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Gua prctica de
MICROBIOLOGA GENERAL
Edicin 2017
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Dos Seminarios:
a) Parsitos de origen alimentario en forma grupal y oral el 23
de noviembre de 15:00 a 18:00 horas.
b) Bsqueda en Internet, de trabajos cientficos afines con la
asignatura en forma individual para presentarlo por escrito.
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PROFESOR RESPONSABLE:
EQUIPO DOCENTE:
TRABAJOS PRCTICOS:
Prctica 4: Micologa
EQUIPOS
Refrigerador (2 a 4C y congelador)
Cabina de flujo laminar, para asegurar la esterilidad en la zona
de trabajo
Autoclave, para esterilizar el material y los medios de cultivo
Estufas de incubacin para microorganismos psicrfilos, mesfilos
y termfilos
Homogeneizador de muestras elctrico, con agitadores magnticos,
se usan en la preparacin de medios de cultivo, soluciones, etc.
Bao Mara, para descongelar reactivos, mantener fundido el agar,
realizar incubaciones
Balanzas de diferente precisin (0,1-0,001g), analtica y
digitales
PH-metros, tiles en la preparacin de medios de cultivo
Microscopios para observar la morfologa bacteriana. ptico con
aumentos de 1000x
Cuenta colonias para recuento de colonias
TTULO:
OBJETIVOS:
TRABAJO PRCTICO 1
Objetivos:
1. Limpieza y acondicionamiento del material de vidrio previo a
su esterilizacin.
2. Esterilizacin por calor seco.
2.1. Pipetas:
Obturar con algodn cardado la boquilla de las pipetas de 1 ml y
mayores. Luego quemar con la llama de un mechero, las hebras de
algodn que sobresalen de la boquilla de la pipeta.
Envolver individualmente mediante el empleo de papel o introducir
la cantidad deseada por su extremo afilado en pipeteros de metal.
Esterilizacin:
Introducir el material de vidrio preparado segn 1 y 2 en estufa
de esterilizacin. Someter a 170C durante 90 minutos. El que est
en contenedores metlicos: 170C no menos de 2 horas.
9
Metodologa de Trabajo
Cada alumno acondicionar y esterilizar mediante mtodos
alternativos el material de vidrio siguiendo las indicaciones que
se den en clase.
Objetivos:
1. Preparacin de medios de cultivo lquido y slidos no
termolbiles.
2. Manejo de autoclaves, esterilizacin y almacenamiento de medios
de cultivo.
Esterilizacin:
1. Asegurarse que el nivel de agua alcance la placa metlica
perforada.
2. Verificar el buen funcionamiento de la vlvula de seguridad.
3. Controlar que la espita se encuentre en posicin abierta.
4. Cubrir los recipientes que contienen los medios a esterilizar,
con un capuchn de papel sujeto con hilo.
5. Disponer el material a esterilizar sobre la placa metlica
(conviene que no se encuentren demasiado juntos con el fin de
que se pueda permitir el libre paso de vapor de agua).
6. Cerrar el autoclave, ajustando las manivelas en forma cruzada y
teniendo cuidado de verificar que la tapa quede perfectamente
acoplada sobre la junta de goma.
7. Encender la fuente de calor, manteniendo abierta la vlvula de
purga (o espita) a fin de expulsar el aire del interior de la
cmara de esterilizacin.
8. Purgado el aparato, que se manifiesta por la salida de un chorro
de vapor de agua continuo durante algunos minutos, cerrar la
vlvula de purga.
9. El manmetro indica el aumento de la presin en el interior del
aparato.
10. Una vez alcanzada la temperatura de esterilizacin
generalmente 121C (medida indirectamente por la presin 15
libras/pulgada2 = 121C), regular la fuente de calefaccin y
comenzar a contar el tiempo de esterilizacin.
11. Autoclavar 15-20 minutos.
12. Transcurrido ese tiempo, interrumpir la fuente de calor y
dejar disminuir espontneamente la presin.
13. Cuando la presin ha llegado a cero, abrir la espita a fin de
eliminar cualquier exceso de presin residual.
14. Abrir el autoclave. Esperar unos minutos antes de retirar el
material.
Metodologa de Trabajo
Cada alumno preparar un medio de cultivo siguiendo las
indicaciones que se den en clase.
12
TRABAJO PRCTICO 2
PROCEDIMIENTO
Colocar las ampollas STEAROTROL sin abrir junto con el material a
esterilizar, en lugares diferentes, para probar distintas zonas de
calor, especialmente aquellas de difcil acceso al flujo de vapor
dentro del autoclave, y cuidando que no se rompan para que no
contamine el material ni lo ensucien.
Proceder a esterilizar por 15-20 minutos a 121C.
Una vez finalizado el proceso, retirar las ampollas e incubarlas en
estufa o bao termosttico entre 56C y 65C durante 48 h. Luego de
24 / 48 h de cultivo observar las ampollas sin abrir, la aparicin
de turbidez y color amarillo indican que la esterilizacin ha
fallado. Si no se observa desarrollo ni cambio de color al cabo de
48 h mantener el cultivo hasta 7 das, examinando peridicamente.
La ampolla control debe haber desarrollado ya a las 24 h y ser
francamente positiva a las 48 h.
Las ampollas que mantienen su color prpura indican que la
esterilizacin ha sido bien realizada. Si las ampollas han sido
sobrecalentadas presentan un color rojo a marrn.
PRECAUCIONES
Las ampollas son para uso profesional solamente. Dado que contienen
cultivos vivos, deben ser manejadas con cuidado para evitar
roturas. Conservar en heladera entre 2 y 8C en un espacio que no
contenga materiales biolgicos ni alimentos. Cada ampolla solo
puede ser usada una vez y luego destruida por calcinacin.
USOS
Las esporas han sido utilizadas para el control de procesos de
esterilizacin por calor hmedo durante mucho tiempo y
especialmente en procesos de productos enlatados y farmacuticos.
TRABAJO PRCTICO 3
Reglas generales
MATERIALES
Cajas de Petri estriles
Agar tripticasa soja (TSA) o similar templado a 50C
Ansa de cultivo
Pipetas de 1 ml estriles
Pipeteros
Agua estril
Caldo tripticasa soja (TSB) o similar
Debido a que ni los implementos de inoculacin ni los recipientes
se pueden soltar durante las manipulaciones, la parte ms difcil
de estos procedimientos a menudo es una persona manipulando todo
simultneamente. Su instructor demostrar que esto puede hacerse y
usted practicar esta tcnica realizando los traslados siguientes:
Metodologa de Trabajo
MATERIALES
Agar tripticasa soja (TSA) u otro medio de agar apropiado
Cajas de Petri
Esptula de Drigalsky o varilla de vidrio doblada en L
Alcohol 96
Pipetas
Ansa
Cultivos mixtos en caldo para plaquear en todo el medio (102/ml) y
por extensin en superficie (103/ml) Micrococcus luteus,
Micrococcus roseus, Staphylococcus epidermidis
Cultivos mixtos de 108/ml para aislar por agotamiento
Metodologa de Trabajo
Estriar el inculo del rea "1" sobre el rea "2." Flamear el ansa
y enfriar el alambre tocando el borde el agar.
Estriar el inculo del rea "2" sobre el rea "3." Flamear el ansa
y enfriar el alambre tocando el borde el agar.
25
Estriar el inculo del rea "3" sobre el rea "4." Flamear el ansa
y enfriar el alambre tocando el borde del agar.
TRABAJO PRCTICO 4
MICOLOGA
Objetivos:
Aprender a reconocer las caractersticas morfolgicas macro y
microscpicas de los hongos pluri y unicelulares de importancia en
el sector agroalimentario.
Observacin macroscpica:
Registrar las caractersticas siguientes de las macrocolonias,
adverso y reverso mediante una lupa binocular haciendo incidir
sobre la placa luz lateral:
- Color de la colonia
- Cambios del mismo en el reverso
- Cambios del color en el medio
- Textura superficial (suelta, compacta, plana, rugosa, curvada,
aterciopelada, enmaraada, flocosa, vellosa, filamentosa,
gelatinosa, coricea, etc.)
- Olor si existe
- Caractersticas del micelio, areo y sumergido (aspecto, color,
consistencia, presencia o ausencia de septos, etc.)
- Caractersticas y disposicin de los rganos de fructificacin
maduros, sean esporangios, conidios, conidiforos sueltos, etc.
- Color, tamao y forma de los rganos de fructificacin maduros.
Bibliografa:
Lennette and col.; Manual of Clinical Microbiology, 4ta Ed., American Society for
Microbiology, 1985, cap.46.
Pelczar and Reid; Microbiology, McGraw-Hill Book Cy., 1972, caps.14 y 15.
Pitt, J. & Hocking, A., Fungi and food spoilage, Academic Press, London, 1985.
Stanier and col.; The Microbial World, 5ta ed., Prentice-Hall, 1986, p.536-544.
29
Figura 4: Rhizopus sp
30
Figura 21 Fusarium
34
Tomado de:
http://bilbo.edu.uy/microbio/hongos.htm/
35
TRABAJO PRCTICO 5
Objetivos:
Capacitar al estudiante en las metodologas ms utilizadas en
microbiologa, para la cuantificacin de microorganismos viables.
Desarrollar habilidades en los estudiantes para el recuento de
las poblaciones de microorganismos viables presentes en muestras
de diferente origen.
1. Recuento en placa
RECUENTO EN PLACA
Permite determinar indirectamente el nmero de microorganismos
presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de
cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan
por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las
condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Como
las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo
de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS
(u.f.c.) Adems, a los efectos de que todas las clulas que estn
en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y
que la incertidumbre del mtodo sea menor, se establece que las
condiciones ptimas de recuento se dan cuando desarrollan entre 30
y 300 colonias por placa. Esta regla general se usa siempre que no
haya una especificacin diferente. Si fuera posible y necesario se
puede repetir el recuento para obtener placas con un nmero de
colonias ptimas.
Procedimiento
La preparacin de la muestra se realiza como para cualquier mtodo
utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones decimales
sucesivas (relacin muestra/volumen de dilucin 1 en 10), partiendo
generalmente de 10 g o ml de muestra en 90 ml de diluyente para la
primera dilucin (1/10 o 10-1). Para la segunda dilucin (1/100 o
10-2) se toma 1 ml de la 10-1 y se descarga en 9 ml de diluyente y
as sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga.
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Medio de cultivo
Se elige segn el tipo de microorganismos que se quiere contar
pudiendo emplearse medios ricos, electivos, selectivos o selectivos
y diferenciales.
Incubacin
Una vez enfriado el agar en el caso del recuento en profundidad, y
absorbida la muestra en el caso de recuento en superficie, las
placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde segn
los microorganismos a contar, durante el tiempo propuesto en la
tcnica correspondiente.
INTERPRETACIN
Finalizado el perodo de incubacin se observa con buena luz a
efectos de visualizar todas las colonias y diferenciarlas de
cualquier partcula de muestra que pueda confundir. Contar todas
las colonias desarrolladas por placa, marcando cada una con un
lpiz de tinta indeleble. Se cuentan como colonias individuales
todas aquellas que disten de las colonias prximas una distancia al
menos igual al dimetro de la colonia ms pequea.
Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente
forma:
1) Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300
colonias. Se hace el clculo multiplicando por la inversa de la
dilucin y luego se promedian si corresponde- los valores de las
distintas placas y diluciones. Para el informe final se toma en
cuenta solo los valores de estas placas.
Si no hay placas que contengan entre 30 y 300 colonias proceder de
la siguiente manera:
2) Si slo hubieran placas con menos de 30 colonias, se hace el
clculo multiplicando por la inversa de la dilucin y se informa
38
No se afectan los
Temperatura del agar puede
microorganismos
afectar la viabilidad de
termosensibles
algunos microorganismos
Tapar las placas y dejarlas sin invertir una media hora hasta que
se hayan secado las gotas.
ufc NxF
=
g o ml V
V = Volumen de la gota
N de Tubos
Positivos en NMP en el inculo de la serie
intermedia de tubos
Primera Serie ltima
serie intermedia serie
0 0 0 < 0.03
0 0 1 0.03
0 0 2 0.06
0 0 3 0.09
0 1 0 0.03
0 1 1 0.061
0 1 2 0.092
0 1 3 0.12
0 2 0 0.062
0 2 1 0.093
0 2 2 0.12
0 2 3 0.16
0 3 0 0.094
0 3 1 0.13
0 3 2 0.16
0 3 3 0.19
1 0 0 0.036
1 0 1 0.072
1 0 2 0.11
1 0 3 0.15
1 1 0 0.073
1 1 1 0.11
1 1 2 0.15
44
1 1 3 0.19
1 2 0 0.11
1 2 1 0.15
1 2 2 0.20
1 2 3 0.24
1 3 0 0.16
1 3 1 0.20
1 3 2 0.24
1 3 3 0.29
2 0 0 0.091
2 0 1 0.14
2 0 2 0.20
2 0 3 0.26
2 1 0 0.15
2 1 1 0.20
2 1 2 0.27
2 1 3 0.34
2 2 0 0.21
2 2 1 0.28
2 2 2 0.35
2 2 3 0.42
2 3 0 0.29
2 3 1 0.36
2 3 2 0.44
2 3 3 0.53
3 0 0 0.23
45
3 0 1 0.39
3 0 2 0.64
3 0 3 0.95
3 1 0 0.43
3 1 1 0.75
3 1 2 1.2
3 1 3 1.6
3 2 0 0.93
3 2 1 1.5
3 2 2 2.1
3 2 3 2.9
3 3 0 2.4
3 3 1 4.6
3 3 2 11
3 3 3 > 24
N de Tubos
Positivos en NMP en el inculo de la serie
intermedia de tubos
Primera Serie ltima
serie intermedia serie
46
0 0 0 < 0.01
0 0 1 0.02
0 1 0 0.02
0 2 0 0.04
1 0 0 0.02
1 0 1 0.04
1 1 0 0.04
1 1 1 0.06
1 2 0 0.06
2 0 0 0.05
2 0 1 0.07
2 1 0 0.07
2 1 1 0.09
2 2 0 0.09
2 3 0 0.12
3 0 0 0.08
3 0 1 0.11
3 1 0 0.11
3 1 1 0.14
3 2 0 0.14
3 2 1 0.17
4 0 0 0.13
4 0 1 0.17
4 1 0 0.17
4 1 1 0.21
4 1 2 0.26
47
4 2 0 0.22
4 2 1 0.26
4 3 0 0.27
4 3 1 0.33
4 4 0 0.34
5 0 0 0.23
5 0 1 0.31
5 0 2 0.43
5 1 0 0.33
5 1 1 0.46
5 1 2 0.63
5 2 0 0.49
5 2 1 0.7
5 2 2 0.94
5 3 0 0.79
5 3 1 1.1
5 3 2 1.4
5 3 3 1.8
5 4 0 1.3
5 4 1 1.7
5 4 2 2.2
5 4 3 2.8
5 4 4 3.5
5 5 0 2.4
5 5 1 3.5
5 5 2 5.4
48
5 5 3 9.2
5 5 4 16
5 5 5 > 24
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Bibliografa:
TRABAJO PRCTICO 6
VIRUS: BACTERIFAGOS
Introduccin
1. Adsorcin
Los sitios de ataque de la cola del bacterifago se adsorben a los
sitios receptores sobre la pared celular de una bacteria husped
susceptible.
2. Penetracin
Una enzima bacterifaga taladra un orificio en la pared celular
bacteriana y el bacterifago inyecta su genoma dentro de la
bacteria. ste comienza el perodo eclipse, perodo en el cual
ningn bacterifago intacto puede observarse dentro de la bacteria.
3. Replicacin
Enzimas codificadas por el genoma bacterifago obstruyen la
sntesis macromolecular de la bacteria (protena, RNA, DNA). El
genoma bacterifago se replica y la maquinaria metablica de la
bacteria es utilizada para sintetizar enzimas bacterifagas y
componentes bacterifagos estructurales.
4. Maduracin
Las partes del bacterifago se congregan alrededor del genoma.
5. Liberacin
Una lisosyma codificada por el bacterifago disuelve el
peptidoglicano bacteriano causando la lisis osmtica de la bacteria
y la liberacin de los bacterifagos intactos.
6. Reinfeccin
De 50-200 bacterifagos pueden producirse por bacteria infectada y
ellos ahora infectar las bacterias circundantes.
Objetivos
55
Materiales
Procedimiento
B. ESPECIFICIDAD VIRAL
Procedimiento
Siembra
Procedimiento
Resultados
Dilucin:.............. Dilucin:..............
Recuento:.............. Recuento:...............
B. Especificidad viral
C DETERMINACIN DE COLIFAGOS
1 2 3
Bibliografa:
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/16mutacion.htm
http://mikrobiologia.elte.hu/?q=system/files/PRACTICALGUIDE-2012-A.pdf
59
TRABAJO PRCTICO 7
Introduccin
Objetivos
Que el alumno conozca algunas de las tcnicas disponibles para
evaluar la calidad higinica de superficies, manos y ambiente. Que
compare las ventajas y desventajas de cada una en funcin de la
informacin que se obtiene, del tiempo invertido y de los recursos
necesarios.
Materiales
Procedimiento
1. Sacabocado / delimitador
2. Hisopo / delimitador
3. Aclarado o lavado
Sacabocado / delimitador
Hisopo / delimitador
Aclarado o lavado
TRABAJO PRCTICO 8
Introduccin
Objetivos
Materiales
Frascos estriles
Solucin salina isotnica estril
Hisopo de algodn estril
Bolsas aptas para homogeneizador de alimentos (Stomacher)
Enrofloxacina
Sensidisco
Cultivo de Escherichia coli sensible a enrofloxacina
Agar de Mueller-Hinton
Sacabocado estril
Procedimiento
1. Control de siembra
2. Control de antibitico: Se colocar un disco con antibitico
(Sensidisco Enrofloxacina)
3. Control de gallina sin tratar
4. Muestra
5. Incubar a 37C durante 48 horas.
6. Nota: En 3 y 4. Se extraer una porcin de agar con sacabocado
utilizando tcnicas estriles. Se colocar en cada pocillo, 0,05
ml aproximadamente de la muestra correspondiente.
7. Lectura: Realizar la medicin de halo de inhibicin, con calibre
o regla
Interpretacin de resultados
Bibliografa
Daz R., Gamazo C., Lpez-Goi I. Manual prctico de microbiologa. pg. 123-125.
Masson S.A.; Barcelona, Espaa. 1995.
66
Introduccin
Tipos de tinciones.
MATERIALES
Microscopio
Portaobjetos
Asa de siembra
Cultivo bacteriano
Pinzas
Mechero
Azul de metileno alcalino
Safranina
PROCEDIMIENTO
La tcnica es la siguiente:
Safranina:
Safranina O (sol. al 5% en etanol de 96) 10 ml
Agua destilada 100 ml
72
MATERIALES
Microscopio
Portaobjetos
Asa de siembra
Cultivo bacteriano
Pinzas
Mechero
Cristal violeta
Lugol de Gram
Alcohol-acetona
Safranina
PROCEDIMIENTO
Solucin de Lugol
Yodo 1 g
Yoduro de potasio 2 g
Agua destilada 300 ml
74
Solucin de safranina
Safranina 2,5% en etanol 10 ml
Agua destilada 100 ml
Bibliografa:
MATERIALES
Microscopio
Portaobjetos
Asa de siembra
Cultivo bacteriano en fase estacionaria
Pinzas
Mechero
Papel de filtro
Solucin acuosa de verde de malaquita al 5%
Safranina
PROCEDIMIENTO
MATERIALES
Microscopio
Portaobjetos
Asa de siembra
Cultivo fngico
Pinzas
Mechero
Azul de lactofenol
Azul de metileno alcalino
Cinta adhesiva transparente
Introduccin
PROCEDIMIENTO
Azul de lactofenol
Cristales de fenol 20 g
cido lctico 20 ml
Glicerol 40 ml
Azul coton (metil-azul) 0,05 g
Agua destilada 20 ml
SEMINARIOS 2017