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Diagnstico microbiolgico de
57 la infeccin por el virus del
papiloma humano
Emilia Cercenado Mansilla Mara Luisa Mateos Lindemann Mara Luisa Mateos Lindemann
Rafael Cantn Moreno Sonia Prez-Castro
Mara Teresa Prez-Gracia
Manuel Rodrguez-Iglesias
ISBN: 978-84-608-7617-5
EDITORES:
Emilia Cercenado Mansilla. Servicio de Microbiologa. Hospital General Universitario Gregorio Maran.
Madrid.
Rafael Cantn Moreno, Servicio de Microbiologa. Hospital Universitario Ramn y Cajal e Instituto Ramn
y Cajal de Investigacin Sanitaria (IRYCIS). Madrid.
SUGERENCIA DE CITACIN:
Mateos Lindemann ML, Prez-Castro S, Prez-Gracia MT, Rodrguez-Iglesias M. Diagnstico micro-
biolgico de la infeccin por el virus del papiloma humano. 57. Mateos Lindemann ML (coordinador).
Procedimientos en Microbiologa Clnica. Cercenado Mansilla E, Cantn Moreno R (editores). Sociedad
Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica (SEIMC). 2016.
AVISO:
Reservados todos los derechos. Los documentos SEIMC o cualquiera de sus partes no podrn ser
reproducidos, almacenados, trasmitidos, distribuidos, comunicados pblicamente o transformados me-
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por la ley. Cualquier publicacin secundaria debe referenciarse incluyendo Este documento ha sido
elaborado por la SEIMC (Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica) y su
contenido puede encontrase en la pgina web www.seimc.org
Procedimientos en Microbiologa Clnica
Editores:
Emilia Cercenado Mansilla
Rafael Cantn Moreno
57 . DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE LA
INFECCIN POR EL VIRUS DEL PAPILOMA
HUMANO . 2016
Coordinador:
Maria Luisa Mateos Lindemann1
Autores:
Mara Luisa Mateos Lindemann1
Sonia Prez-Castro2
Mara Teresa Prez-Gracia3
Manuel Rodrguez-Iglesias4
1
Servicio de Microbiologa. Hospital Universitario Ramn y Cajal. Madrid. 2 Servicio de Microbiologa. Hospital EOXI
de Vigo, Meixoeiro, Pontevedra. 3 rea de Microbiologa. Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad CEU Car-
denal Herrera, Moncada. Valencia. 4 Servicio de Microbiologa. Hospital Universitario Puerta del Mar, Universidad
de Cdiz, Cdiz.
NDICE DEL DOCUMENTO CIENTFICO
1. Introduccin............................................................................................................................................... 6
4. Transmisin.............................................................................................................................................. 13
5. Epidemiologa........................................................................................................................................... 13
8. Indicaciones clnicas................................................................................................................................ 21
9. Bibliografa................................................................................................................................................ 24
DOCUMENTO TCNICO
1. PNT-VPH-01. Deteccin de cidos nucleicos del virus del papiloma humano (VPH).
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ABREVIATURAS
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DOCUMENTO CIENTFICO
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DOCUMENTO CIENTFICO
prctica clnica. Casi todas estn automatizadas, son mujeres que mueren por cncer de mama. Esta si-
muy reproducibles y tienen una elevada sensibilidad tuacin provoca una importante y evitable carga para
para detectar la presencia del virus en mujeres con le- las familias jvenes y, en un grado muy grave, afectan
siones premalignas. Por todo ello, hay acuerdo entre a los nios que pierden a su madre. Sin embargo, la
los expertos de que la prueba de deteccin del VPH trascendencia de estos hechos no ha sido suficiente-
debe usarse como prueba inicial o de primera lnea mente divulgada en el discurso social. La trivializacin
en el cribado del CCU en sustitucin de la citologa o del tema con la participacin de los medios de difusin
tincin de Papanicolau, tradicionalmente utilizada has- ha marginado la necesidad de una discusin clara y
ta ahora con este fin pero que ha mostrado ser poco responsable acerca de la salud sexual y el impacto de
sensible y muy subjetiva comparativamente. Asimis- esta ITS en la sociedad. La realidad biolgica es que
mo, considerando que los genotipos VPH16 y VPH18 la exposicin a la infeccin y reinfeccin frecuente con
causan el 70% de los CCU, todos los esfuerzos se los tipos de VPH mucosotrpicos en jvenes pueden
han dirigido tanto a la prevencin primaria de estos tener consecuencias graves en la salud a largo plazo.
genotipos concretos (vacunas bi o cuadrivalentes aa- El presente documento pretende ser una puesta al da
diendo los VPH6 y VPH11) como a su deteccin con el de los cuadros clnicos mas frecuentes originados por
genotipado selectivo o parcial (identificacin individua- el VPH y sobre todo, dar informacin suficiente para
lizada de VPH16 y VPH18, adems de otros VPH-AR), elegir el mtodo mas adecuado de diagnstico que
aconsejado en el cribado poblacional. se debe utilizar en la prctica clnica diaria y su utilidad
junto con otras pruebas de triaje, en los algoritmos de
Por otra parte, el VPH no solo origina una morbilidad y cribado de CCU y CA.
mortalidad alta en mujeres sino que los procesos ma-
lignos asociados a este virus estn aumentando en es-
tos ltimos aos tambin en hombres, principalmente 2. ASPECTOS VIROLGICOS. VPH Y ON-
el cncer anal, cncer de pene y cncer de la cavidad COGENES
oral. As, los cnceres localizados en zonas genitales
han aumentado su tasa anual en, aproximadamente, 2.1. VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH)
un 3% y los de la cavidad oral en un 1%, alcanzando
estos ltimos una incidencia de 6,2 y 1,4 por 100.000, El VPH pertenece a la familia Papillomaviridae, y son
en hombres y mujeres, respectivamente. Estas cifras virus que generalmente infectan la piel y las mucosas.
pueden ser ms altas en individuos infectados por el Se han clasificado en VPH-AR y VPH-BR segn su
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), hombres capacidad oncognica. Los VPH-BR nicamente oca-
que tienen sexo con hombres (MSM) e inmunodepri- sionan las verrugas y condilomas genitales y otras pa-
midos, en general. Igualmente, el VPH16 es el genoti- tologas benignas de piel y mucosas y la asociacin
po prevalente tanto en el CA como en en el CCO. Los con el CCU es bastante infrecuente por lo que, desde
mismos criterios de cribado y vacunacin aprobados el punto de vista clnico y de cribado, nicamente se
para el CCU sirven tambin para el CA aunque este deben detectar los VPH-AR.
terreno est menos estudiado, y todava no hay algo-
ritmos validados para comprobar su eficacia. El grupo de VPH-AR comprende los genotipos 16, 18,
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 y 59 (Tabla 1). El ge-
En la infeccin por el VPH tambin hay otros factores notipo 68 se considera de probable riesgo oncog-
que conviene considerar. Existe un reconocimiento in- nico y el genotipo 66 previamente era considerado de
adecuado del impacto social en las sucesivas etapas alto riesgo y por esta razn, estn incluidos en muchas
de la vida de las infecciones por el VPH: los recin de las pruebas de deteccin del ADN del VPH (prueba
nacidos que contraen los tipos de VPH de bajo riesgo VPH) disponibles en el mercado.
6 y 11 pueden desarrollar la PRR; los adolescentes
con infecciones benignas, son altamente contagiosos; Los VPH son virus pequeos, de aproximadamente
en la mediana edad hay consecuencias importantes 50-55 nm de dimetro, sin envoltura y con una cpside
sobre la capacidad reproductiva y el bienestar de la icosadrica formada por 72 capsmeros. Su genoma
madre, as como en las personas de edad avanzada est constituido por ADN circular, de doble cadena,
que tienen un mayor riesgo de cncer. De los princi- covalentemente cerrado, de un tamao de 7500-8000
pales tipos de cncer en la mujer, el CCU produce una pb. Este ADN se divide en: 1) una regin E, de expre-
reduccin en los aos de esperanza de vida, estimada sin temprana que codifica diversas protenas estruc-
en 29 aos, considerablemente mayor que para las turales (E1-E7); 2) una regin L, de expresin tarda
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DOCUMENTO CIENTFICO
Alfapapillomavirus
1 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 Evidencia suficiente de cncer cervical
2B 26, 53, 66, 67, 70, 73, 82 Evidencia limitada de cncer cervical
Betapapillomavirus
Evidencia limitada para cncer de piel en
2B 5, 8
pacientes con epidermodisplasia verruciforme
3 Otros tipos
que codifica las protenas de la cpside (L1 y L2); y La integracin del ADN del VPH en el cromosoma de la
3) una regin reguladora, no codificadora (RNC/LCR), clula husped est asociada con la progresin de CIN
situada en direccin 5. La regin temprana (E) repre- de alto grado (CIN3) a cncer. La integracin aparece
senta un 50% del genoma, la tarda (L) un 40% y la en la mayora de los carcinomas invasivos pero es rara
regin reguladora (RNC/LCR), un 10%. en lesiones premalignas y benignas. En la misma c-
lula pueden coexistir formas integradas y epismicas.
2.2. RELACIN ENTRE VPH Y CNCER Los puntos de insercin para la integracin vrica en el
genoma del husped son mltiples y pueden afectar a
Est demostrado que en la mayora de los casos la distintos cromosomas en proximidad a oncogenes ce-
infeccin por el VPH es una condicin necesaria, si lulares. El lugar de integracin del genoma vrico est
bien no nica, para el desarrollo de la neoplasia intrae- caractersticamente situado entre el final 3 de E1 y el
pitelial cervical (CIN) y del cncer. La CIN puede ser de 5 de E2, dando como resultado la ruptura, prdida o
bajo grado (CIN1), moderada (CIN2) y de alto grado inactivacin del ORF de E2 y la funcin de regulacin
(CIN3). La asociacin entre el VPH y la CIN se basa en de la replicacin vrica que ejerce la protena E2 sobre
varios puntos: 1) El virus se detecta en ms del 97% otras protenas del virus. La integracin puede tambin
de las CIN y carcinomas invasivos, principalmente los afectar a los genes E1, E4, E5, L1 y L2 pero nunca
genotipos 16, 18, 31 y 45; 2) la infeccin por el VPH afecta a E6 y E7. La integracin vrica no siempre es
tiene el mayor riesgo relativo para desarrollar lesiones necesaria para la transformacin maligna, as, algunas
premalignas, comparado con otros posibles factores infecciones producidas por el VPH de bajo riesgo se
de riesgo asociados; 3) la progresin de la lesin est han asociado a carcinoma de clulas escamosas, y
relacionada con el tipo de VPH presente en la lesin; en ellas el virus, mantenindose epismico, haba su-
4) el desarrollo de un CIN de grado 3 (CIN3) est muy frido deleciones, mutaciones y amplificaciones en su
relacionado con la existencia anterior a dos aos de genoma.
una infeccin cervical crnica por VPH16 o VPH18; y
5) existe asociacin entre VPH y carcinomas de vulva, Se han identificado tambin otros factores endgenos
vagina, pene, ano y, en menor frecuencia, carcinomas asociados a la transformacin maligna. Los oncoge-
de la cavidad oral, laringe, esfago y tracto respira- nes celulares c-myc y c-ras se pueden activar por la
torio. integracin del ADN vrico en su proximidad. Esto es
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DOCUMENTO CIENTFICO
significativo, puesto que E7 puede cooperar en la acti- proceso de endocitosis e inactivacin de estos recep-
vacin de c-ras e inducir una transformacin celular in tores. E5 tambin se une a una porina que participa en
vitro. La metilacin puede tambin alterar la funcin de la bomba de protones endosmica, y su inactivacin
los genes celulares y vricos. Tambin se han detecta- conduce a la inhibicin en la acidificacin del endoso-
do anormalidades genticas en carcinomas cervicales ma, incrementando la vida media del receptor EGF y
afectando al cromosoma 1, y prdidas allicas en el favoreciendo la accin funcional del EGF de activacin
brazo corto de los cromosomas 3 y 17 y en el lar- de los oncogenes c-fos y c-jun.
go del cromosoma 11. Los genes supresores, como
p53, pueden estar delecionados en el cromosoma 17 Las protenas E6 y E7 juegan un papel central en la
y las protenas E6 y E7 pueden inducir anormalidades transformacin maligna. Ambas se unen a factores ce-
cromosmicas in vitro. Algunos trabajos han asociado lulares con diferente afinidad segn el genotipo vrico,
haplotipos HLA-DQ con cncer cervical sugiriendo un lo que permite distinguir entre protenas con alta ca-
posible papel de factores inmunogenticos. pacidad oncognica (VPH-AR) de otras con escaso o
nulo poder transformante (VPH-BR).
Asimismo, se ha comprobado que existen numero-
sos factores exgenos que juegan un papel coope- E6 es una protena que se fija al ADN bicatenario. En
rador en la transformacin maligna relacionada con el combinacin con una protena asociada, la ubiqui-
VPH. Entre ellos se incluyen las radiaciones X y UV, tinaligasa, (E6-AP) se une a p53, una protena muy
el tabaco, las hormonas esteroideas, las vitaminas A importante en la regulacin del ciclo celular y que se
y D, los retinoides, los factores de crecimiento como acumula en el ncleo durante la fase G1 del ciclo ce-
el beta-TGF, los factores de crecimiento epidrmico y lular. Esta protena detecta el ADN daado y activa
derivado de las plaquetas, citoquinas como el TNF y una serie de genes que inhibirn el progreso del ciclo
los interferones alfa y gamma, y virus tales como VIH y celular o estimularn la apoptosis. La protena p53 es
los herpesvirus. degradada por el complejo E6-AP mediante mecanis-
mos ligados a la ubiquitina. En las clulas eucariotas
2.3. PROTENAS ONCOGNICAS DEL VPH existen dos mecanismos de proteolisis: uno es a tra-
vs de la funcin del lisosoma, que est reservado
Las protenas E1 y E2 estn implicadas en la repli- para las protenas que han entrado en la clula me-
cacin vrica, formando un complejo esencial como diante endocitosis o pinocitosis, mientras que el otro
activador transcripcional del genoma vrico. E1 tam- mecanismo degrada protenas endgenas mediante
bin contribuye al mantenimiento del virus en forma la participacin del proteosoma que destruye aquellas
epismica y puede estar ausente cuando el ADN v- protenas marcadas previamente con ubiquitina. Aun-
rico permanece integrado. Los estudios con VPH16 que la ruta ubiquitina-proteosoma fue inicialmente
han demostrado la funcin de E2 como regulador de descrita como una forma de eliminar protenas de-
la transcripcin y represor de la expresin de E6 y E7, fectuosas y no funcionales, actualmente se ha com-
al unirse el promotor de E6 a la unin proximal de E2 probado que constituye un mecanismo crucial como
(figura 1). En contraste, la integracin vrica fragmenta regulador celular al degradar protenas como ciclinas,
al gen E2 y permite la transactivacin sin control del p53, c-jun y c-fos, participando en muchos procesos
promotor E6/E7 mediante otros factores de transcrip- celulares, incluyendo la progresin del ciclo celular, la
cin como TFIID y SpI, induciendo cambios de diferen- regulacin transcripcional y la presentacin de antge-
ciacin y proliferacin celular, con expresin de CD44 no. De forma resumida consiste en una reaccin en
en la membrana celular. cadena en la que, tras la activacin de la ubiquitina
por la accin de la enzima E1, se une mediante una
La protena E5 est unida a la membrana y participa en enzima conjugante (E2 o UBC) con la protena diana,
la transformacin maligna de la clula. Sin embargo, que a su vez esta unida a la ligasaubiquitina-protena
su participacin no es imprescindible, ya que a me- (E3) y este complejo es reconocido por el proteo-
nudo el gen E5 se encuentra delecionado en clulas soma y conduce a la proteolisis. La E6-AP ligada a
de cncer de crvix. Participa en el proceso de tumo- la oncoprotena E6 de VPH y a p53 funciona como
rignesis interactuando con receptores de factores de una enzima E3 y facilita la degradacin de la prote-
crecimiento celular, incluyendo el receptor del factor na diana, p53 en este caso, por el proteosoma. La
de crecimiento epidrmico (EGF) y, en el caso de VPH- p53 contribuye a detener el ciclo celular en fase G1,
6, tambin con erbB2 y el receptor del factor de cre- transactivando el gen WAF1/CIP1, cuya protena p21
cimiento de las plaquetas (figura 2), interfiriendo en el interacta directamente con el complejo ciclina/kina-
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DOCUMENTO CIENTFICO
Figura 1. Organizacin genmica del VPH16 y de su segmento regulador (URR). El URR comienza despus
del codon de parada del ORF de L1 y termina antes del inicio del ORF de E6. La unin de E2 en ciertos
lugares (E2BS) provoca la represin de E6/E7, siendo contrarrestado por otros factores de trascripcin
como SpI y TFIID.
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Figura 2. La activacin del receptor EGF por la accin experimental del ster de forbol o por la unin con
su ligando, conduce a la activacin en cascada de kinasas que inducen la expresin de Ap-1 y la sntesis
de las protenas proto-oncognicas jun y fos, dando como resultado la diferenciacin y proliferacin de
la clula. Este proceso se controla por la endocitosis del receptor EGF, en donde es degradado por las
condiciones acdicas del endosoma. La acidificacin del endosoma depende de la actividad de una bomba
de protones que puede ser bloqueada por la accin de la protena E5..
clulas cervicales y neuronales, estando muy aumen- La obtencin de ratones transgnicos que expresan
tado en las clulas malignizadas por VPH, debido a por separado las protenas E6 y E7 ha permitido estu-
que acta sobre la transcripcin del virus en la regin diar los efectos aislados de stas sobre la carcinog-
URR. nesis, observndose que E7 induce tumores benignos,
al contrario que E6, que produce la transformacin
La protena E7 altera la funcionalidad de la pRB (prote- maligna de la clula. La carcinognesis es un proceso
na del retinoblastoma), un producto del gen supresor complejo con mltiples efectos sobre el genoma y que
de tumores Rb-1, que al unirse al factor de transcrip- requiere la induccin del tumor benigno y una serie de
cin EF-2 y su protena asociada DP-1 frena el ciclo efectos en cascada que conducen a la malignizacin.
celular en la fase G1. La unin E7-pRB modifica e in-
activa su funcin de control del ciclo celular colaboran- La deteccin de formas epismicas del VPH causan-
do en la transformacin. Tambin E7 puede unirse a tes de carcinoma de crvix ha estimulado el estudio
las protenas p107 y p130, con funciones similares a la de otros factores que no impliquen la integracin del
pRB, provocando la misma accin. Del mismo modo virus en el cromosoma de la clula. As, se ha demos-
que E6, E7 tiene actividad reguladora de la transcrip- trado que mutaciones en el lugar de fijacin del factor
cin del oncogen ras en cultivos celulares y en anima- de transcripcin YY del segmento URR conducen a la
les transgnicos (figura 3). progresin del cncer cervical.
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que transcurre entre la infeccin por el VPH y la inci- se caracteriza por el crecimiento de mltiples papilo-
dencia de cncer es de dos a cuatro dcadas, por lo mas, habitualmente en la regin larngea. La PRR pue-
que el inicio de la infeccin y las lesiones precursoras de manifestarse en la infancia temprana, con un inicio
del CCU son un objetivo apropiado para el cribado y la juvenil, o en la edad adulta y es una enfermedad poco
deteccin temprana. frecuente. El factor de riesgo ms importante para la
PRR juvenil es una historia materna de verrugas geni-
En cuanto a los cnceres de la vagina y sus lesiones tales en el embarazo, mientras que para la PRR adulto,
precursoras, el ADN del VPH se detecta en la mayora lo son el nmero de parejas sexuales a lo largo de su
de los casos. Entre el 60% y el 90% de los casos de vida y el sexo genital oral. Se han evaluado muchas
cncer vaginal y entre el 82% y el 100% de las lesiones terapias para la PRR, con un xito limitado y, a menu-
vaginales catalogadas como neoplasia intraepitelial do, con efectos secundarios graves. Puede ser que
(VIN) de grado 3 son VPH-ADN positivo. la terapia ms eficaz a largo plazo sea la que estimula
una respuesta inmune eficaz y persistente mediante la
Igualmente se ha encontrado tambin ADN del VPH vacunacin.
en los cnceres de la vulva, aunque la asociacin de
la infeccin por VHP con estos es menor, alrededor de
un 40-50%. 4. TRANSMISIN
En los hombres, a pesar de que la neoplasia intraepite- El VPH es un agente responsable de una enfermedad
lial del pene (PIN) es poco conocida, los datos revelan altamente contagiosa que afecta a la especie humana
la participacin del VPH aunque la persistencia es me- debido a su comportamiento sociable. Los datos de
nos probable, el ADN del VPH se encuentra solamente los que se dispone actualmente indican que la trans-
en un tercio de los casos de cncer de pene y en el misin del VPH entre parejas heterosexuales es extre-
87,1%de las lesiones de alto grado. madamente comn, principalmente por contacto con
la piel de la zona genital pero tambin puede transmi-
El CA es una patologa que se puede considerar emer- tirse por contacto con mucosas y fluidos biolgicos.
gente desde que se asoci a la infeccin por el VPH. Se ha descrito algn caso de infeccin por compartir
Incide preferentemente en varones homosexuales objetos sexuales.
pero tambin en mujeres infectadas en el crvix. En
ambos sexos, el ADN del VPH se detecta en el cncer Tambin es comn en la mujer la autoinoculacin entre
anal (88-94%). las regiones genitales y anales. Los estudios demues-
tran que las infecciones por VPH en la regin anal en
Por ltimo, entre las patologas malignas asociadas al mujeres y en MSM son muy frecuentes, sobre todo en
VPH se encuentran los CCO. En ellos, la prevalencia personas infectadas por el VIH. Del mismo modo, el
de ADN del VPH vara mucho segn los diferentes es- aclaramiento del VPH anal es tambin comn y pocos
tudios, la localizacin anatmica del tumor y la geo- individuos muestran persistencia, a menos que estn
grafa, debido a factores exgenos y culturales pro- infectadas por el VIH. Este es un factor que influye en
pios. En el cncer de orofaringe, el ADN de VPH se ha gran medida en el desarrollo del estado precursor del
encontrado entre el 35 y el 50% en pacientes en los cncer invasor anal.
pases desarrollados, en contraste con el resto de la
cavidad oral, donde el ADN de VPH se encuentra en Al igual que lo que ocurre con la prevalencia del VPH
el 5 al 15% de los casos. Tambin se ha confirmado genital, tener un alto nmero de parejas sexuales au-
la expresin del ARNm de E6/E7 y la integracin del menta el riesgo de adquisicin de infecciones por el
genoma vrico y los modelos experimentales han mos- VPH. Otros factores de riesgo son no utilizar protec-
trado la expresin de las protenas oncognicas E6/ cin en el acto sexual, aunque se ha comprobado que
E7 como necesarias para la iniciacin y mantenimiento utilizar preservativo no protege al 100%, las relaciones
del fenotipo maligno de estos cnceres. entre MSM y tener una disminucin de la inmunidad.
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DOCUMENTO CIENTFICO
En Espaa, en 2012 hubo 2.511 nuevos casos y las El cepillado anal, tanto en mujeres como en hombres,
estimaciones para 2020 son de 2.710, y en cuanto se realizar de varias zonas tomadas al azar. Para la
a la mortalidad, en 2010 se produjeron 848 muertes, toma de muestra genitourinaria para deteccin del VPH
estimndose que en 2020 se producirn 949. en el varn, la localizacin elegida de la toma de mues-
tra marcar la sensibilidad. Aunque se pueden utilizar
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DOCUMENTO CIENTFICO
cepillados, orina y semen, algunos autores defienden consecuencia, debe realizarse un pretratamiento de
la triple toma en glande, surco coronario y uretra distal las muestras enviadas en el SurePath antes de la
(introduciendo los tres cepillos en un mismo vial). deteccin del VPH.
Tambin pueden recogerse cepillados de otras locali- En las especificaciones de algunas tcnicas se admite
zaciones para detectar la presencia del VPH pero no el uso de torunda sin medio.
se ha establecido el valor predictivo positivo o negativo
de tales determinaciones, tales como el cepillado de Se podran utilizar otros medios lquidos adecuados
amgdalas, interior de la boca y bordes de la lengua para PCR como buffer TE pH 8,0 (grado biologa mo-
en el caso del diagnstico de infeccin oral. Ciertos lecular). Aunque no existen muchos estudios que ha-
autores han descrito el uso de enjuagues bucales con yan comparado el efecto de la utilizacin de diversos
soluciones antispticas comerciales. Debe aclararse medios de transporte lquidos, ciertos autores han
que la deteccin del VPH en la cavidad oral no debe concluido que el resultado no se influye por los medios
utilizarse como cribado de cncer orofarngeo. Para de transporte sino por la sensibilidad analtica de las
ste, la biopsia extrada en el momento del tratamiento pruebas utilizadas.
quirrgico de la lesin es la muestra adecuada y hay
que sealar que es especialmente til. Dado que el 6.2. TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE
pronstico es diferente segn se detecte o no el VPH, LA MUESTRA
el resultado de la prueba ayudar a decidir la duracin
y dosis del tratamiento quimio y radioterpico mas Previamente a la toma de la muestra, los viales de ci-
adecuado. tologa lquida se mantendrn a temperatura ambiente.
Las muestras se cerrarn hermticamente, se etique-
En ciertos contextos clnicos podra ser til la biopsia tarn con el nombre de paciente y se acompaarn
de verrugas (por ejemplo, verrugas resistentes al tra- de una peticin con datos clnicos. El transporte de las
tamiento tpico o de lesiones verrugosas de dudosa muestras debe realizarse lo antes posible al laboratorio
etiologa y que precisan extraccin quirrgica). Se en- de Microbiologa a temperatura ambiente.
viarn en un bote estril sobre una gasa con un fon-
do de solucin salina en condiciones aspticas. Debe 6.3. MANEJO DE LA MUESTRA EN EL
evitarse el formol puesto que podra inhibir la PCR. En LABORATORIO
caso de que sean biopsias parafinadas, podrn ex-
traerse tras desparafinado con una solucin indicada Dado que no es una determinacin urgente, las mues-
para tal uso. tras se procesarn en grupos de mayor o menor ta-
mao segn el sistema a utilizar. Sin embargo, el ADN
Debe tenerse en cuenta que el genotipo del VPH que y sobre todo el ARNm pueden degradarse tras repe-
se detecte en cualquier localizacin es una aproxima- tidos ciclos de congelacin y descongelacin, por lo
cin al genotipo que est causando la lesin, puesto que siempre se recomienda no congelar, mantener
que puede haber otros en otra localizacin o incluso la muestra en nevera y demorar lo menos posible su
varios en infecciones mixtas. Sin embargo se reco- procesamiento. De forma general los medios de trans-
mendar siempre la toma de muestra menos invasiva porte se deben mantener un mximo de 4-6 semanas
que haya demostrado un valor pronstico adecuado. a temperatura ambiente (15-30C) antes de su proce-
Habitualmente se recomienda la utilizacin de los me- samiento. Los extrados de cidos nucleicos se deben
dios lquidos (medios de citologa lquida) en los que se mantener a -20C.
ha evaluado cada tcnica comercial y que en ciertas
ocasiones son los nicos viales reconocidos por los Las biopsias se machacarn para su posterior extrac-
aparatos automticos de extraccin/PCR. El de uso cin de cido nuclico y se congelarn a -20C.
ms extendido es el Thin Prep PreservCyt Solution
(Hologic Inc., Marlborough, MA, EUA). El BD Sure- Alguna muestra muy mucosa puede dar problemas de
Path (BD Diagnostics) es otro medio de citologa pipeteo durante la extraccin. Se pueden homogenei-
lquida que, a diferencia del anterior, contiene forma- zar previamente con ayuda de bolitas de vidrio estri-
lina. Esto promueve la unin del ADN del VPH a las les y con agitacin con vrtex previo a la extraccin.
protenas, lo que puede provocar una fragmentacin Deben tomarse las precauciones necesarias dado que
de dicho ADN interfiriendo con su amplificacin y por se podran formar gotitas que, segn la sensibilidad de
lo tanto reduciendo la sensibilidad analtica. Como la tcnica, podran dar lugar a contaminaciones.
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DOCUMENTO CIENTFICO
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DOCUMENTO CIENTFICO
resultados falsos positivos que tendran repercusiones caso se utiliza el sistema Abbott m2000 que consta
importantes en el aumento de seguimientos ginecol- de un gran mdulo extractor (m2000sp) y un mdulo
gicos innecesarios y los costes asociados. Estos estu- de termociclado en placa (m2000rt). Permite el pro-
dios de no inferioridad suelen realizarse con la ayuda cesamiento a partir de tubo primario e informa de los
de laboratorios de referencia donde tambin se evala genotipos 16, 18 y otros no16/18 de forma diferencia-
la reproducibilidad intralaboratorio y la concordancia da. Al igual que otros sistemas automatizados para la
interlaboratorio. deteccin del VPH, estn indicados para laboratorios
con elevada carga de trabajo y permiten la conexin
Por otra parte, el protocolo VALGENT (Validacin de direccional de datos con los principales programas de
Test de Genotipado del VPH) es una red internacional laboratorio.
y un foro de validacin de ensayos de genotipado del
VPH. Lleva a cabo la recoleccin de 1.300 muestras BD Onclarity utiliza un aparato de sobremesa (Viper
de citologa cervical que proporciona un gran laborato- LT) basado en la tecnologa Strand Displacement Am-
rio europeo con capacidad suficiente en su biobanco. plification (SDA) con PCR en tiempo real. Es novedo-
Entre estas muestras, se incluye un nmero suficiente so en tres aspectos: amplifica la regin E6/E7, lo que
de citologas con lesiones premalignas y tambin cito- tericamente podra evitar falsos negativos debidos a
logas normales para poder calcular la especificidad y la ruptura de la regin L1 durante la integracin del
sensibilidad de la prueba de deteccin del VPH. Los genoma. Adems informa los genotipos que solicita
informes generales de las evaluaciones se publican el usuario para cada muestra evitando informacin y
en una lista donde aparece claramente si cumple o gastos innecesarios: puede informar individualmente 6
no los umbrales para su uso en la prctica clnica. El genotipos y tambin puede dar resultados de 3 com-
protocolo VALGENT permitir a los organizadores de binaciones de otros genotipos. Por ltimo, los reacti-
programas de cribado realizar las mejores decisiones vos no requieren refrigeracin y vienen listos para uso.
respecto a cul es la prueba ms conveniente que se Est en curso su evaluacin por la FDA.
debe utilizar.
Anyplex II HPV HR (Seegene) se basa en la tecnologa
Asimismo, para conseguir la aprobacin de la FDA, de PCR multiplex en tiempo real con tecnologa DPO
una prueba debe establecer su sensibilidad y espe- y TOCE, de elevada sensibilidad y especificidad.
cificidad clnica mediante estudios prospectivos lleva- Permite el genotipado completo de los 14 genotipos
dos a cabo en 3 o ms lugares diferentes que son incluidos en una misma reaccin y su cuantificacin re-
evaluados por varias comisiones en un proceso largo lativa. La incorporacin del sistema NIMBUS permite
y costoso. Tambin debe probar su reproducibilidad, su automatizacin por lo que puede escalarse su grado
ausencia de reactividad cruzada, contaminacin y de automatizacin, resultando adecuado para labora-
arrastre, y que dichas caractersticas se mantengan a torios de baja, mediana o elevada carga de trabajo.
lo largo del perodo de almacenamiento mximo con-
siderado por el fabricante. El sistema de genotipado de Xpert HPV (Cepheid) des-
taca por ser el test de menor dificultad y mayor rapi-
Ciertas tcnicas poseen la aprobacin de la FDA para dez (1 hora) de los evaluados. Incluye la extraccin de
triaje de ASCUS y/o para cribado primario. Ninguna la cidos nucleicos en el mismo cartucho de reaccin de
posee actualmente para control post-tratamiento de PCR. Las muestras se procesan de forma individual y
cncer cervical, diagnstico de cncer anal, deteccin se obtiene el genotipado de VPH16 as como de otros
en varn o en orofaringe. 5 grupos de genotipos de alto riesgo. El riesgo de
contaminacin es mnimo, hacindolo adecuado para
7.3. COMPARACIN DE LAS PRUEBAS laboratorios con baja carga de trabajo o para situa-
DISPONIBLES ciones de consultas especficas en las que sea con-
veniente dar un resultado rpido desde el laboratorio
En la tabla 2, se reflejan las caractersticas de las prue- de Microbiologa. Con este sistema se puede utilizar
bas de deteccin del VPH validadas clnicamente para medio lquido o torunda seca.
cribado cervical.
Otras tcnicas novedosas de genotipado validadas
Abbott Real Time HR-HPV y BD Onclarity HPV son clnicamente son la deteccin mediante MALDI-TOF o
dos tcnicas de amplificacin de ADN mediante PCR mediante hibridacin reversa con arrays en microes-
en tiempo real totalmente automatizados. En el primer feras en suspensin (Luminex) de productos de PCR.
17
DOCUMENTO CIENTFICO
Tabla 2. Caractersticas de las pruebas de deteccin del VPH (Adaptado de Arbyn M, et al., 2015).
Aprobacin
cido Control
Gen Genotipado Control de FDA para
Test VPH-AR nucleico Amplifica interno de Automatizado
diana individual contaminacin cribado
diana celularidad
primario
Captura de Genoma No
ADN Seal No No No
hbridos completo (13 genotipos total)
PCR-EIA
ADN L1 Diana No No No No
GP5+/6+
No. Control
No (prototipo
interno para
APTIMA HPV ARN E6/E7 Diana identifica No Si
ARN y ADN
16, 18-45)
no infeccioso
Abbott
16,18, otros 12
RealTime High ADN L1 Diana si -globina No Si
VPH-AR
Risk HPV
16,18,31,45,51,52;
BD Onclarity
ADN E6/E7 Diana 3358; 565966; -globina No Si
HPV
353968
14 tipos. Tipado
Cervista HPV Histona
ADN L1/E6/E7 Seal rflex aparte: No Si
HR^ humana 2
16, 18
Cobas 4800 16,18, otros 12
ADN L1 Diana si -globina S Si
HPV VPH-AR
16,18,31,33,35,
"In house"
ADN E6/E7 Diana 39,45,51,52, -globina No No
qPCR(E6/E7)^^
56,58, 59,66,68;
16, 18 y otros 13
HPV-Risk assay ADN E7 Diana VPH-AR -globina No
(HC2 +66+67)
16,18,31,33,35,39,
PapilloCheck
ADN E1 Diana 45,51,5253,56,58, ADAT1 no No
HPV-screening
59,66,68*
16, 18, 31, 33, 35,
Anyplex II
ADN Diana 39, 45, 51, 52, 56, si si no no
HPV HR
58, 59, 66, 68
18
DOCUMENTO CIENTFICO
Las tcnicas validadas para cribado de cncer cervical 7.3.2. Cervista HPV HR (Hologic).
son, en su conjunto, tcnicas consenso que detectan En el ao 2009, la FDA aprob las pruebas Cervista
los genotipos del grupo 1A. Algunas de ellas, tambin HPV HR y Cervista HPV16/18 para su uso en el cri-
los genotipos 68 o incluso el 66. Aunque no hay duda bado de CCU. Es una tcnica de amplificacin de se-
de la carcinogenicidad de seis genotipos no incluidos al con tecnologa Invader. Consta de dos reacciones
entre los 12 del grupo 1A (VPH 68, 26, 66, 67, 73, 82) isotrmicas, la primera se produce en la secuencia del
y de que con su inclusin en pruebas diagnsticas se ADN del VPH y la segunda produce una seal fluores-
podra llegar a abarcar el diagnstico del 98,7% del cente. Incluye un control interno, el gen de la histona
cncer cervical, por su baja prevalencia no se consi- humana 2. El resultado informa de la presencia de al-
dera necesario incluirlos en las pruebas de cribado de guno de los 14 genotipos VPH-AR pero no los detecta
cncer cervical. de manera individualizada. Cervista HPV 16/18 identi-
fica los VPH16 y VPH18 individualmente.
Tambin existen en el mercado otras muchas prue-
bas de genotipado completo como Linear Array HPV 7.3.3. Cobas HPV Test (Roche Diagnostics).
Genotyping Kit (Roche Diagnostics) de uso muy ex- El sistema cobas 4800 (Roche Diagnostics, Mannhe-
tendido, para la deteccin de 37 genotipos, muy tiles im, Germany) es un sistema totalmente automatizado
para estudios de impacto vacunal o para conocer la compuesto por el cobas X, el termociclador cobas
epidemiologa de la infeccin por VPH. Z y el software necesario para la realizacin de una
PCR a tiempo real con primers de la regin L1 del
En general, se puede utilizar cualquier tcnica que est VPH. Se pueden procesar tandas desde 22 hasta
validada para el uso indicado, dependiendo de la can- 94 muestras y es capaz de realizar 1.344 pruebas en
tidad de muestras que se analicen, el entrenamiento 24 horas. Se utiliza el vial primario, es decir, el mismo
del personal y la organizacin general del laboratorio, que para la prueba de citologa lquida (reflex). Los
pero se recomienda la utilizacin de tcnicas automa- resultados aparecen diferenciados en cuatro canales:
tizadas, mejor si estn aprobadas por la FDA, por las VPH16, VPH18, otros VPH-AR no16,18 (31, 33, 35,
ventajas que suponen en cuanto a la estandarizacin 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 66) y beta-globina, que
y el control de calidad que ofrecen. A continuacin se se utiliza como control interno en cada muestra. Tie-
describen brevemente estas tcnicas (tabla 3). Las ne una alta sensibilidad clnica y se ha evaluado por
cuatro estn aprobadas por la FDA para el triaje de numerosos autores en estudios multicntricos como
ASCUS en cribado citolgico o para cribado con ci- el ATHENA con gran concordancia con los resulta-
tologa y VPH a la vez, pero slo una tcnica en la dos obtenidos por otras tcnicas de referencia. Es de
actualidad est aprobada por la FDA para el cribado destacar que en los resultados positivos no se han
poblacional basado en deteccin del VPH (Cobas observado reacciones cruzadas con VPH-BR. La re-
HPV Test). producibilidad y el grado de automatizacin son muy
elevados. Por todas estas caractersticas es uno de
7.3.1. Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA los sistemas mas extendidos y preferidos para el cri-
(Digene). bado primario.
Es la primera prueba aprobada por la FDA (marzo de
2003) para la deteccin de los genotipos carcinog- 7.3.4. Aptima HPV Assay (Hologic).
nicos del VPH. La captura de hbridos es el mtodo Aptima es una prueba que identifica la presencia de
ms evaluado en la literatura. Es una tcnica de am- 14 genotipos VPH-AR mediante el ARN mensajero vi-
plificacin de la seal que utiliza un cctel de sondas ral de los oncogenes E6 y E7 en citologa en medio
de alto riesgo, que en la ltima versin incluye 13 ti- lquido. No discrimina entre los genotipos presentes.
pos del VPH (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, Consta de tres pasos, captura, amplificacin mediante
58, 59 y 68) y otro para el grupo de bajo riesgo que el sistema TMA y deteccin de los productos amplifi-
incluye los genotipos 6, 11, 42, 43 y 44, por lo que cados por hibridacin. Tambin esta prueba incorpora
detecta cualquiera de estos genotipos en dos nicas un control interno en cada paso. Se puede realizar en
reacciones, si bien en el cribado de CCU slo se de- la plataforma automatizada Panther. En caso de utilizar
ben detectar los VPH-AR. El inconveniente es que no ThinPrep, la muestra debe transferirse a unos tubos
discrimina el genotipo presente. Tiene algunas limita- especficos. No realiza genotipado parcial pero ya exis-
ciones como la reactividad cruzada con algunos ge- te un prototipo que identifica VPH 16 y VPH 18/45. No
notipos de VPH-BR que ocasiona resultados falsos posee control de celularidad humana. En los estudios
positivos. publicados, este mtodo ha demostrado ser tan sen-
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DOCUMENTO CIENTFICO
Tabla 3. Indicaciones clnicas de las tcnicas VPH-AR aprobadas por la Food and Drug Administration.
SISTEMAS AUTOMATIZACION
FDA: indicacin aceptada
COMERCIALIZADOS Nombre (nmuestras/tiempo)
NOTA: En todas las pruebas aprobadas por la FDA se ha utilizado el medio de transporte Thin Prep PreservCyt
sible como las pruebas que detectan ADN-VPH con En los laboratorios que procesan un elevado nmero
una especificidad mayor, es decir con menos falsos de pruebas de biologa molecular y desde hace aos
positivos lo que resulta muy prometedor. Tericamente para el diagnstico de diversos patgenos, estos re-
la deteccin de ARNm debera correlacionarse mejor querimientos de calidad suelen ser mejores pues se
con la transcripcin activa de los oncogenes E6/E7. dan unas condiciones adecuadas de manejo e ins-
Los datos del ensayo clnico aleatorizado realizado talaciones para evitar contaminaciones. Asimismo se
con este test de deteccin de ARNm se han analizado aplicarn las precauciones generales para el manejo
a 3 aos. Debe esperarse a la demostracin del bajo de sustancias infecciosas comunes a todos los labo-
riesgo de >CIN3 tras un resultado negativo de ARNm ratoriosde Microbiologa.
a lo largo de un perodo de tiempo mayor para que no
quepa ninguna duda de su utilidad en el cribado de En el aseguramiento de la calidad es destacable la im-
cncer cervical a intervalos de 5 aos o ms. portancia del control de calidad interno, la evaluacin
externa de calidad y la mejora continua de calidad. La
Los tres ltimos ensayos presentan un alto grado de red de laboratorios de VPH de la OMS (WHO HPV La-
automatizacin, pudiendo realizar un gran nmero de bNet) ha establecido, entre otros, el primer estndar
pruebas con una mnima intervencin humana. internacional de ADN de VPH16 y VPH18. Tambin
lidera peridicamente estudios de evaluacin de ge-
7.4. CALIDAD notipado donde considera un test adecuado si detecta
50UI de VPH16 y VPH18 as como 500 equivalentes
El laboratorio de Microbiologa donde se realice la de genoma de los otros 12 tipos incluidos en el pa-
prueba de deteccin del VPH debe tener unos reque- nel tanto en coinfeccin como en monoinfeccin. Para
rimientos imprescindibles como una infraestructura ser adecuado tambin deber tener una tasa cero de
adecuada, el seguimiento de las directrices de buenas falsos positivos. Aunque es un control para validacin
prcticas de laboratorio y de procedimientos conside- analtica de pruebas de genotipado, no se descarta
rados estndar. Tambin es recomendable la acredita- que en un futuro elaboren un panel para evaluacin de
cin del laboratorio para pruebas moleculares clnicas pruebas de cribado. Otros controles de calidad exter-
as como la participacin en evaluaciones intra e inter- nos destacables son UKNEQAS (plan de evaluacin
laboratorio regulares. nacional de calidad externo del Reino Unido) y QCMD
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DOCUMENTO CIENTFICO
(control de calidad europeo para diagnstico molecu- por su riesgo de padecer lesiones mas severas de
lar). aquellas otras que pueden esperar un periodo de
tiempo, generalmente un ao, para entrar en otra
7.5. RETOS nueva ronda de cribado.
Control post-tratamiento (ablativo o escisional): la
El primer reto debe ser utilizar solo pruebas validadas deteccin del VPH predice el fallo del tratamien-
clnicamente o con marcado de la FDA para el cribado to ms rpidamente que el seguimiento citolgi-
de CCU. Tambin hay que tener en cuenta las discor- co. Pero hay que recordar que se debe esperar a
dancias de especificidad y sensibilidad entre las dife- los 4-6 meses (segn los bordes de la conizacin
rentes pruebas cuando se utilizan en programas de estn afectados o no) puesto que la repercusin
cribado, incluso cuando se comparan pruebas comer- clnica de la deteccin del VPH antes de transcurri-
ciales totalmente automatizadas y con marcado FDA. dos estos primeros 4 meses no se ha establecido.
Se deben utilizar pruebas con alta sensibilidad y espe- Es muy recomendable que los clnicos indiquen
cificidad clnica y totalmente evaluadas siendo tambin esta situacin en la peticin para poder valorar
aconsejable que estn totalmente automatizadas a un adecuadamente los resultados.
precio razonable. Seguimiento ginecolgico: control de mujeres con
resultados no coherentes en citologa y biopsia/col-
Otro reto importante es conseguir evidencia cientfica poscopia a las que no se ha indicado tratamiento.
en poblaciones vacunadas, pues todos los estudios CA: al igual que en el CCU, las muestras adecuadas
de sensibilidad y especificidad del cribado se han he- son el cepillado y la biopsia anal en caso de observar
cho con poblacin no vacunada. El rendimiento de las lesiones sospechosas de displasia anal en la anos-
pruebas diagnsticas podra variar en el cribado de la copia de alta resolucin. Desafortunadamente, la
poblacin vacunada. mayora de las tcnicas automatizadas no estn an
validadas para aplicarse en este tipo de muestras.
Mejorar la especificidad de las pruebas de deteccin CCO: la deteccin de la presencia del VPH en las
del VPH es uno de los objetivos a cumplir en los prxi- biopsias o muestras quirrgicas se relaciona con
mos aos, puesto que debido a la elevada prevalencia un mejor pronstico y menor numero de recadas.
de infeccin por el VPH en menores de 30 aos, la Por la dificultad del acceso a la faringe y laringe,
deteccin del VPH no puede utilizarse para cribado de que precisa sedacin del paciente, no se realizan
mujeres menores de esta edad. controles pre o post-tratamiento
21
DOCUMENTO CIENTFICO
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DOCUMENTO CIENTFICO
Tabla 4. Riesgo absoluto de lesiones >CIN3 en 3 aos de seguimiento en mujeres con citologa normal
segn resultado de prueba de deteccin de VPH-AR segn estudio ATHENA.
(Modificado de Wright TC, et al. 2012).
POSITIVO 4,1
NEGATIVO 0,3
Figura 4. Algoritmo de cribado poblacional basado en el genotipado parcial. (Modificado de Huh WK, et
al. 2015).
Cribado primario
VPH
Positivo:
Positivo genotipos
31, 33, 35, 39, 45, 51, Negativo
16/18
52, 56, 58, 59, 66, 68
>ASCUS
Colposcopia Citologa Screening de rutina
NILM
Seguimiento de
12 meses
de tiempo superior a 5 aos. Por lo tanto, sea con colectivo debera ser que a nivel de Salud Pblica, el
citologa, con prueba de deteccin de VPH-AR, con o plan de cribado sea lo ms extenso, sensible y espe-
sin genotipado parcial, el primer objetivo que hay que cfico posible segn la evidencia cientfica disponible
conseguir es que el cribado sea poblacional, es de- en cada momento pero siempre dentro de un marco
cir que se extienda a toda la poblacin diana, mujeres de coordinacin y coste asumibles. Solamente as ha-
con edades comprendidas entre los 30 y 60 aos, que br alguna esperanza de que esta grave enfermedad
sea de fcil acceso y que tenga una cobertura am- totalmente prevenible desaparezca en la mayor parte
plia. La principal funcin de los microbilogos como de los pases.
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Hospital...................................................... virus del papiloma humano (VPH) Edicin N 01 Pgina 1 de 6
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Deteccin de cidos nucleicos del
virus del papiloma humano (VPH)
01 Edicin inicial
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1. PROPSITO Y ALCANCE
Definir la metodologa bsica para la deteccin de cidos nucleicos del virus del papiloma humano (VPH) en mues-
tras relacionadas con procesos en los que el VPH podra estar implicado en el desarrollo de lesiones histolgicas
de carcter benigno o maligno.
Este procedimiento es aplicable a todos los laboratorios de Microbiologa Clnica que participen en el diagnstico
de las infecciones de transmisin sexual y en el proceso de cribado primario del cncer asociado a la infeccin
por el VPH.
2. FUNDAMENTO
La presencia de ciertos tipos del VPH en el aparato genital femenino se asocia a neoplasia intraepitelial cervical,
vaginal y vulvar, adems de adenocarcinoma de crvix. En el hombre est relacionado con cncer de pene y en
ambos sexos se asocia a cncer anal y cncer orofarngeo, as como a otras enfermedades entre las que se en-
cuentran el condiloma, la papulosis bowenoide y la papilomatosis larngea recurrente.
Existen diferentes mtodos de deteccin del VPH, que se diferencian segn se basen en el anlisis de la presencia
del ADN, del ARN que produce el virus o de las diferentes protenas que se sintetizan a partir del ARN. Para la
deteccin del ADN y el ARN pueden utilizarse mtodos sin amplificacin (hibridacin), o bien mtodos con ampli-
ficacin que aumenten la cantidad del cido nucleico en el procesamiento previo a la deteccin. Ambos mtodos,
con o sin amplificacin, se basan en la separacin de la doble cadena de ADN mediante el incremento de la tem-
peratura. Tras la separacin se multiplica el ADN (mediante la tcnica de PCR) o no, y se enfrenta a una secuencia
de ADN conocida y complementaria marcada con diferentes procedimientos para su posterior deteccin. Si se
conjuga el ADN problema y el ADN conocido o complementario, este se detecta y se confirma que la muestra es
positiva.
Independientemente de la prueba utilizada para la deteccin del VPH, es importante destacar la necesidad de
automatizar las pruebas, ya que de esta manera se disminuye o elimina el procesamiento manual, lo que permite
una mayor estandarizacin, al tiempo que reduce sustancialmente los posibles errores del laboratorio.
La seleccin de un determinado mtodo debe realizarse en funcin de los objetivos planteados. Las pruebas de
deteccin del VPH de alto riesgo (VPH-AR) destinadas al cribado deben tener una adecuada sensibilidad clnica,
es decir, una elevada capacidad de detectar lesiones de grado CIN2+, as como la mayor especificidad posible, y
un valor predictivo negativo cercano al 100%. Las pruebas de deteccin del VPH-AR utilizadas en la prevencin
secundaria del cncer de cuello de tero (CCU) deben siempre tomar como referencia la sensibilidad clnica y
estar validadas para dicho propsito.
Las tcnicas moleculares actuales con finalidad de cribado permiten la deteccin especfica de algunos tipos de
VPH de alto riesgo (tipos 16, 18 y 45) y una deteccin inespecfica de otros tipos de alto riesgo, considerando
que los protocolos clnicos de seguimiento y monitorizacin de terapias pueden ser diferentes segn el potencial
oncognico del genotipo detectado. Este enfoque es suficiente para un diagnstico y control de la infeccin ade-
cuados. Sin embargo queda a criterio del laboratorio realizar tcnicas de genotipado especficas de todos o de
la mayora de los genotipos de alto o bajo riesgo, segn la finalidad de la determinacin, considerando el inters
epidemiolgico de conocer la distribucin de genotipos en la poblacin.
Dado el gran nmero de pruebas de deteccin del VPH que existen actualmente en el mercado, es importante
establecer los criterios exigibles para aceptar que una determinada prueba es til en el cribado poblacional:
Evidencia cientfica que acredite que la prueba tiene una sensibilidad en la deteccin de lesiones de grado
CIN2+ entre dos rondas de cribado separadas 2-3 aos, superior al 90%.
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Evidencia derivada de ensayos clnicos aleatorizados, u otros estudios publicados en la literatura cientfica,
as como acreditacin por parte de agencias como la Food and Drug Administration (FDA) o la European
Medicines Agency (EMA) de la prueba de cribado.
Elevada especificidad, de manera que se reduzca al mximo la posibilidad de realizar pruebas complemen-
tarias innecesarias.
Facilidad de validar la prueba entre laboratorios, con resultados transferibles.
Elevada automatizacin, lo que permite reducir el riesgo de contaminacin, as como el tiempo de trabajo
manual y, en definitiva, disminuir el volumen de trabajo.
Posibilitar que la toma de la muestra se realice en un medio universal que permita llevar a cabo otras pruebas
complementarias en la misma toma.
A da de hoy, existen alrededor de 140 mtodos de deteccin de VPH en el mundo. Frente a la aparicin de nuevas
pruebas para la deteccin del VPH, independientemente de las regulaciones administrativas que sean necesarias
para su comercializacin, hay que asegurar su validacin clnica antes de utilizarlas, tanto en la seleccin de cito-
logas anormales (clulas escamosas de significado incierto o ASCUS) como en el cribado primario. Las diversas
tcnicas presentan distinta sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, as como distintos niveles de estandari-
zacin. La aplicacin de una prueba de cribado del VPH debe validarse para la deteccin de lesiones de alto grado
(lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado o CIN2+) utilizando como mtodo de referencia el diagnstico
histolgico.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
4. MUESTRAS
Es necesario un mtodo fiable de recogida y manipulacin de muestras para proporcionar resultados comparables
inter- e intralaboratorio. Esto es especialmente necesario al analizar muestras celulares limitadas a un lugar anat-
mico. El laboratorio debe elegir uno o ms mtodos y aplicarlos de forma uniforme, siguiendo las recomendacio-
nes de los documentos de consulta propuestos.
El objetivo es obtener una muestra celular del lugar de la infeccin con el ADN conservado. Las muestras ade-
cuadas se obtienen utilizando los dispositivos de recoleccin y los mtodos habituales de obtencin de muestras
para citologa cervical rutinaria. La zona de transformacin del cuello uterino es el sitio del origen de la mayora
de las lesiones neoplsicas del cuello uterino y, es la zona de donde se deben recoger las muestras, del mismo
modo que la toma de muestras para citologa cervical. Esto requiere de un profesional de la salud capacitado para
la realizacin de un examen plvico. Tambin se pueden utilizar los mtodos de autorecogida, pero se obtiene un
mayor componente vaginal.
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Para obtener resultados consistentes y longitudinales en todos los estudios, el mtodo de muestreo debe ser
coherente y estar validado para el procedimiento de extraccin y deteccin posterior. Para ello deben seguirse las
indicaciones del fabricante en las que se proporcionan ilustraciones para facilitar la comprensin del mtodo de
recogida de muestras.
El volumen de los medios de recogida debe mantenerse constante. Los medios de recogida comerciales acuosos
tamponados son adecuados y suelen tener un volumen de 1,0 ml. Tambin se puede utilizar solucin salina nor-
mal (9,0 g de NaCl/l) en alcuotas preparadas con precisin. En los medios de citologa lquida se deben seguir las
indicaciones del fabricante. Estos medios estn diseados para conservar las clulas y tienen metanol o etanol,
que tambin preserva el cido nucleico. Algunos contienen volmenes mayores de medio (5-20 ml). En cualquiera
de los medios la muestra se puede mantener a temperatura ambiente hasta 14 das y es estable a 4C durante
al menos tres meses. Para un almacenamiento ms prolongado, es necesario congelar a -20C. Los medios con
metanol y etanol se consideran inflamables y requieren precauciones especiales para su envo al laboratorio.
Si tambin se requiere la muestra para el diagnstico citolgico, son posibles varias opciones dependiendo del m-
todo de toma de muestras y de la preparacin de la prueba de Papanicolaou. Si se utilizan los medios acuosos se
puede obtener una muestra propia para la prueba de Papanicolaou. Con los medios de citologa lquida se puede
obtener una alcuota previa a la determinacin citolgica, con un riesgo escaso de reducir el rendimiento adecuado
de la citologa. Tambin se pueden hacer alcuotas previamente para la citologa, si bien hay cierto riesgo, aunque
muy bajo, de contaminacin de la muestra. Las muestras se deben manejar con un nivel de bioseguridad 2.
Se pueden obtener otras muestras celulares y de tejidos de las zonas anatmicas con sospecha de infeccin por
el VPH. El laboratorio debe verificar la idoneidad de cada mtodo de recogida de la muestra.
Las biopsias cervicales tomadas de las lesiones cervicales tambin se pueden utilizar para la deteccin de ADN del
VPH. Estas tomas requieren la coordinacin necesaria para asegurar que no se interfiere con el diagnstico histo-
lgico ptimo. La biopsia obtenida para la prueba de deteccin del VPH se debe congelar rpidamente en un bao
de isopentano o sumergirla en solucin salina normal y congelarla tan pronto como sea posible. Se puede utilizar
el material residual de bloques de parafina fijados con formol para realizar las pruebas de deteccin del VPH; esto
no interfiere con el manejo clnico y permite la confirmacin histolgica de la muestra que se est analizando.
Para evitar la contaminacin entre bloques, cada muestra se debe cortar en el microtomo con una cuchilla des-
echable e incluir una seccin de control negativo a partir de un bloque de parafina vaco. Sin embargo, hay que
sealar que el efecto que produce la formalina limita el tamao de los fragmentos de ADN que se pueden extraer.
El procesamiento de "rutina" para histopatologa es bastante variable, y estos cambios pueden afectar a la calidad
y cantidad del ADN. El fijador de Bouin impide la posterior deteccin del ADN.
En entornos sanitarios que lo aconsejan se ha demostrado la validez de las muestras tomadas por la propia pa-
ciente mediante la insercin de un hisopo en la vagina. Estas muestras se deben manejar de forma similar a la de
cualquier otra muestra clnica, y en ellas pueden estar ms representados genotipos de bajo riesgo y otros que se
encuentran en la vagina con mayor frecuencia.
Las muestras para la deteccin del VPH se pueden obtener de rganos genitales externos, perineo, ano y mucosa
orofarngea. En superficies queratinizadas se realiza una abrasin suave frotando con un hisopo humedecido para
aumentar el rendimiento celular. La muestra del ano requiere insertar un hisopo o un cepillo suave en el margen
anal. Los medios de recogida y manipulacin de la muestra son similares a los utilizados para las muestras cervi-
cales.
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La orina tambin se puede utilizar para la deteccin del VPH. Para la recogida en mujeres no se deben emplear
las recomendaciones rutinarias de la recogida de muestras para urocultivo, ya que de este modo se reduce la
carga de clulas vaginales. La orina es menos sensible para la deteccin de ADN del VPH en comparacin con las
muestras cervicales pero tiene la ventaja de ser una muestra no invasiva y la exquisita sensibilidad de los mtodos
moleculares minimizan esta limitacin.
En cualquier caso, es obligado realizar controles adecuados para comprobar la presencia de inhibidores de la
PCR, as como la carga celular.
5. REACTIVOS Y PRODUCTOS
Para la realizacin de las diferentes tcnicas se utilizarn los reactivos, controles y calibradores propios de cada
determinacin. Los reactivos se deben conservar siguiendo estrictamente las indicaciones de los fabricantes. No
se utilizarn materiales de dudosa procedencia o conservacin ni aquellos que hayan superado su fecha de ca-
ducidad.
6. APARATOS Y MATERIAL
Debern utilizarse las plataformas adecuadas para cada tcnica siguiendo las indicaciones de cada fabricante. Se
utilizar tambin material general de laboratorio tanto inventariable como fungible, tal como se indica a continua-
cin:
Los protocolos de mantenimiento de los termocicladores deben estar detallados en la hoja de mantenimiento de
equipos y en el plan de control y calibracin de equipos del rea y deben cumplirse rigurosamente.
7. PROCEDIMIENTO
Existe una amplia variedad de reactivos de extraccin de ADN comerciales. Se deben seguir las recomendaciones
del fabricante para la extraccin de ADN de tejidos y lquidos biolgicos (ver los manuales de los kits de extrac-
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DOCUMENTO TCNICO
PNT-VPH-01
Servicio / Unidad de Microbiologa Deteccin de cidos nucleicos del
Hospital...................................................... virus del papiloma humano (VPH) Edicin N 01 Pgina 1 de 6
cin). Es conveniente prolongar la incubacin con proteinasa K, hasta la lisis completa de la muestra (alrededor
de 2,5 h). El ajuste de los pasos de lisis y digestin se debe evaluar para aumentar los rendimientos en cada
laboratorio, pero una vez que se seleccionan las condiciones ptimas, stas deben mantenerse constantes. Los
extractos de ADN son estables durante perodos cortos de tiempo a 4C, y por ello se deben almacenar a -20C
para largos perodos de tiempo.
Hay que evitar los ciclos de congelacin-descongelacin mltiples y se debe tener cuidado para evitar la conta-
minacin durante la extraccin y el procesamiento de las muestras. Se debe extraer al menos un blanco de agua
con cada lote de muestras. El ADN se debe almacenar preferiblemente en tubos sarstedt con tapn de rosca,
cambiando los tapones para evitar problemas de contaminacin cruzada. No se deben utilizar tubos de tapn a
presin, ya que pueden conducir a la contaminacin en la apertura.
Existen diversos mtodos comerciales para la determinacin del cido nucleico del VPH que han sido aprobados
por la EMA y por la FDA. Recomendamos por tanto seguir el protocolo y las recomendaciones que proporcionan
los fabricantes. Para la extraccin del cido nucleico vrico tambin se propone emplear alguno de los mtodos
que los fabricantes recomiendan, ya que son los que han sido validados para el uso con dichos protocolos.
Muchas de estas tcnicas requieren un gran volumen de muestra de partida por lo que en el caso de tener que
realizar diluciones por disponer de muestra insuficiente, se recomienda utilizar para ello suero fisiolgico estril o
agua con grado de calidad de biologa molecular.
Se recomienda la suscripcin a algn programa de control de calidad externo que permita garantizar la correcta
realizacin de la tcnica. La OMS tiene un programa de control de calidad de periodicidad anual (HPV LabNet) que
permite comprobar la precisin de la tcnica utilizada en el laboratorio con estndares de diferentes genotipos de
forma aislada y combinada. El control proporcionado por HPV LabNet considera competente a un laboratorio para
realizar la deteccin del ADN del VPH cuando es capaz de detectar 50 UI/5l de ADN del VPH16 y del VPH18, y
500 equivalentes genmicos (GE)/5l de otros tipos de VPH; y tambin si no se obtiene ms de un resultado falso
positivo en el panel. Se recomienda que los anlisis de genotipado deben detectar, como mnimo, los catorce
genotipos de ms alto riesgo del VPH (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) y los dos tipos de
bajo riesgo del VPH incluidos en la vacuna actual (6 y 11).
Los resultados se expresan de forma cualitativa aunque puede existir un valor cuantitativo que se relaciona con
la carga vrica detectada, expresado pg/ml (equivalente a 100.000 copias/ml), equivalentes a genoma/l y UI/l,
dependiendo de la tcnica utilizada. En cualquier caso, la interpretacin y expresin de resultados debe ser estric-
tamente las indicaciones del fabricante.
En cada tanda de reaccin se deben emplear controles positivos y negativos que aseguren el correcto funciona-
miento de la tcnica y la ausencia de contaminaciones, respectivamente. Se recomienda no tener una demora en
la emisin de resultados superior a 7 das. En caso de emplear una muestra diluida se debe ajustar la cuantificacin
real y el lmite de sensibilidad de la tcnica.
9. RESPONSABILIDADES
Deben estar descritas en el manual general de organizacin del laboratorio de Microbiologa y en las fichas de
descripcin de los puestos de trabajo. El procedimiento deber llevarse a cabo por personal tcnico cualificado
con un entrenamiento especfico. La supervisin de la tcnica y de los resultados emitidos se debern realizar por
el facultativo especialista responsable del laboratorio de Microbiologa Molecular que los emite. Los procedimien-
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DOCUMENTO TCNICO
tos de toma de muestra, su transporte y conservacin, deben estar asesorados y controlados por los facultativos
responsables del laboratorio de Microbiologa.
Todo el personal del laboratorio deber conocer y seguir las normas generales de bioseguridad e higiene, as como
las normas de trabajo en laboratorios de Biologa Molecular. Estas recomendaciones debern estar recogidas en
un documento establecido por el laboratorio de Microbiologa. Como recomendacin general, debern evitarse,
en lo posible las manipulaciones innecesarias y extremarse las precauciones en el manejo de las muestras. Todas
las manipulaciones deben realizarse con guantes.
Es importante considerar que para la obtencin de resultados correctos en un laboratorio de diagnstico mole-
cular en el que se realizan tcnicas de PCR, se debe distribuir el trabajo en 3 reas perfectamente diferenciadas:
Area 1 o zona limpia: dedicada a la preparacin de reactivos. En este rea no se introducirn muestras ni
reactivos que contengan ADN, tanto amplificado como no amplificado. En este rea se preparan las mezclas
reaccin (master mix) de la PCR y se distribuyen en alcuotas los reactivos de extraccin del ADN de las
muestras clnicas.
rea 2 o de manipulacin de muestras y extraccin del ADN. En esta rea se procesan las muestras, se
realiza la extraccin y purificacin del ADN y se aade el ADN a la master mix. En esta zona no se debe
introducir ADN amplificado.
rea 3 o de amplificacin. En esta rea se detectan y procesan los productos de PCR (carga de geles,
purificacin, etc.).
En cada zona de trabajo debe existir material independiente (puntas de micropipeta, micropipetas, guantes, etc.).
No se debe trasladar el material de una zona a otra, salvo el estrictamente necesario. El flujo de trabajo debe ser:
rea 123 y nunca a la inversa. Es importante que para el manejo del material que est en contacto con agen-
tes intercalantes, se usen siempre guantes y se extremen las precauciones de seguridad, ya que son reactivos
txicos. La visualizacin de geles con transiluminador UV debe realizarse con caretas protectoras o en sistema
cerrado de visualizacin de geles.
Sin embargo, segn la tcnica realizada, la exigencia tradicional de divisin de reas para las tcnicas de amplifi-
cacin es mucho menos crtica para algunas de las tcnicas actuales, fundamentalmente llas basadas en PCR en
tiempo real, ya que no es necesario manipular el producto amplificado al realizarse todo el proceso de amplifica-
cin y deteccin en tubo cerrado.
La prevalencia de infeccin por el VPH en una poblacin puede afectar a la eficacia en la deteccin. El valor pre-
dictivo positivo disminuye cuando se estudian poblaciones con baja prevalencia o bajo riesgo de infeccin. Un
resultado negativo no excluye la posibilidad de infeccin o niveles muy bajos de infeccin. Tambin pueden dar
lugar a falsos negativos los errores en la toma de la muestra, ya que el resultado obtenido depende en gran medida
de la calidad de la muestra remitida. Ocasionalmente, se pueden producir inhibiciones de la PCR que no permitirn
obtener un resultado y que se detectarn por la ausencia de amplificacin del gen de la -globina humana. En
estos casos se repetir de nuevo el procedimiento desde el principio, volviendo a extraer el ADN de la muestra si
es posible o en su caso analizando el mismo ADN y adems una dilucin 1/10 del mismo. Si an as no se consi-
gue obtener amplificacin, el resultado deber informarse como: muestra inhibida. Las altas concentraciones de
crema antimictica, gel anticonceptivo u otros productos de higiene vaginal en el momento de recoger la muestra,
pueden dar lugar tambin a falsos negativos.
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12. BIBLIOGRAFA
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