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Ministrio da Agricultura,

Pecuria e Abastecimento
Comunicado 16
Tcnico ISSN 1517-5685
Rio de Janeiro, RJ
Outubro, 2003
Foto:Vincius M Benites

Extrao e Fracionamento
Quantitativo de
Substncias Hmicas do
Solo: um Procedimento
Simplificado de Baixo
Custo

Vinicius M. Benites 1
Beta Madari 2
Pedro Luiz O. de A. Machado2

Introduo do extrato alcalino, de colorao preta, resulta na


coagulao da frao dos cidos hmicos (precipitado preto
A presena de substncias hmicas (SH) no meio ambiente ou amarronzado), enquanto a frao dos cidos flvicos
h muito tempo vem sendo observada (Berzelius, 1839; permanece solvel (soluo amarela amarronzada) (Foto 1).
Kononova, 1958; Orlov, 1985; Frimmel & Christman, Embora este esquema de separao parea bastante
1988). A definio de SH no simples e reflete bem a arbitrrio, consegue-se um certo grau de segregao de
complexidade do material orgnico. SH podem ser definidas materiais polimricos com diferentes propriedades qumicas
como uma srie de polmeros amorfos de colorao amarelo- (McBride, 1994). Nenhuma destas fraes isoladas
marrom a preta, de peso molecular relativamente alto e representa compostos individuais de composio especfica,
formados por reaes de snteses secundrias, biticas e mas sim uma mistura de compostos heterogneos com
abiticas (Stevenson, 1994). Entretanto, como exposto por comportamento qumico similar. A Tabela 1 sumaria
MacCarthy (2001), devido ao aspecto vago desta e de algumas das propriedades qumicas mostrando que a
outras definies de SH, comum definir tambm estes seqncia cidos flvicos - cidos hmicos - humina
materiais operacionalmente em termos de procedimentos representa um contnuo crescente de propriedades qumicas,
laboratoriais usados para extra-los de solos, sedimentos e com certa similaridade com a lignina (um polmero aromtico
guas. O procedimento clssico de extrao do solo resulta complexo) (McBride, 1994).
em trs fraes principais: cidos hmicos (AH), cidos
flvicos (AF) e huminas. Estas fraes so definidas O termo hmus freqentemente usado como sinnimo de
operacionalmente em relao s suas solubilidades em meio SH, mas h casos em que hmus inclui, por falta de
aquoso em funo do pH da soluo extratora (Tombcz & definio correta da nomenclatura, SH e substncias no-
Meleg, 1990). Solues alcalinas, normalmente NaOH 0,1 hmicas como cidos orgnicos de baixo peso molecular (ex.
mol L-1, extraem os cidos hmicos e os cidos flvicos do cido ctrico, cido malnico etc), compostos produtos da
solo deixando a humina ligada fase mineral. A acidificao decomposio da matria orgnica (protenas, lipdeos etc.) e

1
Pesquisador, DS, Embrapa Solos, Rua Jardim Botnico 1024 - CEP 22.460.000 - Rio de Janeiro/RJ, E-mail:vinicius@cnps.embrapa.br.
2
Pesquisador, PhD, Embrapa Solos, Rua Jardim Botnico 1024 - CEP 22.460.000 - Rio de Janeiro/RJ, E-mail:beata@cnps.embrapa.br,pedro@cnps.embrapa.br.
2 Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo

de materiais hmicos e no hmicos (Rice & MacCarthy,


1990) e como tal poderia ser melhor descrita como um
material que contm SH do que uma substncia hmica
propriamente dita. Apesar de apresentar baixa reatividade,
so responsveis por mecanismos de agregao de
partculas e na maioria dos solos tropicais representa a maior
parte do carbono humificado do solo.

O estudo de substncias hmicas no solo desenvolveu-se


bastante nas ltimas trs dcadas, graas ao
desenvolvimento de novas metodologias e equipamentos
(Hatcher et al., 2001). Atravs de reunies bianuais, o
Encontro Brasileiro de Substncias Hmicas vem
oferecendo grande contribuio na oferta e organizao da
informao sobre as SH no solo e nas guas, sua estrutura e
transformao no meio ambiente. Contudo, um dos fatores
que tem dificultado maior estudo de substncias hmicas
em solos tropicais a falta de organizao e apresentao
detalhada de metodologias para a extrao, fracionamento
Foto 1. Tubos de centrfuga com a frao cido flvico (A) como e, especialmente a quantificao das fraes hmicas. A
sobrenadante e a frao cido hmico (B) como precipitado. Sociedade Internacional de Substncias Hmicas (IHSS)
recomenda um mtodo para a extrao das substncias
hmicas de material de solo e posterior fracionamento em
produtos metablicos da atividade microbiana
cidos hmicos, flvicos e humina, baseado na solubilidade
freqentemente associados s substncias hmicas
diferencial destas fraes em meio alcalino e cido (Swift,
(Stevenson, 1994).
1996; Machado, 1999). Contudo, este mtodo laborioso
e deve ser empregado quando se pretende extrair
Tabela 1. Algumas propriedades qumicas importantes das substncias hmicas com alto grau de pureza para fins de
diferentes fraes hmicas. caracterizao.
cidos flvicos cidos hmicos Humina*

Peso molecular (D) 640-5.000 10.000-100.000 >100.000 A sugesto que aqui se apresenta o resultado de uma
C (%) 42-47 51-62 >62 adaptao desta metodologia de extrao e fracionamento,
O (%) 45-50 31-36 <30 visando a quantificao das fraes hmicas por meio de
procedimento simplificado e de fcil execuo. O
N (%) 2,0-4,1 3,6-5,5 >5
procedimento foi testado em vrias classes de solos do
Capacidade de troca
Brasil e os resultados so considerados satisfatrios para o
~1.400 ~500 <500
catinica ( cmol(- ) kg-1 )

* Valores da frao humina so aproximados, dada a dificuldade em se emprego como anlise de rotina (Benites et al., 2000). As
eliminar a fase mineral para a anlise elementar.
informaes geradas pela adoo desta metodologia podem
Fonte: McBride, 1994; Schnitzer & Khan, 1978. ser teis em trabalhos de classificao de solos, como
indicadores do efeito do manejo ou para estudos de
dinmica de carbono no solo (Swift, 2001), fornecendo
Os cidos hmicos e flvicos representam a poro solvel
uma informao complementar ao teor de carbono orgnico
em meio alcalino, de maior reatividade e conseqentemente
total do solo.
de maior polaridade. Os cidos flvicos so os compostos
hmicos de maior solubilidade por apresentarem maior
polaridade e menor tamanho molecular. Estes compostos
Materiais e Equipamentos
so os principais responsveis por mecanismos de
Necessrios
transporte de ctions dentro do solo, por meio de
Para o fracionamento
complexos organo-metlicos, o que caracteriza o processo
de queluviao (Duchaufour, 1982). Os cidos hmicos - Centrfuga refrigerada de alta rotao com rotor para tubos
so os compostos hmicos mais estudados e apresentam de 50 mL e FCR superior a 5.000 g;
pouca solubilidade nas condies de acidez normalmente - Sistema de filtragem a vcuo com suporte para filtros
encontradas em solos. Estes compostos so responsveis 47mm de dimetro ou maior;
pela maior parte da CTC de origem orgnica em camadas
superficiais de solos. A humina consiste em um aglomerado - Bomba de vcuo;
Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo 3

- Filtros de membrana em ster de celulose, 0,45 m de Procedimento


poro e 47 mm de dimetro, lisa (ex. Millipore
HAWP04700); Extrao e Fracionamento
- Bales volumtricos de 50 mL;
- Pesar uma amostra de solo (TFSA) que contenha
- Balana com preciso de 0,0001 g; aproximadamente 30 mg de carbono orgnico total;
- Potencimetro; - Transferir para tubo de centrfuga de 50 mL com tampa e
- Tubos de centrfuga de 50 mL com tampa; adicionar 20 mL de NaOH 0,1mol L-1;

- Soluo de Hidrxido de Sdio (NaOH 0,1 mol L-1); e - Agitar manualmente e deixar em repouso por 24 h
(Foto 2);
- Soluo de cido Sulfrico (H2SO4 20% (v/v)).
- Centrifugar a 5.000 g por 30 min (Foto 3);
Para a determinao do teor de carbono
nas fraes

- Bloco digestor com, no mnimo, 40 posies;

- Bureta automtica (ou titulador);

- Pipetas de 1 e 5 mL (ou pipeta automtica regulvel de 1-


5 mL);

- Dispensador de 5 mL;

- Frascos Erlenmeyer de 125 mL;

- Tubos de digesto com dedos para refluxo (ou bolinhas


de gude); Foto 2. Tubos de centrfuga de 50 mL com solo e soluo NaOH
- Soluo de Dicromato de Potssio (K2Cr2O7) 0,167 mol L : -1 0,1 mol L-1, em repouso aps agitao manual.

Dissolver 49,04 g de K2Cr2O7 (pr-seco em estufa a


105C e conservado em dessecador) em gua e diluir a
soluo para o volume de 1.000 mL;

- Soluo de Dicromato de Potssio (K2Cr2O7) 0,042 mol L -1:


Dissolver 12,26 g de K2Cr2O7 (pr-seco em estufa a
105C e conservado em dessecador) em gua e diluir a
soluo para o volume de 1.000 mL;

- Indicador de Ferroin 0,025 M: Dissolver 1,465 g de orto-


fenantrolina monohidrata e 0,985 g de sulfato ferroso
amoniacal (Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O) em gua. Completar o
volume para 100 mL;

- cido sulfrico p.a. (H2SO4 cc., no mnimo 96%);

- Soluo de sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH4)2 Foto 3. Tubos de centrfuga com destaque do precipitado (solo
(SO4)2.6H2O) 0,250 mol L-1: Dissolver 98,04 g de SFA + humina) aps centrifugao a 5.000 g.

em 500 mL de gua previamente misturada a 15 mL de


H2SO4, resfriar a soluo e diluir ao volume de 1.000 mL. - Recolher cuidadosamente o sobrenadante em copo de
plstico descartvel de 50 mL e reservar4 (Foto 4);
- Soluo de sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH4)2
(SO4)2.6H2O) 0,0125 mol L-1: Dissolver 4,902 g de SFA - Adicionar mais 20 mL de NaOH 0,1 mol L -1 a cada amostra
em 500 mL de gua previamente misturada a 15 mL de e agitar manualmente at o desprendimento e
H2SO4, resfriar a soluo e diluir ao volume de 1.000 mL 3. ressuspenso do precipitado;

- Deixar em repouso por 1 h;

4 O sobrenadante deve ser recolhido imediatamente aps a centrifugao,


3 Este reagente deve ser mantido sob refrigerao e protegido do sol. A evitando, assim, a ressuspenso do precipitado. A transferncia do
normalidade desta soluo deve ser corrigida a cada anlise usando o sobrenadante deve ser feita com cuidado evitando o desprendimento de
branco sem aquecimento, como descrito a seguir. material do fundo do tubo de centrfuga.
4 Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo

Foto 4. Transferncia quantitativa do extrato alcalino do tubo de Foto 6. Filtragem a vcuo do extrato acidificado para separao
centrfuga para os copos plsticos. das fraes cido hmico e flvico.

- Centrifugar novamente a 5.000 g por 30 min;


Determinao do teor de carbono
- Recolher o sobrenadante junto ao previamente reservado orgnico total nas fraes
(extrato alcalino - pH 13,0);
Humina
- Reservar o precipitado.
- Transferir quantitativamente (sem perdas de material) o
- Ajustar o pH do extrato alcalino5 para pH 1,0 ( 0,1), precipitado dos tubos de centrfuga de 50 mL para tubos de
pela adio de gotas de soluo de H 2SO4 20%, dentro do digesto, utilizando o mnimo de lquido possvel 7 (10 ml);
copo plstico de 50 mL (Foto 5);
- Secar em estufa aquecida a 65oC (at a secagem completa);
- Decantar por 18 h;
- Adicionar 5 mL de K2Cr2O7 0,1667 mol L-1 e 10 mL de
- Filtrar o precipitado em filtro de membrana de 0,45 m H2SO4 concentrado a cada amostra e em quatro tubos
sob vcuo (Foto 6); vazios (brancos);

- Recolher o filtrado e aferir o volume para 50 mL usando - Levar os tubos com as amostras e dois dos quatro brancos
H2O destilada (frao cidos flvicos); e ao bloco digestor pr-aquecido a 150oC e deixar por 30
minutos, sob exausto;
- Adicionar NaOH 0,1 mol L-1 sobre o precipitado at a
lavagem completa do filtro6 e aferir seu volume para 50 mL - Transferir quantitativamente o contedo dos tubos de
usando H2O destilada (frao cidos hmicos) (Foto 7). digesto para frascos Erlemeyer de 125 mL (amostras +
dois brancos aquecidos + dois brancos sem
aquecimento);

- Adicionar 3 gotas de indicador FERROIN;

- Titular com sulfato ferroso amoniacal 0,25 mol L-1 sob


agitao;

5 A acidificao do extrato alcalino deve ser feita o mais rapidamente possvel


evitando a oxidao dos cidos hmicos e flvicos, que normalmente ocorre
em meio alcalino.
6 Este procedimento pode ser feito com a bomba de vcuo ligada, o que
facilita a operao. O filtro pode ser reutilizado em at 10 amostras
dependendo do teor de argila no solo.
7 Usar um volume mnimo de gua na transferncia para evitar que a
secagem demore muito tempo. Este trabalho exige um pouco de prtica,
especialmente em solos muito argilosos. Aconselha-se a utilizao de um
Foto 5. Acidificao do extrato alcalino a pH 1,0 pela adio de arame de ao para soltar o material do fundo, com cuidado para no
soluo H2SO4 20%. arranhar o tubo.
Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo 5

Clculo: X = (V baq -Vam) N SFAcorr x 12/4 x 1/peso da amostra (g) - Levar os tubos com as amostras e dois dos quatro brancos
ao bloco digestor pr-aquecido a 150oC e deixar por 30min,
sendo: dentro de capela
X - mg C na forma de humina ( mg de Chumina g-1 solo) - Transferir quantitativamente o contedo dos tubos de
digesto para frascos Erlemeyer de 125 mL (amostras +
Vbaq - Volume (mL) de Sulfato Ferroso Amoniacal (SFA)
dois brancos aquecidos + dois brancos sem aquecimento)
consumido na titulao do branco aquecido
- Adicionar 3 gotas de indicador FERROIN
Vam - Volume (mL) de SFA consumido na titulao da
amostra - Titular com sulfato ferroso amoniacal 0,0125 mol L-1 sob
agitao.
NSFAcorr - Normalidade do SFA corrigida pela equao:
Clculo: X = (Vbaq-Vam)NSFAcorr x 12/4 x 50/alquota (mL)
NSFAcorr = Volume de dicromato x Normalidade do dicromato
x 1/peso da amostra (g)
Volume de SFA consumido na titulao do branco
sem aquecimento X - mg C na forma de cido hmico (ou flvico) por grama
de solo

Vbaq - Volume (mL) de SFA consumido na titulao do


branco aquecido

Vam - Volume (mL) de SFA consumido na titulao da


amostra

NSFAcorr - Normalidade do SFA corrigida pela equao:

NSFAcorr = Volume de dicromato x Normalidade do dicromato


Volume de SFA consumido na titulao do branco
sem aquecimento

Foto 7. Bales volumtricos de 50 mL com as fraes cido


Foto 8. Copos plsticos com as fraes cido hmico (
flvico (FAF) e cido hmico (FAH).
esquerda) e as fraes cido flvico correspondentes ( direita).

cidos hmicos e flvicos (Foto 8)


- Transferir uma alquota de 5mL da soluo de cido
hmico ou flvico para tubos de digesto 8, utilizando uma
pipeta automtica (a alquota pode ser diluda em gua nas
amostras mais concentradas sem se esquecer de considerar
nos clculos)

- Adicionar 1mL de K2Cr2O7 0,042 mol L-1 e 5mL de H2SO4


8 No caso de amostras muito concentradas (pode ser estimado pela colorao
concentrado a cada amostra e em quatro tubos contendo
do extrato) utilizar alquotas menores (ex. 2mL) completando-se o volume
5mL de H2O destilada (brancos) para 5mL com gua destilada.
6 Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo

Comentrios Gerais Referncias Bibliogrficas


Neste mtodo, ao contrrio do que se faz no procedimento BENITES, V. M.; KER, J. C.; MENDONA, E. S.
usado para extrao de substncias hmicas para fins Fracionamento quantitativo de substncias hmicas como
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leve (MOL). Desta forma, estas formas orgnicas estaro SOLOS E INTERPRETACO DE APTIDO AGRICOLA, 6. ,
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isto pode limitar o mtodo para solos onde no haja Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paran. Colombo:
quantidade muito grande de uma destas formas (ex. Embrapa Florestas, 2000. p.184-192
Organossolos so ricos em MOL). A MOL normalmente
considerada como humina, em virtude de sua insolubilidade BENITES, V. M.; SCHAEFER, C. E. R. G.; MENDONA, E.
em solvente alcalino. Os COBPM so co-extrados com os S.; MARTIN NETO, L. Caracterizao da matria orgnica e
cido flvicos e, por isso, a utilizao do termo frao micromorfologia de solos sob Campos de Altitude no Parque
cidos flvicos utilizada para mostrar que o carbono Estadual da Serra do Brigadeiro. Revista Brasileira de Cincia
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replicvel, sendo encontrados coeficientes de variao their role in the environment. Chichester: John Wiley &
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determinao do carbono nas fraes (ex. homogeneidade
no aquecimento dos tubos de digesto) evitando maiores HATCHER, P. G.; DRIA, K. J.; KIM. S.; FRAZIER, S. W.
coeficientes de variao. O somatrio das fraes apresenta Modern analytical studies of humic substances. Soil
variaes entre 90 e 105% do teor de carbono orgnico Science, Baltimore, v. 166, p. 770-794, 2001.
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efetuadas trs repeties de extrao e apenas uma nica KONONOVA, M. M. Die Humusstoffe des Bodens:
determinao de carbono em cada frao por repetio Ergebnisse und Probleme de Humusforschung. Berlin: VEB
suficiente. A metodologia aqui descrita permite a anlise de Deutscher Verlag der Wissenschaften, 1958. 341 p.
36 amostras por semana com um nico operador.
MacCARTHY, P. The principles of humic substances. Soil
A partir dos resultados obtidos (teores de carbono na forma Science, Baltimore, v. 166, p. 738-751, 2001.
de frao cidos flvicos, frao cidos hmicos e humina)
podem ser derivadas algumas variveis como teores MACHADO, P. L. O. A. Mtodo para a extrao de
percentuais em relao ao carbono orgnico total e as substncias hmicas do solo cido hmico e cido flvico.
relaes entre fraes: Rio de Janeiro: Embrapa Solos, 1999. 4 p. (Embrapa Solos.
Comunicado Tcnico, 1)
Relao AH/AF - a relao entre os teores de carbono na
forma de cidos hmicos e cidos flvicos que indica a MALCOLM, R. L. The uniqueness of humic substances in
mobilidade do carbono no solo. Em geral os solos mais each of soil, stream and marine environments. Analytica
arenosos apresentam maiores relaes AH/AF indicando a Chimica Acta, Amsterdan, v. 232, p. 19-30, 1990.
perda seletiva da frao mais solvel (FAF).
MCBRIDE, M. B. Environmental chemistry of soils. New
Relao EA/HUM - a relao entre o extrato alcalino York: Oxford University Press, 1994. 406 p.
(cidos flvicos mais cido hmicos) e a humina. Este ndice
indica iluviao de matria orgnica e nos horizontes ORLOV, D.S. Humus acids of soils. New Delhi: Oxonian
espdicos so encontrados as maiores relaes EA/HUM Press Pvt. Ltd., 1985. 378p.
(Benites et al., 2001) enquanto em horizontes superficiais
as relaes EA/HUM so em geral menores que 1.
Extrao e Fracionamento Quantitativo de Substncias Hmicas do Solo 7

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Comunicado Exemplares desta edio podem ser obtidos na Expediente Supervisor editorial: Jacqueline Silva Rezende Mattos
Tcnico, 16 Embrapa Solos
Reviso de texto: Andr Luiz da Silva Lopes
Endereo: Rua Jardim Botnico, 1.024 Jardim
Tratamento das ilustraes: Jacqueline S. R. Mattos
Ministrio da Agricultura, Botnico. Rio de Janeiro, RJ. CEP: 22460-000 Editorao eletrnica: Jacqueline S. Rezende Mattos
Pecuria e Abastecimento Fone: (21) 2274.4999
Fax: (21) 2274.5291
E-mail: sac@cnps.embrapa.br
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1 a edio
1 a impresso (2003): 300 exemplares