la fidlit dpendent de faon critique des conditions stipules. Les conditions de
rptabilit et de reproductibilit sont des ensembles particuliers de conditions extrmes.
Dans la pratique, on parlera de fidlit pour toutes les conditions exprimentales

comprises entre les conditions de rptabilit et celles de reproductibilit.
5.4.3.2. Champs dapplication
Sont ici dtaills les protocoles et les calculs depuis le cas thorique gnral,
jusquaux cas particuliers de rptabilit et de reproductibilit. Cette approche
exhaustive doit permettre dappliquer ltude de fidlit dans la grande majorit
des situations des laboratoires.
Ltude de fidlit peut a priori sappliquer sans difficult toutes les mthodes
quantitatives.
Dans de nombreux cas, la fidlit nest pas constante sur toute la gamme de
validit de la mthode. Il convient alors de dfinir plusieurs tronons ou niveaux
de gamme , dans lesquels il pourra tre raisonnablement considr que la fidlit
est assimilable une constante. Le calcul de fidlit sera alors ritr pour chaque
niveau de gamme.
5.4.3.3. Cas thorique gnral
5.4.3.3.1.1. Calculs avec plusieurs matriaux dessai
n matriaux dessais sont analyss sur une priode de temps assez longue avec
plusieurs rpliques, pi tant le nombre de rpliques du ime matriau dessai. Les
matriaux dessai doivent conserver des proprits constantes au cours de la
priode considre.
A chaque rplique, la mesure peut tre ralise avec k rptitions, (on ne considre
pas ici le cas o le nombre de rptitions k peut tre variable dun matriau dessai
lautre, ce qui compliquerait encore plus les calculs).
Le nombre total des rpliques devra tre suprieur 10, rparti sur lensemble des
matriaux dessai.
Les rsultats pourront tre consigns dans le tableau suivant, (cas o k = 2)
Rpliques 1 j p1 pi pn
Matriaux dessai.
x1 x1 x1p x1p
1 x11 x1j
1 j 1 1

xi xip xi
i xi1 xij xij
1 i pi

xn xn xnp xnp
n xn1 xnj
1 j n n
Dans cette situation, lcart type de variabilit totale (ou cart type de fidlit Sv)
est donne par lexpression gnrale :
1
S v = Var ( x ij ) + (1 )Var (rpet )
k
avec :
Var ( xij ) variance de la moyenne des rptions des rpliques de tous les
matriaux dessais.
Var (rpet ) variance de la rptabilit de toutes les rptitions.
- Dans le cas o les matriaux dessais ont t analyss en double chaque rplique
(k = 2), lexpression devient :
Var (rpet )
S v = Var ( x ij ) +
2
- Lorsquune seule mesure du matriau dessai a t ralise chaque rplique (k =

1), la variance de rptabilit est nulle, lexpression devient :
Sv = Var ( xij )
- Calcul de Var(xij)
xij + x' ij
La moyenne des deux rpliques xij et xij est : xij =
2
Pour chaque matriau dessai, la moyenne des n rpliques est calcule :

Erreur ! Des objets ne peuvent pas tre crs
partir des codes de champs de mise en forme.
Le nombre de mesures diffrentes N est la somme des pi

n
N= pi
i =1
La variance Var(xij) est alors donne par lquation suivante

n pi
( xij M x )
2
i =1 j =1 i
Var ( xij ) =
N n
NOTE Cette variance peut galement tre calcule partir des variances de variabilit de chacun des
matriaux dessai : Vari(xj). On emploie alors la relation suivante qui est strictement quivalente la relation
prcdente :
n
( pi 1).Vari ( x j )
i =1
Var ( xij ) =
N n
-Calcul de Var(rpet)
La variance de rptabilit est calcule comme une rptabilit classique avec N

matriaux dessai en double. Selon le calcul de rptabilit expos dans le chapitre
rptabilit , pour k = 2 la variance de rptabilit est :
p ni 2
wij
Var (rpet ) =
i =1 j =1
avec wij = xij x'ij
2N
La fidlit v est calcule selon la formule :
v = 2 2.S v = 2.8.S v
La valeur de fidlit v signifie que dans 95% des cas, lcart entre deux valeurs
obtenues par la mthode, dans les conditions dfinies sera infrieur ou gal v.
NOTE 1 Lemploi et linterprtation de ces rsultats est possible dans la

mesure o il est fait lhypothse que les carts suivent une loi normale avec 95% de
confiance.
NOTE 2 On peut galement dfinir une fidlit 99 % avec v=2.58 2.Sv =3.65.Sv
5.4.3.3.1.2. Calculs avec 1 matriau dessai

Dans cette situation, les calculs se simplifient. Il convient de procder p rpliques de
mesure du matriau dessai, ventuellement avec une rptition de la mesure chaque
rplique. p doit tre au moins gal 10.
Dans les calculs suivants, on considre que la mesure se fait en double chaque rplique.
- La variance Var(xij) est alors donne par lquation suivante :
( xi M x )
2
Var ( xij ) = i =1
p 1
avec :
xi moyenne des deux rptitions de la rplique i
p nombre de rpliques
Mx moyenne de toutes les rpliques
- La variance Var(rpet) est alors donne par lquation suivante :
p
wi2
i =1
Var (rpet ) =
2p
avec wi : diffrence entre les deux rptitions de la rplique i
5.4.3.4. Rptabilit
5.4.3.4.1. Dfinitions
La rptabilit est ltroitesse de laccord entre les rsultats danalyse indpendants

entre eux obtenus avec la mthode considre sur un mme vin, dans le mme
laboratoire, avec le mme oprateur utilisant le mme matriel, dans un court
intervalle de temps.
Ces conditions exprimentales seront appeles conditions de rptabilit.
La valeur de rptabilit r est la valeur en dessous de laquelle on peut estimer que

se situe la diffrence absolue entre deux rsultats danalyse unique, obtenus dans
les conditions de rptabilit dfinies ci-dessus, et ce, avec un niveau de confiance
de 95 %.
Lcart type de rptabilit Sr est lcart type des rsultats obtenus dans les
conditions de la rptabilit. Cest un paramtre de la dispersion des rsultats,
obtenu dans les conditions de la rptabilit.
Ltude de rptabilit peut a priori sappliquer sans difficult toutes les

mthodes quantitatives, dans la mesure o les conditions de rptabilit peuvent
tre respectes.
Dans de nombreux cas, la rptabilit nest pas constante sur toute la gamme de
validit de la mthode. Il convient alors de dfinir plusieurs tronons ou niveaux
de gamme , dans lesquels il pourra tre raisonnablement considr que la
rptabilit est assimilable une constante. Le calcul de rptabilit sera alors
ritr chaque niveau de gamme.
5.4.3.4.3.1.Cas gnral
Le nombre matriaux dessai pourra tre variable en fonction du nombre de

rptitions. Dans la pratique on considrera que le nombre de mesures tous
matriaux dessai confondus, devra tre suprieur 20. Il nest pas ncessaire que
les conditions de rptabilit soit maintenues dun matriau dessai lautre, mais
toutes les rpliques ralises sur un mme matriau dessai devront tre raliss
dans ces conditions de rptabilit.
La rptabilit reste un cas particulier du calcul de la fidlit

Var (rpet )
S v = Var ( x ij ) + . La partie Var (rpet ) est naturellement gale 0 (une
2
seule mesure chaque rplique), et le calcul se rsume au calcul de Var( xij )
n pi
( xij M x )
2
i =1 j =1 i
S r = Var ( x ij ) =
N n
La valeur r signifie que dans 95% des cas, lcart entre deux valeurs acquises dans
des conditions de rptabilit sera infrieur ou gal r.
5.4.3.4.3.2. Cas particulier applicable 1 seule rptition
En pratique la situation la plus courante pour les systmes automatiss est lanalyse
de matriaux dessai avec une seule rptition. Il convient dutiliser au moins 10
matriaux de faon atteindre les 20 mesures ncessaires. Les deux rpliques de
mesure dun mme matriau dessai devront tre ralises dans des conditions de
rptabilit.
Dans ce cas prcis, le calcul de Sr se simplifie et devient :
q
wi2
i =1
Sr =
2p
dans laquelle :
Sr = cart type de rptabilit

p = nombre de matriaux dessai analyss en double
wi = diffrences absolues entre doubles
La rptabilit r est calcule selon la formule :
r = 2,8 Sr
Exemple : Pour la mthode alternative de dosage du Dioxyde de soufre libre

envisage, et pour une gamme de mesure de 0 50 mg/l, loprateur cherchera au
moins 10 chantillons prsentant des concentrations comprises entre ces valeurs et
rgulirement rparties.
N de Wi
xi xi
lchantill (valeur
(en mg/l) (en mg/l)
on absolue)
1 14 14 0
2 25 24 1
3 10 10 0
4 2 3 1
5 35 35 0
6 19 19 0
7 23 23 0
8 27 27 0
9 44 45 1
10 30 30 0
11 8 8 0
12 48 46 2
Exemple : En reprenant les valeurs donnes dans le tableau ci-dessus, les rsultats
suivants sont obtenus :
q = 12
Sr = 0,54 mg/l
r = 1,5 mg/l
Ce rsultat permet daffirmer que, avec une probabilit de 95%, les rsultats
obtenus par la mthode ltude auront une rptabilit infrieure 1,5 mg/l.
5.4.3.4.4. Comparaison des rptabilits
5.4.3.4.4.1. Dtermination des rptabilits des deux mthodes
Pour estimer les performances dune mthode, il peut tre utile de comparer sa
rptabilit celle dune mthode de rfrence.
Soit Sr-alt lcart type de rptabilit de la mthode usuelle, et Sr-ref lcart type de la
rptabilit de la mthode de rfrence.
La comparaison est directe. Si la valeur de rptabilit de la mthode alternative est

infrieure ou gale celle de la mthode de rfrence, le rsultat est favorable. Si
elle est plus leve, le laboratoire devra sassurer que ce rsultat reste conforme au
cahier des charges quil a accept pour la mthode concerne. Dans ce dernier cas,
il pourra aussi appliquer un test de Fischer-Snedecor pour savoir si la valeur
trouve pour la mthode alternative est significativement suprieure celle de la
mthode de rfrence.
5.4.3.4.4.2. Test de Fischer-Snedecor
On calculera le rapport :
2
Sr
Fobs = alt
2
Sr
ref
On utilisera la valeur critique de Snedecor avec un risque gal 0,05

correspondant la variable de Fischer au niveau de confiance 1- , avec 1=N(x)-n,
et 2=N(z)-m degrs de libert : F(N(x)-n, N(y)-m, 1- ). Dans le cas dune

rptabilit calcule avec une seule rptition sur p matriaux dessai pour la
mthode alternative et q matriaux dessai pour la mthode de rfrence, la
variable de Fischer aura pour degr de libert 1=p, et 2=q, soit : F(p, q, 1- ).
Interprtation du test :
1/ Fobs > F1- , la valeur de la rptabilit de la mthode alternative est

significativement suprieure celle de la mthode de rfrence.
2/ Fobs < F1- , on ne peut affirmer que la valeur de la rptabilit de la

mthode alternative soit significativement suprieure celle de la mthode de
rfrence.
Exemple : La valeur de lcart type de rptabilit trouve pour la mthode de

dosage du Dioxyde de soufre libre est :
Sr = 0,54 mg/l
Le laboratoire a effectu le dosage sur les mmes matriaux dessai par la mthode
de rfrence OIV. La valeur de lcart type de rptabilit trouve dans ce cas est :
Srf = 0,39 mg/l
2
Fobs = 0.542 = 0,29 = 1,93
0.39 0,15
2 = 12
1 = 12
F1- = 2,69 > 1.93
La valeur Fobs obtenue est infrieure la valeur F1- ; on ne peut affirmer que la
valeur de la rptabilit de la mthode alternative soit significativement suprieure
celle de la mthode de rfrence.
5.4.3.5. Reproductibilit intralaboratoire
5.4.3.5.1.Dfinition
La reproductibilit intralaboratoire est ltroitesse de laccord entre les rsultats
danalyse obtenus avec la mthode considre sur un mme vin, dans le mme
laboratoire, avec le mme oprateur ou des oprateurs diffrents utilisant des
courbes de calibrages diffrents, des jours diffrents.
Les tudes de reproductibilit peuvent tre mises en uvre sur les mthodes
quantitatives, si le temps danalyse est raisonnablement limit, sil existe la
capacit de dtenir au moins un matriau dessai stable dans le temps.
Dans de nombreux cas, la reproductibilit nest pas constante sur toute la gamme
de validit de la mthode. Il convient alors de dfinir plusieurs tronons ou
niveaux de gamme , dans lesquels il pourra tre raisonnablement considr que
la reproductibilit est assimilable une constante. Le calcul de reproductibilit sera
alors ritr chaque niveau de gamme.
Le laboratoire choisira un ou plusieurs matriaux dessais stables. Il appliquera la

mthode rgulirement pendant une priode au moins gale un mois et
conservera les rsultats obtenus (Xij, matriau i, rplique j). Un minimum de 5
rpliques est souhaitable pour chaque matriau dessai le nombre total minimum de
rpliques tant de 10. Les rpliques pourront tre analyses en double.
Le calcul de la fidlit sapplique intgralement pour le calcul de reproductibilit,

en intgrant Var(rpet) si les mesures ont t ralises en double.
La reproductibilit R est calcule selon la formule :
R = 2,8 SR
La valeur R signifie que dans 95% des cas, lcart entre deux valeurs acquises dans
des conditions de reproductibilit sera infrieur ou gal R.
Exemple : Etude de reproductibilit du dosage de lacide sorbique dans les vins

par entranement la vapeur et lecture par absorption 256 nm.
Deux vins sorbats diffrents ont t conservs pendant une priode de 3 mois. Le
dosage de lacide sorbique a t ralis intervalles rguliers sur cette priode,
avec une rptition chaque mesure.
Matriau dessai Matriau dessai

1 2
Rpliques x1 x2 x1 x2
1 122 125 140 139
2 123 120 138 137
3 132 130 139 141
4 121 115 143 142
5 130 135 139 139
6 135 142 135 138
7 137 135 139 139
8 130 125 145 145
9 123 130 138 137
10 112 115 135 134
11 131 128 146 146
12 137 138
13 146 147
14 145 148
15 130 128
n=2
p1 = 11
p2 = 15
N = 26
Var(xij ) =37.8
Var(repet) =5.01
SR = 6.35
R = 17.8
6. Contrle qualit des mthodes danalyse (CIQ)
6.1. Documents de rfrence
- Rsolution OIV no 19/2002 : Recommandations harmonises pour le contrle

interne de qualit dans les laboratoires danalyse.
- CITAC / EURACHEM : Guide pour la qualit en chimie analytique, Edition 2002
- Norme NF V03-115, Guide pour lutilisation des matriaux de rfrence
6.2. Principes gnraux
Il est rappel quun rsultat danalyse est entach de deux types derreur : lerreur
systmatique traduite en terme de biais, et lerreur alatoire. Pour les analyses en
sries, un autre type derreur peut tre dfini, qui peut tenir la fois de lerreur
systmatique et de lerreur alatoire : il sagit de leffet de srie, illustr par
exemple par la dviation du systme de mesure au cours dune srie.
Le CIQ visera la surveillance et la matrise de ces trois erreurs.
6.3. Les matriaux de rfrence
Le CIQ se base essentiellement sur lexploitation des rsultats de mesurage de

matriaux de rfrence. Le choix et la constitution de ceux-ci sont donc des tapes
essentielles quil convient de matriser de faon assurer un socle performant au
systme.
Un matriau de rfrence est dfini par deux paramtres :
-Sa matrice
-Lassignation de sa valeur de rfrence
Plusieurs cas de figure sont possibles ; les cas rencontrs en nologie sont
regroups dans le tableau double entre suivant :
Solution synthtique Matrice naturelle (vin) Vin dop
Matrice Les solutions synthtiques permettent de constituer assez facilement des Les matrices naturelles constituent les matriaux de rfrence les plus intressant priori Un vin dop est un vin ayant reu un apport artificiel dun analyte.
matriaux de rfrence. Elles ne sont pas compatibles avec les mthodes car elles assurent dviter tout risque deffet matrice pour les mthodes qui ne sont pas
Valeur de rfrence dont le signal nest pas spcifiques, et qui sont sensibles aux effets parfaitement spcifiques.
matrice.
Il convient que la solution soit ralise selon les rgles de mtrologie. Sans objet Cette mthode est applicable quand le vin de base est totalement dpourvu de
Il est rappel que la valeur de formulation obtenue est sujette une lanalyte. Ces types de matriaux sont bien adapts pour les adjuvants
incertitude. nologiques non natifs dans le vin. Si le dopage est appliqu avec un
Lapplication dun tel cas de figure permet de surveiller la fidlit de constituant natif du vin, on ne peut plus considrer la matrice comme
Valeur obtenue la mthode, ainsi que sa justesse en un point par rapport une naturelle. Le dopage doit tre ralis selon les rgles de mtrologie. La valeur
par formulation rfrence talonne. obtenue est sujette une incertitude.
Ce cas de figure permet de suivre la fidlit de la mthode, ainsi que sa
justesse en un point. Il peut tre appliqu aux mthodes sensibles aux effets
matrice pour les composs non natifs du vin, mais pas dans le cas de
composs natifs du vin.
Lorganisme fournisseur de la solution devra apporter des garanties La valeur externe a t dtermine sur le vin par une chane danalyse Il sagit en pratique dchantillons conditionns de vins dops et/ou
de qualit et si possible tre certifi. Les valeurs de rfrence seront interlaboratoires. chimiquement stabiliss proposs par des organismes. Ces matriaux ne
accompagnes dune valeur dincertitude un niveau de confiance Certains organismes proposent des chantillons conditionns de vins dont les valeurs peuvent pas prtendre constituer une matrice naturelle. Les valeurs de
MA-F-AS1-12-GUIVAL
indiqu. ont t ainsi dtermines. Cependant, dans certains cas, les vins ainsi prsents rfrence sont gnralement gnres par une chane danalyse.
Valeur externe Ce cas de figure permet de suivre la fidlit dune mthode, et de peuvent avoir t dops et/ou stabiliss chimiquement. La matrice peut alors tre Ce cas de figure permet de suivre la fidlit de la mthode, ainsi que sa
au laboratoire vrifier sa justesse en un point par rapport la valeur externe. Ceci a affecte. justesse en un point par rapport ltalon externe. Ceci a valeur de
valeur de raccordement en ce point si lorganisme fournisseur est Ce cas de figure permet de suivre la fidlit dune mthode, et de vrifier sa justesse raccordement en ce point si la lorganisme fournisseur fait lobjet dune
accrdit pour la prparation du matriau de rfrence en question. Il en un point par rapport la valeur externe. Ceci a valeur de raccordement en ce point accrditation pour la prparation du matriau de rfrence en question. Il ne
ne peut pas tre appliqu aux mthodes sensibles aux effets matrice. si la chane danalyse fait lobjet dune accrditation. Il peut tre appliqu aux peut pas tre appliqu aux mthodes sensibles aux effets matrice
mthodes sensibles aux effets matrice
Dans le cas o la solution synthtique nest pas obtenue avec un La mesure est ralise 3 fois avec la mthode de rfrence, la valeur retenue est la La mesure est ralise 3 fois avec la mthode de rfrence, la valeur retenue
matriel talonn. La valeur de rfrence peut-tre dtermine par moyenne des 3 rsultats, dans la mesure o ils restent dans un intervalle infrieur la est la moyenne des 3 rsultats, dans la mesure o ils restent dans un intervalle
lanalyse de la solution synthtique par mthode de rfrence. La rptabilit de la mthode. infrieur la rptabilit de la mthode.
mesure est ralise au moins 3 fois. La valeur retenue est la moyenne Ce cas de figure permet de suivre la fidlit dune mthode, et de vrifier sa justesse Ce cas de figure permet de suivre la fidlit dune mthode, et de vrifier sa
des 3 rsultats, dans la mesure o ils restent dans un intervalle en un point par rapport la mthode de rfrence. Il peut tre appliqu aux mthodes justesse en un point par rapport la mthode de rfrence. Il peut tre
Valeur obtenue
infrieur la rptabilit de la mthode. Le cas chant, loprateur sensibles aux effets matrice. appliqu aux mthodes sensibles aux effets matrice pour les composs non
par une mthode
peut vrifier la cohrence du rsultat obtenu avec la valeur de natifs du vin, mais pas dans le cas de composs natifs du vin.
de rfrence
formulation de la solution.
Ce cas de figure permet de suivre la fidlit dune mthode, et de
vrifier sa justesse en un point par rapport la mthode de rfrence.
Il ne peut pas tre appliqu aux mthodes sensibles aux effets
matrice.
La valeur de rfrence est mesure par la mthode contrler. Le La valeur de rfrence est mesure par la mthode contrler. Le matriau est mesur La valeur de rfrence est mesure par la mthode contrler. Le matriau est
matriau est mesur avec 10 rptitions, il sera vrifi que les carts avec 10 rptitions, il sera vrifi que les carts entre ces valeurs sont infrieurs la mesur avec 10 rptitions, il sera vrifi que les carts entre ces valeurs sont
Valeur obtenue
entre ces valeurs sont infrieurs la valeur de rptabilit ; les valeur de rptabilit ; les valeurs les plus extrmes peuvent ventuellement tre infrieurs la valeur de rptabilit ; les valeurs les plus extrmes peuvent
par la mthode
valeurs les plus extrmes peuvent ventuellement tre retires, sans retires, sans dpasser deux valeurs retires. Pour assurer la cohrence des valeurs ventuellement tre retires, sans dpasser deux valeurs retires. Pour assurer
contrler
dpasser deux valeurs retires. Pour assurer la cohrence des valeurs obtenues lors des 10 rptitions, cette srie sera contrle dune part par des matriaux la cohrence des valeurs obtenues lors des 10 rptitions, cette srie sera
Lutilisation de
obtenues lors des 10 rptitions, cette srie sera contrle par des de contrle tablis lors dune session prcdente, placs en dbut et en fin de srie. La contrle par des matriaux de contrle tablis lors dune session prcdente,
la valeur
matriaux de contrle tablis lors dune session prcdente, placs en valeur obtenue pourra galement tre compare avec la valeur obtenue par la mthode placs en dbut et en fin de srie.
instrument
dbut et en fin de srie. de rfrence (au cours de 3 rptitions par exemple). Lcart entre les deux valeurs Ce cas de figure ne permet que de suivre la fidlit de la mthode, la justesse
comme valeur de
Ce cas de figure ne permet de suivre que la fidlit de la mthode, la devra rester infrieur la justesse calcule de la mthode alternative par rapport la doit tre suivie par une autre dmarche. Il peut tre appliqu aux mthodes
rfrence ne
justesse doit tre suivie par une autre dmarche. mthode de rfrence. sensibles aux effets matrice pour les composs non natifs du vin, mais pas
permet pas de
Ce cas de figure a un intrt notamment quand une mthode produit une erreur dans le cas de composs natifs du vin.
contrler la
alatoire reproductible propre chaque chantillon, notamment en raison de la non
justesse. Une
spcificit du signal mesur. Cette erreur est souvent minime et infrieure
approche
lincertitude, mais peut gnrer une erreur systmatique si la mthode est ajuste sur
alternative devra
une seule valeur. Ceci permet de suivre la fidlit de la mthode, la justesse devra tre
alors tre mise
suivie par une autre approche. Cest la cas trs notable de lIRTF.
en place.
65
6.4. Contrle des sries analytiques
6.4.1. Dfinition
Une srie analytique est un ensemble de mesurages raliss dans des conditions de
rptabilit.
Pour un laboratoire qui utilise majoritairement le mode danalyse par srie

analytique il est ncessaire de vrifier le bon ajustement instantan de linstrument
de mesure et sa stabilit au cours de la srie analytique.
Deux approches complmentaires sont possibles :

- lutilisation de matriaux de rfrence (souvent appels par extension
matriaux de contrle )
- lutilisation dun talon interne notamment pour les mthodes sparatives.
6.4.2. Contrle de justesse partir de matriaux de rfrence
Lerreur systmatique sera contrle par lintroduction de matriaux de rfrence,

dont la valeur de rfrence a t assigne partir de moyens externes la mthode
contrle.
La valeur mesure du matriau de rfrence est associe une tolrance,

lintrieur de laquelle on accepte la valeur mesure comme valide. Le laboratoire
dfinit des valeurs de tolrance pour chaque paramtre et pour chaque systme
analytique. Ces valeurs sont propres au laboratoire.
Les matriaux de contrle devront tre choisis de faon ce que leurs valeurs de
rfrence correspondent aux niveaux de valeurs habituellement rencontrs pour un
paramtre donn. Dans le cas o lchelle de mesure est large, et o lincertitude de
mesure nest pas constante sur lchelle, il convient dutiliser plusieurs matriaux
de contrle pour couvrir les diffrents niveaux de gamme.
6.4.3. Fidlit intrasrie
Lorsque les sries analytiques sont assez longues, il existe un risque de drive du
systme analytique. Il convient alors de contrler la fidlit intrasrie par
lutilisation dun mme matriau de rfrence positionn intervalles rguliers
dans la srie. Les mmes matriaux de contrle que ceux utiliss pour la justesse
pourront tre exploits.
Il convient que lcart des valeurs mesures du mme matriau de rfrence au

cours de la srie soit infrieur la valeur de rptabilit r calcule pour un niveau
de confiance de 95%.
NOTE Pour un niveau de confiance de 99% on pourra utiliser comme valeur 3.65.Sr.
6.4.4. Etalon interne
Certaines mthodes sparatives permettent lintroduction dun talon interne dans

le produit analyser.
Il convient alors de procder lintroduction dun talon interne avec du matriel
talonn dont lincertitude de mesure est connue.
Ltalon interne permet la fois un contrle de la justesse et un contrle de la
fidlit intrasrie. Il est noter quune drive affecte dans des proportions gales
les signaux de lanalyte et de ltalon interne, la valeur de lanalyte tant calcul
avec la valeur du signal de ltalon interne, leffet de la drive est annul.
La srie sera valide si les talons internes sont lintrieur des tolrances dfinies.
6.5. Contrle du systme danalyse
6.5.1. Dfinition
Il sagit dun contrle complmentaire au contrle des sries. Il sen diffrencie par
le fait que sont compiles des valeurs acquises sur des chelles de temps longues,
et/ou compares avec des valeurs issues dautres systmes danalyse.
Nous dvelopperons deux applications :

- Cartes de Shewhart pour le suivi de la stabilit du systme danalyse
- Comparaison interne et externe du systme danalyse
6.5.2.Carte de Shewhart
Les cartes de Shewhart sont des outils statistiques graphiques qui permettent de
surveiller les drives des systmes de mesure, par lanalyse rgulire, en pratique
dans des conditions de reproductibilit, de matriaux de rfrence stables.
6.5.2.1. Acquisition des donnes
Un matriau de rfrence stable est mesur pendant une priode suffisamment

longue, des intervalles rguliers dfinis. Ces mesurages sont enregistrs et
consigns dans les cartes de contrle. Ils sont raliss dans des conditions de
reproductibilit, et sont de fait exploitables pour le calcul de reproductibilit, et au-

del pour lestimation de lincertitude de mesure.
Les valeurs des paramtres analytiques des matriaux de rfrence choisis doivent
se situer dans celles des gammes de mesure valide.
Les matriaux de rfrence sont analyss au cours dune srie analytique, si

possible routinire, avec une position variable dans la srie dune fois lautre. En
pratique, il est parfaitement possible dutiliser les mesurages des matriaux de
contrle des sries pour alimenter les cartes de contrle.
6.5.2.2. Prsentation des rsultats et dfinition des limites
Les rsultats individuels sont compars la valeur accepte du matriau de

rfrence, et lcart type de reproductibilit du paramtre considr, au niveau de
gamme considr.
Deux types de limites sont dfinis dans les cartes de Shewhart, les limites associes
aux rsultats individuels, et les limites associes la moyenne.
Les limites dfinies pour les rsultats individuels sont habituellement fondes sur
les valeurs dcart type de reproductibilit intralaboratoire pour le niveau de
gamme considr, elles sont de deux types :
- La limite dalerte : + /2.SR .

-La limite daction : + /3.SR .
La limite dfinie pour la moyenne cumule est dautant plus troite que le nombre
de mesures est lev.
3.S R
- Cette limite est une limite daction : + / . n tant le nombre de
n
mesures portes sur la carte.
NOTE Par soucis de lisibilit, la limite dalerte de la moyenne cumule ne figure

2.S R
que rarement sur la carte de contrle, celle-ci aurait pour valeur + / .
n
Carte de Shewhart
0.31
0.29
rsultats indivuduels
Moyenne cumule
Limite sup d'action moyenne
0.27 Limit inf d'action moyenne

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Limite sup d'alerte indiv
Limite inf d'alerte indiv
Limite sup d'action indiv
Limite inf d'action indiv
0.25
0.23
6.5.2.3. Exploitation de la carte de Shewhart
Nous donnons ci-dessous les critres dexploitation les plus souvent utiliss. Cest
aux laboratoires de dfinir plus prcisment les critres quils appliquent.
Une action corrective sur la mthode (ou l'appareil) sera engage :
a) si un rsultat individuel est l'extrieur des limites daction des rsultats

individuels.
b) si deux rsultats individuels conscutifs sont situs l'extrieur des limites
dalerte des rsultats individuels.
c) si de plus, l'analyse a posteriori des cartes de contrle rvlent des drives de la
mthode dans trois cas de figure:
- neuf points de rsultats individuels conscutifs sont situs d'un mme ct de la
droite des valeurs de rfrence.
- six points de rsultats individuels successifs montent ou descendent.
- deux points sur trois successifs sont situs entre la limite dalerte et la limite
daction.
d) si la moyenne arithmtique des n rsultats enregistrs est au-del d'une des
limites daction de la moyenne cumule (ce qui met en vidence une dviation
systmatique des rsultats).
NOTE : La carte de contrle doit tre reprise n=1 ds qu'une action corrective a t
effectue sur la mthode.
6.5.3. Comparaison interne des systmes danalyse
Dans un laboratoire qui dispose de plusieurs mthodes danalyse pour un paramtre

donn, il est intressant de raliser des mesurages de mmes matriaux dessai de
faon comparer les rsultats. Laccord des rsultats est jug satisfaisant entre les
deux mthodes si leur cart reste infrieur 2 fois lcart type de diffrence calcul
en validation, et ce, avec un niveau de confiance de 95%.
NOTE Cette interprtation est possible dans la mesure o il est fait lhypothse
que les carts suivent une loi normale avec 95% de confiance.
6.5.4. Comparaison externe du systme danalyse
6.5.4.1. Chane danalyse de comparaison interlaboratoires
Lorganisation des essais et des calculs est donne dans le chapitre comparaison
une chane danalyse interlaboratoire .
Au-del de la vrification de la justesse par le Zscore les rsultats pourront tre

analyss plus finement, notamment en ce qui concerne la position des valeurs du
laboratoire par rapport la moyenne. Si elles sont systmatiquement dun mme
ct de la moyenne pour plusieurs chanes danalyse successives, cela peut justifier
pour le laboratoire la mise en uvre dactions correctives, mme si le Zscore reste
infrieur la valeur critique.

Dans le cas o la chane dintercomparaison fait lobjet dune accrditation, ce

travail de comparaison valeur de raccordement.
6.5.4.2. Comparaison des matriaux de rfrence externes
Le mesurage intervalles rguliers de matriaux de rfrence externes permet

galement de surveiller lapparition dune erreur systmatique (biais).
Le principe est de procder au mesurage de matriaux de rfrence externes, et

daccepter ou de refuser la valeur en fonction de limites de tolrance. Ces limites
sont dfinies partir de la combinaison des incertitudes de la mthode contrle et

de la valeur de rfrence du matriau de rfrence.
6.5.4.2.1. Incertitude type du matriau de rfrence
Les valeurs de rfrence de ces matriaux sont accompagnes dintervalles de

confiance. Le laboratoire doit dterminer la nature de cette donne, et en tirer le
valeur de lincertitude type de la valeur de rfrence Sref ; en effet, plusieurs cas se
prsentent et doivent tre distingus :
- Cas o lincertitude a est donne sous la forme dun intervalle de confiance

95% (incertitude largie). Ceci signifie quon se place dans le cadre dune loi
normale. a constitue donc une incertitude largie et correspond 2 fois lcart
type Sref de lincertitude type des valeurs de rfrence des matriaux fournis
a
S ref =
2
- Cas de certificat, ou autre spcification, donnant des limites +/- a sans spcifier le
niveau de confiance. On se place alors dans le cadre dune dispersion rectangulaire,
la valeur du mesurage X a la mme chance de pendre une quelconque valeur dans
lintervalle ref+/- a.
a
S ref =
3
- Cas particulier de verrerie donnant des limites +/- a. On se place dans le cadre
dune dispersion triangulaire.
a
S ref =
6
6.5.4.2.2. Dfinition des limites de validit dun mesurage du matriau de rfrence
A lincertitude type Sref de la valeur du matriau de rfrence externe, sajoute

lincertitude type de la mthode du laboratoire contrler, Smthode. Ces deux
sources de variabilit doivent tre prises en compte pour la dtermination des
limites.
Smthode est calcule partir de lincertitude largie de la mthode du laboratoire de

la faon suivante :
incertitude
S mthode =
2
La limite de validit du rsultat (avec un niveau de confiance 95%) =

2 2
valeur de rfrence + / 2. Sref + Smthode
Exemple : Une solution tampon pH 7 est utilise pour le contrle dun pH-mtre.
Lintervalle de confiance donn par la solution pH est +/- 0.01, il est indiqu que
cet intervalle de confiance correspond lincertitude largie avec un niveau de
confiance de 95%. Par ailleurs lincertitude largie du pH-mtre est de 0.024.
2 2
Les limites seront 0.01 + 0.024
+ / 2 ( ) ( )
2 2
soit +/- 0.026 par rapport la valeur de rfrence, et ce avec un niveau de
confiance de 95%.
7. Estimation de lIncertitude de mesure
7.1. Dfinition
Paramtre, associ au rsultat dun mesurage, qui caractrise la dispersion des

valeurs qui pourraient raisonnablement tre attribues au mesurande.
En pratique, lincertitude est exprime sous la forme dun cart type appel
incertitude type u(x), ou sous une forme largie (avec k=2 gnralement)
U =+/- k.u
7.2. Documents de rfrence
- Norme AFNOR ENV 13005 : 1999 Guide pour lexpression de lincertitude de

mesure
- EURACHEM, 2000, Quantifying Uncertainty in Analytical Measurment, ,
EURACHEM second edition 2000
- Norme ISO 5725 :1994 Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure
- Norme ISO 21748 :2004 Lignes directrices relatives lutilisation destimation
de la rptabilit, de la reproductibilit et de la justesse dans lvaluation de
lincertitude de mesure
- Perruchet C. et Priel M., Estimer lincertitude, Editions AFNOR, 2000
7.3. Domaine dapplication
Lincertitude apporte deux types dinformation.
Dune part, celle destine aux clients du laboratoire en indiquant les

carts potentiels prendre en compte pour interprter un rsultat
danalyse. Il convient de prciser cependant que cette information ne peut
tre utilise comme un moyen dvaluation externe du laboratoire.
Dautre part, elle constitue un outil interne dynamique dvaluation de la

qualit des rsultats danalyse du laboratoire. Dans la mesure o son
valuation est rgulire et effectue partir dune mthodologie fixe et
bien dfinie, elle permet de savoir si les carts prsents par une mthode
voluent favorablement ou dfavorablement (dans le cas de lestimation
partir de donnes intralaboratoire exclusivement).
Le prsent guide se restreint ici apporter une mthodologie pratique dans le cadre
de laboratoires dnologie traitant des analyses en srie. Ces laboratoires disposent
de donnes en nombre leur confrant une dimension statistique significative.
Lestimation des incertitudes peut ainsi se raliser dans la majorit des cas partir
des donnes acquises dans le cadre des travaux de validation et de contrle qualit
(notamment avec les donnes des cartes de Shewhart). Ces donnes pourront tre
compltes par des plans dexprience, notamment pour dterminer les erreurs
systmatiques.
Les rfrentiels dcrivent deux grandes approches de la dtermination de

lincertitude : lapproche intralaboratoire et lapproche interlaboratoire. Chacune
fournit des rsultats naturellement et significativement diffrents. Leur
signification et leur interprtation ne peuvent pas tre identiques.
lapproche intralaboratoire fournit un rsultat propre la mthode

considre, dans le laboratoire considr. Lincertitude qui en rsulte est
un indicateur de la performance du laboratoire pour la mthode
considre. Elle rpond la question suivante du client : quelle
dispersion de rsultat puis-je attendre de la part du laboratoire pratiquant
la mthode.
lapproche interlaboratoire utilise des rsultats issus dessais

interlaboratoire, qui apportent une information de performance globale
relative la mthode.
Les laboratoires pourront utiliser les deux approches conjointement. Il sera alors
intressant de vrifier que les rsultats obtenus en approche intralaboratoire
donnent des valeurs infrieures aux valeurs de lapproche interlaboratoire.
7.4. Mthodologie
Le travail destimation de lincertitude se droule en 3 tapes fondamentales.

- Dfinition du mesurande, et description de la mthode danalyse
quantitative
- Analyse critique du processus de mesure
- Estimation de lincertitude.
7.4.1. Dfinition du mesurande, et description de la mthode danalyse

quantitative
Il convient dans un premier temps de :

- Prciser clairement lobjet de la mesure
- Dfinir la grandeur mesure
- Dans le cas o le mesurande serait obtenu par calcul partir de
grandeurs mesures, on exprimera si possible la relation mathmatique
les reliant.
- Indiquer toutes les conditions opratoires.
Ces lments figurent en principe dans les procdures du systme qualit du

laboratoire.
Lexpression de la relation mathmatique entre le mesurande et les grandeurs peut

tre dans certains cas (mthodes physiques) trs complexe, et il nest pas
forcment pertinent ni possible de les dtailler intgralement.
7.4.2. Analyse critique du processus de mesure
Il convient de recenser les sources derreur influenant le rsultat final pour

constituer le budget dincertitude. On pourra estimer limportance de chaque
source, de faon liminer celles qui nont quune influence mineure ngligeable.
Cela se fait par estimation :
- du degr de gravit de la drive engendre par une mauvaise matrise
du facteur en question
- de la frquence des problmes potentiels
- de leur dtectabilit.
Cette analyse critique pourra par exemple se faire selon la mthode des 5M .
Main duvre ;
Effet oprateur
Matire :
Effet chantillon (stabilit, homognit, effets matrice), et consommables
(ractifs, produits, solutions, matriaux de rfrence),
Matriel :
Effet quipement (rponse, sensibilit, modes dintgration, etc), et matriel de
laboratoire (balance, verrerie),
Mthode :
Effet application du mode opratoire (conditions opratoires, succession des
oprations,),
Milieu :
Conditions ambiantes (temprature, pression, clairage, vibration, rayonnement,
humidit),
7.4.3. Calculs destimation de lincertitude type (dmarche intralaboratoire)
7.4.3.1. Principe
Dans le cas de laboratoires travaillant des sries importantes dchantillons avec un

nombre de mthode limit, une approche statistique base sur la reproductibilit
intralaboratoire, complmente avec le calcul de sources derreurs non prises en
compte dans les conditions de reproductibilit intralaboratoire, apparat tre
lapproche la plus adapte.
Un rsultat danalyse scarte de la valeur vraie sous leffet de deux sources

derreur. Les erreurs systmatiques et les erreurs alatoires.
Rsultat de lanalyse = Valeur vraie + Erreur systmatique + Erreur alatoire
Lincertitude va caractriser la dispersion du rsultat de lanalyse. Ceci se traduit

sous la forme dun cart type.
Variabilit (rsultat danalyse) = incertitude
Variabilit (valeur vraie) = 0
S erreurs _ systmatiques
2
Variabilit (Erreur systmatique) =
Variabilit (Erreur alatoire) = SR (Ecart type de reproductibilit intralaboratoire)
Les carts type sadditionnant au carr, lestimation de lincertitude type u(x) prend
la forme suivante :
u(erreurs _ systmatiques) + S R
2 2
u ( x) =
Les sources derreurs non intgrables dans les conditions de reproductibilit

intralaboratoire, cest dire les erreurs systmatiques, doivent tre dtermines
sous forme dcart type pour tre combines entre elles et lcart type de
reproductibilit.
Le laboratoire pourra agir de faon ce que les conditions de reproductibilit

appliques permettent denglober le maximum de sources derreurs. Ceci sobtient
notamment en constituant des matriaux dessais stables sur une priode
suffisamment longue, pendant laquelle le laboratoire veille faire varier tous les
facteurs exprimentaux possibles. Ainsi SR couvrira le plus grand nombre de
sources possibles derreurs (alatoires), et le travail destimation des erreurs
systmatiques, souvent plus complexe raliser, sera minimis.
Il convient de noter ici que le guide EURACHEM/CITAC Quantifier

lincertitude dans les mesures analytiques rappelle que En gnral, le Guide
ISO exige que les corrections soient appliqus pour tous les effets systmatiques
identifis et significatifs . Dans une mthode sous contrle , les erreurs
systmatiques devraient donc constituer une part mineure de lincertitude.
Ce tableau, non exhaustif, donne des exemples de sources derreur types et propose
une approche destimation pour chacune dentre elle, en utilisant, autant que
possible lintgration dans les conditions de reproductibilit.
Source derreur Type derreur Commentaire Mthode destimation

Echantillonnage Alatoire Lchantillonnage est un des Possibilit dinclure la
(constitution de lchantillon) mtiers dfinis dans la norme ISO reproductibilit intralaboratoire en
17025. Les laboratoires dclarant ne incluent lchantillonnage dans la
pas faire lchantillonnage, nincluent manipulation.
pas cette source derreur dans
lestimation de lincertitude.
Sous chantillonnage Alatoire Est significatif si lchantillon nest Inclus dans les conditions de
(prlvement dune quantit pas homogne. Cette source derreur reproductibilit intralaboratoire dans
dchantillon pour la ralisation de reste mineure pour le vin. la mesure ou le matriau dessai
lessai) utilis est similaire aux matriaux
dessais de routine.
Stabilit de lchantillon Alatoire Fonction des conditions de Les ventuelles volutions de
conservation de lchantillon. Sur les lchantillon peuvent tre intgres
vins, les laboratoires pourront prter aux conditions de reproductibilit.
une attention particulire aux Cette source dincertitude sera alors
dperditions de dioxyde de soufre et value globalement.
dthanol.
Etalonnage de lappareillage Systmatique / Alatoire Source derreur prendre en compte Erreur de droite dtalonnage
Cette erreur est dans les mthodes absolues. 7.4.2.4.1
systmatique si
ltalonnage est tabli pour Pris en compte dans les conditions
une dure longue, et de reproductibilit si talonnage
devient alatoire si rgulirement rvis.
ltalonnage est
rgulirement effectu
dans une chelle de temps
intgre dans les
conditions de
reproductibilit
Effet de contamination ou de Alatoire Cet effet sera minimis par une bonne Les conditions de reproductibilit
mmoire conception des instruments de prennent en compte cet effet,
mesures et des oprations de rinage conditions dintercaler les matriaux
adaptes de rfrence divers positionnement
dans les sries danalyse.
Fidlit des automates Alatoire Il sagira notamment des drives Les conditions de reproductibilit
intrasrie possibles. Ces dernires prennent en compte cet effet
seront notamment contrles par le condition dintercaler les matriaux
positionnement de matriaux de de rfrence divers positionnement
contrle dans le cadre du CQI dans les sries danalyse.
Puret des ractifs Alatoire La puret des ractifs naura que trs A intgrer dans les conditions de
peu deffet sur les mthodes relatives, reproductibilit en utilisant
dans la mesure o le calibrage et les diffrents lots de ractifs.
analyses sont ralises avec les
mmes lots de ractifs.
Cet effet prendre en compte dans les
mthodes absolues.
Conditions de mesure Alatoire Effets de la temprature, de Typiquement pris en compte dans
lhumidit des conditions de reproductibilit
Effet matrice Alatoire dun chantillon Ces effets sont prendre en compte Si cet effet est considr comme
lautre, systmatique sur sur les mthodes dont le signal significatif, un plan dexprience
un mme chantillon mesur nest pas parfaitement spcifique pourra tre mis en uvre
spcifique. pour estimer lincertitude due cet
effet. 7.4.2.4.3 Cet effet nest pas
intgr dans les conditions de
reproductibilit.
Effet de calibrage Systmatique si calibrage Pris en compte dans les conditions
constant de reproductibilit si le calibrage est
Alatoire si calibrage est rgulirement renouvel. Si le
rgulirement renouvel calibrage utilis reste le mme (
lchelle des priodes considres
dans le cadre des conditions de
reprodcutiblit), il convient de
mettre en uvre un plan
dexprience pour lestimation de
lerreur de la droite de calibration
7.4.2.4.1
Effet oprateur Alatoire A prendre en compte dans les
conditions de reproductibilit en
prenant soin de faire intervenir tous
les oprateurs habilits.
Biais Systmatique Doit tre minimise par le travail de Effet systmatique pouvant tre
contrle qualit du laboratoire. estime partir de rfrences
certifies.
7.4.3.2. Calcul de lcart type de reproductibilit intralaboratoire
Lcart type de reproductibilit SR est calcule selon le protocole dcrit dans le

chapitre Reproductibilit intralaboratoire (cf. 5.4.3.5).
Ce calcul pourra tre ralis partir de plusieurs matriaux dessai. Dans le cas
notable o SR est proportionnel la grandeur du mesurande, il nest pas souhaitable
de combiner les donnes acquises sur plusieurs matriaux dessai grandeurs
diffrentes, mais SR sera alors exprime en valeur relative (%).
7.4.3.3. Estimation de sources derreurs systmatiques typiques non prises en

compte dans les conditions de reproductibilit
7.4.3.3.1. Erreur de calibrage (ou dtalonnage)
Dans les cas o le calibrage dun instrument (ou talonnage dune mthode
absolue) est nest pas rgulirement refait, il ne peut pas tre intgr dans la
reproductibilit. Un plan dexprience doit tre men pour son estimation par
lerreur rsiduelle de la rgression.
7.4.3.3.1.1. Mode opratoire
La dmarche est similaire celle ralise dans ltude de linarit de la mthode.

matriaux de rfrence seront mesurs p fois en condition de fidlit
intralaboratoire, p sera suprieur 3, un nombre de 5 tant gnralement conseill.
Les valeurs acceptes de matriaux de rfrence devront tre rparti de faon
rgulire sur lchelle de valeurs tudie. Le nombre de mesure doit tre le mme
pour tous les matriaux de rfrence.
Matriaux Valeur accepte du Valeurs mesures

de matriau de Rplique Rplique Rplique
rfrence rfrence 1 j p
1 x1 y11 y1j y1p

i xi yi1 yij yip

n xn yn1 ynj ynp
7.4.3.3.1.2.Calculs et rsultats
On calcule le modle de rgression linaire.

y ij = a + b.xi + ij
o
y ij est la jime rplique du iime matriau de rfrence.
xi est la valeur accepte du iime matriau de rfrence.
b est la pente de la droite de rgression.
a est lordonne lorigine de la droite de rgression.
a + b.xi reprsente lesprance de la valeur du mesurage du iime matriau de

rfrence.
ij est lcart entre yij et lesprance de la valeur du mesurage du iime matriau

de rfrence.

suivantes :
- moyenne des p mesurages du ime matriau de rfrence

p
1
yi =
p yij
j =1
- moyenne de toutes les valeurs acceptes des n matriaux de rfrence

n
1
Mx =
n xi
i =1
- moyenne de tous les mesurages

n
1
My =
n yi
i =1
n
( xi M x )( yi M y )
i =1
n
( xi M x )
2
i =1
- estimation ordonne lorigine a a = M y b M x
- valeur de rgression associe au ime matriau de rfrence yi

y i = a + b xi
- rsidu eij eij = yij y i
7.4.3.3.1.3. Estimation de lincertitude type associe la droite de calibrage (ou

dtalonnage)
Dans le cas o les erreurs dues la droite de rgression sont constantes sur
lensemble du domaine, lincertitude type est estime de faon globale et unique
par lcart type rsiduel global.
n p 2
( yij y i )
i =1 j =1
u(calibrage) = Sres =
np 2
Dans le cas o les erreurs dues la droite de rgression ne sont pas constantes sur
lensemble du domaine, lincertitude type est estime pour un niveau donn par
lcart type rsiduel de ce niveau.
p 2
( yij y i )
j =1
u(calibrage),i = S res,i =
p 1
NOTE Ces estimations dcarts types sont exploitables si le modle de rgression linaire et le
domaine de calibrage (ou talonnage) sont valids (voir 5.3.1)
7.4.3.3.2. Erreur de biais
Selon le guide EURACHEM, Quantifier lincertitude dans les mesures

analytiques , il est rappel que le guide ISO exige en gnral que les corrections
soient appliques pour tous les effets systmatiques significatifs identifis. Il en va
ainsi pour les biais de mthodes pour lesquels le laboratoire met en uvre son
systme de contrle qualit (voir 6), et qui tendent vers 0 pour des mthodes
sous contrle .
En pratique, deux cas peuvent tre distingus :
7.4.3.3.2.1. Mthodes ajustes avec seul un matriau de rfrence certifi
Le biais est en permanence ajust avec un mme matriau de rfrence.
Le matriau de rfrence certifi (MRC) assure le raccordement mtrologique de la

mthode. Une valeur de rfrence a t attribue au MRC accompagne de son
incertitude type uref. Cette incertitude type du MRC est combine lincertitude
compose de la mthode, ucomp, pour dterminer lincertitude type globale de la
mthode du laboratoire u(x).
Lincertitude type globale de la mthode ajuste avec le MRC considr est ainsi :
2 2
u ( x) = uref + ucomp
NOTE 1 La mthodologie est identique dans le cas de mthodes ajustes avec les rsultats dune
chane de comparaison interlaboratoires.
NOTE 2 Il convient de bien noter la diffrence entre un MRC servant ajuster le biais dune
mthode, et dont lincertitude de la valeur de rfrence se combine cette de la mthode, et un MRC
servant contrler une mthode ajuste par ailleurs (cf. 6.5.4.2). Dans ce second cas, lincertitude
du MRC ne doit pas tre utilise pour lestimation de lincertitude de la mthode.
7.4.3.3.2.2. Mthodes ajustes avec plusieurs matriaux rfrents (gammes de

calibrages)
Il ny a pas dajustement particulier du biais en dehors du travail de calibrage.
Il est bien entendu que chaque calibrant apporte une incertitude de biais. Il existe
donc une incertitude thorique globale de biais qui combine les incertitudes des
calibrants. Cette incertitude est trs dlicate estimer, mais elle se rvle
gnralement suffisamment faible pour tre nglige, notamment dans le cas o le
laboratoire veille la qualit de ses calibrants, et de lincertitude de leurs valeurs

de rfrence.
Sauf cas particulier, lincertitude du biais sera ici nglige.
7.4.3.3.3. Effet matrice
7.4.3.3.3.1 .Dfinition
Leffet matrice produit une source derreur rptable pour un chantillon donn,
mais alatoire dun chantillon lautre. Cette erreur est lie linteraction des
composs prsents dans le produit analyser sur le mesurage de lanalyte
recherch. Leffet matrice se manifeste dans les mthodes prsentant un signal non
spcifique.
Leffet matrice constitue une part souvent faible dincertitude, notamment dans les
mthodes sparatives. Mais dans certaines mthodes, dont les techniques
infrarouges, il est une composante importante de lincertitude.
Exemple : Estimation de leffet matrice sur IRTF
Le signal de lIRTF, le spectre infrarouge, nest pas un signal spcifique

chacun des composs qui sont mesurs par cette technique. Le modle statistique
de calibrage permet de traiter linformation spectrale non spcifique, et bruite,
en une estimation suffisamment exacte de la valeur du mesurande. Ce modle
intgre des influences des autres composs du vin, qui variant dun vin lautre
et introduisent une erreur dans le rsultat. En amont du travail danalyse en
routine, un travail particulier est apport par les dveloppeurs de calibrage pour
minimiser cet effet matrice et rendre les calibrages robustes, c'est--dire capables
dintgrer ces variations sans les rpercuter sur le rsultat. Nanmoins leffet
matrice est toujours prsent et constitue une source derreur lorigine dune
partie importante de lincertitude dune mthode IRTF.
En toute rigueur, cette erreur deffet matrice peut tre estime en comparant,
dune part, les moyennes dun grand nombre de rpliques de mesurages IRTF,
obtenus sur plusieurs matriaux de rfrence (au moins 10), dans des conditions
de reproductibilit, et les valeurs vraies des matriaux de rfrence prsentant
une matrice de vin naturel dautre part. Lcart type des diffrences donne alors
cette variabilit de calibration ( condition que la calibration ait t
pralablement ajuste (biais = 0)).
Cette approche thorique nest pas ralisable en pratique, car les valeurs vraies
ne sont jamais connues, mais il est exprimentalement possible de sen approcher
suffisamment :
- Au pralable, la calibration IRTF doit tre ajuste statistiquement (biais = 0)

par rapport une mthode de rfrence partir dau moins 30 chantillons. Ceci
permet dliminer les effets de biais dans les mesures qui suivent.
- Les matriaux de rfrence doivent tre des vins naturels. Il convient dutiliser
au moins 10 matriaux de rfrence diffrents, dont les valeurs sont situes
lintrieur dun niveau de gamme o lincertitude peut tre considre comme
constante.
- Une valeur de rfrence acceptable est acquise partir de la moyenne de

plusieurs mesurages par la mthode de rfrence, effectus dans des conditions
de reproductibilit. Ceci permet en effet de baisser lincertitude de la valeur de
rfrence : si pour la mthode de rfrence utilise, toutes les sources
dincertitude importantes sont comprises dans les conditions de reproductibilit,
la multiplication du nombre p de mesurages raliss dans les conditions de
reproductibilit, permet lincertitude associe leur moyenne dtre divis par
p
. La moyenne obtenue partir dun nombre suffisant de mesurages aura alors
une incertitude faible, voire ngligeable par rapport lincertitude de la mthode
alternative ; et pourra donc tre utilise comme valeur de rfrence. p doit tre au
moins gal 5.
- Les matriaux de rfrence sont analyss par la mthode IRTF, avec plusieurs
rpliques, acquises dans des conditions de reproductibilit. Le fait de multiplier
le nombre de mesurages q en conditions de reproductibilit sur la mthode IRTF
permet de diminuer la variabilit lie la fidlit de la mthode (erreur
alatoire). La valeur moyenne de ces mesurage aura un cart type de variabilit
divise par q. Cette erreur alatoire peut devenir alors ngligeable par rapport
la variabilit lie la calibration (effet matrice) que nous cherchons estimer ici.
q doit tre au moins gal 5.
Lexemple suivant est appliqu au dosage de lacide actique par une calibration
IRTF. Les valeurs de rfrence sont donnes par 5 mesurages en conditions de
reproductibilit sur 7 matriaux dessai stables. Le nombre de 7 matriaux est en
principe insuffisant, mais les donnes nont ici que valeur dexemple.
Mthode de rfrence IRTF

Moy Moy
Matriaux 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Diff
Ref IRTF
1 0.30 0.32 0.31 0.30 0.31 0.308 0.30 0.31 0.31 0.30 0.30 0.305 -0.004
2 0.31 0.32 0.32 0.32 0.31 0.316 0.31 0.32 0.30 0.31 0.31 0.315 -0.006
3 0.38 0.39 0.39 0.38 0.38 0.384 0.37 0.37 0.37 0.37 0.36 0.37 -0.016
4 0.25 0.25 0.25 0.24 0.25 0.248 0.26 0.26 0.26 0.25 0.26 0.26 0.01
5 0.39 0.39 0.40 0.40 0.39 0.394 0.43 0.42 0.43 0.42 0.42 0.425 0.03
6 0.27 0.26 0.26 0.26 0.26 0.262 0.25 0.26 0.25 0.25 0.26 0.255 -0.008
7 0.37 0.37 0.37 0.37 0.36 0.368 0.37 0.36 0.36 0.35 0.36 0.365 -0.008
Calul des diffrences : diff = Moy IRTF Moy Ref.
Il est vrifi que la moyenne des diffrences Md = 0.000 (bon ajustement de

lIRTF par rapport la mthode de rfrence)
Lcart-type des diffrences, Sd = 0.015. Cest cet cart-type qui permet

destimer la variabilit gnre par la calibration, et on peut donc dire que :
Uf = 0.015
NOTE Il convient de noter que la valeur de Uf peut tre surestime par cette
approche. Si le laboratoire considre que la valeur est significativement
excessive dans les conditions opratoires dfinies ici, il pourra augmenter le
nombre de mesurages sur la mthode de rfrence et/ou sur la mthode IRTF.
Les conditions de reproductibilit englobent toutes les autres sources

significatives derreur, SR a t calcul par ailleurs : SR = 0.017
Lincertitude du dosage de lacide actique par cette application IRTF est :
2 2
+ / 2 * 0.015 + 0.017 soit +/- 0.045 g.L-1
7.4.3.3.4. Effet chantillons
Dans certains cas, les plans dexpriences pour lestimation de lincertitude sont
raliss partir de matriaux dessai synthtiques. Dans une telle situation,
lestimation ne couvrira pas leffet lchantillon (homognit). Les laboratoires
devront alors estimer cet effet.
Il convient de noter cependant que cet effet est souvent ngligeable dans les
laboratoires dnologie, qui utilisent des chantillons homognes de petite taille.
7.4.4. Estimation de lincertitude type par essais interlaboratoires
7.4.4.1. Principe
Lapproche interlaboratoire fait intervenir les donnes issues dessais

interlaboratoire partir desquelles est calcule un cart type de reproductibilit
interlaboratoire, selon les principes donns au 5.4.3. Les statisticiens en charge du
calcul des rsultats des essais interlaboratoire peuvent identifier des rsultats ou des
laboratoires aberrants , en utilisant des tests dcrits dans la norme ISO 5725
(test de Cochran). La mise lcart de ces rsultats pourra alors tre ralis aprs
accord entre les statisticiens et les analystes.
Pour lestimation de lincertitude par approche interlaboratoire les principes de

base noncs dans la norme ISO 21748 sont les suivants :
1. Lcart type de reproductibilit (interlaboratoire) obtenu dans une tude

collaborative est une base valide pour lvaluation de lincertitude de
mesure
2. Les effets qui ne sont pas observs dans le cadre de ltude

collaborative doivent tre manifestement ngligeables ou pris en
compte explicitement.
Les essais interlaboratoire sont de deux types :
1. Les tudes collaboratives qui sont relatives une seule mthode. Ces
tudes sont ralises pour la validation initiale dune nouvelle mthode
afin den dfinir lcart type de reproductibilit interlaboratoire
SRinter(mthode).
2. Les chanes de comparaison interlaboratoire, ou essais daptitude. Ces

essais sont raliss pour la validation dune mthode adopte par le
laboratoire, et le contrle qualit en routine (voir 5.3.3.3). Les
donnes sont traits globalement et intgrent toutes les mthodes
danalyses employes par les laboratoires participants. Les rsultats
sont la moyenne interlaboratoire m, et lcart type de reproductibilit
interlaboratoire et intermthode SRinter.

intramthode SRinter(mthode)
Lcart type de reproductibilit intralaboratoire SRinter(mthode) prend en compte

les variabilits intralaboratoires et la variabilit interlaboratoire totale lies la
mthode.
Il convient de prendre ensuite en compte le fait que la mthode danalyse puisse

produire une biais systmatique par rapport la valeur vraie.
Dans le cadre dune tude collaborative, et lorsque cela est possible, lerreur
produite par ce biais pourra tre estim en utilisant des matriaux de rfrence
certifis, dans les mmes conditions que dcrites dans le 7.4.3.3.2, et ajoutes
SRinter(mthode)

intermthode SRinter
Lcart type de reproductibilit intralaboratoire SRinter prend en compte les variabilits

intralaboratoires et la variabilit interlaboratoire pour le paramtre tudi.
Le laboratoire doit vrifier sa justesse par rapport ces rsultats (voir 5.3.3).
Il ny a pas lieu dajouter de composante associe la justesse de la mthode au budget

dincertitude, car dans les essais daptitude multi-mthodes on peut considrer que
les erreurs de justesse sont prises en compte dans SRinter
7.4.4.4. Autres composantes au budget dincertitude
Dans la mesure o les matriaux dessais utiliss pour les essais interlaboratoires sont
reprsentatifs des chantillons classiques analyss par les laboratoires, et quils suivent
lensemble de la procdure analytique (sous-chantillonnage, extraction, concentration,
dilution, distillation), SR-inter reprsente lincertitude type u(x) de la mthode, au sens
interlaboratoire.
Les erreurs non prises en compte dans les essais interlaboratoire devront alors tre
tudies pour en estimer leur incertitude type compose qui sera combine
lincertitude type compose des essais interlaboratoire.
7.5. Expression de lincertitude largie
Lincertitude sexprime en pratique sous sa forme largie qui est donne de faon
absolue pour les mthodes dans lesquelles lincertitude est stable dans le domaine
de travail, ou de faon relative quand lincertitude varie proportionnellement la
grandeur du mesurande :
Incertitude absolue : U = + / 2.u ( x)
2.u ( x)
Incertitude relative (en %) : U = + / .100 avec x moyenne des
x
rsultats de reproductibilit.
NOTE Cette expression de lincertitude est possible dans la mesure o il est fait
Ces expressions induisent une valeur dincertitude donne avec un niveau de
confiance de 95%
REFERENCES
(1) OIV Recueil des mthodes internationales danalyse des vins et des mots ;
OIV Ed., Paris.
(2) OIV, 2002 Recommandations harmonises pour le contrle interne de qualit

dans les laboratoires danalyse ; OIV rsolution no 19/2002., Paris.
(3) Norme ISO 5725 : 1994 Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et
mthodes de mesure, indice de classement X 06-041-1
(4) IUPAC, 2002 Harmonized guidelines for single-laboratory validation of

methods of analysis ;Pure Appl. Chem., Vol. 74; N5, pp. 835-855.
(5) Norme ISO 11095 : 1996 Etalonnage linaire utilisant des matriaux de
rfrence, Numro de rfrence ISO 11095 :1996
(6) Norme ISO 21748 : 2004 Lignes directrices relatives lutilisation

destimation de la rptabilit, de la reproductibilit et de la justesse dans
lvaluation de lincertitude de mesure, Numro de rfrence ISO ISO/TS
21748 :2004
(7) Norme AFNOR V03-110 : 1998 Procdure de validation intralaboratoire

dune mthode alternative par rapport une mthode de rfrence, indice de
classement V03-110
(8) Norme AFNOR V03-115 : 1996 Guide pour lutilisation des matriaux de
rfrence, indice de classement V03-115
(9) Norme AFNOR X 07-001 : 1994 Vocabulaire international des termes

fondamentaux et gnraux de mtrologie, indice de classement X07-001
(10) Norme AFNOR ENV 13005 : 1999 Guide pour lexpression de

lincertitude de mesure
(11) AFNOR, 2003, - Mtrologie dans lentreprise, outil de la qualit 2me dition,
Edition AFNOR 2003
(12) EURACHEM, 2000, - Quantifying Uncertainty in Analytical Measurment, ,

EURACHEM second edition 2000
(13) CITAC / EURACHEM, 2000 - Guide pour la qualit en chimie analytique, ,

EURACHEM dition 2002
(14) Bouvier J.C., 2002 - Calcul de lincertitude de mesure Guide pratique pour
les laboratoires danalyse nologique, Revue Franaise dnologie n197, nov-dec
2002, pp : 16-21
(15) Snakkers G. et Cantagrel R., 2004 - Utilisation des donnes des circuits de
comparaison interlaboratoires pour apprcier lexactitude des rsultats dun
laboratoire Estimation dune incertitude de mesure - Bull OIV, Vol. 77 857-876,
Jan Fv 2004, pp : 48-83
(16) Perruchet C. et Priel M, 2000 - Estimer lincertitude, Editions AFNOR
(17) Neuilly (M.) et CETAMA, 1993 - Modlisation et estimation des erreurs de

mesures, Lavoisier Ed, Paris
Annexe N1
Table A - Loi de SNEDECOR
La table donne les valeurs de F en fonction de 1 et 2 pour un risque de 0,05
P=0,950
1 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2 2
1 161,4 199,5 215,7 224,6 230,2 234,0 236,8 238,9 240,5 241,9 1
2 18,51 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37 19,38 19,40 2
3 10,13 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,89 8,85 8,81 8,79 3
4 7,71 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,09 6,04 6,00 5,96 4
5 6,61 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82 4,77 4,74 5
6 5,99 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15 4,10 4,06 6
7 5,59 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,64 7
8 5,32 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,35 8
9 5,12 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,29 3,23 3,18 3,14 9
10 4,96 4,10 3,71 3,48 3,33 3,22 3,14 3,07 3,02 2,98 10
11 4,84 3,98 3,59 3,36 3,20 3,09 3,01 2,95 2,90 2,85 11
12 4,75 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,91 2,85 2,80 2,75 12
13 4,67 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,83 2,77 2,71 2,67 13
14 4,60 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,76 2,70 2,65 2,60 14
15 4,54 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,71 2,64 2,59 2,54 15
16 4,49 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,66 2,59 2,54 2,49 16
17 4,45 3,59 3,20 2,96 2,81 2,70 2,61 2,55 2,49 2,45 17
18 4,41 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,58 2,51 2,46 2,41 18
19 4,38 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,54 2,48 2,42 2,38 19
20 4,35 3,49 3,10 2,87 2,71 2,60 2,51 2,45 2,39 2,35 20
21 4,32 3,47 3,07 2,84 2,68 2,57 2,49 2,42 2,37 2,32 21
22 4,30 3,44 3,05 2,82 2,66 2,55 2,46 2,40 2,34 2,30 22
23 4,28 3,42 3,03 2,80 2,64 2,53 2,44 2,37 2,32 2,27 23
24 4,26 3,40 3,01 2,78 2,62 2,51 2,42 2,36 2,30 2,25 24
25 4,24 3,39 2,99 2,76 2,60 2,49 2,40 2,34 2,28 2,24 25
26 4,23 3,37 2,98 2,74 2,59 2,47 2,39 2,32 2,27 2,22 26
27 4,21 3,35 2,96 2,73 2,57 2,46 2,37 2,31 2,25 2,20 27
28 4,20 3,34 2,95 2,71 2,56 2,45 2,36 2,29 2,24 2,19 28
29 4,18 3,33 2,93 2,70 2,55 2,43 2,35 2,28 2,22 2,18 29
30 4,17 3,32 2,92 2,69 2,53 2,42 2,33 2,27 2,21 2,16 30
40 4,08 3,23 2,84 2,61 2,45 2,34 2,25 2,18 2,12 2,08 40
60 4,00 3,15 2,76 2,53 2,37 2,25 2,17 2,10 2,04 1,99 60
120 3,92 3,07 2,68 2,45 2,29 2,17 2,09 2,02 1,96 1,91 120
3,84 3,00 2,60 2,37 2,21 2,10 2,01 1,94 1,88 1,83
2 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 1
Annexe N2
Table B - Loi de STUDENT
La table donne les valeurs de t en fonction de P et de
P P
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 0,975 0,990 0,995 0,9995

1 0,158 0,325 0,510 0,727 1,000 1,376 1,963 3,078 6,314 12,706 31,821 63,657 636,619 1
2 0,142 0,289 0,445 0,617 0,816 1,061 1,386 1,886 2,920 4,303 6,965 9,925 31,598 2
3 0,137 0,277 0,424 0,584 0,765 0,978 1,250 1,638 2,353 3,182 4,541 5,841 12,929 3
4 0,134 0,271 0,414 0,569 0,741 0,941 1,190 1,533 2,132 2,776 3,747 4,604 8,610 4
5 0,132 0,267 0,408 0,559 0,727 0,920 1,156 1,476 2,015 2,571 3,365 4,032 6,869 5
6 0,131 0,265 0,404 0,553 0,718 0,906 1,134 1,440 1,943 2,447 3,143 3,707 5,959 6
7 0,130 0,263 0,402 0,549 0,711 0,896 1,119 1,415 1,895 2,365 2,998 3,499 5,408 7
8 0,130 0,262 0,399 0,546 0,706 0,889 1,108 1,397 1,860 2,306 2,896 3,355 5,041 8
9 0,129 0,261 0,398 0,543 0,703 0,883 1,100 1,383 1,833 2,262 2,821 3,250 4,781 9
10 0,129 0,260 0,397 0,542 0,700 0,879 1,093 1,372 1,812 2,228 2,764 3,169 4,587 10
11 0,129 0,260 0,396 0,540 0,697 0,876 1,088 1,363 1,796 2,201 2,718 3,106 4,437 11
12 0,128 0,259 0,395 0,539 0,695 0,873 1,083 1,356 1,782 2,179 2,681 3,055 4,318 12
13 0,128 0,259 0,394 0,538 0,694 0,870 1,079 1,350 1,771 2,160 2,650 3,012 4,221 13
14 0,128 0,258 0,393 0,537 0,692 0,868 1,076 1,345 1,761 2,145 2,624 2,977 4,140 14
15 0,128 0,258 0,393 0,536 0,691 0,866 1,074 1,341 1,753 2,131 2,602 2,947 4,073 15
16 0,128 0,258 0,392 0,535 0,690 0,865 1,071 1,337 1,746 2,120 2,583 2,921 4,015 16
17 0,128 0,257 0,392 0,534 0,689 0,863 1,069 1,333 1,740 2,110 2,567 2,898 3,965 17
18 0,127 0,257 0,392 0,534 0,688 0,862 1,067 1,330 1,734 2,101 2,552 2,878 3,922 18
19 0,127 0,257 0,391 0,533 0,688 0,861 1,066 1,328 1,729 2,093 2,539 2,861 3,883 19
20 0,127 0,257 0,391 0,533 0,687 0,860 1,064 1,325 1,725 2,086 2,528 2,845 3,850 20
21 0,127 0,257 0,391 0,532 0,686 0,859 1,063 1,323 1,721 2,080 2,518 2,831 3,819 21
22 0,127 0,256 0,390 0,532 0,686 0,858 1,061 1,321 1,717 2,074 2,508 2,819 3,792 22
23 0,127 0,256 0,390 0,532 0,685 0,858 1,060 1,319 1,714 2,069 2,500 2,807 3,767 23
24 0,127 0,256 0,390 0,531 0,685 0,857 1,059 1,318 1,711 2,064 2,492 2,797 3,745 24
25 0,127 0,256 0,390 0,531 0,684 0,856 1,058 1,316 1,708 2,060 2,485 2,787 3,725 25
26 0,127 0,256 0,390 0,531 0,884 0,856 1,058 1,315 1,706 2,056 2,479 2,779 3,707 26
27 0,127 0,256 0,389 0,531 0,684 0,855 1,057 1,314 1,703 2,052 2,473 2,771 3,690 27
28 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,855 1,056 1,313 1,701 2,048 2,467 2,763 3,674 28
29 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,854 1,055 1,311 1,699 2,045 2,462 2,756 3,659 29
30 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,854 1,055 1,310 1,697 2,042 2,457 2,750 3,646 30
40 0,126 0,255 0,388 0,529 0,681 0,851 1,050 1,303 1,684 2,021 2,423 2,704 3,551 40
60 0,126 0,254 0,387 0,527 0,679 0,848 1,046 1,296 1,671 2,000 2,390 2,660 3,460 60
120 0,126 0,254 0,386 0,526 0,677 0,845 1,041 1,289 1,658 1,980 2,358 2,617 3,373 120
0,126 0,253 0,385 0,524 0,674 0,842 1,036 1,282 1,645 1,960 2,326 2,576 3,291
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 0,975 0,990 0,995 0,9995
P P
Validation par un seul laboratoire
Recommandations harmonises
pour la validation des methodes d'analyse
par un seul laboratoire (rapport technique)
Synthse
La validation de mthode figure parmi les mesures universellement

reconnues comme faisant ncessairement partie d'un systme exhaustif
d'assurance qualit dans le domaine de la chimie analytique. L ISO,
lUICPA (Union internationale de chimie pure et applique) et AOAC
INTERNATIONAL ont coopr afin de produire des protocoles accords
ou des recommandations sur la Conduite et interprtation des tudes de
performance de mthodes1 , sur la Vrification de l'Aptitude des
Laboratoires de chimie analytique2 , sur le Contrle interne de Qualit
dans les Laboratoires de Chimie Analytique3 et sur l'Utilisation des
donnes de recouvrement dans les Mesures Analytiques).4 Le Groupe
de Travail ayant formul ces protocoles/recommandations a t
mandat par l' UICPA pour prparer des recommandations sur la
validation des mthodes d'analyse par un seul laboratoire. Ces
recommandations prcisent les bases des procdures qui devraient tre
utilises pour assurer une validation adquate des mthodes d'analyse.
Un projet de recommandations a t discut au cours dun Symposium

international sur l'harmonisation des systmes d'assurance qualit dans
les laboratoires d'analyse chimique dont les actes ont t publis par la
Royal Society of Chemistry du Royaume-Uni.
MA-F-AS1-13-SINVAL 1
TABLE DES MATIERES
1 INTRODUCTION
1.1 Contexte
1.2 Protocoles, normes et guides existants
2 DEFINITIONS ET TERMINOLOGIE
2.1 Dfinitions gnrales
2.2 Dfinitions utilises uniquement dans ce document
3 Validation des mthodes, incertitude et assurance qualit
4 PRINCIPES DE BASE DE LA VALIDATION DES METHODES

4.1 Spcification et porte de la validation
4.2 Hypothses des essais
4.3 Sources d'erreur en Analyse
4.4 Effets lis la mthode et au laboratoire
5 Conduite des Etudes de Validation
6 Porte des tudes de validation

6.1 Le laboratoire est tenu dutiliser une mthode "entirement"
valide
6.2 Le laboratoire doit utiliser une mthode entirement valide mais
avec une nouvelle matrice
6.3 Le laboratoire doit utiliser une mthode bien tablie mais qui n'a
pas fait l'objet d'une tude collaborative
6.4 La mthode a fait l'objet d'une publication dans la littrature
scientifique celle-ci fournissant quelques caractristiques
analytiques
6.5 La mthode a fait l'objet d'une publication dans la littrature
scientifique, mais sans prcision sur les caractristiques, ou bien
la mthode a t dveloppe en interne
6.6 La mthode est empirique
6.7 L'analyse est ad hoc
6.8 Changements concernant le personnel et l'quipement
7 RECOMMANDATIONS
8 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE A: NOTES SUR LES CONDITIONS REQUISES POUR L'ETUDE

DES CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE DE LA METHODE.
A1 Domaine dapplication
A2 Spcificit
A3 Etalonnage et linarit
A3.1 Linarit et ordonne l'origine
A3.2 Etude de leffet matrice
A3.3 Procdure finale dtalonnage
A4 Justesse
A4.1 Evaluation de la justesse
A4.2 Conditions appliquer pour les expriences de justesse
A4.3 Valeurs de rfrence utiliser pour les expriences de justesse
A4.3.1 Matriaux de rfrence certifis (MRC)
A4.3.2 Matriaux de rfrence
A4.3.3 Utilisation d'une mthode de rfrence
A4.3.4 Utilisation des ajouts doss / recouvrement
A5 Fidlit
A6 Recouvrement
A7 Domaine de validit
A8 Limite de dtection
A9 Limite de dtermination ou limite de quantification
A10 Sensibilit
A11 Robustesse
A12 Aptitude lessai
A13 Variation de matrice
A14. Incertitude de mesure
ANNEXE B. CONSIDERATIONS SUPPLEMENTAIRES POUR LESTIMATION

DE L'INCERTITUDE DANS LES ETUDES DE VALIDATION
B1 Analyse de la sensibilit
B2 Jugement
1. INTRODUCTION
1.1 Contexte
Des mthodes d'analyse fiables sont requises pour assurer la conformit

avec les rglementations nationales et internationales dans tous les
domaines d'analyse. Par consquent, il est reconnu partout dans le
monde qu'un laboratoire doit prendre les dispositions appropries pour
s'assurer quil est en mesure de fournir (et de fournir effectivement) des
donnes du niveau de qualit requis. De telles dispositions
comprennent:
L'utilisation de mthodes d'analyse valides;

L'utilisation de procdures de contrle interne de qualit;
La participation des programmes dessai daptitude technique; et
L'obtention d'une accrditation selon une Norme Internationale,
gnralement ISO/CEI 17025.
Notons que l'accrditation ISO/CEI 17025 porte plus particulirement

sur la mise en place de la traabilit des mesurages, tout en requrant
un ensemble dexigences techniques et de gestion, qui comprennent
notamment celles figurant dans la liste ci-dessus.
La validation de mthode est ainsi une composante essentielle des

mesures qu'un laboratoire devrait mettre en uvre pour lui permettre
de produire des donnes analytiques fiables. D'autres aspects du sujet
ont t abords par le Groupe de Travail Interdivisionnel de l' UICPA sur
l'Harmonisation des Programmes d'Assurance Qualit pour les
Laboratoires d'Analyse, tout particulirement en laborant des
Protocoles/ Recommandations sur les tudes de performance des
mthodes interlaboratoires,1 sur les essais daptitude technique 2, et sur
le contrle qualit interne. 3
Dans certains domaines, notamment en matire d'analyse alimentaire,

la lgislation en vigueur exige l'utilisation de mthodes ayant t "
compltement valides". 5,6 Il est gnralement attendu que la validation
" complte" d'une mthode d'analyse comprenne l'examen des
caractristiques de la mthode dans le cadre dune tude
interlaboratoire des performances de celle-ci (galement appele tude
collaborative ou essai interlaboratoire). Des protocoles accepts partout
dans le monde ont t tablis pour la validation "complte" d'une
mthode d'analyse par un essai interlaboratoires, notamment par le
Protocole Harmonis international1 et par la procdure de l' ISO.7 Ces
protocoles / normes exigent la participation d'un nombre minimum de

laboratoires et de matriaux dessais soumis ltude interlaboratoires
pour valider compltement la mthode d'analyse. Toutefois, il n'est pas
toujours vident dans la pratique ou ncessaire de parvenir la
validation complte d'une mthode d'analyse. Dans ce cas, une
"validation interne de mthode" (effectue par un seul laboratoire) peut
tre approprie.
La validation de mthode par un seul laboratoire est adquate dans

plusieurs situations, notamment dans les circonstances suivantes :
pour s'assurer de la viabilit de la mthode avant de s'engager dans

l'exercice onreux de l'essai interlaboratoires formel;
pour fournir la preuve de la fiabilit d'une mthode d'analyse lorsque
des donnes d'essai interlaboratoires ne sont pas disponibles ou
lorsque l'organisation d'un essai interlaboratoires formel n'est pas
possible ;
pour s'assurer que des mthodes valides "prtes l'emploi" sont
utilises correctement.
Lorsqu'il s'agit de dterminer en interne les caractristiques d'une

mthode, il est important que le laboratoire dfinisse prcisment, en
accord avec son client, les caractristiques valuer. Cependant, dans
certaines circonstances, ces caractristiques peuvent tre imposes par
la lgislation en vigueur (par exemple pour les rsidus de mdicaments
vtrinaires dans l'alimentation ou encore pour les pesticides dans le
secteur alimentaire). La porte de l'valuation entreprise par un
laboratoire doit rpondre aux exigences dfinies par la lgislation.
Cependant, dans certains domaines d'analyse, la mme mthode

analytique est utilise par un grand nombre de laboratoires pour
dterminer les composants chimiques stables dans des matrices bien
dfinies. Il faut souligner que lorsque l'on peut mettre la disposition de
tous ces laboratoires une mthode approprie tudie collectivement, le
poids financier de l'essai interlaboratoires venant valider cette mthode
peut tout fait se justifier. Lutilisation dune mthode tudie en
interlaboratoire diminue de faon importante les efforts qu'un
laboratoire doit engager dans un travail de validation approfondi avant
dutiliser une mthode en routine. Un laboratoire qui utilise une
mthode tudie en interlaboratoire, et qui a t reconnue comme tant
adapte lutilisation prvue, na plus qu' prouver qu'il peut obtenir les
niveaux de performance spcifies pour la mthode. Une telle
vrification du bon usage de la mthode cote bien moins cher quune
validation interne complte. Il revient gnralement moins cher la
Communaut Analytique de valider une mthode grce un essai

interlaboratoires dans un premier temps, puis dans une deuxime temps
de vrifier les niveaux de performance dans les diffrents laboratoires
souhaitant utiliser cette mthode, que dassurer indpendamment dans
de nombreux laboratoires une validation interne de cette mme
mthode.
1.2 Protocoles, Normes et Guides existants
Un certain nombre de protocoles et de recommandations8-19 sur la

validation de mthode et sur l'incertitude ont t labors, notamment
dans AOAC INTERNATIONAL, dans la Confrence Internationale sur l'
Harmonisation (CIH) et dans les documents Eurachem :
Le Manuel de Statistiques de l' AOAC, qui comprend des

recommandations sur les tudes internes (un seul laboratoire)
prcdant des tudes collaboratives13
Le texte de la CIH15 et sa mthodologie,16 qui tablissent des
exigences minimales pour les tudes de validation quand il s'agit de
test utiliss pour motiver une demande d'autorisation de mise sur le
march.
The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to
Method Validation and Related Topics (1998)12
Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement (2000)9
La validaton de mthode a t galement largement dbattue lors d'une

Consultation Conjointe d'Experts FAO/IAEA en Dcembre 1997, sur la
Validation des Mthodes Analytiques pour les Contrles Alimentaires; le
rapport de cette consultation est disponible19.
Les prsentes "recommandations" regroupent les principes scientifiques

essentiels des documents mentionns ci-dessus, ceci afin de fournir les
informations ayant t soumises l'approbation internationale, et
surtout afin d'indiquer la marche suivre pour la meilleure pratique de
la validation interne d'une mthode (validation effectue par un seul
laboratoire).
2 DEFINITIONS ET TERMINOLOGIE
2.1 Dfinitions Gnrales
Les termes utiliss dans ce document respectent les dfinitions ISO et
UICPA lorsqu'elles sont disponibles. Les documents suivants contiennent

les dfinitions pertinentes:
i) IUPAC: Compendium of chemical terminology, 1987
ii) International vocabulary of basic and general terms in metrology. ISO

1993
2.2 Dfinitions utilisees uniquement dans ce document :
Incertitude relative : Incertitude exprime comme un cart-type relatif.
Domaine de validit : La partie dun domaine de concentration d'une

mthode d'analyse qui a t soumise la validation.
3 Validation des Mthodes, Incertitude et Assurance Qualit
La validation de mthode utilise un ensemble de tests qui vrifient la

fois les hypothses de base de la mthode danalyse et tablissent et
documentent les caractristiques de performance d'une mthode; ce
faisant, elle dmontre si une mthode est adapte son emploi
analytique. Les caractristiques de performance habituelles des
mthodes d' analyse sont : dfinition du champs dapplication; la
spcificit; ltalonnage (linarit); la justesse; la fidlit; la gamme de
validit; la limite de quantification; la limite de dtection; la sensibilit
et la robustesse. On peut y ajouter l'incertitude de la mesure et
laptitude- lessai.
Stricto sensu, la validation devrait faire rfrence un 'systme

danalyse' plutt qu' une 'mthode danalyse, le systme comprenant
la dfinition dun protocole de mthode, dun domaine de concentration
de l'analyte et la spcification de la nature du matriau dessai. Pour les
besoins de ce document, une rfrence la 'validation de mthode'
s'entendra comme faisant rfrence un systme danalyse dans son
ensemble. Quand on fera rfrence la procdure danalyse en tant que
telle, on parlera du 'protocole'.
Dans ce document la validation de mthode est considre comme tant

distincte des activits continues telles que le contrle interne de qualit
(CIQ) ou les essais daptitude technique. La validation de mthode est
ralis une seule fois, ou intervalles relativement espacs tout au long
de la dure d'utilisation de la mthode; elle nous renseigne sur la

performance que l'on est en droit d'attendre d'une mthode l'avenir.
Le contrle interne de qualit (CIQ) nous renseigne sur les
performances de la mthode dans le pass. Le CIQ est par consquent
abord comme tant une activit distincte dans le Programme
d'Harmonisation de l' UICPA.3
Dans la validation de mthode les caractristiques quantitatives

prsentant un intrt sont celles concernant le degr de prcision du
rsultat que l'on est susceptible d'obtenir. Par consquent on peut
considrer de manire gnrale que la validation de mthode revient
valuer l'incertitude de la mesure. Au fil des ans et des fins de
validation est ne lhabitude qui consiste reprsenter divers aspects de
la performance de la mthode en faisant rfrence aux diffrents
lments noncs ci-dessus; et d'ailleurs les recommandations
prsentes s'inscrivent dans cette tendance dans une large mesure.
Cependant avec la confiance croissante porte sur l'incertitude de la
mesure comme indicateur cl la fois de laptitude- lessai et de la
fiabilit des rsultats; les analystes feront de plus en plus appel la
validation des mesures pour tayer leur valuation de l'incertitude, et
certains souhaiteront recourir cette pratique immdiatement. Par
consquent l'incertitude de la mesure est aborde brivement dans
l'Annexe A comme une caractristique de la performance d'une mthode
d'analyse, tandis que l' Annexe B fournit des recommandations
supplmentaires sur certaines procdures non abordes ailleurs.
4 PRINCIPES DE BASE DE LA VALIDATION DE METHODE
4.1 Spcification et portee de la validation
La validation s'applique selon un protocole bien dfini, la

quantification, dans un cadre donn, dun analyte spcifi associ un
domaine de concentration, se trouvant dans un matriau dessai. Dune
faon gnrale, la validation devrait vrifier que les performances de la
mthode rpondent aux besoins dans tout le domaine de concentration
de l'analyte et pour tous les matriaux dessai auxquels elle s'applique.
Il s'en suit que ces donnes devraient tre parfaitement prcises avant
de procder une quelconque validation et tre accompagnes d'une
nonciation de tout critre d'aptitude- lessai
4.2 Hypothses des essais
Les tudes de validation fournissent des donnes de performance qui
renseignent sur l'aptitude lessai et qui prennent le pas aujourd'hui

sur l'utilisation pratique faite des donnes de validation. De plus, les
tudes de validation constituent un test objectif des hypothses de
dpart sur lesquelles toute mthode d'analyse est fonde. Par exemple,
si un rsultat est obtenu partir d'une simple droite dtalonnage, on
suppose implicitement que l'analyse est exempte de tout biais
significatif, que la rponse est proportionnelle la concentration de
l'analyte et que la dispersion des erreurs alatoires s'effectue de
manire constante sur tout la domaine de concentration qui nous
intresse. Dans la plupart des cas, de telles hypothses sont formules
sur la base de l'exprience accumule tout au long du dveloppement de
la mthode, ou sur le plus long terme encore; elles sont par consquent
raisonnablement fiables. Nanmoins, les bonnes pratiques en matire de
science de la mesure reposent sur des hypothses testes. C'est
pourquoi de trs nombreuses tudes de validation se fondent sur des
tests dhypothses statistiques, l'objectif tant de vrifier rapidement
que les hypothses raisonnables formules concernant les principes de
la mthode ne sont pas gravement errones.
Cette remarque apparemment abstraite a une importante consquence

pratique. Il est plus facile de vrifier que l'on s'loigne grandement
d'une hypothse fiable que de 'prouver' qu'une hypothse donne est
correcte. Ainsi, lorsque l'on utilise depuis longtemps et avec succs une
technique d'analyse particulire (par exemple l'analyse
chromatographique en phase gazeuse ou encore les mthodes de
digestion acide) pour un ensemble d'analytes et de matrices, les
vrifications de validation se rsument juste titre des tests
relativement simples pour apporter des garanties sur la mthode.
l'inverse, lorsque l'on dispose de peu d'exprience, l'tude de validation
doit apporter des preuves solides de l'adquation des hypothses
retenues dans le cas particulier l'tude; il est alors gnralement
ncessaire d'tudier tous les cas de figure dans le dtail. Il s'en suit que
l'ampleur requise d'une tude de validation dans un cas donn dpendra
en partie de l'exprience accumule concernant la technique d'analyse
utilise.
Dans l'expos suivant, on considrera comme allant de soi que le

laboratoire a une longue pratique de la technique concerne, et que
l'objectif de tout test statistique de signification est de s'assurer qu'il
n'existe aucune preuve solide allant l'encontre des hypothses sur
lesquelles le protocole en question repose. Le lecteur se souviendra que
des vrifications plus strictes peuvent se rvler ncessaires pour des
techniques de mesure mal connues ou moins bien tablies.
4.3 Sources d'Erreur en Analyse
Les erreurs de mesures en analyse proviennent de diffrentes sources*

et des niveaux d'organisation diffrents. On peut utilement
reprsenter ces diffrentes sources (pour une concentration prcise de
l'analyte) de la manire suivante+24:
Erreurs alatoires de la mesure (rptabilit);

Erreur systmatique (biais) de srie;
Erreur systmatique (biais) de laboratoire;
Erreur systmatique (biais) de mthode;
Effet de variation de la matrice.
Bien que ces diffrentes sources ne soient pas ncessairement

indpendantes, cette liste constitue une manire utile de vrifier les
domaines dans lesquels une tude de validation donne doit chercher
les sources derreur.
La rptabilit intra-srie comprend des contributions de toutes les

tapes de la procdure qui varient au cours d'une srie, ceci comprend
les contributions dues aux erreurs bien connues, gravimtriques et
volumtriques, l'htrognit du matriau dessai et une variation
dans les tapes de la chimie de l'analyse; on l'observe facilement
partir de la dispersion d'analyses rptes. L'effet de srie explique les
variations supplmentaires quotidiennes du systme analytique, comme
un changement de l'analyste, des lots, des ractifs, du rtalonnage des
instruments, ainsi que de l'environnement du laboratoire (par ex. des
changements de temprature). Lors d'une validation par un seul
laboratoire, l'effet de srie s'value habituellement en procdant des
rpliques d'analyse dun matriau appropri au cours de plusieurs sries
distinctes. La variation inter-laboratoires s'explique par diffrents
facteurs, tels que des variations dans les normes dtalonnage, des
*
On ne tient pas compte dans le document prsent de lincertitude d'chantillonnage, au
sens strict d'incertitude due la prparation de l'chantillon de laboratoire partir du
volume dorigine. L'incertitude lie au prlvement sur l'chantillon de laboratoire d'une
prise dessai fait intgralement partie de l'incertitude de la mesure et donc est
automatiquement incluse aux diffrents niveaux de l'analyse suivante.
+
Plusieurs groupes alternatifs ou 'partitions d'erreur' sont possibles et peuvent tre utiles
lors de l'tude plus approfondie de sources d'erreur bien spcifiques ou pour un ensemble
diffrent de situations. Par exemple, le modle statistique ISO 5725 combine gnralement
les effets de l'exprience et du laboratoire, tandis que la procdure d'valuation de
l'incertitude de ISO GUM se prte bien l'estimation de l'influence sur le rsultat de chaque
lment distinct et mesurable.
diffrences dans les interprtations d'un protocole dun endroit lautre,

des changements dans l' quipement ou dans les ractifs utiliss, ou
encore des facteurs environnementaux , par exemple des conditions
climatiques moyennes diffrentes. La variation inter-laboratoires
apparat trs clairement dans les rsultats d'essais interlaboratoires
(tudes de performance de la mthode) et de tests de comptence
technique; parfois, on peut discerner la variation inter-mthode dans les
rsultats de ces derniers.
Gnralement, la rptabilit, l'effet de srie et l'effet de laboratoire

sont d'amplitude comparable, on ne peut par consquent en ngliger
aucun sans risque lors d'une validation. Dans le pass, on a eu tendance
ngliger certains aspects, surtout quand il s'agissait d'valuer et de
faire tat des informations concernant l'incertitude, avec pour
consquence des intervalles d'incertitude trop troits. Par exemple,
l'essai interlaboratoires tel qu' il se pratique normalement ne donne pas
lensemble des informations car la contribution sur l'incertitude du biais
de la mthode et des variations de la matrice ny sont pas pris en
compte, et doivent donc tre abordes par ailleurs (habituellement lors
d'tudes internes pralables). La validation interne prsente quant elle
un danger particulier: le biais de laboratoire risque d' tre nglig , or
cette source derreur est gnralement le premier pourvoyeur
dincertitude de la liste ci-dessus. Il faut donc porter une attention toute
particulire au biais de laboratoire lors d'une validation interne.
En plus des problmes voqus ci-dessus, la validation d'une mthode

se limite la porte de son application, c'est--dire la mthode
applique une catgorie bien particulire de matriau dessai. S'il
existe des variations importantes du type de matrice l'intrieur d'une
catgorie dfinie, intervient alors une source supplmentaire de
variation due aux effets de matrice intra-catgorie. Bien videmment, si
la mthode est ultrieurement utilise pour des matriaux dessai hors
de la catgorie dfinie (c'est--dire hors de la porte de la validation), le
systme analytique ne peut pas tre considr comme tant valid: en
effet une erreur supplmentaire d'ampleur inconnue est introduite dans
le processus de mesure.
Il est galement important que les analystes tiennent compte des

variations de la performance d'une mthode en fonction de la
concentration de l'analyte. Dans la plupart des cas la dispersion des
rsultats augmente avec la concentration et le recouvrement peut tre
trs diffrent forte et faible concentrations. L'incertitude de la
mesure associe aux rsultats dpend par consquent souvent de ces
deux effets et d'autres facteurs dpendants de la concentration.
Heureusement, il est souvent raisonnable de supposer qu'il existe une

relation simple entre la performance et la concentration de l'analyte;
couramment les erreurs sont proportionnelles la concentration de
l'analyte.* Cependant, dans les cas o l'on s'intresse la performance
de la mthode des concentration trs diffrentes, il est important de
vrifier la relation suppose entre la performance et la concentration de
l'analyte. Cela se fait habituellement en vrifiant la performance aux
extrmits du domaine dapplication probable ou bien quelques
niveaux slectionns. Des contrles de linarit fournissent galement
des informations du mme ordre.
4.4 EFFETS LIES A LA METHODE ET AU LABORATOIRE
Il est d'une importance critique lors d'une validation interne de mthode

de tenir compte du biais de la mthode et du biais du laboratoire. Il
existe quelques laboratoires aux quipements particuliers dans lesquels
de tels biais peuvent tre considrs comme tant ngligeables, mais il
s'agit l d'une situation tout fait exceptionnelle.(Cependant dans le cas
o un seul laboratoire pratiquerait une analyse spcifique, le biais de la
mthode et le biais du laboratoire revtent une signification
particulire). Gnralement, les effets lis la mthode et au laboratoire
doivent tre inclus dans le budget dincertitude, mais souvent ils sont
plus difficiles traiter que l'erreur de rptabilit et que l'effet de srie.
En rgle gnrale, pour pouvoir valuer les incertitudes respectives, il
est ncessaire d'utiliser des informations indpendantes du laboratoire.
Gnralement parlant, les sources d'informations indpendantes les plus
utiles sont (i) les statistiques provenant dessais inter-laboratoires
(donnes souvent non disponibles dans les cas de validation interne de
la mthode), (ii) de statistiques provenant dessais daptitude technique,
et (iii) des rsultats provenant de l'analyse des matriaux de rfrence
certifis.
Les essais inter-laboratoires valuent directement la variance des biais

inter-laboratoires. Bien qu'il puisse exister des lacunes thoriques dans
la conception de tels essais, ces estimations de variance sont adaptes
de nombreux usages pratiques. Par consquent il est toujours instructif
de tester les validations internes en comparant les estimations
d'incertitude avec les estimations de reproductibilit provenant des
essais inter-laboratoires. Si le rsultat de la validation interne est
nettement le plus petit, il est fort probable que des sources importantes
d'incertitude ont t ngliges. (Il peut arriver qu'un laboratoire
*
Cela peut ne pas s'appliquer des concentrations en de de dix fois la limite de
dtection.
particulier travaille en fait un degr moindre d'incertitude que ce que

l'on trouve dans les essais inter-laboratoires : dans ce cas, ce
laboratoire devrait mettre en place des mesures spcifiques pour
justifier de sa situation). Si aucun essai inter-laboratoires n'a t
effectu sur la combinaison mthode/matriau dessai considre, une
estimation de lcart type de reproductibilit H pour une concentration
c de l'analyte suprieure 120 ppb environ peut gnralement tre
obtenue en utilisant la fonction de Horwitz, H = 0.02c
0.8495
, les deux
variables tant exprimes comme des fractions de la masse.
(L'estimation de Horwitz varie normalement du simple au double par
rapport aux rsultats observs lors d'tudes collaboratives). On a
observ que la fonction de Horwitz est incorrecte pour des
concentrations infrieures 120 ppb environ, et dans ce cas une
fonction modifie est plus approprie.21, 25 Toutes ces informations
peuvent tre intgres au domaine de la validation interne avec des
changements minimes.
Les statistiques provenant des essais daptitude technique sont tout

particulirement intressantes parce qu'elles fournissent des
informations d'ordre gnral sur l'ampleur des biais combins de
laboratoire et de mthode; dans certains cas spcifiques, le participant
obtient, quant lui, des informations sur l'erreur totale. Des statistiques
telles que lcart type consolid des rsultats des participants, pour un
analyte au cours dun service dessai inter-laboratoire peuvent en
principe tre utilises de la mme faon que lcart type de
reproductibilit inter-laboratoire, par exemple, pour obtenir une valeur
raisonnable de l'incertitude globale comparer avec des estimations
individuelles provenant de validations internes. En pratique il peut tre
plus difficile d'avoir accs aux statistiques provenant des essais
daptitude technique car elles ne sont pas systmatiquement
rpertories et publies, comme c'est le cas lors d'essais inter-
laboratoires (souvent elles ne sont disponibles que pour les
participants). Bien sr, si l'on doit utiliser de telles statistiques il faut
qu'elles fassent rfrence la matrice et la concentration de l'analyte
appropries. Les diffrents participants des programmes dessais
daptitude technique peuvent galement valuer la validit de leur
estimation de l'incertitude en comparant leurs rsultats avec les valeurs
assignes de plusieurs sries successives26. Cependant il s'agit l d'une
activit continue, qui par consquent ne ressort pas stricto sensu du
domaine de comptence de la validation interne (qui est un vnement
singulier).
Si un matriau de rfrence certifi (MRC) est disponible, un test interne
permet au laboratoire d'valuer les biais combins du laboratoire et de

la mthode en analysant le MRC un certain nombre de fois. L'estimation
du biais combin est la diffrence entre la moyenne des rsultats et la
valeur certifie.
Les matriaux de rfrence certifis adquats ne sont pas toujours
disponibles, aussi peut-on se trouver dans lobligation d'utiliser d'autres
matriaux. Parfois des matriaux restant aprs des essais daptitude
technique sont utiliss cet effet et, mme si les grandeurs assignes
ces matriaux peuvent prsenter des incertitudes sur les valeurs
desquelles on peut sinterroger, leur utilisation permet cependant une
vrification du biais global. De faon spcifique, les valeurs assignes
aux essais daptitude technique sont gnralement choisies pour fournir
une estimation avec le minimum de biais, par consquent un test du
biais partir dun tel matriau est une pratique tout fait raisonnable. Il
existe aussi la possibilit d'utiliser des informations partir de tests
dajouts doss et de recouvrement,4 pour fournir des estimations de ces
biais, mme s'il peut y avoir des sources d'incertitude non mesures par
ces techniques.
Couramment l'effet le moins reconnu en matire de validation est celui

d la variation des matrices l'intrieur de la catgorie de matriau
dessai dfini. L'exigence thorique pour pouvoir estimer ce composant
de l'incertitude serait d'analyser en une seule fois un ensemble
reprsentatif des matriaux dessai, en valuant leurs biais individuels et
en calculant la variance de ces biais. (Le fait d'analyser en une seule fois
signifie que des biais de plus hauts niveaux n'ont pas d'incidence sur la
variance. Si un large intervalle de concentration est concern, il faut
prendre en considration lvolution du biais en fonction de la
concentration).
Si les matriaux reprsentatifs sont des matriaux de rfrence certifis,
les biais peuvent tre directement valus comme tant les diffrences
entre les rsultats et les valeurs de rfrence, et toute la procdure est
directe. Dans le cas plus probable o le nombre de matriaux de
rfrence disponibles est insuffisant, on doit parfois faire appel des
tests de recouvrement avec une gamme de matriaux dessais types, en
procdant avec tout le soin
que cela mrite. Actuellement il existe fort peu de donnes quantitatives

quant lordre de grandeur des incertitudes provenant de cette source,
mme si dans certains cas on suspecte qu'elles sont importantes.
5 CONDUITE DES ETUDES DE VALIDATION
La conception dtaille et la ralisation des tudes de validation de

mthode sont des sujets traits de faon approfondie dans d'autres
documents, et ils ne seront donc pas repris ici. Cependant, les principes
les plus importants qui sont pertinents, sont pris en considration ci-
dessous:
Il est essentiel que des tudes de validation soient reprsentatives.

C'est--dire que, dans la mesure du possible, les tudes devraient tre
conduites pour fournir une reprsentation raliste du nombre et et de
ltendue des effets intervenants lors de l'utilisation normale de la
mthode, et conduite galement pour couvrir les domaines de
concentration et les types d'chantillons inclus dans le champ
dapplication de la mthode. Lorsquun facteur (ex : la temprature
ambiante) a vari significativement et de manire alatoire au cours
d'une tude de fidlit, par exemple, les effets de ce facteur
apparaissent directement dans la variance observe et ne ncessitent
pas d'tude supplmentaire, sauf si une optimisation de la mthode est
souhaitable par la suite.
Dans le contexte de la validation de mthode, la variation

reprsentative signifie que le facteur observ doit prsenter une
distribution de valeurs en accord avec le domaine de variation attendu
du paramtre en question. Pour des paramtres mesurables en continu,
il peut s'agir dun domaine de variation autoris, d'une incertitude
dclare ou dun domaine de variation attendu ; pour des facteurs
discontinus, ou pour des facteurs avec des effets imprvisibles comme la
matrice d'chantillon, un intervalle reprsentatif correspond la
diversit des types ou niveaux de facteur autoriss ou rencontrs lors
de l'utilisation normale de la mthode. Idalement, la reprsentativit
ne s'applique non pas seulement la fourchette de valeurs mais aussi
leur distribution. Malheureusement, il est souvent trop onreux de
mettre en place la variation totale de nombreux facteurs de nombreux
niveaux. Cependant, dans la plupart des cas pratiques, le minimum
acceptable est de mettre en place des essais bass sur les points
extrmes de lintervalle attendu, ou sur un intervalle plus large que celui
prvu dans la mthode.
Lorsque l'on choisit des facteurs de variation, il est important de

s'assurer que les effets les plus importants sont le plus tudis possible.
Par exemple, quand la variation dun jour lautre (pouvant tre due
aux effets de rtalonnage) est importante compare la rptabilit,
deux dterminations par jour pendant cinq jours fourniront une
meilleure estimation de la fidlit intermdiaire que cinq dterminations
par jour pendant seulement deux jours. Dix dterminations individuelles
sur plusieurs jours distincts seraient prfrables encore, condition

d'exercer un contrle suffisant, mme si cela ne fournit pas
d'information supplmentaire sur la rptabilit observe au cours dune
mme journe.
Il est vident que lorsque lon prvoit des tests dhypothse, toute tude
devrait tre capable de dtecter de tels effets avant qu'ils ne deviennent
importants pratiquement parlant (c'est--dire comparables la plus
grande composante de l'incertitude).
De plus, les considrations suivantes peuvent se rvler importantes:
Lorsque l'on sait ou suspecte que des facteurs interagissent entre

eux, il est important de s'assurer que l'effet de l'interaction est pris
en compte. Pour ce faire, on peut soit procder une slection
alatoire diffrents niveaux des paramtres qui interagissent, soit
concevoir avec une attention particulire un systme adapt
lobtention des effets dinteraction ou des informations sur la
covariance.
Lorsque lon procde des tudes du biais global, il est important que
les matriaux de rfrence et les valeurs soient en rapport avec les
matriaux soumis aux essais de routine.
6 PORTEE DES ETUDES DE VALIDATION
La porte souhaitable de la validation par un laboratoire donn d'une

mthode nouvelle, modifie ou mal connue, dpend en partie du statut
actuel de la mthode et de la comptence du laboratoire. Ci-dessous
nous mettons des suggestions sur la porte de la validation et des
mesures de vrification dans diverses situations. Nous supposons dans
l'ensemble que la mthode en question est destine une utilisation de
routine, sauf exception clairement indique.
6.1 Le laboratoire est tenu dutiliser une methode

entierement validee
La mthode a t tudie lors d'un essai interlaboratoires et le

laboratoire se doit donc de vrifier qu'il est en mesure d'obtenir les
caractristiques de performance de la mthode ayant t publies (ou
sinon qu'il est capable de rpondre aux exigences de la tche
analytique). Le laboratoire devrait entreprendre des tudes de fidlit,
des tudes de biais (y compris des tudes de variation de la matrice), et
ventuellement des tudes de linarit, certains essais nanmoins, et
par exemple celui de la robustesse pouvant tre laisss de ct.
6.2 Le laboratoire doit utiliser une methode entierement

validee mais avec une nouvelle matrice
La mthode a t tudie lors d'un essai interlaboratoires et le

laboratoire se doit donc de vrifier que la nouvelle matrice n'introduit
pas de nouvelles sources d'erreur dans le systme. La mme porte de
ltude de validation que prcdemment est requise.
6.3 Le laboratoire doit utiliser une methode bien etablie mais

qui n'a pas fait l'objet d'une etude collaborative
La mme porte de ltude de validation que prcdemment est requise.
6.4 La methode a fait l'objet d'une publication dans la

litterature scientifique celle-ci fournissant quelques
caracteristiques analytiques
Le laboratoire devrait entreprendre des tudes de fidlit, des tudes de

biais (incluant des tudes de variation de la matrice), ainsi que des
tudes de robustesse et de linarit.
6.5 La methode a fait l'objet d'une publication dans la

litterature scientifique, mais sans precision sur les
caracteristiques, ou bien la methode a t developpee en interne
Le laboratoire devrait entreprendre des tudes de fidlit, des tudes de

biais (incluant des tudes de variation de la matrice), ainsi que des
tudes de robustesse et de linarit.
6.6 la methode est empirique
Dans une mthode empirique la quantit estime est tout simplement le

rsultat obtenu en suivant la procdure spcifie. Elle diffre des
mesurages visant valuer des grandeurs indpendantes de la
mthode, comme la concentration d'un analyte donn dans un
chantillon, dans le fait que le biais de la mthode est
conventionnellement nul et que la variation de la matrice (dans la
catgorie dfinie) n'est pas considrer. Le biais de laboratoire quant
lui ne peut pas tre ignor, mais il a tendance tre difficilement valu
au moyen d'une tude intra-laboratoire. De plus, les matriaux de
rfrence sont rarement disponibles. En l'absence de donnes provenant
dtude collaborative, on peut valuer la fidlit inter laboratoire en
utilisant une tude de robustesse spcialement conue cet effet ou en

utilisant la fonction de Horwitz.
6.7 l'analyse est ad hoc
On a parfois besoin de recourir une analyse ad hoc pour estimer une

valeur de faon peu prcise moindre frais et sans exigence pousse.
L'effort dispens des fins de validation est par consquent strictement
limit. Les biais devraient tre tudis par des mthodes comme
l'estimation du recouvrement ou des ajouts doss, de plus la fidlit
peut tre tudie par rplique de plusieurs mesures.
6.8 changements de personnel et d' equipement
On peut donner des exemples importants suivants: changements

concernant les principaux instruments; nouveaux lots de ractifs
pouvant fortement varier (par exemple les anticorps polyclonaux);
changements touchant les locaux du laboratoire; mthodes utilises
pour la premire fois par un nouveau personnel ; ou bien une mthode
valide, employe aprs une priode de mise en sommeil. Il s'agit alors
et avant tout de prouver qu'aucune modification dltre n'est
survenue. La vrification minimale requise est une simple tude de biais
base sur une tude de type avant et aprs sur des matriaux dessai
types ou sur des matriaux de contrle. En gnral, les tests effectus
devraient mettre en vidence l'impact possible du changement sur la
procdure analytique.
7 RECOMMANDATIONS
Les recommandations suivantes sont formules pour l'utilisation de la

validation intra-laboratoire de la mthode:
A chaque fois que cela est possible et pertinent, un laboratoire
devrait utiliser une mthode d'analyse dont les caractristiques de
performance ont t values lors d'un essai interlaboratoires
conforme un protocole international.
Quand de telles mthodes ne sont pas disponibles, une mthode doit
tre valide en interne avant d'tre utilise pour produire des
donnes analytiques pour un client.
Pour une validation interne, il faut que le laboratoire choisisse des
caractristiques d'valuation adquates dans la liste suivante:
domaine dapplication, spcificit, talonnage, justesse, fidlit,
domaine de validit, limite de quantification, limite de dtection,
sensibilit, robustesse et adquation lusage prvu. Le laboratoire
doit tenir compte des besoins du client lors du choix des
caractristiques dterminer.
On doit fournir aux clients du laboratoire la preuve que ces
caractristiques ont bien t values s'ils en font la demande.
8 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Performance Studies", W Horwitz, Pure Appl. Chem., 1988, 60, 855
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methods, including quantification and detection capabilities Pure and
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23. ISO 11843. Capability of detection. (Plusieurs parties). International

Standards Organisation, Genve.
24. M. Thompson, Analyst, 2000, 125, 2020-2025
25. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb

concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency
testing M Thompson, Analyst, 2000, 125, 385-386.
26. How to combine proficiency test results with your own uncertainty
estimate - the zeta score, Analytical Methods Committee of the Royal
Society of Chemistry, AMC Technical Briefs, publi par M. Thompson,
AMC Technical Brief No. 2, www.rsc.org/lap/rsccom/amc
ANNEXE A: NOTES SUR LES CONDITIONS REQUISES POUR

L'ETUDE DES CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE DUNE
METHODE
Les conditions gnrales requises pour les caractristiques individuelles

de performance d'une mthode sont les suivantes.
A1 Domaine dapplication
Aprs validation, la documentation devrait fournir, en plus de toute

spcification de la performance, les informations suivantes:
l'identification de l'analyte, y compris la spcification si

ncessaire (Exemple: arsenic total);
le domaine de concentration couvert par la validation (Exemple:
0-50 ppm);
la spcification des types de matrices du matriau dessai
couverte par la validation (Exemple: vin rouge sec);
un protocole dcrivant l'quipement, les ractifs, la procdure (y
compris la variation autorise dans les instructions spcifies, par
ex. chauffer 100 5 pendant 30 5 minutes), ltalonnage et
les procdures qualit, ainsi que toute mesure de prcaution ou
de scurit ventuellement ncessaire;
l'application prvue et ses exigences critiques d'incertitude
(Exemple: L'analyse alimentaire des fins de slection rapide.
L'incertitude normale (standard) u(c) du rsultat c devrait tre
infrieure 0.1c.).
A2 Spcificit
La spcificit se dfinit comme tant le niveau de capacit dune

mthode quantifier l'analyte exactement en prsence d'interfrents.
Dans l'idal, on devrait valuer la spcificit pour chaque interfrent
important susceptible d'tre prsent. Il est particulirement important
de vrifier les interfrents susceptibles, sur la base de principes
chimiques, de donner une rponse lessai. Par exemple, on peut
raisonnablement s'attendre ce que des ractions colorimtriques pour
l'ammoniac rpondent aux amines aliphatiques primaires. Il peut se
rvler peu ou pas pratique de tenir compte et d'valuer chaque
interfrent potentiel; dans ce cas, on recommande denvisager les
situations les plus dfavorables susceptibles de se produire. Le principe
gnral est que la spcificit devrait tre suffisamment bonne pour ne

pas avoir se proccuper des interfrences.
Dans de nombreux types d'analyses, la spcificit est essentiellement

une valuation qualitative fonde sur la rponse, significative ou non,
des tests appropris pour les tudes des interfrences. Cependant, il
existe des mesures quantitatives utiles. Par exemple l'indice de
spcificit ban/bint, o ban reprsente la sensibilit de la mthode (pente
de la droite dtalonnage) et o bint reprsente la pente de la rponse
produite indpendamment par un interfrent potentiel; cet indice fournit
une mesure quantitative de l'interfrence. On peut dterminer bint de
faon approximative en excutant la procdure sur un blanc matrice et
sur le mme blanc supplment avec l'interfrent potentiel une
concentration donne adapte. Si aucun blanc matrice n'est disponible
et qu'on utilise la place un matriau type, on ne peut estimer bint
partir d'une exprience aussi simple que si l'on supposait que les effets
mutuels de matrice sont absents. Notons qu'il est plus facile de
dterminer bint en l'absence de l'analyte, car il existe le risque de
confondre son effet avec un autre genre d'interfrence lorsque la
sensibilit du dosage de l'analyte est elle mme affecte par l'interfrent
(effet matrice).
A3 Etalonnage et linearite
Si l'on exclut les erreurs grossires de prparation des talons, les

erreurs dtalonnage constituent gnralement (mais pas toujours) une
composante mineure du budget total de l'incertitude, et l'on peut en
gnral raisonnablement les rpartir dans diverses catgories que lon
estime par des mthodes dites descendantes. Par exemple, les erreurs
alatoires rsultant de ltalonnage font partie du biais de srie, qui est
valu de manire globale, tandis que des erreurs systmatiques
provenant de cette source peuvent se retrouver dans le biais du
laboratoire, valus eux aussi de manire globale. Nanmoins, il est
utile de connatre certaines caractristiques de ltalonnage ds le
dpart de la validation de la mthode, car elles ont une incidence sur la
stratgie adopter pour la ralisation optimale de la procdure. Dans
cette catgorie il est question de savoir sil est plausible que la fonction
dtalonnage (a) soit linaire, (b) passe par l'origine et (c) ne soit pas
affecte par la matrice du matriau dessai. Les procdures dcrites
dans le prsent document s'appliquent aux tudes dtalonnage dans le
cadre dune validation, celles-ci sont ncessairement plus exigeantes
que celles appliques ltalonnage ralis lors d'analyses de routine.
Par exemple, une fois que l'on a tabli lors de la validation que la
fonction dtalonnage est linaire et passe par l'origine, on peut
instaurer une stratgie dtalonnage beaucoup plus simple au moment

de lutilisation en routine (par exemple, un plan dexprience avec deux
points rpts). Normallement, les erreurs provenant de cette mthode
simplifie dtalonnage se rpartissent dans le cadre de la validation,
dans des niveaux derreurs suprieurs.
A3.1 Linarit et ordonne l'origine
On peut tester la linarit de manire informelle en examinant la

reprsentation graphique des erreurs rsiduelles produites par la
rgression linaire des rponses sur les concentrations dans un
ensemble dtalonnage appropri. Tout graphe en forme de courbe
suggre un manque dajustement d une fonction dtalonnage non
linaire. Un test statistique de signification peut tre entrepris en
comparant la variance de lerreur dajustement avec celle due l'erreur
pure. Cependant il existe d'autres causes derreur dajustement que la
non linarit, et qui se produisent lors de certains types dtalonnages
analytiques ; il faut donc utiliser le test statistique de signification en
conjonction avec la reprsentation graphique des erreurs rsiduelles.
Bien que largement utilis comme indicateur de la qualit de
lajustement, le coefficient de corrlation porte confusion; il n'est pas
appropri comme test de linarit et ne devrait pas tre utilis.
Le plan dexprience est de la plus grande importance pour les tudes

derreur dajustement, car il est facile de confondre la non linarit avec
la drive. Des mesures rptes sont ncessaires pour fournir une
estimation de l'erreur pure s'il n'y a pas d'estimation indpendante. En
l'absence de spcifications, les consignes suivantes devraient tre
appliques:
Il devrait y avoir au moins six calibrants;

Les calibrants devraient tre placs intervalles rguliers sur
toute la gamme de concentration tudie;
La gamme devrait englober 0-150% ou 50-150% de la
concentration susceptible d'tre rencontre, selon le pourcentage
le plus appropri;
Les calibrants devraient tre analyss deux fois au minimum et
de prfrence trois fois ou plus, dans un ordre alatoire.
Aprs un premier essai dajustement partir dune rgression linaire

simple, les erreurs rsiduelles devraient tre examines pour trouver les
modles adapts. L' htroscdasticit est assez frquente dans
ltalonnage analytique et un modle la suggrant signifie que les
donnes de ltalonnage doivent de prfrence tre traites au moyen

de la rgression pondre. Le non recours la rgression pondre dans
ces circonstances pourrait occasionner des erreurs exagres dans la
partie infrieure de la courbe dtalonnage.
Ltude de lerreur dajustement peut tre effectue en utilisant soit la

rgression simple soit la rgression pondre. Une tude de lordonne
l'origine testant si elle est significativement diffrente de zro peut
galement tre effectu sur cette donne sil n'y a pas derreur
dajustement significative.
A3.2 Etude de leffet matrice
Ltalonage se trouve grandement simplifi si les talons peuvent tre

prpars partir dune solution simple de l'analyte. Les effets d'une
possible erreur de matrice doivent tre valus lors de la validation si
cette stratgie est adopte. On peut tester les effets matrice en
appliquant la mthode des ajouts d'analyte (appele aussi ajouts de
standard) une solution dessai drive d'un matriau dessai type. Il
faudrait effectuer lessai de faon obtenir la mme dilution finale que
la procdure normale, et la gamme des ajouts devrait recouvrir la mme
fourchette que celle de la validation de ltalonnage dfinie par la
procdure. Si ltalonnage est linaire, la pente de la fonction habituelle
dtalonnage peut tre compare la pente de la reprsentation
graphique des ajouts doss, pour rechercher une diffrence significative.
Labsence de signification indique qu'il n'existe pas d'effet matrice
dtectable. Si ltalonnage n'est pas linaire on a besoin d'une mthode
plus complexe avec un test statistique de signification, mais une
comparaison visuelle des concentrations gales pourra gnralement
suffire. Labsence de signification dans cet essai indique souvent que
l'effet de variation de la matrice [Section A13] est aussi absent.
A3.3 Procdure finale dtalonnage
On peut tre amen valider sparment la stratgie dtalonnage telle

quelle est dfinie dans la procdure, bien que les erreurs impliques
contribuent des incertitudes estimes conjointement. Il est important
de noter ici que les incertitudes estimes partir des plans dexprience
spcifiques pour la linarit etc,.. seront plus petites que celles issues de
ltalonnage simple, dfini dans le protocole de la procdure
A4 Justesse
A4.1 Evaluation de la justesse
La justesse est le degr de concordance entre le rsultat dun essai et la

valeur de rfrence accepte du paramtre mesur. La justesse
s'exprime quantitativement en termes de biais; plus le biais est petit,
plus la justesse est grande. Le biais est typiquement dtermin en
comparant la rponse de la mthode un matriau de rfrence
prsentant une valeur connue affecte. Le test statistique de
signification est recommand. Quand l'incertitude de la valeur de
rfrence n'est pas ngligeable, l'valuation des rsultats devrait tenir
compte de l'incertitude lie au matriau de rfrence ainsi que de la
variabilit statistique.
A4.2 Conditions appliquer pour les expriences de justesse
Des biais peuvent apparatre diffrents niveaux d'organisation dans un

systme analytique, par exemple, le biais de srie, le biais de laboratoire
et le biais de la mthode. Il est important de savoir quel biais est trait
par les diffrentes mthodes dtude des biais. En particulier:
La moyenne d'une srie de mesurages d'un matriau de

rfrence, raliss ensemble au cours de la mme srie, donne
des informations sur la somme des effets de mthode, de
laboratoire et de srie pour cette srie en particulier. Puisque l'on
suppose que l'effet de srie est alatoire dune srie lautre, la
variation du rsultat dune srie lautre sera plus importante
que celle que lon pourrait attendre partir de la dispersion
observable des rsultats; il faut en tenir compte dans l'valuation
des rsultats (par exemple, en comparant le biais mesur avec
lcart type entre sries dtermin par ailleurs).
La moyenne des analyses d'un matriau de rfrence, rptes
sur plusieurs sries permet d'estimer les effets combins des
biais produits par la mthode et par le laboratoire pour un
laboratoire donn (sauf quand la valeur est attribue en utilisant
la mthode en question).
A4.3 Valeurs de rfrence utiliser pour les expriences de

justesse
A4.3.1 Matriaux de Rfrence Certifis (MRC)
Les MRC sont raccords aux talons internationaux, avec une incertitude
connue, et peuvent, par consquent, tre utiliss pour aborder

simultanment tous les aspects des biais (mthode, laboratoire, et intra-
laboratoire), en supposant qu'il n'y a pas derreur li la matrice. En
consquence, on devrait faire usage des MRC pour la validation de la
justesse, lorsque cela est possible en pratique. Il faut s'assurer que les
incertitudes des valeurs certifies sont suffisamment petites pour
permettre la dtection d'un biais de grande ampleur. Quand elles ne le
sont pas, on recommande malgr tout l'utilisation des MRC, mais des
vrifications supplmentaires doivent tre effectues.
Une exprience de justesse type engendre une rponse moyenne pour

un matriau de rfrence. Au moment de l'interprtation du rsultat , il
faut prendre en considration l'incertitude associe la valeur certifie
ainsi que l'incertitude due la variation statistique dans le laboratoire.
Ce dernier lment peut tre fond sur lcart type intra-srie, inter-
sries, ou sur une estimation de lcart type inter-laboratoires; tout
dpendra alors du but de l'exprience (statistique ou matriaux). Quand
l'incertitude de valeur certifie est petite, un test de Student- t est
gnralement pratiqu, en utilisant le niveau de confiance appropri.
Lorsque cela se rvle ncessaire et possible en pratique, on devrait

examiner un certain nombre de MRC appropris, avec les matrices et les
concentrations d'analyte adquates. Quand c'est le cas, et que les
incertitudes des valeurs certifies sont infrieures celles des rsultats
d'analyse, il serait raisonnablement bon d'utiliser la rgression simple
pour valuer les rsultats. Ainsi on pourrait exprimer le biais en fonction
de la concentration et il pourrait se rvler comme tant une ordonne
lorigine diffrente de zro (biais transitionnel ou constant) ou comme
tant une pente diffrente de 1 (biais de rotation or proportionnel). Il
faut faire preuve de prudence lors de l'interprtation des rsultats
lorsque la gamme de matrices est importante.
A4.3.2 Matriaux de rfrence :
Quand des Matriaux de Rfrence Certifis (MRC) ne sont pas

disponibles, ou en complment des MCR, on peut faire usage de tout
matriau suffisamment caractris pour le besoin prsent (un matriau
de rfrence10), en ne perdant jamais de vue que, si un biais insignifiant
n'est pas une preuve de l'absence de biais, en revanche un biais
significatif sur quelque matriau que ce soit doit tre tudi de faon
approfondie. Les matriaux de rfrence comprennent par exemple: des
matriaux caractriss par un fournisseur de matriaux de rfrence,
mais dont les valeurs ne sont pas accompagnes par des donnes
d'incertitude ou sont qualifies autrement; des matriaux caractriss

par un fabricant du matriau; des matriaux caractriss dans le
laboratoire pour tre utiliss comme matriaux de rfrence; des
matriaux soumis un essai comparatif restreint, ou distribus lors d'un
test daptitude technique. Mme si la traabilit de ces matriaux nest
pas parfaite, il est nettement prfrable de les utiliser plutt que de ne
procder aucune valuation des biais. Ces matriaux seront utiliss
autant que possible de la mme manire que des MRC, cependant, en
l'absence de donnes d'incertitude, tout test statistique de signification
reposera entirement sur la fidlit observable des rsultats.
A4.3.3 Utilisation d'une mthode de rfrence
On peut en principe utiliser une mthode de rfrence pour tester les

biais dune autre mthode en cours de validation. C'est une possibilit
trs utile quand on veut vrifier une alternative /ou une modification
d'une mthode courante tablie dj valide et utilise par le
laboratoire. Les deux mthodes sont utilises pour analyser un certain
nombre de matriaux dessais types, recouvrant de faon bien rpartie
de prfrence, un domaine de concentration pertinent. Une comparaison
des rsultats sur le domaine l'aide d'une mthode statistique
approprie (par exemple un test-t bilatral, avec les vrifications
ncessaires d'homognit de variance et de normalit) mettrait en
vidence tout biais entre les mthodes.
A4.3.4 Utilisation des ajouts doss / recouvrement
En l'absence de matriaux de rfrence, ou pour tayer les tudes

partir de matriaux de rfrence, le biais peut tre tudi grce des
ajouts doss et ltude de recouvrement. Un matriau dessai type est
analys par la mthode valider la fois dans son tat d'origine et
aprs ajout dos d'une masse connue de l'analyte. La diffrence entre
les deux rsultats, exprime en proportion de la masse ajoute est
appele recouvrement de substitution ou parfois recouvrement
marginal. Des recouvrements sensiblement diffrents de 1 indiquent
qu'un biais affecte la mthode. Au sens strict, les tudes de
recouvrement ici dcrites n'valuent que le biais d aux effets s'exerant
sur l'analyte ajout; les mmes effets ne s'appliquent pas
ncessairement dans la mme mesure l'analyte natif, et des effets
supplmentaires peuvent s'appliquer sur lui. Les tudes d'ajouts doss
et de recouvrements sont par consquent fortement sujettes
l'observation suivante: mme si un bon recouvrement n'est pas une
garantie de justesse, un mauvais recouvrement est certainement une

indication d'un manque de justesse. Des mthodes concernant la
manipulation des donnes de lajout dos/recouvrement ont t traites
en dtail ailleurs.4
A5 Fidelite
La fidlit est ltroitesse daccord entre des rsultats dessais

indpendants obtenus dans des conditions bien stipules. Elle est
gnralement dfinie en termes dcart type ou de coefficient de
variation. La distinction entre la fidlit et le biais est fondamentale,
mais dpend du niveau auquel le systme analytique est considr.
Ainsi, du point de vue dune dtermination donne, toute dviation
affectant ltalonnage de la srie serait perue comme un biais. Du point
de vue de l'analyste passant en revue une anne de travail, le biais de
srie sera diffrent chaque jour et agira comme une variable alatoire
avec une fidlit associe. Les conditions stipules pour l'valuation de
la fidlit tiennent compte de cette diffrence de point de vue.
Pour la validation interne, deux types de conditions sont pertinents: (a)

la fidlit dans des conditions de rptabilit, dcrivant les variations
observes pendant une seule srie danalyse prsentant une esprance
statistique de 0 et un cart type r , et (b) la fidlit inter-sries
dcrivant les variations du biais de srie run avec une esprance de 0 et
un cart type run . Gnralement ces deux sources d'erreurs affectent
les rsultats d'analyse individuels, qui par consquent ont une fidlit
tot = ( 2r n + 2run )
12
combine , avec n nombre de rsultats rpts
obtenus l'intrieur d'une mme srie exprims sous la forme de leur
moyenne dans les rapports dtude. Les deux estimations de la fidlit
peuvent tre obtenues plus simplement en analysant le matriau dessai
slectionn en double pendant un certain nombre de sries successives.
Les divers composants de la variance peuvent alors tre calculs en
appliquant une analyse unidirectionnelle de la variance. Chaque analyse
duplique doit tre issue dune mise en oeuvre de la procdure de faon
indpendante, que lon applique un chantillon indpendant du
matriau dessai. Par une autre approche, la fidlit combine tot peut
tre directement value en procdant lanalyse du matriau dessai
une seule fois au cours de sries successives, et en estimant lcart type
partir de l'quation classique. (Notons que les cart types observs
portent gnralement le symbole s, pour les distinguer des carts types
vrais ).
Il est important que les valeurs de fidlit soient reprsentatives des

conditions dessai probables. Premirement, la variation dans les
conditions au cours des sries doit reflter ce qui se passerait
normalement dans le laboratoire dans les conditions de lutilisation en
routine de la mthode. Par exemple, des variations dans les lots de
ractifs, dans les analystes et les instruments devraient tre
reprsentatives. Deuximement, le matriau dessai employ devrait
tre typique, en termes de matrice et (idalement) d'tat de
fractionnement, des matriaux susceptibles d'tre rencontrs dans
l'application en routine. Il en rsulte que des matriaux dessai vrais ou,
un degr moindre, des matriaux de rfrence correspondants la
matrice seraient adquats, mais les solutions synthtiques ne le seraient
pas. Notons galement que les MRC et les matriaux de rfrence
prpars sont frquemment beaucoup plus homognes que des
matriaux dessai typiques, et la fidlit calcule partir de leur analyse
peut par consquent sous-estimer la variation que l'on observera pour
les matriaux dessai.
La fidlit varie souvent en fonction de la concentration de l'analyte. On

suppose gnralement que i) il ny a pas de changement de la fidlit en
fonction du niveau de l'analyte, ou ii) lcart type est proportionnel , ou
dpend linairement du niveau de l'analyte. Dans les deux cas, il faut
vrifier la supposition de dpart si l'on s'attend ce que le niveau de
l'analyte varie de faon substantielle (c'est--dire de plus de 30%
environ par rapport sa valeur centrale). L'exprience la plus
conomique est probablement de procder une simple valuation de la
fidlit au niveau des, ou proche des, points extrmes du domaine
dapplication, en l'accompagnant d'un test statistique appropri appliqu
sur la diffrence de variance. Le test F est adapt lorsque lerreur suit
une distribution normale.
Des donnes sur la fidlit peuvent tre obtenues partir d'un grand
nombre d'ensembles de conditions diffrents, en plus des conditions les
plus simples qui sont celles de la rptabilit et celles inter-sries,
stipules ici, il peut tre pertinent d'acqurir des informations
supplmentaires. Par exemple, il peut tre utile, pour l'valuation des
rsultats, ou pour amliorer le mesurage, d'avoir des indications
spares sur les effets des sries et des oprateurs, d'un jour l'autre
ou au cours d'une mme journe ou sur la fidlit laquelle on peut
prtendre en utilisant un ou plusieurs instruments. Une gamme de
diffrents plans dexprience et de diffrentes techniques d'analyse
statistique est disponible, et l'on recommande fortement de toujours
bien choisir son plan dexprience pour de telles tudes.
A6 RECOUVREMENT
Des mthodes d'valuation du recouvrement sont traites dans le

chapitre consacr aux mthodes d'valuation de la justesse (ci-dessus).
A7 Domaine de validit
Le domaine de validit est l'intervalle de concentration de l'analyte

l'intrieur duquel la mthode peut tre considre comme tant valide.
Il est important de bien comprendre que ce domaine n'est pas
ncessairement identique au domaine utile de ltalonnage. Tandis que
ltude dtalonnage peut recouvrir un large domaine de concentration,
le restant de la validation (qui reprsente gnralement une partie
beaucoup plus importante en termes d'incertitude) recouvrira un
domaine plus restreint. Dans la pratique, la plupart des mthodes ne
seront valides qu' un ou deux niveaux de concentration. On peut
considrer le domaine de validit comme une extrapolation raisonnable
de ces points sur lchelle de concentration.
Quand l'utilisation de la mthode se focalise sur une concentration

donne bien suprieure la limite de dtection, une validation proche de
ce niveau critique prcis serait approprie. Il est impossible de dfinir
une extrapolation gnrale sre de ce rsultat d'autres concentrations
de l'analyte, car beaucoup d'lments dpendent du systme analytique
individuel. Par consquent le rapport de l'tude de validation devrait
prciser lintervalle autour de la valeur critique, dans lequel, la personne
qui procde la validation, en recourant un jugement professionnel,
considre que l'incertitude estime est vraissemblable.
Quand le domaine de concentration tudi s'approche de zro, ou de la

limite de dtection, il est incorrect de faire l'hypothse soit d'une
incertitude absolue constante soit d'une incertitude relative constante.
On peut procder une approximation utile de cette situation courante
en posant l'hypothse d'une relation fonctionnelle linaire, avec une
ordonne lorigine positive, entre l'incertitude u et la concentration c,
de la forme suivante
u ( c ) = u0 + c
o reprsente l'incertitude relative estime pour une concentration
bien suprieure la limite de dtection. u0 reprsente l'incertitude type

estime pour une concentration nulle, ce que dans certains cas pourrait
tre estime comme tant c L / 3 . Il serait alors raisonnable de
considrer que le domaine de validit s'tend de zro un petit multiple
entier du point de validation suprieur. Encore une fois il s'agira de
recourir au jugement professionnel.
A8 limite de dtection
En termes gnraux la limite de dtection est la plus petite quantit ou

concentration de l'analyte dans l'chantillon dessai que l'on peut
distinguer de zro de faon fiable.22,23 La limite de dtection ne doit pas
ncessairement faire partie d'une validation pour les systmes
analytiques dans lesquels le domaine de validation ne linclut pas, ni ne
s'en approche.
L'ide peut paratre simple, mais toute la question de la limite de

dtection est en proie aux problmes noncs ci-dessous:
Il existe plusieurs approches conceptuelles sur le sujet, chacune

donne une dfinition quelque peu diffrente de la limite. Les
essais de clarification du sujet semble encore plus confus.
Bien que chacune de ces approches dpende d'une estimation de
la fidlit, ou prs d'une concentration nulle, on ne sait pas
clairement si lon doit appliquer des conditions de rptabilit ou
quelque autre condition pour l'estimation.
Sauf dans les cas o l'on a accs une quantit exceptionnelle
de donnes, les estimations de la limite de dtection seront
sujettes une variation alatoire assez importante.
Les estimations de la limite de dtection tendent souvent tre
sous values cause de facteurs oprationnels.
Des interfrences statistiques lies la limite de dtection
dpendent de lhypothse de rpartition normale des rsultats,
ce qui est pour le moins douteux aux faibles concentrations.
A des fins pratiques, en matire de validation de mthode, il semble
prfrable de choisir une dfinition simple, conduisant une estimation
rapidement mise en uvre que l'on utilisera seulement caractre
indicatif des fins utiles pour la mthode. Il faut cependant reconnatre
que la limite de dtection telle qu'on l'estime lors de la mise au point de
mthode peut ne pas tre identique sur le plan du concept ou
numriquement la limite utilise pour caractriser une mthode
analytique complte. Par exemple la limite de dtection instrumentale,
telle qu'on la trouve dans la littrature ou dans les brochures
accompagnant les instruments et qui est ensuite ajuste pour la

dilution, se trouve tre souvent trs infrieure une limite pratique de
dtection; elle se rvle donc inadapte pour la validation de mthode.
Par consquent, pour la validation de mthode, on recommande de

fonder l'estimation de fidlit utilise ( $ 0 ) sur au moins 6
dterminations compltes et indpendantes de la concentration de
l'analyte dans un blanc matrice type ou avec un matriau de faible
concentration, sans censurer les rsultats zro ou ngatifs; on calcule
alors la limite de dtection approximative comme 3 $ 0 . Notons qu'avec
le nombre minimal recommand de degrs de libert, cette valeur est
assez incertaine, et peut facilement tre errone dun facteur de deux.
Quand on requiert des estimations plus rigoureuses (par exemple pour
tayer des dcisions prises sur la base de la dtection ou non d'un
matriau), certaines rfrences bibiolgrapliques devraient apporter des
recommandations adaptes (voir par exemple les rfrences 22-23).
A9 Limite de determination ou limite de quantification
Il est parfois utile de dterminer une concentration en dessous de

laquelle la mthode analytique ne peut pas fonctionner avec un degr
acceptable de fidlit. On dfinit parfois arbitrairement cette fidlit
comme tant 10% de lecart-type de lerreur de la mthode, parfois la
limite est tout aussi arbitrairement dfinie comme un multiple fixe
(gnralement 2) de la limite de dtection. Bien quil soit dans une
certaine mesure rassurant d'oprer au del d'une telle limite, nous
devons reconnatre quil s'agit l d'une dlimitation assez artificielle de
l'chelle de concentration: des mesurages infrieurs une telle limite ne
sont pas dpourvues d'informations et peuvent rpondre lattente que
lon fait deux. C'est pourquoi l'utilisation de ce type de limite pour la
validation nest pas recommande ici. Il est prfrable dessayer
d'exprimer l'incertitude de la mesure en tant que fonction de la
concentration, et de comparer cette fonction avec un critre d'aptitude
lessai issu dun accord entre le laboratoire et le client ou l'utilisateur
final des donnes.
A10 Sensibilit
La sensibilit d'une mthode est la pente de la fonction dtalonnage.

Comme elle est souvent arbitraire, dpendant du paramtrage de
linstrument, la sensibilit n'est pas utile en validation, (elle peut
nanmoins tre utile dans les procdures d'assurance qualit, pour
vrifier si la performance d'un instrument se situe un niveau constant

et satisfaisant.).
A11 Robustesse
La robustesse d'une mthode danalyse est la rsistance au changement

des rsultats quelle produit quand des modifications mineures ont lieu
par rapport aux conditions exprimentales dcrites dans la procdure.
Les limites pour des paramtres exprimentaux devraient tre stipules
dans le protocole de la mthode (mme si cela n'a pas toujours t fait
dans le pass); et de telles modifications acceptes, sparment ou
sous quelque combinaison possible, ne devraient pas produire de
changement significatif dans les rsultats produits. (Un changement
significatif se traduit par le fait que la la mthode ne pouvait pas
fonctionner sans franchir des limites d'incertitude adoptes qui
dfinissent laptitude lessai.). Les aspects de la mthode susceptibles
d'avoir une incidence sur les rsultats devraient tre identifis, et leur
influence sur la performance de la mthode devrait tre value en
ayant recours des tudes de robustesse.
La robustesse d'une mthode est teste en introduisant dlibrment de

lgres variations dans la procdure et en observant les effets sur les
rsultats. Il peut tre ncessaire de tenir compte d'un certain nombre
d'aspects de la mthode, mais comme la plupart d'entre eux ont un effet
ngligeable, on peut gnralement en faire varier plusieurs la fois.
Youden13 a dcrit une exprience conomique base sur des modles
factoriels fractionns. Par exemple, il est possible de formuler une
approche en utilisant 8 combinaisons de 7 facteurs variables, c'est--
dire d'observer les rsultats de sept paramtres l'aide de seulement
huit rsultats analytiques. Les approches univaries sont galement
possibles quand une seule variable la fois est modifie.
Les exemples de paramtres que pourrait traiter un test de robustesse

sont les suivants : changements d'instrument, d'oprateur ou de
marque de ractif; concentration d'un ractif; pH d'une solution;
temprature d'une raction; temps imparti l'achvement du processus
etc
A12 Aptitude A LESSAI
L'aptitude lessai, c'est le domaine lintrieur duquel la performance
d'une mthode rpond aux critres qui, daccord entre lanalyste et

lutilisateur final des donnes, dcrivent les besoins de l'utilisateur final.
Par exemple, les erreurs dans les donnes ne devraient pas tre d'une
ampleur telle qu'elles suscitent des dcisions incorrectes plus souvent
quune petite probabilit dfinie; mais ces erreurs ne devraient pas tre
rendues faibles au point que des dpenses inutiles soient demandes
lutilisateur final. On peut fonder les critres d'aptitude lessai sur
quelques unes des caractristiques dcrites dans cette annexe, mais en
fin de compte ces critres s'expriment en terme d'incertitude totale
acceptable.
A13 variation de matrice
Dans de nombreux domaines, la variation de matrice est l'une des

sources d'erreurs les plus importantes mais les moins reconnues en
matire de mesures analytiques. Lorsque nous dfinissons le systme
analytique valider en prcisant, entre autres choses, la matrice du
matriau dessai, des variations considrables peuvent exister
l'intrieur de la catgorie dfinie. Pour donner un exemple extrme,
un chantillon de la catgorie sol peut tre
compos d'argile, de sable, de craie, de latrite (principalement Fe2O3 et
Al2O3), de tourbe, etc.
ou d'un mlange de ceux ci. On peut aisment imaginer que chacun de

ces types produira un effet matrice singulier (unique) sur une mthode
danalyse comme que la spectrophotomtrie d'absorption atomique. Si
nous ne disposons pas d'informations au sujet du type de sols que nous
analysons, il se produira une incertitude supplmentaire dans les
rsultats, du fait de cet effet matrice variable.
Il convient de quantifier sparment les incertitudes lies aux variations

de matrice car elles ne sont prises en compte nulle part ailleurs dans le
processus de validation. On acquiert cette information en recueillant un
ensemble reprsentatif des matrices susceptibles d'tre rencontres
l'intrieur de la catgorie dfinie, toutes ayant des concentrations
d'analytes dans le domaine appropri. Les matriaux sont analyss
conformment au protocole, et l'on estime les biais dans les rsultats.
Sauf quand les matriaux de test sont des MRC, il faut gnralement
procder l'estimation des biais en utilisant les ajouts doss et
lestimation du recouvrement. L'incertitude est estime par lcart type
des biais. (Note: cette estimation renfermera galement une
contribution la variance venant de l'analyse rpte. L'ampleur de
celle-ci sera de 2 r si lajout dos a t employ. Si l'on exige un
2
budget dincertitude strict, ce terme devrait tre dduit de la variance de

la variation de matrice pour viter de le comptabiliser deux fois.)
A14 Incertitude de Mesure rf. roger wood
L'approche formelle de l'estimation de l'incertitude de mesure calcule

une estimation de l'incertitude de la mesure partir d'une quation, ou
modle mathmatique. Les procdures dcrites pour la validation de
mthode sont conues pour assurer que l'quation utilise pour valuer
le rsultat, prenant en compte les erreurs alatoires de tous genres, soit
une expression valable qui englobe tous les effets reconnus et
significatifs sur le rsultat. Il s'en suit, une rserve prs dtaille ci-
aprs, que l'quation ou modle soumis une validation peut tre
utilis(e) directement pour estimer l'incertitude de mesure. Pour ce faire
on suit des principes bien tablis, fonds sur la loi de propagation de
l'incertitude qui, pour des effets d'entre indpendants s'crit:
u(y(x1,x2,...)) = ci2u( xi ) 2
i =1, n
o y(x1,x2,....xn) est une fonction de plusieurs variables indpendantes

x1,x2..., et ci un coefficient de sensibilit valu par lexpression
ci=y/xi, la diffrentielle partielle de y par rapport xi.u(xi) et u(y) sont
des incertitudes type, c'est--dire des incertitudes de mesure exprimes
sous la forme dcart-type. Puisque u(y(x1,x2,...)) est fonction de
plusieurs estimations d' incertitudes distinctes, on y rfre comme tant
l incertitude type combine.
Ainsi, pour estimer l'incertitude de mesure partir de l'quation

y=f(x1,x2...) utilise pour calculer le rsultat, il faut, premirement
tablir les incertitudes u(xi) pour chacun des termes x1, x2 etc, et
deuximement combiner ceux-ci avec les termes supplmentaires
ncessaires pour reprsenter les effets alatoires tels quils sont trouvs
en validation; et enfin il faut tenir compte de tous les effets
supplmentaires. Dans la discussion de la fidlit figurant ci-dessus, le
modle statistique est:
y=f(x1,x2...) + run + e
o e reprsente l'erreur alatoire pour un rsultat donn. Puisque run et

e ont respectivement des carts types run et r qui sont connus
partir des expriences de fidlit, ces carts type, (ou, strictement
parlant, leurs estimations srun et sr) constituent les incertitudes associes
ces termes supplmentaires. Quand on fait la moyenne des rsultats
individuels intra-srie, l'incertitude combine associe ces deux termes
(
est (comme donn prcdemment) s tot = s r2 n + s run 2
)12
. Notons que
lorsquil est dmontr que les termes de fidlit varient avec le niveau
d'analyte, l'estimation d'incertitude pour un rsultat donn doit utiliser le
terme de fidlit appropri pour le niveau donn. Par consquent, la
base servant estimer l'incertitude dcoule directement du modle
statistique pos comme hypothse et test en validation. Il faut ajouter
cette estimation tous les termes supplmentaires ncessaires pour
tenir compte (notamment) du manque d'homognit et de l'effet
matrice (voir section A13). Enfin, l'incertitude type calcule est
multiplie par un 'facteur de couverture', k, pour fournir une incertitude
largie, c'est--dire un intervalle attendu couvrant une large fraction de
la dispertion des valeurs que l'on peut attribuer au mesurande8. Quand
le modle statistique est bien tabli, la distribution reconnue comme
tant normale et le nombre de degrs de libert associs avec
l'estimation est lev, alors on choisit gnralement k comme tant gal
2. L'incertitude largie correspond alors approximativement un
intervalle de confiance de 95%.
Il faut ici ajouter une rserve importante. Quand on teste le modle

statistique pos comme hypothse, des essais imparfaits sont utiliss
par la force des choses. Il a dj t signal que ces essais ne prouvent
pas que quelque effet que ce soit ft identique zro ; ils ne peuvent
montrer seulement qu'un effet est trop petit pour tre dtect
lintrieur de l'incertitude associe au test statistique de signification en
question. Un exemple particulirement important est le test statistique
de signification du biais de laboratoire. D'vidence, s'il s'agit l du seul
test effectu pour confirmer la justesse, il doit rester une incertitude
rsiduelle sur l'absence vritable et effective de biais dans la mthode. Il
s'en suit que quand de telles incertitudes sont significatives par rapport
l'incertitude calcule jusqu'alors, il conviendrait de les prendre en
compte.
Dans le cas d'une valeur de rfrence prsentant une incertitude, le plus

simple est de prendre en compte l'incertitude stipule pour le matriau,
combine avec l'incertitude statistique de la mthode utilise. Une
discussion exhaustive de ce point dpasse la porte du texte ici prsent
; la rfrence biobliographique 9 fournit des dtails supplmentaires.
Cependant, il est important de noter que, si l'incertitude estime
directement partir du modle statistique pos comme hypothse
constitue l'incertitude minimale qui peut tre associe au rsultat
analytique, elle sera presque srement toujours sous estime; de
mme, une incertitude largie fonde sur les mmes considrations et
utilisant k=2 ne constituera pas un intervalle de confiance suffisant.
Le Guide ISO8 recommande que, pour augmenter lintervalle de

confiance, plutt que d'additionner des termes de faon arbitraire, la
valeur de k devrait tre augmente si besoin est. L'exprience pratique
suggre que, pour des estimations de l'incertitude fondes sur un
modle statistique valid, et alors qu'il n'existe aucune preuve au del
des tudes de validation qui renforce la confiance qu'on a dans ce
modle, k ne devrait pas tre infrieur 3. Quand on a de fortes raisons
de souponner que l'tude de validation nest pas exhaustive, k devrait
tre encore augment si ncessaire.
ANNEXE B. CONSIDERATIONS SUPPLEMENTAIRES POUR

L'EVALUATION DE L'INCERTITUDE DANS LES ETUDES DE
VALIDATION
B1 Analyse de la Sensibilit
L'expression de base utilise pour l'valuation de l'incertitude
u(y(x1,x2,...)) = c
i =1, n
2
i u ( xi ) 2
requiert les coefficients de sensibilit ci. Il est courant au cours de

l'valuation de l'incertitude d'observer que, alors qu'un facteur
d'influence donn xi a une incertitude connue u(xi), le coefficient ci n'est
pas suffisamment caractris ou pas immdiatement disponible partir
de l' quation dexpression du rsultat. Ceci est particulirement courant
dans les cas o un effet n'est pas inclus dans l'quation dexpression de
mesure parce qu'il n'est pas normalement significatif, ou parce que la
relation n'est pas suffisamment explique pour justifier une correction.
Par exemple, l'effet de la temprature d'une solution Tsol sur une
procdure d'extraction temprature ambiante est rarement tabli dans
le dtail.
Quand on dsire valuer l'incertitude relative un rsultat soumi un
tel effet, on peut dterminer le coefficient de faon exprimentale. Cela
peut tre fait trs simplement en changeant xi et en observant l'effet sur
le rsultat, d'une faon trs semblable aux essais de robustesse de
base. Dans la plupart des cas, il suffit en premier lieu de choisir tout au
plus deux valeurs pour xi en dehors de la valeur nominale, et de calculer
une pente approximative partir des rsultats observs. Cette pente
nous fournit une valeur approximative pour ci. Le terme ci.u(xi) peut
alors tre dtermin. (Notons qu'il s'agit l d'une mthode pratique pour
dmontrer la signification ou l'absence de signification d'un effet

possible sur les rsultats).
Lors d'une telle exprience, il est important que le changement de

rsultat observ soit suffisant pour permettre un calcul fiable de ci. Cela
est difficile prvoir l'avance. Cependant, pour un intervalle donn o
varie la grandeur d'influence xi, ou alors pour une incertitude largie
relative cette grandeur, dans lesquels on s'attend voir produire un
changement insignifiant sur le rsultat, il est videmment important
d'valuer ci partir dun plus grand intervalle. Par consquent on
recommande, pour une grandeur d'influence avec un intervalle attendu
de a, (o a peut tre, par exemple : lintervalle autoris, l'intervalle
d'incertitude largi ou un intervalle de confiance 95%), que
l'exprience de sensibilit utilise dans la mesure du possible un
changement d'au moins 4a pour garantir des rsultats fiables.
B2 Jugement
Il n'est pas rare d'observer que mme si un effet est reconnu et peut
tre significatif, il n'est pas toujours possible d'obtenir une estimation
fiable de l'incertitude. Dans de telles circonstances, le Guide ISO dit
assez clairement qu'une estimation de l'incertitude effectue par le
professionnel est prfrable au fait de ngliger l'incertitude. Ainsi, quand
on ne dispose pas d'une estimation de l'incertitude pour un effet
potentiellement important, l'analyste devrait se fier son meilleur
jugement pour valuer l'incertitude probable et l'appliquer l'estimation
de l'incertitude combine. La rfrence 8 donne des indications
supplmentaires sur l'utilisation du jugement en matire d'valuation de
l'incertitude.
Recommandations sur lincertitude de mesure

(Rsolution 9/2005)
INTRODUCTION
Il est important que les analystes soient conscients de lincertitude

associe chaque rsultat danalyse et quils estiment cette incertitude.
Lincertitude de la mesure peut tre dtermine par plusieurs mthodes.
Il est demand aux laboratoires danalyse de denres alimentaires
rpondant aux exigences de contrle dutiliser des mthodes ayant fait
lobjet danalyses inter-laboratoires lorsquelles existent et de vrifier
leur application avant de les utiliser comme mthodes usuelles. Ces
laboratoires devraient donc avoir leur disposition une srie de donnes
analytiques pour estimer.
TERMINOLOGIE
La dfinition accepte de lincertitude de mesure1 est la suivante:

paramtre, associ avec le rsultat dun mesurage, qui caractrise la
dispersion des valeurs qui pourraient tre raisonnablement attribues au
mesurande.
NOTES:
1. Le paramtre peut tre par exemple un cart-type (ou un

multiple de celui-ci) ou la demi largeur dun intervalle un
niveau de confiance dtermin.
2. Lincertitude de mesure comprend en gnral plusieurs

composantes; certaines peuvent tre values partir de la
distribution statistique des rsultats dune srie de mesurages et
peuvent tre caractrises par des carts-types exprimentaux.
Les autres composantes qui peuvent tre aussi caractrises par
des carts-types, sont values partir de distributions
prsumes de probabilit bases sur lexprience acquise ou sur
dautres informations.
1
[Il est reconnu que le terme incertitude de mesure est le plus largement utilis par les
organisations internationales et les agences daccrditation. Cependant, la Commission du
Codex Alimentarius sur les mthodes danalyse et dchantillonnage a observ plusieurs
reprises que lexpression incertitude de mesure avait une connotation ngative dans le
contexte lgal et a donc pris note du fait quon pouvait utiliser une expression alternative
quivalente, fidlit (ou fiabilit) de mesure.]
MA-F-AS1-14-INCERT 1
3. Il est entendu que le rsultat dun mesurage est la meilleure

estimation de la valeur dun mesurande et que toutes les
composantes de lincertitude, y compris celles qui proviennent
deffets systmatiques, telles que les composantes associes aux
corrections et aux talons de rfrence, contribuent la
dispersion.
RECOMMANDATIONS
Les recommandations suivantes sont adresses aux gouvernements :
1. Aux fins de lOIV, le terme incertitude de mesure ou fiabilit

de mesure devra tre utilis.
2. Lincertitude de mesure ou fiabilit de mesure associe

tous les rsultats analytiques doit tre estime et doit, sur
demande, tre mise la disposition de lutilisateur (client) des
rsultats.
3. Lincertitude de mesure ou fiabilit de mesure dun rsultat

analytique peut tre estime par diffrentes mthodes, en
particulier celles dcrites par lISO1 et EURACHEM2. Ces
documents recommandent des mthodes bases sur une
approche composant par composant, les donnes concernant la
validation des mthodes, le contrle de qualit interne et les
tests de comptence. Il nest pas ncessaire dentreprendre une
estimation de lincertitude des mesures ou fiabilit des mesures
en utilisant lapproche ISO composant par composant si dautres
formes de donnes sont disponibles et utilises pour estimer
lincertitude ou la fiabilit. Dans de nombreux cas, lincertitude
globale peut tre dtermine par une tude inter-laboratoires
collaborative par un certain nombre de laboratoires et de
matrices en utilisant les protocoles IUPAC/ISO/AOAC
INTERNATIONAL3 ou ISO 57254.
RFRENCES
1. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement, ISO,

Geneva, 1993.
2. EURACHEM/CITAC Guide Quantifying Uncertainty In Analytical

Measurement (Second Edition), EURACHEM Secretariat, HAM,
Berlin, 2000. Ce guide est disponible et librement tlchargeable
partir du site internet http://www.vtt.fi/ket/eurachem.
3. Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method

Performance Studies, ed. W. Horwitz, Pure Appl. Chem., 1995,
67, 331-343.
4. Precision of Test Methods, Geneva, 1994, ISO 5725, Les

ditions prcdentes ont t publies en 1981 and 1986.
Conformment la jurisprudence, lO.I.V. dcline toute responsabilit pouvant rsulter des
erreurs ou des omissions involontaires qui, malgr les soins apports la rdaction de
louvrage, auraient pu se produire. La reproduction des textes publis dans cet ouvrage est
interdite. Ils sont la proprit de lO.I.V. qui se rserve le droit de reproduction et de
traduction dans le monde entier. La loi interdit les copies ou reproductions destines une
utilisation collective. Toute reprsentation ou reproduction intgrale ou partielle faite par
quelque procd que ce soit sans le consentement de lO.I.V., est illicite et constitue une
contrefaon.
O.I.V. - 2006
ORGANISATION INTERNATIONALE DE LA VIGNE ET DU VIN

18, rue dAguesseau
75008 PARIS
Tl. (33) 01.44.94.80.80 - Tlc. (33) 01.42.66.90.63
E-mail: oiv@oiv.int - www.oiv.int

Metodos Análisis OIV Vol 2

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COMPENDIUM OF

O.I.V. - 18, RUE DAGUESSEAU - 75008 PARIS

General organization of the Compendium

ANNEX A METHODS OF ANALYSIS OF WINES AND MUSTS

SECTION 1 DEFINITIONS AND GENERAL PRINCIPLES

SECTION 2 PHYSICAL ANALYSIS

SECTION 3 CHIMICAL ANALYSIS

SECTION 3.1 ORGANIC COMPOUNDS

SECTION 3.1.1 SUGARS

SECTION 3.2 NON ORGANIC COMPOUNDS

SECTION 3.2.1 ANIONS

SECTION 4 MICROBIOLOGICAL ANALYSIS

SECTION 5 OTHER ANALYSIS

ANNEX B - CERTIFICATES OF ANALYSIS

ANNEX C - MAXIMUM ACCEPTABLE LIMITS OF VARIOUS SUBSTANCES

ANNEX E LABORATORY QUALITY ASSURANCE

Table of contents ................................................ MA-E-INT-00-TABMAT

Foreword ........................................................... MA-E-INT-01-AVPROP

ANNEX A METHODS OF ANALYSIS OF WINES AND MUSTS

SECTION 1 DEFINITIONS AND GENERAL PRINCIPLES

SECTION 2 PHYSICAL ANALYSIS

SECTION 3 CHIMICAL ANALYSIS

SECTION 3.1 ORGANIC COMPOUNDS

SECTION 3.1.1 SUGARS

SECTION 3.1.2 ALCOHOLS

- by frequency oscillator (oeno 8/2000) ..... MA-E-AS312-01-TALVOL

SECTION 3.1.3 ACIDS

SECTION 3.1.4 GAS

SECTION 3.1.5 OTHER ORGANIC COMPOUNDS

Artificial sweeteners (A 36) ................................... MA-E-AS315-07-EDUSYN

SECTION 3.2 NON ORGANIC COMPOUNDS

SECTION 3.2.1 ANIONS

SECTION 3.2.2 CATIONS

SECTION 3.2.3 OTHER NON ORGANIC COMPOUNDS

Arsenic (A 34) .................................................... MA-E-AS323-01-ARSENI

SECTION 4 MICROBIOLOGICAL ANALYSIS

SECTION 5 OTHER ANALYSIS

ANNEX B - CERTIFICATES OF ANALYSIS

ANNEX C - MAXIMUM ACCEPTABLE LIMITS OF VARIOUS SUBSTANCES

ANNEX E LABORATORY QUALITY ASSURANCE

1. Principle of the methods

(Applicable to the determination of ethyl carbamate concentrations between 10

2.4 Rotary evaporator under vacuum or concentration system similar to Kuderna

3.7 Practice sample - 100 ng EC/mL in 40 % ethanol. Transfer 1 mL of the

Sample Added EC, Mean EC Recovery sr SR RSDr % RSDR%

1. Principle of the methods

3. High-performance liquid chromatography

Repeatability (r) and Reproducibility (R)

1) JUNGE C., Feuillet vert N 877 (1990)

Examination of artificial sweeteners

1. Principle of the methods

2.2.6 Nitric acid solution, 25% (v/v),

- solution of Dulcin, 0.1 % (m/v), in methanol,

Saccharin ...................................................... 10 mg/L

International Federation of Fruit Juice Manufacturers, 1972, F.V., O.I.V., n 40.

SALO T., ALRO E. and SALMINEN K., Z. Lebensmittel Unters. u. Forschung,

Examination of artificial colorants

4.2.2 Characterization by thin layer chromatography.

TERCERO C., F.V., O.I.V., 1970, n 356.

BANDION F., VALENTA M. & KOHLMANN H., Mitt. Klosterneuburg, Rebe

BERTRAND A., Conn. vigne vins, 1985, 19, 191.

Laboratoire de la rpression des fraudes et du contrle de la qualit de

MEASURING OCHRATOXINE A IN WINE AFTER

This solution is stable at -18C for at least 4 years.