Guia Caracterizacion Enzima Bioquimica

Bioqumica 251311 - Bioingeniera
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
GUIA DE LABORATORIOS BIOQUIMICA

251.311
BIOINGENIERIA
0
LABORATORIO 1: Introduccin al Trabajo de Laboratorio
INFORMACIONES GENERALES DE LOS PRCTICOS
Como estudiantes de una asignatura que requiere la manipulacin de reactivos,

material biolgico y equipos, es necesario que conozcan y recuerden con claridad
las reglas de bioseguridad que ya han sido presentadas en las asignaturas de
qumica. Todo el trabajo realizado est enmarcado en el Manual de seguridad que
se adjunta a continuacin.
MANUAL DE SEGURIDAD
Cada actividad desarrollada en un laboratorio en que se manejan sustancias

qumicas y/o biolgicas involucra un nivel de riesgo, por lo tanto, en general cuiden
su organismo y el de sus compaeros. El profesor a cargo avisar si necesitan
algn elemento de proteccin personal.
ANTE CUALQUIER PROBLEMA AVISAR INMEDIATAMENTE AL PROFESOR(A)

ENCARGADO(A) DEL LABORATORIO
Reglas Bsicas Generales
Proteccin de los ojos:
Utilice gafas de seguridad si es necesario.
En caso de emergencia utilice el LAVAOJOS que est colgado en la pared de

cada laboratorio.
Proteccin odos:
Use un protector en caso de ruidos producidos por equipos y/o campanas de

extraccin, que sobrepasen los 85 decibeles. (Ej. Sonicador).
Cortes y quemaduras:
No trabaje con material defectuoso (trizado o quebrado), porque constituye un

riesgo fsico y biolgico.
Sea precavido al trabajar con mechero y baos termorregulados, transite lento

por los puestos de trabajo.
En caso de quemaduras por llama asfixie el fuego con una manta o abrigo.
1
Si se trata de quemaduras por lquidos calientes, sumerja la zona afectada en

agua o colquela bajo la llave de agua fra para mitigar el dolor y disminuir la
accin del calor (use siempre zapatos cerrados en el laboratorio).
Manejo de sustancias:
Es conveniente leer siempre la etiqueta de cualquier reactivo antes de usarlo.

Compruebe que se trata realmente del reactivo indicado y observe los smbolos
y frases de seguridad que sealan los riesgos ms importantes derivados de su
uso y las precauciones que hay que adoptar para su utilizacin.
Nunca saborear ni oler los reactivos o productos de una reaccin.
Nunca pipetear con la boca.
Eliminacin de residuos:
Los residuos inertes plsticos como tubos, puntas y guantes, debern

descartarse en el recipiente especial para ese efecto.
Los residuos contaminantes debern verterse a los recipientes correspondientes

que proporciona MATPEL (Sistema de deshechos de Materiales peligrosos de
la Universidad de Concepcin), y que estarn indicados en el laboratorio. (Ej.
Mezcla cida).
Vestimenta:
Es obligatorio el uso de delantal en el laboratorio. (Cada alumno debe traer su

delantal).
Usar guantes de proteccin si es necesario.
Utilizar un calzado que cubra completamente el pie.
Se prohbe el uso de falda o pantaln corto (un derrame podra afectar a la piel
expuesta).
Incendios: Medidas de prevencin
No acercar ningn envase de reactivos cerca de una llama.
Cerrar siempre el mechero Bunsen cuando no se utilice mediante la llave

incorporada y la llave de paso de la mesa.
No calentar en el mechero lquidos inflamables.
Utilizar los extintores adecuados para apagar cualquier incendio.
2
Medidas de seguridad:
Todos los alumnos tienen la obligacin de saber dnde est el extintor, el

Lavaojos, y la salida de emergencia ms cercana.
Adems de lo anterior, se prohbe estrictamente:
Hacer experimentos no autorizados.
Sacar fuera del Laboratorio reactivos materiales o instrumentos.
Fumar, comer o beber en el laboratorio.
La permanencia en el laboratorio de personas ajenas al curso prctico.
Distraer o interrumpir a las personas que se encuentran trabajando en el

laboratorio por riesgo de accidentes (una broma aun inocente puede causar
daos irreparables).
Procedimiento Seguro:
Antes y despus de finalizar cada trabajo, se deber lavar las manos con jabn
lquido y secar con papel.
El incumplimiento de cualquier norma de seguridad puede acarrear la inmediata

expulsin del laboratorio.
La responsabilidad por las consecuencias de no cumplir esta norma dentro del

laboratorio es enteramente del estudiante.
Telfono del Paramdico del Campus: Anexo 4567
3
PAUTA PARA EL DESARROLLO DEL TRABAJO PRCTICO
En un trabajo cientfico es de mucha importancia aspectos tales como la confeccin

de informes, elaboracin de un cuaderno de protocolo con una descripcin clara y
precisa de la informacin en cuanto a la realizacin de experimentos, anlisis de los
resultados obtenidos y revisin bibliogrfica de acuerdo al tema en desarrollo.
Se revisar con los estudiantes todos los elementos tanto de materiales como
equipos que se utilizarn durante el laboratorio, especialmente el uso de
micropipetas y espectrofotmetro.
CUADERNO DE PROTOCOLO:
Este cuaderno constituye una bitcora del trabajo que se realiza en el laboratorio.
Las notas del investigador en este cuaderno, prueba la autora de los experimentos
y permiten su reproducibilidad y continuidad si es necesaria, por lo tanto cada
estudiante debe mantener su Cuaderno de Protocolo AL DA.
Se espera que el cuaderno contenga para cada actividad prctica:
Ttulo del experimento

Objetivo
Metodologa: incluye reactivos a utilizar, modo de preparacin, y protocolo de
trabajo
Resultados: debe anotarse con cuidado cada uno de ellos y representarlos con
grficos y tablas.
Cada resultado debe llevar un comentario y un anlisis que posteriormente les
ayudar en la confeccin de un informe final.
Considerando lo anterior, el cuaderno ser revisado y su progreso ser evaluado

con el concepto cumple o no cumple requisito
PAUTA PARA REDACTAR INFORME PRCTICO
4
PRESENTACIN Y FORMATO DE INFORME:
a) Formato: El trabajo deber presentarse en hoja tamao carta. El texto deber ser
escrito en formato paper: Ttulo, autores, resumen y palabras claves en un prrafo,
seguido del resto del texto en dos columnas. Utilice interlineado sencillo, fuente tipo
Arial y tamao 10.
b) Tablas: Las tablas deben poseer un ttulo que exprese claramente el contenido en
el extremo superior. Tienen que ser claras, auto-explicativas y en espaol,
numeradas con nmeros arbigos, en forma correlativa (ejemplo; Tabla 1.), cuidando
de no duplicar la informacin ya disponible en el texto. En caso que una tabla haya
sido publicada previamente, debe indicarse la fuente de origen en el ttulo,
acompaado de la respectiva cita.
c) Grficos y Figuras: Las figuras y grficos deben poseer un ttulo y una leyenda
ubicados en el extremo inferior redactados en espaol en un lenguaje claro,
numerados con nmeros arbigos, en forma correlativa (ejemplo; Fig. 1.). Deben
expresar claramente el contenido, ser auto-explicativas y no duplicar la informacin
disponible en las tablas o texto. En caso que una figura y/o fotografa haya sido
publicada previamente, debe indicarse la fuente de origen en el ttulo, acompaado
de la respectiva cita.
d) Lenguaje: Utilice un lenguaje formal y cientfico. Utilice ortografa y gramtica de

acuerdo a las normas del idioma espaol.
e) Originalidad: No debe copiar prrafos completos de otras fuentes bibliogrficas,

incluso si incluye la cita.
SECCIONES DEL INFORME:
Titulo
Autores
Resumen
Palabras Claves
Introduccin
Mtodos
Resultados
Discusin y Conclusin
Referencias bibliogrficas
DESCRIPCIN DE LAS SECCIONES
5
1) RESUMEN: Todo informe o publicacin cientfica comienza con un resumen en el

que se expresa de forma concisa lo que se ha estudiado, la metodologa, los
resultados importantes obtenidos y la conclusin. Con frecuencia es lo primero que se
lee de un trabajo para saber si est dentro de la lnea de inters del lector. El resumen
del trabajo de investigacin debe tener una extensin mxima de 250 palabras.
2) PALABRAS CLAVES: Incluye 4 a 6 palabras relacionadas con el trabajo realizado.
3) INTRODUCCIN: Incluye Marco Terico. Debe establecer claramente el

problema a investigar, el conocimiento que explica este problema y las razones para
conducir la investigacin. Debe explicar cul es la relevancia del estudio en general.
Debe resumir la investigacin relevante que proporciona el marco terico y
establecer cmo este trabajo difiere de los publicados y qu pregunta(s) va(n) a ser
respondida(s). La introduccin debe estar respaldada slidamente por literatura
cientfica reciente (de preferencia los ltimos 10 aos) y provenir de trabajos
publicados en revistas cientficas, o de libros actuales. Las citas de pginas web
slo se aceptarn cuando la informacin presentada no est disponible en revistas
de investigacin cientfica. Se debe evitar las citas de comunicaciones personales,
paneles de congreso y resmenes. Debe incluir el(los) objetivo(s) redactado(s) en
infinitivo (Determinar, Analizar, Conocer).
Extensin mxima de 400 palabras.
4) MATERIALES Y MTODOS: Esta seccin debe ser escrita en tiempo pasado (Ej:
Se determin). Los mtodos, aparatos y procedimientos empleados deben
anotarse claramente. En el caso de emplear mtodos o tcnicas desarrollados por
otros autores debern ser descritos brevemente e indicar claramente la referencia
de stos. Extensin mxima de 1.000 palabras.
5) RESULTADOS: Deben describirse en forma clara y objetiva los hallazgos de la

investigacin, de preferencia siguiendo el orden planteado en los objetivos
especficos y metodologa. Los datos crudos infrecuentemente se escriben en un
trabajo cientfico, los datos deben ser analizados y expresarse en forma de tablas,
grficos, figuras o imgenes y descripciones, etc. y cada tabla, grfico, figura o
imagen y descripcin debe ser explicada con texto. Esta seccin NO DEBE incluir
interpretacin de datos ni anlisis de resultados. Esto es materia de la discusin.
Cuando el trabajo de investigacin consista en comparar resultados propios con los
obtenidos por otros autores, debe indicarse claramente el origen de los datos
comparados.
Extensin mxima de 1.000 palabras.
6) DISCUSIN: En esta seccin se describe el significado de los resultados

obtenidos, en el contexto de lo que se conoce sobre el tema investigado. Se debe
6
enfatizar los hallazgos nuevos y posiblemente importantes del estudio. Los datos del
estudio deben ser comparados con hallazgos previamente publicados. Las
limitaciones de los mtodos experimentales deben ser discutidas, as como las
posibles implicaciones para las futuras investigaciones.
Al final de la discusin se deben incluir las conclusiones que deben ser redactadas
como un listado de oraciones relativamente cortas, basadas directamente en los
resultados obtenidos y en la evidencia. Se debe evitar la especulacin proveniente
de otros trabajos.
Extensin mxima de 600 palabras.
7) REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: Las referencias son artculos de revistas o

libros que fueron citadas en el informe. En todo trabajo de investigacin se exige un
listado de REFERENCIAS, que debe tener un mnimo de 15 y un mximo de 50
citas.
El listado de referencias debe seguir un modelo estndar, segn sea el modelo
Harvard o el numerado.
En el listado de referencias debe incluirse a TODOS los autores del artculo, aunque
sean ms de tres. La abreviacin del nombre de la revista debe ser la estandarizada
para esa revista. Ejemplo: La palabra Journal se abrevia J. Una excepcin es
cuando la revista tiene un solo nombre; se escribe el nombre completo, por ejemplo:
Science, Biochemistry, etc. El listado de referencias puede seguir un modelo
aceptado en revistas internacionales que en general, usan el mnimo de puntuacin.
Ejemplos de listado Numerado:

(1) Leblond, C P., and Warshawsky, H. (1979), Dynamics of enamel formation in the
rat incisor tooth. J. Dent. Res. 58(B):950-975.
(2) Risnes, S. (1999). Mature enamel morphology and forming enamel dynamics:
Cristal orientation, cristal continuity, prism diameter, Retzius lines, and prison cross-
striations. In: Dental Morphology 1998. J.T., Mayhall and T. Heikkinen (eds), pp.
312-322 (Oulu University Press, Oulu).
Ejemplos de listado por orden alfabtico

Aaronson, S. 1977. Style in scientific writing. Current Contensts, No 2, 10 January;
p. 6-15.
Mitchell, J. H. 1968. Writing for professional and technical journals. John Wiley &
Sons, Inc., New York.
7
LABORATORIO 2: Cuantificacin de Protenas y Determinacin de

la Actividad Enzimtica de Fosfatasa Alcalina
Objetivos
Realizar una curva de calibracin de protenas por el mtodo de Bradford.

Determinar la concentracin de protenas de una muestra.
Medir la actividad enzimtica de fosfatasa alcalina.
Mtodo de Bradford
(Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248-254)
El mtodo de Bradford se basa en la unin del colorante Coomassie Blue G250 a

las protenas. Al hacer estudios detallados se observa que el colorante puede existir
en cuatro formas inicas de acuerdo a los pKa: 1.15, 1.82 y 12.4. Las formas
cationicas roja y verde absorben a 470 y 650 nm respectivamente. La forma
aninica azul, que se une a protenas, presenta un mximo de absorbancia a
590nm. La cantidad de protenas puede estimarse midiendo la cantidad de colorante
en la forma azul y en general se hace midiendo a 595nm.
Reactivos
Solucin Standard : albmina de suero de bovino 100 g/ml

Reactivo de Bradford (Merck)
PROCEDIMIENTO
Elija las diluciones adecuadas a partir de la Solucin Standard de albmina 100

g/ml, para obtener concentraciones de protenas en un rango de 1 a 20 g/ml.
Realizar curva de calibracin:
Tubo N 1 2 3 4 5 6 Bco
Standard Albmina100 g/ml (ml)
Agua destilada (ml)
Reactivo Bradford (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Volumen final (ml) 1 1 1 1 1 1 1
Concentracin de albmina (g/ml)
(calculada segn volumen agregado)

Mezclar bien. Dejar de 2 a 5 minutos a temperatura ambiente y leer a 595 nm en cubeta
de plstico, lavando la cubeta despus de cada lectura.
Absorbancia 595 nm
8
Cuantificacin de la muestra:
Elija tres diluciones distintas de la enzima, para cuantificar las protenas totales de
su muestra. La lectura a 595 nm debe estar dentro de rango de la curva de
calibracin.
Cuantificacin de Protenas de una Muestra
de Enzima
Tubo A B C
Dilucin
Muestra de Enzima (ml)
Agua destilada (ml)
Reactivo Bradford (ml) 0,2 0,2 0,2
Volumen final (ml) 1 1 1
Agitar correctamente. Dejar 2 a 5 minutos a temperatura ambiente y leer a 595 nm en

cubeta de plstico, lavando la cubeta despus de cada lectura.
Absorbancia 595 nm
Determinacin de la actividad enzimtica
(Fiske C. and Subbarow Y. The colorimetric determination of phosphorus. J. Biol. Chem. 1925,
66:375-400).
Las fosfatasas son enzimas muy difundidas en los organismos. La fosfatasa alcalina
de intestino de ternera, que se usar en los siguientes laboratorios, cataliza la
siguiente reaccin:
CH2OH CH2OH

CHO - PO3HNa2 + H2O CHOH + PO4HNa2

CH2OH CH2OH
Glicerol 2-fosfato Glicerol Fosfato de Sodio
Para determinar la actividad de la enzima se valorar uno de los productos

generados por la reaccin, el fosfato de sodio, el cual se determinar utilizando el
mtodo de Fiske & Subbarow. Segn este mtodo, al agregar el reactivo molibdato,
el fosfato pasa a cido fosfomolbdico en medio cido, y luego es reducido al
agregar acido 1,2,4,amino naftol sulfnico, producindose una coloracin azul, cuya
intensidad, medida por la absorbancia a 620 nm, depender de la concentracin de
fosfato.
9
Reactivos
Determinacin de la actividad enzimtica:

Tampn : Glicina/NaOH 0,1 M pH 9,4 NaCl 1 (p/v)
Sustrato : Beta glicerofosfato de sodio 6 mM
Enzima : Fosfatasa alcalina de intestino de ternera
Determinacin de Fosfato
Reactivo Molibdato: Molibdato de amonio al 2,5% en H 2SO4 5 N
Solucin Reductora: cido 1,2,4,amino naftol sulfnico (Eiconocen)
Solucin Patrn de Fosfato: Fosfato de sodio 1 mol/ml
En tubos eppendorf de 2 ml, agregue los siguientes componentes segn el esquema

de trabajo.
TUBOS
1 2
COMPONENTES
(Muestra) (Blanco)
Tampn Glicina (l) 100 100
Sustrato 6 mM (l) 100 _____
Enzima (l) 60 0
Agua destilada (l) 340 500
3
Agitar. Incubar 10 minutos a 37C.
(Patrn)
Sol. Patrn Fosfato 1 mol/ml (l) _____ _____ 200
Molibdato de amonio (l) 600 600 600
Solucin reductora (Eiconocen) (l) 80 80 80
Agua destilada (l) 720 720 1320
Agitar. Esperar 10 minutos a temperatura ambiente y leer en

espectrofotmetro.
Absorbancia 620 nm _____
Resultados
Grafique su curva de calibracin e interpole los valores de absorbancia obtenidos

por Ud.
Calcule la concentracin de protenas en su muestra en mg/ml.
Calcule la concentracin de fosfato producida en la determinacin de actividad
enzimtica.
10
LABORATORIO 3: Determinacin de la Curva de Progreso
Objetivo
Construir una curva de progreso para Fosfatasa Alcalina y determinar velocidad
inicial.
La velocidad de una reaccin se puede determinar a partir de su curva de progreso,

siguiendo la desaparicin de los reactantes o la aparicin de productos en el tiempo.
Para el caso de la enzima que estamos analizando, esta curva se obtiene
directamente midiendo el aumento en la absorcin producto de la aparicin de
fosfato en funcin del tiempo.
A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va

disminuyendo, hasta alcanzar el equilibrio de la reaccin. En la figura siguiente, se
muestra el grfico de una familia de curvas de progreso para distintas
concentraciones de sustrato:
m=Vi
[P]
mg/
mg/
ml
0 Tiempo
o (min)
La velocidad inicial (Vi) de la reaccin, es determinada a partir de la pendiente (m)
de la curva de progreso al comienzo de la reaccin.
La velocidad inicial, es el cambio en la concentracin de reactante o producto

durante los primeros minutos de la reaccin y es determinada como la pendiente de
la curva en la fase lineal. La velocidad de la reaccin disminuye hasta alcanzar el
equilibrio, donde llega a ser cero.
Los estudios cinticos de aparicin y desaparicin de enzimas plasmticas,

requieren de una determinacin enzimtica vlida. Una buena determinacin implica
controlar todos los factores que afectan la actividad de una enzima, como la
temperatura y pH, al igual que niveles saturantes de sustratos, cosustratos y
cofactores.
Reactivos
11

PROCEDIMIENTO
Preparar 15 tubos (numerados) con 600 l de reactivo Molibdato de Amonio en cada

uno de ellos. Estos sirven para detener la reaccin enzimtica de las alcuotas que
provienen del tubo de incubacin y que el molibdato presente reaccione con el fosfato
(P) liberado.
En un tubo de 15 ml denominado tubo de incubacin, agregar los siguientes

componentes:
Tubo de Incubacin (l)

Tampn Glicina 0.1 M 3000
Sustrato 6 mM 1500
Agua destilada 3690
Agitar e incubar el tubo a 37C por 5 a 6 minutos,
luego agregar:
Enzima 810
Inmediatamente despus de agregada la enzima, homogenizar la mezcla invirtiendo el

tubo un par de veces, sacar rpidamente una alcuota de 600 l y verterla en el tubo
N 1 que contiene Molibdato de Amonio, agitar inmediatamente. Este tubo ser el
tiempo cero (en el cual no ha ocurrido la reaccin catalizada por la enzima).
Mantener el tubo de incubacin en el bao a 37C y retirar las alcuotas de 600 l a

los 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60 minutos sucesivamente.
Vaciar estas alcuotas en los respectivos tubos preparados previamente con

molibdato.
Una vez retiradas todas las alcuotas, agregar 80 l de solucin reductora a todos los
tubos.
Completar a 2 ml con agua destilada todos los tubos. Esperar 10 minutos y leer al
Espectrofotmetro (longitud de onda 620 nm). Medir las D.O.
Preparar un blanco y un patrn como se describe a continuacin:
Tubos N
12
Patrn
Componentes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Fosfato
Blanco
Tiempo de 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ___ ___

Incubacin [min]
Molibdato de NH4 (l) 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600
Alcuotas de mezcla ___ ___
de incubacin 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600
(l)
Solucin Patrn ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
200
Fosfato 1 mol/ml (l)
Al agregar la alcuota al tubo con molibdato, agitar inmediatamente para detener la reaccin.
Despus que se han recolectado todas las alcuotas, agregar:

Soluc. Reductora (l) 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80
Agua destilada (l) 720 720 720 720 720 720 720 720 720 720 720 720 720 1120 1320
Agitar, esperar 10 minutos a temperatura ambiente. Leer en espectrofotmetro a 620

nanmetros.
La absorbancia de cada tubo es proporcional a la cantidad de fosfato liberado.

Utilizando la lectura del patrn, calcular los micromoles de fosfato liberado en los
distintos tiempos de incubacin y la velocidad de la reaccin a los diferentes tiempos.
Clculo:
La velocidad de una reaccin enzimtica se define como los micromoles de sustrato

transformados (o micromoles de producto generado) en una unidad de tiempo. Como
unidad de tiempo la Comisin Internacional de Enzimologa recomienda elegir 1
minuto.
Por lo tanto, para determinar la velocidad, interesa conocer los micromoles de sustrato
transformados o de producto formado en el tiempo. Estos datos se obtienen de la
curva de progreso, calculado la pendiente en la zona lineal, en los primeros minutos
de la reaccin.
Registre los resultados obtenidos en la tabla dada a continuacin:
[HPO4] corregida
Tiempo Absorbancia [HPO4]
Tubo N (mol/ml)
(min) (620 nm) (mol/ml)
([HPO4]-[HPO4]tiempo 0)
13
1 0 _____
2 5
3 10
4 15
5 20
6 25
7 30
8 35
9 40
10 45
11 50
12 55
13 60
14 Patrn _____
Resultados
Graficar la curva de progreso, con el tiempo en minutos en la abscisa y concentracin

de HPO4 en la ordenada ([P] vs. tiempo).
Calcular la velocidad inicial de reaccin.
LABORATORIO 4: Curva de Saturacin y Determinacin de K m y

Vmax de Fosfatasa Alcalina
14
Objetivos
Construir una curva de saturacin para la fosfatasa alcalina.

Determinar Km y Vmax.
Si en una reaccin enzimtica se mantiene constante el pH, el tiempo de incubacin,

la concentracin de enzima, la concentracin de activadores y se utiliza como nica
variable, la concentracin de sustrato [S], entonces la velocidad de la reaccin
catalizada por la enzima depender solamente de la [S].
As, si la concentracin de sustrato es muy pequea, la velocidad ser proporcional a

sta, pero si se alcanza una concentracin tal que mantenga saturada a la enzima, la
velocidad de la reaccin llegar a un valor mximo y constante llamado velocidad
mxima (Vmax). La Vmax es una constante para una determinada concentracin de
enzima.
El efecto de la [S] sobre la V i de una reaccin catalizada por una enzima, puede
representarse grficamente as:
Del anlisis de esta curva conocida como curva de saturacin, se pueden obtener los
parmetros cinticos, Km y Vmx.
La constante de Michaelis-Menten (Km) corresponde a la concentracin de sustrato

con la cual la velocidad de reaccin enzimtica alcanza un valor igual a la mitad de la
velocidad mxima. La Km, es un elemento muy importante para caracterizar una
enzima y se expresa en trminos de concentracin de sustrato.
Es importante sealar que la constante de Michaelis es un valor que corresponde a

condiciones perfectamente definidas del sistema, en el que ocurre la reaccin
enzimtica, ya que variaciones del medio ocasionan cambios en la K m como sucede
por ejemplo, con la presencia de activadores, inhibidores o cambios de pH.
Para determinar la Km se precisa conocer la velocidad mxima, la que no siempre es

fcil de determinar a partir de la curva de saturacin, debido a que la V max se alcanza
asintticamente. Este parmetro corresponde a la velocidad mxima que alcanza la
reaccin, lo cual ocurre en condicin de saturacin de la enzima.
15
Para determinar grficamente los valores de V max y Km se debe utilizar la

representacin de dobles recprocos (1/V i vs. 1/[S]), ya que es una lnea recta,
conocida como la representacin de Lineweaver y Burk que es una transformacin
algebraica de la ecuacin de Michaelis-Menten.
De la interseccin de la recta con la ordenada, se obtiene el valor 1/V max, cuyo valor
recproco es Vmax, y de la interseccin de la recta con la abscisa se obtiene - 1/K m
desde donde se calcula Km. La pendiente de la curva corresponde a K m/Vmax.
Reactivos
PROCEDIMIENTO
Prepare una serie de tubos de acuerdo al esquema de trabajo.
La preparacin enzimtica se adiciona al final, una vez que todos los reactivos han
sido agregados a los diferentes tubos.
ESQUEMA DE TRABAJO
TUBOS
16
Componentes 1 2 3 4 5 6 7 8 Blanco
[Sustrato] (mM) 0,1 0,14 0,2 0,3 0,4 0,6 0,8 1 ___
Tampn glicina (l) 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Sustrato 6 mM (l) 10 14 20 30 40 60 80 100 ___
dH2O (l) 430 426 420 410 400 380 360 340 500
Enzima (l) 60 60 60 60 60 60 60 60 ___
Agitar. Incubar a 37C por 10 minutos, luego agregar:

Molibdato de NH4 (l) 600 600 600 600 600 600 600 600 600
Soluc. Reductora (l) 80 80 80 80 80 80 80 80 80
Agua destilada (l) 720 720 720 720 720 720 720 720 720
Agitar, esperar 10 minutos. Leer en espectrofotmetro a 620 nanmetros.
La lectura de absorbancia de cada tubo es proporcional a la cantidad de fosfato

liberado. Utilizando la lectura del patrn del experimento anterior, calcule los
micromoles de fosfato liberado en cada tubo. Estos valores, divididos por 10
corresponden a la velocidad inicial de la reaccin para cada concentracin de sustrato,
puesto que corresponde a la pendiente entre el tiempo 10 minutos y el tiempo 0,
expresando la velocidad micromoles de fosfato liberado por minuto.
Registre los resultados en la tabla dada a continuacin:
Velocidad
Tubo Concentracin Absorbancia [HPO4] cada 10 (mol/ml)/
1/[S] 1/Vi
N sustrato (mM) (620 nm) (mol/ml) min
1 0,1
2 0,14
3 0,2
4 0,3
5 0,4
6 0,6
7 0,8
8 1
Resultados
17
Grafique la curva de saturacin, en que se exprese [S] en la abscisa y V i en la

ordenada. Estime Vmax y Km.
Realice el grfico de dobles reciprocos (Lineweaver-Burk), con 1/[S] en la abscisa y

1/Vi en la ordenada. Calcule Vmax y Km.
18
LABORATORIO 5: Efecto de la Concentracin de Enzima y del pH

en la Actividad Enzimtica de Fosfatasa Alcalina
Objetivo
Determinar el efecto de la concentracin de enzima y del pH sobre la actividad de

Fosfatasa Alcalina.
Una reaccin catalizada por una enzima se ver afectada por la cantidad de enzima
y adems por el ambiente que la rodea. Cuando la concentracin de sustrato es
saturante, en presencia de un exceso de sustrato, la totalidad de la enzima se
encuentra como complejo enzima-sustrato y entonces la velocidad de la reaccin
(Velocidad mxima) es directamente proporcional a la concentracin de enzima,
manteniendo constantes todos los dems factores como pH, temperatura, fuerza
inica, etc. Por otra parte, el pH afecta de manera notoria la actividad de las
enzimas ya que stas poseen grupos disociables que pueden estar relacionados
especficamente ya sea con la unin de sustrato o con la catlisis.
Reactivos

Tampones:
- Tris/HCl 0,05 M pH 5
- Glicina/NaOH 0,1 M pH 9
- Glicina/NaOH 0,1 M pH 9,4
19
PROCEDIMIENTO
1) Efecto de la concentracin de enzima
La reaccin se inicia por la adicin de la preparacin enzimtica, por lo que es

absolutamente necesario tener la serie de tubos preparada con todos los reactivos,
excepto la enzima.
ESQUEMA DE TRABAJO
TUBOS
COMPONENTES 1 2 3 4 5 6 Blanco
[Enzima] (mg/ml) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 ____
Tampn glicina pH 9,4 (l) 100 100 100 100 100 100 100
Sustrato 6 mM (l) 200 200 200 200 200 200 ____
Agua destilada (l) 285 270 255 240 225 210 500
Enzima (l) 15 30 45 60 75 90 ____

Molibdato de NH4 (l) 600 600 600 600 600 600 600
Soluc. Reductora (l) 80 80 80 80 80 80 80
Agua destilada (l) 720 720 720 720 720 720 720
Velocidad
Tubo Concentracin Absorbancia [HPO4] cada 10
(mol/ml)/min
N Enzima (mg/ml) (620 nm) (mol/ml)
1
2
2) Obtencin de pH ptimo.
20
Determinacin de actividad enzimtica a diferentes pH, utilizando los tampones

correspondientes y manteniendo todos los otros factores constantes. Para el tubo
blanco, elija la solucin tampn pH 9,4.
ESQUEMA DE TRABAJO
TUBOS
COMPONENTES 1 2 3 4 5 6 7 8 Blanco
Tampn pH 5 6 7 8 9 9,4 10 11 ____
Tampn (l) 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Sustrato 6 mM (l) 100 100 100 100 100 100 100 100 ____
Agua destilada (l) 340 340 340 340 340 340 340 340 500
Enzima (l) 60 60 60 60 60 60 60 60 ____

Molibdato de NH4 (l) 600 600 600 600 600 600 600 600 600
Agua destilada (l) 720 720 720 720 720 720 720 720 720
____
Absorbancia 620 nm
Resultados
Efecto de la concentracin de enzima. Grafique la velocidad de la reaccin vs la

concentracin de enzima.
Efecto de pH. Grafique Actividad vs pH e informe y discuta el pH ptimo de la

enzima.
21
LABORATORIO 6: Efecto de un Inhibidor en la Actividad Enzimtica

de Fosfatasa Alcalina
Objetivo
Determinar el efecto de un inhibidor, citrato de sodio, sobre la actividad de

Fosfatasa Alcalina.
La inhibicin enzimtica consiste en la disminucin de la actividad de una enzima

por accin directa de un inhibidor. Algunos inhibidores son metabolitos normales de
la clula que inhiben una enzima particular como parte de los mecanismos de
regulacin celular. Otros son molculas extraas al organismo, como drogas o
toxinas, pudiendo ser el efecto daino o teraputico.
La inhibicin puede ser irreversible, en la cual el inhibidor se une fuertemente a la

enzima, habitualmente mediante un enlace covalente con un residuo del sitio activo
o cercano a l, inactivando a la enzima permanentemente.
La inhibicin puede ser reversible, en la cual el inhibidor (I) se une mediante enlaces
dbiles y el complejo EI est en equilibrio con la enzima y el inhibidor libre. La
inhibicin reversible puede ser competitiva, no competitiva y mixta.
En la inhibicin reversible competitiva, el inhibidor posee una estructura similar al

sustrato, compitiendo con este por el sitio activo. La unin es excluyente, de modo
que disminuye la cantidad de enzima disponible y se requiere mayor cantidad de
sustrato para llenar la mitad de los sitios activos, es decir para alcanzar Vmx/2,
aumentando la Km. La Vmx se mantiene inalterada.
En la inhibicin reversible no competitiva el inhibidor es diferente al sustrato, de

modo que se une en un sitio diferente, ya sea a la enzima libre o al complejo ES. La
enzima puede unir simultneamente el inhibidor y el sustrato. La unin del inhibidor
provoca un cambio conformacional que afecta la Vmx.
En la inhibicin mixta, el inhibidor es diferente al sustrato, de modo que se une en

un sitio diferente, y slo se une al complejo ES. En este caso provoca un cambio
conformacional que afecta tanto la Km, como la Vmx.
El tipo de inhibicin se puede determinar comparando las curvas en presencia y

ausencia de inhibidor en un grfico de dobles recprocos identificando cul(es)
parmetro(s) cinticos varan en presencia del inhibidor.
22
Reactivos
Inhibidor : Citrato de sodio 0,1 M
PROCEDIMIENTO
Los volmenes de inhibidor correspondern a concentraciones entre 0,01 y 0,02 M.

Cada grupo har una curva de saturacin a una concentracin especfica indicada
por el profesor. De acuerdo con esto debe calcular el volumen de agua necesario
para completar la tabla del protocolo.
TUBOS
COMPONENTES 1 2 3 4 5 6 7 8 Blanco
[Sustrato] (mM) 0,1 0,14 0,2 0,3 0,4 0,6 0,8 1 ___
Tampn glicina (l) 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Sustrato 6 mM (l) 10 14 20 30 40 60 80 100 0
Citrato de sodio 0,1 M (l)
dH2O (l)
Enzima (l) 60 60 60 60 60 60 60 60 0
Molibdato de NH4 (l) 600 600 600 600 600 600 600 600 600
Agua destilada (l) 720 720 720 720 720 720 720 720 720
23
Velocidad
Tubo Concentracin Absorbancia [HPO4] cada 10
(mol/ml) 1/[S] 1/Vi
N sustrato (mM) (620 nm) (mol/ml)
/min
1 0,1
2 0,14
3 0,2
4 0,3
5 0,4
6 0,6
7 0,8
8 1
Resultados
Efecto de inhibidores. Haga un grfico de actividad vs concentracin de inhibidor

(Calcule las concentraciones efectivas en su tubo de reaccin).
Haga un grfico de la curva de saturacin en presencia del inhibidor. Haga un

grfico de dobles recprocos. Qu tipo de inhibicin puede observar?
24

Guia Caracterizacion Enzima Bioquimica

Caricato da

Informazioni sul documento

Titolo originale

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Guia Caracterizacion Enzima Bioquimica

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

Bioqumica 251311 - Bioingeniera

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

GUIA DE LABORATORIOS BIOQUIMICA

LABORATORIO 1: Introduccin al Trabajo de Laboratorio

INFORMACIONES GENERALES DE LOS PRCTICOS

Como estudiantes de una asignatura que requiere la manipulacin de reactivos,

Cada actividad desarrollada en un laboratorio en que se manejan sustancias

ANTE CUALQUIER PROBLEMA AVISAR INMEDIATAMENTE AL PROFESOR(A)

Reglas Bsicas Generales

Proteccin de los ojos:

Utilice gafas de seguridad si es necesario.

En caso de emergencia utilice el LAVAOJOS que est colgado en la pared de

Use un protector en caso de ruidos producidos por equipos y/o campanas de

No trabaje con material defectuoso (trizado o quebrado), porque constituye un

Sea precavido al trabajar con mechero y baos termorregulados, transite lento

Si se trata de quemaduras por lquidos calientes, sumerja la zona afectada en

Es conveniente leer siempre la etiqueta de cualquier reactivo antes de usarlo.

Nunca saborear ni oler los reactivos o productos de una reaccin.

Nunca pipetear con la boca.

Los residuos inertes plsticos como tubos, puntas y guantes, debern

Los residuos contaminantes debern verterse a los recipientes correspondientes

Es obligatorio el uso de delantal en el laboratorio. (Cada alumno debe traer su

Usar guantes de proteccin si es necesario.

Utilizar un calzado que cubra completamente el pie.

Incendios: Medidas de prevencin

No acercar ningn envase de reactivos cerca de una llama.

Cerrar siempre el mechero Bunsen cuando no se utilice mediante la llave

No calentar en el mechero lquidos inflamables.

Utilizar los extintores adecuados para apagar cualquier incendio.

Todos los alumnos tienen la obligacin de saber dnde est el extintor, el

Adems de lo anterior, se prohbe estrictamente:

Hacer experimentos no autorizados.

Sacar fuera del Laboratorio reactivos materiales o instrumentos.

Fumar, comer o beber en el laboratorio.

La permanencia en el laboratorio de personas ajenas al curso prctico.

Distraer o interrumpir a las personas que se encuentran trabajando en el

El incumplimiento de cualquier norma de seguridad puede acarrear la inmediata

La responsabilidad por las consecuencias de no cumplir esta norma dentro del

Telfono del Paramdico del Campus: Anexo 4567

PAUTA PARA EL DESARROLLO DEL TRABAJO PRCTICO

En un trabajo cientfico es de mucha importancia aspectos tales como la confeccin

Se espera que el cuaderno contenga para cada actividad prctica:

Ttulo del experimento

Considerando lo anterior, el cuaderno ser revisado y su progreso ser evaluado

PAUTA PARA REDACTAR INFORME PRCTICO

PRESENTACIN Y FORMATO DE INFORME:

d) Lenguaje: Utilice un lenguaje formal y cientfico. Utilice ortografa y gramtica de

e) Originalidad: No debe copiar prrafos completos de otras fuentes bibliogrficas,

SECCIONES DEL INFORME:

1) RESUMEN: Todo informe o publicacin cientfica comienza con un resumen en el

2) PALABRAS CLAVES: Incluye 4 a 6 palabras relacionadas con el trabajo realizado.

3) INTRODUCCIN: Incluye Marco Terico. Debe establecer claramente el

5) RESULTADOS: Deben describirse en forma clara y objetiva los hallazgos de la

6) DISCUSIN: En esta seccin se describe el significado de los resultados

7) REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: Las referencias son artculos de revistas o

Ejemplos de listado Numerado:

Ejemplos de listado por orden alfabtico

LABORATORIO 2: Cuantificacin de Protenas y Determinacin de

Realizar una curva de calibracin de protenas por el mtodo de Bradford.

El mtodo de Bradford se basa en la unin del colorante Coomassie Blue G250 a

Solucin Standard : albmina de suero de bovino 100 g/ml

Elija las diluciones adecuadas a partir de la Solucin Standard de albmina 100

Tiempo de 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 _ _