Cdigo: I-CIRB-AADC-05 Revisin: 01

Instructivo para las tinciones de

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1.- OBJETIVO
Establecer de una manera adecuada y correcta la metodologa para la realizacin de las tinciones de
medula sea y/o sangre perifrica.

2.- ALCANCE

Aplica a todas las muestras de mdula osea o sangre periferica que se recepcionen en el AADC.

3.- DESCRIPCIN DE LA OPERACIN

PEROXIDASA LEUCOCITARIA (MIELOPEROXIDASA)

Principio:

La reaccin de la peroxidasa es positiva en las clulas de serie granuloctica en todos

sus estadios de maduracin y dbil o negativa en los monocitos, y esta determinacin se
puede usar para diferenciar clulas de estas lneas, de clulas linfoides o eritroides que son
peroxidasa negativa. La peroxidasa leucocitaria transforma el hidrogeno de la bencidicina o de
otros substratos en perxido de hidrogeno, manifestndose con un color marrn, pudindose
observar esta coloracin en el lugar de la actividad enzimtica. La mieloperoxidasa es una
enzima que se encuentra en los grnulos primarios de las clulas granulocticas.

Procedimiento:

1. Fijar en fijador universal durante 30 segundos.

2. Lavar con agua corriente 30 segundos. Dejar secar
3. Prepar la siguiente mezcla de tincin:
a. 10 ml de buffer de fosfato pH 7.4
b. Diaminobencidina 7.5 mg
c. H2O2 al 3% (comercial) 0.03 mL.
d. Mezclar perfectamente.
4. Filtre y cubra las laminillas con esta solucin durante 5 minutos.
5. Lavar con agua corriente por 1 minuto.
6. Contrateir con Wright (mismos tiempos).

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7. Lavar. Secar. Montar. Leer

Criterios de positividad:

La Muestra con 3% o ms de Peroxidasa positiva en clulas blsticas, se considera

POSITIVA.

REACCIN DEL CIDO PERYODICO (PAS)

Principio:

Polisacridos, mucopolisacrido y mucoprotenas son puestas de manifiesto por la

reaccin de PAS. El cido perydico es un oxidante que rompe los enlaces C-C en varias
estructuras cuando estn presentes como grupos 1, 2-glicoles (CHOH- CHOH) convirtindolos
en dialdehidos (CHO-CHO). Los grupos amino alquilamino derivados del 1, 2-glicol sus
productos de oxidacin (CHO- CO) son tambin atacados y convertidos a dialdehido. La
propiedad del cido perydico es que no oxida los aldehdos resultantes, y estos se combinan
con el reactivo de Schiff dando un color rojo. Los grupos carbonilo son tambin oxidados a
grupos carboxilo y preparados para reaccionar subsecuentemente con el reactivo de Schiff.
Una gran variedad de compuestos intracelulares reaccionan al PAS, pero en las clulas de
sangre perifrica y mdula sea, el glucgeno parece ser el compuesto primariamente
responsable, ya que la tincin puede ser bloqueada mediante la digestin de las
preparaciones con amilasa.

Procedimiento:

1. Fijar durante 3 minutos con fijador universal.

2. Lavar con agua corriente durante 5 minutos.
3. Sumergir en solucin de cido perydico 1% por 20 minutos.
4. Lavar con agua corriente por 5 minutos.
5. Sumergir en reactivo de Schiff 30 minutos en refrigeracin.
6. Sumergir en 2 cambios de solucin de metabisulfito de sodio durante 4.5 minutos
cada cambio, esto a temperatura ambiente.

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7. Lavar con agua corriente por 5 minutos.

8. Contrateir con hematoxilina de Mayer por 8 a 10 minutos.
9. Lavar con agua corriente durante 5 minutos
10. Dejar secar. Montar. Leer.

Interpretacin:

En la sangre perifrica, el citoplasma de los polimorfonucleres se tie intensamente de

color rojo o rosa con aspecto granular en algunas clulas. El citoplasma de los monocitos se
puede teir dbilmente de color rosa y contener algunos grnulos finos o gruesos. Los
eritrocitos no se tien, y las plaquetas se tien intensamente. En la mdula sea normal, los
precursores granulococitarios (mieloblastos, mielocitos y metamielocitos) a excepcin de los
promielocitos que son PAS (+) (promielocitos anormales, principalmente), son PAS (-) y la
tincin citoplasmtica granular o difusa aumenta de manera proporcional a la madurez de las
clulas mieloides. Los megacariocitos se tien difusa o intensamente de rojo o rosa. Los
precursores eritroides no se tien. La digestin con amilasa inhibe la tincin de todas las
clulas. En eritroleucemia (LMA M6) y en algunos casos de anemia refractaria, los
normoblastos se tien difusa e intensamente, o bien pueden contener grnulos rojos. Tambin
son positivos al PAS los normoblastos en algunas anemias ferropnicas, beta-talasemias,
anemia hemoltica grave y en SMD I y II. La reaccin es muy acentuada en los normoblastos
de la eritroleucemia, pero puede ser notable en otras enfermedades, y por otra parte, la
reaccin al PAS por si sola, no es suficiente para el diagnstico de eritroleucemia. Las clulas
PAS positivas de la eritroleucemia o de la anemia refractaria son a menudo megaloblastoides;
pero los megaloblastos en dficit de vitamina B12 y/o cido flico son PAS negativos.

En la Leucemia Linfoblastica Aguda, los blastos contienen mltiples granulos PAS

positivos de tamao variable en su citoplamas (70-80%). Para considerar una leucemia como
PAS positiva, debe de presentar 15% o ms de clulas blsticas PAS positivas. Los
mieloblastos son PAS negativos.

Los linfocitos de sangre perifrica con linfoma (clulas de linfosarcoma), incluyendo la

enfermedad de Hodgkin, LLC y micosis-fungoide (Sindrome de Szary) pueden contener un

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importante numero de grnulos PAS positivos. Esto tambin se observa en enfermedades

benignas como mononucleosis infecciosa y no es de importancia diagnostica. De particular
inters son los linfocitos anormales en el sndrome de Szary que contienen grnulos PAS
positivos los cuales no son de glucgeno, ya que estos grnulos son eliminados por digestin
por amilasa en extensiones fijadas con metanol. La naturaleza de los grnulos en las clulas
de Szary es incierta.

TINCION DE PERLS

Principio.-La tincin se basa en la conocida reaccin del azul de Prusia. El hierro

inico (Fe3+) reacciona con una solucin de acido ferrocianidica y da un color azul (azul de
Prusia).

PROCEDIMIENTO:

1.-Los frotis de sangre perifrica, medula sea o sediment urinario, se fijan con
vapores de formaldehido al 37% de 5 a 7 minutos.

2.-En material libre de hierro se prepara la mezcla de volmenes iguales de HCl al 4% y

de ferrocianuro de potasio al 4%. Esta mezcla se calienta a 56C y las lminas se cubren con
esta solucin durante 30 minutos. (Sin calentar esta mezcla, se obtienen resultados
semejantes).

3.-Se lava con agua libre de hierro. Dejar secar.

4.-Contrateir con solucin de contra tincin para hierro por 7 minutos.

5.-Lavar con agua corriente 1 minuto, secar, y leer.

INTERPRETACIN

La tincin del hierro medular es muy til en el diagnostico de la anemia ferropnica, en

este trastorn, las clulas reticuloendoteliales generalmente no contiene hierro. Los
eritroblastos en desarrollo que contienen grnulos de hierro teible, son conocidos como
sideroblastos, estn clulas estn presentes normalmente y no existen o estn disminuidos en
los pacientes con anemia por deficiencia de Hierro. Por otra parte en la anemia sideroblastica,

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la cantidad de ,los grnulos de hierro en los eritroblastos esta muy aumentada. Inclusiones
que contienen hierro en los eritrocitos de la sangre perifrica generalmente solo se ven
pacientes esplenectomizados y en trastornos d la eritropoyesis. El Hierro (hemosiderina)
existe en el sediment urinario de los pacientes con hemolisis intravascular (HPN) y puede ser
demostrado en forma de grnulos libres o grnulos en el interior de las clulas epiteliales.

Las partculas de hierro en las clulas reticuloendoteliales pueden ser esfricas, en

forma irregular, finamente granulares, o las clulas pueden aparecer difusamente teidas. Las
clulas de la serie roja nucleadas (eritroblastos) que contienen uno a ms pequeos grnulos
azules (Fe3+) normalmente una micra de dimetro o menos, son los llamados sideroblastos.

PREPARACIN DE REACTIVOS:

Buffer Formalina Acetona (Fijador Universal)

120 mL agua destilada

80 mg de Na2HPO4
400 mg KH2PO4
180 mL de acetona
100 mL de formaldehido 37%
Mezclar perfectamente y ajustar el pH en 6.6

La solucin es estable por 3 meses a 4 C.

Buffer de fosfato pH 6.64

3.786 g Na2HPO4
5.443 g de KH2PO4
1000 mL agua destilada
Gurdese en refrigeracin, preprese cada semana.

Nitrito de sodio 4%

0.25 g de NaNO2
6.25 mL agua destilada

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Gurdese en refrigeracin, preprese cada semana.

Buffer de fosfato pH 7.4

7.572 g Na2HPO4
1.814 g KH2PO4
1000 mL agua destilada
Gurdese en refrigeracin

Hematoxilina de Mayer

1.0 g hematoxilina
500 mL agua destilada
500 mL agua destilada
0.2 g NaIO3 (iodato de sodio)
50 g AlK (SO4) 12 H2O (sulfato de aluminio y potasio)
Mezclar perfectamente. Filtrar y guardar en frasco mbar a temperatura ambiente. (Una
vez usada, se puede reutilizar). La sal de hematoxilina se guarda a temperatura ambiente.

Alfa-naphtyl acetate ( guardar en refrigeracin)

3,3 diaminobenzisine tetrhydrochloride (guardar en refrigeracin)

Reactivo de Schiff

Llevar a ebullicin 100 mL de agua destilada movindola durante el calentamiento e

inmediatamente agregar 1 g de fuschina bsica. Se adiciona primero una cantidad pequea
de colorante agitando suavemente, seguido por la adicin del resto del colorante para evitar
un burbujeo violento al adicionar una cantidad de partculas al agua cerca de su punto de
ebullicin. La mezcla se enfra a 60 C y se filtra. Se la aaden 2 g de Na2S2O5 (metabisulfito
de sodio) y 20 mL de HCl 1N al filtrado. La solucin se coloca en un frasco cerrado y se
mantiene por 18-26 horas guardado de la luz. S ele agregan 500 mg o ms de carbn
activado, se agita y se filtra hasta incoloro, y se guarda en frasco mbar en refrigeracin (4
C). La solucin se usa hasta que se vuelva ligeramente rosa. (NOTA: se puede usar la

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fuschina de Ziehl usada en bacteriologa la cual se calienta a 60 y se la adicionan las sales

siguientes).

Prueba de Schiff: en un tubo de ensayo se colocan unas gotas de reactivo de Schiff + 2 gotas
de formaldehido 37%:

Color rojo prpura= Reactivo en buenas condiciones

Color azul intenso= reactivo en malas condiciones
Solucin de metabisulfito de sodio al 1% para lavados.

Prepare antes de usar:

0.5 g Na2S2O5 ( metabisulfito de sodio)

100 mL agua destilada
Mezclar perfectamente. Usar.

4.- DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Cdigo
Nombre del documento Lugar de almacenamiento
(cuando aplique)
N/A Hematologa de Williams Laboratorio de AADC
N/A Manual de tcnicas en hematologa Laboratorio de AADC
N/A Atlas color Citologa Hemtica Laboratorio de AADC
P-CIRB-AADC-03 Procedimiento de muestras y entrega de resultados Sheirpoint

5.- CONTROL DE REGISTROS

Identificacin Nombre del Lugar de Responsable de Tiempo de Disposicin de

(cdigo) registro almacenamiento su proteccin retencin los registros
F-CIRB- Bitcora de
Laboratorio Qumica 2 aos Archivo muerto
AADC-11 leucemias y M.O

6.- GLOSARIO

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6.1 .- SIGLAS
AADC.- Area de apoyo al diagnstico clinico
M.O.- Medula osea
PAS.- cido peryodico

6.2 .- DEFINICIONES
Medula Osea.- Tejido que se encuentra en el interior de los huesos largos, vertebras, costilla y esternon.

7.- CONTROL DE REVISIONES

NIVEL DE SECCIN FECHA DE

DESCRIPCIN DE LA MODIFICACIN Y MEJORA
REVISIN Y/O PGINA MODIFICACIN
Todo el Se modific el formato
documento
01
18 de Enero 2013
Seccin 1 Se mejor la redaccin del objetivo
Nota: La seccin 7 ser utilizada a partir de la primera modificacin a este documento. La revisin 00, se
mantendr en blanco.

Elabor Revis Aprob

M. en C. Irma Quintal Ortiz M.C. Pedro Gonzlez Martnez Dr. Jorge E. Zavala Castro
Tcnico Acadmico Responsable del AADC Director del CIR

Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el documento, revisan su adecuacin
y aprueban para su implementacin dentro del Sistema de Gestin de la Calidad de la Universidad
Autnoma de Yucatn.

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