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Immunologia - Lezione 1 - 04.03.

13- Novelli

Prof.Novelli
Slides programma 2012-13.
Slides adi , ladi consiste in una discussione su un caso clinico a base immunologica e si possono guadagnare
punti bonus per lesame ( uno ad adi e sono due) rispondendo correttamente a fine lezione a domande
aperte, i punti valgono fino a dicembre 2013.
Esame: fa fede quanto spiegato a lezione.
Si pu sostenere lesame in tutte le sessioni.
Lesame consiste in un test di 63 domande con risposte a scelta multipla, cui si deve rispondere in 60
minuti.
Ogni domanda vale 0,5 punti (60 x 0,5 = 30 + tre domande per la lode)
Ogni risposta sbagliata o non data vale 0. Si pu correggere la risposta finch si vuole.
Le risposte date vengono discusse personalmente in un colloquio con il docente. E possibile far valere le
proprie ragioni contro il parere del professore.
Necessarie le firme al 70% per sostenere lesame e aver fatto il questionario di valutazione.

IMMUNIT NATURALE

L'immunologia lo studio dell'immunit, immunit indica esenzione.


Lo sviluppo dei mammiferi un processo che si evoluto negli anni, il nostro organismo tiene conto del
fatto che viviamo con microbi intorno che hanno influenzato il nostro sviluppo.
Questi tendono a invaderci e noi dobbiamo difenderci: ci ha determinato un impulso per lo sviluppo e il
perfezionamento del nostro sistema di difesa durante levoluzione.
Il nostro sistema immunitario (formato da una serie di organi) ha la finalit di difenderci dai pericoli di
invasione da parte di organismi multicellulari e complessi.

Siamo attaccati da:


Microorganismi (virus, batteri,..)
Geni estranei(virus, DNA ,RNA)
Cellule proprie mutate (trasformazione di nostre cellule)
Cellule aliene( tutte le cellule che non appartengono al nostro organismo: es rigetto trapianto)

Il nostro sistema immunitario riconosce le mutazioni e scatena una risposta.


I microorganismi ci invadono perch siamo dei corpi caldi, ricchi di nutrimento, in cui i microorganismi
trovano un ambiente ottimale per vivere.
Tuttavia molti microorganismi mettono in pericolo la nostra vita, sono direttamente patogeni e per questo
dobbiamo essere in grado di scatenare una risposta di tipo immunitario. Se l'invasione dei batteri
incontrollata, l'individuo va incontro a malattia e a morte.

Alcuni non sono cattivi quindi raggiungiamo dei compromessi: es. con la flora batterica, perch previene
l'attacco da parte di altri batteri pi pericolosi di tipo patogeno.
Creiamo una situazione di simbiosi con la quale scendiamo a patti con questi batteri per salvaguardare la
nostra esistenza. La simbiosi sembra essere importante anche per controllare le risposte del sistema
immunitario. Si sviluppata una pratica chiamata microbioma che studia il rapporto tra sistema
immunitario e microbi nel nostro corpo.

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Molte malattie di tipo autoimmune sono dovute a un disequilibrio tra la presenza di batteri simbionti e il
nostro organismo.

I microorganismi ci attaccano in modo diverso:


Esotossine: sostanze rilasciate all'esterno dal patogeno che provocano malattie, come: scarlattina,
difterite, tetano, colera,...
Contenendo endotossine: presenti nei microrganismi stessi e provocano infezione , per es. sistemica (
sepsi), meningite, polmonite, tifo, dissenteria, peste...
Uccidono la cellula in cui penetrano: usano molecole sulla nostra cellula per entrare e poi la uccidono.
Riescono ad indurre una risposta immunitaria talmente forte che diventa abnorme e determina dei
danni perch la risposta infiammatoria molto forte e pu cronicizzare dando danni al nostro
organismo. Troviamo questo meccanismo nelle malattie autoimmuni.
Il nostro sistema immunitario si difende creando degli immuno-complessi, cio produce degli anticorpi
(proteine) che si appiccicano a delle molecole prodotte dai microorganismi e riescono quindi a neutralizzare
la risposta.
Questi complessi possono per diventare pericolosi perch possono precipitare bloccando la funzione
renale dando problemi come nefriti e altro. Questi meccanismi possono dar vita a fenomeni di
autoimmunit. In alcuni casi i microorganismi determinano immunodeficienza, come nel caso dell'HIV.

Lorganismo continuamente attaccato e quest invasione stata costante nel corso di tutta l'evoluzione,
portando alla creazione del sistema immunitario e di tecniche di difesa sempre pi avanzate. (Come
metafora fa quella di un castello sotto assedio).

Strategie di difesa del sistema immunitario:

1. Involucro: abbiamo una corazza che impedisce l'ingresso fisico dei microbi ed la cute.
2. Immunit innata: attivata quando i patogeni superano l'involucro ed quasi sempre efficiente.
3. Immunit adattativa: l'ultima e pi efficace e scatena una memoria immunitaria.

Involucro

Barriera continua, elastica, molto resistente, costituita dalla cute.


Attraverso la cute i microbi non riescono a passare.
L'efficacia dell'involucro dipende da meccanismi importanti che sono di tipo :
Fisico: per impedire fisicamente l'ingresso dei microorganismi
Chimico
Biologico
Antibiosi( batteri nostri che ci proteggono da altri batteri
patogeni).

L'involucro ha barriere:
biochimiche e biologiche, come le lacrime che contengono il
lisozima, le ghiandole sebacee e la flora batterica.
chimico-fisiche, attraverso cui o i microbi non riescono a
penetrare, o non riescono a riprodursi. Tra queste abbiamo

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il muco, l'epitelio ciliato che elimina gran parte dei microrganismi, la cute che desquama eliminando
cellule e batteri, HCl nello stomaco che rende il pH acido e dunque rende impossibile ai batteri la
replicazione e la sopravvivenza.

Questa corazza presenta dei punti deboli attraverso cui i microbi riescono a penetrare con pi facilit:
Mucose: dell apparato gastroenterico, del respiratorio e del genitale, sono presenti punti di
contatto tra esterno ed interno.
Cute in condizione di traumi ( discontinuit della cute) ,
Condizioni ambientali( caldo-freddo, mani in acqua, screpolature,...)
Apparati come occhio e orecchio che sono pi esposti e pi facilmente aggredibili.

Quando l'involucro viene superato, i microorganismi entrano nellorganismo innescando l'immunit innata.

IMMUNIT INNATA E ADATTATIVA

La risposta immunitaria innata la seconda barriera,


formata da meccanismi cellulari e molecolari.
La risposta innata ha anche la funzione di "ponte": permette
l'attivarsi della risposta adattativa.
Se la risposta innata sconfitta, si attua
la risposta adattativa che molto raffinata ed efficace e
scatena dei meccanismi (fase efferente della risposta
immunitaria) che portano all'eliminazione dei microbi.
La risposta adattativa crea una memoria immunitaria che ci
permettere di riconoscere gli organismi che ci hanno invaso
e ci hanno provocato una certa malattia. Sul meccanismo
della memoria sono basati tutti i vaccini.

IMMUNIT INNATA

La risposta innata scatenata dal sistema immunitario che riconosce determinate molecole.
Questi determinanti sono comuni a tutti i microorganismi e sono di tipo:

Cellulare, cio quando le cellule vengono attivate da questo riconoscimento e portano all'eliminazione
dei microbi.
Molecolare: vengono prodotti sistemi basati su molecole solubili che sono presenti nel nostro
organismo, per esempio nel siero, estremamente importanti per eliminare i microorganismi.

La risposta innata fa produrre determinante sostanze.


Queste difese sono anche chiamate umorali (immunit umorale) perch le sostanze si trovano nel siero,
negli interstizi della cellula e quindi nei liquidi biologici che venivano definiti dagli antichi umor.

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Le sostanze prodotte sono:

Lisozima: importante per eliminare batteri che cercano di introdursi attraverso le vie respiratorie.
Betalisine: nella cute.
Batteriocicline: nella cute.
Tufsina: nella cute.
Sistema lactoperossidasi-tiocianato- H 2 O 2 che porta alla produzione di ros nei macrofagi.
Interferoni: molecole con attivit antivirale: inibiscono la replicazione virale e vengono prodotti subito,
poche ore dopo l'invasione della cellula da parte dei virus
Coagulazione del sangue: dopo che un microrganismo entra nella cute si formano dei trombi nei vasi per
evitare la diffusione sistemica dei microbi e la conseguente sepsi.
Complemento: proteine del nostro siero che vengono attivate da anticorpi o zuccheri dei batteri. C' una
cascata di proteine del nostro siero che si attivano in serie innescando fenomeni infiammatori o
eliminando il patogeno.

Lisozima
O muramidasi.
Scoperto da Fleming nel 1922.
Scinde legami beta glucosidici 1-4 tra acido n-acetilmuramico e n- acetilglicosamina che sono propri del
peptidoglicano presente sulla parete dei batteri [il peptidoglicano costituisce sia parte della parete dei
batteri Gram - che Gram +, ma in quest'ultimi nettamente prevalente e perci su di essi il lisozima pi
forte. E' una molecola esclusivamente batterica]. Scindendo queste molecole, la parete del batterio perde
rigidit e va incontro a un processo che alla fine provoca la lisi, quindi la morte del batterio.
Lo si ritrova nei tessuti dei mammiferi e nel siero, ma nelle lacrime, nel secreto nasale, nella saliva il
lisozima in concentrazioni pi elevate.
prodotto da granulociti e monociti.

Recettori di membrana e pattern recognition molecules

Il primo livello di risposta innata ci porta al controllo dell'invasione. Il nostro sistema immunitario
estremamente efficace perch noi siamo continuamente invasi da miliardi di patogeni, ma quasi mai ci
ammaliamo.
Uno dei problemi che affronta l'immunit innata riconoscere qualcosa di estraneo "al buio".
Il sistema immunitario per farlo si basa su recettori di membrana : le nostre cellule, come neutrofili ed
eosinofili o linfociti nk, facenti parte della risposta immunitaria innata, possiedono dei recettori di
membrana attraverso cui si rendono conto se hanno a che fare con qualche microbo, innescando poi la
risposta immunitaria.
Sono recettori specifici per strutture microbiche cio strutture usate solo dai microbi e non dai mammiferi.
Queste strutture sono dette pattern recognition molecules, cio dei profili di molecole di riconoscimento
microbico (per esempio ci sono zuccheri che non fanno parte delle pareti delle nostre cellule, ma si trovano
solo nelle pareti microbiche, anche alcuni DNA nei virus vengono riconosciuti).

Pattern recognition molecules :


Proteine con residui terminali di mannosio
Lipopolisaccaride su batteri gram negativo
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RNA a doppia elica (virus)


N-Formil-metionil-peptidi (batteri)
Sequenza CPG non metilate (DNA batterico)

I recettori che legano il mannosio (simili alla lectina che lega i mannani) lega zuccheri presenti solo sui
microrganismi. Queste tipiche molecole possiedono delle teste globulari che si legano e attivano la risposta
immunitaria.
La risposta adattativa invece specifica.

Toll like receptors , TLR

[slides: Christiane Nusslein scopr il gene toll , Nobel nel 1995 per i suoi studi; Nobel Prize in Physiology or
Medicine 2011 shall be divided, with one half jointly to Bruce A. Beutlerand Jules A. Hoffmann for their
discoveries concerning the activation of innate immunity]
I recettori sono stati scoperti a partire dagli anni '90 grazie a studi su Drosophila.
Furono studiati i geni che regolano lo sviluppo dorso- ventrale in Drosophila ed stata clonata la parola
"toll" ( = che figo!) in seguito a un esperimento venuto bene. Si scoprirono una serie di recettori che
controllavano lo sviluppo di questo animaletto e, qualche anno dopo, vennero clonati dei geni omologhi a
questi geni toll nell'uomo.
Questi geni vennero chiamati "toll like receptors" e si scopr che controllano il riconoscimento della
risposta innata. Riconoscono i pattern recognition molecules.

Sono cos importanti che sono stati mantenuti nell'evoluzione dalle drosophile fino ai mammiferi. La
risposta dei mammiferi a (virtualmente) tutti i microorganismi dipende inizialmente dai TLR.
Quelli identificati nell'uomo sono strutturalmente simili al recettore toll della Drosophila. Questi recettori
sono presenti anche negli insetti, nelle piante e nei mammiferi.
Comunicano che c qualcosa di esterno e danno il via alla risposta innata.
Nell'uomo ne sono stati identificati 11 tipi ( TLR 1 - 11).
I tlr riconoscono possono riconoscere tutti i microbi. Non riconoscono solo i vermi.
La maggior parte dei tlr sono esposti sulla membrana cellulare. Alcuni sono all'interno delle cellule,
negli endosomi (servono per riconoscere DNA virale) , perci contattano i loro ligandi o nello spazio
extracellulare o negli endosomi.
Presentano una porzione extracellulare, che sporge dalla membrana cellulare, e una parte
intracellulare, che permette di mandare un messaggio all'interno della cellula una volta che hanno legato
il ligando.
Possono combinarsi, formando degli eterodimeri, e quindi la quantit di ligandi aumenta notevolmente.

Funzionamento:
Quando il ligando lega il recettore ha inizio una risposta pro-infiammatoria. Vengono principalmente
trascritti geni relativi a citochine e chemochine, sostanze solubile secrete allesterno della cellula che
funzionano come segnali per la localizzazione dellinfiammazione, reclutando granulociti nella zona
interessata.

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Agiscono in diversi modi; i TNF (Tumor Necrosis Factor, fattore di necrosi tumorale), tra i pi comuni e i pi
importanti, agiscono soprattutto sugli endoteli, modificandone la permeabilit e permettendo
lextravasazione dei granulociti in circolo permettendone la mobilitazione.

La parte extracellulare incontra il ligando e lo lega: questo legame determina una modificazione
conformazionale della proteina sulla membrana, la modifica nello spazio, e ci inizia una serie di segnali che
vengono trasmessi all'interno della cellula.

C' una regione importante nella parte intra-citoplasmatica che si chiama TIR (regione omologa a un
recettore toll della drosophila) e, quando avviene il legame tra il ligando e il recettore, questa regione
funziona come punto di attracco per delle proteine che stanno all'interno del citoplasma come MyD88.
MyD88 si lega a TIR e questo legame inizia una serie di reazioni che portano altri adattatori citoplasmatici a
legarsi l'uno con l'altro. Ci sono altri adattatori che si legano a MyD88 che si chiamano TRAF6 e IRAK.
Tali molecole attivano dei fattori trascrizionali (sono: MAPK, AP1, IRF7, NFkB) che vanno nel nucleo e
attivano la trascrizione di citochine e chemochine.
Cos viene attivata la risposta immunitaria.

Esempi funzione dei recettori


Possono formare eterodimeri, ampliando cos il numero di ligandi.
Inoltre la specificit anche influenzata dal coinvolgimento di molecole accessorie.

TLR2 + TLR2, omodimero, riconoscono batteri di tipo Gram+, porta alla sintesi di TNF.
TRL2 + TLR1, un etero dimero che riconosce una famiglia di lieviti. Produce TNF.
TLR2+3 e TLR2 + 6 riconoscono l'acido lipoteicoico nei batteri Gram positivi o dei lieviti presenti in
questi batteri. Fanno produrre TNF.
TLR3 riconosce virus (RNA a doppia elica o DNA), fa produrre IFN alfa/beta.
TLR 4 molto importante e funziona in associazione con CD14 che il recettore per il lipopolisaccaride,
che influenza la specificit di TLR4. TLR4 in associazione con CD14 riconosce molto bene lipopolisaccaridi
batterici, lega inoltre peptoglicani e N-formil metionin peptidi.

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Riconosce anche fibrinogeno e heatshock proteins, non sono sostanze prodotte da una infezione
batterica o virale, ma vengono sintetizzate in caso di danno cellulare.
Sia TLR4 che TLR5 portano allespressione, sulla membrana, di MHC II (molecole di istocompatibilit di
classe II, importanti lipoproteine). Inizia la risposta infiammatoria provocando sia la produzione di TNF
che di Interferone alfa e beta.
TLR 5 riconosce i flagelli dei batteri.
TLR6 riconosce strutture di tipo virale, sia DNA che RNA doppia elica, portando alla produzione di
Interferone alfa e beta, proteina antivirale che interferisce con la replicazione dei virus..
TRL7 e TRL8 riconoscono RNA a singola elica, stimolando produzione TNF.
TLR9 riconosce sequenza di DNA non metilato, CPG, specifiche quindi dei batteri.

(nella slide ci sono i TRL: 2+2,2+1,2+6,3,4,5,9,7+8)

Un attivazione dei TLR non dovuta a una infezione (come nel caso del riconoscimento di fibrinogeno del
TLR4) viene detta infiammazione sterile.

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Riprende e prosegue il discorso sul riconoscimento di microrganismi e risposta immunitaria

Batteri e virus entrano nellorganismo e vengono captati dai macrofagi : in seguito al riconoscimento da
parte di TLR di un ligando, acquisiscono nuove funzioni, maturano.
Vengono secrete citochine, TNF e interferone, che reclutano altre cellule immunitarie. Si ha un processo di
amplificazione del segnale immunitario.
Anche questi macrofagi reclutati si attivano, cominciando a produrre a loro volta segnali solubili (per lo
pi citochinici) che riversano nel flusso circolatorio, che possono attivare anche altri tipo cellulari: linfociti T
e cellule natural killer, amplificando ulteriormente la risposta.

Nei macrofagi (particolarmente) le citochine portano ad un aumento del metabolismo (burst respiratorio),
aumentando sistemi enzimatici che portano alla produzione di radicali dellossigeno e monossido dazoto,
usati per eliminare i batteri fagocitati.
[Nota: non detto che i primi macrofagi coinvolti rilascino citochine che attivano solo altri macrofagi,
possono contattare (direttamente o agendo sullendotelio) altri tipi cellulari. I linfociti T normalmente sono
coinvolti in un secondo momento, mentre le cellule natural killer possono essere coinvolte sin da subito.]

Anche le cellule dendritiche si attivano in seguito alla segnalazione di TRL.


Esse pattugliano lorganismo, si trovano in diversi tessuti periferici (nella cute prendono il nome di cellule di
Langherans), e collaborano con linfociti T.
Le cellule dendritiche possiedono:
-TRL - Recettori che permettono di interagire con altre cellule del sistema immunitario -MHC II.
Fagocitando batteri ne immagazzinano gli antigeni e cominciano il processo di maturazione: migrano verso i
linfonodi dove incontrano i linfociti T, a cui mostrano gli antigeni fagocitati che verranno legati sui recettori
dellMHC, il TLR4 guida la presentazione dellantigene sulle molecole MHC II (in particolare, quando la
fagocitosi associata a segnali di TLR4, questa esposizione dellantigene particolarmente efficiente,
soprattutto per quanto riguarda i linfociti T).
La molecola B7, presente sulla superficie delle cellule dendritiche, coinvolta nellinterazione coi linfociti T.

La risposta immunitaria innata d cos il via a una di tipo adattativo, mediata soprattutto da linfociti T e B.
Questo un processo critico della risposta immunitaria: se i linfociti T non maturano non riesce a partire la
risposta immunitaria.
Le cellule dendritiche sono dette tolleranti: un problema comune nei pazienti tumorali, spesso la risposta
immunitaria non riconosce gli antigeni, e le cellule dendritiche non si attivano, non promuovendo azione
immunitaria.

Errori di trasduzione del segnale di TRL

Se i TRL hanno problemi e funzionano di meno si hanno:


senza i segnali dei TLR si ha una situazione di tolleranza, incapacit dellorganismo di reagire a
stimoli esterni.
In altri casi i TLR funzionano, ma vi sono errori nella trasduzione del segnale, con conseguente
immunodeficienza.
Se i TRL funzionano troppo si hanno quadri di autoimmunit : la risposta immunitaria si dirige verso
il self. Un esempio il morbo di Chron, che colpisce il tessuto intestinale per una esagerata

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efficienza dei TRL, che riconoscono i batteri intestinali dando una risposta eccessiva con una
conseguente eccessiva risposta infiammatoria.

Vi sono virus che producono proteine che inibiscono i TLR, mentre alcuni farmaci, come lImiquidor,
possono provocare una risposta infiammatoria (viene usato soprattutto in caso di infezioni a livello
genitale).

[Esempio di segnale TLR difettoso, caso clinico, Douglas 6 anni:


caso di meningite pneumococcica (serotipi 3 e 6), infarto del miocardio, problemi di crescita,
parziale perdita udito e difetti apprendimento, ricorrenti infezioni allorecchio da pneumococco.
Ai test di laboratorio la formula linfocitaria (il numero di linfociti T e B e monociti ) normale, cos
come la quantit di anticorpi nel siero.
La vaccinazione contro streptococcho pneumoniae e meningitidis non d per risposta.
Da questo si deduce una suscettibilit a infezioni pneumococciche.
Si cerca allora la causa:
da un campione di sangue vengono isolati i leucociti, li si stimola con ligandi di TLR e si valuta la
produzione TNF alfa, che risulta molto bassa (da 10 a 100 volte rispetto a un sano).
Si usa quindi Interleuchina-1 (IL-1) dei leucociti, il cui recettore molto simile a quello dei TLR, e si
trova unassenza di produzione di MAPK e NFKB.
La via di trasmissione del segnale nei leucociti non funzionante.
Si sequenzia il DNA per il gene IRAK4, una chinasi coinvolta nella trasmissione del segnale dei TRL,
si trova un difetto e il segnale non pu perci raggiungere il nucleo.
(Quando TLR riconosce il ligando, MyD88 si lega ad una zona citoplasmatica del recettore. TRAF6 si lega a
sua volta a MyD88. A questo punto coinvolto il fattore IRAK (trascritto dal gene prima citato, IRAK4). In
mancanza di questo tutti i successivi fattori trascrizionali non possono legarsi, e il segnale di trascrizione per
citochine e chemochine non arriva al nucleo.)]

Altri recettori della reazione immunitaria:

Le proteine NOD sono i sensori intracellulari dellinfezione batterica,


fan parte dellimmunit innata.
Si trovano nel citosol ( i TLR si trovano sulle membrane o negli
endosomi, soprattutto membrana, entrambi i tipi (TRL e NOD) di
recettori possono trovarsi nella stessa cellula, avendo una funzione
complementare).
Riconoscono i ligandi microbici attraverso un dominio di
oligomerizzazione legante il nucleotide (Nucleotide-binding
oligomerization domain), e attivano NFkB attivando gli stessi processi infiammatori di TRL, portando alla
produzione di chemochine e citochine.
Si trovano in cellule molto esposte allazione batterica, come le cellule epiteliali e le cellule di Paneth, nel
tessuto intestinale. Inducono la sintesi di otenti peptidi che bloccano la replicazione batterica, alfa
defensine.

I recettori RLR (Rig Like Receptors) si trovano nel citosol, e reagiscono a infezione virale (qualora i virus
fuoriescano dagli endosomi, dove si trovano normalmente).

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Ce ne sono due tipi principali: RIG (Retinoic acid Inducible Gene I) e MDA5. Entrambi riconoscono RNA
virale a doppio filamente grazie a un dominio RNA elicasi. Un secondo dominio, CARD (caspase activation
and recruitment domain), permette linterazione con proteine adattatrici che segnala al nucleo la
presenza di RNA virale.
Attivano i fattori trascrizionali che portano alla sintesi di Interferone alfa e beta (come i TLR3 negli
endosomi).
[MDA-5 e RIG-1 legano RNA, legando CARDIF che attiva i
fattori trascrizionali IRF3 e IRF7. Dimerizzano e migrano nel
nucleo, dove attivano trascrizione geni per IFN alfa e beta.]

Linterferone prodotto lega i recettori sulla cellula


inducendo sintesi di proteine inibenti replicazione virale:
-Oligoadenilato sintetasi, attiva endonucleasi che degrada
RNA virale (pu inoltre polimerizzare ATP in oligomeri
legati a 2 e 5).
-PKR chinasi, treonina chinasi che fosforila eIF-2 (fattore
iniziazione sintesi delle cellule eucariote), inibendo
replicazione cellula e quindi quella virale.
-Mx, necessaria per la resistenza cellulare alla replicazione del virus ( dellinfluenza soprattutto).

[da slide, non nella sbobina. Ndr]


I mastociti, i granulociti, i macrofagi, le cellule dendritiche (DC) e le cellule degli endoteli sono le cellule
dellimmunit naturale. Queste cellule:
Esprimono un alto repertorio di diversi pattern recognition receptors
Non presentano differenze clonali
Non vanno incontro ad espansione clonale

Quando trovano uninfezione microbica: -Fagocitano -Uccidono -Chiedono aiuto


Chiedono aiuto tramite messaggi (citochine e chemochine) che:
attivano le cellule vicine (endoteli)
reclutano le cellule che passano (aumentano l'espressione delle molecole dadesione da
parte delle cellule endoteliali, e favoriscono l'estravasazione)
dicono al midollo di mettere in circolo piu'cellule (dilatazione delle cellule endoteliali, liberazione dei
granulociti dai depositi midollari)
bloccano la diffusione dei microrganismi (citochine antivirali, deposizione di fibrina, coagulazione del
sangue)

CITOCHINE
Classificazione:
La famiglia delle citochine comprende:

Cito china: metto in moto la cellula.


Inter leu china (nome storico che si riferisce ai leucociti. Ne fan parte gli interferoni alfa,beta e
gamma)
Chemo china (a prevalente attivit chemotattica)

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Immunologia Lezione 02 06.03.13 Novelli
CSF (colony stimulating factor, citochine che agiscono principalmente a livello del midollo
mobilitandone le cellule. MCSF, per esempio, stimolano la formazione di colonie macrofagiche.)

Funzione:
Le citochine sono sostanze solubili il cui ruolo , sostanzialmente, quello di far muovere altre cellule (da
cyto, cellula, e kinos, movimento). Questo obiettivo viene raggiunto in diversi modi (gradienti, attivazione di
altre cellule).
Citochine e chemochine, tra gli altri effetti, aumentano la sintesi di molecole di adesione da parte
dellendotelio. I granulociti e gli eosinofili circolanti aderiscono pi facilmente allendotelio, con il fenomeno
della extravasazione: le cellule immunitarie possono uscire dallendotelio, raggiungendo il punto in cui il
batterio entrato nellorganismo.
Le chemochine creano poi un gradiente di concentrazione, svolgendo attivit chemoattrattiva nei confronti
delle cellule immunitarie, che seguono il gradiente fino a raggiungere il punto interessato.
Le citochine per lo pi svolgono la funzione di innescare risposta infiammatoria.
I messaggi veicolati bloccano anche direttamente la diffusione dellinfezione in caso di ferite o traumi: le
citochine infiammatorie fanno s che, a livello dellinfezione, si deponga la fibrina, favorendo coagulazione
dei vasi e impedendo la diffusione a livello sistemico del microorganismo.

Struttura, secrezione e caratteristiche:


Tutte le citochine hanno una struttura simile.
Sono molecole piccole, circa 17 KDa, con struttura a foglietti beta messi in contatto da alfa eliche.
La maggior parte delle citochine agisce nel microambiente tra cellula e cellula, mentre alcuni agiscono
come ormoni, stimolando anche secrezione e effetti a distanza.
La secrezione per lo pi di tipo polarizzato. Pu essere sia autocrina che paracrina (le cellule legano le
citochine secrete da altre cellule). Altre funzionano a livello endocrino, come I CSF a livello del midollo.

Le citochine sono molecole molto potenti, con una vita media nellordine dei minuti per evitare una
risposta eccessiva (vi sono patologie dovute a rilascio incontrollato di citochine, sino a livelli di shock
anafilattico).
Vengono metabolizzate rapidamente a livello renale, inoltre vi sono degli inibitori nel siero (proteine che
legano le citochine).

Recettori delle citochine:


I recettori, molto specifici, hanno una costante di dissociazione media nellordine di 10^-11 molare.
Vengono perci saturati rapidamente anche a concentrazioni molto basse.
I recettori per le citochine sono selettivi e a loro espressione avviene solo in alcuni tipi di cellule, sono
costituite da pi catene combinate insieme e alcune catene vengono espresse sulla membrana solo in
alcune situazioni funzionali delle cellule stesse. Non sono sempre pronte a captare segnale della citochina.
I linfociti T esprimono il recettore solo dopo aver riconosciuto un antigene.
Classificabile in diverse famiglie:
Uno in particolare il recettore per lIL-2 (importante perch i linfociti proliferino).
un recettore multimerico, con catene specializzate nel legare la citochina e altre nel trasdurre il
segnare. Si trova soprattuto su linfociti T e cellule natural killer.
In condizioni normali formato cos:
-Catena beta, lega IL-2 a bassa intensit.

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-Catena gamma, che non entra in contatto con la citochina, ma possiede una coda citoplasmatica per
trasmettere segnale al nucleo.
Il complesso beta-gamma lega IL-2 a bassa affinit.
Quando il linfocita T viene attivato riconoscendo un antigene estraneo viene indotta sintesi di una terza
catena.
-Catena alfa, detta anche CD25. Alfa lega, da sola, IL-2 a bassissima affinit (10-8 molare), ma associandosi
al complesso beta-gamma si forma un recettore ad altissima affinit (sino a 10-11 molare).
La catena alfa pu quindi regolare la funzionalit del recettore.

Trasduzione del segnale


Tutti i recettori delle citochine trasducono il segnale nel nucleo con il sistema JAK/STAT (JAK ,cinasi; STAT,
molecole di trasduzione del segnale e fattori di trascrizione).
Le JAK sono sempre legate al recettore, quando questo lega la citochina, le JAK fosforilano le code
intercitoplasmatiche, rendendo possibile il legame con le STAT, che viene reclutata legandosi al sito di
attracco. Le STAT vengono fosforilate a loro volta, si staccano e dimerizzano, poi migrano nel nucleo per
completare la trasduzione del segnale e attivare la trascrizione.

La catena gamma nel recettore per IL-2 detta common gamma chain perch si trova nei recettori di
molte interleuchine (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 , differiranno in altre componenti).
Mutazioni della catena gamma portano a problemi nella ricezione di molte interleuchine, con grave
immunodeficienza detta X-linked SCID (severe combined immunodeficiency X-linked), con difetti della
maturazione sia di linfociti B che T.

Funzioni relative a
diverse interleuchine,
perse in caso di difetto
nella catena gamma

Regolazione a feed-back negativo:

Lo shedding del CD25 un meccanismo di regolazione, limitato quindi (perch usa la catena alfa) ai
recettori per IL-2. Normalmente i linfociti T, rispondendo al segnale di IL-2, proliferano. Un linfocita
specifico per un determinato antigene in pochi giorni si divide in moltissime cellule: il meccanismo deve
essere controllato, per evitare conseguenza autoimmunitarie. Allora i linfociti T cominciano a perdere la
catena alfa, con riduzione dellaffinit. Inoltre la catena alfa, rilasciata nellambiente intercellulare, lega IL-
2, neutralizzandone leffetto.

Le molecole SOCS (suppressor of cytokine signalling) sono un altro tipo di meccanismo regolatorio.
Quando un linfocita T viene attivato da IL-2, dopo un certo periodo, produce le proteine SOCS : agiscono a
livello di JAK/STAT (alcune a livello di JAK, altre a livello di STAT), bloccando il segnale. Quando funzionano
male si hanno malattie autoimmuni o sindromi tossiche dovute a continua produzione di citochine.
La produzione di SOCS interessa tutti i tipi di recettori citochinici.

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Immunologia - Lezione no 3 12.03.13 Novelli

CHEMOCHINE

Sono unaltra famiglia di recettori solubili dellimmunit.


Sono oltre 40 piccole citochine (8-11 kD= chilo Dalton) ad attivit chemotattica: guidano, una volta che
sono attivate attraverso i segnali di TLR (Toll-like receptors), il movimento di moltissime cellule
dellimmunit (granulociti, eosinofili, neutrofili, linfociti T).
Le chemochine sono strutturalmente diverse dalle citochine ma sono anchesse delle piccole molecole e
hanno affinit elevata per specifici recettori.
Quando queste citochine sono legate al recettore, viene trasmesso un segnale e la cellula risponde
muovendosi verso il gradiente di concentrazione che si forma a partire dalla sorgente dove la chemochina
stata prodotta.
E molto importante il ruolo di queste cellule perch il sistema immunitario costituito da cellule circolanti
nel sangue e nella linfa, con sede negli organi linfatici.
Quando entra un patogeno i linfociti e i granulociti devono essere guidati: prima devono raggiungere il
sistema linfatico nei linfonodi e nella milza dove, interagendo con altre cellule, elaborano la risposta
immunitaria. Poi devono raggiungere i tessuti , dove sono guidati durante la fase effettrice (leliminazione
del patogeno), per raggiungere il punto critico.

Ci sono diversi tipi di chemochine:


- Chemochine costitutive: regolano innanzitutto lextravasazione, cio la fuoriuscita dai vasi delle
cellule immunitarie (linfociti, granulociti, macrofagi, che sono munite di recettori per le
chemochine) per raggiungere il punto dove entrato il patogeno.
Le chemochine guidano anche la localizzazione delle cellule del sistema immunitario negli organi
linfatici e nei tessuti.
- Chemochine infiammatorie: quando c un segnale di pericolo mediato dal TLR si attiva il
fenomeno dellinfiammazione, dovuto al fatto che i granulociti si attivano.
Viene modificata la permeabilit dei vasi, ladesivit e i granulociti escono dai vasi in seguito ai
segnali chemochinici, fenomeno chiamato diapedesi, (il granulocita si deforma passando tra le
giunzioni delle cellule endoteliali), poi fuoriescono verso il luogo in cui c il patogeno per esercitare
la fagocitosi e distruggere il patogeno stesso.

Si possono distinguere due famiglie di chemochine in base alla loro struttura, composta da sequenze
amminoacidiche differenti:
- CXC: hanno una sequenza di cisteine intervallate da un amminoacido qualsiasi (detto X)
- CC: sequenza caratterizzata da doppie cisteine nella sequenza

Recettori:
I recettori sono particolari e differenti dai recettori delle citochine. Sono delle tipiche proteine multipasso,
attraversano 7 volte la membrana cellulare.
Il segnale che viene trasdotto dal legame chemochine-recettore non segue la via JAK-STAT, ma attiva delle
proteine G che, a loro volta, trasducono il segnale verso il nucleo. Il segnale viene trasdotto attraverso lo
scambio di GTP con GDP.
Esistono due tipi di recettori:
- CXCR: legano le chemochine di tipo CXC
- CCR: legano le chemochine di tipo CC

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A differenza dei recettori per le citochine, sono meno specifici e possono legare diversi tipi di chemochine
(comunque CXC il primo e CC il secondo).

Questi recettori sono particolarmente importanti in biologia ed immunologia perch, oltre a legare delle
chemochine, hanno la capacit di legare dei microorganismi infettivi e perci sono delle porte di ingresso
per alcuni patogeni. Per esempio posso legare il Plasmodium vivax o il virus dellHIV.
Gli immunologi hanno sviluppato alcune strategie per limitare le infezioni: per esempio producendo
antagonisti per il recettore delle chemochine, cos lo legano e impediscono al virus di usarlo per entrare.
anche possibile che durante una risposta immunitaria, se il soggetto produce molte chemochine, esse
leghino il recettore e impediscano al virus di entrare.

Quindi questi recettori (per le citochine e le chemochine) sono tutti solubili, sia citochine che chemochine
hanno un ruolo nellinfiammazione, ma hanno meccanismi di trasduzione del segnale diversi e recettori
diversi.

MHC

MHC significa major histocompatibility complex (=complesso maggiore di istocompatibilit).


un complesso di glicoproteine espresse dalla membrana cellulare di quasi tutte le cellule del nostro
organismo. Queste molecole sono codificate da una serie di geni che vanno sotto il nome di MHC.
Ci servono a regolare lindividualit biologica: ci rendono unici ed incompatibili con la maggior parte degli
individui della nostra specie. Per questo quando dobbiamo fare un trapianto non va quasi mai va a buon
fine.
molto importante conoscerli perch si scoperto che MHC non solo regolano listocompatibilit e quindi
sono legate ai trapianti dorgano, ma sono anche i recettori dellimmunit:
dentro queste molecole si organizza una specie di tasca dove alloggiano tutti i peptidi che derivano dal
catabolismo proteico e i peptidi vengono esposti allesterno della cellula per essere riconosciuti dai linfociti
T. Questi ultimi, attraverso questo contatto, sono in grado di capire se c qualcosa che non va allinterno
della cellula e scatenano una risposta immunitaria qualora questi peptidi originino da organismi estranei
(non-self) al nostro organismo.

Origine evolutiva del MHC e funzione


I microbi cercano di entrare continuamente, a volte riescono a penetrare attraverso la cute; allora quando
rimangono allesterno della cellula rischiano molto perch possono essere uccisi da tutta una serie di
meccanismi: lisozima, complemento, possono essere opsonizzati (sistemi naturali per cui i microorganismi
vengono incrostati da una serie di sostanze rendendosi molto pi appetibili a macrofagi e affini).
Questo ha prodotto una grandissima spinta selettiva affinch i microorganismi utilizzassero una strategia
per evadere il sistema immunitario entrando allinterno delle cellule, dove possono sopravvivere anche a
lungo, dentro la cellula possono moltiplicarsi e sopravvivere, al riparo dallambiente esterno.
Questa mossa ha spinto il sistema immunitario ad elaborare, a sua volta, una contromossa.
Questa ha evitato una situazione di grosso pericolo: quando il microorganismo penetra dentro alla cellula,
si moltiplica ed evade la risposta immunitaria; a questo punto la cellula viene uccisa e il microorganismo
torna in circolo, anche se acquisisce la capacit di entrare anche in altre cellule.
Levoluzione e linvenzione del MHC sono state le soluzioni a questo problema.

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Si sono evolute delle glicoproteine di due tipi: di classe I e di classe II, codificate da un gruppo di geni che
prende il nome di MHC, nellevoluzione, il sistema immunitario ha favorito lo sviluppo di questi geni uno
vicino allaltro a formare un unico supergene.
Queste glicoproteine fungono da antigeni, cio qualsiasi sostanza che in un organismo determina una
risposta immunitaria e quindi la produzione di anticorpi: se prendiamo la cellula di un individuo e la
trasferiamo in un altro individuo, queste molecole di istocompatibilit, che ricoprono le cellule, scatenano
una risposta immunitaria verso quella cellula. In definitiva, le molecole del MHC non fanno altro che
segnalare allesterno della cellula lindividualit immunologica di ognuno di noi (rilevante per i trapianti).
Queste glicoproteine, agendo da antigeni, fanno vedere allesterno cosa avviene allinterno delle cellule.
In questo modo il sistema immunitario riesce ad evitare il pericolo che dei microorganismi entrino e
rimangano silenti allinterno della cellula.

LMHC presente in tutti i vertebrati e nelluomo prende il nome di HLA (= human leucocytes antigenes); il
nome dovuto al fatto che gli immunologi che hanno studiato i trapianti, hanno osservato queste molecole
come antigeni presenti sulla superficie dei leucociti che guidavano la risposta ai trapianti.
Questo complesso MHC contiene molti geni che codificano per molte molecole di classe I, II, III e altre
ancora. Le caratteristiche tipiche di questi geni sono due:
- sono il sistema pi polimorfico che esista: per ogni locus genico esistono diverse varianti alleliche e
ognuno di noi pu avere una forma allelica diversa da quella di un altro individuo.
- Sono codominanti: ereditiamo i geni dal pap e dalla mamma e li esprimiamo entrambi.
Queste due caratteristiche rendono il sistema HLA peculiare.
Se consideriamo il sistema HLA , tutti i geni solo localizzati nel braccio p del cromosoma 6 e il gruppo di geni
misurato con unit di ricombinazione genica, occupa 3 cM (centiMorgan), che ununit di misura
abbastanza ingombrante contando che questo sistema contiene 7 milioni di paia di basi (7x106 pb) e oltre
200 geni. Questi geni si organizzano sul cromosoma in modo specifico.
I geni di classe I e II sono i veri e proprio recettori per
gli antigeni nel sistema immunitario. Oltre a questi
geni ci sono altri geni che non sono tipicamente dei
geni HLA, ma fanno parte di questo complesso e
codificano per proteine come:
- Tap 1 e 2: molto importanti nella biosintesi degli antigeni a livello del sistema immunitario
- Alcuni elementi del complemento come proteine sieriche C4, C2 e il fattore B

Struttura glicoproteine di classe I e II


Le glicoproteine di classe I e II sono simili tra loro e sono simili a moltissime molecole del sistema
immunitario: utilizzano tutte una struttura base molto semplice ma molto efficace chiamata dominio
immunoglobulinico.
Il dominio immunoglobulinico un pacchetto di circa 100-120
amminoacidi che si avvolgono nello spazio tridimensionale a
formare delle strutture globulari (queste strutture globulari sono
fatte in modo che ci siano dei foglietti beta paralleli collegati con
delle alfa-eliche).
Ogni dominio proteico si arrotola formando una struttura piuttosto
solida, flessibile, resistente e soprattutto componibile, perch queste
molecole usano montare pi domini insieme. Repliche della stessa
struttura possono formare lunghe catene. Questa struttura caratterizza
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Immunologia - Lezione no 3 12.03.13 Novelli

la superfamiglia delle immunoglobuline (Ig): prende questo nome perch le Ig sono anticorpi e anche gli
anticorpi sono costituiti da questi domini globulari.

[vi metto la pagina di wikipedia per dominio Ig, spiega decisamente meglio.
Un dominio Ig, o dominio immunoglobulinico, una particolare struttura globulare comune a moltissime
proteine recettoriali dell'organismo umano. Tutte le proteine che hanno nella loro struttura uno o pi
domini Ig vengono considerate come appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline.
Un dominio Ig una struttura ripiegata formata da circa 70-100 amminoacidi, i cui estremi sono stabilizzati
da un ponte disolfuro di circa 55-75 amminoacidi e vanno a costituire il cosiddetto "ripiegamento
anticorpale". La sua struttura terziaria composta da due foglietti , ognuno dei quali costituito a sua
volta da 3-5 "nastri" ad andamento antiparallelo di 5-10 amminoacidi ciascuno. Questa struttura,
cosiddetta "a sandwich", mantenuta compatta dalla presenza, sui due beta foglietti, di amminoacidi
idrofili rivolti verso l'esterno associati ad amminoacidi idrofobici rivolti verso l'interno: questi ultimi
cementano la struttura e sono quindi altamente conservati, cio vengono mantenuti in tutti i differenti tipi
di domini Ig.
I domini Ig sono comuni a diversi tipi di molecole, ma dal momento che sono maggiormente rappresentati
appunto nelle immunoglobuline si classificano a seconda della somiglianza con i domini della regione
variabile (domini Ig di tipo V, con 5 nastri ) o della regione costante (domini Ig di tipo C, con 3 nastri )
degli anticorpi. Esiste inoltre un terzo tipo di dominio Ig, il tipo C2 o H, che presenta 3 nastri ma ha
analogie strutturali sia con i domini C che con quelli V.
Le principali molecole che presentano almeno un dominio Ig nella loro struttura sono:
Immunoglobuline: un dominio V ed un dominio C nella loro catena leggera, ed un dominio V e
tre/quattro domini C nella loro catena pesante.
Recettore delle cellule T o TCR: quattro domini Ig, di cui due di tipo V e due di tipo C (uno per la
catena / ed uno per la catena /).
MHC di classe I: un dominio di tipo C nella sua catena ed un dominio Ig che costituisce l'intera 2-
microglobulina.
MHC di classe II: un dominio C nella catena ed uno nella catena ]

HLA DI CLASSE I
E formata da:
- una catena alfa che utilizza 3 domini globulari alfa1, alfa2 e alfa3 che si
ripiegano nello spazio extracellulare.
- Un dominio trasmembrana S
- Un dominio intracitoplasmatico I che collega la parte extracellulare con il
citoplasma.
Nello spazio questi tre domini non riescono, per, a mantenere diritta la molecola che
tende a collassare andando incontro a collasso conformazionale e a perdita di funzione.
Per poter funzionare la molecola deve stare in piedi e, per fare questo, si associa ad una piccolissima
molecola detta beta-2 microglobulina; questa ha anchessa una struttura globulare che si associa alla classe
I e la sorregge.

Caratteristiche della beta-2 microglobulina:


- La non fa parte dei geni HLA ( codificata da un altro gene).
- Non polimorfica, ma uguale in tutti gli individui.

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- Presenta unalta omologia nella sequenza amminoacidica tra le diverse specie. Si mantenuta
pressoch invariata durante levoluzione perch aveva un ruolo piuttosto importante.
- La sua struttura simile alla classe I con una sequenza di 99 aa organizzata nello spazio con una
struttura a foglietti beta antiparalleli, possiede un ponte disolfuro (s-s) che stabilizza e alfa-eliche
che collegano il tutto. Tutto ci rende la molecola altamente flessibile, importante per stabilire
contatti tra varie molecole nello spazio.
- Si associa sempre al dominio alfa3 della catena alfa e stabilisce dei piani di contatto con il piano a
foglietti beta dei domini alfa1 e alfa2.
- E indispensabile perch la molecola HLA di classe I stia dritta sulla membrana; se questa non c la
catena alfa collassa e non espressa in membrana. Quando una molecola MHC non espressa in
membrana, questa causa un enorme problema al sistema immunitario: i linfociti per svilupparsi
devono entrare in contatto con le molecole di classe I e II, se queste non sono non c lo sviluppo
dei linfociti e non si pu produrre una risposta immunitaria.

Le molecole HLA in definitiva hanno tutte questa struttura:


-Dominio alfa 1 e alfa 2
-Beta-2 microglobulina che si associa allalfa3
-Tramite lassociazione fisica dei domini alfa1 e alfa2 si forma una tasca
con le labbra ad a-elica ed il pavimento a foglietti b. Essa contiene SEMPRE
un peptide (frammenti di proteine catabolizzati dalla cellula) e lo espone
in membrana,non mai vuota.

Tutte le HLA di classe I sono codificate da geni codominanti materni e


paterni e sono molto simili, differiscono solo per qualche amminoacido.
Sulla membrana delle cellule abbiamo 4 tipi di proteine codificate da geni
della classe I: IA, IB, IC, ID. Pur essendo molto simili, ogni gene codifica proteine leggermente diverse per
ottenere molte molecole HLA tutte un po diverse le une dalle altre; cos si avranno tante tasche a
disposizione e quindi tanti peptidi che possono essere esposti per essere controllati dal sistema
immunitario. Quante pi molecole HLA abbiamo, tanti pi peptidi esprimiamo e cos aumenta la possibilit
di controllare al meglio cosa avviene allinterno della cellula.
Le molecole HLA di classe I sono ubiquitarie.

HLA- IA
Sono codificate da tre geni chiamati A, B, C; sono i pi importanti per la risposta immunitaria, sono molto
simili tra di loro e altamente polimorfici.
-A ha oltre 400 alleli ( allele: variazione maggiore dell1% in un loco genetico in una popolazione)
-B ha oltre 700 alleli ( iperpolimorfico)
-C ha oltre 200 alleli
Questi geni sono quelli tipizzati per:
I trapianti: bisogna controllare se tra il ricevente ed il donatore c compatibilit e si va a fare una mappa
dei geni HLA-IA del polimorfismo A, B, C.
Analizzate anche per le malattie autoimmuni: si visto che ci sono delle associazioni tra la presenza di
alcuni geni HLA e una predisposizione a sviluppare alcune malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla.
Nei casi di aborto spontaneo si fanno delle analisi di questo tipo: solitamente nelle donne che vanno
incontro ad aborto spontaneo ci sono problemi di riconoscimento eccessivo di molecole HLA.

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Le HLA-IA si trovano su tutte le cellule nucleate del nostro organismo, anche se ci sono tessuti che le
esprimono poco e sono: il tessuto nervoso, le ghiandole endocrine, i muscoli e gli spermatozoi.
Questo perch tutti i tessuti strategici che devono essere conservati vanno essere protetti dalla risposta
immunitaria: se il peptide esposto non self e viene riconosciuto da una cellula T si scatena la risposta
immunitaria, che anche citotossica, cio porta alla morte della cellula.
Se viene uccisa una cellula del fegato questa si riproduce e viene rimpiazzata, ma se vengono uccise delle
cellule nervose andiamo incontro a seri problemi. Ci nonostante questo pu essere un problema; alcuni
virus, per esempio, cercano di stare nel sistema nervoso perch cos non vengono scoperti.

Le citochine, e soprattutto quelle infiammatorie come interferoni, TNF-alfa e beta, sono importanti
regolatori di queste molecole: quando le molecole HLA sono presenti nel microambiente e le cellule
percepiscono le citochine, queste ultime fanno alzare lespressione delle molecole HLA-I aumentando la
capacit del nostro sitema immunitario di far vedere cosa c dentro alla cellule.
I tumori usano questo trucco: per evitare la risposta immunitaria fanno abbassare i livelli di HLA sulla
membrana cellulare; per ripristinare la capacit di queste molecole di essere viste dal sistema immunitario
bisogna introdurre molte citochine che ne stimolino lespressione.
Le HLA-IA non sono mai vuote e lassociazione tra HLA-IA e peptide non avviene mai fuori, ma allinterno
della cellula durante la biosintesi dell HLA.
Il peptide ha una lunghezza predeterminata tipica della classe I che di 8-10 aa.
Quando i peptidi sono alloggiati nella tasca, il complesso HLA-peptide pu essere visto dai linfociti T e dalle
cellule NK (natural killer), entrambi i tipi di cellule hanno recettori che si legano al complesso; i linfociti T di
tipo alfa beta hanno un recettore molto specifico tramite il quale capiscono se stanno legando un peptide
self o non self.

HLA -IB
Formata da molecole E, G, F. La struttura sempre la stessa, ma sono molecole che hanno una pi limitata
variabilit allelica:
E ha solo 8 alleli: espressi a livello del trofoblasto (per cui hanno un ruolo nello sviluppo e nella
gravidanza). Sono riconosciuti dalle cellule NKT (a met tra le cellule T e NK) e dalle cellule NK;
queste ultime legandosi vengono inibite. Questo un concetto importante: pu succedere che le
cellule perdano lespressione dell HLA e che non siano pi riconosciute dai linfociti T che, quindi,
smettono di funzionare; le cellule NK sono un meccanismo di compensazione importante perch,
se normalmente bloccate dallHLA, quando questo scompare si mettono a lavorare attivamente.
F ha 20 alleli: espressi soprattutto sui linfociti B e nelle tasche non presentano tanto dei peptidi,
quanto degli oligosaccaridi (zuccheri).
G ha 23 alleli: sono espressi nel trofoblasto e nella placenta e hanno un ruolo, interagendo con le
cellule NK, nella gravidanza guidando i rapporti allinterfaccia tra madre e feto. Presentano un
limitato numero di peptidi, hanno un ruolo nella morfogenesi e, come le E, inibiscono le NK.

HLA -IC
E un sottogruppo ancora diverso formato da geni vicini, non dentro, lHLA e hanno a che fare con la
segnalazione dello stress cellulare.
Quando le cellule entrano in uno stato di stress, esprimono queste molecole C.
I prodotti di questi geni sono due che codificano per due proteine polimorfiche:
MIC-A: ha 60 alleli
MIC-B: ha 25 alleli
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Le cellule stressate, cio che sono state infettate da vari tipi di microorganismi (es. micobatteri),
sono andate incontro a stress metabolico di vario tipo o incontro a trasformazione in senso
neoplastico, esprimono queste molecole MIC-A e MIC-B che vengono riconosciute dal linfociti NK,
CD8 e da alcuni macrofagi.
C un altro gene di questa famiglia che codifica per una proteina del tutto differente: il gene
Hfe, che un recettore del ferro, lega il ferro e interagisce con il recettore della transferrina.
Hfe appartiene a questa categoria anche se non un vero e proprio recettore per i peptidi.

HLA ID
Sono codificate da geni sparsi nel genoma. Sono suddivise nel gene CD1A, CD1B, CD1C, CD1D, CD1E.
Hanno sempre la stessa struttura delle molecole di classe I ma nella tasca hanno glicolipidi, non peptidi.
Ne fanno parte anche:
-Il gene FcRn (=recettore per il frammento cristallizzabile dellimmunoglobulina) che un recettore per
unimmunoglobulina prodotto durante il periodo neonatale.
Le Ig sono degli anticorpi con una tipica struttura con due braccia e una coda che viene chiamata
frammento Fc e pu essere legato dai recettori in modo che lo trasportino, sempre nel periodo neonatale,
dallintestino e dal rene allinterno dellorganismo. FcRn ha un ruolo completamente diverso dalle molecole
CD1, ma codificato dagli stessi geni HLA e ha la loro identica struttura.
-ULBP: espresso in cellule che sono andate incontro a trasformazione neoplastica. E un recettore
riconosciuto dalle cellule NK.

Le molecole CD1 svolgono un ruolo particolarmente importante; finora se ne conoscono 5 geni diversi: A, B,
C, D, E. La struttura generale prevede una tasca con glicolipidi ,riconosciuti dai linfociti T; i glicolipidi
vengono riconosciuti perch, cos come i glicopeptidi, sono presenti nelle pareti del micobatterio.
Per avere un riconoscimento specializzato del micobatterio, il nostro organismo deve utilizzare le molecole
CD1, che fanno vedere ai linfociti T che siamo in presenza di uninfezione di tipo micobatterico.
I lipidi e le proteine si legano alle molecole CD1 nel reticolo ergastoplasmatico (quindi i legami allinterno
delle tasca avvengono dentro la cellula).
Le cellule dentritiche, molto importanti per lelaborazione della risposta immunitaria, e i macrofagi
esprimono le molecole MHC CD1 e sono, quindi, in grado di presentare i peptidi legati al CD1 sia ai linfociti
T che alle cellule NK e permettere una risposta contro le infezioni batteriche.

Ricapitolando:

Polimorfismi della classe I:


Il numero di alleli viene continuamente aggiornato (circa ogni 6 mesi), perch ne vengono scoperti sempre
di nuovi.
La classe I-A possiede un numero di geni enormi, (molecole A, B, C). HLA-IE,F,G (classe I-B) sono molto
meno polimorfici.

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la I-C possiede un certo poimorfismo a livello delle molecole MIC-A e MIC-B e la classe I-D poco, se non
nulla, polimorfica.

Dobbiamo immaginarci le cellule come ricoperte da HLA-I di vario tipo. Queste molecole non sono mai
vuote, ma sono sempre associate a dei peptidi e presentano allesterno quello che succede allinterno della
cellula.
Ogni allele ha una tasca diversa e presenta molecole diverse; ci significa che per ogni locus genico ognuno
di noi, che possiede una determinata variante, avr la capacit di legare un peptide diverso da quello di un
altro individuo con un allele diverso. Questo un vantaggio immunitario; avere tante varianti alleliche
allinterno della stessa popolazione un vantaggio evolutivo per la specie: se noi avessimo solo una
variante che presenta un singolo peptide, se non riusciamo ad attuare una risposta corretta contro quel
peptide non self di un determinato microbo, quel microbo potrebbe attaccare lintera popolazione. In
questo caso, invece, sono una piccola parte della popolazione verr colpita ed molto pi difficile per i
microbi creare problemi alla specie.
I geni HLA sono codominianti, perci esprimiamo sulla membrana cellulare sia i geni ereditati paterni che
materni.
Se i peptidi, legati allHLA, espressi sulla membrana delle cellule sono self, il sistema immunitario rimane
tollerante; se i peptidi sono non self (es. virus che si replica e produce proteine virali, che sono montate con
lMHC ed esposte in membrana) viene montata una risposta immunitaria. La stessa cosa avviene per una
trasformazione neoplastica: in questo caso verr esposta in membrana la proteina alterata.

HLA DI CLASSE II

Le HLA di classe II sono molto simili alle HLA di classe I. Dal punto di vista strutturale c la solita
organizzazione appartenente alla superfamiglia delle Ig: stessa struttura molecolare con dominini a
struttura globulare ad alfa eliche e foglietti beta antiparalleli, stabilizzata da ponti disolfuro.
Il sistema immunitario usa sempre lo stesso tipo di struttura per tutte le sue molecole espresse in
membrana!
Da sinistra a destra:
HLA di classe II
HLA di classe I
Ig (immunoglobulina)

Le HLA di classe II:


non sono formate da ununica catena, come quelle di classe I, ma da due catene. Sono degli
eterodimeri: c una catena alfa, formata da due domini alfa1 e alfa2, e la catena beta, che
formata dai domini beta1 e beta2.
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Le due catene alfa e beta si associano tra di loro a formare una struttura in cui alfa1 e beta1 vanno
a formare la tasca in cui alloggia il peptide.
Anche le molecole di classe II hanno un ruolo nellesporre in membrana dei peptidi che derivano
non tanto dal catabolismo, quanto dal prodotto della fagocitosi di alcuni tipi cellulari; sono, quindi,
anchessi dei recettori per peptidi.
I peptidi che alloggiano sono pi lunghi di quelli associati alla classe I ,sono formati da circa 20aa
(cos noi possiamo riconoscere lorigine di un peptide (se deriva dalla classe I o II) dalla sua
lunghezza).
I geni delle catene alfa e beta sono localizzati in regioni del supergene HLA che possono essere
anche molto distanti tra di loro: le molecole si associano tra di loro dopo essere state trascritte e
tradotte.
Le molecole di HLA-II sono poligeniche, polimorfiche e codominanti.

Risolvendo queste molecole mediante procedure di cristallografia, alla fine lassociazione nello spazio delle
HLA di classe I e II risulta molto simile, pur con delle piccole differenze:
HLA-I: il risultato dellinterazione di alfa3 con la beta2-microglobulina.
HLA-II: formata da due catene, un eterodimero. Alfa1 e alfa2 si associano, sopra, a formare il pavimento
della tasca con foglietti beta antiparalleli in cui viene alloggiato il peptide e con le alfa eliche che formano i
bordi della tasca. La tasca formata dai foglietti beta dei due dimeri alfa1 e beta1 e il peptide che alloggia
leggermente pi lungo.

Le HLA-II si trovano anchesse sul cromosoma 6 e i sono codificate da 5 loci genici, ognuno dei quali ha
numerosi alleli:
-3 sono estremamente polimorfici, DP, DQ, DR: codificano per delle proteine di classe II che alloggiano sulla
membrana cellulare nelle tasche, come peptidi.
- gli altri due loci, poco polimorfici, sono DO e DM: le proteine da loro codificate non sono mai espresse in
membrana, ma si trovano nel reticolo ergastoplasmatico e hanno un ruolo nella biosintesi di queste
molecole.
Lorganizzazione genica di queste molecole leggermente pi complessa perch ogni molecola di classe II
dovr essere composta da un gene che codifica per alfa e uno che codifica per beta, mentre per la classe I
c un solo gene che codifica. Possiamo, poi, avere pi copie di una catena alfa e beta.

A=che codifica per la catena alfa 3DP, 2DM, 2DO, 2DQ, 3DR; questultimo ha due geni che
B=che codifica per la catena beta codificano per la catena beta.

Questi sono esempi di duplicazione genica: i geni si sono duplicati durante levoluzione e perci abbiamo
pi geni che codificano per lo stesso elemento.

Polimorfismo:
Tutte queste varianti alleliche fanno si che la
combinazione di questi alleli sia molto elevata; ci vuol

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dire che, se consideriamo le HLA-II di due individui, difficilmente questi avranno uno stesso aplotipo HLA.
Non troveremo mai nessuno, a meno che non si tratti di due
gemelli, con lo stesso HLA.
Questo spiega come mai cos difficile fare trapianti tra
individui anche se della
stessa specie. Se, poi,
moltiplichiamo la
variabilit della classe I
con quella della classe II diventa ancora pi impossibile trovare delle
affinit tra individui.

Nomenclatura dei geni HLA-II: solo per avere unidea di quanto sia
polimorfico questo sistema

Nelle catene HLA-II eterodimeriche possiamo avere diverse combinazioni: sia nel cromosoma paterno che
nel materno abbiamo 2 geni di classe II, uno che codifica per la catena alfa e uno per la catena beta; perci
questi si possono complementare in maniera differente.
Complementazione:
Cis: le complementazioni sono allinterno dello stesso cromosoma

Trans: le complementazioni avvengono tra cromosoma paterno e materno

Con gli stessi due geni possiamo avere 4 tipi di proteine differenti, ovvero possono presentare ai linfociti T
quattro peptidi diversi alloggiati nella tasca.
Questo fa si che sulle nostre cellule possiamo avere fino a 16 HLA-II diverse.

Mentre le molecole di classe I sono ubiquitarie, le HLA-II si trovano solo su cellule particolari, chiamate
cellule che presentano lantigene o leucociti attivati, cio cellule che sono professioniste nel presentare ai
linfociti T delle molecole estranee.
Queste cellule con espressione costitutiva sono:
- cellule dentritiche: sono il tipo cellulare pi specializzato per elaborare la risposta immunitaria,
sono piene sulla loro superficie cellulare di HLA-II.
- cellule di Langerhans: sono cellule dendritiche immature che pattugliano soprattutto la cute
- cellule epiteliali timiche: il timo ha unorganizzazione formata da linfociti T e cellule epiteliali
timiche; durante il fenomento dell educazione timica lintimo contatto tra lHLA delle cellule
epiteliali timiche e i linfociti determina lo sviluppo di questi ultimi.
- linficiti B: sono cellule che producono anticorpi, ma sono anche specializzati nel presentare gli
antigeni.
Tutte queste cellule, in qualsiasi momento della loro esistenza, esprimono in membrana unelevata
quantit di HLA.

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Immunologia - Lezione no 3 12.03.13 Novelli

Ci sono, poi, delle cellule che, per esprimere elevati livelli di HLA, devono essere stimolati a farlo.
Perci lespressione di HLA-II per loro inducibile:
- Cellule endoteliali
- Cellule epiteliali
- Macrofagi
- Alcuni granulociti come eosinofili e neutrofili
- Fibroblasti
- Cellule tumorali come il melanoma
In genere il segnale che provoca lespressione elevata di HLA su queste cellule solo le citochine, soprattutto
gli interferoni e il TNF.
Nelle cellule esiste un fattore di trascrizione della classe II, cio una proteina che va nel DNA attivando la
trascrizione delle proteine HLA-II, chiamato CIITA (=attivatore della trascrizione di classe II). E molto
importante perch si lega al promotore della classe II facendo in modo che la classe II sia indotta ad essere
espressa. CIITA regolato dalle citochine, soprattutto IFN-gamma, che ne induce la sintesi durante la
risposta immunitaria.
C una malattia causata da un difetto genetico del gene CIITA e porta a gravi immunodeficienze: lassenza
di questo gene provoca limpossibilit di esprimere HLA-II sulla superficie cellulare e si ha un impatto
devastante sui linfociti T, che non si posso sviluppare e perci ne sono privi. Questi individui sono
suscettibili a qualsiasi tipo di infezione virale, a funghi, batteri intracellulari ecc Siccome i linfociti (B,
macrofagi, cellule dendritiche.)di questi pazienti non esprimono la classe II in membrana, sono chiamati
linfociti nudi e la malattia detta sindrome da linfocita nudo.

La classe I ci protegge dai pericoli che sono presenti dentro la cellula, ma non basta a dare una risposta
immunitaria completa: se noi siamo affetti da un virus, questo entra nella cellula, le sue proteine sono
catabolizzate ed esposte in membrana insieme alle molecole di classe I.
Se, invece, siamo infettati da un micobatterio che viene fagocitato, i suoi antigeni vengono montati sugli
HLA di classe II. Se non abbiamo lHLA di classe II non possiamo rispondere ai micobatteri, ai funghi ecc

Trasduzione del segnale:

-Parte sinistra della figura: abbiamo unattivazione


tessuto-specifica del CIITA che sempre legato al
promotore del HLA-II e ne permette lespressione
costitutiva in membrana (in cellule dentritiche, linfociti
B,cellule di Langerhans ecc.).
-Parte destra della figura: nelle cellule in cui viene
espresso in maniera inducibile, IFN-gamma viene legato
dal proprio recettore specifico e avviene una trasduzione
del segnale mediata dalle proteine del sistema JAK-STAT;
Il recettore per l IFN-gamma attiva STAT-1, viene
attivato un TF che si chiama IRF1, questo si associa al
CIITA che va nel nucleo, lega il promotore della classe II e
ne attiva la trascrizione. Sotto lo stimolo di IFN-gamma,
abbiamo una superattivazione del TF CIITA con una molto pi elevata espressione di HLA-II sulla membrana
cellulare.

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Immunologia - Lezione 04 13.03.13 Novelli

MHC DI CLASSE III

Mentre le molecole dellHLA di classe I e II sono coinvolte soprattutto nella presentazione di peptidi ai
linfociti T e alle cellule NK, esiste unulteriore classe di geni che sono quelli dell MHC di classe III: essi sono
distribuiti allinterno del braccio p del cromosoma 6, tra i geni codificanti per la classe II e quelli codificanti
per la classe I.
Sono sempre geni polimorfici, e le molecole hanno struttura e funzione eterogenea (sono 30 geni).
Include una serie di molecole del complemento:
ad esempio C4B , una molecola polimorfica della quale si conoscono 16 alleli. C4A un altro
componente del complemento, presente nella popolazione con 13 alleli. Ci sono anche BF, C2.
Poi ci sono delle proteine HSP 70, che sono proteine da stress da calore ed hanno funzione di
chaperonine. Le Heat Shock Proteins (come la HSP70) sono proteine che aumentano la loro
espressione nei casi di stress cellulare. Sono delle chaperon, cio molecole che durante la sintesi
proteica si associano alle proteine in formazione, stabilizzandole ed evitando che collassino, fino a
quando queste non assumono la loro conformazione definitiva. Nel sistema immunitario alcune
chaperonine servono per mantenere la corretta conformazione delle molecole MHC I e II nel loro
viaggio tra il reticolo endoplasmatico e la membrana.
Ci anche delle citochine che sono codificate da questi geni, come TNF alfa.

Insomma, esiste una certa eterogeneit tra i geni che mappano nel cluster genico dellMHC di classe III.
C anche quello che codifica la 21-idrossilasi, molecola coinvolta nella sintesi degli steroidi;
individui deficienti per questa proteina soffrono di iperplasia surrenalica congenita. Si tratta di una
proteina anomala nel contesto dellMHC cos come stato finora affrontato.
La proteina B144 non ha una funzione ben definita; il suo trascritto stato individuato in alcune
cellule del sistema immunitario come i macrofagi ed i linfociti T.
(dalle slide, non detto) RD: proteina con uninusuale struttura periodica

Polimorfismo del sistema MHC

Ritornando al concetto di polimorfismo del sistema MHC.


Tale sistema esasperatamente polimorfico, e questo importante in quanto pi alleli di tasche peptidiche
noi possediamo sulle nostre cellule, pi possiamo far vedere ai linfociti T ed al sistema immunitario quello
che succede nella cellula.
Le tasche non sono specifiche per un peptide, ma ve ne possono alloggiare di diversi tipi, ed esiste quindi
una competizione tra peptidi che si legano meglio ed altri che si legano peggio.
Se noi abbiamo una tasca in cui determinati peptidi si legano bene, la risposta immunitaria nei loro
confronti sar molto efficiente. Quando non siamo infettati da nessun patogeno, i peptidi caricati nelle
tasche sono self, vengono riconosciuti come tali e tollerati, e quindi non si scatena la risposta immunitaria.
Quando siamo infettati, invece, c una competizione tra i nostri peptidi endogeni e quelli virali; spesso
succede che questi ultimi vincano la competizione, in quanto ne vengono prodotti molti, e riescono ed
essere espressi sulle molecole di MHC. A questo punto vengono riconosciuti dai linfociti T come estranei e
scatenano la risposta immunitaria.
Perci il polimorfismo dei geni MHC ha unazione positiva per la risposta immunitaria, dandoci pi occasioni
di rispondere meglio ad uninfezione da parte di patogeni.
Il polimorfismo per pu anche avere effetti negativi sul sistema immunitario, in quanto il possesso di
alcuni alleli HLA associato alla predisposizione nei confronti di malattie autoimmuni.
Questo stato osservato per esempio per il possesso dellallele HLA B53.
Allele b53 dellHLA di classe I: poco diffuso in Europa (1% della popolazione), ma molto espresso nel
Gambia (25%degli individui). Unipotesi per giustificare questo fenomeno che tale allele porti a una
maggiore resistenza alla malaria infantile. Pu essere dovuto al fatto che B53 favorisce la presentazione dei
peptidi del plasmodio, scatenando cos una risposta immunitaria adeguata. La seconda possibilit che

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Immunologia - Lezione 04 13.03.13 Novelli

individui con B53 generino una efficace risposta dei linfociti T citotossici verso le cellule infettate dal
plasmodio.

Metodi di tipizzazione dellHLA

Per tipizzazione si intende il processo di definizione dellaplotipo di un individuo (set di alleli presenti su
ciascun cromosoma). Tipizzare lHLA significa inquadrare laplotipo di un individuo per lHLA.
La tipizzazione dellHLA ha notevole importanza medica nei trapianti e nella determinazione della
suscettibilit di alcune malattie associate allHLA.
E una metodica iniziata alla fine degli anni 50 con metodi tradizionali quali la sierologia: attraverso luso di
sieri provenienti da persone immunizzate (contro altri alleli HLA) , questi venivano provati contro i leucociti
di altri individui (non immunizzati) e si osservava se questi generavano anticorpi contro gli antigeni di
superficie.
Negli umani, i sieri che si possono trovare possedenti anticorpi (per altri HLA) sono soprattutto nelle donne
poli gravide e nei trasfusi: le donne poligravide, ad esempio, possiedono nel loro siero degli anticorpi
naturali generati contro gli antigeni di istocompatibilit dei figli (in quanto questi hanno un patrimonio
genetico che uguale solo per met a quello della madre). I politrasfusi possiedono degli anticorpi generati
contro i globuli rossi del donatore.
Quando utilizziamo i metodi sierologici abbiamo una serie di antigeni che vengono caratterizzati.
Usando anticorpi, li possiamo far reagire con i leucociti di un individuo e vedere quali sono positivi per
questi antigeni. Quindi facendo degli screening degli alleli con questi anticorpi specifici possiamo definire
laplotipo di questo individuo.

Oggi attraverso tecniche di biologia molecolare possibile riconoscere anche varianti molto piccole di alleli,
(ad esempio un solo nucleotide di differenza) e fare quindi uno screening molto accurato.
Prima dei trapianti viene fatta una tipizzazione a due livelli: prima sierologica, per vedere se il donatore ed il
ricevente sono grossomodo compatibili, e se poi si trova una certa compatibilit si fa unindagine pi
accurata dal punto di vista molecolare, per andare a scoprire eventuali differenze che potrebbero insorgere
nel corso del trapianto.

I loci pi importanti per la risposta immunitaria che determinata dai geni HLA:
Per quanto riguarda la classe I sono soprattutto lHLA-A e lHLA-B. Sono stati definiti, attraverso questa
metodologia, 24 antigeni con 291 alleli per lHLA-a e 49 antigeni con oltre 550 alleli per lHLA-b.
Per quanto riguarda la classe II, il gene pi importante per la risposta immunitaria lHLA-DR, di cui sono
stati definiti 20 antigeni e 525 alleli.
Allinterno di ogni allele, inoltre, ci possono essere tutta una serie di sottospecie alleliche (ad esempio, per
lHLA-A ci possono essere tutte le sottoclassi A1, A2, A3, A9 etc).
Se moltiplichiamo tutti questi alleli notiamo che con questi 3 geni (A, B, DR) abbiamo oltre 77 milioni di
fenotipi antigenici diversi, il che vuol dire in totale miliardi di fenotipi allelici diversi.
Esiste una probabilit su circa una decina di milioni di trovare un individuo con le stesse caratteristiche HLA.
La tabella indica il numero degli antigeni e degli alleli individuati con questo sistema a partire dal 1968 (slide
27 di MHC classe II, non si vede se la metto qui, comunque inutile).
Tipica scheda di laboratorio di immunologia dei trapianti; vediamo i vari
antigeni esaminati dal punto di vista sierologico. Lindividuo in questione
possiede gli antigeni indicati in tabella, dove ce n uno solo sta a significare
una omozigosi per quellallele.
HLA-A, HLA-B, HLA-C sono i geni che vengono tipizzati di routine, gli altri
hanno un minore polimorfismo e non vengono tipizzati. Vengono inoltre
tipizzati lHLA-drb1, HLA-drb3 e lHLA-dqb1.
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Immunologia - Lezione 04 13.03.13 Novelli

IMMUNITA ADATTATIVA

Immunit che viene scatenata quando le prime barriere e limmunit innata vengono superate.
Ci sono 4 caratteristiche che la definiscono e la distinguono da quella innata:

Riarrangiamento genico somatico; nellimmunit adattativa si sono derivati dei recettori di


riconoscimento che, a differenza di quella innata in cui i TLR riconoscono alcuni determinanti
comuni tra i vari patogeni, riconoscono determinanti specifici. Pertanto questo tipo di
immunit genera un repertorio molto vasto di recettori assolutamente specifici per particolari
antigeni. Questi recettori non sono sempre uguali nella popolazione, ma vengono generati
specificamente per un determinato antigene attraverso il meccanismo di riarrangiamento.

Clone cellulare; i recettori delle cellule dellimmunit innata sono distribuiti su tutta la
popolazione, quindi qualsiasi cellula che vi appartenga pu rispondere ad un determinato
pericolo. Nellimmunit adattativa diverso, solo un linfocita in grado di riconoscere un
determinato antigene (attraverso il meccanismo del riarrangiamento genico somatico),
dopodich va incontro ad espansione, dando luogo ad una risposta di tipo clonale e generando
una progenie di cellule del tutto simili a quella di partenza.

Selezione clonale; ovvero lantigene che seleziona il clone, che si espande e d luogo ad una
risposta immunitaria.

Memoria immunitaria; il linfocita che risponde ad un determinato antigene d origine ad una


progenie di linfociti, che poi vanno in quiescenza ma mantengono la memoria immunitaria di
ci che hanno incontrato. Questo meccanismo rende possibile scatenare nuovamente la
risposta immunitaria in caso si venga di nuovo infettati dallo stesso antigene, anche dopo mesi
o anni. Quando lantigene viene incontrato per la seconda volta, la risposta generata dal
sistema immunitario sar molto pi veloce ed efficiente. E proprio attraverso la generazione
della memoria immunitaria che gli immunologi sono stati in grado di sintetizzare i vaccini.

SELEZIONE CLONALE

Si parte da un precursore staminale che si differenzia


in linfocita. Troviamo il precursore staminale negli
organi linfatici primari, dove matura, che sono il timo
per quanto riguarda i linfociti T ed il midollo osseo e il
fegato fetale per quanto riguarda i linfociti B.
Attraverso il meccanismo di ricombinazione genica
somatica, da questo precursore originano una miriade
di linfociti che esprimono sulla loro superficie ognuno
un recettore differente (uguali gli uni agli altri al 99%,
ma con piccole sequenze amminoacidi che
cambiano). Ognuno di questi sar in grado di legare
un antigene differente. Questo fenomeno avviene in

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Immunologia - Lezione 04 13.03.13 Novelli

maniera indipendente dallantigene ed del tutto casuale.


Poi quando lantigene penetra nel nostro corpo si va a legare al recettore con la migliore complementariet
spaziale con lantigene, e potr cos determinare una risposta immunitaria.
Il linfocita viene selezionato dallantigene, e sar promosso andando in contro ad una espansione clonale,
porta alla produzione di una batteria di linfociti tutti uguali pronti ad interagire con quello stesso antigene.
Questo secondo fenomeno avviene a livello degli organi linfatici secondari, quali linfonodi, milza e MALT. E
in questo momento che viene anche generato il meccanismo della memoria.

Dal precursore staminale, negli organi linfatici primari, si ha quindi la differenziazione linfocitaria.
I linfociti B, che andranno a produrre anticorpi ed immunoglobuline, si divideranno in due sottotipi diversi
che si distribuiranno, anche dal punto di vista anatomico, in zone diverse dei linfonodi. Tale suddivisione
avviene in base allespressione, sulla membrana cellulare, della molecola CD5, e permette distinzione tra
CD5 positivi e CD5 negativi (a seconda che esprimano o meno la molecola). I positivi si localizzano nella
zona marginale del linfonodo, e saranno quelli pi capaci di produrre alcuni tipi di immunoglobuline.
Sembrano inoltre quelli pi coinvolti nei fenomeni di autoimmunit.
I linfociti T vanno a differenziarsi nel timo, lo colonizzano e possono diventare di due sottotipi, a seconda
del tipo di recettore per lantigene che esprimono sulla loro superficie cellulare. La maggioranza sono di tipo
alfa/beta, mentre una piccola minoranza ha un recettore di tipo gamma/delta. Quelli di tipo alfa/beta si
suddividono a loro volta. Alcuni esprimono la molecola recettoriale CD4, e sarebbero i linfociti T-helper,
con il compito di aiutare i linfociti B a produrre gli anticorpi. Altri esprimono invece in superficie la molecola
CD8, che li rende capaci di differenziarsi in cellule killer, T citotossici. In questa differenziazione, prima di
diventare linfociti T, una parte di cellule cambia strada e si differenzia in cellule NK. Queste ultime non
hanno il recettore per lantigene (come invece avviene per i linfociti T) e fanno parte dellimmunit innata.

Linfociti T e recettore TCR

Esistono 2 tipi di linfociti T: linfociti TH (T-helper, specializzati nellinteragire con i linfociti B e ad aiutarli nel
diventare produttori di anticorpi) e i linfociti TK (T-Killer, si specializzano a diventare degli uccisori andando
ad uccidere tutte le cellule che esprimeranno quegli antigeni sulle molecole HLA).
I linfociti T stanno quindi al centro della risposta immunitaria. Sono importanti in quanto, insieme ai linfociti
B, sono protagonisti dellimmunit adattativa.
Sono cellule potenti ma molto fragili, facilmente suscettibili ai segnali apoptotici, nel senso che tendono a
rimanere vivi solo se altre cellule gli forniscono segnali antiapoptotici.

Il linfocita T vergine un linfocita maturo: cio esprime il suo recettore per lantigene, ma non lha mai
incontrato. Per fargli scatenare la risposta immunitaria lo dobbiamo attivare in modo potente, attraverso
stimoli che passano per il suo recettore e non solo. Questo linfocita, che circola tra sangue e linfonodi,
monta sulla sua superficie cellulare circa 100.000 copie dello stesso recettore per lantigene (TCR). Questi
recettori sono specifici per ogni linfocita.
A livello di questi recettori ci sono delle zone ipervariabili: ogni linfocita ha una sequenza diversa che gli
permette di complementarsi con un antigene specifico.

TCR
Il TCR un eterodimero, fatto da una catena alfa e una catena beta. Sono molecole che fanno parte della
superfamiglia delle immunoglobuline, hanno quindi una organizzazione a domini globulari.
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Immunologia - Lezione 04 13.03.13 Novelli

E una molecola usata dal linfocita T per interagire con lantigene, ogni linfocita T tramite il TCR interagisce
con uno specifico complesso MHC-peptide.

Vediamo lunit di riconoscimento dellantigene.


Ogni linfocita possiede un recettore per lantigene che costituito dalle catene alfa e beta del TCR. Questo
interagisce con il peptide specifico montato sulle molecole MHC di classe I e II.
Questo TCR non mai solo sulla superficie cellulare, ma sempre associato ad altre molecole che servono a
mandare segnali di attivazione al nucleo del linfocita T.
Il TCR non in grado di riconoscere solo il peptide; riconosce contemporaneamente il peptide associato
allMHC, tramite le due molecole alfa e beta del recettore.
Per il riconoscimento essenziale che il peptide sia associato allMHC, altrimenti non avviene: si dice
appunto che il riconoscimento antigenico ristretto dallMHC.

Quando i nostri linfociti T vengono generati, subito dopo la nascita, noi possediamo un intero repertorio
capace di interagire con gli MHC.
Spesso succede che la risposta immunitaria esaurisca alcuni di questi repertori; essendo i TCR proni alla
morte cellulare, nel corso della vita possiamo perderne alcuni, diventando quindi tolleranti per lantigene
che quel TCR era in grado di riconoscere. Quelli persi possono anche essere rigenerati, ma comunque molto
parzialmente, e questo il motivo per cui nellanziano si ha un calo della risposta immunitaria.

Il riconoscimento da parte del TCR non sufficiente per lattivazione e la proliferazione del linfocita T, in
quanto il TCR non in grado di trasdurre il segnale dellavvenuto riconoscimento fino al nucleo del linfocita.
Vengono quindi usate altre molecole per trasdurre il segnale al nucleo.
Le molecole per la trasduzione che si associano al recettore alfa/beta sono monomorfiche, cio sono
sempre le stesse, non hanno la variabilit del TCR; sono uguali in tutti i linfociti T. Possono formare degli
eterodimeri (come vediamo nel caso della molecola epsilon che dimerizza con delta o gamma)oppure degli
omodimeri (come nel caso dellassociazione delle due lunghe molecole z).
Lintero complesso formato dalle catene epsilon, delta e gamma prende il nome di CD3.
Le catene zeta lavorano insieme al CD3 per trasdurre il segnale di attivazione.
Su queste molecole esistono dei residui di tirosina, che vengono fosforilati tutte le volte che il linfocita T
riconosce qualcosa di specifico; questa fosforilazione attiva a valle tutta una serie di reazioni biochimiche
che portano alla trasduzione del segnale, ovverosia segnali tramite cui vengono attivati dei fattori
trascrizionali che nel nucleo attivano geni specifici.

Origine dei linfociti T


Nascono da precursori ematopoietici che ad un certo punto diminuiscono lespressione di alcune molecole
di adesione e iniziano a circolare per lorganismo. Vengono quindi catturate dal timo grazie a dei recettori,
che sono recettori di NOTCH sui linfociti e ligandi di NOTCH sullo stroma timico.
La cattura di questi precursori da parte del timo determina la loro differenziazione in linfociti T invece che
in linfociti B.
I recettori di NOTCH (presenti sulla superficie dei precursori ematopoietici dei linfociti T) interagiscono con
due tipi di ligandi ,che sono presenti sulle cellule stromali del timo, Delta e Jagged.
Quando NOTCH lega il ligando la sua coda citoplasmatica diventa suscettibile alla proteolisi ed il frammento
citoplasmatico Nic cos generato trasloca nel nucleo ed interagisce con fattori di trascrizione che portano
alla maturazione del linfocita.

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Immunologia - Lezione 04 13.03.13 Novelli

Linterazione di NOTCH con Delta, presente sullo stroma timico, determina il blocco della maturazione della
linea B, e di conseguenza la spinta alla maturazione di tali precursori verso la linea T. Lattivazione di
NOTCH pu intervenire successivamente ,quando i linfociti T sono maturati, e portare alla differenziazione
in linfociti alfa/beta o gamma/delta, e dei linfociti T-helper in Th-1 e Th-2.

Il timo un organo posto sotto lo sterno, diviso in lobi da trabecole di tessuto connettivo.
I lobi timici hanno una parte esterna chiamata corticale, con origine di tipo epiteliale, ed una parte interna
chiamata midollare, che contiene delle cellule che vengono chiamate Corpuscoli di Hassal; questi
contengono macrofagi e cellule dendritiche. I linfociti T che entrano nel timo lo attraversano passando per
la zona corticale e per la midollare, subendo tutta una serie di contatti, soprattutto con le cellule epiteliali,
e ci determiner il loro destino funzionale.
Questorgano va incontro ad atrofia adiposa post-puberale, seppur mantenendo una certa funzione
residua.
Dentro il timo avviene leducazione timica dei linfociti T, cio questi vengono educati ad attivare la risposta
immunitaria. In questo processo i linfociti vengono pesantemente selezionati, con un rapporto di 1/100 per
quanto riguarda i linfociti che sopravvivono rispetto alla totalit dei linfociti che aveva intrapreso il
processo.
Quindi a livello del timo avvengono eventi cruciali legati alleducazione timica dei linfociti T, che sono
linterazione notch-delta, apertura della cromatina, inizio della trascrizione di geni del TCR con successivo
riarrangiamento somatico. (Tutte le cellule del nostro corpo hanno i geni del TCR. Non esprimono il
recettore in quanto non vanno in contro al riarrangiamento somatico di questi geni, processo che avviene
soltanto nei linfociti T a livello del timo.)

Un altro passo che avviene sempre nel timo, e successivamente a quando i linfociti T hanno acquisito il
recettore sulla loro membrana cellulare, consiste nella scelta da parte dei linfociti di avere un corecettore
associato al TCR. Questi corecettori sono CD4 e CD8. C una fase della maturazione timica, a livello della
corticale, in cui i linfociti T esprimono entrambe queste molecole, e sono quindi sia CD4 che CD8 (doppi
positivi). Durante unaltra fase, incontrando le molecole dellepitelio timico ed interagendo con lMHC,
reprimono una di queste due molecole, restando o CD4 o CD8.

Le cellule dellepitelio timico sono quelle con cui i linfociti T entrano in intimo contatto, e sono ricche di
molecole MHC di classe I e II; possiedono Delta, con cui i linfociti possono interagire, e possiedono anche
molecole MHC che esprimono antigeni endogeni. Questi antigeni endogeni sono le molecole self. I linfociti
T riconoscono questo self, e vengono educati a discriminarlo dal non self. Leducazione timica consiste
nelleliminare i linfociti che reagiscono contro il self e far sopravvivere solo quelli che riconoscono il non self:
una volta sintetizzato ed esposto in membrana, il TCR ha 3 possibilit:
Non si lega alle molecole HLA-peptide, non essendo abbastanza complementare
Legame a bassa affinit la molecole HLA-peptide
Legame ad alta affinit la molecole HLA-peptide, in quanto presenta una elevata complementariet

Il programma di default dei linfociti la morte apoptotica, che viene inibita da segnali anti apoptosi.
A seconda dellaffinit per lHLA che il TCR acquisisce per caso, i linfociti vanno incontro a destini diversi. Pi
del 95% dei linfociti non in grado di legarsi e va incontro a morte per solitudine.

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Immunologia - Lezione 04 13.03.13 Novelli

I linfociti che si legano ad alta affinit hanno quattro possibili destini:


vengono fatti uscire e il processo di riarrangiamento genico somatico viene ripetuto fino a quando
questi linfociti non trovano un recettore meno affine.
Attivare un fattore trascrizionale che Foxp3, trasformandosi in linfociti T regolatori ,che sono
inibitori ,ovvero in grado di bloccare lattivit di altri linfociti. Questi sono importanti in quanto
intervengono in tutte le situazioni in cui vi sia una eccessiva attivazione dei linfociti T, con lo scopo
di placare questa situazione (questo capita in moltissimi casi in cui si verifica autoimmunit: in tutte
queste situazioni, in cui vi un eccesso di linfociti che aggrediscono i nostri tessuti, si riscontrano
carenze di questi linfociti T regolatori).
La terza possibilit di diventare cellule NKT, che hanno caratteristiche intermedie tra quelle delle
cellule Nk e delle cellule T. Anche loro svolgono un ruolo regolatorio della risposta immunitaria.
La quarta possibilit di innescare il meccanismo di apoptosi.

I linfociti che si legano ad alta affinit con molecole MHC-peptide self vanno quindi in contro a selezione
negativa, che porta alla scomparsa dei cloni che reagiscono troppo con lMHC-self, che non saranno pi
usati dalla risposta immunitaria.
Le cellule che vengono promosse, e che vanno quindi in contro a selezione positiva, sono quelle a bassa
affinit. Queste cellule proliferano, maturano, diventano dei linfociti CD4 o CD8, e vanno fuori dal timo a
costituire la stragrande maggioranza dei linfociti T che circola tra sangue periferico, linfonodi e milza.

Tolleranza centrale: il nome che prende questo processo di selezione, in cui nel timo vengono eliminati
tutti i cloni potenzialmente autoreattivi, i linfociti imparano contro le proteine che incontrano nel timo.
Si distingue dalla tolleranza periferica, in cui i linfociti T autoreattivi vengono bloccati quando sono gi in
periferia: non tutti gli antigeni sono presenti nel timo, altri stanno in altri tessuti.
La tolleranza centrale ,sostanzialmente, la pi importante.

Nel timo oltre al processo di educazione avviene anche il processo di selezione positiva, ovvero viene
favorita la proliferazione e lespansione clonale dei linfociti che hanno un TCR che lega con debole forza le
molecole HLA-peptide (self), promossa la loro proliferazione affinch ce ne sia un numero grosso da
mandare in periferia. Oltre ad avere bassa affinit per lHLA-peptide questi linfociti T hanno sulla loro
membrana o il recettore CD4, definiti CD4 positivi, oppure linfociti che hanno sulla loro superficie cellulare
la molecola CD8, definiti CD8 positivi.

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Immunologia - Lezione 05 14.03.13. prof. Novelli

AVIDITA DI LEGAME TCR - MHC-PEPTIDE


Fino ad ora abbiamo discusso il concetto di affinit, cio di complementazione tra lMHC-peptide ed il suo
ligando e abbiamo definito affinit la forza di legame tra i due. Naturalmente c da fare una piccola
correzione di questo concetto perch quando parliamo di affinit consideriamo un singolo TCR che lega un
singolo HLA, ma in realt la cellula T possiede sulla membrana centomila di questi TCR, quindi, i legami non
sono singoli ma multipli. Per cui con affinit ci si riferisce ad un singolo legame, invece con avidit si
considera il prodotto tra affinit e il numero di legami possibili.
Immaginiamo di avere un legame a bassa affinit tra un TCR e MHC, ma se questo MHC molto numeroso
questo legame ha avidit piuttosto elevata. Per cui, in alcuni casi, lautoimmunit si instaura se c un TCR
che lega male un autoantigene ma lautoantigene molto presente: durante la risposta immunitaria si
producono le citochine che fanno aumentare lMHC-peptide sulla superficie cellulare quindi i linfociti
autoreattivi lo possono riconoscere e possono scatenare una risposta. Molte malattie autoimmunitarie si
instaurano in seguito ad infezioni perch le proteine virali, attraverso lo scatenamento della reazione
immunitaria, fanno produrre interferone. Linterferone fa aumentare gli MHC che esprimono peptidi
normalmente non riconosciuti dai linfociti T, ma, se sono tanti, i TCR a bassa affinit possono riconoscerli e
reagire.

Quando lavidit tra TCR e MHC-peptide molto bassa, il CD3, che lelemento che trasduce il segnale, non
si attiva fortemente e, quindi, non si trasduce nessun segnale forte ai linfociti T. Quindi quello che viene
stimolato muore per solitudine perch non riceve nessun segnale di sopravvivenza e quindi va incontro ad
apoptosi.
Quando invece si ha avidit debole il TCR lega i vari MHC-peptide, il CD3 trasduce dei segnali parzialmente
attivatori che non raggiungono una soglia tale attivare completamente il linfocita. Questo segnale debole
favorisce la sopravvivenza del linfocita che in questo contesto in grado di dare un clone che si espande.
Quel linfocita verr quindi promosso ed espanso. Questi linfociti si espandono ma hanno tutti lo stesso TCR,
non un clone di risposta allantigene. Si tratta di maturazione. di fatto una proliferazione. Sono TCR
specifici che quando incontreranno lantigene saranno in grado di rispondere. Questi linfociti rimangono
vergini e per essere attivati hanno bisogno di un segnale molto forte da parte dellantigene. I linfociti
proliferano ma rimangono naif. E anche possibile che questi linfociti vengano promossi e poi in qualche
modo possano subire altri fenomeni di riarrangiamento, per cui tra questi linfociti espansi alcuni possono
cambiare TCR ma sono tutti linfociti vergini, inattivati. Questi linfociti sono gli unici ad uscire dal timo.
Quando lavidit diventa elevata, il CD3 si attiva e si scatena un segnale forte, una trasduzione forte, ed il
linfocita pu andare incontro a quattro destini:
- CAMBIARE TCR: il segnale forte porta il linfocita a riattivare geni della ricombinazione genica e
quindi a rieditare il proprio TCR (lo modifica per vedere se riesce a legare MHC-peptide con minore
affinit);
- DIVENTARE LINFOCITA TREG: il linfociti T cambia natura perdendo la capacit di diventare cellula
effettrice. Si attiva FOXP3 (fattore trascrizionale) che fa assumere un comportamento regolatorio
alla cellula. Questi linfociti sono CD4 positivi, esprimono la catena alfa del recettore
dellinterleuchina-2 (CD25), fattori trascrizionali e altre molecole tipiche (come molecola GITR), ma
soprattutto sono in grado di produrre citochine come IL-10 (interleuchina 10) che un importante
regolatore della risposta immunitaria perch spegne la risposta dei linfociti T e quindi le risposte
immunitarie [mutazioni a carico di FOXP3 inducono gravi malattie immunitarie che colpiscono molti
organi. Se non c regolazione vi una aggressione autoimmune da parte dei linfociti. In alcune
malattie autoimmunitarie come la sclerosi multipla c un difetto di numero e/o funzione delle
cellule regolatorie che non riescono a bloccare la risposta T autoreattiva];
- DIVENTARE CELLULA NKT: il linfocita diventa capace di produrre IL-13 (anche essa ha attivit
soppressoria nei confronti dei linfociti T);
- MORIRE PER APOPTOSI: il segnale di CD3 pu anche portare allattivazione di un programma
apoptotico che causa il suicidio della cellula.

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Ricapitolando: nel timo, prima si ha una generazione casuale del recettore per lantigene (si crea un
repertorio grande), poi alcune cellule sono selezionate negativamente (soprattutto le cellule che
interagiscono ad alta affinit con MHC-peptide), successivamente questo numero diminuisce perch anche
i linfociti negletti che non legano con nessuna affinit l MHC-peptide vanno incontro ad apoptosi, e per
ultimo abbiamo la selezione positiva (i linfociti rimasti vengono aiutati ad espandersi e finire la loro
differenziazione). Poi questi linfociti escono dal timo e vanno a colonizzare i tessuti linfoidi secondari.

AIRE
Un punto importante che nel timo a livello delle cellule epiteliali o corpuscoli di Hassal espresso il
fattore di trascrizione AIRE (AutoImmune REgulator) che fa esprimere sullMHC, in maniera ectopica sulle
cellule epiteliali, proteine che normalmente sono espresse nei tessuti. Ci induce la tolleranza centrale di
alcuni antigeni normalmente presenti negli altri tessuti. Questa osservazione fu fatta per la prima volta anni
fa da Diane Mathis, unimmunologa francese che lavora a Boston. Risult chiaro che la tolleranza centrale
che normalmente si avvera per antigeni ubiquitari che stanno solo nelle cellule timiche pu anche avverarsi
per alcuni antigeni espressi normalmente nei tessuti. Alla pubert, quando il timo diventa parzialmente
atrofico, continua a funzionare al punto che potremmo capire quanti antigeni self stanno nel timo.
AIRE un fattore trascrizionale molto potente perch permette la trascrizione di proteine, implicate in
sindromi autoimmuni, presenti in altri tessuti: insulina (importante perch pu essere coinvolta nel
diabete), tireoglobulina (d la tiroidite), proteina basica della mielina (provoca la miastenia), antigeni della
retina (causa luveite). Quindi i linfociti T possono anche diventare tolleranti a questi antigeni gi a livello
del timo.
Se durante la selezione timica scappano i linfociti T che hanno una media/alta affinit nei confronti di questi
antigeni e vanno in periferia si manifesta la relativa malattia autoimmune.
Nel timo troviamo anche altre cellule che presentano lantigene come le cellule dendritiche e i macrofagi
che possono presentare sulla loro membrana HLA-peptide. I corpuscoli di Hassal producono citochine come
la linfopoietina stromale tipica e IL- 7 che sono mediatori che attivano le cellule dendritiche che diventano
brave ad interagire con i linfociti T e soprattutto possono funzionare come fattori di regolazione e
maturazione dei linfociti T regolatori.

Quando i linfociti timici o timociti raggiungono la zona corticale timica, incominciano ad esprimere CD3 che
serve per trasmettere il segnale (hanno gi il TCR, soprattutto di tipo alfa-beta). In queste condizioni il
linfocita detto doppio positivo perch esprime contemporaneamente CD4 e CD8, importanti perch
facilitano linterazione del linfocita T con la molecola MHC. Infatti la molecola CD4 lega MHC di classe II,
mentre la molecola CD8 lega MHC di classe I. CD4 e CD8 sono corecettori perch aiutano il TCR ad
interagire con pi adesione e forza alle cellule che presentano lantigene. Durante la selezione positiva il
linfocita doppio positivo potr interagire con HLA-peptide di classe I o II. Per cui se questo doppio positivo
interagisce con una molecola di classe II (si lega al dominio alfa 2) che il CD4 lega bene perde la molecola
CD8, invece perde il CD4 se si lega ad una molecola di classe I (dominio alfa 3) che il CD8 lega meglio. In
pratica questo linfocita incontra lHLA e, a seconda se incontra HLA I o II, ha un segnale di repressione del
corecettore che non ha interagito con il proprio HLA specifico. E importante anche la forza della durata di
questo legame. Esiste il fattore trascrizionale THPok (T Helper Pok) che quando il doppio positivo lega con
CD4 lHLA II fa reprimere il CD8 facendo in modo che il CD4 venga definitivamente espresso. Sono le
caratteristiche del TCR a decidere se sar un CD4 positivo o CD8 positivo. A questo punto il linfocita
fuoriesce e va a svolgere la sua funzione in periferia.

TOLLERANZA PERIFERICA
Per quanto riguarda la tolleranza periferica esistono quattro meccanismi attraverso cui si esplicita:
- anergia cio la paralisi funzionale di un linfocita T che riconosce un antigene: si attiva ma non in
grado di proseguire nella sua attivazione e diventa un linfocita anergico. Ci dovuto al fatto che
un linfocita T vergine per attivarsi ha bisogno di segnali molto forti (coattivatori) che non trova a
livello dei tessuti, ma ha bisogno delle cellule dendritiche e delle loro molecole stimolatorie;

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- attivazione violenta e continua contro lantigene che porta ad apoptosi tramite espressione sulla
membrana cellulare di molecole che, se toccate, innescano la morte, come Fas e Fas-ligando. Se
sia Fas sia Fas-ligando sono espressi sullo stesso linfocita, questa apoptosi di tipo autocrino;
- uccisione fratricida se Fas e Fas-ligando sono espressi su cellule diverse. Ci sono esempi molto
chiari di topolini sperimentali e pazienti con difetti di questi sistemi Fas-Fas ligando che soffrono di
malattie dette linfoproliferative, cio eccesiva proliferazione di linfociti T che porta a malattie
autoimmunitarie;
- intervento dei linfociti T regolatori, che si sono generati nel timo ma anche in periferia, che a
livello periferico possono bloccare i linfociti autoreattivi.

POPOLAZIONE CELLULARE DEL TIMO
Dal punto di vista anatomico il timo diviso in lobi da trabecole di tessuto stromale. Nella parte pi esterna
dei lobi, detta sottocapsulare, i precursori dei linfociti (protimociti) arrivano, durante la gravidanza,
soprattutto durante lottava settimana, ad ondate successive. Raggiungono la sottocapsulare e pian piano
iniziano ad attraversare tutto il lobo timico. Per cui dalla sottocapsula passano alla corticale dove sono
definiti pretimociti. Questi hanno il CD3 espresso sulla loro superficie cellulare e incominciano ad avere
segnali di proliferazione, per cui si espandono. Man mano si spostano verso la parte midollare e, ad un
certo punto, arrivano a livello della giunzione corticale-midollare dove avvengono i fenomeni apoptotici: il
98% di questi linfociti va incontro ad apoptosi, quindi solo una piccola percentuale raggiunge la midollare
del timo (linfociti midollari) dove avvengono i fenomeni di selezione positiva dopo che avvenuta la
selezione negativa. A questo punto i linfociti che hanno terminato la loro maturazione vengono definiti
linfociti T vergini, vanno nel circolo sanguigno e attraverso venule ad endotelio alto entrano nei linfonodi
dove possono interagire con altre cellule e riconoscere lantigene e a loro volta riuscire e circolare nel flusso
sanguigno.
I fenotipi: le molecole che sono espresse nella sottocapsulare sono negative per CD3, CD4 e CD8. C TdT
(Terminal deoxynucleotidyl Transferase) importante per il riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline.
I linfociti iniziano ad esprimere Notch, fondamentale per la specificazione del destino. E, a questo punto,
passano nella corticale dove possono interagire con il ligando di Notch: comincia il riarrangiamento dei geni
dei TCR. Pian piano iniziano ad esprimere un recettore per il TCR ancora provvisorio che si chiama psi alfa
beta che pu ricevere un segnale di proliferazione cellulare e, in qualche maniera, attraverso questo
recettore i linfociti T possono essere controllati per vedere se funzionano bene o male. Poi il TCR si
completa, definitivo, cos vengono espressi entrambi i corecettori CD4 e CD8, ma continuano ad avere
TdT acceso, cio continuano ad avere la possibilit di riarrangiare geni delle immunoglobuline. Nella
midollare diventano CD4 o CD8 positivi e perdono la capacit di riarrangiamento. Escono e la specificazione
fissata, cos possono andare in periferia. Sono prodotti circa 2 milioni di linfociti al giorno che vengono
riversati in periferia.


GENERAZIONE TCR
A met degli anni Ottanta il ricercatore giapponese Susumu Tonegawa, che lavorava in un istituto di
immunologia a Basilea, ha dimostrato che, attraverso un meccanismo definito ricombinazione somatica
dei geni del TCR, i 30.000 geni del genoma possono codificare per pi di 1011 sequenze diverse di TCR.
Questo meccanismo avviene attraverso due strategie adottate dal sistema immunitario:
1. ricombinazione casuale dei segmenti genici multipli presenti nel genoma di ciascuno di noi. In
poche parole, non esiste un unico gene che codifica per il TCR ma esistono tanti pacchetti genici
diversi che possono essere casualmente scelti. Per cui il TCR montato scegliendo a caso uno di
questi segmenti. Questo crea una enorme variabilit di queste molecole. Immaginate il TCR alfa-
beta costituito da tre o quattro di questi segmenti genici montati insieme e a livello genico ci sono
10/20/30 segmenti genici che codificano per questo segmento che possono essere scelti
casualmente.
2. Questo repertorio diventa ancora pi parossistico grazie ad un altro sistema che si sovrappone: il
fatto che durante la ricombinazione di questi geni, che vengono giustapposti uno con laltro, si
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creano errori di giunzione tra un gene e laltro. Ci crea un fenomeno di variabilit molto elevato.
Per cui sommando questi due processi si arriva ad avere un numero molto grande di TCR a
disposizione.
Quindi riusciamo ad avere un repertorio enorme di recettori per lantigene per un numero praticamente
infinito di complessi HLA-peptide. Quello che fa il sistema immunitario eliminare tutti i TCR autoreattivi e
mantenere ed espandere tutti i TCR che potenzialmente potrebbero reagire con gli infiniti antigeni. Per cui
questo sistema piuttosto dispendioso e raffinato ci permette di difenderci da tutti i pericoli a cui possiamo
andare incontro durante la nostra esistenza.

STRUTTURA TCR
Il TCR formato da due molecole, un eterodimero, in cui le due molecole possiedono una regione
EXTRACELLULARE che contatta lHLA-peptide, una regione H (Hinge=cerniera) che conferisce flessibilit,
una regione TRANSMEMBRANA e una regione CITOPLASMATICA. Esistono sia recettori con catene alfa/beta
(98%) che recettori con catene gamma/delta (2%): hanno tutti la stessa struttura.
Ogni catena contiene una parte variabile ed una costante. Ad esempio i geni delle catene alfa sono di due
tipi: geni costanti uguali in tutti i linfociti e variabili diversi nei vari linfociti. Per cui esistono pochi geni per le
parti costanti e tanti per quelle variabili (usati in maniera casuale). Lorganizzazione genica delle catene
beta e delta pi complessa poich il prodotto della ricombinazione di 3 loci genici: V, D e J. Esistono,
quindi, tre pacchetti di segmenti genici che possono essere combinati attraverso almeno due eventi di
ricombinazione: V deve essere associato a D e poi il segmento VD deve essere associato a J. Le catene alfa e
gamma sono invece il prodotto della ricombinazione di due soli loci: V e J. In poche parole, queste catene
hanno una parte variabile e una costante.
In particolare, alfa e gamma hanno un segmento prodotto del gene V e uno prodotto del gene J, che
ricombinati insieme costituiscono la porzione variabile, e una parte codificata dal segmento costante C che
comprende le parti cerniera, transmembrana e citoplasmatica. Le catene beta e delta, invece, hanno la
porzione variabile costituita dalla ricombinazione dei segmenti prodotti dai geni V, D e J e la solita porzione
costante C.
La regione transmembrana una regione con una sequenza di amminoacidi di carica totale positiva:
questo permette lassociazione con il CD3 perch le molecole del complesso CD3 delle catene Z hanno nella
zona transmembrana amminoacidi che conferiscono una carica negativa.


Per ogni catena alfa, beta, gamma, delta troviamo pi locus genici che codificano per queste regioni (V-D-J
e C). Quindi, abbiamo tanti segmenti genici che, in maniera del tutto casuale, vengono ricombinati. Quello
che avviene durante il riarrangiamento di questi geni un taglia e cuci molecolare; per cui vengono scelti
alcuni segmenti a caso, tagliati e cuciti insieme e ricomposti ed espressi sulla membrana del linfocita. Nella
realt esistono molti segmenti V-D-J, che sono distanti tra di loro sul cromosoma, che vengono scelti a caso.
Quindi, tutte le nostre cellule del nostro corpo hanno geni TCR in questa configurazione, chiamata
germinale, in cui i geni sono tutti messi a diversa distanza luno dallaltro. Solamente nei linfociti T
esistono dei particolari enzimi che determinano questo taglia e cuci molecolare, per cui questi geni
vengono scelti. Per la porzione variabile viene scelto un gene D e un gene J, che vengono montati su catena
beta o delta, insieme ad una porzione costante montata sulla superficie del linfocita T. Quindi, i segmenti
genici sono lontani, si associano tra di loro e danno origine ad un gene che codifica unintera catena.
Questo processo viene chiamato riarrangiamento perch i geni vengono tagliati e cuciti e scelti; questo
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ha unimportanza fondamentale nella nascita della specificit. Il repertorio dei recettori delle cellule T
nasce proprio da questo taglia e cuci molecolare, che determina un enorme numero di TCR casualmente
riarrangiati. Quindi, quando le cellule sono ancora in uno stadio non differenziato, noi abbiamo
linformazione dei vari geni V-D-J nella configurazione germinale; questi geni V (per variable), D (per
diversity) e J (per joining) sono distanti tra di loro e a monte, c il segmento costante, chiamato C.

Quando un linfocita T si sta differenziando, un segmento D,
uno V e uno J vengono portati vicini e viene tagliato tutto il
DNA in mezzo. Questo processo viene chiamato
ricombinazione sito-specifica. Questa ricombinazione non
altro che una delezione del DNA intercalato tra questi
segmenti. Quindi, quando vengono scelti un V, un D e un J tra i
vari segmenti possibili, questi vengono riarrangiati a formare
un unico gene. Questi segmenti vengono uniti attraverso la
ricombinazione specifica; il primo passo della ricombinazione
sempre lunione di un segmento D con un segmento J. Questi vengono messi vicini e tutto quello che ci
sta in mezzo viene tagliato via. Questo il primo livello della ricombinazione. Il DNA intercalato viene
circolarizzato e poi eliminato.
A questo punto, se questa ricombinazione d origine a qualcosa di produttivo, inizia il secondo passo della
ricombinazione: il segmento D-J viene unito a V e tutto quello che ci sta in mezzo viene eliminato e si ha il
DNA riarrangiato. A questo punto, questo il primo esone che viene prodotto (V-D-J), in grado di codificare
la parte variabile della catena beta del TCR. Quindi, la catena beta il prodotto di questi riarrangiamenti V-
D-J e del gene costante C. A livello dei geni che codificano per la catena beta, abbiamo tante catene beta
variabile (75). Lungo il cromosoma, ci sono 75 segmenti V che sono messi a disposizione per la
ricombinazione. Ognuno di questi ha una leader sequence, per cui quando loro vengono utilizzati questa
leader sequence viene montata in modo che loro possano essere montati sulla membrana cellulare. A
valle del cromosoma abbiamo un segmento D (D beta 1) e laltro lo troviamo ancora pi a monte (D beta 2);
poi troviamo dei segmenti J per la catena beta. Questa lorganizzazione della catena beta.



Nella catena alfa, che pi semplice, abbiamo tanti segmenti variabili (da 50 a 70) e pi a valle, separati da
lunga distanza, moltissimi geni J (60). Le combinazioni
possibili sono molte. Poi, abbiamo un solo gene C alfa.
Immersi in questi geni della catena alfa troviamo i geni
della catena delta. Quindi, la catena delta un po
meno variabile della catena alfa: ci sono solo 3 geni
variabili, 2 D e 3 J e una catena delta C e unaltra
regione variabile delta 4. Questi geni portano ad un
assetto di catena V-D-J.

Un motivo per cui TCR delta e gamma sono molto rari
perch quando avviene il riarrangiamento tra beta e
alfa e, quindi alfa viene riarrangiato (un gene D alfa
viene legato ad un gene J), tutti questi geni si perdono.
Quindi, un linfocita non pi in grado di utilizzare
questo DNA per formare dei TCR utilizzando la catena delta. In un linfocita alfa-beta prima avviene la
ricombinazione di beta, poi la ricombinazione di alfa; per, quando alfa finisce la ricombinazione taglia
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tutto quello che c in mezzo e quindi, questo DNA non pi disponibile per la ricombinazione. Quindi, in
realt, quello che succede che i linfociti gamma-delta si devono formare prima dei linfociti alfa-beta.

Questa lorganizzazione della catena gamma: abbiamo un certo numero di V, un certo numero di J.







La sequenza di ricombinazione sempre questa:
- linfocita T per primo fa sempre riarrangiamento catena beta e quindi, inizialmente, quello che
avviene che tutti i riarrangiamenti portano ad esprimere una catena beta, che verr espressa
sulla membrana;
- riarrangiamento della catena alfa, che verr espressa sulla membrana.

Quindi, ogni catena beta riarrangiata potr poi associarsi con una delle tante catena alfa. Dal punto di vista
della sequenza, il primo evento del riarrangiamento quello di unire uno dei segmenti D con uno dei
segmenti J; successivamente, avviene il secondo riarrangiamento: V viene unito a D e J che si sono
riarrangiati. La sequenza sempre questa.
In questo esempio (immagine sotto), un D1 si riarrangia con J1 e il DNA che intercalato viene eliminato. Se
questo riarrangiamento produttivo, cio che d origine ad una sequenza che funziona e che pu essere
tradotta, avviene il secondo riarrangiamento. Quindi, questo segmento D1 riarrangiato con J1 viene unito
con una delle tante catene V, a formare un esone V-D-J. Qui siamo ancora a livello del DNA. Questo DNA
viene trascritto a livello di RNA messaggero e, attraverso un meccanismo di splicing, viene prodotto lRNA
messaggero completo per la catena beta (cio, a questo segmento V-D-J riarrangiato si unisce uno dei 2
segmenti C).



Questo un meccanismo che porta ad un numeroso repertorio di TCR. Possiamo fare linventario di tutte le
diversit possibili solo per quanto riguarda lalfa e beta. A livello del DNA germinale, le regioni V sono 75
per alfa e 52 per beta; le regioni D sono 2 per beta; le regioni J sono 61 per alfa e 13 per beta; una regione C
per alfa e 2 per beta. Le possibili combinazioni per alfa sono 4575 e per beta sono 2704; se le
moltiplichiamo, solo attraverso il meccanismo di ricombinazione genica, abbiamo oltre 12 milioni di
combinazioni TCR possibili. In realt molto pi complesso, perch un TCR arriva a fare moltissime
combinazioni in pi; questo avviene grazie ad altri meccanismi di errore, che aumentato ancora di pi il
repertorio.

Un punto importante che questo processo di ricombinazione non preciso: alcune volte si determinano
delle variazioni nella sequenza di queste giunzioni. Proprio a livello giunzionale, le variazioni a livello della
sequenza (che avvengono durante il riarrangiamento prima di D-J e poi V-D-J ci sono 2 ricombinazioni e
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quindi 2 possibilit di errore) determinano unenorme variabilit della giunzione e quindi aumentano molto
di pi le possibili sequenze che sono messe a disposizione. Quindi, gli eventi molecolari che riguardano la
catena beta evidenziano molto bene i meccanismi in cui questa variabilit avviene. Consideriamo che il
primo evento del riarrangiamento quello di D-J sulla catena beta; poi, segue un secondo evento che
dovuto al riarrangiamento V-D-J. A questo livello c gi un primo controllo: il riarrangiamento di V-D-J, se
d origine ad evento produttivo, tutto va bene; se invece il riarrangiamento non produttivo, se ci sono
degli errori, se ci sono delle sequenze di STOP, il linfocita pu provare diverse volte. Pu provare diverse
volte perch ha diversi geni D a disposizione; tutte le volte che riarrangia male, ci sono un certo numero di
D che possono provare a riarrangiare e a correggere questo errore. Quando il linfocita si riarrangia
correttamente e quindi d origine ad un esone che codifica per un segmento corretto, si forma lRNA
messaggero (che contiene anche lRNA per la zona costante); poi, successivamente si fa lo splicing dellRNA
messaggero, che codifica tutta la catena e, a quel punto, la catena beta cos prodotta va nel citoplasma e
non viene subito montata in membrana.


MECCANISMO DI RICOMBINAZIONE A LIVELLO MOLECOLARE
La ricombinazione V-D-J definita come ricombinazione non omologa perch non avviene tra geni uguali.
Questa ricombinazione porta a produrre dei geni codificanti completi: V-D-J un gene codificante
completo. Ovviamente, questo richiede degli eventi di ricombinazione molto importanti che sono guidati da
proteine chiamate RAG (recombination activating gene). Queste proteine sono solo presenti nei linfociti T e
B: nei linfociti T attivano la ricombinazione dei geni del TCR; nei linfociti B attivano la ricombinazione dei
geni delle immunoglobuline, che avviene in maniera simile a quella dei TCR. Queste proteine RAG sono
molto importanti perch determinano la rottura del DNA a doppia elica nei punti di giunzione e, quindi,
favoriscono poi la ricombinazione dei vari segmenti. Queste proteine esistono solo nei linfociti, per cui
esistono degli individui che hanno deficienze a carico di queste RAG: questi individui non hanno linfociti T e
B sviluppati, perch non si pu attivare il meccanismo di ricombinazione genica (soffrono di grave
immunodeficienza).
Per riarrangiare, i geni devono possedere delle sequenze nucleotidiche specializzate chiamate RSS
(recombination signal sequences). Queste RSS sono molto caratteristiche e contengono sempre:
- sequenze palindrome di 7 basi, chiamate eptamero;
- sequenze di 9 basi ricche di adenina e timina chiamate nonamero;
- sequenze spaziatrici, che possono essere di 12 o di 23 basi.

Ogni segmento genico, per esempio D, ha a valle un eptamero, uno spaziatore, un nonamero e a monte, un
eptamero, uno spaziatore e un nonamero. In questa maniera, D pu essere unito con J attraverso queste
sequenze segnale. Quando inizia il riarrangiamento, i geni utilizzano queste sequenze segnali caratteristiche
che sono presenti associate ad ogni segmento. Queste sequenze permettono lavvicinamento dei geni. Si
segue una regola per cui lo spaziatore 12 si associa allo spaziatore 23 (regola 12/23): ad un certo punto i
segmenti risultano adiacenti e questo pu far attivare i geni per tagliare il DNA in quei punti.
La ricombinazione V-D-J inizia quando i geni RAG1 e RAG2, insieme alla proteina HMG1, formano un
complesso che lega le RSS che fiancheggiano ogni elemento di V, D o J. Quello che avviene che: 2
sequenze segnale vengono avvicinate tra di loro e si forma una specie di sinapsi (questo avvicinamento
segue sempre la regola 12/23; cio, per avere la ricombinazione, una RSS con una spaziatura di 12 basi si
appaia pi facilmente con una RSS con una spaziatura di 23 basi). Il primo evento della ricombinazione D-J
utilizza questa regola; per cui, queste le sequenze spaziatrici si avvicinano in maniera tale per cui i segmenti
genici si avvicinino. Quindi, in questa configurazione intervengono RAG1 e RAG2, che codificano degli
enzimi che tagliano il doppio filamento di DNA. Una volta che si forma questa sinapsi, i due eptameri e i due
nonameri sono appaiati (essendo palindromici), il 12 e il 23 sono associati, RAG1 e RAG2 possono tagliare il
DNA a doppia elica nel punto di giunzione. Lo tagliano, leptamero si fonde con leptamero e si forma un
DNA quasi sempre circolare, che viene eliminato.

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A questo punto, ci sono le 2 doppie eliche che sono state interrotte e bisogna riunirle. Il primo meccanismo
che porta al ricongiungimento dei 2 segmenti questo: lOH in 3 di ciascun filamento rotto viene usato per
fare un legame nucleofilo sullaltra emielica; si forma una forcina (hairpin), che chiude la catena.


Successivamente, abbiamo intervento di una endonucleasi (ARTEMIS; in alcuni casi pu essere mutata,
determinando limpossibilit di finire il riarrangiamento dei geni del TCR), che taglia il DNA delle forcine e fa
s che si apra la forcina mandando i 2 nucleotidi che fanno parte di unemielica dallaltra parte. Si generano
2 nucleotidi P (palindromici). La sequenza a livello di questa giunzione, per opera di ARTEMIS, un punto di
variabilit nel repertorio. La TDT aggiunge dei nucleotidi per chiudere queste 2 emieliche e li aggiunge in
maniera casuale. Questi nucleotidi vengono chiamati N; chiamati cos perch non esiste uno stampo, ma li
aggiunge a caso. Ad un certo punto, intervengono delle nucleasi che tagliano via i nucleotidi che non si
appaiano correttamente. Alla fine di questo processo si attiva la sintesi di nucleotidi, che riempiono le 2
emieliche: si attiva una DNA-polimerasi che completa la giunzione. Quindi la giunzione ha questa
conformazione che non pi quella di prima. Esistono nuovi nucleotidi aggiunti casualmente (N). Nella
struttura del TCR, i punti in cui si concentrano queste zone (zone di ipervariabilit), a livello della sequenza
peptidica, sono i punti in cui TCR contatta lantigene. Queste zone sono importanti perch qui il punto
dove c la specificit genica.


un meccanismo molto controllato: quando beta ha finito il riarrangiamento, se questo produttivo,
questa viene prodotta nel citoplasma e montata sulla membrana. Se il linfocita riarrangia male o non riesce
a riarrangiare, si suicida, cio va incontro ad apoptosi; in genere prova ancora ad avere una beta
funzionante e se non funziona si suicida.
Una volta che la catena sulla membrana, il linfocita deve controllare che questa
catena veramente funzioni. La catena beta riarrangiata, a livello del citoplasma, viene
associata ad una catena PSI alfa, che una catena provvisoria ( un surrogato della
catena alfa). Il linfocita monta un recettore provvisorio fatto dalla sua catena beta e PSI
alfa e prova a vedere se funziona. Contatta le cellule stromali timiche e questo
contatto provoca un segnale che viene trasdotto al linfocita che ha riarrangiato la
catena beta; questo segnale provoca 2 eventi fondamentali:
- blocca ulteriori riarrangiamenti del gene beta;
- fa proliferare il linfocita che ha riarrangiato.

In questo modo il numero di linfociti che esprimono questa catena beta aumenta, diventa molto elevato e
questi linfociti possono iniziare il riarrangiamento della catena alfa in modo da poter essere funzionali.
Questo meccanismo di controllo molto importante perch porta alla proliferazione, selezionando dei
linfociti T che hanno la catena beta funzionante e che possono iniziare a riarrangiare la catena alfa. Se la
catena alfa non funziona si riarrangiano i segmenti genici fino a che non trovare la catena alfa giusta da
poter associare e formare un recettore.
Tutto questo avviene nei linfociti della corticale e man mano che i linfociti vanno verso la midollare si hanno
i diversi stadi del riarrangiamento (prima catena beta, poi catena alfa).

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Immunologia Lezione 6 20/3/13 - Novelli
Nel fenomeno della ricombinazione somatica si hanno 12 milioni di possibilit ricombinatorie solo grazie al
diverso accoppiamento di segmenti genici. Con altri meccanismi si aumenta la variabilit del repertorio dei
TCR:
Variabilit giunzionale: durante le ricombinazioni si creano delle variabilit giunzionali, in quanto
vengono aggiunti dei nucleotidi N e P, e questo fa aumentare il repertorio di 12 milioni fino a 10^11. Le
regioni P e N sono quindi molto importanti: nella alfa le troviamo nella giunzione D-J, nella beta in V-D e
in D-J;
La regione D pu venire letta durante la trascrizione partendo da nucleotidi diversi e questo aumenta
ancora un po il repertorio.

Nel meccanismo della generazione del TCR avviene anche il fenomeno dellesclusione allelica: quando
riarrangiano i geni su un cromosoma, questi vengono spenti sull'altro cromosoma. Sullaltro cromosoma i
geni possono venire riattivati solo nel caso in cui le ricombinazioni sul primo cromosoma non sian
produttive.

Per quanto riguarda la ricombinazione dei geni per le immunoglobuline (Ig) (che sono simili a quelli per il
TCR), la variabilit del repertorio molto condizionata dalle mutazioni somatiche che possono venire a
carico dei geni delle immunoglobuline: durante la proliferazione di un linfocita B possono avvenire delle
mutazioni puntiformi a livello dei geni che codificano per le immunoglobuline queste contribuiscono
molto allaumento del repertorio. Queste mutazioni non avvengono quasi mai per quanto riguarda il TCR
nel caso del TCR hanno contributo piccolo allaumento del repertorio.
Se volessimo quindi fare linventario delle varie diversit possibili del TCR abbiamo che a livello germinale le
diversit possibili sono oltre 10^7, mentre per opera della ricombinazione somatica bisogna tener conto di
ulteriori 10^11 possibili combinazioni: quindi moltiplicando questi due valori otteniamo 10^18 possibili TCR
che possono formarsi durante lo sviluppo dei linfociti. In realt per non abbiamo nel nostro repertorio
10^18 TCR, ma ne abbiamo 10^7/10^8, perch, a causa delleducazione timica, i linfociti con TCR troppo
affini al self vengono eliminati.

La membrana di una cellula ricoperta di complessi HLA1+peptidi self (che possono essere 10000 peptidi
diversi), che derivano dalla degradazione o dal catabolismo di proteine endogene. Chiaramente maggiore
il numero di tasche diverse, maggiore il numero di peptidi che la cellula potr presentare --> aumenta la
nostra capacit di difenderci contro eventuali pericoli.

INTERAZIONE LINFOCITA T CON HLA+PEPTIDE
Normalmente, il linfocita t che incontra un MHC+peptide self non si attiva, in quanto tollerante, perch
nel timo avvengono dei meccanismi che portano alla tolleranza centrale.
Si pu per avere un'infezione da parte di microorganismi, che producono proteine che non sono self:
queste proteine possono entrare nella cellula, o questi microorganismi possono entrare nelle cellule e
produrre proteine. Quindi si verranno a produrre anche dei peptidi non self che iniziano a competere coi
peptidi endogeni per le tasche dell'MHC. Ad un certo punto possibile che alcuni peptidi dei
microorganismi scalzino o spiazzino dei peptidi endogeni (abbiamo visto che ogni tasca pu legare dei
peptidi differenti). Quando il microorganismo prolifera pu produrre un alto numero di peptidi non self,
che possono alloggiare nelle tasche. In questo contesto queste proteine non self possono essere captate da
linfociti T con TCR affine per questi peptidi, e ci scatena una risposta immunitaria.

Dopo il legame ad alta affinit con MHC+peptide il linfocita T vergine messo nelle condizioni di attivarsi e
di scatenare una risposta immunitaria. Quando parliamo di attivazione parliamo di un segnale che porta
soprattutto alla divisione del linfocita T attivato, che d origine a un clone di linfociti che modificano il loro
comportamento e si differenziano diventando in gran parte dei linfociti effettori (cio capaci di esercitare
la risposta immunitaria) e in piccola parte dei linfociti della memoria, che saranno in grado di ricordare il
riconoscimento antigenico e saranno in grado di montare una risposta molto rapida e efficiente in caso di
reincrontro con lantigene. Questi linfociti hanno dal punto di vista del TCR lo stesso recettore, li troviamo
nellorganismo che circolano tra i linfonodi e la periferia e, soprattutto i linfociti effettori, vanno a cercare
cellule che presentano lo stesso peptide sullHLA. Quando questi linfociti effettori le trovano, le contattano,
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andandole o a uccidere (ad esempio i CD8+, detti killer) o iniziando a produrre citochine (come i CD4+),
innescando quindi una reazione di tipo infiammatorio.
(N.B. Il linfocita T killer contiene alcune sostanze al proprio interno in grado di provocare la morte del
bersaglio e dopo il contatto con la cellula infetta scarica il contenuto di queste sostanze a ridosso del
bersaglio, provocandone la morte; quando questo avviene, il linfocita si allontana, per evitare l'effetto
tossico delle sostanze da lui rilasciate, e va alla ricerca di altri bersagli. Questa la base della guarigione
dalle malattie)

Gi il fatto che il linfocita T entri in contatto con un MHC+peptide non self, attraverso il suo TCR genera dei
primi segnali attivatori al linfocita T, che sono segnali accendi-spegni che cominciano a sommarsi tra di
loro e solo quando si supera una soglia il linfocita va incontro ad attivazione completa.
L'attivazione dei linfociti T un evento molto selettivo e regolato, non si verifica in maniera cos facile, in
quanto un evento drammatico perch scatena eventi molto importanti sul piano immunitario:
inizialmente prevede linterazione di TCR con HLA+peptide, che favorita da una serie di segnali aspecifici,
in quanto le cellule devono essere intimamente legate luna con laltra.
Naturalmente levento selettivo di questa attivazione linterazione ad alta affinit del TCR con
MHC+peptide, tuttavia esistono anche degli altri segnali da prendere in considerazione: il TCR contatta il
peptide solo con una parte della catene alfa e beta, mentre unaltra parte contatta l'HLA il TCR riconosce
contemporaneamente sia il peptide sia la molecola HLA. Non pu quindi esserci un riconoscimento di un
peptide al di fuori del contesto dellHLA.

Dal punto di vista molecolare sono importanti le CDR (complementarity determining regions), che sono le
regioni ipervariabili nelle catene alfa e beta del TCR che contattano il complesso HLA + peptide. Ce ne sono
tre:
CDR1: posizionate pi verso l'esterno della tasca. Queste contattano lMHC.
CDR2: in posizione pi intermedia. Anche queste contattano lMHC.
CDR3: pi all'interno, sono le CDR pi variabili e contattano il peptide. La maggior variabilit proprio
data dal fatto che sono codificate dalle regioni dei nucleotidi P e N, che abbiamo visto formarsi durante il
riarrangiamento del recettore.


Il TCR, oltre alle catene alfa e beta, costituita da una altra serie di catene che attraversano la membrana e
si prolungano nel citoplasma: CD3 e la catena zeta. Quando il linfocita T interagisce con un peptide+HLA, le
CD3 e la catena zeta si modificano di conformazione e iniziano a generare un segnale di tipo attivatorio
nella cellula, come vedremo a breve.



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CARATTERISTICHE CATENA ZETA:
lunga coda citoplasmatica e una piccola porzione extracellulare. Quindi tipicamente una molecola
che trasduce il segnale all'interno della cellula
Nella parte citoplasmatica presenta 3 domini amminoacidi detti ITAM (immune receptor tyrosine
based activating motifs), che contengono Tyr che tutte le volte che la catena zeta cambia
conformazione vengono fosforilate. La fosforilazione di queste Tyr lorigine del segnale attivatorio
La catena zeta un trasduttore universale: la troviamo anche in altre cellule, associata a altri
recettori che riconoscono qualcosa dallesterno. Ad esempio la troviamo:
1. nei linfociti natural killer, dove associata a CD16;
2. negli stessi linfociti T anche associata a CD2, molecola molto importante per l'adesione.
Si dice che un trasduttore universale in quanto usata non solo dalle cellule T e serve per
propagare un segnale.

(N.B. Sequenza ITAM: due Tyr separate da circa 9-12 amminoacidi. La sequenza ITAM pi tipica la
seguente:


Il meccanismo di funzionamento delle ITAM basato sul fatto che sono in grado di legare, una volta
fosforilate, proteine che hanno domini SH2. Ad esempio vengono reclutate sulle ITAM delle proteine della
famiglia Syk, delle tirosin-chinasi fondamentali per il propagarsi del segnale di attivazione.

CARATTERISTICHE DEL CD3:
Ha una struttura eterodimerica: pu essere formato da eterodimeri gamma-delta, epsilon-delta e
gamma-epsilon.
Ha una porzione extracelllulare un po' pi lunga delle catena zeta e una porzione intracellulare.
Anche queste catene possiedono una ITAM c una ITAM per ogni catena.


Per arrivare all'attivazione del linfocita T non basta linterazione con un singolo MHC+peptide, sono
necessarie interazioni multiple, in cui molti TCR vengono in contatto con l'HLA e molte volte e questo
evento si pu protrarre anche per ore.
Il TCR flessibile e si pu adattare allMHC+peptide e questa deformazione fa s che si deformino anche il
CD3 e la catena zeta, e ci scatena i segnali attivatori, in primis la fosforilazione delle ITAM:


Si possono in alcuni casi formare dei dimeri di TCR che possono riconoscere dei dimeri di MHC+peptide:
quando linterazione mediata da forme dimeriche ovviamente avremo un segnale pi forte dentro la
cellula.

Ogni linfocita T possiede circa 10.000 TCR. Devono esserci molti contatti, in modo che la soglia di
attivazione del linfocita t venga raggiunta. Solo in seguito a segnali multipli si pu raggiungere la soglia.

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Il singolo TCR stesso va incontro a contatti multipli con lHLA+peptide, tramite un movimento a pistone, poi
si sposta e un altro TCR sussegue al primo e quindi abbiamo pi TCR che contattano MHC+peptide. Si
creano quindi pi segnali, che devono sommarsi insieme fino a quando ad un certo punto si raggiunge la
soglia.
Questo tipo di segnalazione ci porta ad una primo segnale di attivazione del linfocita, per i segnali di
attivazione dipendono soprattutto e anche da quanto la cellula T interagisce in maniera stretta con la
cellula che presenta lantigene. Quindi esistono delle altre molecole che si associano al TCR che favoriscono
questa stretta interazione alcune di queste sono i corecettori:
CD8: contattando e legando il dominio alfa-3 della molecola MHC1 favorisce la forza di interazione
tra cellula presentante lantigene e il linfocita T
CD4: si lega al dominio alfa-2 di MHC2
Tanto pi ci sono questi corecettori che aumentano la forza di adesione tra le cellule, tanto pi i segnali
possono portare allattivazione dei linfociti T.


Il primo segnale per lattivazione dei linfociti t quindi deriva da:
Incontro casuale, pilotato da molecole di adesione, chemochine e linfochine, tra un linfocita T naif
e una cellula presentante lantigene (APC). Questo incontro avviene in organi linfatici secondari,
come il linfonodo: ci devono essere dei segnali che portano il linfocita nel linfonodo, e l questo
contatta un APC. Quanto maggiore ladesione del linfocita allAPC (favorita da molecole di
adesione), tanto pi il linfocita potr riconoscere MHC+peptide;
Avidit del legame tra TCR e peptide+HLA: maggiore lavidit maggiore sar la possibilit di
andare incontro ad attivazione;
Stabilit del legame: dipende molto da molecole di adesione e dai corecettori. Le molecole che
garantiscono stabilit al legame aumentano la capacit di rispondere di un linfocita T fino a 10-100
volte, e hanno un ruolo critico quando ci sono pochi HLA + peptide;
Durata del legame: il legame deve permanere per molto tempo affinch si raggiunga il valore
soglia;
Dal numero di TCR che, con il meccanismo di slittamento, interagiscono con pochi p-HLA uguali.

Il problema della comunicazione quindi un problema molto forte durante lattivazione di un linfocita T. I
linfociti quindi cercano di entrare in contatto con le APC nel modo pi intimo possibile. Tutto ci reso
possibile dalle molecole di adesione intracellulare, le cosiddette ICAM, una famiglia di proteine
appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline, che mediano questi contatti e questi legami.
Queste molecole di adesione intracellulare legano unaltra famiglia importante di proteine, le integrine.
Lintegrina espressa sui linfociti T, l LFA-1 (lymphocyte function associated antigen-1), lega delle molecole
di adesione ed importante per formare le sinapsi immunologiche, dove si concentrano i recettori
immunitari che favoriscono la trasmissione del segnale di attivazione.
Quando il linfocita t entra in un linfonodo, LFA-1 pu contattare le APC: quando avviene il contatto si ha
una redistribuzione di questi recettori che vengono portati nel punto in cui le cellule si contattano,
formando le sinapsi immunologiche. Questo contatto molto importante perch a questo livello che il
linfocita T pu contattare il complesso MHC+peptide, grazie alla mediazione delle molecole dadesione.
SMAC un complesso che vuol dire supramolecular activation cluster (nota aggiunta dal compositore
della sbobina: a quanto pare SMAC un sinonimo di sinapsi immunologica). Il contatto con un APC
determina una riorganizzazione del citoscheletro e la riorganizzazione delle molecole di membrana verso il
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polo orientato verso lAPC. Quando un linfocita incontra una cellula che presenta lantigene dopo 10-15
minuti inziano i contatti tra TCR e HLA+peptide e i segnali portati dentro dal CD3 determinano la
riorganizzazione del citoscheletro e la redistribuzione delle molecole di membrana. All'interno della sinapsi
troviamo le molecole specifiche che mediano l'attivazione dei linfociti T, cio il TCR, CD3, i corecettori CD4 o
CD8, e anche unimportantissima molecola detta CD28 (determinante nel dare un segnale definitivo ai
linfociti T per attivarsi), mentre pi esternamente nella sinapsi immunologica troviamo le molecole di
adesione e CD45.


Le LFA-1 (lymphocyte function associated antigen) sono integrine del linfocita che hanno connessioni col
citoscheletro e tutte le volte che vengono legate da ICAM questo genera dei segnali intracellulari mediati da
G proteins; altri segnali di adesione sono mediati da ICAM3 sui linfociti T che legano DC-SIGN sulle APC e
anche questo determina una riorganizzazione del citoscheletro; la molecola CD2 unaltra integrina, anche
detta LFA-2, che pu legare unaltra integrina LFA-3.
Allinterno della sinapsi immunlogica abbiamo il TCR, i corecettori CD8 o CD4, e la molecola CD45, che ha un
ruolo molto importante. Quindi queste molecole di adesione fanno s che le cellule possano entrare in
contatto stretto, questo determina dei segnali di riorganizzazione del citoscheletro che favoriscono i
contatti tra TCR e MHC+peptide. Se non c' riconoscimento del p-HLA il legame tra le molecole di adesione
dura poco: ad esempio, LFA-1, in assenza del riconoscimento dellHLA+peptide, assume una conformazione
che lega a bassa affinit ICAM-1. Viceversa, se c il riconoscimento dellHLA+peptide da parte del TCR, LFA-
1 assume una conformazione ad alta affinit con ICAM-1 e ci favorisce il fatto che le cellule possano
rimanere attaccate anche per lungo tempo, fino quando tutta linterazione tra TCR e lHLA+peptide non
porta allattivazione del linfocita.

C
La sinapsi immunologica che si genera in seguito a un segnale specifico dura da 15 a 36 ore e durante
questo contatto, dove le due cellule si muovono assieme nel linfonodo, avvengono tutti i processi utili
all'attivazione del linfocita.
Quando questi contatti sono protratti nel tempo, per mandare un segnale forte di attivazione importante
CD45, una fosfatasi. CD45 la troviamo su tutti i leucociti. Nel casi dellattivazione dei linfociti T importante
perch inizia tutte le fasi che portano allattivazione.
Nella sinapsi immunologica troviamo anche CD28 una molecola costimolatoria, che interagendo con B7
dellAPC costituiscono il secondo segnale necessario per l'attivazione dei linfociti T. Se non ricevono il
secondo segnale attraverso CD28, i linfociti T non possono continuare nel processo di attivazione: questo
uno dei motivi per cui i nostri linfociti T non si attivano contro cellule della periferia degli organi, perch
anche se trovano lHLA+peptide specifico manca questo segnale e loro non possono attivarsi.
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Dopo aver interagito ad alta affinit con p-HLA, il TCR trasloca dentro delle zattere lipidiche (lipidic rafts),
(lipidiche perch sono ricche di colesterolo, acidi grassi insaturi, sfingomieline e glicosfingolipidi), dove si
trovano enzimi necessari per la trasmissione del segnale: in particolare troviamo le chinasi Fyn e Lck (fanno
parte della famiglia di Src) che normalmente sono fosforilate e inattive. Quando il TCR traslocato assieme
al suo corecettore nelle zattere lipidiche anche il CD28 trasloca nelle zattere lipidiche su queste zattere
lipidiche abbiamo laggregazione dei recettori e delle molecole che partecipano allattivazione insieme alle
tirosin chinasi Fyn e Lck che sono inizialmente inattive (nota delleditore: il professore alcune volte ha detto
Lck e altre Lyn: io ho riportato Lck come c nella slide!).




CD45 toglier il fosfato da Lck e Fyn, permettendo loro di espletare la loro funzione, come vedremo tra
poco.

Per portare a termine la attivazione servono:
Riconoscimento specifico con antigene HLA (segnale 1)
Costimolazione mediato dal B7 attraverso CD28 (segnale 2)
Segnali mitogenici date dalle citochine, in particolar modo da IL2 (segnale 3).

Il segnale 2 generato da molecole che si trovano su cellule specializzate ad attivare i linfociti T, le APC
(cellule dendritiche e linfociti B, che sono capaci di esprimere B7). Le altre cellule non riescono ad attivare i
linfociti T perch mancano del B7. Dovrebbe risultare chiaro come sia importante che la costimolazione
possa avvenire solo da parte di determinate cellule: infatti, se i linfociti fossero in grado di attivarsi solo con
il riconoscimento di p-HLA sarebbero in grado di attivarsi in tutti i contesti, con conseguenze distruttive. In
questo modo invece i linfociti possono essere attivati solo in determinati punti ( linfonodi) e da cellule
specializzate.

I segnali di costimolazione quindi fanno attivare i linfociti T in modo definitivo e determinano una risposta
appropriata dei linfociti T. Dal punto di vista della costimolazione esistono due famiglie di molecole:
A: appartengono alla superfamiglia delle Ig. Ad esempio abbiamo B7 e L-ICOS. Queste molecole sono
espresse sulle APC: B7 lega CD28 e CTLA-4, mentre L-ICOS lega ICOS. CD28 legando B7 determina la
costimolazione allinizio della risposta immunitaria, mentre alla fine della risposta immunitaria, per tirare
il freno alla risposta immunitaria (che non pu protrarsi per troppo tempo), CTLA-4, pi affine del CD28
lega B7, dando un segnale di inibizione della risposta immunitaria. CD28 lega le due isoforme B7.1 (CD80)
e B7.2 (CD86);
B: appartengono alla famiglia del TNF e mediano segnali costimolatori. Diverse molecole tra cui OX40, 4-
1BB, CD27 e CD30. Agiscono come trimeri e si legano a vari recettori del TNF.
I segnali costimolatori sono in gradi di potenziare il segnale dato dal legame del TCR, quindi fanno
raggiungere pi facilmente la soglia, determinando l'attivazione definitiva dei linfociti t.

Le molecole costimolatorie danno segnali che:
Aumentano sopravvivenza del linfocita T: dobbiamo ricordare che i linfociti T sono proni al suicidio
Stimolano direttamente la proliferazione
Stimolano la produzione di citochine infiammatorie.

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Quando si sommano i segnali di attivazione e quelli costimolatori, il linfocita T inizia a produrre la catena
alfa (CD25) del recettore dell'IL2 mette in membrana IL2R a alta affinit per IL2, diventando quindi
responsivo al massimo a IL2. Parallelamente IL2 inizia a essere secreta e viene usata in maniera autocrina o
paracrina, quindi alla fine si arriva alla proliferazione del linfocita T con la generazione di un clone di T
effettori e memoria. Bloccando la secrezione di IL2 o bloccando IL2R si blocca la risposta immunitaria
mediata dai linfociti T questa strategia utilizzata per far attecchire i trapianti.



TRASDUZIONE DEL SEGNALE DOPO LEGAME CON P-HLA
Dentro la cellula viene generata una foresta di segnali, scatenati da eventi di pochi secondi sulla membrana
cellulare, a cui segue a valle l'attivazione di vie di trasduzione nel giro di pochi minuti:
Via Ras-MAPK
Protein chinasi C
Aumento del calcio intracellulare
Tutte queste vie portano alla attivazione della trascrizione di alcuni geni e ci determiner una variazione
nel comportamento dei linfociti T.



Una parte importante dellattivazione dei linfociti T la svolgono alcune chinasi della famiglia Src, Lck e Fyn.
Lck e Fyn sono normalmente inattive, e stanno nei lipid rafts. Quando si ha interazione tra TCR e
peptide+HLA, il TCR trasloca nei lipid rafts, dove ci sono Lck e Fyn inattive. Per lavorare Lck e Fyn devono
essere attivate. Normalmente Lck si associa al dominio citoplasmatico del corecettore (CD4 o CD8), mentre
Fyn si associa alle catene zeta, ma comunque sono inattive. CD45 pu defosforilare queste chinasi e
quando ci avviene Lck e Fyn diventano attive. Lck e Fyn, attivate da CD45 fosforilano le Tyr nelle sequenze
ITAM della catena zeta e del CD3.

CD45 (anche detto LCA, leucocyte common antigen) un corecettore che si trova su tutti i leucociti.
Esiste un solo gene CD45 ma nel sistema immunitario possiamo trovare diverse isoforme, a causa di splicing
alternativi, a seconda dello stato maturativo dei linfociti T (vergini, memoria), o a seconda delle cellule che
lo esprimono. Nei linfociti T si associa al corecettore durante linterazione del TCR con HLA+peptide. Il CD45

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dei Teffettori/memoria reagisce a si attiva pi velocemente, favorendo lattivazione rapida della risposta
immunitaria.



A questo punto intervengono delle chinasi della famiglia Syk, che sono tirosin chinasi espresse nelle cellule
ematopoietiche (dove troviamo la chinasi Syk) e nei linfociti T (dove troviamo ZAP-70, Z-associated
protein-70). Queste chinasi della famiglia Syk hanno due domini SH2, quindi possono legare le Tyr
fosforilate delle ITAM.
ZAP-70 viene reclutato sulle ITAM fosforilate e si attiva, fosforilando:
I substrati LAT (linker of activation in T cells)
Una proteina chiamata SLP-76
Queste sono definite molecole adattatrici. Quando vengono attivate non hanno attivit enzimatica
intrinseca, ma regolano lassemblaggio e lorganizzazione di complessi multimolecolari che portano alla
trasduzione del segnale. Quindi quando ZAP-70 si attivata fosforila e recluta queste proteine, in modo che
si formino questi complessi multimolecolari che mediano la propagazione del segnale. Allinterno di questo
complesso multimerico molto importante ITK, che fa parte della famiglia delle Tec chinasi (chinasi
espresse prevalentemente nei linfociti). ITK lega SLP-76: viene fosforilata e attivata da Lck. Quando ITK
fosforilata riconosce come substrato la PLC-gamma, che viene attivata da ITK mediante fosforilazione. Dalla
PLC-gamma si dividono poi due vie: quella dellaumento di calcio e quella della PKC.

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Segnali di attivazione dei Linfociti T (continua)

Nella formazione del complesso molecolare ad opera di ZAP-70, una serie di molecole adattatrici vengono
assemblate a ridosso della membrana citoplasmatica e portano al reclutamento dellenzima fosfolipasi C ,
il quale viene attivato ed agisce su un lipide di membrana, il fosfatidil-inositolo (PIP2), che viene idrolizzato,
portando alla formazione di due prodotti: inositolo-3-fosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG).
Questi due prodotti determinano effetti importanti per lattivazione dei linfociti T.

IP3 una piccola molecola che agisce sui recettori del reticolo endoplasmatico, determinando il rilascio nel
citosol del Ca++. La concentrazione di Ca++ aumenta anche perch questo segnale permette lapertura di
canali del Ca++ sulla membrana.
Laumento del Ca++ intracitoplasmatico un evento fondamentale che guida e regola la risposta cellulare
dei linfociti T.
Di conseguenza, a valle dellattivazione della fosfolipasi C abbiamo un forte aumento della concentrazione
di Ca++ intracitoplasmatico. Questa alta concentrazione permette la attivazione di determinati fattori di
trascrizione e la conseguente alterazione dellespressione genica della cellula.
LIP3 determina la liberazione del calcio intracellulare, mediante lapertura dei canali del Ca++ (detti CRAC), i
quali fanno entrare Ca++ nel citoplasma; di conseguenza, il linfocita nel giro di pochi secondi si trova ad
avere unelevatissima concentrazione di Ca++ intracellulare, e questo aumento di concentrazione agisce su
un enzima detto calmodulina (che per funzionare dipende dal calcio).
A sua volta, la calmodulina agisce su una serie di altri enzimi, sempre Ca++ dipendenti, tra cui troviamo la
calcineurina, una fosfatasi che ha la capacita di defosforilare un importante fattore trascrizionale detto
NF-AT (fattore nucleare delle cellule T attivate), che cosi facendo si attiva, migra nel nucleo e a sua volta
attiva la trascrizione di numerosi geni.
NF-AT agisce soprattutto sul promotore dei geni delle citochine (specie IL-2, ovvero interleuchina-2) e sul
recettore dellIL2 (ovvero su IL-2R, detto anche CD25).



Quando il linfocita T contatta ripetutamente la cellula dendritica, ovvero la cellula presentante lantigene
(APC, Antigen Presenting Cell), si determina una sinapsi immunologica in cui i recettori mediano questi
segnali.
Quindi, nel giro di pochi secondi, si determina un pesante aumento della concentrazione di Ca++ che si
diffonde nel citoplasma del linfocita, ma grazie a questa sinapsi anche il Ca++ interno della APC aumenta;
questo determina un cambiamento del comportamento della APC che si predispone ad avere un
atteggiamento pi attivante.

La Protein Chinasi C (PKC) determina anchessa lattivazione di dei fattori di trascrizione.
In questo caso, il DAG attiva la PKC, la quale agisce su un altro importantissimo fattore trascrizionale,
chiamato NFkB, che controlla la sintesi delle citochine e di tutti quei segnali che guidano lattivazione dei
linfociti T.

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Immunologia Lezione 7 22.03.13 Novelli

NFkB in genere latente nel citoplasma, associata a una molecola che ne inibisce lattivit. Quando questa
molecola inibitoria viene fosforilata da PKC, inizia a degradarsi.
Quindi PKC permette lo sganciamento (e conseguentemente la degradazione) di questo fattore inibitorio,
cosicch NFkB si trovi libero di migrare nel nucleo, andare sui promotori dei geni target e attivarne la
trascrizione.

La cascata del segnale necessita dellinterazione peptideHLA con il TCR, e talora prevista
loligomerizzazione (cio due molecole di TCR si devono associare sulla membrana, si avvicinano tra loro, e,
aiutati dalle molecole co-recettoriali CD4 e CD8, incominciano a permettere la trasmissione del segnale).
Quando si ha la formazione di tali oligomeri di TCR sulla membrana, si ha la formazione (e quindi
lespletamento della sua funzione) di CD45 che poi porta allattivazione di PLC . Essa una fosfatasi in
grado di rimuovere gruppi fosfato sulle Sarc chinasi presenti nei lipid draft inattivi che in questo modo
vengono attivati (attenzione! mediante defosforilazione, non fosforilazione) e possono agire su Lck (el-si-
chei) e Fyn (fin). Questultime a loro volta attivano le ITAM (presenti nelle code della catena Z di CD3) che,
se fosforilate promuovono lattivazione del complesso multimolecolare ( reclutato direttamente da lat e
spl76 fosforilate).

Di questo complesso fa anche parte la molecola ITK, la quale viene attivata da LCK. ITK fosforila PLC , la
quale agisce su PIP2, che a sua volta viene idrolizzato a IP3 e DAG.
IP3 fa aumentare la concentrazione di Ca++ intracitoplasmatico, attiva la calcineurina e attiva NF-AT.



Abbiamo una terza via, quella delle piccole proteine G
(della famiglia RAS) che attivano una cascata di chinasi
dette MAP (mytogen activated protein chinases: chinasi
che promuovono la mitogenesi, ovvero la proliferazione
cellulare).
Quando si forma il complesso multimerico, anche in questo
caso vengono reclutati dei fattori di scambio, i quali
agiscono sulle piccole proteine G RAS e RAC, le quali a loro
volta propagano il segnale di attivazione attivando la
cascata di queste chinasi della famiglia MAP.
Il risultato finale quello di agire a livello del nucleo, e
questo avviene grazie a C-JUN e C-FOS, che sono due fattori
trascrizionali attivati dalle MAP chinasi; essi migrano nel
nucleo, formano un unico complesso (che rende nome di AP-1), il quale si lega a dei promotori di geni
specifici per la risposta dei linfociti T.
Alla fine, vengono attivati in definitiva 3 fattori trascrizionali specifici, che agiscono sui geni dellIL-2, delle
altre citochine e del recettore delle interleuchine (IL-R).

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Immunologia Lezione 7 22.03.13 Novelli

Quindi questa foresta di segnali, apparentemente ramificata e complessa, in realt converge
nellattivazione di 3 fattori trascrizionali: NF-AT, NF-kB, AP-1.
Tutti questi 3 fattori trascrizionali lavorano sui geni dellIL2 e su quelli della catena dei recettori per
linterleuchina 2 (IL-2R), che sono il motore che permette la proliferazione dei linfociti T nella risposta
immunitaria cellulo-mediata.

Tutte le strategie farmacologiche che puntano a bloccare la risposta dei linfociti T (nelle malattie
autoimmuni, nei trapianti) sono tese ad agire su questa proliferazione.

Esistono molti eventi che regolano lattivazione dei linfociti t: un evento che viene controllato a pi stadi.
Il primo segnale linterazione TCR-complesso HLA; questo determina i primi livelli di attivazione, a cui
devono seguire i segnali di costimolazione (detto segnale numero 2): il segnale che permette alla
molecola CD28, presente sui linfociti T attivati, di interagire con la molecola B-7 per ricevere il segnale e
proseguire nella attivazione.
Questo segnale di costimolazione molto importante, perch i linfociti T lo trovano solo quando
interagiscono con cellule specializzate ad attivare i linfociti T (soprattutto APC, ma in alcuni casi anche i
linfociti B).
Solo se questi segnali si sommano, alla fine il linfocita T riesce a esprimere la catena di IL-2R. Altrimenti, il
terzo segnale non pu partire, e conseguentemente non ci pu essere la divisione cellulare.


Meccanismi molecolari di costimolazione

I segnali di costimolazione sono particolarmente importanti perch permettono il potenziamento del
segnale del TCR.
Quando il linfocita T incontra con il suo recettore un HLA + peptide, riceve un segnale, ma per raggiungere
la soglia per lattivazione, il linfocita T ha bisogno di un ulteriore segnale, dato dai segnali di costimolazione.
Se questi sono presenti, la soglia viene raggiunta pi facilmente.
Questi segnali fanno aumentare la sopravvivenza dei linfociti T, il linfocita T grazie a questi segnali di
costimolazione vive pi a lungo, non tende a suicidarsi; in poche parole queste molecole di costimolazione
provocano segnali che favoriscono la proliferazione dei linfociti T, e soprattutto questi segnali favoriscono
la secrezione di citochine e quindi favoriscono un atteggiamento proinfiammatorio da parte delle cellule.

Linterazione pi conosciuta che porta segnali di costimolazione quella che riguarda la molecola CD28
(espressa dai linfociti T), che interagisce con B7.1 e B7.2, dette anche rispettivamente CD80 e CD86
(presenti sulle APC).
Queste ultime due molecole non sempre sono espresse sulle APC in condizioni di quiescenza: le APC
devono ricevere dei segnali di attivazione o di pericolo attraverso i Toll-like Receptors per poterle
esprimere.
Invece CD28 sono sempre presenti sui linfociti T. Dal legame CD28-B7 deriva un segnale di costimolazione
che lo porta il linfocita T ad attivarsi in maniera definitiva.
Quindi i segnali di costimolazione sono forniti sempre dalle APC, specializzate a fare questo lavoro, e
necessitano naturalmente di un dialogo tra APC e linfociti T.

I linfociti T possono vedere lantigene (Ag) nei linfonodi e nei tessuti linfatici secondari, grazie allinterazione
delle molecole di adesione riescono ad aderirvi, e questo contatto dura molto (circa 36 ore): in questo
tempo si verifica un dialogo tra il linfocita T e APC, e questo dialogo porta a una attivazione definitiva.
Lattivazione del linfocita T un evento rarissimo!! Questo perch abbiamo un enorme repertorio di
recettori, e i linfociti T devono andare a trovare il peptide giusto allinterno dei linfonodi, ovvero la giusta
APC!
Se lo trovano, vi rimangono a contatto per tutto il tempo in modo da ricevere tutti questi segnali di
costimolazione e proliferazione.
Quindi c un vero e proprio dialogo molecolare, per lattivazione di diverse molecole.
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Le molecole di costimolazione che non sono direttamente espresse, devono essere indotte!
Uno dei meccanismi questo: una cellula fuori dal linfonodo in grado di fagocitare lantigene, elaborarlo,
montarlo sulla plasmamembrana e esporlo sull HLA.
C una molecola molto importante: CD40, che d un segnale molto importante, perch se viene contattato
dal suo ligando (sulla membrana di linfociti T) fa mettere in membrana il B7.
Quindi, quando nel linfonodo o nella milza, il linfocita T specifico riesce a contattare l MHC-peptide con
lantigene fagocitato e elaborato, questo linfocita T riceve un segnale di attivazione e, attivandosi, riesce a
esprimere sulla membrana cellulare il CD40-ligando (CD40L).
Questo NON un segnale costimolatorio, perch non diretto nei confronti dei linfociti T! CD40L fa s che
CD40 segnali ad APC di esporre in membrana B7.
Questa interazione tra CD40 e CD40L e importantissima soprattutto per i linfociti B, per permettere la
comunicazione tra i linfociti B e T! Se questo non avviene, molte funzioni immunitarie non riescono a essere
espletate. Infatti solamente quando avviene questa interazione il segnale viene trasmesso, e
conseguentemente APC pu esporre in membrana B7.
Quando B7 espresso, il CD28 che si trova sulla membrana del linfociti T trasduce il segnale: riceve il
segnale numero 1 via T-cell Receptor e il numero 2 (segnale costimolatorio) via CD40 e B7.


AZIONE MOLECOLE COSTIMOLATORIE DELLA SUPERFAMIGLIA DELLE IG
Sui linfociti T, a livello delle zattere lipidiche, sono presenti le molecole costimolatorie della famiglia A:
CD28 e ICOS. Queste due molecole appartengono alla superfamiglia delle Ig, ed hanno delle code
intracitoplasmatiche con dei domini fosforilabili.
Quando avviene linterazione con B7, a livello delle zattere si verifica la fosforilazione delle code
intracitoplasmatiche, che determinano lintervento di enzimi come la fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K);
questo determina la generazione di fosfoinositidi fosforilati che a loro volta determinano lattivazione di
proteine adattatrici (e quindi di fattori trascrizionali) che attivano il gene dellIL-2, e danno un segnale per la
stabilizzazione dellmRNA dellIL-2. (Le citochine hanno la caratteristica di avere un messaggero molto
facilmente degradabile).
Quando c un segnale costimolatorio, i linfociti T producono per pi tempo citochine che permangono
(grazie ai segnali di sopravvivenza).
Comunque sia, anche nella costimolazione, cos come nel segnale 1, il bersaglio genico sempre IL-2R.

Unaltra funzione importante delle molecole costimolatorie il controllo della sopravvivenza cellulare. Si
attivano geni che aiutano la sopravvivenza del linfocita T. Spesso il linfocita T quando stimolato dal TCR
senza segnali costimolatori, indotto ad attivare dei segnali di morte cellulare.
Un altro segnale mediato sempre da queste molecole il controllo del riarrangiamento del citoscheletro,
poich attraverso questo viene, ad esempio, la secrezione e lesocitosi di importanti citochine.
Tutti questi segnali complessi aiutano il linfocita T a portare a termine la propria maturazione.

La biologia dei segnali costimolatori un aspetto importantissimo dellimmunologia. da 20 anni che gli
immunologi pensano a come aumentare questi segnali, perch permettono al corpo umano di attivare una
risposta specifica e protrarla nel tempo!
Sappiamo certamente che il nostro sistema immunitario in grado di riconoscere cellule tumorali e di
attivarsi, ma lo fa poco efficacemente. Tuttavia in vitro possibile, attraverso sistemi di DNA ricombinante,
aumentare questi segnali costimolatori e da un punto di vista terapeutico i risultati fanno ben sperare.

Oltre a questi fattori, i segnali costimolatori hanno anche un ruolo molto importante nellinibire lapoptosi
indotta dal sistema FAS/FAS-L (molto sviluppata nei linfociti t). FAS viene attivato a produrre segnali di
morte.
Il segnale di CD28 blocca, inibisce questa via.


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AZIONE DELLE MOLECOLE COSTIMOLATORIE DELLA FAMIGLIA DEI TNF
Le altre famiglie di molecole costimolatorie sono quelle della superfamiglia dei TNF, presenti come trimeri;
posseggono dei domini intracellulari detti TRAF (TNF receptor associated factor), che possono reclutare
anchessi PI3K, quindi questi fosfoinositidi possono attivare diversi fattori di trascrizione, tra cui AP1, NFkB,
AKT.
Alcuni di essi agiscono direttamente sulla proliferazione cellulare, AP1 agisce sulla secrezione di IL-2 e del
suo recettore, AKT ha invece effetto soprattutto sulla sopravvivenza del linfocita T, perch aumenta
lespressione di molecole antiapoptotiche, tra cui BCL-2, che diminuiscono lespressione di BAD (che
favorisce la apoptosi).

Ricapitolando: ci sono 3 segnali per portare a termine Lattivazione del linfocita T: un segnale specifico, un
segnale di costimolazione, e, solo se questi due funzionano, si pu avere il terzo segnale per lespansione
del clone di linfociti.



RECETTORE DELL IL-2
IL-2R un recettore dimerico e che lega IL-2 a bassa affinit.
Quando il linfocita T si attiva, viene indotta la produzione della catena
(CD25) e inizia la secrezione di IL-2. La catena lega IL-2 a bassa affinit
(10-8), ma quando si coniuga con questo complesso, si forma un
recettore di 3 ordini di grandezza maggiore (10-11), che lega IL-2 a
grandissima affinit e media il fenomeno della proliferazione cellulare.
Questo segnale viene propagato allinterno della cellula grazie alla
fosforilazione delle JAK (Janus Kinasaes), che sono associate al
recettore.
La fosforilazione attiva la famiglia dei trasduttori e degli attivatori della
trascrizione delle STAT, i quali migrano nel nucleo e attivano anchesse
il ciclo cellulare dei linfociti.

Di conseguenza, i linfociti che posseggono la catena (CD25-positivi, o CD25+) passano dalla fase G1 alla
fase S del ciclo. O meglio, i segnali 1 e 2 fanno s che i linfociti passino da G0 a G1, ma per progredire nel
ciclo dalla fase G1 alla fase S hanno bisogno del segnale di IL-2. Solo IL-2 permette questo passaggio.

Tutti questi fenomeni, molto controllati, molto complessi, riguardano i linfociti T vergini.

Quando tutto ci avviene, i linfociti vanno incontro a espansione clonale, cio proliferano, si dividono molte
volte, danno origine a una numerosa progenie, e una parte diventer linfociti T di memoria, in grado di
attivare la risposta immunitaria con modalit molto pi rapide e meno controllate, in maniera molto pi
violenta.
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Infatti i linfociti T di memoria quando si generano, e sono presenti nei nostri tessuti, non hanno bisogno dei
segnali costimolatori!
sufficiente che la cellula veda il segnale montato sullMHC, e senza segnale costimolatorio si adegua e si
attiva, poich necessita il raggiungimento di una soglia molto, molto pi piccola! In poche parole, si attiva
con pi facilit.

REGOLAZIONE MECCANISMO DI ATTIVAZIONE
Il sistema di attivazione, con una grande espansione di linfociti T, prevede lalterazione dellomeostasi: oltre
ad una certa soglia, questa iperproliferazione pu causare problemi (di autoimmunit, fino anche,
potenzialmente, a una neoplasia).
Perci il sistema immunitario produce anche dei segnali che a un certo punto frenano questa proliferazione
e aiutano alla riacquisizione dellomeostasi fisiologica.

La de-attivazione dei linfociti T viene attuata tramite 5 meccanismi:
- espressione sul linfocita Tdella molecola CTLA-4, simile a CD28, che lega B7. Cos il linfocita non
ottiene il segnale di costimolazione, ma di blocco. CTLA-4 ha unaffinit maggiore per il B7, quindi
vince, lo lega meglio;
- espressione del recettore di FAS (detto CD95), che pu legare le molecole di FAS-L presenti su
linfociti T e portare segnali di apoptosi;
- espansione delle cellule T regolatorie, che producono citochine che bloccano i linfociti T;
- produzione da parte dei macrofagi attivati (spesso dallinterferon ) della molecola IDO
(indoleamina 2,3 diossigenasi) che elimina il triptofano. I linfociti T sono molto sensibili a questo
aminoacido, e conseguentemente muoiono;
- produzione di citochine soppressorie, tra cui IL-10, IL-4 e TGF, che bloccano la proliferazione dei
linfociti.
Ci sono esempi di mutazioni genetiche che bloccano queste funzioni: in questi casi gli individui soffrono di
malattia autoimmni molto gravi.

MECCANISMO DI CTLA-4
I linfociti T esprimono CD28 sulla membrana, ma dopo che hanno ricevuto il segnale e si sono espansi,
esprimono sulla superficie cellulare anche CTLA-4 (della superfamiglia delle Ig), simile a CD28.
CTLA-4 blocca il segnale di attivazione perch, similmente a CD28, possiede una coda intracitoplasmatica,
ma, mentre CD28 possiede dei domini ITAM, CTLA-4 possiede dei domini aminoacidici con molte tirosine
detti ITIM che determinano dei segnali di inibizione della risposta immunitaria.
(In immunologia ci sono alcuni recettori con domini ITAM che trasmettono segnali attivatori, e recettori che
esprimono domini aminoacidici di tipo ITIM che producono segnali che inibiscono la risposta).
Quando CTLA-4 lega B7, avviene la fosforilazione delle code, che permettono cos il reclutamento di
fosfatasi che sono inibitorie: il tipico esempio e SHP (leggi scip), fosfatasi che viene reclutata da residui
fosforilati dei domini ITIM, che attiva la defosforilazione della catena o CD3, coinvolti nella segnalazione
attivata dal legame TCR - HLA-p, cos si blocca segnale attivatorio.

Queste fosfatasi, quindi, sono importantissime perch defosforilano in Tyr dei recettori attivatori dei
linfociti T, e questo blocca dei segnali susseguenti alle fosforilazioni delle ITAM.
CTLA-4 blocca la risposta perch reagisce con maggiore affinit su B7, quindi a parit di espressione di B7 e
CTLA-4, questultima si lega con maggior affinit, vince x competizione.

Lespressione di CTLA-4 in definitiva la conseguenza della necessit, da parte del sistema immunitario, di
inattivare lattivazione. Questa stata una scoperta importantissima per gli immunologi perch, attraverso
la possibilit di somministrare questa molecola in forma solubile, si riesce a bloccare lattivazione dei
linfociti T ( unimportante applicazione ad esempio nelle malattie autoimmuni, o nei trapianti, per il
controllo del rigetto).


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Presentazione dei peptidi
Per attivare un linfocita T vergine, sono necessari molti segnali in successione. Non solo il complesso
peptide+HLA deve essere espresso in maniera abbondante sul linfocita e sullAPC affinch si verifichino
multiple interazioni tra HLA-peptide e TCR, ma anche sono necessari anche i segnali di costimolazione e i
segnali mediati dalle citochine.
Attenzione!! Solo le APC professioniste (quelle che esprimono livelli di MHC, specie di classe 2, in maniera
costitutivamente elevata), ovvero le cellule dendritiche e a volte i linfociti B, sono in grado di far
raggiungere ai T vergini la soglia necessaria per portare a termine questo fenomeno.

Il peptide antigenico, che il linfocita T pu vedere, pu arrivare da molecole sintetizzate allinterno della
cellula (peptidi endogeni) o pu anche essere captato dallesterno (ad esempio, in seguito a fagocitosi).

ESPOSIZIONE ANTIGENI SULLA MEMBRANA CELLULARE
Quando sono esposte sulla membrana, le molecole MHC non sono mai vuote: il peptide sempre presente.
Perci, da un lato vengono demoliti i peptidi, dallaltro sono sintetizzate le molecole MHC, e a un certo
punto vengono assemblati insieme; poi il complesso viene portato sulla membrana della cellula.

Esiste quindi un flusso dellinformazione immunologica che segue alcune tappe:
- percezione ed acquisizione di segnali di pericolo dalla periferia. Quando il linfocita T incontra tali
segnali inizia ad attivarsi;
- elaborazione dellinformazione acquisita: le APC fagocitano qualche microrganismo (segnale),
elaborano il segnale e permettono lassemblaggio di Ag sulle molecole MHC;
- spostamento dellinformazione dalla periferia ai linfonodi, cio la APC va a finire nei linfonodi
dove linformazione viene trasferita ai linfociti: i linfociti T non vedono nessun pericolo esterno, non
vedono le proteine intere, ma vedono solo pezzi di patogeni, e li vedono esclusivamente nei
linfonodi grazie allazione di APC.
- Elaborazione di risposte appropriate da parte dei linfociti;


ANTIGEN PRESENTING CELL (APC)
Sono cellule professioniste, specializzate. In alcuni casi sono macrofagi (specie se attivati da segnali
citochinici e infiammatori e quindi divengono in grado di trasferire le informazioni ai linfociti T) o cellule di
Langherans. Tuttavia entrambi questi tipi di cellule non hanno grandi capacit di trasferire le informazioni:
sono in grado soprattutto di mangiare, fagocitare: ingeriscono e si attivano, migrando, in cellule capaci di
dare le informazioni ai linfociti.
Le cellule migliori a presentare lantigene sono le cellule dendritiche, che derivano dalle cellule di
Langherans.
Quindi le cellule di Langherans sono bravissime a mangiare, ma sono le cellule dendritiche (che da esse
derivano) a essere specializzate nellesprimere le molecole MHC e B7.
I linfociti B sono cellule professioniste che producono Ab, ma possono fungere anche da APC perch hanno
unelevata espressione costitutiva di molecole MHC di classe 2, possono fagocitare e internalizzare lAg
attraverso le Ig, ovvero gli Ab che posseggono sulla loro membrana. Quindi, a differenza delle cellule
dendritiche, sono molto pi specifiche.

Quindi le cellule APC professioniste sono: le cellule dendritiche, i linfociti B e, in misura minore, le cellule di
Langherans e i macrofagi.

Queste cellule sono capaci di esprimere costitutivamente elevati livelli di HLA di classe 2, ma sono anche in
grado di captare lAg e di presentare i peptidi che derivano da proteine non self associate a molecole di HLA
di classe 1 e 2 in associazione ai segnali di costimolazione.
Quindi le cellule APC professioniste devono essere in grado di captare lAg, di presentare i peptidi sulle
classi 1 e 2, e di associare questa presentazione ai segnali di costimolazione dei linfociti.

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LE CELLULE DENDRITICHE
Le migliori cellule APC sono le cellule dendritiche, che hanno una morfologia
caratteristica, tipica delle cellule che presentano dendriti sulle superfici cellulari.
Sono al centro dellelaborazione della risposta immunitaria.
Fino a 20 anni fa, si conoscevano ma erano neglette, finch il ricercatore STEIMAN le
studi a fondo e ne comprese il ruolo, al centro della risposta immunitaria. Vinse il
premio nobel per la medicina nel 2011, il giorno dopo alla sua morte (insieme ai 2
ricercatori che scoprirono i Toll-like Receptors).

Oggi sono molto importanti da un punto di vista clinico perch molti protocolli terapeutici per la cura dei
tumori sono basati sulle cellule dendritiche.
Prendendo il sangue periferico di un paziente che soffre di tumore e che viene operato, si vede che ci sono
cellule che esprimono il marcatore CD34: in vitro possibile generare milioni di cellule dendritiche
mettendo in coltura le cellule che esprimono CD34 e dando loro determinati stimoli (TNF, TLR).
A queste cellule poi si fanno mangiare pezzi di tumore autologo, si espandono e si reinoculano nel
paziente, che cos potentemente attivato contro gli Ag del tumore. Con questa terapia si hanno
regressioni davvero clamorose.
Ora si stanno facendo, soprattutto in America, questi vaccini specifici contro il proprio tumore, ma la cura
molto costosa.

Esistono due tipi di cellule dendritiche: derivanti da cellule mieloidi o da cellule linfoidi.
Per poterle fare maturare, si fanno passare per diversi stadi maturativi in cui cambiano le loro capacit.
Le cellule di Langherans sono tipiche cellule dendritiche immature, sulla loro superficie cellulare hanno
molti recettori di tipo lectinico (le lettine sono proteine che legano zuccheri, e molti batteri hanno zuccheri
sulla loro superficie). Questi recettori di tipo lectinico poi formano dentro la cellula i cosiddetti Granuli di
Birbeck.

CELLULE DENDRITICHE IMMATURE
Le cellule dendritiche immature sono caratterizzate da una esasperata capacit di fagocitosi.
Oltre ad avere queste strutture, hanno recettori che legano gli Ab, per cui se i batteri vengono riconosciuti
da un Ab, e sono incrostati da Ab, le cellule dendritiche le riescono a riconoscere e le fagocitano con
molta pi efficienza.
Le cellule dendritiche immature sono per definizione tollerogeniche, poich non avendo sulla membrana
dei segnali di costimolazione, non sono in grado di attivare i linfociti T.
Quindi fondamentalmente le cellule dendritiche immature mangiano moltissimo e montano tutti i peptidi
sulle molecole MHC di classe 1 e 2.
I recettori pi importanti di queste cellule immature sono i Toll-like receptors, gli MHC (specie quelli di
classe 1), i recettori per le Ig, il CD40, il recettore per il TNF.

Attraverso questi recettori, sono in grado di percepire molti prodotti del mondo microbico, quindi possono
attivarsi e inoltre riescono a interagire con i linfociti T perch possiedono il CD40, che si lega al CD40-L dei
linfociti T.
Nel corso di uninfiammazione, se un microbo invade il nostro organismo, tramite il recettore per il TNF, la
cellula dendritica riesce a percepire linsulto.
Tutti questi segnali (TNF, CD40-L, prodotti del mondo microbico) fanno spingere le cellule dendritiche
immature a maturare e quindi a divenire capaci di non essere pi soppressorie ma di aiutare i linfociti T ad
attivarsi.

Un altro segnale che facilita il passaggio da immature a mature sono gli immunocomplessi: complessi tra gli
Ab e le molecole antigeniche. Si possono legare a recettori per frammenti cristallizzabili delle Ig (FcR) (cio
la coda delle Ig, si pu fissare a questi recettori e mandare un segnale di attivazione).
Quindi le cellule immature hanno dei sensori del microambiente con cui possono percepire i segnali del
mondo microbico, percepire linfiammazione e attivare i vari leucociti tra cui i linfociti T.
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Immunologia Lezione 7 22.03.13 Novelli

Quando sentono questi segnali, le cellule dendritiche immature iniziano a maturare, cio a differenziarsi in
modo tale da attivare i linfociti T. Da immature possono solo fagocitare e processare i peptidi (soprattutto
nella classe seconda), ma non possono attivare i linfociti T.

CELLULE DENDRITICHE MATURE
Le cellule dendritiche mature le troviamo soprattutto nei linfonodi, dove diminuiscono le capacit di
fagocitosi, ma divengono brave a processare i peptidi per essere espressi soprattutto nellHLA di classe 1.
Perci i linfociti T vergini CD4 e CD8 per poter essere attivati devono essere a contatto con le cellule
dendritiche mature.
Le cellule dendritiche mature sono caratterizzate dallavere molta espressione di MHC (molta espressione
della classe 1, e enorme della classe 2) e esprimono sulla propria membrana le molecole B7-1 (CD80) e B7-2
(CD86).
Quindi queste cellule diminuiscono la capacit di fagocitare ma aumentano la capacit di attivare i linfociti.
Le cellule dendritiche mature producono anche 3 citochine molto importanti: IL-12, IL-18, IFN-, importanti
per far differenziare i linfociti T (specie CD4), spingendo i linfociti T vergini a divenire T attivati.
Inoltre sono in grado di attivare le cellule NK a potenziare la loro capacit killer, citotossica.



Un particolare tipo di cellula dendritica di origine linfoide la cellula dendritica plasmocitoide, perch la
sua morfologia ricorda quella dei linfociti B che producono Ab (plasmacellule): si tratta infatti di una cellula
rotondeggiante, con un nucleo eccentrico, tipico delle plasmacellule, che quando viene attivata non si
distingue pi dalle cellule dendritiche di origine mieloide.
Sono cellule particolari perch esprimono soprattutto i Toll-like receptors 3 e 8 a livello degli endosomi,
mentre le cellule dendritiche classiche (di origine mieloide) esprimono soprattutto TLR-7 e 9.
Questo le rende capaci di essere sensori delle infezioni di virus con DNA e RNA doppia elica, invece le altre
riconoscono soprattutto i virus a DNA a singola elica e RNA a singola elica.
Le cellule dendritiche plasmocitoidi sono le pi forti sorgenti di Interferone di tipo 1, quindi sono
importanti per le infezioni virali. (LInterferone 1 una delle pi potenti molecole virali).

Ricapitolando: lelaborazione della risposta immunitaria passa dalle cellule dendritiche immature, che
percepiscono i segnali in periferia, captano lAg, captano gli immunocomplessi, sentono le infezioni e i
segnali di infiammazione. Quando sono stimolate da tali segnali, elaborano linformazione attraverso il far
esprimere alle molecole MHC i peptidi sulle tasche, quindi si differenziano cos da poter poi essere in grado
di esprimere sia le molecole MHC sia quelle costimolatorie per poter trasferire ai linfociti T linformazione
immunologica, provocandone la differenziazione.
Solo nei linfonodi sono in grado di interagire con i linfociti T.

fondamentale il concetto di presentazione dei peptidi e il percorso che le proteine non self dentro le
cellule percorrono per arrivare ai linfociti T.
Quando un peptide antigenico deriva da una proteina sintetizzata dallinterno della cellula, questo peptide
viene processato principalmente nelle molecole MHC di tipo 1.
I linfociti T killer, i CD8, sono in grado di legare le molecole HLA di classe 1 e quindi riconoscono i peptidi
sintetizzati allinterno delle cellule. [I linfociti T CD8+ quindi si trasformano in cellule killer].
Invece, se il peptide deriva dalla fagocitosi (cio dallesterno), esso viene processato in modo da finire sulle
molecole HLA di classe 2, e viene riconosciuta dai linfociti CD4.I linfociti CD4 sono detti helper, aiutanti,
perch il loro compito aiutare i linfociti B a produrre Ab. Il risultato di questo riconoscimento sar la
produzione di citochine infiammatorie e laiuto ai linfociti b nel produrre Ab verso queste proteine.
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Immunologia - Lezione 8 05.04.2013 - Prof. Novelli

PRESENTAZIONE DEI PEPTIDI


I linfociti T per poter riconoscere i peptidi hanno bisogno di interagire con molecole MHC I e II.
Tutte le cellule del nostro organismo presentano sulla membrana MHC I con peptidi endogeni, ma che
possono anche essere esogeni. La stessa cosa avviene sulla membrana di Cellule presentanti l'antigene APC
che montano su MHC II peptidi esogeni, ma che possono essere anche endogeni.

PRESENTAZIONE PEPTIDI ENDOGENI
Il legame tra MHC e i peptidi avviene all'interno della cellula.
Una cellula possiede circa 10 milioni di ribosomi che lavorano continuamente e sintetizzano moltissime
proteine, circa 10 milioni di proteine al minuto.
Spesso succede che le proteine fallate o in eccesso o rimpiazzate sono targhettate per essere eliminate:
vengono legate a una molecola chiamata ubiquitina, molto diffusa nel citoplasma. Tutte le proteine che
devono essere eliminate sono ubiquitinate.
La proteina nello stato di ubiquitinazione perde la struttura terziaria, si srotola e questo stimola l'attivit
peptidasica di una struttura deputata alla demolizione di queste proteine detta proteosoma. Il principale
costituente del proteosoma quello chiamato 20S, un cilindro cavo che consiste di 4 anelli formati da 7
unit codificate da geni diversi. Il lume del cavo di 13 Armstrong e attraverso di esso passano le proteine
srotolate: quindi si ha l'attivit peptidasica che taglia le proteine in peptidi pi piccoli.
Le proteine si trovano libere nel citoplasma o possono provenire da vacuoli di fagocitosi da cui sono riuscite
ad uscire. fondamentale che le proteine abbiano perso la loro struttura terziaria affinch possano inserirsi
nel proteosoma, inoltre quest'ultimo contiene dei siti per il riconoscimento e il legame dell'ubiquitina.
Nel corso della risposta immunitaria vengono prodotte delle citochine, la pi importante IFNgamma la cui
presenza, agendo a livello genico, modifica la composizione del proteosoma. Il proteosoma modulato
soprattutto a livello delle parti regolatorie: aumenta infatti l'espressione di due unit costituenti il
proteasoma 20S, LMP2 e LMP7, che normalmente sarebbero espresse a bassissimo livello. Il fatto che ci
siano molte di queste unit comporta il cambio delle caratteristiche dei peptidi prodotti quando le proteine
si ingolfano nel proteosoma, cio diventano dei peptidi con molti residui idrofobici e basici che sono pi
adatti a legarsi alle molecole MHC I. Ci avviene solo in presenza di citochine infiammatorie e IFNgamma.
I geni delle due unit sono parte del complesso HLA, si trovano in mezzo ai geni per le molecole delle
subunit di classe II. I geni LMP2 e LMP7 sono polimorfici, ognuno ha un pattern diverso, quindi ognuno di
noi apporta tagli dei peptidi leggermente diversi rispetto chi ha un locus genico con un diverso allele, perci
questo un altro fattore che aumenta il polimorfismo e la capacit di rispondere a peptidi diversi nella
popolazione.
Non tutti i peptidi generati dall'azione peptidasica si legano a MHC I, infatti dal proteosoma escono peptidi
di 15 aa che nel citoplasma sono rapidamente degradati da aminopeptidasi. Solo lo 0,1% dei peptidi si
salva da questa azione e vengono trasportati nell'endoplasma del RE grazie a due proteine dette TAP
(Transporter associated with antigen processing) che
attraversano la membrana del RE. Con l'IFNgamma aumenta
il numero di peptidi con queste caratteristiche.
Le TAP sono eterodimeri formati da TAP1 e TAP2 i cui geni
sono sul gene HLA e sono polimorfici, per cui ciascuno di noi
ha TAP leggermente diverse e questo varia ulteriormente il
numero di peptidi che ciascuno di noi associa alle HLA.
TAP1 e TAP2 fanno parte dell'HLA di classe II, come LMP2 e
LMP7, e si trovano vicino ai geni che codificano per le catene
alfa e Beta di classe II. I peptidi, caricati da queste proteine
TAP, si trovano nel RE dove ci sono le proteine HLA che
vengono neosintetizzate e avranno quindi la chance di
incontrare MHC I.
Le TAP hanno la capacit di traslocare circa 20000 peptidi al
minuto dentro al reticolo.
Nel RE sono sintetizzati da 10 a 100 MHC I al minuto.

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Immunologia - Lezione 8 05.04.2013 - Prof. Novelli


MHC I necessita della Beta2-microglobulina che al momento della sintesi non immediatamente associata,
vi invece una chaperonina detta calnexina che accompagna l MHC I finch non acquisisce la formazione
definitiva con l'arrivo della Beta2-microglobulina.
Quando avviene il complesso esso non stabile (manca ancora il peptide), quindi per mantenere la stabilit
intervengono altre due proteine chaperonine: tapasina e calreticulina.
Infine il peptide raggiunge la tasca e la lega, le due proteine possono dissociarsi dal complesso che pronto
per essere portato sulla membrana cellulare grazie a vescicole.
Ogni cellula del nostro organismo sar ricoperta da 10000 molecole MHC con 10000 diversi peptidi self, se
si genera un'infezione virale o batterica questi peptidi sono spiazzati da peptidi esogeni e si genera la
risposta immunitaria.



PRESENTAZIONE PEPTIDI FAGOCITATI
Vi sono cellule specializzate a fagocitare, le strutture fagocitate finiscono su MHC II.
Questa presentazione avviene incrociando due percorsi: formazione di vescicole di fagocitosi e sintesi di
MHC II nel RE.
All'inizio vi l'internalizzazione di strutture fagocitate, si formano dei lisosomi con enzimi che cominciano a
digerire la proteina e vengono generati peptidi. La digestione limitata da Heat Shot Protein, in particolar
modo Hsp 70. Alla fine si formano dei peptidi con una lunghezza dai 10 agli 80 aa.



Parallelamente vi la via di sintesi di MHC II, dal RE vanno al Post Golgi dove si hanno le associazioni di
catena Alfa e Beta tra loro a formare MHC II.
Nel RE si sono anche le MHC I che hanno legato il peptide: per evitare che i peptidi di classe I vadano su
MHC II c' una proteina detta catena invariante che tappa le MHC II impedendo il legame; anche nel post
Golgi troviamo la catena invariante che oltre al tappo presenta una serpentina avvolgente.
Le due catena Alfa e Beta sono sintetizzate indipendentemente e poi unite formare eterodimeri. In verit la
catena invariante lega insieme tre molecole MHC II.

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Le vescicole del post Golgi possono fondersi con le vescicole lisosomiali e incontrare i peptidi demoliti
derivanti dalla fagocitosi.
Le vescicole del post Golgi si muovono su microtubuli grazie a dineina e kinesina, durante il viaggio vi sono
delle proteasi (catepsine) che digeriscono la catena invariante lasciando solo il tappo o clip. Dopo l'unione
delle due vescicole, il clip salta e i pepidi possono alloggiare ed essere esposti sulla membrana cellulare.
Mentre MHC II ancora associato a clip ad esso si associano anche le molecole DM che fanno parte della
classe II, ma non sono espresse nella membrana: restano nel citoplasma e hanno un ruolo nel formare le
MHC II definitive. DM si associa a MHC II (che potr essere DP, DQ, DR) e regola lo scambio tra clip e
peptide siccome dopo la fusione cala il pH nella vescicola: ci comporta una modificazione spaziale di DM
che a sua volta favorisce la modificazione della conformazione di MHC II cosicch clip sfugge e l'antigene ha
la chance di legarsi al suo posto.
Oltre a DM si associa anche DO, facente parte della classe II, quest'ultimo favorisce ancora di pi questo
fenomeno.
Sulla membrana troviamo esclusivamente MHC II associate a peptidi.


Per capire quali debbano essere le caratteristiche dei peptidi affinch siano sulle HLA, alcuni immunologi
hanno staccato i peptidi dalle tasche attraverso l'acido tricloroacetico: si osservato che peptidi staccati da
MHC I erano lunghi 8-10 aa mentre quelli staccati da MHC II erano di 12-20 aa.
Di questi peptidi anche stata studiata la sequenza aminoacidica ed stato osservato che esistono delle
regole per cui ad ogni HLA possibile staccare peptidi con sequenze diverse, ma con uguali aa in posizioni
fisse dette siti di ancoraggio. Questi aa servono per potersi alloggiare sullHLA. I siti di ancoraggio sono
diversi per i diversi alleli di HLA.



Il legame perci tra HLA e peptide dipende da forze deboli e dalla
complementariet tra il peptide e la tasca.
Ogni allele pu legare circa 1000 peptidi, ma i siti di ancoraggio
sono sempre molto specifici. C una competizione tra i peptidi
con caratteristiche comuni per la stessa tasca.
Mentre il legame TCR-peptide specifico, la tasca dell'HLA pi
promiscua e pu legare pi peptidi.
Le proteine nel citoplasma sono quelle degradate nel proteosoma
e dalle peptidasi e i peptidi derivanti sono presentati tutti si MHC
I, mentre le proteine endocitate sono presentate su MHC II.
Questo significa che tutte le proteine endogene vanno su MHC I e viste dai linfociti CD8 mentre le proteine
esogene vanno su MHC II e sono viste dai linfociti CD4.
Esiste un'eccezione a questa regola nelle cellule specializzate dendritiche, esiste infatti un canale (Sec61)
nel fagosoma che fa uscire alcune proteine fagocitate che escono nel citoplasma e possono venir caricate
su MHC I. questo fenomeno chiamato cross presentazione e permette di generare linfociti citotossici nei
confronti di proteine derivanti da fagocitosi. un meccanismo importante per avere risposte a proteine che

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derivano da cellule tumorali andate in apoptosi: si formano cos linfociti citotossici nei confronti di antigeni
derivanti da cellule tumorali.

PEPTIDI DOMINANTI
La tasca pu alloggiare 1000 peptidi diversi perci il legame permissivo e promiscuo, potendo legare
molti peptidi diversi esiste una competizione di tipo darwiniano per potersi legare.
I peptidi che riescono a legarsi meglio son definiti peptidi dominanti. Il peptide dominante vince perch
pi numeroso, perci ha maggiori possibilit di legarsi, oppure perch pi affine dal punto di vista
chimico, cio pi complementare alla tasca.
Nel corso di uninfezione virale il virus produce delle proteine e si formano dei peptidi a una concentrazione
tale da vincere la competizione con i peptidi endogeni per entrare nelle tasche: sar poi il pi affine tra
questi peptidi a guidare la risposta immunitaria.
Normalmente sono distrutte milioni di proteine al minuto nella cellula e a queste corrispondono milioni di
peptidi che vengono demoliti e competono per circa 100.000 tasche dell'HLA sulla superficie della cellula.
Il linfocita T pu attivarsi se almeno 1000 tasche con lo stesso peptide sono in interazione multipla con il
TCR. Nella maggior parte dei casi questo numero minimo non viene raggiunto, quindi non si raggiunge la
soglia di attivazione e accade una situazione definita ignoranza immunitaria: il peptide esiste ed
espresso, ma non riconosciuto su 1000 tasche, perci viene ignorato dal sistema immunitario. Questa
situazione pu essere superata aumentando le tasche con segnali citochinici. Ci responsabile dello
scatenarsi di malattie autoimmuni rivolte a peptidi self, normalmente ignorati dai linfociti, che per sono
riconosciuti nel caso sia scatenata una risposta immunitaria (per esempio con influenza) che attraverso le
citochine fa aumentare le MHC I quindi il peptide viene visto e si innescano questi tipi di malattie.
Normalmente le MHC presentano peptidi autologhi verso cui noi siamo tolleranti, i peptidi non self
competono con i peptidi autologhi e questo avviene sostanzialmente per le MHC I espresse su tutte le
cellule dell'organismo; esiste un vantaggio dal fatto che l'espressione di classe II sia selettiva infatti vi una
limitata espressione di peptidi self e questo riduce il rischio di autoimmunit (elevato invece per le MHC I).

CROSS PRESENTAZIONE
Le cellule degli organi normalmente, pur presentando MHC con peptidi, non sono in grado di attivare i
linfociti T vergini siccome non c' la co-stimolazione.
L'organo viene riconosciuto e rigettato nei trapianti d'organo perch vi stata una cross presentation:
durante il trapianto, durante la chirurgia, vi necrosi di cellule che sono fagocitate dalle APC portate nel
linfonodo e, attraverso la fagocitosi, gli antigeni di questo trapianto sono esposti su MHC I (invece di essere
esposti su MHC II) e si generano linfociti T citotossici che provocano il rigetto di questi organi.
possibile che l'MHC dell'organo sia visto come non self, ma non abbiamo il co-stimolo. Solamente le
cellule dendritiche e le cellule APC professioniste possono dialogare con il linfocita T vergine e questo
meccanismo sempre mediato dalla cross presentation.

RESTRIZIONE MHC
Non mai possibile che il TCR riconosca il peptide senza l'HLA: senza l'HLA giusto il linfocita non si attiva
anche se in grado di riconoscere quel peptide.
Lo stesso peptide pu essere presentato da alleli HLA diversi in maniera differente ed comunque
riconosciuto da TCR: esiste un concetto definito restrizione MHC, ovvero il riconoscimento da parte del
linfocita ristretto dall'MHC.
Questo concetto stato spiegato da due immunologi, Doherty e Zinkernagel, essi avevano fatto degli
esperimenti per spiegare ci e avevano dimostrato, senza conoscere ancora il TCR e conoscendo poco
sull'MHC, che il riconoscimento di una cellula T avviene con un recettore che riconosce
contemporaneamente l'antigene del trapianto MHC e l'antigene peptide.
Essi si sono accorti che infettando, con un determinato ceppo, un topolino con un background genetico di
un certo tipo e provocando l'infezione si generava la risposta memoria. Se usavano lo stesso ceppo in un
altro topolino con un altro background genetico (diverso HLA) non si otteneva nessuna risposta: si aveva
una protezione contro il virus solo se era usato il topolino con lo stesso HLA con lo stesso peptide virale.

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Sulla basi di questi esperimenti, fecero un modello corretto anche quando fu chiaro come fosse costituito
l'MHC e come l'MHC interagisse con il peptide: fu cos chiaro il concetto di restrizione, ovvero il linfocita T
non pu riconoscere alcun peptide al di fuori di questa interazione con lHLA.
Questo semplice concetto ha avuto un'importante ricaduta per l'immunologia, la vaccinologia e altre
applicazioni mediche.
Il TCR ha nella parte variabile sia sequenze che mediano l'interazione sia con l'MHC sia con il peptide, ed
necessaria la complementariet sia nelle regioni pi esterne CDR1 e CDR2 con l'MHC sia la
complementariet con il peptide nella regione chiamata CDR3 (zone in cui risiede la maggiore variabilit del
TCR).
Legame peptide-HLA: permissivo
Legame HLA+peptide-TCR: selettivo
Maggiore la complementariet maggiore l'affinit e quindi l'attivazione.
Se manca la complementarit tra le regioni CDR1 e CDR2 del TCR con lHLA o della regione CDR3 con il
peptide il TCR non si pu legare ed il linfocita non si attiva.

L'affinit minima del TCR verso questo complesso di circa Kd=0.00001 M [Kd=costante di dissociazione],
questa deve essere moltiplicata per il numero di TCR che si possono legare e si ottiene l'avidit.

Ricapitolando: quando arriva l'antigene avvengono una serie di segnali che iniziano il meccanismo
dell'attivazione e della reattivit naturale come coagulazione del sangue, attivazione del complemento,
innesco delle molecole e cellule dell'immunit cellulare, attivazione delle produzione di citochine.
Tutti questi processi, guidati dall'interazione con il TLR, portano alla fagocitosi del microrganismo che
arrivato e all'intervento di cellule APC, soprattutto le cellule dendritiche, che migrano nei linfonodi e nei
MALT e i GAT dove avviene l'interazione con i linfociti T specifici, viene riconosciuto il TCR, si attiva la co-
stimolazione e si attiva il linfocita T.
Dopo l'attivazione dei linfociti T vi l'attivazione dei linfociti B che sono in grado di captare l'antigene nella
forma primitiva con un recettore specifico, hanno anche la capacit di cooperare con i linfociti T attivati e
innescano il fenomeno della differenziazione delle cellule B in plasmacellule responsabili della liberazione di
anticorpi.


FUNZIONI EFFETTRICI DEI LINFOCITI T
I linfociti T CD3+ sono divisibili in due categorie: helper (Th) e killer (Tk).
I killer hanno capacit di uccidere, possiedono il CD8 e interagiscono con MHC I.
Gli helper hanno la capacit di aiutare i linfociti B a produrre anticorpi contro proteine, inoltre mediano
l'infiammazione attraverso le citochine e sono CD4+.

Linfociti Th
Esistono almeno tre tipi diversi di Th: Th1, Th2, Th17, diversi solo per alcune sfumature, perci simili, ma
con compiti diversi nella risposta immunitaria.
Agli inizi degli anni 80 fu dimostrato che i linfociti CD4 potevano essere divisi in Th1 e Th2 in base alla
produzione delle loro citochine, i Th1 soprattutto IFNgamma e i Th2 IL-4.
Questi due tipi di linfociti CD4 svolgono funzioni differenti perch esprimono fattori trascrizionali
caratteristici:
- Tbet per Th1
- GATA3 per Th2.

La terza categoria Th17, scoperta pi recentemente, chiamata cos perch produce un citochina chiamata
IL-17 e sono caratterizzati per l'espressione di un fattore trascrizionale detto RORgammaT.

Queste cellule possiedono recettori caratteristici a seconda della categoria.

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CARATTERISTICHE GENERALI:
- TH1: Esprimono il recettore per IL-12 (IL-12R), importante perch IL-12 sintetizzata dalle cellule
dendritiche e quando lega il recettore induce la produzione dell'IFNgamma. Con l'IFNgamma vengono
prodotte anche la LinfoTossina- alfa (LT-), il fattore che stimola le colonie di macrofagi (GM-CSF) e l'IL-12.
Producendo queste citochine dispongono la risposta immunitaria in una determinata maniera.
L'IFNgamma attiva i macrofagi affinch producano ROS per aggredire ad esempio i micobatteri della
tubercolosi che vivono all'interno dei macrofagi [alcuni bambini nascono senza recettori per l'IL-12 e per
l'IFNgamma, quindi si ammalano, a 3 anni, di un micobatterio qualsiasi, in maniera cronica e spesso
muoiono perch non ci sono cure antibiotiche che possono salvarli, forse solo il trapianto di midollo].

- TH2: sono importanti perch hanno un recettore per l'IL-4 (IL-4R), la stessa IL che producono, inoltre
producono IL-5, IL-10 e IL-13 che sono conosciute come citochine antinfiammatorie che bloccano la
risposta infiammatoria e antagonizzano ad esempio l'azione dell'IFNgamma: possono quindi bloccare la
risposta di Th1 e sono inoltre coinvolte in alcuni fenomeni come l'allergia (IL-4 la tipica citochina che
agisce sui linfociti B per la produzione di anticorpi IgE responsabili dei fenomeni allergici e dell'anafilassi).
IL-5 induce il reclutamento di eosinofili a livello intestinale ad esempio se siamo infestati dalla tenia, la
risposta di Th2 fa produrre IL-5 che richiama nell'intestino un elevato numero di eosinofili che producono
istamina che fa contrarre la muscolatura liscia e cos espelliamo il verme solitario.

- TH17: sono responsivi alla IL-23 (posseggono IL-23R) e sono potenti produttori di citochine pro
infiammatorie come IL-17, presente nell'isoforme A e F, IL-6 e il TNFalfa.
QuestI linfociti sono importanti nelle risposte ai funghi: il fatto che inducano risposte infiammatorie cos
spiccate fa si che siano pericolosi per la nostra salute infatti molte malattie autoimmuni sono mediate da
un'esasperata attivazione di questi linfociti.
I Th 17 sono critici per innescare le fasi attive della sclerosi multipla: in pazienti con sclerosi multipla in fase
attiva (con linfociti che aggrediscono il tessuto nervoso) la quantit di linfociti Th17 drammaticamente
aumentata nel sangue periferico e nel liquor.



TH1
Il linfocita T quando vede l'antigene tramite il suo TCR pu, attraverso la produzione di IFNgamma,
produrre a sua volta IFNgamma, usarlo quindi in maniera autocrina e pu dare luogo ad un Th1.
L'IFNgamma facilita:
- la proliferazione e differenziazione dei linfociti CD8: se abbiamo uninfezione virale e sono
necessari dei linfociti CD8 l'IFNgamma aiuta questo processo;
- lattivazione dei macrofagi e delle cellule endoteliali facendo aumentare lespressione di molecole
di adesione che favoriscono il reclutamento di granulociti agli endoteli e la loro extravasazione
dove sono necessari;
- la stabilizzazione dei linfociti Th1;
- lamplificazione dellattivazione delle cellule NK.

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I linfociti Th1 sono importanti per la resistenza ai patogeni endocellulari (micobatterio della lebbra, della
TBC, la Leishmania major) che per sopravvivere e riprodursi devono essere fagocitati entrando nei vacuoli
di fagocitosi: se la risposta a questi patogeni non mediata da Th1 e IFNgamma non efficace.
I Th1 sono responsabili dell'ipersensibilita ritardata cio tutti i meccanismi cellulari mediati dai linfociti T
che richiedono del tempo per mettersi in moto come, ad esempio, il rigetto dei trapianti.

Se i Th1 sono prodotti esageratamente possono esserci infiammazioni croniche che possono portare a
sindromi autoimmuni o allergiche.

Un deficit di Th1 porta una deficienza di risposta agli antigeni intercellulari: tutti gli individui con deficienze
di produzione di IFNgamma, ricezione di IL-12, mutazioni a carico dei geni responsabili della trasduzione del
segnale di IFNgamma, come STAT1, sono esposti a infezione sistemica da micobatteri. Senza queste
citochine non si forma neanche il granuloma, una struttura formata da macrofagi, istiociti e linfociti T che
localizza l'infezione da parte di micobatteri nei tessuti il micobatterio pu raggiungere i tessuti nervosi e
uccidere questi individui.

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Immunologialezionen910/04/2013Assistente

Ora conosceremo meglio i linfociti T dal punto di vista della maturazione e delle loro funzioni effettrici.
VedremosialamaturazioneedildifferenziamentodeilinfocitiThelper(sonoiCD4)chelamaturazioneed
ildifferenziamentodeilinfocitiTkillerocitotossici.

THELPER(CD4+)

Esistonoinrealtpisottopopolazionidiquantevenesianoquimostrate,malemegliocaratterizzatesono
leTh1eleTh2perchsonostateleprimeadesserescoperteequindicisonostatipianniadisposizione
perillorostudio.Gida6o7annistatadescrittaunaterzapopolazionecostituitadailinfocitiTh17che
sonomoltoimportantiperchsonospessoassociatiareazioniautoimmunitarie.
Ciascunapopolazionecaratterizzatadaunsetdicitochinechevengonosecreteinmanieraspecificadalla
singolapopolazione:

Th1secernonoIFN,GMCSF,linfotossina(LT)eIL2
Th2secernonoIL4,IL5,IL13eIL10
Th17secernonoprincipalmenteIL17(diverseisoforme:eccoperchnellaslidecompaionoIL17A
edIL17F)IL6,cheserveinizialmenteperlalorodifferenziazione,eTNFconcuiespletanodiverse
funzionieffettrici

Ciascunapoianchecaratterizzatadallespressionediunfattoretrascrizionalespecifico:

Th1sonocaratterizzatidallespressionedelfattoreTbetcheresponsabilepoidellatrascrizionedi
geni specifici di questa popolazione e quindi in primis delle citochine che vengono secrete da
questecellule.
Th2 sono caratterizzati dallespressione di GATA3, tant vero che topi knock out per GATA3 non
hanno praticamente risposte Th2, cio non possono differenziare linfociti T in senso Th2. Quindi
nonhannounarispostaguidatadaquestecitochine.TopichenonsonoingradodiprodurreIL12,
fattorecheguidaunpoladifferenziazionediquestapopolazione,hannorisposteTh1moltodeboli
(inrealtnonsonoassenti)edhannopreferenzialmenterisposteTh2.

Tuttiquestiesperimentisuitopiknockoutsonoservitiperdimostrarecheeffettivamentecisono
segnalispecificicheguidanoildifferenziamentoinunsensopiuttostocheinunaltro.
Fino a poco tempo fa si pensava che il differenziamento in una sottopopolazione escludesse
necessariamente il differenziamento nellaltra sottopopolazione. Non cos in realt, soprattutto
perquantoriguardaiTh17eTh22.Sivistochelenuovepopolazionichesistannocaratterizzando
sonomoltoplastichesiainvitrosiainvivo.CisignificachenasconocomeTh17,maproduconoed
hannocaratteristichesimiliperesempioalTh1,infattiTbetunfattoretrascrizionalespecificodei
Th1,maespressoanchedaiTh17.

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Immunologialezionen910/04/2013Assistente

I Th17 nascono come popolazione caratterizzata dallespressione del fattore trascrizionale RORt,
ma, poich lambiente citochinico rimane differenziato in maniera diversa, possono esprimere
ancheilTbetequindinonsoloproduconoIL17,IL6,TNF,mapossonoancheprodurreIFN.

Percapiremeglioquestaplasticitanchenellarispostapraticasipuprenderecomeesempiolarisposta
allamalaria:nelleprimefasidellinfezionelindividuomontaunarispostaTh1perchilinfocitiTh1,tramite
laproduzionediIFN,tengonosottocontrollolinfezione;fannoscheilparassitanonsiespandaanchealle
celluleadiacenti.Dopocircaunasettimana/10giorniiTh1,attivandoimacrofagielecelluleNK,spengono
unpolarispostaTh1;ilparassitapassanellafaseextracellulareelindividuomontaunarispostaTh2.

Vediamomeglioneldettagliolesottopopolazioni:

o TH1

SonolinfocitiCD4+.
Riconoscono con il loro recettore il complesso peptiderecettore MHC II e si ha lattivazione di questo
linfocita naif in senso Th1 perch gli stimoli (ovvero i patogeni) che vengono a contatto con la cellula
presentante, inducono la cellula presentante ad esprimere determinate molecole in superficie ed a
secernere citochine che fanno s che il linfocita T, che riconosce tramite il suo TCR il complesso peptide
MHC,iniziadifferenziarsiinsensoTh1.
Lecitochinechelacellulapresentantevieneindottaasecerneresono:

IFN,
IL2(serveasostenerelapropriaproliferazione)
Linfotossine
GMCSF(perattivareilinfocitiTcitotossiciCD8+edattivareimacrofagielecelluleNK).

Itipidipatogenicheinduconoquestadifferenziazionesonointracellulariesonocaptatiefagocitatidalle
cellulepresentanti.LeinduconoadesporreinmembranadeterminatemolecolecomeilCD40,ilB7(quindi
molecolecostimolatorie)eligandidellafamigliadelrecettoreNotch.
InquestocasoilligandoDeltasilegaalrecettoreNotchsuilinfocitiTevieneprodottaIL12(NB:ilrecettore
perlIL12specificatamenteespressosullepopolazioniTh1)equandoillinfocitaTnaifconilsuorecettore
ingaggiailcomplessoMHCpeptideespostodaquestacellulapresentante(quindisiformaunasinapsiper
cuituttelemolecolediadesionecomincianoadassemblarsipermanteneresaldoilcontattoedaumentare
iltempodiattivazione)icontattitra:

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Immunologialezionen910/04/2013Assistente

CD40ligandoeCD40
B7eCD28
DeltaeNotch

fannoaumentarelatrascrizionediTbetcheilprimopassaggioperildifferenziamentodiunlinfocitaTnaif
aTh1.

IllinfocitaTcosattivato,oltreaproliferare,incominciaaprodurreIFN,IL2eGMCSFchesononecessarie
persostenereanchelaproliferazioneedildifferenziamentodeilinfocitiTkiller(ocitotossici)elattivazione
deimacrofagiedellecelluleNK.
Lo stimolo esterno (il patogeno) condiziona la cellula presentante e questultima, in parte condizionata,
determina il differenziamento del T helper. Un altro tipo di patogeno condiziona diversamente la cellula
dendriticaedabbiamoildifferenziamentoinlinfocitiTh2.

ATTIVAZIONEDEIMACROFAGIEDELLECELLULENKDAPARTEDIINFELINFOTOSSINAPRODOTTIDAITH1
LIFN fa aumentare le molecole di MHC I e II sulla superficiedelle cellule presentanti.I macrofagi che si
trovano in questo microambiente in cui viene prodotto tanto IFN esporranno pi molecole HLA in
membrana,quindipotrannopresentarepipeptidiailinfocitichestannoaccorrendoequestoutilenel
sitodiinfezione.InpifaaumentareilrecettoreperleC(quellechequisonobarretteblu).
Unanticorpo costituito dalle catene pesantiedallecateneleggere.Le catenepesantihannopidi una
porzione costante ed il sottotipo si chiama C. Il recettore per questa porzione espresso sulle cellule
macrofagiche e sulle cellule NK ed importante per mediare lADCC, cio la citotossicit anticorpo
dipendente.
QuindilIFNaumentalacapacitdieliminareipatogenidapartedimacrofagiedNKaumentandoADCC.
Chiaramentesononecessariancheglianticorpi,perchavrannoopsonizzatoilpatogenoomegliolecellule
infettate.
ITh1sonoimportanti:

Perlarispostacontropatogeni,batteriintracellulari.
Perch sono in grado di aiutare i linfociti B ad effettuare lo switch isotipico perch possono
aumentarelADCC.

I linfociti B sono deputati al differenziamento delle plasmacellule che sono le grosse cellule produttrici di
anticorpi.Lanticorpopuavereunaporzionecostantedidiversitipi:nelluomoesistonoleIgG,IgA,IgM,
IgEedIgB;delleIgGsihannoalmeno4sottoclassi1,2,3,4.Questediversesottoclassimedianofunzioni
diverseedinparticolarmodoleIgG1eIgG3servonomeglioadopsonizzare,aricoprirelacellulabersaglioo
ilpatogenoriconoscendodelleporzionidelpatogenoodellacellula.Lanticorporiconoscequesteporzioni

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(strutturapicomplessaetridimensionale),coscomeilTCRriconosceilpeptide;quindirivesteilpatogeno
olecelluleinfettate.
Ilmacrofagopuofagocitarelacellulaodeciderepropriodieliminarlainducendocitotossicitanticorpo
dipendente. Esistono quindi diverse classi di anticorpi perch alcuni sono molto bravi ad opsonizzare il
bersaglio,altrisonomoltoefficientinellattivareirecettoriperfarscheilmacrofagononsolofagocitila
cellulabersagliomalainducaamorire,inducalalisisecernendovarienzimicomuniaicitotossici.
ITh1aiutanoilinfocitiBaprodurreanticorpidiquesteduesottoclassi:IgG1eIgG3.
InpilecitochineprodottedaiTh1:

amplificanolaproduzionedellecelluleNK
sonoresponsabilidellereazionidiipersensibilitritardata,cioditipo4

Lereazionidiipersensibilitsonoquellereazionichemedianoleallergieesonodovuteessenzialmentead
allergenioproteineinsolubiliotossineecc...sonodi4tipi(1,2,3,4).Quelleditipo1,2,3sonomediateda
anticorpi,mentrequelladitipo4hannocomeeffettorieresponsabilidiquestereazioniimacrofagiedi
linfocitiditipo1.
ChiaramentequestononvalesoloperilTh1mapertuttelepopolazionilinfocitarie.Senonsonopiche
regolati nella loro attivazione e nel loro spegnimento possono dare origine a reazioni autoimmunitarie o
forti reazioni allergiche come nelle reazioni di ipersensibilit. E necessario che allattivazione a cui segue
proliferazione, quindi espansione clonale, produzione di citochine e liberazione anche di granuli dannosi
perlacellula(neicitotossici),seguaanchelospegnimento.
Lo spegnimento si ha tramite lesposizione in membrana di ligandi che, contattando sempre la cellula
presentantelacellulabersaglio,anzichsegnalareunulterioreattivazionefaschelacellulasispenga,cio
non produca pi citochine, non proliferi pi e ritorni in uno stato quiescente. Il principale ligando in
questioneilCTLA4chelegaB7.Lostessorecettoresullecellulepresentanticheinizialmenteserveinvece
asegnalarelattivazionetramiteCD28.

o TH2



I linfociti Th2 sono caratterizzati dallespressione del fattore trascrizionale GATA3 e dallespressione del
recettoredellIL4;propriolIL4ilprincipalefattorechenesostienedifferenziamentoeproliferazione.Si
pensava che quando il linfocita contatta la cellula presentante, riconosce con TCR il complesso peptide
MHC e, in presenza di IL4, differenziano in Th2 e poi questi incominciano subito a produrre IL4 per
sostenersi.IlfattocheloroproducanosubitoIL4haunposfalsatoleconoscenzenelsensochesipensava
chelIL4fosseilfattoredominanteillorodifferenziamento.Noncosperchlecellulepresentantinon
produconomoltaIL4,quindinonsiriuscivaacapirebenecomefossepossibilechelIL4amediasseilloro
differenziamento. Infatti quando sono diventati disponibili i topi STAT 6 knock out (STAT6 il fattore
trascrizionaleavalledellIL4)sivistochedifattoquestitopinonmancanodiTh2equindisicapitoche

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ci deve essere qualche altro fattore che regola il loro differenziamento. Sicuramente non hanno una
risposta Th2 come i topi wild type (cio come quelli che hanno STAT6) per cui sicuramente lIL4
necessaria per il loro mantenimento ed espansione, ma non sufficiente per il loro differenziamento da
naifaTh2.

FUNZIONEDELLECITOCHINEEFATTORICHEDETERNINANOLADIFFERENZIAZIONEATH2
I Th2 producono: IL4 per il loro sostenimento ed IL5 che serve per mantenere la proliferazione,
lespansioneedildifferenziamentoinsensomaturativodeilinfocitiB.InpisempresuilinfocitiBIL5edIL
10hannolostessoeffettovistoprimadellIFN,ciodeterminanolaproduzionedianticorpi,inparticolare
diIgG4,equindidiunaspecificasottoclasse.GlianticorpiIgG4adifferenzadiquellivistiprimaIgG1eIgG3,
nonsonotantoefficientinellopsonizzare,nonservonoperaumentarelafagocitosidapartedeimacrofagi
del patogeno o della cellula infettata, cos come non attivano sicuramente la citotossicit anticorpo
dipendente.LeIgG4sonomoltoefficacinelneutralizzareparassitidigrossedimensionietossineincircolo,
percuileganoquestetossinespessoemessedaiparassitidepositandolaclearancedeglianticorpialivello
del fegato e del rene. In pi lIL5 molto efficace nellattivare gli eosinofili (sottopopolazione immunit
innata) mentre lIL13 i mastociti, altra popolazione dellimmunit innata. Eosinofili e mastociti sono due
popolazioniimportantinelreagireimmediatamentesoprattuttoalleinfezionidagrossiparassiti.

IpatogenicheattivanoprincipalmenteiTh2sonoextracellulari.

Una cellula presentante che venuta a contatto con i patogeni extracellulari e che quindi ha potuto
fagocitarneparte,presentaipeptidiailinfocitiTnaifchericonosconotramiteillororecettoreilcomplesso
MHCpeptide. In questo caso vediamo che esprime B7 perch deve dare il secondo segnale di
costimolazione,manonsihalespressionedelCD40,quindiTh2nonesprimonoCD40ligandoinsuperficie
perch tanto non gli servirebbe. Essi esprimono un altro ligando della famiglia dei ligandi di Notch che si
chiamaJagged.QuandoNotchlegaJagged,aNotchvienetagliatalacodaintracitoplasmaticacheinquesto
modo pu traslocare nel nucleo ed attivare la trascrizione del gene dell Il4. A seguire lIL4 viene
immediatamente prodotta ed ecco come i Th2 riescono a sostenere la loro attivazione. Se anche non
prodotta (NB: ricordate limmagine di prima in cui era proprio la cellula presentante a produrre lIL12
necessaria per il differenziamento di Th1) in questo caso non abbiamo la produzione di IL4 dalle cellule
presentanti,maselaautoproduconoiTh2inseguitoadattivazioneesiautomantengonoinquestomodo.
InpilecitochineprodottedaiTh2(5,10,13,16)servonoper:

sostenere lattivazione dei linfociti B che presentano anche lMHC II e che quindi possono a loro
voltadiventaredellecellulepresentanti.ConlattivazionedapartedellecitochineprodottedalTh2,
ilinfocitiBmiglioranoilloroassettomolecolareinsuperficieediventanobuonecellulepresentanti
(nellaslideindicatouncontattodellinfocitaBconilsuocomplessoMHCpeptideconilTCRdel
linfocita T naif perch non sufficiente per attivare il linfocita B solo la presenza delle citochine,
infattianchequestodeveavereunminimodicontattoconqualchecellula)
sostenere la proliferazione, lo switch isotipico, il cambio di classe degli anticorpi e fa produrre in
questocasoilIgG4.

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LIFNsefossepresentenellambientequandounBvieneattivatoindurrebbeinvecelaproduzionediIgG1
ed IgG3. In pi migliora lassetto delle molecole di superficie sulle cellule B, quindi esprimono il CD40 e
possono contattare con i propri linfociti. Qui in realt messo sui linfociti Th2 ma serve per contattare
meglioiTh1.

o TH17



Sonostaticaratterizzatirecentementeperchneltoposonoassociatiadunapatologiaautoimmuneche
lencefalomieliteparagonabileallasclerosimultiplanelluomo.
Studiandoitopiknockoutperdiversecitochinepercapirequalipotesseroessereiresponsabilidiquesta
malattia si visto che topi che mancavano del gene per lIL23 sviluppavano proprio in maniera blanda
questaencefalomielite.IL23deveessereimportanteperlosviluppodeglieffettoripernonhaeffettosui
Th1 e nemmeno sui Th2. Si suppose allora che avessero effetto su unaltra popolazione non ancora
determinata.CossonostaticaratterizzatimanmanodeinuovilinfocitiinvitrocheproducevanomoltoIL
17(dacuiilnomeTh17).Sivistocomequestilinfocitipotevanoesseredifferenziatiinvitroinpresenzadi
due citochine importanti: TGF ed IL6. A poco a poco si riusciti a definire i fattori necessari al
differenziamentodiquestapopolazioneedlelorofunzionieffettrici,anchesealmomentolelorofunzioni
sonoancoraabbastanzacontroverseindiversicasicomeperesempioneitumori.
ITh17:
sidifferenzianoinpresenzadiTGFedIL6.
esprimono il recettore della IL23 che importante non tanto perch l IL23 guida di fatto il
differenziamento,quantoperchlIL23serveperlaloroespansioneeperilloromantenimento.
esprimonofattoritrascrizionaliRORtcheessenzialeperindurrelatrascrizionedellIL17.
produconolIL6cheinizialmenteservepermantenerelindifferenziamentochepoinonservepi.
InfattismettonoanchediprodurlaeproduconotantoTNF.
tramiteilTNFpossonoattivareimacrofagi,possonosostenereunpoilinfociticitotossiciequindi
attivanotuttaunaseriedivieinfiammatorie.
sonoimportanticomeTh2nelleliminazioneanchediparassitidigrandidimensioni.

Tuttequestecitochinesonoimportantiperdeterminarelaproduzionedidiverseclassianticorpali.Inrealt
inquestocaso,adifferenzadiTh1eTh2,noncunasottoclassespecificachevieneindotta,madifatto
sembraaumentaresololaproduzione,quindiunavoltacheilBsidifferenziapuprodurrepoidiversitipidi
anticorpi.
NB: gli anticorpi che i linfociti B producono sono dello stesso tipo del loro recettore. Il linfocita B ha un
recettorechemoltosimilealTCR,sichiamaBCRedcostituitoesattamentecomesefosseunanticorpo
(2 catene pesanti, leggere ecc...) che si riarrangiano in maniera molto simile al TCR, per cui noi abbiamo,
esattamentecomeabbiamoTconrepertoriodiTCRaltissimo,ancheBconunrepertoriodiBCRaltissimo

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perchdobbiamoriconoscereunamareadieventualipatogeni.ComeperilTCR,ancheilBesprimeunsolo
tipodirecettorechehaquesteporzionicostantiinizialmentenellostadioimmaturotutteuguali.Quelloche
cambia solo la porzione variabile come nel TCR. Quando poi il B riconosce e si attiva e va incontro a
proliferazioneclonaleecc...aduncertopuntomaturainplasmacellula,quindidiventaunacelluladeputata
esclusivamenteallaproduzionedianticorpi.

Perdiventareplasmacelluladeve:

1. essersiattivatoriconoscendounpatogeno
2. avereavutoilcostimolodapartedeilinfocitiThelper

Per costimolo non si intende solo CD40 ligandoCD40, ma si intende proprio la presenza di citochine che
guidano questo scambio isotipico per cui un linfocita B con un determinato BCR diventer una
plasmacellulachepuprodurre:IgA,IgE,IgM(sonoquellipiimmaturiperchnormalmentesonoGoM),
oppure tutte le sottoclassi di IgG > 1, 2, 3, 4 (queste sottoclassi sono tutte mediate dalla presenza di
diversecitochinespecifiche).

NeilinfocitiBimmaturicisonosottoclassiB(chenonvengonopraticamentesecrete),maturandodiventano
M, quando maturano sempre di pi hanno M e perdono il B, quando maturano ancora e incontrano
lantigene con questo recettore, in presenza di Thelper e di citochine secrete questo recettore ha la
porzionecostantedelleIgMpucambiareediventareIgGdituttiitipiopudiventareIgAodIgEaseconda
delpatogenochehaincontrato.Asecondadelpatogenolenostrecellulepresentantidiventanodiversee
guidano il differenziamento anche dei nostri linfociti Thelper che sono s linfociti CD4+, ma possono
diventareTh1,Th2,Th17,Th9,Th22ecc...



PERRIASSUMERE:comesidiventaunlinfocitaTh1eTh2?Unlinfocitaverginenondifferenziatocheperha
giilsuoTCRespostopudiventareTh1,Th17,Th2indiversimodi.Quandolorganismovieneacontatto
con patogeni intracellulari e quindi le nostre sottopopolazioni di cellule presentanti lantigene o
dendriticheproduconoIL12,espongonotantoCD40eabbiamoildifferenziamentoinTh1;quandoinvece
inpresenzadipatogeniextracellularielenostrecelluledendriticheesprimonoinparticolarmodoJagged
sullaloromembranaeabbiamoildifferenziamentoinsensoTh2(lacostimolazioneB7csempresiaper
Th1cheperTh2).Sipensainoltrecheanchelaquantitdiantigenedeterminiundifferenziamentoinun
senso o in un altro (sono per ancora dati controversi): una grossa quantit di antigene sembrerebbe
influenzaredipiocomunqueindurreildifferenziamentoinTh1,mentreanchebassequantitdellostesso
antigenesarebbeingradodisostenereildifferenziamentoinsensoTh2.

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In presenza di TGF ed IL6 invece abbiamo il differenziamento del linfocita T naif in senso Th17 e quindi
produrrIL17cheesprimerIL23.

In questa slide si vedono patogeni che arrivano: un neutrofilo in alto, un macrofago ed una cellula
dendriticachepossonofagocitareodessereinfettate.InseguitoafagocitosiproduconoIL12;lIL12guida
ildifferenziamentoinsensoTh1eattivaanchelaproliferazionedellecelluleNKchesiattivanoediventano
effettricigrazieallaproduzionediIFNeTNFprodottodaiTh1.



In presenza di patogeni extracellulari come grossi parassiti e vermi, le cellule fagocitiche captano
frammenti, esprimono sempre B7, quindi molecole di costimolazione in superficie, ma in questo caso il
ligando Jagged (non delta!) ed allora sono in grado di guidare il differenziamento del linfocita T naif in

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sensoTh2perchinducelatrascrizionedelgenedellIL4equindiquestofasostenerelaproliferazionedei
TH2.



PERRIASSUMERE:stimolidiversi,quindipatogeniintraoextracellulari,celluletumoraliecc...dannosegnali
diversiallecellulepresentanti,induconolegamidiNotchconDeltaoJaggedoppuremoltoCD40.
Delta e CD40 sono indotti dallattivazione del Tolllike receptor. Il Tolllike receptor riconosce DNA, RNA,
porzionilipidiche,glicosidichedibatteriecc...sonotendenzialmenteappartenentiadeibatteri,mapossono
ancheessereDNAedRNAself;secDNAselfedRNAselfincircoloperchlacellulaevidentemente
andata in necrosi. Quindi stimoli che attivano i Tolllike receptor inducono delta e CD40. Alla fine queste
cellulepresentantifaciliterannoildifferenziamentoinsensoTh1.StimoliinvecechenonattivanoiTolllike
receptor,induconoJaggedinsuperficiee,legandoNotch,fannoschelasuacodaintracitoplasmaticavada
nelnucleoadattivarelatrascrizionedelgenedellIL4.

PRECISAZIONI: topi CD40 knock out montano solo Th2, quindi non hanno il Th1. Si capisce che
essenzialmenteimportanteperguidareildifferenziamentoinsensoTh1.

TKILLER(CD8+)

SonolinfocitiCD8+.
ConsegnalazionedaTolllikereceptor,siaquellisumembranaesternachesullemembranedellevescicole
interne,sihaunacascatadisegnalazionesimilechefaaumentareinparticolarmodoCD40maancheB7.Il
contattoCD40CD40ligandomoltoimportanteesihasoloneiThelperequestalunicadifferenzadai
TkillerchenonhannoilCD40ligando,percuiservirsicuramenteilB7.
Non avendo CD40 ligando come se alla cellula effettivamente presentante mancasse una sorta di
segnalazione.
Nei T citotossici manca questo CD40 ligando per cui la cellula dendritica che presenter gli antigeni ai
citotossicideveessereinqualchemodoautorizzatadaiThelper:ilThelperchericonosceilpMHCII,grazie
alcontattotraCD40ligandoeCD40rendepiattivaquestacelluladendriticachepotrpresentarelMHCI
(gli antigeni) ai linfociti citotossici, che non hanno CD40 ligando, ma grazie allattivazione ricevuta dai
Thelperquestecelluledendritichesidiconoautorizzateapresentaregliantigeniancheaicitotossici.
UnlinfocitaCD8+naif,esattamentecomeilCD4+,perattivarsihabisognodiriconoscereconilsuoTCRil
complessopeptideMHC.MHCsardiclasseIequestocontattofaschesiformiunasortadisinapsi,ossia
induce sia nel linfocita sia nella cellula presentante una sorta di riarrangiamento del citoscheletro che
facilitailriarrangiamentodellesposizionedellemolecoleinsuperficieinunazonabenprecisadicontatto:
sinapsiimmunologica.
Traquestemolecoledisuperficiechevengonoatrovarsiinquestazonadicontattoabbiamononsolole
centinaia di molecole MHC I che servono per attivare in maniera efficiente il nostro T citotossico, ma ci
sonoanchelemolecolediadesione,lemolecoledicostimolazione,quindituttequellemolecolenecessarie
a mantenere il pi a lungo possibile questo contatto e a fornire i segnali secondari di costimolazione ai
linfociti.QuindiillinfocitaTcitotossicoverginericonosceeformalasinapsi;lasinapsisiformaperuncerto
periodosoloseilTCRquellospecificoperilcomplesso.Conlaformazionedellasinapsielattivazionedel

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linfocitaTvergineabbiamolespansioneclonaleconlaformazionediuncloneprecitotossico(preCTL)che
in presenza e delle sostanze secrete si arricchiscono di granuli. Quindi quando un linfocita T killer naif
incontra l MHC I con il suo antigene, d origine a cloni di preCTL che poi in presenza di varie citochine
prodottedaThdivariotipoodallecellulepresentantilantigene(APC)siarmanoediventanoCTL.
ITh1:
1. produconoIL2>espansioneclonale:clonepreCTL
2. produconoIFN>armamento:cloneCLT

I CTL hanno allinterno una serie di vescicole precostituite che contengono le loro armi. Quando arriva il
linfocita Tk, gi armato in questo caso, basta il riconoscimento con un solo TCR di un complesso MHC
antigene e si ha degranulazione. Questi granuli contengono sostanze diverse: perforine, granzini, ATP,
mediatori chimici che permettono lingresso nella cellula bersaglio. Si legano al recettore della cellula
bersaglioeneinduconolamorteperapoptosi.

PERFORINE
Le perforine sono proteine (70kDa) che in presenza di calcio si aggregano a formare dei polimeri, quindi
quandoillinfocitaTsiattivaconilBCLnellacascata,sihaanchelamobilitazioneinternadicalcio.Questofa
scheleperforinecontenuteinquestigranulisiuniscanoaformaredellecatenedipoliperforinechesono
rilasciatequandoquestevescicolesifondonoconlamembranaplasmatica;hannolastrutturadelsistema
complemento(delC9>componentedelsistemadelcomplementochehalafunzionediformareunporo
nellamembranaplasmatica).Leffettofinaledellaperforinaquellodicrearenellamembranaplasmatica
dellacellulaesattamenteunporo.
Ilsistemadelcomplementouninsiemedienzimi,proteasiinparticolarmodo,presentinelsierochesi
attivano quando vengono tagliate. Una volta che si attiva la prima perch tagliata, attiva la seconda
tagliandolaegeneraunacascata.SonosiglaticonlaletteraC(C=complemento)seguitadaunnumero.
Questienzimisonoattivatiessenzialmentedalcomplessoanticorpoantigene:lanticorpofermo,stabilefa
scheilcomplementosileghiinC1esiattiviperchvienetagliato.IlC1attiverilC2cheattiverilC3e
cosvia.OgnunoattivandosivienetagliatoinduepartiAeBchehannouneffettochemochinico,rifiutare
dellealtrecellulefagocitarieaopsonizzareibatteri.AllafinequandoC5attivatoattivail6,il7,l8edil9
cheformanoilMaccheunporodiattraccoallamembrana,cheformatodallevariecomponentisulla
membranaedaquifuoriescetuttoilcontenutodellacellula.
Ilcomplementoserveperfareesplodereilpatogenoolacellulainfettata.
LeperforinehannolastessastrutturadelC9epercisonoingradodiformarequestoporosullecellule,
perciilcitotossicofardeibuchisullasuperficiedellacellulabersaglio.

GRANZIMI
Altrecomponentideigranulisonoigranzimichesonodelleproteasi(serineesterasi).Questetaglianotutte
le proteine quando incontrano una sequenza speciale che contenga lamminoacido serina. Quindi
distruggonotutteleproteinecontenutenellacellula.
Il concetto che il citotossico rilascia questi granuli, le perforine fanno i buchi, i granzimi entrano e
cominciano a digerire il contenuto della cellula e possono attivare intanto BAX (nellapoptosi). Sulla
membrana del mitocondrio esistono in forma stabile BCL2 e BCLXL che sono delle proteine
antiapoptotiche. Quando BAX viene espressa perch viene indotto il programma di apoptosi, BAX si
trasferisce sulla membrana dei mitocondri, scalza BCL2 e lo inibisce e quindi si forma il poro sulla
membranadeimitocondri,pufuoriuscireilcitocromocchesiassociaaformarelApoptosoma,datodalle
proteineattivantilapoptosiAPAF,siattivalacaspasi9esicontinuaconilprocessodiapoptosi.
Quindiigranzimi:

sonoingradodiattivareBAX>attivanoilprogrammadimorte
digerisconoleproteina
attivanodelleDNAsi>fannodegradareancheilDNA

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CALRETICULINA
LAcalreticulinaunamolecolaespostainmembranaspessoinseguitoallattivazionedellacascataindotta
dagliIFN1:IFN1(alfaebeta)sonoprodottidallimmunitinnataequindisonoprodottiimmediatamente,
soprattutto in risposta di un infezione virale. Quando si producono interferoni, le cellule epiteliali in
risposta espongono anche in membrana calreticulina e ci rappresenta un meccanismo di difesa perch
inibisceleperforineequindilecelluleepitelialiinqualchemodosiriparanodauneventualelisidapartedi
uncitotossico,soprattuttosenonunacellulainfettata.

SEPRINE
Comelacalreticulinainibisceleperforine,abbiamoancheleserpineinibisconoigranzimi.Sonoprodotte
anche loro dalle cellule epiteliali. E un sistema dellorganismo per difendersi, ma quando non funziona
inibisceilsistemaimmunitarionellespletarelepropriefunzioni.

Ilinfocitikillerpossonoliberareanche:
ATP>unaltramolecolachepuindurrelaformazionedeipori:silegaadunrecettoreespostoin
membranaepuindurrelapoptosi
TNF
LINFOTOSSINA
TRAIL > ligando della famiglia dei TNF, quindi ha un recettore che agisce allo stesso modo del
recettoredelTNF
FASLIGANDO

APOPTOSI:1)VIAINTRINSECA
2)VIAESTRINSECA>LaviaestrinsecaindottadaFASorecettoredelTNF

Tuttelesostanzecontenuteneigranulipreformatineicitotossiciinduconolacellulaamorire.Nellaslidesi
vede il linfocita citotossico gi armato che contatta tramite il singolo TCR il complesso MHCpeptide. La
cellulabersagliopresentainmembranaivarirecettoriperTNF,perilFAS,perATPecc...diventabersaglio
in tutti i sensi del linfocita killer effettore perch tramite lassemblarsi di questi recettori con specifici
ligandiinduconolamortedellacellulainquestione.

MECCANISMIDIUCCISIONEDAPARTEDEILINFOCITIT
TKILLER:>citotossiciperforinodipendente
>citotossiciadespressionediATP,FASL,TNF,TRAIL
THELPER:>citochine(TNFeLINFOTOSSINA)
>attivanomacrofagiegranulociti
>attivanoNKedNKT
>trombizzanovasi:ischemia

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FUNZIONEDELCITOTOSSICO
Riassumiamo la funzione effettrice del nostro citotossico che si trova in uno stato prearmato, quindi
proviene gi da un linfocita T vergine citotossico che stato attivato. Quando viene a contatto con il
bersaglio si forma questa sinapsi anche in periferia, non solo a livello del T naif. Si ha riarrangiamento
citoscheletrico che porta ad avere le molecole di adesione in questa zona, si stabilisce cos il contatto ed
ora, tramite il recettore, il linfocita riconosce la cellula in qualit di bersaglio: si ha quello che viene
chiamatodagliimmunologibaciodellamorte:illinfocitainpochiminutisecernequestigranuliproprio
perchsonogipreformatiallinternodelcitoplasmaoppureesponeinmembranailigandidelFASedel
TRAILedinpochiminutiinducelacellulabersaglioamorire.Illinfocitakillerritornaliberoedingradodi
ucciderenuovecellule.Quindiillinfocitakillerdifattoefficienteperchdegranulacosvelocementeda
eliminarenumerosecellulebersaglioprimadiesaurirsiedandareincontroancheluiadapoptosi.Ilinfociti
killer costituiscono il meccanismo pi importante nella difesa dellorganismo dai microrganismi
microcellulariequestoperchsonoCD8+ericonosconosolocomplessiMHCIequindisolodeipeptidiche
provengonodallinternodellacellula.
Ilinfocitikillersonomeccanismodidifesacontro:patogeniestranei,controlinsorgenzaditrasformazione
neoplastica e contro anche eventuali componenti o cellule che vanno incontro e danno e accumulano
materialedannoso(ancheseself)chenonpossonopiespletarelalorofunzionefisiologicamente.

IlinfocitiThelperedilinfociticitotossicisonoimplicatiin:
guarigionedainfezioniditipobattericoovirale.
rigetto dei trapianti riconoscendo self o non self e cellule mutate dovute a percorsi di
trasformazioneneoplasticaodaqualcheproblemametabolicoodancoradovutoadannoesterno.
attivazionedilinfocitiBelaproduzionedianticorpichesonoaltrieffettoriperguariredainfezioni
edinfiammazione.
regolano le risposte infiammatorie: possono regolare non solo la propria espansione,
differenziamento, larmamento dei citotossici ma regolano anche lattivit di eosinofili, mastociti,
macrofagi,cellulepresentanti,celluleendoteliali.

REGOLAZIONE
Senonsiregolafinementelattivazionedeilinfocitiquestipossonoessereunarmaadoppiotaglioperch
possono indurre reazioni autoimmunitarie. Una volta che sono attivati ucciderebbero qualsiasi cosa che
conosconocomebersaglio,selfoinfettato.
Occorrono delle regolazioni fini che possono essere lespressione di inibitori da parte delle cellule per
difendersiolaregolazionedapartedicellulesoppressoriecomeiTregolatoriolemieloidisoppressorie.

SOPRAVVIVENZA
Per quanto riguarda la sopravvivenza, i CD4+ e CD8+ naif che contattano con il TCR i complessi MHC e
peptide,necessitanodicitochine,inparticolarelIL2elIL7perespandersiesopravvivere.ITCD4+eCD8+
memoria, che derivano dal clone attivato, e incontrano per la seconda volta il complesso MHCpeptide,
necessitano solo di IL7 per sopravvivere e per lattivazione non necessitano neanche di una grande
costimolazione.

LINFOCITIT

Siformanoesattamentecomeglialivellodeltimo.Allostadiofetalevengonoprodottidalfegato,ma
allo stadio prenatale e postnatale i precursori emopoietici passano dal fegato al timo e quindi maturano
neltimodovesihaunriarrangiamentodelTCR(riarrangianolae).
I linfociti T sono i pi abbondantemente prodotti nello stadio prenatale (il timo fetale produce
essenzialmente ), dopodich alla nascita comincia a produrre maggiormente linfociti . Infatti gli
sonolaprincipalepopolazionecircolantementreisonosolo15%deilinfociticircolanti.Questoanche
perch risiedono essenzialmente negli epiteli, infatti vengono spesso definiti linfociti infraepiteliali ed
anchesehannounTCRsimileall,inrealtnonhannolostessopolimorfismodegliedinparticolar

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modo il 6090% dei ha la seguente espressione del recettore: esprime la catena 9 e la catena 2. La
restanteporzioneesprimelacatena9elacatena5.
Igenisonomoltomenodiquelliperlacatena.Inpi,nonessendotantocircolantimaresidentinei
tessuti,comeseilpoolpresenteinunospecificotessutopresentasseancheunospecificoTCR:

92sonoquellipidiffusiinepiteliintestinali
95sononellacute

SembrachetuttiTinunospecificotessutoabbianoilTCRricombinatonellostessomodo.
Arrivano dallo stesso precursore emopoietico dei linfociti e delle cellule NK (quindi nel midollo si avr il
differenziamentoelamaturazionedeiB,neltimolamaturazionedegliematurazionedei).Alivello
timicoquandosihailriarrangiamento,lacatenasiassociaadunacatenaTfittiziagiustoperaverela
primaselezionedelchericonoscalMHC.Questaescludeilriarrangiamentodellealtrecatene.Lastessa
cosaavvienealivellofetale:isonoipiprodottiperchsihariarrangiamentodellacatenachefasche
nonriarrangilaepoila.Sonomutualmenteesclusiviinquestosenso.Gliealivellotimicodiventano
CD4+oCD8+,inveceinonesprimonoCD4,possonoesprimereilCD8informamonomerica.
CD8formatodaduecatenee:ipossonoesprimereCD8alfaalfa.
Sonounpoamettralimmunitinnataedadattativa,nelsensochedifattosonodeilinfocitiT,hannoil
TCRnonaltamentepolimorficocomenelcasodeglichericonosceancheunpoinmanierapromiscuagli
antigeni (assomiglia in questo caso pi ad una cellula dellimmunit innata) e presenta dei recettori che
assomiglianomoltoosonoproprioglistessirecettoricheesprimonoleNK.

Caratteristiche:
derivanodaprecursoritimicicomegli
riarrangianoesattamentecome
sonoCD4CD8negativi,senonCD8alfaalfa
proliferanoalivelloepitelialeenonalivellodeltimo
la trasduzione del TCR di maggiore intensit rispetto a quella , per cui sono effettori pi
efficienti.
rispondonopirapidamente(altracaratteristicacheliaccomunadipiallecelluledellimmunit
innata), ovvero nel giro di 13 giorni al massimo si ha lattivazione del che ha riconosciuto
lantigeneecheespletalepropriefunzioni.PerillinfocitaTnormalmentesononecessaricirca7
giorniperavereespansioneclonaleoildifferenziamentoolarmamentocitotossico.
hannounTCRchenonnecessariamentedevericonoscereilpeptideMHC,mapossonoriconoscere
fosfopeptidi per cui si parla di fosfoantigeni, ma anche di peptidi lipidici e possono riconoscere
ancheilpatogenodirettamenteedattivarsisenzaaverecostimolazioneesattamentecomefarebbe
unacellulaNK.

92ilcloneprincipale,riconosceifosfoantigenichepossonoessereespressidirettamentedaibatterio
essere prodotti in metaboliti, quindi possono essere anche secreti dalle cellule presentanti in seguito a
fagocitazione o dalle cellule epiteliali in seguito a stress metabolico. Laccumulo di fosfoantigene viene
presentato ai linfociti che possono effettuare il riconoscimento e leliminazione della cellula bersaglio
conglistessimeccanismideiTeffettori.

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ImmunologiaLezioneno1016.04.13Novelli

CELLULENK
PossiamocontrollarecosasuccedeallinternodellecelluleconilinfocitiTche,usandoillororecettoreper
lantigene, vengono a contatto con dei peptidi associati allMHC e possono stabilire se questi sono self o
nonself.

Le cellule NK non hanno un recettore proprio per lantigene, ma hanno una predisposizione a uccidere
attraverso un meccanismo naturale, che per pu essere modulato e intensificato dalla risposta
immunitaria. In particolar modo, il problema grosso che le infezioni virali e anche le trasformazioni
neoplastiche possono inibire lespressione delle molecole HLAI. I virus per poter sfuggire alla risposta
immunitariausanodeimeccanismichefannodiminuirelespressionediHLAIsullasuperficiecellulare.La
stessa cosa avviene durante la trasformazione tumorale: spesso le cellule tumorali perdono lespressione
dellHLA di classe I. Perdere lespressione dellHLA di classe I impedisce ai linfociti T di interagire e di
attivare una risposta immunitaria propria. Quindi, quando le molecole MHCI diminuiscono, tutta la
reattivitTdiclasseImessafuorigioco.Ilsistemaimmunitariopossiedeunmeccanismoalternativoper
sorvegliare le cellule infettate: le cellule NK. Queste cellule ci permettono di salvarci quando viene persa
lespressionediMHCIinseguitoadinfezioneviraleoinseguitoallatrasformazioneneoplastica
LecelluleNKsonoingradodisalvarciquandoilsestesso,ciolMHC,perduto.

Concettodelmissingself:inalcunicontestipatologicinoinonsiamopiingradodipresentareailinfociti
il se stesso, lo perdiamo, e quindi abbiamo necessit di un meccanismo alternativo di salvataggio. Il
concetto del se stesso perduto si riferisce appunto alle cellule natural killer e consiste nel fatto che in
alcunesituazionilemolecoleHLAsonoperseoespresseinmanieraincompleta,equindiilselfnonpi
espressoinmanieraappropriatasullacellulabersagliochequindinonpuessereeliminataperesempiodai
linfocitiTCD8+.Nellasituazionedelsestessoperduto,sonopropriolecelluleNKcheentranoingioco.
Sulla superficie cellulare delle cellule NK ci sono dei recettori che, legandosi a molecole di HLAI,
trasmettono dei segnali inibitori. Nel nostro organismo ci sono cellule NK che legano le molecole self e
quandolelegano,lecelluleNKsonoinibitenellaloroattivitkiller.Alcunideiligandiinibitoridellecellule
NK sono proprio delle molecole MHC che, quando diminuiscono sulla superficie cellulare per effetto di
uninfezioneviraleounatrasformazioneneoplastica,sbloccanolattivitdellecelluleNK.Esattamentecon
unmeccanismocontrariocheavvieneperilinfociticheuccidonolegandolMHCI.LecelluleNKnonsolo
esprimonoquestirecettoriinibitori,maesprimonosullasuperficiecellulareanchedeglialtrirecettorichein
generefunzionanoacoppiechehannoancheunafunzioneattivatoria.

LecelluleNKesprimonodeirecettoriacoppiasullasuperficiecellularechehannounacodacitoplasmatica
lunga con sequenze inibitorie o corta con sequenze che trasducono dei segnali che attivano opposte
funzioni.Questirecettori,asecondadellacodachepossiedononellaregioneintracitoplasmaticapossono
esseresiainibitorisiaattivatori:
selunga(consequenzeITIM)>trasmettonosegnaliinibitori
secorta>trasduconosegnalicheattivanofunzioniopposte.

CARATTERISTICHEMORFOLOGICHEEFUNZIONALI
Le cellule NK sono tipiche perch la loro morfologia le ha fatte definire, quando sono state scoperte
allinizio degli anni80, dei linfociti grandi granulari. La loro dimensione piuttosto grande rispetto a dei
linfociti normali e possiedono al loro interno parecchi granuli e vescicole che sono tipiche e le fanno
distinguere dagli altri linfociti. Possiedono i loro precursori nel midollo osseo, e si possono trovare nel
sangue periferico, dove corrispondono a circa il 1015% di tutti i linfociti del sangue periferico;

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rappresentanoun34%deilinfocitichesonopresentinellamilza;hannodellelocalizzazionispontaneenei
polmoni,nelfegato,nelladeciduaeneivilliintestinali.La
loro presenza nei villi intestinali rende evidente che
queste cellule sono importanti anche per il controllo di
tutto quello che arriva dall'esterno attraverso il tratto
gastrointestinale; la loro localizzazione nei polmoni e nel
fegato sottolinea come le cellule NK siano molto
importanti nel controllo delle metastasi tumorali, per la
lorocapacitdiuccidere.Infatti,neimodellisperimentali
con animali da laboratorio, se inoculiamo dei tumori
attraversolaviaendovenosa,itumorisilocalizzanomolto
facilmente nei polmoni e nel fegato, dove danno metastasi. Se eliminiamo le cellule NK e quindi la
possibilitdilimitarel'espansionediquestemetastasi,ilnumerodimetastasiaumentadrammaticamente,
proprioperchlecelluleNKhannounruolomoltoimportantenellalimitarelametastatizzazionedeitessuti
polmonariedepatici.

LacellulaNKnonpossiedelamolecolaCD3,chetrasduce
il segnale dei T cell receptor, non possiede il recettore
delle cellule B e nemmeno quello delle cellule T, ma
possiedeunacaratteristicamolecolachesichiamaCD16,
unamolecolacheilrecettoreperlacatenagammadelle
immunoglobulinediclasseG.QuestamolecolaCD16in
grado di legare delle immunoglobuline di classe G
attraversoilframmentocristallizzabile:inquestamaniera
riescono a ricevere un segnale per cui delle
immunoglobuline che hanno legato un batterio o una
cellulapossonointeragireconlacellulaNKescatenarelalorocapacitdiucciderequellacellulaincrostata
dianticorpiditipoIgG.Questounmeccanismoimportantedicitotossicit.Unaltramolecolatipicadelle
celluleNKCD56,unamolecoladiadesione.
Le cellule NK sono in grado di aderire ad altre cellule, per cui esprimono dei recettori di adesione tipici,
come le integrine, la molecola CD2 che un'altra integrina e il CD56. In questo modo possono aderire ad
altrecelluleescambiarsideisegnaliimportanti.
Sono delle cellule molto responsive alle citochine, infatti esprimono recettori per: IL2, IL12, IL15, IL18
che le fanno attivare, inoltre rispondono anche all'interferone. In genere queste citochine, legando i
recettorisullecelluleNK,lespingonoaprodurremoltealtrecitochineeadiventaremoltocattivenellaloro
capacitkiller.Percilalorofunzionepredominantequelladiuccideree,sesonocontattatedaqueste
citochine,uccidonoinmanieramoltopiefficiente.
REGOLAZIONE
Per la loro capacit naturale di uccidere sono definite cellule natural killer, ma questa loro capacit
regolatadaunaseriedisegnalicheleinibisconooleattivano.Questaattivit,chetendeaessereun'attivit
killer naturale, regolata dal fatto che le cellule contattano delle molecole MHC o contattano delle
molecole bersaglio e tramite questo contatto vengono generati dei segnali inibitori o modulatori. Dal
bilancio di questi segnali si determina il comportamento di queste cellule ed il risultato finale della
propensioneauccidere.

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RECETTORIINIBITORI
I recettori inibitori legano le molecole sulle cellule del
nostroorganismo,trasduconosegnaliinibitoriebloccano
lecelluleNK.
Una prima categoria di recettori inibitori sono quelli che
sono definiti a coda lunga, cio questi recettori
possiedono una porzione intracellulare e una coda
intracitoplasmatica.
Esistonoduegrandifamigliediquestirecettori:

1. La prima famiglia appartiene alla superfamiglia


delle immunoglobuline: possiedono vari domini extracellulari di 99100 aminoacidi, hanno nelle
code intracitoplasmatiche delle sequenze con i residui aminoacidici ITIM, cio quelli basati sulle
tirosine,cheinibisconolarisposta.DuediquestirecettorisonoquellichesonochiamatiKIR,cio
killer Iglike receptor, e ILTs, cio Iglike Transcipts. Quando questi recettori sono stimolati, le
tirosine sono fosforilate in questa coda, reclutano delle fosfatasi che tagliano i sistemi e
defosforilanoletirosinechepotrebberoprovocarel'attivazione.

2. Un'altrafamigliadirecettoriinibitoriquelladelleLectineditipoC:hannounaparteextracellulare
ditipolectinico,cioleganodelleproteineeleganoanchedeglizuccheri,hannounpontedisolfuro
che forma omodimeri, ma hanno code simili a quelli della superfamiglia delle immunoglobuline.
Quando contattano il loro ligando, la tirosina fosforilata, e attiva una fosfatasi inibitoria.
AppartengonoaquestafamigliamolecolecomeCD94,cheprendeancheilnomediNKG2A/B.
Perprovocarequestosegnaleinibitorio,lemolecoleinibitoriericonosconosullecellulebersagliogruppidi
alleli delle glicoproteine HLA di classe IA e IB quindi HLAC, HLAB, HLAA,B,C,D. Tutti questi geni
codificanoperleglicoproteine;alcunidiquestiallelipossonoesserericonosciutidairecettoriinibitori,cos
comelemolecoleHLAE.Ilcontattoconquestiallelipresentisullecelluledelnostroorganismodetermina
un'inibizionediquestirecettori.

Il nostro sistema immunitario possiede delle cellule che, quando si legano ad alleli HLA e vedono il
peptide,siattivanoesonoilinfocitiT.InvecealtrecellulecomelecelluleNKprendonocontattoconlMHC,
elegandoquestemolecole,vengonoinibitenellapropriafunzione.
La cellula bersaglio non uccisa perch quando avviene questa interazione, la cellula natural killer
paralizzata nella sua azione litica. Linterazione con
questi alleli determina la fosforilazione dei domini
ITIM e quindi questo provoca il reclutamento di
fosfatasi (SHP1, SHP2): queste fosfatasi sono in
grado di bloccare e di defosforilare i substrati
fosforilati in tirosina in seguito ad attivazione dei
recettori attivatori; alcuni possiedono dei motivi
ITAMattivatori,quindiaccantoaquestemolecoleci
possonoesseredeirecettoriattivatorichesonostati
attivatiechequindispingonolacellulanaturalkiller
adesercitarelapropriaazionekiller.

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ImotiviITIMnonsonotipiciedesclusividellecellule
NK, ma sono presenti anche in altre molecole come
CTLA4 che una molecola sorella di CD28, ma
mentre CD28 possiede un motivo che trasduce un
segnale attivatore, CTLA4 trasduce un segnale
inibitore, che quindi blocca lattivit dei linfociti T
attivati. Esiste un recettore CD32 che presente
soprattutto nei linfociti B e quando
un'immunoglobulina prodotta contro una proteina
lega questo recettore, viene attivato un recettore
inibitorio che spinge il linfocita B a bloccare la propria attivit ed a non continuare nella produzione di
anticorpi.

RECETTORIATTIVATORI
Glistessimotivimolecolarisonousatidadiversirecettorisudiversitipicellulari.LecelluleNKpossiedono
per anche dei recettori attivatori che non bloccano l'attivit, ma possiedono delle code corte
intracitoplasmatichechescatenanoopromuovonol'attivitkiller.
1. Irecettoriattivatoririconosconoligandi,alcunideiqualinonsonodeltuttoidentificati,macisonodue
tipidirecettori:
1. appartieneallasuperfamigliadelleimmunoglobuline,construtturaadomini,(NKp30,p44,p46)
2. recettoriattivatoriditipolectinicoesattamentecomepergliinibitori.

2. Unaltra categoria di recettori inibitori invece legano le molecole come MICA e MICB, che sono
molecole HLA di classe IB, che sono molecole che sono espresse dalle cellule stressate, tumorali e
dallecelluleinfettatedacitomegalovirus.

A differenza dei recettori inibitori, questi recettori hanno una coda intracitoplasmatica corta e non
possiedonolasequenzaITIM,quindinonsonoingradoditrasdurredirettamenteisegnali.
per tradurre i segnali questi recettori attivatori a coda corta devono associarsi a recettori che
favorisconolatrasmissionedelsegnaleattivatorio.
MICAunamolecolapolimorficapresentesucelluleendoteliali,sucheratinocitiealivellodellamucosa
intestinale; viene iperespressa soprattutto durante la trasformazione tumorale o in seguito a stress;
riconosciutadallecelluleNKedeilinfocitiT.
MICB una molecola abbastanza polimorfica, espressa dalle cellule stressate, alterate, infettate o che
vannoincontroaunatrasformazioneneoplastica;riconosciutadallecelluleNKedeilinfocitiT.
Per esempio, il recettore lectinico attivatorio NK
G2D, lega le molecole MICA e MICB. Quindi,
quandounacellulatumoralecheiperesprimeMICA
e MICB entra in contatto con la cellula NK, questo
recettore pu trasdurre dei segnali di attivazione,
puquindiucciderelacellula,mapertrasmettereil
segnale,avendolacodacortaenonavendoquindila
capacit intrinseca di trasdurre il segnale, usa una
molecolacomeDAP10.DAP10unatipicamolecola
di trasduzione del segnale con una corta porzione
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extracellulareeunalungacodaintracitoplasmaticadoveesistonodeidominichesifosforilanoeleganoun
importantemediatoredell'attivazionecellularechePI3K,chetrasmettesegnalidiattivazioneattraverso
questosistema.Questoportal'attivazionedellalisidapartedellecellulenaturalkiller.

3. Esiste un terzo gruppo di recettori attivatori che sono i recettori che legano gruppi di alleli HLA con
minore affinit dei recettori inibitori e che mancano di coda intracitoplasmatica. Il fatto che questi
recettorileghinoquestigruppidialleliHLAconaffinitminoresignificachecunalottadiaffinittrai
recettoriinibitoriequelliattivatori.Cisonoduetipidirecettori:
1. unofapartedellasuperfamigliadelleimmunoglobuline,comeKIRS
2. un secondo tipo di recettori lectinico, dove la molecola pi importante CD94 che
corrispondeallamolecolaNKG2C.
Quindi questi recettori che hanno un'affinit
leggermenteminorerispettoairecettoriinibitori,legano
HLA IA se sono della superfamiglia delle
immunoglobuline,mentreleganoHLAIEsesonoditipo
lectinico.

LemolecoleDAP12sonousateinmanierasimileanche
da molecole diverse e le code lunghe
intracitoplasmatiche di DAP12 possiedono dei residui
ITAM che attivano una tirosinachinasi come Syk, che
attivalalisicellulare.
RECETTORIATTIVATORIVSINIBITORI
Dalpuntodivistamolecolarelestrutturesonopiuttostosimili:coppiedirecettorileganolostessoligando
conaffinitdiversaeinquestocasolemolecoleattivatoriehannoun'affinitminorediquelleinibitorie.
uneventosimileaquellochesivistoperilCD28chelegaB7,equandololega,illinfocitaTstimolato
(secondo segnale). Linterazione tra CD28 e B7 ha un'affinit minore di quella che ha CTLA4 con CD28.
Quandoavvienel'interazione,illinfocitaTsiattiva,maquandoc'CTLA4legaCD28,percuihaunaffinit
maggiore,bloccalattivazione.

Il ligando lo stesso, ma hanno affinit differenti. In genere vince l'inibitore perch tende a essere
dominantesull'attivatore;inrealtquellochefavincereilrisultatodelbilanciodituttirecettori.Ingenere
c' una sequenza temporale dei segnali: all'inizio c' un segnale attivatorio con un'affinit maggiore per
potersi legare, poi, quando quest'affinit attiva la funzione attivatoria, si innesca la funzione inibitoria e
quindi negativa e il segnale spento pi facilmente perch il ligando ha un'affinit maggiore. Quando
dobbiamoscatenareunarispostainibitoria,potremmoaverelanecessitdiun'affinitmaggioreingradodi
spegnereilsegnaleattivatore.
Quando abbiamo parlato della costimolazione, abbiamo detto che il CD28 attiva la via PI3K quando
interagisce con B7. Questa interazione provoca la generazione di fosfoinositidi fosforilati e proteine
adattatrici e tutta una serie di segnali che vanno nel nucleo dove agiscono sul gene dellIL2, portano
all'attivazionedelgenedell'interleuchina2estabilizzanolmRNAdelleinterleuchina2.

questo porta al controllo della sopravvivenza cellulare e al controllo del riarrangiamento del
citoscheletro.
Quandolarispostaimmunitariavaavanti,aduncertopuntoB7pulegareCTLA4elolegaconmaggiore
affinit;questoportadeisegnaliinibitoriperchlesequenzechesonosuCTLA4,ovverolesequenzeITIM,
si fosforilano e reclutano SHP che sono delle tirosina fosfatasi che defosforilano tutte le tirosine e quindi
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interrompono i segnali che sono successivi alla fosforilazione delle ITAM. un meccanismo inibitorio
abbastanzaclassicoeirecettoriinibitorieattivatoridellecelluleNKfunzionanonellastessamaniera.
RECETTORECD16EMECCANISMODIUCCISIONEDELBERSAGLIO

Un altro recettore delle cellule NK la molecola di attivazione CD16, che lega degli anticorpi delle
immunoglobulineabassaaffinit.IllegamediCD16conleimmunoglobulinedi106molare.importante
perch questo recettore non riesce a legare le immunoglobuline monomeriche, ma solo gli
immunocomplessicioleimmunoglobulineeglianticorpichehannolegatol'antigene.Soltantodopoche
lanticorpo ha legato lantigene, la molecola CD16 lega limmunoglobulina e scatena il segnale di
attivazione.LabassaaffinitdelCD16impedisceillegamedelleimmunoglobulinemonomerichenonlegate
allantigene: il CD16 legato solo quando si ha un'aggregazione di immunoglobuline legate all'antigene.
QuestinterazionedunsegnalediattivazioneallacellulaNK.LacellulaNKsiavvalediunmeccanismodi
funzionamentomoltosimileaquelloutilizzatodellecelluleCD8+checontengonogranulipienidigranzimie
perforine: quando CD16 contatta limmunoglobulina che legata allantigene, manda un messaggio di
degranulazione e di conseguenza il contenuto dei granuli, che nel caso delle cellule NK contenuto nel
citoplasma, riversato all'esterno per uccidere le cellule bersaglio.Quindi tramite il rilascio di granzimi e
perforine,lacellulaNKprovocalalisidellacellulabersagliouccidendola.
Questo un meccanismo molto frequente nell'immunologia e si chiama citotossicit cellulare anticorpo
dipendente ed in genere abbreviata con ADCC. In questo meccanismo le immunoglobuline guidano
l'attivazionedicelluleNKnell'uccisionedivaritipidibersagli.
CD16 trasduce un segnale di tipo attivatorio; una
molecola con una coda corta che lega da una parte
un'immunoglobulina che ha legato l'antigene a bassa
affinit e quando questi legami si formano in maniera
cospicua, cio quando pi molecole CD16 interagiscono
conglianticorpilegatiall'antigene,questesiaggreganoe
incomincianoamandareunsegnaleattivatorioall'interno
della cellula NK. Il segnale attivatorio trasmesso
attraverso le stesse molecole implicate nella trasduzione
del segnale per i linfociti T: gamma e zeta. Tutte queste
molecole gamma e zeta possono essere eterodimeri od
omodimeri, possiedono delle ITAM fosforilate da questa
interazione e reclutano gli stessi trasduttori del segnale
che sono attivati durante l'attivazione dei linfociti T,
ZAP70eSyk.
BILANCIOTRASEGNALI
L'attivitdellecelluleNKregolatadauncomplesso
bilancio di segnali attivatori e inibitori. Il fatto che le
cellule NK uccidano o siano paralizzate, dipende dal
bilancio della concentrazione dei vari ligandi con cui
interagisconoilororecettoriattivatorioinibitori.
Esempio:lacellulaNKriconosceligandiattivatoriche
attivano ITAM attraverso i loro recettori lectinici;
quando la cellula perde le molecole MHC di classe I,

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non pu pi attivare i recettori inibitori KIR e quindi il bersaglio viene ucciso perch vengono favoriti i
segnaliattivatoririspettoaquelliinibitori.
QuandoinvecelMHCespressoadaltilivelli,KIRvieneattivatoemandaunsegnalenegativochebloccai
segnaliattivatoridellacellulaNKmancanzadilisi.Quandol'MHCespresso,legamoltodipirecettori
inibitori che bloccano l'attivit delle cellule natural killer e quindi questequilibrio si sposta a favore di
recettoriinibitorienonafavorediquelliattivatori.QuandolMHCperso,alcontrario,vinconoirecettori
attivatori e le cellule natural killer uccidono. Questo il motivo per cui le cellule NK sono molto attive
nelleliminazione delle cellule infettate da virus, perch durante lespressione virale il virus fa diminuire
lespressionediMHC,equestofavoriscelattivitattivatoriaekillerdellecelluleNK.

RIEPILOGOSUFUNZIONIEREGOLAZIONEDELLECELLULENK
Le cellule NK costituiscono una piccola parte delle cellule circolanti nel sangue periferico, ma svolgono
funzionimoltoimportanti:

rilascianocitochine,quindisonocoinvolteintuttifenomenidiimmunoregolazione
sono delle grandissime produttrici di interferone : quando sono stimolate, le cellule NK
produconotantointerferoneeproduconolarispostaconlattivazionediTH1
sono in grado di promuovere la maturazione dei linfociti T citotossici (CTL), quindi attivando le
cellule NK, i linfociti citotossici sono attivati e sono coinvolti soprattutto nelle guarigioni dalle
infezionivirali.

La loro citotossicit naturale regolata dal concetto del Missing Self: tendono ad essere molto attivate
quando lMHC diminuisce. Quindi quando lMHC presente sulle nostre cellule, attiviamo soprattutto i
linfocitiCTL,icitotossicicomeilCD8+chericonosconoilinfocitiTlegatiallaclasseI,mentrequandolMHC
diminuisce,vengonoattivatelecellulenaturalkillerperdistruggerelecellulec'undoppioregistrocon
cui ci si pu difendere sia dalle cellule a seguito di infezione virale sia a seguito di una trasformazione
neoplastica. Quando le cellule stressate o neoplastiche esprimono e aumentano espressione di MICA e
MICBsonovistidairecettoriattivatorietendonoaessereeliminate.
un'altrafunzionemoltoimportantedellecellulenaturalkillerilcontrollodell'ematopoiesiperch
tralecitochinechelororilascianocisonoancheifattorichestimolanolecoloniemacrofagichee
granulocitomacrofagiche, sono delle grandi produttrici di MCSF e di GMCSF. Quindi attraverso
queste citochine contribuiscono alla maturazione dei macrofagi e dei granulociti a livello del
midolloosseo.
svolgonofunzioniimportantissimeattraversolacitotossicitcellulareanticorpodipendenteche
funzionedellegamedeglianticorpiconunamolecolaCD16.

Fraifattorichestimolanoleattivitdellecellulenaturalkillersisono:
ladesioneconlealtrecellule,perchappuntolapresenzadirecettoridiadesionecomeintegrine
sullalorosuperficiefaschel'adesioneconlecellulenaturalkillerportiall'attivazione
sonostimolatedaimmunocomplessi,ciocomplessianticorpoantigene
sonoregolatedallecitochine,perchlecelluleNKpossiedonomoltissimirecettoriperlecitochine,
chesonoovviamenteattivatedasituazionidistresscellulare

Altri fenomeni di regolazione che sono stati osservati, sono a livello genetico: alcuni di noi hanno una
predisposizione maggiore all'attivit NK, altri meno. Questo dipende dal controllo genetico; pi geni
regolanol'attivitdellecelluleNK.

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QuestecelluleNKpossiedonodeirecettoripergliormoni,quindisubisconouncontrolloendocrino:stato
dimostrato che alcuni ormoni endocrini regolano l'attivit delle cellule natural killer come nel caso degli
ormonicheregolanoilciclomestrualecheaumentanoodiminuisconol'attivitnaturalkiller.

Lo stress controlla le attivit natural killer: la bassa quantit di cellule natural killer favorisce tutta una
gamma di virus, soprattutto virus tra cui: herpes, virus della varicella di Epstein Barr, che provoca la
mononucleosiinfettiva,edilcitomegalovirus.QuandoalcunisoggettihannodifettinaturalidellecelluleNK
diventanosuscettibiliaquesteinfezioni.
Esiste la possibilit di stimolare l'attivit natural killer attraverso soprattutto l'uso delle citochine:
possibile potenziare la funzione citotossica attraverso la produzione di citochine come l'interleuchina15
che prodotta dai macrofagi o dalle cellule dello stroma timico; sotto il suo stimolo, le cellule NK
proliferanoeproduconocitochineinmanieracospicuaesonoquindiingradodiuccidereinmanieramolto
piefficace.Unaltromodoconcuilecellulenaturakillersonoregolatepositivamentelaproduzionedi
citochinechefavorisconolaproduzionedinterferonecomelinterleuchina12,15e18,ediinterferone
,chesonorilasciatisiadaimacrofagiattivatisiadallecelluledendriticheattivate.Avvieneancheinvivo,
mapossibilefarlofarmacologicamentesomministrandoquestecitochineallecelluleNK.

Neglianni90unricercatoreamericano,SteveRosemberg,dimostrchealtedosidiinterleuchina2erano
in grado di attivare le cellule NK ad uccidere cellule tumorali, per cui stata utilizzata questa tecnica: si
prendeva il sangue periferico di pazienti con carcinoma renale e si coltivavano questi linfociti del sangue
periferico,fracuilecellulenaturalkiller,conaltissimedosidiinterleuchina2.Questecellulesiattivavanoe
si differenziavano in cellule particolarmente capaci di uccidere LAK e queste cellule venivano poi infuse
nuovamentenelpazienteconrisultatiterapeuticiabbastanzaeclatanti:nel50%deicasiregredivanoanche
i tumori metastatici. Il problema era che l'alto uso di concentrazioni elevate dinterleuchina2 dava
problemi di tossicit notevoli, per cui parte di questi pazienti moriva a causa dell'azione tossica delle
citochinelattivitnaturalkillerpuesserepotenziataattraversol'usodellecitochine,mabisognafare
attenzionenellorouso.
Esiste un circuito reciproco per cui le cellule natural
killer che sono stimolate da queste citochine,
produconointerferoneeTNF:tramitelinterferone
vengonoattivatiimacrofagi,inveceilTNFprodotto
dalle cellule natural killer fa maturare le cellule
dendritiche e per questo si crea un circuito
attivatorio.Inoltre,lecellulenaturalkillerstimolatea
produrre interferone , attivano linfociti T o
favorisconoladifferenziazionedeilinfocitiT,iqualia
loro volta producono interferone e interleuchina2
che possono contribuire all'attivazione delle cellule
naturalkiller.Sicreauncircuitochepotenzialafunzionecitotossicadellecellulenaturalkillereattivatutte
le altre cellule del sistema immunitario. Si pu dire che le cellule natural killer sono al centro di un
complessodialogotravaritipicellularichesonoregolatedallaproduzionedellecitochine.

LINFOCITIB
Oltre ai linfociti T ci sono altri tipi di linfociti che rientrano nell'immunit adattativa. Esistono alcuni
meccanismi di differenziazione e di attivazione simili a quelli dei linfociti T. Anche i linfociti B hanno un
precursore staminale che prende origine negli organi linfatici primari ma, a differenza dei linfociti T, il
precursoredeilinfocitiBsitrovanelmidolloosseoenelfegatofetale.
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In questi organi i precursori vanno incontro


alla generazione di un vastissimo repertorio
direcettorichiamatirecettoriperilinfocitiB.
Quandofinisconolamaturazione,ilinfocitiB
vanno a localizzarsi negli organi linfatici
secondari dove arriva l'antigene che
seleziona uno dei cloni dei linfociti B in base
al grado di complementariet a livello
recettoriale. Quindi si ha l'attivazione del
linfocita prescelto che si divide
ripetutamente dando origine a cloni di
linfociti B che si differenziano in cellule che
produconoanticorpi(plasmacellule)edanche
a linfociti B di memoria, che conservano la memoria dellavvenuto contatto con un determinato tipo di
antigene in modo da attuare una risposta pi rapida qualora si verificasse un nuovo contatto con il
medesimotipodiantigene.
IlinfocitiBpossiedonounrecettoreperl'antigenecheun'immunoglobulina.IlinfocitiBsonoingradodi
internalizzare lantigene assieme al recettore al quale lantigene legato, quindi sanno funzionare come
APC (antigene presenting cell). Una volta avvenuta linternalizzazione dellantigene, lo montano sulle
molecoleMHCIIeloespongonoinsuperficie.QuestopermetteallinfocitaBdidialogareconilinfocitiT
helper,chequindientranoincontattoconilinfocitiBepossonoesserealorovoltaattivati.Questodialogo
trailinfocitiThelpereiBmoltocriticoperlerisposteimmunitarieedessenzialeaffinchilinfocitiB
possano differenziarsi e attivarsi completamente diventando plasmacellule, ovvero cellule che danno
origineaunnumeroenormediimmunoglobuline.QuestainterazionetrailinfocitiThelpereBunodei
punti centrali della risposta immunitaria. Gli anticorpi, una volta prodotti dai linfociti B, possono ad
esempiolegarelecelluleNKattraversorecettoriCD16escatenarelalorocapacitdiucciderevaribersagli.
I linfociti B possono anche differenziarsi in linfociti B della memoria e persistere nel nostro organismo
anchealungotemporimanendocapacidiattivarsiquandorincontranolostessoantigene.IlinfocitiBsono
ingradodipresentarel'antigeneailinfocitiT:questoantigenesilegaailinfocitiBattraversounrecettoredi
membranaequestopermetteailinfocitiBdiattivarelinfocitiThche,unavoltaattivi,alorovoltaattivanoi
linfocitiB.
Ilmeccanismodell'attivazioneilseguente:

quando i linfociti B riconoscono qualcosa di estraneo, lo legano, lo internalizzano e lo espongono su una


molecolaMHCII;intuttoquestoprocessoilinfocitiBsipreattivano,ciononsiattivanocompletamente.
Per attivarsi completamente aspettano che i linfociti T riconoscano l'antigene e a loro volta si attivino e
inviino il segnale ai linfociti B di poter completare la loro attivazione. Quando si attivano linfociti B, si
trasformano in plasmacellule, che sono cellule specializzate nella produzione di anticorpi (o
immunoglobuline).

Ilnostrosistemaematopoieticoproduceognigiornocirca10milionidilinfocitiBverginechenonhanno
maiincontratol'antigene.
IlinfocitiBverginisilocalizzano:

15%nelsangueperiferico

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85% in particolari zone dei linfonodi, della milza e del tessuto linfatico associato alle mucose
(MALT), ai bronchi (BALT) e all'intestino (GALT). I linfociti B stanno prevalentemente associati ai
tessutilinfoidiodeilinfonodiodellamilzaoquelliassociatiallemucose,netroviamorelativamente
pochialivellodellaperiferia.
Un linfocita B vergine caratterizzato
dall'espressione sulla membrana cellulare di circa
100.000 recettori per l'antigene che corrispondono
alle immunoglobuline (hanno lo stesso sito
combinatorio). Questi recettori per le
immunoglobuline nei linfociti B vergine sono di due
sottoclassidifferentidefiniteIgMeIgD.UnlinfocitaB
cheesprimeIgDeIgMinmembranapuesseresolo
unlinfocitaBmaturo,mavergine;mentrequandoil
linfocita B incontra l'antigene e si attiva, attiva un
meccanismo che fa cambiare le sottoclassi di
immunoglobuline sulla superficie cellulare e questo
linfocitacominciaamontaresullamembranaIgG.
OgnilinfocitaBhasullamembranacellularecirca100.000copiediimmunoglobulinemonometricheditipo
IgMeIgD.Ilsitocombinatorio,ovveroilpuntoincuilimmunoglobulinaincontral'antigene,ugualesiaper
IgM sia per l'IgD, quello che cambia sono le sequenze costanti. Limmunoglobulina pu cambiare di
sottoclasse, ma mantiene sempre la stessa specificit per il sito combinatorio e quindi per l'antigene. Un
altro punto importante che bisogna tenere in considerazione che i linfociti B, attraverso le
immunoglobuline, legano l'antigene in forma naturale, cio i linfociti B non hanno la necessit di vedere
peptidi, come i linfociti T, ma legano l'antigene nella sua forma nativa quindi una proteina con la sua
conformazione terziaria vista dagli anticorpi espressi sulla membrana cellulare nella sua configurazione
nativa.Nelriconoscimentodell'antigenedapartedeilinfocitiBnonintervienel'HLA,cheintervienesoloper
quanto riguarda il riconoscimento de linfociti T. Inizialmente i linfociti B riconoscono solo l'antigene che
proviene dall'esterno e quindi gli anticorpi prodotti contro certe proteine sono mirate contro la loro
conformazioneterziaria;selaproteinaperdelapropriaconformazioneterziaria,questianticorpinonsono
pi in grado di riconoscerla. Questo importante perch quando un virus o una tossina entra nel nostro
organismo, i linfociti B riescono a riconoscere la proteina nella sua configurazione originale e la possano
bloccare.

IMMUNOGLOBULINE
L'immunoglobulinafattadaquattrocateneugualiadueadue:
una catena pesante, una catena leggera; tipicamente i domini
sonoglobularistabilizzatidalegamidisolfuro.
La parte che corrisponde alla zona variabile delle
immunoglobuline contiene i siti di legame per l'antigene. Le
immunoglobuline espresse sulla membrana del linfocita B sono
sempreassociateadellemolecoletrasduttriciperchdasolenon
sanno trasdurre il segnale. Ci sono eterodimeri Ig e Ig , che
sono due molecole trasduttrici: hanno una porzione extra
cellularecortaeunaparteintracellulareconcaratteristiciresidui
ITAMperattivarelarispostadeilinfocitiB.

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ImmunologiaLezioneno1016.04.13Novelli

L'immunoglobulinadimembranafattadaunamolecolatetracatenariaconunacatenaleggera,chiamata
catena L, e una catena pesante, chiamata catena H: due catene pesanti e due catene leggere. La
combinazionedella catena leggera con la catenapesanteformailsitocombinatorio,cioilpunto dove
l'antigene legato. Esistono anche delle cisteine che formano dei ponti intracatenari che stabilizzano la
molecoladell'immunoglobulinasullamembranacellulare;esisteunaporzionetransmembranaeunacoda
intracitoplasmatica:quindisempreduecatenepesantiHugualieduecateneleggereLuguali.

La generazione del repertorio delle immunoglobuline si avvale degli stessi meccanismi di ricombinazione
somatica con le Rag e usa gli stessi sistemi di riarrangiamento, regola degli eptameri e dei nonameri.
L'organizzazionegenicadelleimmunoglobulineleggermentediversadaquelledeilinfocitiT.
Le immunoglobuline hanno una parte variabile e
una parte costante. La parte variabile varia da
clone a clone di linfocita B e si lega all'antigene,
mentre la parte costante delle immunoglobuline
durante la vita del linfocita B varia moltissimi
clonidilinfocitiBesprimonoinizialmentelaparte
costante che determina l'immunoglobulina di
classe M o di classe D, e se questo linfocita
risponde all'antigene, mantiene lo stesso sito
combinatorio, ma monta diverse parti costanti e
diventa IgA, IgD o IgE. Quindi la parte costante
determina le caratteristiche biologiche delle
immunoglobuline:(leimmunoglobulinenonstannofissesullalinfocitaB,aduncertopuntosonosecrete)
l'attivit,lafunzione,leproprietbiologichedell'immunoglobulinasecretadipendonodallapartecostante,
mentrelapartevariabilerimaneugualeelegasemprelostessoantigene.Leimmunoglobulinesitrovano
sullamembranacellularedeilinfocitiBcheleproduconoequindisonoparteintegrantedelrecettoreper
l'antigene dei linfociti B, BCR; sono molto diffuse in tutti i liquidi organici, saliva, plasma, ma quantit
differenti a seconda della parte costante, per non le troviamo solo solubili nei vari distretti, ma anche
legateallemembranedeilinfociti,fissateaparticolarirecettorichiamatirecettoriperlaporzioneFc,FcR.
LamolecolaCD16unodiquestirecettorielegasoprattuttoleimmunoglobulinediclasseIgG.

Il repertorio la diversit delle


immunoglobuline e il numero dei siti
combinatori che si generano in maniera
casuale, indipendentemente
dallantigene. Durante la gestazione,
quando il feto non ancora a contatto
con lesterno e non subisce ancora
nessun contatto con lantigene, il
linfocita B ha una maturazione antigene
indipendente in cui generato il
repertorio di immunoglobuline.
Attraverso i meccanismi di
ricombinazione somatica tutti i linfociti B che stanno maturando cominciano a esprimere dei recettori
diversi.Ilrepertoriomoltovasto,contienepidi109recettori.
Come fa il nostro organismo, che ha un numero limitato di geni, a produrre un numero tanto elevato di
recettori?Comeriesconoleimmunoglobulinealternativamenteainserirelemolecolesullamembranaoa
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ImmunologiaLezioneno1016.04.13Novelli

secernerle? un aspetto che non si considerato nei linfociti T perch essi sono sempre fissi sulla
membrana,inveceleimmunoglobulinesonofissesullamembranacomerecettori,perauncertopunto
sonosecrete.

VARIABILITADEGLIANTICORPI:ILRIARRANGIAMENROGENICO
Le catene pesanti esistono in diverse sotto forme: , , , . La presenza di queste catene pesanti nella
molecola delle immunoglobuline d il nome all immunoglobulina stessa. Le varie catene pesanti delle
immunoglobuline sono definiti isotipi, e ne determinano le classi. Ogni classe ha una funzione biologica
differente.
Igenidellecatene pesanti edellecatene leggerestannosucromosomidifferenti:subisconofenomeni di
ricombinazionesomatica,sonoprodotteindipendentementeepoiunitenelcitoplasma.
Igenidellecatenepesanti>cromosoma14
La vicinanza di questi geni permette complessi riarrangiamenti genici e uso di vari geni costanti da parte
dello stesso linfocita d luogo al fenomeno che nellimmunologia si chiama commutazione di classe o
switchisotipico.DurantelavitaillinfocitaBpuutilizzareporzioniC(costanti)differenti,mantenendola
stessa specificit per lantigene e questo cambiamento un meccanismo importante: quando dobbiamo
montareunarispostaimmunitaria,dobbiamomontareunarispostaanticorpaleappropriata;sedobbiamo
eliminare dei patogeni extracellulari, dobbiamo avere delle immunoglobuline di classe G, mentre se
dobbiamorispondereaunallergene,dobbiamomontareleimmunoglobulinediclasseE.

Il sistema immunitario fa cambiare la classe immunoglobulina, facendo produrre lanticorpo pi


appropriato.
Esistonoduetipidicateneleggereperleimmunoglobuline:e,funzionanonellostessomodo.

Igenidellecatene>sulcromosoma2
Igenidellecatene>sulcromosoma22
Lusodiononconferisceparticolaripropriet
manedeterminailsottotipo.
Le catene leggere sono montate e costituite
attraversounsegmentoKchecodificatoepoi
sisceglieunadelletanteregionivariabililegatea
unadelletanteregioniJ,cunriarrangiamento
analogoallecatenedelTCR.
LecateneleggerehannosolounfenomenodiriarrangiamentocheunisceunsegmentoVconunsegmento
J.Lastessacosaavvieneperlecatene.
Per le catene pesanti ci sono due riarrangiamenti per quanto riguarda la parte variabile, analogamente a
quellocheavvieneperlacatenadelTCRedobbiamoavereunprimoriarrangiamentocheunisceDconJe
poi uno successivo che unisce V con J. Questo segmento riarrangiato variabile, potr utilizzare una delle
tanteregionicostantidellecatenepesanti.IlriarrangiamentosimileaquellodelTCR,trannecheperle
porzionicostantiperchlecatenepesantipossonoutilizzarediverseparticostantidurantelalorovita.
Ci sono una serie di segmenti V e una serie di segmenti D e una serie di segmenti J costanti per quanto
riguarda le catene pesanti; una serie di segmenti V e J per quanto riguarda le catene leggere. Il
riarrangiamentodiquestisegmentiportaallaformazionedellecatenepesantioleggere.

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LecateneHnelDNAembrionalehannotuttiigeninelcromosoma14.
Il primo evento di ricombinazione
unisceunodeitantisegmentiJconuno
deisegmentiD>DJ
IlDNAintercalanteeliminato
Il secondo eventi di ricombinazione:
uno dei segmenti V unito al
segmentoriarrangiatoDJ>VDJ
LRNA trascritto come trascritto
primario
Mediante lo splicing differenziale il
prodotto dellesone unito con a
formare IgM, che tradotta e poi
glicosilata
Una parte di queste immunoglobuline, mediante un meccanismo di splicing differenziale, utilizzer la
catenacostanteperformareIgD,montatasullamembrana.
PerlecateneL,lesequenzesonosimiliallacatenadelTCR:
J unito a uno dei tanti segmenti
variabilidellecateneleggere
Siformaunesone
Il DNA trascritto come trascritto
primario,usandounsegmentoCk
LRNAtradottoaformareunacatena
leggera

Il riarrangiamento dei geni un fenomeno sequenziale: dal DNA embrionale si ha dapprima il


riarrangiamento delle catene pesanti; avendo due cromosomi, ci sar prima il riarrangiamento su un
cromosomaepoisequestononfunziona,cilriarrangiamentosulsecondocromosoma.
1. Dapprima inizia il riarrangiamento delle
catenepesantisulprimocromosoma
2. Questiriarrangiamentipossonoomeno
funzionare se il riarrangiamento
funziona, il riarrangiamento va avanti,
se il riarrangiamento non funziona, il
riarrangiamento torna indietro e la
catena pesante comincia a riarrangiare
ilsecondocromosoma
3. Se questo riarrangiamento fallisce, il
linfocita si perde; se il riarrangiamento
dellecatenepesantistatoproduttivo,
sipuavereilriarrangiamentodellacatenaleggera.
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NB:ilriarrangiamentodellecatenesempresequenziale,primadie
poidi.Quandotroviamounimmunoglobulinachemontaunacatena
leggera , perch il riarrangiamento delle catene leggere non ha
funzionato. un fenomeno sequenziale: se funziona
limmunoglobulina monta le catene , se non funziona si riarrangia il
secondocromosomaeilprocessoprosegue.

Se si passa al riarrangiamento delle catene , se non funziona c il


secondo riarrangiamento riarrangiamento delle immunoglobuline
primasuprimauncromosomaepoisullaltro;sequestofallisce,si
passaa.

Ilriarrangiamentodelleimmunoglobulineavvienenelmidolloenelfegatofetaleedregolatodasegnali
delmicroambientemidollare:ilinfocitisonoimmersiinunostroma,attraversoilqualesubisconosegnali
che attivano fattori trascrizionali delle catene pesanti e attivano le DNA binding proteins che attivano la
trascrizione.

Il fenomeno del riarrangiamento vede sempre come prima tappa lapertura della cromatina;
successivamentesiattivanoigeniRAG1eRAG2(attivianchenelriarrangiamentodeilinfocitiT).Richiede
lattivazione della TdT, che lenzima che riempie le giunzioni tagliate dopo la forcina e si attiva la
trascrizione prima dei geni delle catene pesanti e poi delle catene leggere attraverso NFkB, fattore
trascrizionale anche attivo nei fenomeni dellinfiammazione, soprattutto nellattivazione delle catene
leggere.
Quando il riarrangiamento terminato per le catene pesanti , queste sono portate nel citoplasma.
Quando finisce il riarrangiamento delle catene pesanti e queste sono nel citoplasma, inizia il
riarrangiamentodellecateneleggere.

C un fenomeno di esclusione allelica: quando inizia il riarrangiamento su un allele di un cromosoma,


laltro cromosoma bloccato. Questo fenomeno risultato evidente quando sono stati fatti dei topi
transgenici per il gene della catena : se si mettete nellovocita un gene riarrangiato per la catena e si
generauntopotransgenico,igeniendogenidellecatenenonsonopiriarrangiatilapresenzadiuna
catenariarrangiatanelcitoplasmabloccailriarrangiamentodellacatena.
Nelluomoilrapportotralecateneleggereedi50:50.IlinfocitiB,concateneIgGecatene,hanno
ancoraigeninellaloroconfigurazionegerminale.
Neltopolapercentualeleggermentediversamalecateneleggereconlecateneriarrangiate,hannoi
genichenonsonopifunzionanti.

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MATURAZIONEANTIGENEINDIPENDENTE

Prendiamo in considerazione il discorso della maturazione dei linfociti B; i linfociti T in maniera simile ai
linfociti B sono sottoposti ad un riarrangiamento somatico al fine di montare sulla membrana cellulare il
recettoreperlantigene.LamaturazionedeiBavvienenelmidolloosseo,infattilaBstaappuntoperbone
marrow,eavvieneanchenelfegatofetale.Quindia
livello del midollo osseo i linfociti B occupano lo
spaziotraletrabecoleosseeedimportanteilfatto
che durante la loro maturazione i linfociti B entrino
in stretto contatto con lo stroma perch attraverso
questo contatto i linfociti B ricevono tutta una serie
di segnali che regolano e che coordinano la loro
maturazione. La maturazione, cio il passaggio da
cellula staminale totipotente, regolata da eventi
che non dipendono dallinterazione con lantigene e
quindiquestamaturazionecompletamenteindipendentedallantigeneesterno.Quellocheimportante
echeregolalescelteeipassaggisuccessividellamaturazionedeilinfocitiBilcontattoconlostromasu
cuiilinfocitiBsiadagiano.Tramiteunaseriedisegnali,soprattuttoguidatidallecitochineedaaltrifattori,i
precursorideilinfocitiBcontattanolostromaeacquisisconounaseriedimolecolesullaloromembranache
permettelorodiprocedereversolaloromaturazione.

Inizialmente le cellule staminali totipotenti


sonoregolatedaalcunecitochine,inparticolar
modo dallinterleuchina3, e successivamente
tramitelinterazioneconmolecolequalilacido
ialuronico, che espresso sulle molecole
stromali,ilinfocitiBsonoportatiaproseguire
nellaloromaturazione.Inseguitosentirannoil
segnaledicitochine,comelinterleuchina7e
4, sempre prodotti dalle cellule stromali, e
proseguirannonellalorodifferenziazione.

Quindi possiamo dire che la prima parte della


maturazione dei linfociti B dipende da una
citochina che lInterleuchina3 e che viene
secreta dalle cellule stromali; siccome i
precursori esprimono il recettore per IL3
possono proseguire nella differenziazione.
Successivamente le cellule stromali rilasciano
interleuchina4 che serve per guidare le fasi
successive della maturazione. Le cellule
stromali iniziano a produrre interleuchina4 e
interleuchina7 e quindi questi segnali
citochinici,chesonocaptatidailinfocitiB,portanoacompimentotuttalamaturazione.

Pag1

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Lezione1117/04/2013prof.NovelliImmunologia

Un segnale importante che i linfociti B ricevono dallo stroma lacido ialuronico che espresso sulla
superficie delle cellule stromali e
interagisce con una molecola: cd44 che
espressa sulla superficie dei linfociti.
Dunqueinquestafasematurativailinfociti
sentono l interleuchina3 e sono sensibili
allesposizioneallacidoialuronicoequesto
permette loro di andare avanti verso la
maturazione.

Nello stadio successivo si aggiunge anche


un altro segnale che essenzialmente un
segnale di adesione. Le cellule stromali
esprimono sulla superficie la molecola V
CAMcheinteragisceconunaltramolecoladiadesioneVLA4cheespressasullasuperficiedellinfocitaB
che sta maturando. Un altro segnale molto importante per la maturazione SCF (stem cell factor) che
anchessoprodottodallecellulestromaliedcaptatodaunrecettorespecificodellecellulestromaliche
KIT,espressosullasuperficiedellinfociti.

Il passaggio successivo viene guidato dal


rilascionelmicroambientediinterleuchina7e
quindi il linfocita B maturando inizia a
esprimere anche il recettore per questa
citochina. In questa fase i segnali sono
paralleli all inizio del riarrangiamento della
catena pesante, quindi i linfociti B iniziano a
riarrangiare i geni per la catena pesante
tramite tutti i meccanismi di riarrangiamento:
con l esclusione allelica e con la possibilit di
provarepivolteseilriarrangiamentonon
produttivo. Il linfocita che sta maturando continua a essere suscettibile agli stessi segnali, ma incomincia
anche a essere suscettibile allinterleuchina4, che viene rilasciata dallo stroma; i linfociti b iniziano a
esprimere il recettore per questa citochina e questo permette al linfocita di completare la propria
maturazione.Aduncertopuntoifenomenilegatialriarrangiamentodellacatenapesantesiconcludono.La
catena pesante riarrangiata liberata nel citoplasma, questo blocca ogni successivo riarrangiamento e fa
iniziarequellodellacatenaleggeraesostanzialmentesempresuscettibileaglistessisegnali.

Durante tutto questo percorso il linfocita B dipende dall interazione con lo stroma, e diventa anche
suscettibilealsegnaledellinterleuchina5,unaltracitochinaprodottadallostroma.Aduncertopunto
ancheiriarrangiamentidellecateneleggereterminano,lacatenaleggeravienemontataesullasuperficie
dellinfocitacomincianoacomparireleIgdiclasseM.Aquestopuntoirecettorielemolecolediadesione
montatisullasuperficiecellulareincomincianoadiminuireelavitadellinfocitaBdiventacompletamente
indipendente dall interazione con lo stroma e quindi pu uscire da questo ambiente ed andare
definitivamenteincircolo.

Maladesionefondamentaleperriceveredeisegnali?Tuttequestecitochinesonoprodottedallecellule
stromaliquindiquestifattoriguidanoallamaturazioneealriarrangiamento.Quandoilriarrangiamento
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Lezione1117/04/2013prof.NovelliImmunologia

completato il linfocita B non necessita pi dell interazione con le citochine per poter sopravvivere e a
questopuntopuusciredalmidolloosseo.

SeripercorriamoletapperiprendiamolanomenclaturaconcuiilinfocitiBvengonochiamatiduranteilloro
percorsodifferenziativo:

Il linfocita B all inizio detto pro B precoce, e sostanzialmente a questo stadio quello che avviene nel
linfocita B lapertura della cromatina, che si srotola e questo consente laccesso di tutti i fattori
trascrizionali che regolano larrangiamento delle catene pesanti, di quelle leggere, delle Ig. Dopodich il
precursoredellinfocitaBprendeilnomedilifocitaBtardivoeaquestopuntoavvengonoiprimieventidi
riarrangiamento, il primo quello della ricombinazione tra il segmento D e il segmento J delle catene
pesanti. Questo linfocita esprimer i geni della TdT che lenzima che completa la ricombinazione,
naturalmenteesprimerigeniRAG1eRAG2chesonoglienzimiricombinasichetaglianoepotrpassare
allostadiosuccessivo,chechiamatolostadiopreBI,inquestostadiosicompletailsecondoeventodi
ricombinazionedelleregionivariabili:unsegmentoVsiassociaaunsegmentoDJricombinatoedesprime
molecolediMHCIIsullasuperficiecellulare,esprimeilrecettoreKITequelloperlinterleuchina7.Nello
stadio successivo il linfocita prende il nome di preB II ed esprime la catena pesante , riarrangiata nel
citosol ed esprime una catena leggera provvisoria che si chiama VpreB 5, nel frattempo per perde
lespressionedelleTdTperchglieventidiricombinazionesisonocompletati,continuaaesprimereRAG1
eRAG2eilrecettoreperlinterleuchina7.

IntalestadioilpreBIIvaincontroauncontrolloeditorialedelrecettore:insiemealrecettoreVpreB5si
monta un recettore provvisorio sulla superficie del linfocita B; questo contatta alcune strutture del
microambienteedilsegnalepercepitodallinfocitaBglipermettediproliferare.Allafinedellespansioneil
linfocita B monta in membrana la catena pesante , in questo complesso VpreB 5 va incontro alla
proliferazioneeallafinediquestaproliferazioneperdelespressionedellaTdT.

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5 un surrogato di catena leggera, non quella definitiva, perch la catena viene espressa sulla
membrana e per formare questo recettore ancora provvisorio, il linfocita B associa alla catena questo
complesso provvisorio. Con questo complesso riesce ad aver dei segnali di proliferazione ed in questo
modosipuespandere.

Il linfocita B si espande come risultato dellavvenuta ricombinazione della catena , questo un


meccanismocheconsentediaveretantilinfocitiBconlacatenapesanteriarrangiatacorrettamente.Alla
fine di questo fenomeno il linfocita B incomincia a riarrangiare la catena leggera, quindi tante catene
leggere potranno associarsi alla catena pesante formata. Tale controllo molto importante per quanto
riguardalecatenepesantieddovutodalfattochelecateneVpreB5sonougualipertuttiilinfocitiB,
vannosullamembranaesiassocianoallacatenapesante.AllafinedellaproliferazioneillinfocitaBperde
questa catena e inizia a riarrangiare la catena leggera, che diventer poi una catena leggera definitiva.
Quindi se questo complesso corretto dal punto di vista strutturale, esso in grado di interagire con le
cellulestromalietrasdurredeisegnalidentroallinfocitaBcheloportanoaproliferare,questoperchgli
eventidiricombinazionespessoabortisconononportanoauncorrettoriarrangiamento.

Laddoveavvieneilriarrangiamentodellacatenapesantepresenteunvantaggioselettivo:ilinfocitisono
selezionati,proliferanoepossonoespandersie,attraversoilriarrangiamentodellacatenaleggera,possono
completare la loro maturazione. importante dire che i segnali che vengono trasdotti attraverso questo
recettore ancora provvisorio necessitano di una tirosinchinasi detta di Bruton, BTK1, che permette
lespansionedeilinfocitiB.

In sostanza i segnali mediati dalla BTK servono per avvisare la cellula che la catena pesante funziona
correttamente. In virt di questo segnale il linfocita inizia a proliferare e d origine a tante cellule con la
medesima catena pesante H che proseguono nella maturazione. Se il complesso non funziona la cellula
provaariarrangiarequellochelerimanedellacatenaH,provaeriprova,masenonriesceadaroriginea
una catena H funzionante prova sull altro cromosoma e se anche questo riarrangiamento sul secondo
cromosomanonfunzionaillinfocitasisuicidaattraversoapoptosi.Quandoquestosegnaleinvecefunziona,
e quindi la catena H funziona, ovvero il complesso funziona, attraverso BTK si ha una serie di eventi che
consentono di bloccare il riarrangiamento delle catene pesanti. Quindi, quando il linfocita B prolifera e
sente che il segnale funziona c un blocco del riarrangiamento delle catene pesanti, si determina il
fenomeno dell esclusione allelica, cio il riarrangiamento sullaltro cromosoma si blocca, si attivano i
meccanismicheportanoallaproliferazionecellularequindiallespansioneclonaleecontemporaneamente
si attiva il riarrangiamento della catena leggera. Se i fenomeni del riarrangiamento della catena leggera
vanno a buon fine, la catena leggera riarrangiata spiazza il complesso VpreB 5 e si associa alla catena
pesante e a questo punto si monta lIg completa. Di conseguenza i geni di VpreB 5 vengono repressi e
quindi il linfocita B non riarrangia pi i geni delle Ig, ma esprime le Ig sulla membrana ed pronto per
andareincircoloecircolareneltessutolinfaticosecondario.

Riepilogo: se la proliferazione, guidata dalla catena in membrana e dal complesso VpreB 5 funziona
correttamente, cominciano i riarrangiamenti dei segmenti J L delle catene leggere, il linfocita perde
lespressione di TdT, esprime RAG1 e 2 ed MHC II, va incontro a un controllo editoriale affinch tutto

1
Brutonerauncolonnellodellesercitoamericano,hastudiatoleimmunodeficienzeneibambini,edstatocoluiche
hascopertolaprimaimmunodeficienzaBdellacompletagammaglobuminemia.Alcunidiquestibambiniavevanoun
immunodeficienzageneticalegataalsesso.IllinfocitaBmontalacatenaHsullamembrana,ma,nonavendolatirosin
chinasidiBruton,nonpuespandersiecideterminaungrandissimodifettodimaturazionedeilinfocitiB.Inquesti
bambiniilinfocitiBnonmaturano.
Pag4

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funzionibeneequindiaquestopuntosullinfocitaBimmaturocompaionoleIgM,elultimopassaggioda
linfocita B immaturo a maturo sostanzialmente dovuto al fatto che questo linfocita che esprime lIg
riarrangiata,puutilizzarealternativamenteancheunaltrosegmentocostantechenonsoloquellodelle
catene,maquellodellecatene.

Sullasuperficiedellinfocitamaturocompaionole
IgM e anche le IgD. Noi possiamo distinguere un
linfocitaBmaturodaunoimmaturodalfattoche
quello maturo esprime anche le IgD. Questi sono
gli eventi della maturazione, a questo punto i
linfociticoirecettoricircolanonelsangueevanno
nei linfonodi e nella milza. Loro sono esposti
potenzialmente all antigene, quindi lantigene
pulegareilrecettore.

RICONOSCIMENTODELLANTIGENEEATTIVAZIONEDEILINFOCITIB

Il linfocita B riconosce lantigene nativo nella sua conformazione terziaria. Non ha bisogno che sia
presentatodadellemolecoleMHC.UnantigenenativopuadesempiolegareillinfocitaB,percuialcunidi
questideterminantiantigenicisonoriconosciutidalsitodilegame;quandoillinfocitaBlegailsuoantigene
nativosubiscedeisegnalidiattivazionenoncompleti,nelsensochenoncompletalapropriaattivazione,
masipreattiva:simetteincondizionediattivarsidefinitivamente.Lacosachesafaremoltobeneillinfocita
B quella di funzionare come antigen presenting cells , infatti capace di internalizzare l antigene, lo
degradaedesponeilpeptidediquestoantigenesullemolecolediMHCcheluipossiedesullamembrana.

Avviene un processamento dellantigene. Ci molto importante perch un processo molto simile a


quello che avviene per le cellule dendritiche, nei linfociti T, solo che le cellule dendritiche usano dei
recettorinonspecifici,itolllikereceptor,percuileganomoltissimiantigenieliespongonosullamembrana
cellulare.IlinfocitiBinvecefannounendocitosiantigenespecifica,percuiquellochelorointernalizzanoin
realtloconcentranomoltissimo.Sonodeipresentatoridellantigenemoltospecifici.Questipeptidisono
espressisullemolecolediclasseMHCIIequindiquestolinfocitaanchecapacedipresentarelantigenee
contattare i linfociti T e far veder loro i peptidi che derivano dalla demolizione dellantigene; quindi si
comportanocomedelleantigenpresentingcellsmoltopiselettiviperchlapresentazioneriguardasolo
un antigene, ma con molta efficacia. A questo punto il linfocita B, che si trova presumibilmente in un
linfonodo,puincontrareunThelpercheabbiaunrecettorespecificocomplementarealpeptidechelui
ha sulla membrana, quindi se il linfocita B ha la fortuna di incontrare un linfocita che complementare
entra in uno stretto contatto ed inizia una fase di collaborazione e interazione che pu portare
allattivazione finale del linfocita: se l interazione produttiva, il linfocita B subisce un segnale di
attivazionedapartedellinfocitaTequindiasuavoltaillinfocitaTsiattiva.

Quello che importante per lattivazione dei linfociti e quindi per la produzione di Ig che vi siano dei
segnali dei linfociti T che vengono rilasciati anche nel contesto di segnali TLR. Se ci sono dei prodotti
batterici che segnalano attraverso TLR, la probabilit che i linfociti B vengano attivati aumenta

Pag5

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notevolmente, soprattutto da parte dei TLR 4. In realt i linfociti B, per essere attivati, sono aiutati nella
maturazionedailinfocitiThelpercheliaiutanoaproseguiredefinitivamenteinquestopercorso.

ATTIVAZIONEDEILINFOCITIB

I recettori dei linfociti B sono


trimerici. Uno dei modi
attraverso cui il linfocita B
recepisceilsegnaledovutoal
fatto che gli antigeni possono
provocare laggregazione dei
recettori sulla membrana,
quindi quello che fa scattare il
segnale che porta la
preattivazione proprio la
preattivazione dei TCR che
avvienequandoleIgleganogli
antigeni. Quindi le Ig di
membrana si aggragano tra
loro e tale aggregazione porta
allamodificazionestericadelle
molecole associate alla
membrana cellulare che trasducono il segnale e che portano alla fosforilazione dei domini VCAM delle
catene Ig Ig che sono associate ai recettori. Quindi aggregazione o attivazione crociata, la cross
activationdapartediquestiantigenichepromuovelaggregazionedipirecettoridellinfocitaB.

Per quanto riguarda lattivazione iniziale dei linfociti T necessaria un altra molecola, CD45, che una
fosfatasiingradoditogliereiresiduidifosfatotirosinchinasidellafamigliaSal.IlrecettoreCD45sempre
associato al recettore per lantigene e, quando avviene laggragazione dei recettori, succede che CD45
attraversoilsuodominiofosfatasicoingradodiagiresuquestetirosinchinasidellafamigliaSalche,nei
linfocitiB,prendonoilnomediBLK;sonotuttetirosinchinasichepermettonolaprosecuzionedelsegnale
attivatorio. In condizione inattiva le tirosinchinasi sono normalmente fosforilate; quando CD45 le
defosforilalorosiattivanoepossonoiniziarealavorare.Lafosforilazioneadoperadiquestetirosinchinasi
sidiffondeneiresiduiintercitoplasmaticidellecatenedieterodimeriIgeIgchecontengonodeiresidui
VCAM, quindi vengono fosforilati a livello delle tirosine e si ha anche in questo caso laggregazione dei
recettorideiTCRfosforilatinellezatterelipidiche,analogamenteaquantoaccadeperilinfocitiT,migrano
insiemeetrasduconoinsieme.LafosforilazionedeiresiduiVCAMdeglieterodimeriIgeIgassociatialle
IgcreaipuntidiapprodoperlaproteinaSicchequindisilega.LeproteineSicsitransfosforilanotraloro
perch anchesse sono delle tirosinchinasi e iniziano tutti i processi che determinano lattivazione della
fosfolipasi C che a un certo punto genera sulla membrana cellulare fosfatidil inositolo 2 fosfato e
diacilgliceroloedancheinquestocasosihannoglistessieventicheportanoallattivazionedi:

1 ProteinchinasiC,attivazionediNFKBeattivazionedellatrascrizioneinmanieradeltuttoanalogaa
quellavistaperillinfocitiT.
2 La via del calcio: si attiva la calmodulina, calcineurina e NFAT che va nel nucleo e attiva la
trascrizioneeciportaallattivazionedellinfocitaB.

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3 SmartGproteinRASeRAFconlattivazionedellacascatamitogenactivatedkinaseMAPCHINASIe
quindisigenerailfattoretrascrizionaleAP1chevanelnucleoeattivalatrascrizione.

RIEPILOGO:ImeccanismibiochimicisonopiomenosimiliperlinfocitiBeT,naturalmenteneilinfocitiB
abbiamo un ruolo predominante di Sic al posto della catena zeta, ma sostanzialmente abbiamo gli stessi
meccanismivalidiperilinfocitiT:illinfocitariconoscelantigene,esprimeipeptidiinmembrana,esprimei
recettori delle citochine e aspetta che i linfociti Th rilascino le citochine, se il linfocita Th non si attiva il
linfocitaBnonpuandareavanti.IllinfocitaB,perprodurreanticorpi,necessitaditalecontrollodaparte
deilinfocitiTinfiammatori.SenzailinfocitiThelperlattivazionesiblocca.IllinfocitaBesprimeilsuoMHC
sullamembranaedice:okiosonoprontoastimolareilmiolinfocitaTfratello.Questesonoletreviedei
trefattoritrascrizionaliequestoquellocheavviene.

COSTIMOLAZIONEDILINFOCITIB

AncheilinfocitiBverginihannolanecessitdiaverecostimolatori,inmanierasimileaquellicheabbiamo
visto per i linfociti T. Ad esempio ricevono segnali costimolatori molto potenti quando gli antigeni che
contattano il TCR sono incrostati da C3, che un componente del complemento; quando subiamo delle
infezioni micobatteriche C3 lega lantigene e questo viene legato da dei costimolatori. In tali condizioni il
linfocita B si attiva con molta pi facilit. Questo frammento pu ricoprire il microorganismo che
penetratonelnostrocorpo,quindilantigenepulegarelIgnelsitodilegame.

Quando il nostro organismo viene invaso, ci


pu essere unattivazione del complemento
cheportaalladeposizionediquestiframmenti
su tutta la superficie del batterio. In questa
maniera i fagociti, che possiedono il recettore
per C3, lo riconoscono pi facilmente e
possono internalizzarlo con pi facilit. In tal
caso si parla di opsonizzazione del
microorganismo: opsonizzare vuol dire
rendere pi appetibile ai fagociti i
microorganismi ricoperti da questo
frammento. I linfociti T presentano anche dei
recettori che riconoscono questi frammenti come CR2 che un recettore per il complemento. Quindi si
creaunasituazionedicostimolazioneperchCR2legaquestiframmentidiC3percuisicreaunasinergiadi
segnalidapartedelBCRcheattivaletirosinchinasi.CR2associatoaduncorecettorechiamatoC19,che
appartiene anchesso alla super famiglia delle Ig, che attiva la fosforilazione: dunque la collaborazione di
questisegnalifadacostimoloediminuiscelasogliaperlattivazionedeilinfocitiB.

TraicostimolatoricancheCD81cheunamolecolamultipasso,ovveroattraversapivoltelamembrana
cellulare,edstatovistochetopideficientipertalegenesiattivanomoltomalenellastimolazionedaparte
del TCR, hanno difficolt nella maturazione dei linfociti, difficolt a montare una risposta anticorpale per
assenzadeisegnalicostimolatori.Peresempioitopik.o.perlatetraspamminapresentanounacarenzadi
IgecisignificachelapresenzadiquestamolecolaimportanteperlastimolazionedeilinfocitiB.

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Quando un linfocita B vergine esce dal


linfonodo e va nel circolo quiescente, si
trova in fase del ciclo G0 ed esprime circa
100 mila IgM e IgD sulla sua superficie di
membrana; quando arriva lantigene nativo,
il linfocita riconosce la struttura terziaria, lo
lega e tale legame favorisce il fenomeno di
cross link: si creano legami tra i recettori
dellantigene che promuovono un
aggregazionedeirecettoriTCRedessoinizia
a mandare segnali di trascrizione al nucleo.
Sihalespressionedialcunecitochine,masi
ha anche la riorganizzazione del
citoscheletro, che determina il fenomeno di
capping:polarizzazionedeiBCRnelpuntoincuilantigenenativohalegatoilrecettore.Lariorganizzazione
del citoscheletro anche funzionale al fatto che si ha il trasferimento di molte molecole nelle zattere
lipidiche.

Il fenomeno della polarizzazione dei


recettori dove lantigene stato
riconosciutoportaallattivazionediFynche
attiva Syk e alla fine questo processo porta
all internalizzazione dell antigene nelle
vescicole di endocitosi dove inizia la sua
demolizione da parte degli enzimi
lisosomiali.

Lendocitosi porta quindi alla demolizione


dellantigene, contemporaneamente
lattivazione genica porta all espressione
delle citochine e allespressione e
allassociazione di tali peptidi endocitati alle molecole di HLA di classe 2; a questo punto il linfocita
preattivato: monta i recettori per le citochine, monta i peptidi sulle membrane e spera di incontrare un
linfocitaThelperchelopossaaiutareecheloconducaavantiinquestoprocesso.Senonlotrovamuoredi
solitudine.

LapreattivazionefondamentaleedeterminalesposizionedeipeptididellantigenesuHLAII;seillinfocita
BinteragisceconunThloattivaeunavoltaattivato,ilThasuavoltaproducelecitochinecheservonoal
linfocita B per portare a termine la propria attivazione. Si tratta di un punto critico: esiste un dialogo
molecolare e questo dialogo una cooperazione; sono eventi che stanno al centro della risposta
immunitaria, cio tutti i difetti genetici a tale livello portano a immunodeficienze molto gravi: senza la
cooperazionenoinonpossiamoavereunefficienterispostaanticorpale.

DIALOGOMOLECOLARETRALINFOCITIBELINFOCITITH

PrendiamoorainesameimeccanismicheportanoallattivazionedellinfocitaT.Quandoiniziaadattivarsi,
riceve dei segnali che lo portano ad esprimere le molecole MHC sulla superficie. A questo punto,

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soprattuttoneilinfonodienellamilza,doveilinfocitiBpossonoincontrareilinfocitiT,sihalinterazione
conlamolecolaCD4,equindipuaccaderecheunlinfocitaTpossacontattareunB.Sequestosiverifica,
sihatuttaunaseriedisegnalicheportanoillinfocitaadattivarsi.

Qualisonoquestisegnali?

Uno degli eventi importanti dellattivazione


deilinfocitiT,successivialfattocheunTCR
abbia riconosciuto un MHC associato ad un
peptide esposto, lespressione del CD40
ligandosullasuperficiedeilinfocitiCD4+.Le
cellulechepresentanolantigeneesprimono
lamolecolaCD40,equandoilCD4riconosce
il suo peptide specifico nel complesso
dellMHC, una delle prime cose che fa
quella di montare sulla membrana CD40
ligando. Linterazione con CD40 sulla
superficie dei linfociti B ( CD40 appartiene
alla famiglia di TNF), presente in molte
cellule che presentano lantigene, un
evento critico perch il CD40 ligando
permette al linfocita B di segnalare
attraverso CD40 dentro la cellula e di
esporresullasuperficiecellularelamolecola
B7 che la molecola critica per fornire la
costimolazioneailinfocitiB.IllinfocitaCD4+,
per potersi attivare, deve riconoscere
lantigene e, perch ci avvenga,
necessario che il linfocita B esprima la
molecola B7. A questo punto il linfocita
CD4+ pu percepire il secondo segnale che
gli permette di portare a termine la propria attivazione. Quindi il legame tra CD40 e CD40 ligando fa
esprimereB7:questoilverosegnale2dellattivazioneequindifacilitalattivazioneperchilinfocitiCD4+
produconocitochinecheagisconosuilinfocitiBfacendolicambiarediclasse.

Questainterazionefondamentale,cisonodeibambinichenasconoconmutazionigeneticheacaricodi
CD40ligando,einquestibambinicunacompletaagammaglobuminemia:ilsistemaimmunitariononin
gradodiprodurreIgdiclasseGcontroleproteineperchilinfocitiCD4+nonriesconoadessereattivatidai
linfocitiBediconseguenzanonpossibilecommutareclassediIg.LinterazionetraCD40eilsuoligando
importantissima per la cooperazione tra linfociti, fondamentale anche perch attraverso il segnale di
CD40illinfocitaBbloccalasuapropensioneadandareincontroadapoptosi:quandostimolatoilCD40
claumentodellasintesidelleproteineantiapoptotiche.

Questainterazionefondamentaleperunfenomenochechiamato:laformazionedeicentrigerminativi
neilinfonodi.Ilinfonodisonolarealesededoveavvienelarispostaimmunitariaeneilinfonodicisonosiai
linfocitiBiT.Quandoarrivalantigeneneilinfonodi,ilinfocitiBsiattivanoedentranoincontattocoiTein
questazonadicontattosiformailcentrogerminativo,doveilinfocitiproliferanoecomincianoamutaredi
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classe.Senonsiformailcentrogerminativoneilinfonodinonsihaunarispostaproduttiva.Pergenerare
questi centri germinativi all interno del linfonodo necessaria linterazione tra CD40 ed il suo ligando. I
bambinichehannodeficienzegeneticheperCD40ligandosonoprividilinfonodiconcentrigerminativi.I
linfocitiBnonproliferano,lindividuononproduceanticorpiditipoIgG,producesoloIgDeIgMingradodi
riconoscereglizuccheri,manonvengonofattiglianticorpicontroleproteine.Unaltrafunzioneimportante
dellinterazione tra CD40 e CD40 ligando dovuta al fatto che il CD40 fa indurre CD23 che unaltra
molecoladicostimolazionedeilinfocitiedimportanteperchcontribuisceallaproduzionedeilinfocitiB
della memoria. Quando i linfociti B proliferano attivamente, sono protetti dall apoptosi e alcuni di essi
hanno capacit di vivere a lungo diventando linfociti della memoria. Inoltre CD40CD40 ligando un
segnalechefacilitainmanieraindirettailrilasciodellecitochinedapartedeilinfocitiTperchfacendo
esprimereB7fannoattivareilinfocitiT.Quandomancataleinterazionesigeneraunquadromoltopesante
diimmunodeficienzaperchsigeneraunfenomenoditolleranzadeilinfociti.

RIASSUNTO: Le varie tappe della cooperazione dei linfociti B e T> il primo lega lantigene in maniera
specifica,lointernalizzaedingradodiesprimeresullasuperficiecellulareirecettoriperlecitochine.A
secondadellecitochinechevengonoprodottedailinfocitiT(seINF,IL4,etc..)variailtipodiIgprodotta:

SevieneprodottaIL4,sarprodottasoprattuttoIgE
SevieneprodottaIL10,laproduzionedianticorpisarspintaversoleIgA

Inseguitoallespressioneinmembranadelrecettoreperlecitochine,illinfocitaBdiventaricettivoperle
citochine. I peptidi antigenici sono internalizzati, demoliti e riespressi sulle molecole di MHC II.
Naturalmente ci sono molti di questi segnali che, insieme ai segnali di adesione, favoriscono lattivazione
dellinfocitaTequindimettonoincondizioneillinfocitaThdiattivarsi.Maquellochemoltoimportante
perlasuaattivazioneilsegnalelegatoallostimolodiCD40cheportaallespressioneinmembranadiB7e
dlapossibilitdisentireilsegnale2dellattivazioneecliniziodellaproduzionedellecitochine.Quando
ilCD28avvisailThdellavvenutocontattoconlantigene,siattivalasintesidelmessaggerodellecitochine;
essevengonorilasciatesullasuperficiedeiB.IllinfocitaBinrispostaallecitochinepuattivarsiepudar
luogoadunaamplificazioneclonale.Dipendemoltodalmicroambienteincuisitrovaillinfocita.

Laltra cosa importante che il linfocita B,


oltre a proliferare, incomincia a produrre
anticorpi in forma solubile. Lattivazione dei
linfociti B cambia latteggiamento dei linfociti
che diventano proliferanti, per questo sono
detti blasti: sono dei tipici linfociti che
cambiano anche la loro morfologia; siccome
sono sottoposti a molte divisioni cellulari,
hannonucleimoltoevidenti,infattiaumentail
volume del nucleo: il rapporto tra nucleo e
citoplasma si sposta a favore del nucleo. Il
blasto quindi un linfocita B che sta
attivamente proliferando e che pu andare
incontroaduedestini:

1. differenziazione in plasmacellule: macchina per produrre anticorpi in forma solubile, una


macchinamoltoefficienteedopounpovaincontroamorte.

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2. differenziazione in cellule della memoria che possono vivere molto a lungo, anche anni. Per
esempioperiltossoidetetanicoriusciamoadesserecopertiancheadistanzadi10annidalvaccino.
QuestisonodeilinfocitiBchepersistononellorganismo.

Nota: la memoria dipende dalle caratteristiche dellantigene, dalla stimolazione e dalle condizioni
ambientalieintrinsechedelsistemaimmunitario,manondipendedallagravitdellamalattia.

IlinfocitiBdellamemorianonsecernonoIg,tornanoinunasituazionediquiescenza,mapossonoessere
attivate dallo stesso antigene. Essi sono quelli che ci forniscono la protezione dalla malattia durante i
protocollivaccinali,perchquandosivaccinasiinduceunarispostaimmunitariachegeneralinfocitidella
memoriaesarannoquellicheciproteggonodalpatogenorispettocuisiamostativaccinati.

Il differenziamento dipende dalle interazioni


casuali a cui va incontro il blasto, dipende
moltissimo dai segnali CD40CD40 ligando che
bloccano lapoptosi. Un'altra molecola CD23,
espressa da un particolare tipo di cellule
follicolaridendritiche,lequalistannoneifollicoli
(danonconfondereconlecelluledendritiche)e
stimolano continuamente i linfociti che hanno
riconosciutolantigenefavorendolaproduzione
anticorpale in maniera molto ripida. Esse
esprimono anche una molecola che si chiama
CD23 che, quando interagisce col linfocita B, lo
spingeadiventareunaplasmacellula.

La produzione di anticorpi a carico delle plasmacellule, che sono la forma differenziale terminale dei
linfociti B. In seguito all interazione dell antigene coi linfociti B, devono passare circa 48 ore affinch il
linfocita inizi a proliferare. La vita media delle plasmacellule pu durare da giorni a anni e dipende dalle
interazioni che hanno con il microambiente, sono in genere bloccate in fase G1 ed S del ciclo cellulare e
ognunadiquestecelluleproduceunasolaclasse
di Ig. Quindi se una cellula riconosce lantigene
conleIgMeleIgDepoicommutalasuaclasse
in seguito allo stimolo citochinico in IgG, tale
celluladiventerplasmacellulaeprodurrquell
Ig per sempre, nelle plasmacellule non mai
possibile effettuare la commutazione di classe.
La loro capacit di produrre Ig enorme,
produconocirca2000Igalminuto.Perogniml
di siero, se consideriamo le Ig totali, ci sono 15
mg di Ig. Ciascuna pesa 150 k Da, quindi
abbiamo6x1018Igperognimldisiero.

Occorrono 144 ore perch differenzino completamente: dapprima il linfocita diventa un blasto, il suo
nucleomoltogrosso,unapartediquestilinfocitiprolifera,unapartediventacelluledimemoria,ilinfociti
proliferantiinizianoadifferenziarsi,ilnucleocomparereniforme,siformaunabbondanteRERcheindica
un attivissima produzione di proteine. Questo reticolo diventa molto evidente e il nucleo inizia a

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restringersi.LaplasmacelluladunqueunagrandecellulariccadiREcheproducegranulidiIgepoialcune
diessesopravvivonomolto,nelmidollo,altremuoionoinfretta.

LARISPOSTADEILINFOCITIB

Lantigene seleziona il BCR: tra tutto il


repertorio possibile viene selezionato il BCR
che meglio si lega dal punto di vista
complementare a quellantigene. Quindi, per
ottenere una risposta da parte dei linfociti B,
bisogna avere un BCR che sia in grado di
interagire con questo antigene ad elevata
affinit. I peptidi che ne derivano devono
permettere laiuto dei linfociti Th e questo
determina una risposta che possiamo definire
rispostamonoooligoclonale:significacheun
linfocitasiattivasolamenteinrispostaad un
singoloantigene;siccomelaproteinapuesserecomplessa,cipuesseresullasuperficiepidiunepitopo
cheattivailinfociti.Ilinfocitipossonodareorigineadueotreclonidiretticontroideterminantidiquesta
famiglia,intalcasolarispostadefinitaoligoclonale,dapartedipochilinfocitiBchehannoriconosciuto
determinatiantigeni.

Nel sistema immunitario solamente i linfociti B riconoscono lantigene nella forma terziaria, mentre i T
riconoscono solo peptidi lineari, per entrambi sono capaci di fagocitare lantigene e associarne i peptidi
sulle molecole HLA. Solamente i linfociti B,
perilfattochesonoingradodiinternalizzare
lantigene da parte di un recettore specifico,
sonocapacidicaptaretraccemoltopiccoledi
antigene,dellordinedi1012.Sonogliunicia
captare tracce molto piccole di antigene
perch hanno un recettore ad elevatissima
affinit. Una cellula dendritica, per potersi
attivare, deve mangiare grandi quantit di
antigene e lo internalizza in maniera
aspecifica perch non usa un recettore
specifico.

TalelivellodispecificitdeilinfocitiBpermettediscatenarerispostespecifichecontroantigenipresentiin
piccole quantit. La capacit di endocitare permette a questo antigene captato a piccolissime
concentrazioni di essere concentrato nelle vescicole. In questa maniera, concentrandolo ed esponendolo
sulle molecole MHC, riescono a raggiungere il valore soglia di concentrazione antigenica, tale per cui i
linfociti T lo possano vedere. (NB: ricordate che i linfociti T possono vedere l antigene, ma se non
espressoaconcentrazionisufficientisullasuperficiecellularesiverificailfenomenodellatolleranza,invece
i B captano piccole concentazioni di Ag, lo concentrano e lo espongono in quantit sufficiente per i Th
affinchsiavisto.)Seciavviene,ilinfocitiThattivaticollaboranocoiBtramitelaproduzionedicitochine
chealorovoltainduconoiBarilasciareIg.Nelquadrogeneraledellarispostaimmunitariasihachefare
con linfociti T che interagiscono con cellule che presentano lantigene, cellule dendritiche che hanno
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internalizzatolantigeneelohannoespostosullamembrana.IlinfocitiTpossonoriconosceretaleantigene
edarluogoadunarispostaproliferativa.

Pu succedere che il linfocita T, che ha riconosciuto un antigene sulle cellule dendritiche, riconosca lo
stessoepitoposullecelluleB,quindiquestainterazionediventacriticaperchpermetteaquestolinfocitaB
diattivareilTeproseguirenellattivazione.PertantoquandoillinfocitaThsimetteaprodurrecitochine,
in grado di dialogare con B1. Un linfocita B3 che ha un altro recettore, non in grado di interagire col
linfocitaB1,quindinonsarattivatodaesso.Soloqueltipo1dilinfocitaB,cheesprimerlostessopeptide,
saringradodiproliferareunavoltaricevutoilsegnalecitochinico,perpoidifferenziarsiinplasmacellulee
produrreanticorpi.UnaltrolinfocitaBchenonhainternalizzatolostessoantigeneechenonhalastessa
specificitperilThelper,nonpuproseguirenellasuaattivazione.IllinfocitaB1vieneattivatoattraverso
talemeccanismodisecrezionepolarizzata.IllinfocitaB3invecenonsenteilsegnaledellecitochine,maun
altro linfocita B2, che pu trovarsi nel microambiente ed capace di captare lo stesso antigene e quindi
pumettereinmembranalostessopeptide,analogamentealB1potrproseguirenelladifferenziazione.Lo
fannosoloilinfocitiBcheinternalizzanolospecificopeptideechehannocontattatoillinfocitaTspecifico
perquelpeptide.Abbiamounarispostaoligoclonale,dueclonicontrounastessaproteinanativa.

NellarispostadeilinfocitiBabbiamo3tipidirisposte:

1. Policlonali > ci spingono a introdurre il concetto di mitogeno: una sostanza che fa proliferare i
linfociti B in maniera aspecifica.Ci sono alcune sostanze, come ad esempiolbs, che sono in grado di
attivarelaproliferazionedeilinfociti.
2. Oligoclonali>devonorifarsialconcettodiAg.Illinfocitainteragisceinmodospecificoconlantigene.
3. Timoindipendenti>ilinfocitiBpossonoinrealtrispondereanchesenzalinterventodeiT,questo
tipo di risposte senza laiuto dei T sono dette timo indipendenti perch esistono degli antigeni in
natura che inducono una risposta anticorpale senza necessit dell intervento dei B: per esempio i
linfociti B possono fare anticorpi contro gli zuccheri. Questo tipo di antigeni vengono chiamati timo
indipendenti e portano ad una risposta essenzialmente limitata alle Ig di classe M, priva di memoria
immunitaria.Questarispostaanticorpalenondialtaqualit.SiccomenonintervengonoilinfocitiT,
non viene generata nessuna memoria: tali linfociti rispondono, fanno anticorpi IgM e poi muoiono
senzalasciaretracciadimemoriaimmunitaria.

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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli

TIPIDIRISPOSTEPROLIFERATIVECHEPOSSIAMOAVERECONILINFOCITIB
Alcunesostanze,soprattuttosostanzechehannopolimeridideterminatimoltoripetuti,possonoagiresui
linfocitiBtrasmettendosegnalidiproliferazioneeattivazione.Questisegnalisonotrasmessiamoltilinfociti
contemporaneamente indipendentemente dalla specificit antigenica; questo significa che un grande
numerodilinfocitiBpuandareincontroaproliferazione.
Talisostanzevengonodettemitogene:chedannounarispostapoliclonalemoltoestesa.
AlcunilinfocitiBpotenzialmenteautoreattivipossonoessereespansidaquestareazione,quandosostanze
comelaldsinduconolaproliferazioneindipendentementedallantigene,percipossonoesseresituazioni
incuiquestilinfociticomincianoamontareunarispostacontroilself.
Normalmente le risposte proliferative dei linfociti B vengono definite oligoclonali, questo significa che
spesso, quando un antigene viene riconosciuto nella sua forma nativa, possiede 234 determinanti
antigenici che sono in grado di attivare ed essere riconosciuti da specifici cloni e quindi contro questo
antigene si sviluppa una risposta oligoclonale. Questo tipo di risposte hanno sempre a che fare con una
specificitantigenica.

IlinfocitiBpossonorisponderecontroantigenidettitimoindipendenti.

QuestiantigenistimolanounarispostaproliferativadeilinfocitiBescatenanounarispostaanticorpale,ma
soprattuttoperquantoriguardaantigenicomezuccheri,polisaccaridi,larispostaproliferativachenederiva
limitataallesottoclassiIgMperchquestiantigeninonvengonopresentatidalleantigenpresentingcells,
quindinonvengonovistidailinfocitiThelperchepertantononaiutanoilinfocitiBafareanticorpidiclasse
IgG.

IlinfocitiBriconosconogliantigeni,peresempiosullaparetediqualchebatterio,siattivanoedannouna
rispostaanticorpaledigenereIgMdibassaqualit.Larispostadibassaqualitinquantolimitatanel
tempoe non d origine a linfociti T della memoria, infatti solamente i linfociti T helper, attraverso CD40
ligandoeCD40,sonoingradodidareilsegnalecheproteggeilinfocitiBdallapoptosieneaumentalaloro
sopravvivenza.
>Inassenzadiquestisegnali,ilinfocitiBdannoluogoadunarispostaanticorpale,cheancheprotettiva,
mamoltolimitataneltempoenondorigineanessunamemoriaimmunitaria.

Questiantigenitimoindipendenti,dopoesserestatilegatidalBCR,induconounaproduzioneanticorpale
senzalanecessitdiaverelacooperazionedeilinfocitiT,quindigliantigenitimoindipendetiagisconocome
deimitogeni>induconodirettamenteunattivazionedeilinfocitiB.

Chiaramentegliantigenitimoindipendentigeneranounarispostaanticorpalecaratterizzatadaunabassa
affinit,perchquandogliantigenisonotimodipendentielarispostadeilinfocitiBdipendedailinfocitiT
nel centro germinativo, dove si forma questa risposta, vi uno stretto contatto tra linfociti B attivati da
antigeni timo dipendenti con cellule follicolari dendritiche, per cui vengono continuamente stimolati a
proliferare.Lintensaproliferazionedeterminamutazionipuntiformineigenidellecatenevariabili,percui
sihaunaselezioneditipodarwinianoversoiclonicheproduconoanticorpiapialtaaffinit.

Quando intervengono i linfociti T, si ha la maturazione di anticorpi in termini di affinit, mentre per gli
antigenitimoindipendentiquestononavviene:vienegeneratounanticorpodiclasseIgMenonsiverifica
mai la commutazione di classe, che consiste nel cambio di classe della catena pesante della
immunoglobulinaconuneffettochedirettamentedipendedallecitochine.

Sono le citochine che fanno commutare le classi e le queste sono prodotte dai linfociti Thelper, dunque
solamenteiThsonoingradodipromuoverelacommutazionediclasse.

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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli

Alla fine si ha anche unassenza di memoria perch, non essendoci contatto tra CD40 del linfocita B con
CD40 ligando del T helper, non si generano segnali che prolungano la sopravvivenza del linfocita B e che
quindigeneranolaproduzionedilinfocitiTdellamemoria.

ANTICORPI
Glianticorpisonodefinitiancheimmunoglobulineesonomolecolemoltonumeroseneiliquidiorganicie
nel siero (parte non cellulare sangue) dove si trovano in quantit di circa 15 mg/ml che corrisponde,
considerando il peso molecolare medio di ogni molecola di immunoglobulina di 150kDa, a circa 6x1018
molecolediimmunoglobulinaperml.

STRUTTURA
Strutturalmentesonocostituiteda4cateneugualiadueadue:2pesantie2leggereehannounastruttura
tipicaadY.
Hannounaparticolareformamolecolareconduebracciaeunacodadoveesisteunazonadettacerniera
che conferisce loro una certa plasticit permettendo di adattarsi bene agli antigeni; fanno s che queste
sostanzesianomoltoappiccicose.
Una delle qualit degli anticorpi quella di appiccicarsi agli antigeni alterandone spesso la funzione:
quandocisonobatteriovirusvisiattaccanoimpedendoviilfunzionamentoesonomoltoefficaci.
Sonocostituitidaunapartevariabileedunapartecostante,chesonodueporzionidistinte:quellavariabile
lega il suo bersaglio specifico, invece quella costante attiva i meccanismi per eliminare lantigene che
stato riconosciuto. Linterazione della coda dellanticorpo con alcune cellule, come i fagociti o i recettori
specifici,determinalafunzionebiologicadellimmunoglobulina.

unapartelegalantigene
laltraparteguidalafunzionebiologica

Ogni molecola possiede due siti per lantigene e spesso necessita il riconoscimento di due molecole di
antigenecontemporaneamente.
Ogni catena leggera in combinazione con quella pesante forma un sito di legame e laltra catena leggera
con quella pesante forma un altro sito di legame esattamente uguale; le immunoglobuline poi possono
polimerizzareindimeriopentametri.
Unacatenapesanteedunacatenaleggeradelleimmunoglobulinehannounapartevariabilecodificatadai
segmenti variabili dei geni per le immunoglobuline e quindi questa parte diversa in ogni clone del
linfocita.Diconseguenzanoigeneriamoalmeno1011partivariabilidiverse,possiamolegareinlineateorica
1011molecolenonself.
LepartivariabilidellIgsonougualiaquelledellinfocitaBprogenitorechesiattivatoaplasmacellula.
Questo linfocita legher lantigene attraverso la sua parte variabile, ma la sua parte costante potr
cambiaredurantelasuaesistenza:quandodiventamaturomontaIgMeIgGchefunzionanodarecettore;
quando viene stimolato comincia a produrre IgM che nel corso della sua esistenza pu interagire coi T
helper,commutarediclasseediventareunIgEounIgA.Laspecificitverrconservata,mamonteruna
partecostantediversaattraversounaltromeccanismodiricombinazioneperchattraversounsegnaledi
citochineigeniverrannoriarrangiatipermontareparticostantidiverse.
LapartecostantedellIgleconferiscelecaratteristichebiologiche:

IgG>neutralizzaivirus
IgA>protezionealivellodellemucose
IgE>risposteallergiche

La parte costante cambia durante la maturazione antigene dipendente poich lantigene determina la
maturazioneclonaleelinterazioneconillinfocitaThelperfarcommutarelapartecostante.

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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli


Dal punto di vista operativo
possiamo suddividere la molecola di
immunoglobulina in pi segmenti
simili:lapartevariabilechecontiene
la parte che lega lantigene viene
chiamata anche Fab (primo), e se
consideriamo questa parte variabile
tutta insieme viene anche
considerataFabpreso2volte.
La parte costante viene definita
frammento cristallizzabile indicato
conlasiglaFc.


Su molti leucociti esistono recettori per i frammenti Fc che si legano tramite diverse affinit alle diverse
frazioniFc:daquesteinterazionisideterminailtipodireazioneimmunitariaequindilafunzionebiologica
deglianticorpi.
Nella porzione Fab avviene il riconoscimento specifico dellantigene, mentre nella frazione Fc avviene
linterazioneconlecelluledelSIcheguidanolazionedeglianticorpi.

Dal punto di vista della struttura tridimensionale


un anticorpo presenta diversi domini globulari
con foglietti beta antiparalleli che formano vari
domini.InFabcilsitodilegameperlantigene,
inceve la porzione Fc con due domini globulari
avr a livello dei vari domini dei residui di
zuccheriinquantositrattadiunaglicoproteina>
questaporzionemedialazionebiologica.
La molecola estremamente flessibile: possiede
foglietti beta compattati, si lega allantigene e la
zona cerniera particolarmente flessibile
rendendo la molecola appiccicosa e facendo in
modo che pi antigeni possano legarsi
contemporaneamente.
Lapartevariabiledellecateneleggerepuessere
montata su due tipi di parti costanti: k e , che
dal punto di vista funzionale non presentano
alcunadifferenza.

CLASSIDIIMMUNOGLOBULINE
Lapartevariabilevienemontatasu5tipidifferentidicatene:,,,ed
Corrispondonoagliisotipi:
>IgM
>IgD
>IgG
>IgA
>IgE
Ognuna di queste catene conferisce una particolare funzione alle immunoglobuline, poi alcune di queste
(gammaedalfa)possiedonodeisottotipi,percuiognunadefinisceunasottoclassediIgepoiallorointerno
esistonoulteriorisottoclassicheledistinguono.
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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli

IGM
Sono le prime immunoglobuline che vengono
secrete, funzionano come recettori per
lantigene ed in genere nei liquidi corporei le
troviamocomepentameri.
Ogni monomero fatto da 5 domini tenuti
insieme da un peptide chiamato J; ogni
segmento lega due catene attraverso ponti
disolfuro, ed essendo pentameri, hanno 10 siti
dilegameperlantigene.

Lecaratteristicheprincipalisonocheattivanomoltobeneilcomplemento:unsistemadiproteine
sieriche che ha funzione soprattutto antibatterica, infatti sono una serie di proteine inattive nel
sierocheallarrivodellantigeneedellIgMpossonoformaredeisistemidiattaccoallamembrana
battericadeterminandoneluccisione.
Unaltra caratteristica che non riescono a passare il filtro placentare e non possono quindi
difendereilfetodurantelagravidanza.
OgniIgMpulegareda5a10determinantiantigenici.
Sulla membrana c sempre la forma monomerica delle IgM, nel siero e nei liquidi corporei
troviamolaformapentamerica.
NonesistonoinnaturadeirecettoriperleIgM,mentreneesistonoperIgG,IgEeIgA.

IGD
Sono immunoglobuline estremamente flessibili perch la regione cerniera chiamata ING,
particolarmenteestesacomelunghezza.
Le IgD possono essere espresse dal linfocita B quando passa da immaturo a maturo: quando
immaturo non esprime le IgD in membrana, quando supera lultimo step della maturazione
acquisisceleIgD.
Sonopresentiinpochissimetracceneiliquidicorporeiperchfungonoessenzialmentedarecettori,
la loro estrema flessibilit le rende particolarmente adatte a lavorare sulla membrana e ad
interagirecongliantigeni.
Caratterizzano una particolare neoplasia di tipo B chiamata mieloma: alcune cellule B si
trasformano in tumorali e alcune di queste possono essere linfociti B maturi; avere in circolo
parecchilinfocitiBcheesprimonoIgDsullasuperficieunparticolaresegnodiagnostico.

IGG
Neesistono4sottoclassidiversipoichcstataunaduplicazionedeigenidellaporzionecostante.
Questi4segmenticodificanoper4tipidicatenacostantechespecificano4sottoclassi:IgG1,IgG2,
IgG3eIgG4.
Le differenze riguardano soprattutto la regione cerniera e i ponti disolfuro che si creano tra le
catenepesanti:ladifferenzatraIgG1eIgG2haachefareconlaregionecernierachepuesseredi
diversa lunghezza e con ponti disolfuro che si possono creare tra le due catene pesanti e altri
legamiintercatenachesigeneranotralecateneleggereelecatenepesantichecaratterizzanoIgG1
piuttosto che IgG2. IgG3 consiste in unimmunoglobulina con numerosissimi ponti disolfuro tra le
catenepesantieanchetralepesantieleleggere.
Costituisconodal70%all80%ditutteleimmunoglobulinecircolanti,quindisonoimmunoglobuline
sieriche.

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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli

IGA
Sono in assoluto lisotipo pi numeroso dellorganismo, ed anche pi numeroso di tutti gli altri
isotipimessiassieme.
Letroviamosoprattuttoalivellodellemucosechenesonoricoperte.
Hannounruolostrategicoperdifenderci:siappiccanoaimicrorganismichecercanodientrarenel
nostroorganismo.
Ne esistono 2 sottoclassi leggermente diverse, la cui differenza dovuta alla presenza di ponti
disolfurotralecateneleggereelecatenepesanti,manonsiconosceunadifferenzasostanzialedal
puntodivistafunzionale.
In genere nel siero sono in forma monometrica o dimerica, mentre a livello delle mucose le
troviamosempreinformadimericaeimonomerisonotenutiinsiemedalpolipeptideJ(stessoche
legaleIgM);questevengonochiamateIgAsecretorie.

Le IgA secretorie sono importantissime la difesa dallingresso dei virus nel nostro
organismoeletroviamonelcolostro(ilprimolatteprodottodallamadrecheimmunizzail
bambinoche,appenanato,nonhaunSImoltosviluppato),nellasaliva,nellelacrime,nella
mucosarespiratoria,nellamucosagastroenterica,nellabile;neiliquidiorganiciinvecesono
la seconda classe pi abbondante, dopo le IgG, mentre a livello delle mucose sono le pi
abbondanti.

Dalpuntodivistabiologicoilnostroorganismoalivellodellemucosetappezzatodaunapparatolinfoide
moltoorganizzato.
Alivellointestinale,nellasottomucosa,lingressodegliantigenideterminaunaforterispostaimmunitaria,
percuisipossonodifferenziaredelleplasmacellulecheproduconoIgAinformamonomericaedimerica.
Nella parte basale dellepitelio esiste un recettore che
lega le IgA dimeriche prodotte dalle plasmacellule; il
legame con questo recettore fa s che si crei una
vescicoladiendocitosicheintrappolalaIgAeattraversa
tutta la cellula endoteliale trasportandola al di fuori
dovesvolgelasuafunzione.
Questo meccanismo si chiama transcitosi ed molto
spiccato nelle mucose: dapprima il recettore viene
espressoinmembranaconlIgAlegata,poiquestaviene
secretaconpartedelrecettoreagganciato;sembrache
questo recettore rimanga legato alle IgA per
proteggerledalladegradazioneenzimatica.

PIRG:peresseresecrete,leIgAsileganoalrecettoreperleimmunoglobulinepolimeriche(PIGR),espresso
sullamembranadellecelluledellamucosa,estabilisconodeipontidisolfuroconlecisteinedeidominiCH2
delleIgAdimeriche.Questorecettoreappartieneallasuperfamigliadelleimmunoglobulineedpresente
costitutivamente sulla superficie delle cellule epiteliali, per durante la risposta immunitaria, quando i T
helper cominciano a produrre INF e TNF, viene maggiormente espresso e quindi le cellule della mucosa
diventano pi abili a captare IgA e a portarle allesterno. responsabile dellendocitosi e dellesocitosi
dellIgAequindineguidailviaggiodallinternoallesterno;nerimaneattaccounpezzo,dettosecretorio,
cheproteggeleIgAdalladegradazioneenzimaticaunavoltaesposteallesterno.
Questirecettorisileganoalleimmunoglobulinepolimeriche,inparticolareallacatenaJ,quindinonsoloalle
IgA,maanchealleIgMpentameriche,pertantopusuccederecheleIgMpentamericheleghinoilrecettore
evenganotrasportatealdifuoriconlostessomeccanismodelleIgA.
Irecettoriperleproteinepolimerichesitrovanosoprattuttosullamembranabasaledellecelluleepiteliali
secretorie, mediano il processo di transcitosi e le immunoglobuline polimeriche secrete costituiscono la
prima linea difesa contro i patogeni che stanno allesterno, di cui favoriscono leliminazione soprattutto
tramitemeccanismiditipofisico(cigliaoperistalsi).
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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli

Il SI a livello mucoso molto diffuso, infatti abbiamo una superficie estremamente elevata di mucosa e
quindi a livello di questi tessuti abbiamo sempre un tessuto linfatico associato alle mucose. stato
calcolato che questo tessuto ha una superficie di 400m2 (mucosal associated linfoid tissue), e si ha un
controllomoltoattentodituttoquellochearrivadallesterno.

Questotessutocostituitoda:
Cellule epiteliali a contatto con lesterno al di sotto delle quali ci sono numerosi linfociti che
possonoriconoscerelantigeneeiniziarerisposteimmunitarie.
Inframmezzate alle cellule epiteliali ci sono le cellule m che hanno la capacit di intrappolare e
fagocitaregliantigeniprovenientidallesterno.
Celluledendritiche
Macrofagi
LinfocitiTeB

Gliantigenisonocaptatidallecellulechepresentanolantigenealdisottodellamucosaepossonoessere
vistidailinfocitiTedailinfocitiB;insiemedeterminandolattivazionedeiBassiemeaiTesappiamoche,
quandoneitessutilinfoidisecondariunantigenevienevistocontemporaneamentedaiTedaiB,siforma
un centro germinativo che vede linfociti B al centro e i T attorno, a formare una specie di corona.
AllinternodelcentrogerminativosihaunaproliferazionedeilinfocitiBchehannoriconosciutolantigene,
si ha la commutazione di classe e si generano plasmacellule che cominciano e secernere IgA, le quali
vengonocaptatedairecettoriperleimmunoglobulinepolimericheetrasportateallesternodellamucosa.
Alloraallinternodellemucoseesistonotantissimeplasmacelluleelaloroconcentrazionepiaccentuata
perquantoriguardaleIgA.
Al di sotto delle mucose troviamo grandi follicoli con centri germinativi che indicano che stato
riconosciutounantigeneesistaelaborandounarispostaditipoB.
DunqueleIgAsonoimportantissimeperbloccarelingressodivirus,hannoquindiunattivitstrategicaper
lorganismo,peresempiotuttiiviruschepenetranodallintestinoeivirusrespiratorisonobloccatidalleIgA
alivellodelmuco,deibronchiedellintestino.
Lapoliomeliteeraunamalattiaviralechestatacontrastatadallavaccinazionefattaattraversoilvaccino
prodottoprimadaSalkepoidaSabin;unodeigrossisuccessidelvaccinodiSabin,somministratopervia
orale,chelimmunizzazioneperviaorale,adifferenzadelprecedentevaccinochevenivafattoattraverso
uniniezione,induceunapotentereazionedapartediIgA,mentreglialtrivaccinisoprattuttodiIgG.

Oltreallattivitantivirale,leIgApossiedonounattivitantitossinica,possonobloccareletossine:
adesempiolatossinacolerica,introdottatramiteglialimenti,vieneneutralizzatadalleIgAchesono
moltoappiccicose,laleganoeleimpedisconodipenetrarenellecellule.
PerindurresecrezionediIgAsiusanovaccinioralionasali,lantigenepassaperlemucoseegenera
rispostaimmunitariadapartedelleIgA.
Hanno anche unattivit antibatterica perch le IgA dimeriche inibiscono ladesione dei batteri
allepitelioequindilaloropenetrazionenellepitelio.
Sono inoltre in grado di attivare il complemento attraverso una via alternativa, generando una
rispostacheportaallalisidimoltibatteri.
InfinelapresenzadiIgAbloccamoltemolecoleantigenicheimpedendochegliantigenipenetrino
nellemucoseequindinelnostroorganismo.

IGE
Sonodelleimmunoglobulinecon5dominiglobulari,alcunenehanno4altre5.
NelsieroleIgEsonopresentiinpiccolissimequantit:0,001mg/ml,praticamenteinesistenti.
La maggior parte le troviamo legate al recettore Fc, particolarmente diffuso sulla superficie di
mastocitiebasofili,sileganoconfacilitetendonoanonstaccarsimai.QuandoIgElegataaFc,
d un segnale di sopravvivenza cellulare ai mastociti; quando per si lega a Fc in presenza
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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli

dellantigene, il mastocita comincia a degranulare e ad espellere mediatori dellinfiammazione


comelistaminaemetteipresuppostipergenerareunarispostaditipoallergicoedianafilassi.

Quando arriva lantigene, le IgE lo legano e si forma un legame crociato che manda alla
cellulailsegnaledidegranulare.Quandoveniamoparassitatidalvermesolitariogeneriamo
delle IgE e, quando le IgE sono legate allantigene del parassita, queste inducono la
degranulazione: in pochi minuti la cellula libera istamina e viene stimolata la peristalsi
intestinalealfinediespellereilparassita.

Abbiamo attivazione delle IgE anche in situazioni allergiche nelle quali particolari individui sono
responsivi a molecole chiamate allergeni. Quando lallergene lega le IgE legate al recettore Fc,
provocaladegranulazionedelmastocitachecausailfenomenodellallergiaconprurito,starnuto,
raffreddoredafieno;sequestareazioneavvienealivellosistemicosihailfenomenodellanafilassi
chepuportareamorteinseguitoalbloccodellamuscolaturadellarespirazione.

Pesimolecolari:
IGG:150170kDa
IGA:variaasecondachesiamonomerica150kDaodimericafinoa600kDa(bisognaconsiderareilpeso
dellacatenaJ)
IGM:comepentameri900kDa
IGD:180kDa
IGE:190kDa

Laconcentrazionerelativadituttequestesottoclassinelsieropiuttostoelevatasoprattuttoperquanto
riguardaleIgG(circa8g/ml);laIgG4lamenorappresentatatratuttelesottoclassi;leIgAsonoseconde
alleIgG;leIgMsonopocopresentiperchprodottesoprattuttonellaprimafasedellarispostaimmunitaria;
leIgDnonsonopresentiperchagisconocomerecettoriecosancheleIgEperchstannosuimastociti.
Lavitamediadifferente,quelleconunemivitamaggioresonoleIgG1,leIgG2eleIgG4.
SolamenteleIgGattraversanolaplacentaequindisonoleunichechegarantisconodurantelavitafetalela
protezionealfeto.

Ilcomplemento:
Viene attivato dalle IgG attraverso la via classica, cio innescata dal riconoscimento dellantigene; le IgM
sonoquellepibraveadattivarloperchpossonovederemoltiantigenicontemporaneamente,mentrele
IgA normalmente non attivano il complemento attraverso il legame con lantigene ma tramite una via
alternativa;lealtresottoclassinonsonoingradodiattivarlo.

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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli

AFFINITAANTICORPALE
Glianticorpirappresentanounmeccanismoprotettivo,vengonoprodottineicentrigerminatividellinfatico
eneltessutolinfaticoassociatoallemucose,agisconoadistanza.
La loro risposta o la loro capacit protettiva viene indotta rapidamente nellorganismo, ma ci vogliono
alcuni giorni per produrre una buona risposta anticorpale; tuttavia in questo arco di tempo. Pi
immunizziamounindividuoconundeterminatoantigene,piproduciamoanticorpidimigliorequalitche
quindihannounamaggioraffinitdelsitocombinatorioperlantigene.
Unacaratteristicaimportantechevannoincontroallacommutazionediclassepercuilediversesituazioni
dipericolochesigeneranodannounsegnaleperprodurrelasottoclassepiadatta.

I migliori anticorpi sono quelli che hanno laffinit maggiore; lanticorpo lega lantigene secondo questa
leggedellequilibrio:[Ac][Ag]>><<[AcAg](reazionereversibile)
Laconcentrazionedellantigeneedellanticorpoinequilibrioconquelladelcomplesso,reversibileepu
andare da una parte o dallaltra a seconda delle concentrazioni dellantigene, dellanticorpo e del
complesso.Inoltrelanticorposipustaccare.

Laffinit nientaltro che la quantit di antigene necessaria affinch il 50% dei siti dellanticorpo siano
occupatidallantigene.
Pilanticorpoaffineallantigeneminoresarlaquantitdiantigenenecessariaperraggiungereil50%di
saturazionedeisiticombinatori>elevataaffinitsignificachebastapocoantigenepersaturareil50%dei
sitideglianticorpi.

Ilconcettodiaffinithaachefareconilconcettodicomplementariet
spaziale.
Si generano tante forze deboli che mantengono il legame: facile
formareillegamemadifficiledisfarlo.
Laffinit quindi dipende dalle forze di legame che si generano
dallinterazione tra antigene ed anticorpo. Se la complementariet
spaziale minore, si generano meno forze deboli tra antigene ed
anticorpo, quindi il legame pi fragile. Questi legami non sono
covalenti, ma sono legami multipli e sono legami deboli. La forza di
questi legami influenzata dalla distanza su base logaritmica, quindi
cicheimportaladistanzafisicatraantigeneedanticorpo.

Laffinitdiunantigeneperunanticorporisultadaalmeno3fattoricombinati:
- Estensionedellareadicontatto:piestesa,piforzedebolisigeneranoatenerleunite
- Numerodilegamichesiformano
- Complementarietspaziale
-
Sipossonogenerarediversitipidilegamechesigeneranotraantigeneeanticorpo:
- Pontiidrogenotraatomiconcaricaelettronegativaedaltriconcaricaelettropositiva
- Legami idrofobici tra gruppi ionici con cariche elettriche opposte ed escludono lacqua da questo
legame
- ForzediVanderWaal,dipendentidalladistanzaallasettimapotenza;>F=1/d7
- Forzedinaturaelettrostaticachedipendonodalladistanzaconunesponentedibase2,pifortidi
quellediVanderWaal;>F=1/d2

Unlegameadaltaaffinitunlegameincuituttequesteforzedebolitendonoadavvicinarelantigenee
lanticorpo,mentreinunlegameabassaaffinitquesteforzedebolitendonoadesserepiseparate.
Maggiorelaffinitdiunanticorpo,pibassasarlaconcentrazionediantigenenecessariaaformareil
complessoantigeneanticorpo.

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Immunologia lezione 12 19.04.13 Novelli

AVIDITAANTICORPALE
Bisognacorreggereilconcettodiaffinit:nonsitrattadiuninterazionesingola,masidevetenercontodei
varisiticombinatoridellAc.Enecessarioquindiparlarediavidit,ciomoltiplicarelaffinitperlavalenza
dellanticorpo (la valenza data da quanti siti di combinazione sono presenti su quellanticorpo). La
valenza,perquantoriguardailsegmentoFabvale1,quindiunanticorpochepossiededueFabhavalenza
2.LFchavalenza0perchnonlegalanticorpo.UnIgmonomericahavalenza2,perchha2sitidilegame.
LeIgAdimerichehanno4sitidilegamequindivalenza=4,leIgMpentamerichepossonoavereda5a10siti
dilegame,quindiancheselaffinitbassa,labilitaltaperchhannomoltisiticombinatoriingradodi
interagireconlantigene.

IMMUNOCOMPLESSI
La risposta immunitaria genera immunocomplessi in cui lanticorpo lega
lantigene; quando si ha un anticorpo dimerico, si formano degli aggregati tra
antigeneedanticorpo.
Questi aggregati sono funzione della concentrazione relativa di anticorpi ed
antigeni; dal punto di vista chimico si pu costruire una curva di precipitazione:
quando si formano gli immunocomplessi, se la loro concentrazione elevata,
possonoprecipitareformandodeiprecipitati.

Iprecipitatisonounproblemamedicomoltoimportante,infattidiversemalattieautoimmunisonocausate
dallaprecipitazionediimmunocomplessi,adesempioseprecipitanonelrenesipossonoaverenefritimolto
gravi.
Questacurvavalesoloquandolantigenemultivalenteelanticorpoalmenobivalente.
Nellazonadieccessodianticorposiformanopochiaggregatiequindinoncprecipitato;questosiforma
soloquandounanticorpolegapiantigeni.
Aumentandolaquantitdiantigenesiarrivaaunpuntoincuilaconcentrazionediantigenimultivalentied
anticorpi bivalenti rappresenta la situazione ottimale per formare aggregati molto grandi che quindi
precipitano.
Quandosihauneccessodiantigeneilreticolononsiforma,diminuisceequindisihannopiccoliaggregati
percuilaconcentrazionediprecipitatodiminuisce.

Quandosivaccina,vieneindottaunarispostaanticorpalecheingenereeterogeneacontrounantigene
complesso, oligoclonale e la risposta varia da individuo ad individuo; limmunizzazione un fenomeno
dinamico che cambia come quantit e qualit in funzione dellesposizione allantigene ed anche un
fenomenoregolatocheaduncertopuntovienebloccato.

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Immunologia - Lezione 13 - 23.04.13- Novelli

ANALISI della RISPOSTA PRIMARIA e SECONDARIA


In questa lezione analizziamo le attivazioni di risposta primaria e secondaria e i tempi in cui esse agiscono.

VARIAZIONE della RISPOSTA ANTICORPALE nel TEMPO MATURAZIONE della RISPOSTA

Gli anticorpi prodotti contro un certo antigene variano nel tempo. Vediamo di che variazioni si tratta. I 4
esempi seguenti suggeriscono quanto la produzione anticorpale sia dinamica.

1)Variazione di classe. Esistono situazioni mediche in cui importante conoscere la classe di


immunoglobuline prodotte, poich, come di consueto, abbiamo delle variazioni di classe in funzione del
tempo di esposizione allantigene e del livello di risposta. E utile per capire a che livello la risposta
immunitaria e lo si pu fare controllando i tipi di Ig (prima sono prodotte IgM, poi IgA o). Ovviamente, pur
cambiando la classe, non cambia la specificit verso lantigene. Se un paziente ha una produzione di IgM
contro HIV, ha avuto uninfezione recente. Se invece ha le IgG linfezione perdura da molto tempo.

2)Aumento di affinit. In risposta ad una prolungata risposta antigenica, abbiamo una maturazione della
risposta anticorpale. Tale maturazione si manifesta con la formazione di anticorpi sempre pi specifici,
ovvero dotati di una maggiore affinit media verso lantigene (volendo si pu parlare anche di avidit). E
un continuo miglioramento da parte del clone nel generare un anticorpo capace di legare in maniera
ultraspecifica lantigene.

3)Diminuzione delleterogeneit della risposta immunitaria. Inizialmente si generano numerosi cloni


anticorpali contro i determinanti antigenici. I vari cloni entrano in competizione, che una selezione
naturale basata sulla loro capacit di produrre anticorpi specifici. I vincitori di tale competizione
sopravvivono e hanno occasione di migliorare ulteriormente laffinit media degli anticorpi da loro prodotti.
Altri perdono la competizione e sono selezionati negativamente per lestinzione, cosa che porta alla
scomparsi delle Ig da essi prodotti. Alla fine della risposta, quindi, abbiamo un numero pi ridotto di cloni(e
di Ig) che rispondono ad certo antigene, ma con specificit maggiore.

4)Generazione del fenomeno della memoria. Parte dei linfociti B che rispondono ad un antigene subiscono
dei segnali da parte dei linfociti T tramite linterazione CD40-CD40L. Ci sono anche interazioni con le cellule
follicolari dendritiche presenti nei linfonodi, che presentano in superficie CD23. Queste interazioni
spingono il linfocita B a fare delle scelte sul suo destino differenziativo. Alcune diventano plasmacellule,
altre diventano cellule della memoria. Queste ultime rientrano nel ciclo, fermandosi e non dividendosi pi.
Possiamo trovare i linfociti B della memoria sia in circolo, sia nel tessuto linfoide secondario. Queste cellule
della memoria esprimono in superficie un BCR che sar il frutto della loro esposizione allantigene. In
particolare, importante la classe anticorpale (IgG, IgA, IgE) prodotta nel momento in cui scelgono di
diventare cellule della memoria, poich continueranno ad esporre tali Ig per uneventuale seconda risposta.
Attraverso specifici anticorpi diretti contro le sottoclassi possiamo indagare nella periferia di un individuo la
quantit di linfociti B naif (con solo IgM, IgD) e di linfociti B della memoria (IgG, IgA, IgE). Nel cambio di
classe, il linfocita B si preattiva, stimola il linfocita T che ha come effetto sul linfocita B il cambio di classe,
quindi i linfociti della memoria, che sono discendenti da cloni che hanno gi avuto contatto con lantigene,
sono esclusivamente dotati d queste 3 classi immunoglobuliniche.

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Immunologia - Lezione 13 - 23.04.13- Novelli

CINETICA della RISPOSTA ANTICORPALE

Proviamo ad immunizzare un soggetto con un antigene specifico. Dopo ci, possiamo rilevare il titolo
anticorpale (cio la concentrazione di un anticorpo nel siero) a tempi diversi dallinoculo dellantigene, per
vedere la variazione nel tempo della risposta immunitaria, ovvero la cinetica della risposta anticorpale. Con
il tempo, avviene un cambio di classe dopo linterazione coni linfociti T. Il primo picco della risposta
anticorpale sempre a carico delle IgM. Dopo circa due settimane la quantit di IgM comincia a diminuire,
per come risultato dellattivazione dei linfociti T avviene il cambio di classe, con picchi di IgG, IgA, IgE, che
poi tornano a diminuire. In genere, per qualsiasi antigene, si configura il medesimo profilo cinetico
scomponibile 4 fasi, una successiva allaltra. Sia la risposta primaria, sia la risposta secondaria sono
caratterizzate dalla presenza di queste quattro fasi.

Risposta primaria. Rappresenta la prima esposizione dellantigene al linfocita B ancora naif. Alla fine della
risposta primaria il linfocita maturato e torner in quiescenza, lasciando delle cellule della memoria, che
daranno uneventuale risposta secondaria, fatta sempre da 4 fasi ma con andamento del tutto diverso della
cinetica.

Fase di latenza. E la prima fase a seguire linoculazione antigenica ed priva di risposta anticorpale. E
dovuta al fatto che debba essere innescata la risposta e ci richiede di un certo tempo (alcuni giorni). Il
linfocita B deve internalizzare lantigene, processarlo ed esprimerlo sull MHCII (preattivazione). A questo
punto pu essere riconosciuto da un linfocita T con il completamento dellattivazione e la produzione finale
di anticorpi. La durata della fase di latenza diversa in base al tipo di antigene. Ad esempio se
somministriamo ad un animale da laboratorio degli eritrociti, usandoli come antigeni, essi inducono una
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Immunologia - Lezione 13 - 23.04.13- Novelli

risposta con un periodo di latenza di 3-4 giorni. Al contrario le proteine antigeniche inducono una risposta
caratterizzata da un periodo di latenza di una settimana, poich devono essere processate, cio
internalizzate, degradate e esposte sul complesso MHCII. Gli eritrociti danno una risposta con latenza
inferiore poich essi esprimono degli zuccheri sulla membrana cellulare contro cui sono prodotte delle IgM
che vengono prodotte contro degli antigeni timo indipendenti (quali sono gli zuccheri). Gli antigeni timo-
indipendenti sono quegli antigeni che inducono una risposta anticorpale che prescinde dallazione
maturante del timo. Se anzich inoculare proteine o eritrociti inoculiamo dei batteri, la risposta ancora
pi complessa e richiede fino a due settimane

Fase di incremento esponenziale. Pu durare molti giorni. E detta esponenziale perch raddoppia la
concentrazione di anticorpi ogni circa 6 ore. Il linfocita B prolifera molto e inizia a produrre anticorpi. Nel
giro di pochi giorni abbiamo milioni di linfociti che poi si differenziano in plasmacellule che iniziano a
produrre anticorpi diffusibili. Questa doppia crescita rende esponenziale laumento del titolo anticorpale.

Fase di equilibrio E una fase stazionaria in cui il titolo anticorpale, dopo essere cresciuto
esponenzialmente, si stabilizza su un plateau, cio la concentrazione resta costante per il tempo di tutta
questa fase. In questa fase il processo di degradazione degli anticorpi ha la stessa velocit di quello di
sintesi, quindi la concentrazione non cambia.

Fase di declino. E caratterizzata dalla decadenza del titolo anticorpale, imputabile ad un eccesso di
degradazione, pi rapida della sintesi.

Risposta secondaria. E la risposta ad un antigene gi incontrato in una precedente infezione, quindi


abbiamo direttamente lazione delle IgG e non delle IgG. Abbiamo cellule della memoria molto specifiche, e
la cinetica della risposta differente rispetto alla primaria. E una risposta solo richiamata, perch
abbiamo gi cellule della memoria molto specifiche, quindi necessita di una quantit di antigene minore per
essere innescata. Lampiezza della risposta secondaria dipende molto dal boost, ovvero dal tempo di
richiamo (tempo tra prima e seconda esposizione allantigene). Questo ha unimportanza praticamente per
i vaccini. Ad esempio, se facciamo uniniezione dopo un boost ridotto abbiamo una risposta soltanto
moderata, non eccessivamente ampia. Lo stesso risultato si ottiene se aspettiamo troppo tempo per
effettuare il richiamo, perch in questo tempo alcuni linfociti della memoria possono andare incontro ad
apoptosi e possiamo avere pochi linfociti della memoria da richiamare (o addirittura nessuno). Questo
effetto varia in base al tipo di antigene: alcuni inducono una memoria a lungo termine, altri a breve
termine. La tossina tetanica induce linfociti B della memoria molto longevi, che persistono nellorganismo
fino a 25-30 anni e quindi non abbiamo difficolt ad effettuare un richiamo ottenendo un buon titolo
anticorpale anche dopo lungo tempo dalla prima vaccinazione.

Fase di latenza. E molto ridotta perch i linfociti B della memoria hanno meno requisiti da soddisfare per la
loro attivazione. Non hanno bisogno di costimolazione e sono pi facilmente stimolabili perch sulla loro
superficie hanno Ig molte specifiche, quindi necessitano di una dose di antigene nettamente minore per
attivarsi. Il tempo di latenza addirittura dimezza.

Fase di incremento esponenziale. E analogo alla crescita esponenziale che avviene nella risposta primaria,
ma in questo caso lincremento ancora pi rapido e anche i tempi di questa fase sono dimezzati. La
maggior rapidit dovuta al fatto che le cellule della memoria, quando attivate, proliferano di pi rispetto
ai normali linfociti B e producono pi anticorpi. Per queste ragioni si raggiunge anche un titolo finale
maggiore.

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Fase di equilibrio. E temporalmente pi prolungata rispetto a quella primaria. In ragione del fatto che
abbiamo moltissimi anticorpi (che sono tutti bivalenti), si possono formare degli immunocomplessi con un
antigene e pi anticorpi legati tra di loro. La formazione degli immunocomplessi tipica dei linfonodi e
svolge un ruolo importante per il meccanismo dellaumento dellaffinit.

Fase di declino. E dotata di una particolare lentezza, al fine di far permanere gli anticorpi il pi a lungo
possibile. Questa lentezza dovuta al fatto che alcuni anticorpi, specie le IgG, persistono per molto tempo
nel siero, addirittura per mesi o anni.

FRAMMENTO CRISTALLIZZABILE e FcR

Gli anticorpi possiedono due braccia per il sito di legame con lantigene (detti frammenti Fab) e poi
possiedono un frammento cristallizzabile, detto anche frammento Fc, che la porzione con cui guidano la
risposta immunitaria (indicato in colore scuro nellimmagine). Il frammento cristallizzabile legato da
specifici recettori presenti su cellule immunitarie che guidano lazione di anticorpi. Pertanto, gli anticorpi
non agiscono solo come proteine solubili, bens mettono in moto anche la risposta cellulare tramite i
frammenti cristallizzabili.

Il frammento cristallizzabile legato da dei recettori detti FcR.


Alcuni recettori di questo tipo sono diffusibili, altri sono presenti
sulla superficie di alcune cellule dellimmunit come macrofagi,
basofili, eosinofili e linfociti B.

Ci sono degli Fcr di trasporto, recettori cos nominati poich sono


indispensabili per legare lanticorpo e trasportarlo legato a s verso
la sede che richiede risposta anticorpale.

Un esempio paradigmatico quello delle immunoglobuline


neonatali (le chiama cos perch evidentemente sono presenti anche nel neonato, ma ci che ci interessa
riguarda il feto). Tali Ig neonatali per essere trasportate da madre a feto si legano a degli FcR neonatali
(FcRN). Il FcRN codificato da geni dellHLA1b: questo significa che si tratta di geni sparsi lungo il genoma,
non si tratta di geni che si trovano associati agli altri geni per HLA. Alcune delle proteine codificate da questi
segmenti genici sono le glicoproteine CD1, che appartengono alla superfamiglia delle Ig e sono simili a
quelle del complesso MHCI. Da queste porzioni di cromosoma, come detto, deriva anche la produzione di
FcRN, indispensabile per legare le Ig e portarla dalla placenta, dal rene e dallintestino della madre al feto.

Un altro esempio quello delle immunoglobuline polimeriche che sono legate da FcR per immunogloblunie
polimeriche. Tali recettori legano i dimeri o i pentameri delle IgM permettono la transcitosi.

Ci sono invece FcR attivanti la risposta immunitaria. Differiscono dalla categoria precedente poich i primi
si limitavano a portare lanticorpo in sede. Questi recettori, invece, sono presenti sui fagociti e sui leucociti
dei recettori che legano 3 sottoclassi di immunoglobuline: IgA, IgG, IgE. Il legame avviene con la parte
costante delle Ig. Non ci sono recettori per le IgD e le IgM. Le IgM sono in grado di attivare molto bene il
complemento ma non sono in grado di legare gli FcR e come vedremo cio determina lassenza di feedback
negativo per la produzione di IgM (in ogni caso non sono mai prodotte in eccesso perch switchano ad IgG).
Gli FcR sono di tipo diverso e sono classificati in base alla loro affinit con limmunoglobulina, che pu
essere alta, media o bassa.
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Tra questi tipi di recettori citiamo il recettore gamma-R2B (detto anche CD32) per le IgG. Il CD32 una
proteine che a livello genetico appartiene alla superfamiglia delle immunoglobuline. E importante perch
interviene nella regolazione della produzione anticorpale. Il CD32 funziona come sensore degli
immunocomplessi antigene-anticorpo che si formano durante la risposta immunitaria. Un linfocita B
quando inizia a produrre anticorpi di classe G e questi anticorpi legano lantigene formando gli
immunocomplessi. Tali immunocomplessi sono legati da CD32 e viene bloccata lattivazione di linfociti B
vergini. E un sistema di feedback negativo anticorpale che ordina alla cellula su cui posto il CD32, e che
sta per attivarsi, di fermare il proprio imminente processo di risposta, poich sono gi stati prodotti
immunocomplessi. Il recettore, pertanto, alla base dellomeostasi della risposta umorale, evitando
lulteriore produzione di Ig.

Lantigene forma il crosslinking con il BCR esposto sulla superficie del linfocita B; ci genera un segnale
intracellulare che consiste nella modificazione della porzione del citoscheletro a ridosso della membrana
che porta anche alla modificazione spaziale dei recettori transmembrana con innesco di un segnale di
fosforilazione sulle code delle molecole Ig-alfa e Ig-beta. Questo segnale viene trasdotto in senso positivo e
determina attivazione cellulare e produzione di anticorpi che formeranno immunocomplessi. Gli
immunocomplessi sono potenzialmente pericolosi perch se hanno grosse dimensioni e sono presenti in
alte concentrazioni possono precipitare a livello renale o nella sinovia delle diartrosi degli arti. Per tali
motivi il legame con il CD32 e il blocco della risposta anticorpale fondamentale. Dopo che sono stati
prodotti gli anticorpi, lantigene pu interagire ulteriormente con il BCR di unaltra cellula naif attraverso
un legame crociato che d inizio alla cascata che dovrebbe portare alla risposta. Anche CD32 presente
sulla membrana dei linfociti B naif e anche esso d crosslinking con le Ig degli immunocomplessi. Questo
legame crociato innesca un segnale negativo: esso attiva delle chinasi che fosforilano le code
intracitoplasmatiche di CD32 e avviene anche una fosforilazione del fosfoinositolo di membrana. Gli
amminoacidi fosforilati di CD32 costituiscono delle sequenze consenso per il legame di SHP fosfatasi che
defosforilano le tirosine sulle code citoplasmatiche di Ig-alfa e Ig-beta.

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RIASSUNTO sulla RISPOSTA ANTICORPALE

Iniziamo ricordando il primo avvenimento che sancisce la maturazione della risposta anticorpale: il cambio
di classe delle Ig in base ai segnali citochinici recepiti. Quando poi gli anticorpi sono in forma diffusibile
possono svolgere un ruolo importante andando a raggiungere la sede dellinfezione a livello periferico.
Abbiamo una prima risposta protettiva da parte degli anticorpi; risposta che viene indotta praticamente
subito, ma questa risposta immunitaria migliora con il passare del tempo. Pi siamo a contatto con
lantigene, pi la risposta migliora in quanto a specificit. Nei linfonodi, ad esempio, troviamo dei batteri
persistenti e creano dei centri germinativi molto evidente. In questi casi lantigene persiste a lungo e la
produzione di anticorpi contro lantigene procede ininterrotta, ma ad ogni ciclo di produzione anticorpale la
specificit per lantigene viene migliorata. Questo passo avanti connesso alla diminuzione
delleterogeneit della risposta. La risposta attivata lascia memoria di s nel tempo: abbiamo una memoria
protettiva che pu difenderci per tempi molto lunghi. Di seguito ricapitoliamo come agiscono gli anticorpi.

-Lantigene viene neutralizzato dalla formazione di immunocomplessi, ma la loro eccessiva formazione


pericolosa, ragion per cui vi un sistema a feedback negativo che pone al riparo dalleccessiva risposta
anticorpale.

-Gli anticorpi sono anche responsabili dellopsonizzazione, cio di rendere appetibili gli antigeni ai fagociti.
Gli anticorpi incrostano lantigene, cio si aggregano intorno ad esso e gli immunocomplessi possono
essere riconosciuti dagli FcR presenti sulla membrana dei fagociti, che attivano la fagocitosi.

-Gli anticorpi legano FcR, cosa appena vista, attivando vari tipi di risposta immunitaria cellulo-mediata
degranulando o fagocitando lantigene in base al tipo cellulare.

-Gli anticorpi guidano la citotossicit anticorpo-dipendente, cio potenziano lattivit killer delle cellule NK
verso un bersaglio antigenico che stato corpo da IgG.

-Gli anticorpi danno attivazione delle proteine del complemento.

PROTEINE del COMPLEMENTO

Si tratta di un insieme di proteine presenti nel siero utili a contrastare le infezioni batteriche e a regolare in
generale la risposta immunitaria. Fanno parta tutti gli effetti dellimmunit innata. Il complemento fu
scoperto da Jules Bordet con un esperimento molto elegante. Prelevo del siero fresco da un individuo
infettato da un batterio, definito siero immune fresco. Fu nominato cos poich ponendo in contatto
questo siero con un batterio specifico (quello che avevo provocato linfezione), il siero ne determinava la
lisi. Us per lesperimento anche un altro tipo di siero immune per lo stesso batterio, ma si trattava di un
siero immune riscaldato, che aveva perso parte delle sue caratteristiche in seguito ad un riscaldamento a
56o. Mescolando gli stessi batteri a questo siero non si verificava la lisi, quindi il potere di lisare i batteri
veniva perso dal riscaldamento. Mescolando siero non immune fresco e siero immune riscaldato si
riacquisivano la capacit litiche contro i batteri. Da ci Bordet intu che in condizioni fisiologiche vi fosse
sempre il COMPLEMENTO: una componente termolabile del siero presente indipendentemente dal contatto
con lantigene e capace di complementare lazione degli anticorpi.

Come risult dallesperimento, necessaria la compresenza di proteine del complemento e di anticorpi per
avere lazione litica, che non si verifica se uno dei due elementi cambia (componente importante
dellimmunit innata e delladattativa). Dal punto di vista biochimico, il complemento costituito da un
insieme di proteine presenti nel siero (e non solo) in forma inattiva. Abbiamo 9 proteine fondamentali che
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vengono indicate con una sigla: C1, C2, C3C9. Inoltre esistono altre componenti proteiche, che sono il
fattore B, il fattore D e il fattore P (la properidina). Tutte queste 12 proteine sono presenti in forma inattiva
in tutti i nostri liquidi organici. Il sistema con cui il complemento opera consta di unattivazione sequenziale,
cio a cascata della varie componenti proteiche. Questa attivazione a cascata d lopportunit di avere
una notevole amplificazione del segnale, con una risposta finale massiva in termini di azioni litiche da parte
degli anticorpi.

Le proteine appena elencate sono delle proteasi che tagliano parzialmente il loro substrato, attivandolo.
Ogni proteina, tagliata in due parti dalla proteasi precedente, pu attivare la proteasi successiva tagliandola
in due parti, e cos via. Si tratta di un meccanismo a cascata molto potente e dotato di una grande forza
amplificante: una proteina attivata ne attiva moltissime altre. Arrivati al 6o-7o componente abbiamo
tantissime proteine attive tagliate che possono uccidere il batterio con fenomeni litici, ma possono
potenzialmente agire anche sulle cellule sane (ma c un fisiologico meccanismo di protezione che evita che
ci avvenga).

Inizialmente il complemento inattivato, ma non appena esso viene attivato inizia una cascata in cui da
ogni proteina deriva derivano due frammenti:

- frammento A, quello generalmente pi piccolo, che rimane in circolo e funziona come molecola
segnalatrice e pro-infiammatoria nel microambiente; tali molecole sono dette anafilotossine
perch la loro capacit di generare episodi infiammatori poteva esitare in fenomeni
anafilattici gravi.

- frammento B, quello generalmente pi grosso, che fa proseguire la cascata del complemento.

MODALITA di ATTIVAZIONE del COMPLEMENTO

Il complemento pu essere innescato attraverso 3 meccanismi differenti: via classica, via lectinica, via
alternativa. Vediamole nel dettaglio:

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1) Via classica. Il suo nome deriva dal fatto che fu la prima ad essere studiata. E un meccanismo di
attivazione che necessita degli anticorpi: sono le Ig legate allantigene nellimmunocomplesso ad attivare il
complemento. Solo le IgG e IgM dellimmunocomplesso possono attivare il complemento attivando il primo
componente, detto C1, fatto da 3 subunit: q,r,s.

C1q ha una forma a mazzo di tulipani


rovesciato, o per meglio dire ad ombrello, con
6 catene disposte radialmente, le cui estremit
radiali si legano alle regioni Fc delle IgM, delle
IgG1, IgG2, IgG3. Il legame permesso anche
quando queste ultime non sono legate ad un
antigene di un batterio; ma in tal caso C1q non
attivato. Il C1q si attiva solo quando lega 2 Fc
di 2 Ig sufficientemente vicini; lunica
possibilit che si verifichi che gli anticorpi
siano parte di un immunocomplesso. Da
questo punto di vista le IgM (pentameri che)
sono pi efficaci rispetto alle IgG
(monomeriche) nellattivare C1q, poich
necessitano di 1/5 della concentrazione IgG
necessaria per avere probabilisticamente la
presentazione di 2 Fc.

Associati al C1q ci sono C1r e C1s. Quando C1q riesce ad attivarsi mette in
funzione C1r e C1s, che sono entrambe delle proteasi, precisamente delle
serin-esterasi che vanno ad agire sul secondo elemento del complemento. Il
secondo componente si chiama C4 ed tagliato in 2 pezzi, diventando attivo.
C4a va in circolo e C4b si lega covalentemente alla membrana del batterio
garantendo che il processo prosegua solo in presenza dellimmunocomplesso.
A questo punto C4b taglia il terzo fattore della cascata, C2, in C2a e C2b. C2b e
C4b si legano alla membrana del batterio ravvicinati tra loro, formando il
complesso C2b-C4b, che viene anche detto C3 convertasi (della via classica). La
C3 convertasi agisce sul C3 scindendolo in C3a e C3b. C3a diventa diffusibile e
C3b si lega alla membrana cellulare del batterio formando un unico complesso
con la C3 convertasi. Quindi si forma un unico complesso finale C3b-C2b-C4b
detto C5 convertasi (della via classica).

2) Via lectinica. Non necessita lintervento degli anticorpi. Al contrario, i mannani, degli zuccheri presenti
esclusivamente sulla parete dei batteri, vengono legati da una proteina detta lectina. E composta da una
porzione strutturale morfologicamente affine a C1q con ha la funzione di legare i mannani; dopo che tale
legame avvenuto, possibile che la lectina sia completata reclutando due subunit serin-esterasiche
affini a C1r e C1s. Esse tagliano il C4 e da qui in poi la via del tutto affine a quella classica.

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3) Via alternativa. Viene innescata non a partire dal C1 bens a partire dal C3, che la pi presente nel siero
tra le proteine del complemento. Essa va incontro a una scissione spontanea senza la necessit di alcuna
reazione precedente riguardante gli anticorpi. Il frammento A, di dimensioni minori, liberato nel siero. Il
frammento B, di dimensioni maggiori, viene detto C3b; stabilizzato dai batteri a livello della membrana
cellulare e per la sua stabilizzazione deve legare il fattore B. Cio non accade nella cellule di mammifero: il
legame pu esservi, ma le cellule di mammifero, al contrario dei batteri, hanno delle proteine di membrana
che possono degradare il C3b legato. Nel batterio, invece, abbiamo il legame di C3b e del fattore B che sono
uniti tra di loro e il C3b a sua volta legato alla membrana del batterio. Ora agisce il fattore D del
complemento che divide il B in una piccola porzione Ba che diventa solubile, e una porzione Bb che resta a
contatto con C3b. Pertanto, si viene a formare il complesso C3b-Bb, che viene anche detto C3 convertasi. La
C3 convertasi stabilizzata dalla properidina, detta anche fattore P. In questo modo la C3 convertasi
presente pu agire sul C3 circolante nel plasma, che viene clivato in C3a e C3b. Il vantaggio di tutto questo
processo sta nel poter clivare una quantit di C3 nettamente superiori, ottenendo amplificazione. A volte
anzich la properidina si pu legare un ulteriore C3b (in virt della grande concentrazione dello stesso),
dando vita ad un complesso C3b-Bb-C3 detto C5 convertasi (della via alternativa).

RUOLI del COMPLEMENTO

Alla fine della cascata protesica, devono essere attivati dei sistemi che traducano questi segnali in unattiva
risposta immunitaria. Ecco i tipi di risposte.

1) Lisi cellulare, effettuata a danno dei batteri in collaborazione con gli anticorpi.

2) Segnalazione dellinfiammazione. Alcuni frammenti tagliati hanno una struttura terziaria molto simile a
quella delle chemochine e fungono da mediatori dellinfiammazione.

3) Eliminazione dei complessi antigene-anticorpo. Gli immunocomplessi sono eliminati grazie al legame dei
loro frammenti cristallizzabili con le proteine del complemento, che contribuiscono ad opsonizzare il
batterio; questa poi si legano con i recettori del complemento presenti soprattutto sugli eritrociti che li
portano al fegato per leliminazione. Tali recettori si possono anche trovare su fagociti che fagocitano
direttamente limmunocomplesso. Leliminazione viene anche detta clearance dellimmunocomplesso.

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MECCANSIMO di LISI da parte del COMPLEMENTO: Tutte le 3 vie portano alla formazione di una C3
convertasi, che nel caso della via classica e della via lectinica C2b-C4b, mentre nella via classica C3b-Bb.
La differenza tra la via classica e la via lectinica sta nel fatto che la prima richiede una forma di immunit
adattativa per essere attivata, mentre la seconda richiede il semplice riconoscimento di mannani, quindi
interamente innata. Questa differenza di attivazione, che in un caso richiede lattivit anticorpale, non
toglie che il complemento sia un sistema costitutivo nel nostro organismo, quindi etichettabile come
innato.

La C3 convertasi lenzima fondamentale che pu clivare la C3 in C3a e C3b. Come possiamo dedurre, la C3
convertasi e la rottura di C3 che essa opera sono i punti cruciali di tutte le vie. La C3 la proteina del
complemento pi presente nel siero, con una concentrazione di 1,2 mg/ml. Ogni molecola di C3 convertasi
pu rompere 1000 C3, creando 1000 C3b, dando grande amplificazione. Il C3b pu andare a legarsi in
modo covalente alla membrana degli organismi, prendendo contatto anche con altri elementi del
complemento che sono ivi legati: si forma la cosiddetta C5 convertasi. La C5 convertasi scinde il C5
plasmatico in C5a (che resta solubile) e C5b, che si lega alla membrana batterica. In questa sede, insieme al
C5b, si collocano il C6, C7, C8 che senza essere tagliati sono assemblati sulla membrana insieme a C5. Il
complesso C5b-C6-C7-C8 ha la giusta struttura per permettere la polimerizzazione del C9. Il complesso
formato da C5b, C6, C7, C8 e vari monomeri di C9 viene detto complesso MAC (complesso di attacco alla
membrana). Di tale complesso, i polimeri di C9 sono la parte pi distruttiva: formano un cilindro che
attraversa la membrana costituendo un canale che permette il passaggio di ioni Cl- e K+ che portano ad
uniperosmolarit della cellula e quindi alla sua esplosione.

ELIMINAZIONE degli IMMUNOCOMPLESSI da parte del COMPLEMENTO: Abbiamo un immunocomplesso


fatto da antigene e pi anticorpi. I frammenti C3b e C4b possono associarsi agli anticorpi, e quindi agli
immunocomplessi. Sui fagociti sono presenti recettori per questi due frammenti del complemento; tra i
recettori citiamo CD11, CD18, CD21. Abbiamo anche il recettore CR2 presente sui linfociti B (utile alla
costimolazione dei linfociti B tramite il complemento). Grazie a questa mediazione fornita da frammenti del
complemento, gli immunocomplessi possono essere fagocitati. I recettori si trovano anche sugli eritrociti

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che trascinano gli immunocomplessi fino al fegato, dove possono essere eliminati. E evidente come un
sistema di mediazione di questo tipo sia un importante fattore di opsonizzazione del patogeno.

SEGNALAZIONE dellINFIAMMAZIONE da parte del COMPLEMENTO: E una funzione svolta dai frammenti A,
ovvero dai frammenti solubili delle proteine del complemento, che proprio in virt della loro solubilit si
possono rinvenire sia in prossimit del patogeno, sia in circolo. I pi importanti sono C3a, C4a, C5a. Sono
come delle chemochine, poich guidano fenomeni chemiotattici.

-I loro recettori si trovano sui fagociti e sui neutrofili, mastociti, portando a degranulazione e fagocitosi.

-Hanno recettori sulle cellule endoteliali, quindi hanno unimportante ruolo nellattivazione degli endoteli.

-Hanno recettori sulle cellule muscolari lisce, quindi portano a contrazione della muscolatura liscia vasale.

Per queste ragioni questi 3 frammenti sono anche nominati anafilotossine: la loro inoculazione in vivo
porta a shock anafilattico con la degranulazione massiccia dei granulociti, rilascio di agenti vasoattivi
(istamina) da parte di mastociti, attivazione degli endoteli che porta ad edemi e marginazione dei leucociti
che vanno nei connettivi, contrazione della muscolatura lisca del vaso. Tra le 3 anafilotossine:

-il C5a ha potenza infiammatoria maggiore,

-il C3a ha potenza infiammatoria media,

-il C4a ha potenza infiammatoria minore.

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Il complemento formato da proteine che tendono a solubilizzare gli immunocomplessi: quando si genera
una risposta anticorpale si formano immunocomplessi e quando la concentrazione di questi ultimi diventa
molto elevata possibile che siano resi insolubili e precipitino, in genere quando sono legati a frammenti
del complemento gli immunocomplessi si formano meno facilmente e tendono a essere pi solubili. In
presenza di frammenti del complemento, quindi, gli immunocomplessi tendono a formarsi di meno e, di
conseguenza, a essere meno pericolosi per lorganismo.

Tutti questi meccanismi agiscono in maniera abbastanza aspecifica, il complemento si pu depositare su


tutte le superfici cellulari. Quando si deposita sulle superfici dei patogeni avviene tutta la cascata
complementare che porta alla lisi dei patogeni. Quando questo avviene sulle nostre cellule ci devono essere
dei meccanismi per neutralizzare gli effetti nocivi del complemento, altrimenti tutte le nostre cellule su cui
si deposita il complemento (come C3b che spontaneamente idrolizza) verrebbero lisate. Esistono una serie
di proteine regolatorie che regolano lattivit del complemento sulle membrane dei mammiferi. Una di
queste un inibitore del primo componente del complemento, chiamato inibitore del C1. Questo una
serpina, quindi inibitore delle serin-proteasi, che inibisce lattivit proteolitica quando il C1 viene attivato (il
C1 una serin-proteasi, pu essere attivato sia dal legame con antigene-anticorpo, sia dal legame della
proteina che lega il mannosio). una proteina molto importante e quando manca linibitore per difetti
genetici insorge una grave malattia, ledema angioneurotico, che pu essere curata tramite la
somministrazione al paziente di inibitore del C1 ricombinante.
Quando il complemento si attiva viene generata la C3 convertasi, che funziona scindendo il C3 in due
frammenti: C3a e C3b. Quando il C3b si lega sulle membrane dei microorganismi con un legame covalente,
determina lattivazione del complemento, oppure, se questo avviene sulla superficie delle membrane dei
mammiferi, determina uninibizione del complemento perch su queste membrane sono presenti delle
molecole, come CR1, DAF (fattore che accelera il degrado del complemento -decay acceleration factor-),
che determinano fenomeni di proteolisi e inibiscono lattivazione del complemento. Il fattore H (facente
sempre parte delle proteine complementari) importante perch anchesso arresta lattivazione del C1.
Quando il C3 si lega, questi fattori scindono C3b in altri frammenti pi piccoli e lo rendono inattivo al suo
funzionamento. Attraverso tutti i fattori regolatori che sono presenti solo sulla superficie delle cellule dei
mammiferi noi riusciamo a bloccare lattivazione del complemento e a rendere la sua attivit pi specifica
nei confronti dei microorganismi.
Fattori regolatori: DAF, C4 binding protein (proteina che si lega al
C4 e lo inibisce), il recettore 1 del complemento (che funziona
anche come costimolo per i linfociti B) e il fattore H. Queste
proteine agiscono sulla C3 convertasi, quindi competono con i
substrati della C3 convertasi, oppure dissociano i complessi dei
fattori b attivati (come il C3b, soprattutto, ma anche C4b e C2b),
li tagliano e li disattivano, cos tali fattori non riescono a
proseguire nella cascata complementare. Tutto questo apparato di
molecole regolatatrici rende molto specifica lazione del
complemento.
Dal punto di vista genetico, immersi tra i geni che codificano per le glicoproteine di membrana, HLA1, HLA2,
HLA3, ci sono alcuni geni che codificano per i componenti del complemento, in particolare C2, C4 e fattore
B. Alcune di queste proteine, facendo parte dellHLA, sono anchesse polimorfiche, quindi nella popolazione
esiste un certo polimorfismo, non tutti abbiamo gli stessi componenti del complemento, esistono diverse
forme alleliche.

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Utilizzo degli anticorpi nella medicina e nella ricerca


Lanticorpo stato definito come molecola che ha 2 siti di legame e un FC. Allinizio, quando la riposta
anticorpale stata studiata, si capito che tale risposta si genera contro una proteina complessa, tale
proteina pu avere diversi eptopi molecolari riconosciuti dagli anticorpi. Si genera una risposta
oligoclonale, cio alcuni cloni si attivano e producono anticorpi contro alcuni determinanti di questa
proteina. Il sogno degli immunologi stato quello di ottenere anticorpi a specificit unica. Selezionare gli
anticorpi con una singola specificit stato un problema che ha impegnato gli immunologi per molti anni,
fino a quando si scoperto il mieloma multiplo, un tumore delle cellule B che si trasforma in senso
tumorale e produce anticorpi della stessa specificit. Si cercato di capire come fosse possibile sfruttare
ci. Gli studi hanno portato alla definizione delle classi e sottoclassi di Ig, alla struttura la molecola degli
anticorpi e sono stati sequenziati gli aminoacidi. Si capito dove risiedevano le zone di maggiore variabilit
genetica degli anticorpi e infine sono state fatte analisi del DNA e sono stati clonati i geni per le Ig.
Il problema dellottenere anticorpi con una singola specificit stato risolto nel 1975 da due ricercatori,,
Koeller e Milstein, che hanno inventato gli anticorpi monoclonali e grazie ai quali vinsero il premio Nobel
verso la met degli anni 80. Sono anticorpi di una singola specificit, derivano da un singolo clone. Tali
anticorpi hanno rivoluzionato il panorama dellimmunologia perch nel giro di 20 anni gli anticorpi
monoclonali sono presenti in tutti i campi della medicina: sia per la ricerca di base, per eseguire test
banalissimi, come quello di gravidanza o altri test antivirali e sono pesantemente entrati nella terapia:
farmaci che vengono usati per moltissime malattie, tra cui quelle autoimmunitarie e tumori. Possiamo
produrre un anticorpo contro il bersaglio che vogliamo e possiamo produrlo in quantit enormi perch
questa tecnologia ci permette di produrre delle cellule chiamate ibridomi che vivono illimitatamente, non
vanno incontro a morte e possono essere coltivate in coltura, congelate e scongelate e continuano a
produrre lo stesso anticorpo della stessa specificit. Possiamo purificarli, togliere tutti i contaminanti
presenti per la produzione di anticorpi e abbiamo un reagente con una specificit assolutamente definita.
La tecnologia usata quella dellibridazione somatica. Si prenda un topolino immunizzato contro una
proteina, nella sua milza ci saranno tanti anticorpi, ma ci sar anche il clone che produce lanticorpo contro
quella proteina, mischiato con tanti altri anticorpi. Se coltiviamo i linfociti di un topolino questi sono proni
allapoptosi, nel giro di 2 giorni muoiono, quindi smettono di produrre anticorpi. Per se prendete un
tumore delle cellule B (mieloma), che stato mutato e quindi non in grado di produrre Ig ma si riproduce
come un tumore, e fate una fusione (facendo dei buchi nelle membrane) tra un linfocita B e un mieloma,
ottenete una cellula che prolifera indefinitamente e produce anticorpi. In questo modo possiamo
selezionare un ibridoma, cio un ibrido tra un mieloma e il linfocita che produce lanticorpo che ci interessa.
Adesso si producono anticorpi
monoclonali di tutte le
specificit che vogliamo.
Naturalmente con la
tecnologia del DNA
ricombinante questo tipo di
tecnica stata affinata,
possiamo usare anche altre
tecnologie pi molecolari.
Immunizziamo un topolino con
lantigene, dopo qualche giorno
facciamo un richiamo, per
potenziare la risposta

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immunitaria, e poi preleviamo la milza di questo topolino. Dentro vi troviamo dei linfociti B che hanno il
recettore specifico per lantigene che abbiamo immunizzato, ma che sono abbastanza proni allapoptosi e
non sono coltivabili in vitro.
Fondere due cellule abbastanza semplice: si prende una sostanza, il polietilenglicole, che determina dei
buchi nelle membrane delle cellule, senza distruggerle, per cui le cellule coltivate insieme tendono a
formare degli ibridi cellulari, mettendo insieme i loro cromosomi. Il plasmocitoma (tumore delle
plasmacellule), che non secerne alcuna Ig, pu vivere illimitatamente in coltura, quindi se noi facciamo una
fusione con il linfocita T otteniamo una cellula che pu crescere illimitatamente. Il plasmocitoma ha un
difetto genetico, per cui una via della sintesi dei nucleotidi mutata e quando si fondono, mettendo del
terreno con veleno (che blocca una via metabolica per la sintesi dei nucleotidi) libridoma sfrutta la via
metabolica dei linfociti per proliferare. Il trucco stato quello di mettere un veleno metabolico nel terreno
di coltura, tale veleno interferisce con la sintesi dei nucleotidi. In questo modo selezioniamo soltanto le
cellule che sono ibride. Nel terreno metabolico il plasmocitoma che non si fuso non riesce a sopravvivere
perch viene avvelenato, i linfociti B muoiono per apoptosi, e quindi in presenza del terreno selezioniamo
sono le cellule ibride.
Otteniamo 3 tipi di popolazioni in seguito alla fusione somatica in presenza del veleno metabolico:
1) si possono fondere i linfociti B tra di loro, ma muoiono per apoptosi;
2) si possono fondere i plasmocitomi tra di loro, ma il veleno impedisce loro di utilizzare la via alternativa
per sintetizzare nucleotidi;
3) sopravvivono solo i B che si sono fusi con il mieloma, perch questultimo pu essere complementato
per il difetto genetico dal DNA dei linfociti B.
Solo le cellule che nascono dalla fusione dei linfociti B e delle
plasmacellule sopravvivono e proliferano. Li mettiamo in coltura e li
dividiamo in pozzetti. Chiaramente in questo sopranatante [nota:
tutto ci che galleggia sopra la soluzione, il pellet invece ci che si
deposita sul fondo (o sedimento)] ci sono gli anticorpi che sono
secreti dalle cellule. Possiamo testare con test immuno-enzimatici
la capacit di questi anticorpi nel legare lantigene che ci interessa.
Se disponiamo dellantigene che abbiamo utilizzato per
immunizzare il topolino possiamo andare a vedere quali di questi
sopranatanti sono positivi per quellantigene. Il motivo per cui vengono chiamati anticorpi monoclonali,
perch una volta che abbiamo identificato la coltura che contiene lanticorpo contro lantigene, viene fatta
una diluizione limite. Ci vuol dire diluire le cellule nei pozzetti in modo da averne al massimo una per
pozzetto, in questa maniera il clone si espande, produrr lanticorpo che vogliamo. Congeliamo il clone
tenendolo nellazoto, possiamo scongelarlo e inocularlo in un topolino per far crescere il tumore sotto
forma di ascite e recuperare lanticorpo, si possono fare tante altre cose e abbiamo lanticorpo diretto
contro una singola proteina in quantit illimitata. Dopo aver fatto la diluizione limite possiamo
standardizzare la produzione di anticorpi.
In questo modo possiamo avere la possibilit di scegliere un
anticorpo con le caratteristiche che desideriamo, lo possiamo
produrre in grande quantit, lo possiamo purificare in modo da non
avere nessun altro contaminante, possiamo definirne la specificit,
possiamo calcolarne laffinit di legame per lantigene e attraverso
questi anticorpi gli immunologi hanno potuto stabilire perch ad ogni
anticorpo che noi generiamo corrisponde una molecola molto
precisa e cos sono stati definiti i cluster of differentiation, sono

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tutte le molecole (CD1, CD2, ecc) codificate dovute al fatto che ognuna di queste molecole riconosciuta
da uno specifico anticorpo monoclonale.
Gli anticorpi monoclonali hanno un problema: se prendiamo un
anticorpo del topo e lo inoculiamo nelluomo si genera una risposta
anti-anticorpo che pu bloccare lanticorpo. Laltro problema che
quando inoculiamo un anticorpo la molecola piuttosto grossa, circa
150 kDalton, fa difficolt a entrare negli interstizi.
- possiamo costruire degli anticorpi pi piccoli, dove per il sito di
legame mantenuto, tagliamo a livello di Fab2, ad esempio, usiamo
anticorpi con un singolo sito di legame per lantigene;
- costruiamo minibody, dove rimane solo la parte variabile, il sito di legame dellanticorpo. Questi anticorpi
sono pi diffusibili e riescono a penetrare dentro a degli spazi dove la molecola di IgG completa non riesce a
entrare. Tali minibody hanno una singola specificit;
- possiamo anche costruire, mediante ingegneria biomedica, anticorpi con diversa specificit, quindi non
solo una. Questo utile perch se abbiamo un antigene tumorale come Herb2, espresso sulle cellule
tumorali, e abbiamo un anticorpo diretto contro il CD3 che riconosce le molecole killer CD8, attraverso un
anticorpo bi-specifico possiamo fare da ponte cercando di avvicinare le cellule CD8, che uccidono, al
bersaglio tumorale. In questo modo aumentiamo la capacit killer contro le cellule tumorali. Attraverso la
messa in comune degli anticorpi doppi, tripli o con 4 specificit, possiamo costruire anticorpi con pi
specificit e utilizzarli anche nella terapia;
- usare lingegneria genetica, per cui possiamo usare la scheletro di molecole umane, di Ig umane in cui
andiamo a clonare le parti variabili di un anticorpo monoclonale generato nel topo. Otteniamo unIg umana
in cui solo le parti variabili sono di origine murina, in cui stato generato un anticorpo monoclonale contro
quel determinato antigene. In questa maniera disponiamo di un farmaco umano che per monta le parti
variabili del topo, specifiche, molto piccole, e quindi evitiamo tutto il problema dellimmunogenicit che si
pu avere inoculando direttamente una proteina murina.
Questo ha determinato la possibilit di utilizzare le conoscenze sulla risposta immunitaria sulla generazione
degli anticorpi per sfruttarla attraverso la generazione di reagenti utilizzati in tutti i campi della medicina.
Tuttavia a volte anche utile avere tutta al molecola completa da somministrare perch le IgG complete
inducono fenomeni di citotossicit mediata da anticorpi, per esempio contro cellule tumorali, come nel
caso dellHerceptin, uno dei meccanismi di eliminazione del tumore il fatto che lanticorpo lega lantigene
sulla superficie del tumore e recluta le cellule NK a uccidere.
Gli anticorpi monoclonali stanno prepotentemente entrando nella clinica, stanno diventando dei farmaci
veri e propri e sono molto ben tollerati. Curare i tumori in questo caso permette di non avere effetti
collaterali, non c assolutamente paragone con lutilizzo dei chemioterapici o altri farmaci molto tossici.

La memoria
Alcuni linfociti della memoria vivono molto a lungo, altri molto meno. importante capire cosa determina
la frequenza dei linfociti specifici per lantigene. Ognuno di noi ha circa 1012 linfociti T e circa 1013 possibili
recettori per lantigene (TCR). La specificit riguarda solo uno di questi cloni, una sola di queste specificit,
quindi abbiamo una frequenza bassa. Quando lantigene entra nel nostro corpo, seleziona il clone che
meglio si adatta dal punto di vista del recettore e quindi si ha unespansione di questo clone che per primo
ha identificato lantigene. Questa popolazione va poi incontro a una contrazione, si attivano meccanismi di
limitazione della risposta immunitaria per cui il numero della progenie diminuisce, si crea una popolazione
di linfociti che torna a essere quiescente, non proliferano pi ma possono avere una vita piuttosto lunga e
infatti hanno bloccata la propensione ad andare incontro al suicidio apoptotico. La memoria la possibilit

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di avere dei linfociti che hanno reagito ad un antigene, che vivono per pi o meno lungo tempo in
quiescenza, senza andare incontro ad apoptosi.

Nei linfociti T della memoria ne identifichiamo 2 tipi:


- linfociti centrali, perch risiedono nei linfonodi. Sono caratterizzati dallavere sulla superficie cellulare due
particolari molecole: CD62 Ligando che una molecola di adesione e un recettore per le chemochine,
chiamato CCR7+, tipico di questi linfociti della memoria. I linfociti T che lo possiedono stanno dentro i
linfonodi perch i linfonodi producono il ligando di questo recettore e quindi sono attratti dal linfonodo.
- linfociti effettori/memoria che possiedono CD62L, ma sono negativi per il CCR7 (CCR7-). Non sono in
grado di sentire i segnali delle chemochine che portano a raggiungere il linfonodo e quindi tendono a stare
fuori. Vengono attivati dallantigene come risposta secondaria, quando vedono lantigene per la seconda
volta, sono quelli che escono dal linfonodo, vanno nei tessuti. Possiedono anchessi il CD62L.

Regolazione vita delle cellule memoria


Lespansione dei linfociti T attivati dallantigene regolata dallIL2, che viene prodotta e utilizzata in
maniera autocrina dal linfocita T. Oltre a IL2 intervengono altre 2 citochine importanti per la sopravvivenza
dei linfociti T attivati, veicolano segnali di sopravvivenza in termini di resistenza allapoptosi. Tali citochine
sono IL15 e IL7; mandano segnali ai linfociti T attivati per rimanere vivi e vivere pi o meno a lungo. Queste
citochine utilizzano la stessa catena gamma dellIL2 che trasduce il segnale e che comune ai recettori
specifici dellIL15 e IL7.
Il grafico riporta la frequenza minima per avere una
memoria immunitaria. stato calcolato quanti linfociti
della memoria dobbiamo avere per essere in grado di
poter rispondere a una riesposizione dellantigene in
maniera efficace. Sullasse Y abbiamo le frequenze: una
ogni milione di cellule, una ogni centomila, una ogni
diecimila, una ogni 1000 e cos via. Quando abbiamo
lesposizione allantigene i linfociti proliferano molto
velocemente e quindi il clone specifico passer da una
frequenza bassissima a molto alta in virt di questa
espansione. Questo determina la guarigione
dallinfezione, poi il clone inizia a contrarsi
numericamente quindi la frequenza dei linfociti diminuisce progressivamente. Durante il corso del tempo
questo numero fluttua a seconda dei segnali antiapoptotici, maggiori sono questi ultimi, maggiormente
questa frequenza rimane elevata. Per nel corso del tempo questa frequenza tende ad abbassarsi e quando
si abbassa oltre la soglia minima, calcolata come 7x10-5, non abbiamo pi nessuna memoria,non siamo pi
in grado di determinare una risposta immunitaria efficace.

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La sopravvivenza dei linfociti T memoria dipende da 2 fattori concomitanti: i segnali dati al TCR, quanto pi
un linfocita T viene attivato, ma la risposta antigenica non sufficiente a generare una buona memoria, ma
servono i segnali dati soprattutto dallIL7 che promuovono la proliferazione e sopravvivenza dei linfociti T. I
linfociti della memoria sono diversi dal linfociti vergini, perch si attivano pi velocemente, han bisogno di
una soglia di attivazione pi bassa, richiedono segnali pi semplici per attivarsi, non han bisogno di cellule
dendritiche che forniscano segnali co-stimolatori e hanno unaffinit pi elevata per lantigene.

La memoria immunitaria delle Ig


Le Ig hanno una vita media di 2-3 settimane, soprattutto le IgG. In genere nella prima fase della risposta
immunitaria si determinano delle plasmacellule a vita breve che sono caratterizzate dallavere sulla
superficie cellulare la molecola CD5, vivono per pochi giorni e successivamente si generano delle
plasmacellule che vivono pi a lungo e che sono il prodotto dello switch isotipico e del contatto dei linfociti
con i T helper che forniscono loro segnali antiproliferativi, attraverso il CD40.
Storicamente il primo che si accorse della memoria immunitaria fu Tucidide. Riport quello che successe ad
Atene durante lepidemia di peste e fu il primo nella storia che osserv che gli individui sopravvissuti
allepidemia erano quelli sopravvissuti allepidemia precedente.
Successivamente il dottor Panum, medico danese, osserv lepidemia di morbillo nelle isole Faroer del 1781
e del 1846. Lepidemia che provoc tantissimi morti, ma si accorse che solamente le persone sopravvissute
allultima epidemie erano anche quelle sopravvissute alla prima. Ci mise le basi per il concetto di memoria
e immunit. il meccanismo alla base delle vaccinazioni che ci permette di proteggere milioni di persone
da eventi patogeni semplicemente esponendoli agli antigeni contro cui vogliamo proteggerli.

ANATOMIA FUNZIONALE DEL SI


La risposta immunitaria, la generazione dei linfociti della memoria, cos come degli anticorpi, non avviene
nel circolo sanguigno. Il riconoscimento dellantigene e la produzione di anticorpi avviene in siti
specializzati, che rappresentano il sistema linfatico secondario: linfonodi, milza in parte e il tessuto linfatico
associato alle mucose (MALT). Dobbiamo far ricorso al concetto di anatomia funzionale del sistema
immunitario, cio dove avvengono davvero le reazioni immunitarie. Gli organi linfatici primari (midollo,
fegato fetale e timo) sono molto importanti per la maturazione e per la generazione del repertorio, sono
importanti fino alla nostra nascita. Da questo momento in poi sono importanti gli organi linfatici secondari,
dove avviene la risposta immunitaria. Qui avvengono tutti i riconoscimenti antigenici, le attivazioni, i
rapporti tra i vari tipi di linfociti, i fenomeni di espansione clonale e la generazione dei linfociti della
memoria.
Gli organi linfatici secondari sono:
la milza, irrorata dallarteria splenica, e qui arrivano tutti gli antigeni che passano attraverso il circolo
sanguigno;
i linfonodi, stazioni strategiche diffuse in tutto il corpo, vengono drenati gli antigeni che arrivano varie vie,
epiteliali, respiratorie, uro-genitali, gastro-enteriche.
Sono anche diffusi a livello delle mucose. Il nome generico del sistema linfatico associato alle mucose
MALT. Questo tessuto ha diversi nomi a seconda degli specifici siti anatomici: GALT (gut-associated
lymphoid tissue), BALT (bronchial-associated lymphoid tissue, tessuto linfoide associato alle vie aeree -
trachee, bronchi-), SALT (skin-associated lymphoid tissue, tes),NALT (nose-associated lymphoid tissue). Al di
sotto degli epiteli troviamo gli istiociti che sono sostanzialmente macrofagi dei tessuti, poi cellule
dendritiche, basofili e linfociti. In genere al di sotto delle mucose questi linfociti sono dispersi in modo
disorganizzato, quando arriva lantigene i linfociti si riorganizzano per collaborare a una risposta specifica.

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Questo tipo di organizzazione presente anche nei linfonodi: quando arriva un antigene, i linfociti B lo
riconoscono, iniziano a produrre anticorpi e si forma un centro germinativo, dove ci sono i blasti, cio i
linfociti B che hanno risposto allantigene e che stanno producendo anticorpi specifici. Allesterno di questo
centro germinativo ci sono i linfociti B non specifici per lantigene che costituiscono una specie di mantello
e poi allesterno i linfociti T che han permesso lespansione di queste cellule. Quando una risposta
immunitaria avviene in maniera specifica nei confronti di un antigene si genera sempre questa tipica
struttura che prende il nome di follicolo secondario o centro germinativo, e li troviamo sia al di sotto delle
mucose, sia nei linfonodi e nella milza. Il centro germinativo caratterizzato dallespansione di linfociti B, in
forma di blasti. Ci sono 2 tipi di blasti: scuri (centrociti) e pi chiari (tendono a essere pi quiescenti).
Come fatto un linfonodo. Ha la forma di un piccolo fagiolo, ci sono vasi linfatici afferenti che drenano la
linfa e molti antigeni che possono provenire dellorgano vicino al linfonodo. Il linfonodo caratterizzato da
una capsula esterna e da tante trabecole che definiscono diverse aree. Ogni area del linfonodo, al di sotto
della capsula, definisce unarea corticale, una midollare e una paracorticale. Nella corticale c tutta una
serie di linfociti che possono avere rapporti tra di loro, ci sono soprattutto cellule B . Nella paracorticale ci
sono tanti linfociti organizzati in modo da poter collaborare, ci sono cellule B e T che formano il follicolo
primario, i capillari si trovano soprattutto in questarea. Nella midollare ci sono linfociti T, macrofagi,
plasmacellule che tendono ad andare verso i vasi efferenti e a uscire dal linfonodo.

I linfonodi sono presenti a migliaia nellorganismo, solo nei mammiferi. Sono localizzazioni strategiche per il
riconoscimento antigenico, pesano circa un grammo e ognuno di essi contiene 2x10 7 linfociti. Possediamo
una rete di questi linfonodi collegati al sistema linfatico e a tutto lorganismo, e quando produciamo
linfociti vergini facciamo in modo che circolino attraverso la linfa, il sangue, i linfonodi e ogni linfocita
vergine in grado di raggiungere ogni linfonodo almeno una volta ogni giorno, in modo che ogni linfocita
abbia la possibilit di riconoscere il suo antigene specifico. Altrimenti sarebbe difficilissimo che un linfocita
trovi un antigene attivante nel sistema. solamente nei linfonodi che un linfocita incontra lantigene. Pu
incontrarlo nella milza se questo antigene arriva per via sistemica attraverso il sangue, ma mangiando,
ingerendo, ferendoci, gli antigeni vanno nei linfonodi, ed esattamente nel linfonodo pi vicino al tessuto
che stato interessato nellinfezione. I vasi linfatici efferenti invece portano i linfociti fuori dal linfonodo.
Dal linfonodo escono circa 10 milioni di linfociti allora (75% T, 6% B, 15% macrofagi e co), il 90% di questi
linfociti arrivano dal sangue, il 6% arriva dalla milza, dal sistema linfatico e solo in 4% provengono da una
produzione locale, cio dalla proliferazione di un linfocita che ha riconosciuto lantigene. Allinterno del
linfonodo abbiamo anche tantissime arteriole, abbiamo il circolo arterioso e venoso. Le arteriole a un certo
punto assumono una forma caratteristica: prendono il nome di venule ad endotelio alto (HEV), attraverso
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cui i linfociti che circolano nel sangue entrano nel linfonodo, non possono uscire da questa via. Le venule
collegano il circolo del sangue al linfonodo. Dalle arteriole fuoriescono i linfociti che circolano nel sangue e
che entrano nel linfonodo. Fuoriescono il 25% dei linfociti T e 25% dei linfociti B.
La fuoriuscita del linfocita dipende dalla selectina-L. I linfociti esprimono questa molecola che aderisce alle
cellule endoteliali (HEV) e le selectine legano particolari strutture presenti sulle cellule endoteliali. Quando i
linfociti vengono attivati non esprimono pi questa molecola e quindi non sono pi in grado di aderire alle
cellule endoteliali e fuoriuscire dai linfonodi.
Un linfocita T, in genere vergine, esprime la selectina-L, quando viene
attivato dallantigene perde lespressione della selectina-L, quella gi
presente viene tagliata da enzimi proteolitici, e viene trattenuto nel
linfonodo, tende a non circolare pi. Invece un linfocita che non viene
attivato dallantigene continua a esprimere la selectina-L e pu uscire
dal linfonodo grazie al circolo linfatico ed arrivare poi nuovamente a
livello del circolo sanguigno e ricominciare il ciclo possedendo la
molecola. Una volta uscito il linfocita tende a non rientrare, anche
perch il linfocita attivato va a fare la sua azione e poi tende a morire.
Esistono dei meccanismi che regolano il traffico e la localizzazione dei linfociti negli organi linfatici:
la selectina, di cui abbiamo parlato
i recettori per le chemochine, perch nei linfonodi vengono prodotte chemochine importanti che vengono
captate dai linfociti T vergini. Questi ultimi, attraverso la secrezione di chemochine seguono il gradiente e
vanno dentro al linfonodo. Le chemochine inoltre attraggono nel linfonodo le cellule dendritiche, che
pattugliano lorganismo.
Il recettore della sfingosina-1-fosfato. Regola la fuoriuscita dagli organi linfatici, e quindi quando i linfociti
vengono attivati, questi recettori vengono inibiti ; analogamente alla selectina, che regolava lingresso.

Dal punto di vista della localizzazione dei linfonodi, quando un linfocita interagisce con una cellula
dendritica dopo che ha riconosciuto lantigene (le cellule dendritiche arrivano dallesterno del linfonodo
attraverso un gradiente di chemochine) si forma un coniugato di linfociti T - cellule dendritiche dove
avviene il riconoscimento antigenico. Queste cellule dendritiche si muovono a una velocit tra 10-30
micron/minuto. Attraverso questo contatto stretto tra linfocita T e cellule dendritiche si determinano delle
interazioni che possono variare tra 2 a 36 ore, a seconda che sia uninterazione specifica (36h) o aspecifica
per lantigene (in questo caso si staccano). Queste interazioni determinano lattivazione del linfocita.
Dopo circa 24 ore i linfociti che non vengono attivati dalla cellula dendritica esprimono il recettore S1P e
quindi fuoriescono dal linfonodo. Se invece si avvitano questo recettore viene inibito quindi loro rimangono
nel linfonodo a proseguire le tappe successive dellattivazione e differenziazione.

Cosa avviene a livello di una trabecola e cosa succede quando vi lattivazione con antigene.
Lorganizzazione di linfociti B quiescenti viene definito follicolo linfatico primario, un compartimento dal
quale parte la produzione degli anticorpi e dei linfociti della memoria. Un linfonodo costituito da tanti
follicoli linfatici. Al centro del follicolo troviamo una particolare cellula, la cellule follicolare dendritica
(CFD). Questa non una cellula dendritica, di quelle che d un costimolo, ma possiede dei prolungamenti
simili a quelli dei neuroni ( per questo che si chiama dendritica) e sulla superfice possiede marcatori di tipo
linfoide e mieloide. La cosa importante che le cellule follicolari dendritiche possiedono sulla superficie
numerosissimi recettori per i frammenti cristallizzabili delle Ig e dei recettori per il complemento. La
presenza dei recettori per i frammenti Fc sar critica per la produzione delle Ig ad alta affinit. Inoltre questi

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prolungamenti sulla superficie possiedono moltissime molecole di adesione, come le ICAM che
interagiscono con questi antigeni (uno in particolare VLA-4 che presente sui linfociti B).

Il linfocita B presente nel follicolo linfatico pu interagire attraverso VLA-4 con tali molecole. Questo
determina una forza di adesione rilevante tra i linfociti B e le cellule follicolari dendritiche nel follicolo
primario. Queste cellule stanno esclusivamente nei linfonodi a contatto coi linfociti B.
La cellula dendritica possiede gli FcR che sono i recettori per gli anticorpi, quindi se si formano degli
immunocomplessi nel linfonodo, gli anticorpi possono depositarsi sugli FcR delle cellule follicolari
dendritiche. Infatti le cellule follicolari dendritiche sono ricche di questi immunocomplessi, depositati sui
dendriti che contengono anticorpi legati ai recettori Fc con lantigene legato. Questi immunocomplessi
prendono il nome di iccosomi (sta per immuno-complex): sono costituiti da antigene e immunoglobuline
bivalenti, in genere IgG, legate al recettore Fc. Ci sono anche i recettori del complemento.
Le cellule follicolari dendritiche esprimono anche recettori del TNF, citochine rilasciabili a livello del
linfonodo. Il TNF molto importante perch quando le cellule follicolari dendritiche sentono il TNF la loro
propensione a morire per apoptosi viene bloccata e quindi vivono abbastanza a lungo e riescono a
localizzarsi nelle aree B del linfonodo e formano un reticolo su cui i linfociti del follicolo linfatico si
adagiano. Il reticolo fondamentale per la produzione dei follicoli linfatici. Nel follicolo linfatico c questa
formazione circolare che resa possibile dalla presenza delle cellule dendritiche che entrano a stretto
contatto con i linfociti B. Se non ci sono le cellule follicolari dendritiche non si formerebbe il follicolo
linfatico. Queste strutture sono importantissime perch l vengono trattenuti i linfociti B: quando uno
incontra lantigene incomincia a proliferare, i linfociti T possono cooperare con il linfocita B attivandolo,
esso spinge i linfociti T a formare una corona intorno al follicolo. La proliferazione stimolata dagli
immunocomplessi che sono presenti sui dendriti delle cellule follicolari dendritiche. Questa continua
stimolazione determina il cambio di classe delle Ig e soprattutto determina la continua proliferazione dei
linfociti B che determina mutazioni somatiche a carico dei geni per le catene variabili delle Ig. Tali sono i
presupposti per il fenomeno della maturazione dellaffinit e della generazione di anticorpi sempre pi
affini per lantigene.

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Immunologia - Lezione 15 - 03.05.13 - Novelli
Come abbiamo gi visto alcuni antigeni entrano nel corpo e attivano nel giro di pochissimo tempo il
complemento. Con l'attivazione dellimmunit innata si attivano tutte le vie infiammatorie che portano,
attraverso il riconoscimento tramite TLR, alla produzione di citochine infiammatorie. L'attivazione agisce
anche a livello dei fibroblasti con una risposta coaugulativa.

Attraverso l'azione delle citochine infiammatorie sia ha l'attivazione degli endoteli che cambiano
atteggiamento ed iniziano ad esprimere molecole di adesione che trattengono i leucociti che circolano e
avviene il fenomeno della marginazione: cio questi leucociti aderiscono agli endoteli e sotto lo stimolo
delle citochine e chemochine infiammatorie, marginano e cominciano a fuoriuscire dal vaso e a raggiungere
il punto dove l'antigene entrato.

Nel frattempo questi antigeni iniziano ad entrare nel circolo linfatico, arrivano tramite i vasi linfatici al
linfonodo pi vicino (2h), raggiungono la sottocapsulare dove abbiamo visto essere presenti una serie di
cellule B e T che raggiungono la corticale dove sono organizzate in un follicolo primario che, con l'inizio
della risposta immunitaria, comincia a diventare un follicolo secondario con centro germinativo quando un
antigene giunge attraverso il circolo sanguigno raggiunge invece la milza).
Per esempio quando c' una lesione che crea discontinuit della cute il primo sito in cui si attiva
l'infiammazione sono i linfonodi tramite vasi linfatici: questo processo richiede circa 2 ore e una volta
arrivati a livello dei vasi linfatici a ridosso della corticale avviene la processazione dell'antigene: entrano in
gioco macrofagi, cellule dendritiche, e linfociti che risiedono nel linfonodo. Queste cellule sono tutte in
grado di captare l'antigene e di elaborarlo.

Risposta Timo-Indipendente (rapida)


Terzo passaggio della risposta a livello del linfonodo (dopo invasione e pro cessazione) si ha in virt della
presenza dei linfociti B che grazie al BCR possono determinare le prime risposte immunitarie di tipo Timo-
indipendente: cio questi linfociti B captano l'antigene senza bisogno di entrare in rapporto con un T-helper
che li attivano; e la risposta immunitaria che ne risulta il risultato dell'attivazione di questi linfociti B che si
trasformano rapidamente in plasmacellule con conseguente produzione di IgM pentameriche che in genere
sono a bassa affinit perch questi linfociti B non vengono sottoposti alla maturazione dell'affinit. Si ha
cos una risposta molto rapida che la tipica risposta caratterizzata dalla produzione di IgM (vedi cinetica di
attivazione). Questi linfociti B sono localizzati nella zona marginale, presente sia nel linfonodi che nella
milza. IgM pentameriche a bassa affinit sono essenzialmente contro polisaccaridi della parete batterica di
molti patogeni. Sono linfociti caratteristici rispetto a quelli che si fanno attivare dai th, poich posseggono
sulla membrana cellulare una tipica molecola che si chiama CD5; sono anche detti linfociti B CD5+.

Risposta Timo-Dipendente (lenta)


Ma mentre si sta attivando questa risposta a bassa affinit i
linfociti B (CD5-) captano l'antigene come anche i macrofagi
e le cellule dendritiche, lo internalizzano ed espongono
sullMHC II. Un altro punto poi importante, infatti le
cellule dendritiche che pattugliano la periferia (per esempio
le cellule di Langerhans che sono specifiche cellule
dendritiche immature) del nostro organismo possono
captare l'antigene che entrato e poi vanno nel linfonodo
dove possono poi presentare questi antigeni ai linfociti T-
helper. Quindi ci vogliono circa 18 ore affinch le cellule

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dendritiche che pattugliano la periferia possano arrivare al
linfonodo e siano in grado in qualche modo di interagire con i
linfociti T specifici. Chiaramente nel linfonodo i linfociti T
incominciano a contattare i linfociti B e le cellule dendritiche che
hanno esposto l'antigene specifico sulle molecole MHC. I primi
contatti di questo tipo avvengono soprattutto ai confini di quelle
che vengono definite aree T.
Pu succedere che i linfociti T trovino le cellule dendritiche
specifiche avviando il fenomeno della presentazione con una
continua interazione che va avanti dalle 15 alle 36 ore (abbiamo
visto il controllo dellattivazione del linfocita T).
A questo punto i linfociti B stimolati dai linfociti T cominciano a dar luogo alla prima produzione di anticorpi
solubili che si legano agli antigeni che ora sono presenti nel linfonodo, quindi si formano i primi
immunocomplessi che si depositano sulle cellule follicolari dendritiche e formano gli iccosomi: sono
costituiti da materiale antigenico che quindi continua a persistere nel linfonodo e stimola i linfociti B ad
andare incontro a continue proliferazioni.
Questi sono gli eventi che consentono la creazione di un centro germinativo dove il linfocita B attivato
produce anticorpi specifici e si espande sotto stimolo di cellule T-helper. Si ha cos una fase in cui
procedendo le interazioni tra linfociti T e B si arriva ad una produzione di immunoglobuline ad alta affinit.
Infatti il linfocita T produce citochine inducendo il linfocita B ad andare incontro sia a switch isotipico, sia,
essendo continuamente stimolato dalle cellule follicolari dendritiche in presenza dell'antigene, a
replicazione: questo fenomeno causa mutazioni a livello dei geni delle immunoglobuline che codificano per
regioni variabili con conseguente formazione di anticorpi con maggiore affinit. Gli immunocomplessi
negli iccosomi sono sempre a maggiore affinit.
Il centro germinativo
Tutti questi eventi (l'arrivo dell'antigene, il
riconoscimento dell'antigene tramite BCR e la
produzione delle IgM) avvengono tutti nella
porzione definita Corticale.
importante notare che:
Nella Corticale avviene la produzione di IgM.
Nella Paracorticale ci sono i linfociti B che sono
preattivati (hanno riconosciuto l'antigene e hanno
esposto i recettori per le citochine, sono i CD5-) ma
vanno in cerca dei linfociti T specifici per questi
peptidi e se lo trovano si attivano dando luogo al
fenomeno della cooperazione linfociti T-linfociti B
cio il linfocita B esprime l'antigene sull'MHC II e viene attivato grazie ad una interazione CD40 - CD40L e
alla produzione di citochine da parte del linfocita t helper.
A seguito di questa interazione i linfociti B che si sono attivati si portano in un'area precisa della
Paracorticale che quella ricca di cellule follicolari dendritiche che viene definito follicolo primario.

Il follicolo primario una zona dove i linfociti B attivati riproducono Ig molto intensamente e in seguito a
questa ripetuta divisione si crea il centro germinativo (si tratta gi di un follicolo secondario), cio una zona
in cui il linfocita B stimolato dall'antigene specifico sta nel centro e comincia attivamente a proliferare e, a
forza di riprodursi, spingono gli altri linfociti B che non sono attivati a formare un mantello e

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successivamente spingono i linfociti T con cui hanno interagito a formare una corona periferica intorno a
questo centro. Ci troviamo di fronte a due zone ben distinte: una zona pi scura (al centro del follicolo) con
i cosiddetti blasti (linfociti B in elevata proliferazione con nucleo evidente, visto il rapporto
citoplasma/nucleo), e una chiara dove si sono dispersi i linfociti T e i B non attivati.
La proliferazione provoca un rimodernamento della costituzione delle cellule nel follicolo, in quanto le
cellule B tendono a formare un cerchio intorno alle cellule follicolari dendritiche.
I CD5- che interagiscono con i TH garantiscono una protezione ad alta affinit, vista lespansione clonale che
avviene a livello del follicolo secondario, senza i T-helper potrei solo contare su un riconoscimento di
patogeni basato sui principali polisaccaridi batterici e basta.
Al centro del centro del follicolo inizio a vedere alcune plasmacellule producenti IgG ma a bassa affinit,
aumentando il centro germinativo in parallelo alla proliferazione, vista la persistenza dellAg sulle follicolari
dendritiche, aumenta laffinit dellIg.

Quindi nel centro germinativo ci sar una zona chiara e una zona scura corrispondenti ai 2 stadi diversi in
cui si trovano i linfociti B che stanno proliferando.

Riepilogando, il follicolo secondario ha un centro germinativo che caratterizzato da:


una zona chiara
una zona scura
le cellule follicolari al centro con gli iccosomi sui loro dendriti
una corona di linfociti B esterni nella fase G0 del ciclo germinativo con intorno i linfociti T.

I linfociti che prima erano inattivi in G0 e poi iniziano a proliferare intensamente una volta attivati sono
nella zona scura e periodicamente escono dal ciclo cellulare e diventano linfociti B della zona chiara e
venendo stimolati continuamente tornano a proliferare nella zona scura; il ciclo continuo: alcuni di loro
escono da questo giro e diventando plasmacellule iniziano a produrre IgG.

Tutto questo circuito stimola i linfociti B a proliferare e a produrre anticorpi con affinit sempre pi alta
migrando anche nei tessuti. Quindi a livello del follicolo secondario nel centro germinativo abbiamo tre
fenomeni che sono importanti per la risposta immunitaria:
L'espansione clonale del linfocita B che stato selezionato dall'antigene;
Il fenomeno delle mutazioni somatiche perch questa proliferazione intensa determina piccole mutazioni
puntiformi che fanno cambiare la specificit dell'antigene ;
Le commutazioni di classe: ovvero la produzione di citochine determina il cambiamento della sottoclasse
degli anticorpi che sono prodotti dai linfociti B.

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Caratteristiche della zona chiara e della zona scura


Periodicamente i linfociti B stimolati dall'antigene diventano dei blasti che si stanno dividendo (ogni 6 ore),
escono dal ciclo, e vanno nella zona chiara.

Nella zona chiara cambiano aspetto, il loro nucleo meno scuro e diventano dei linfociti che vengono
chiamati centrociti: in questo stadio riescono ad esprimere le immunoglobuline sulla membrana
contrariamente a quando sono blasti, in cui non riescono ad esprimerle sulla membrana. Solo i centrociti
sono in grado cos di legare l'antigene.
Per cui abbiamo da una parte i blasti (centroblasti) con nucleo scuro che si stanno dividendo e non hanno Ig
sulla membrana, da essi possono formarsi le plasmacellule o le cellule della memoria che escono dal ciclo, e
poi abbiamo i centrociti che sono quelli crescono dal ciclo e possono esprimere le Ig sulla membrana che
possono venire stimolati dagli immunocomplessi (tutto questo dopo unattivazione dati dai linfociti T, e
legandosi negli iccosomi, cosa che determina una elevata proliferazione).
Quindi i linfociti B nelle zone chiare possono subire il segnale attivatorio da parte delle cellule follicolari
dendritiche: data questa continua e intensa stimolazione si viene a creare una competizione per quanto
riguarda la sopravvivenza perch soltanto i linfociti B che hanno un recettore specifico per quell'antigene
riescono a legarsi perch c' una competizione di tanti cloni: cos chi vincer questa "battaglia darwiniana"
riuscir a sopravvivere perch grazie al legame con l'antigene riuscir a procurarsi il segnale di
sopravvivenza esprimendo cos Bcl2, proteina antiapoptotica, che gli consente di proliferare. Questa
proliferazione permetter loro di commutare di classe e quindi di diventare o delle cellule B di memoria
oppure delle plasmacellule.
Quindi i linfocita B con il recettore a pi alta affinit per questo antigene vengono stimolati e viene
prodotta una proteina che fa da stimolo per la sintesi Flip (proteina antiapoptotica).
Bcl2: antiapoptotica e inoltre consente di proliferare a lungo
Flip: antiapoptotica
I linfociti B che non si legano e che giungono al follicolo secondario vanno incontro ad apoptosi.

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L'apoptosi sopraggiunge quindi per:
cellule che continuano a mantenere il BCR allo stato originale;
cellule che subiscono mutazioni che le portano a non avere dei recettori molto affini.

Quando invece i linfociti hanno il recettore affine e riconoscono l'antigene passano di nuovo nella zona
scura perdendo di nuovo le Ig di superficie e iniziano a blastizzare il loro DNA proliferando e dando luogo a
ripetute divisioni e migrazioni in area chiara e area scura.

Nella zona scura le cellule chiamate blasti vanno incontro ogni 6 ore a divisione cellulare e quindi si
espandono clonalmente aumentando di numero e compiendo cos commutazione di classe (quando i
linfociti B del centro germinativo sono stimolate da alcune citochine a cambiare i geni che codificano per la
porzione costante delle Ig).
Abbiamo i segmenti della regione variabile (esoni V-D-J) che definiscono la specificit e abbiamo a valle di
questi geni tutta una serie di geni codificanti per le parti costanti delle Ig.
Ci sono delle sequenze particolari che permettono la
ricombinazione genica molto conservate a monte
delle sequenze costanti per cui l'Ig usa la catena pi
vicina all'esone VDJ, nel preattivo o nel CD5+ IgM,
quindi viene creato un trascritto primario e uno
splicing che determina la produzione di un'IgM. Nel
centro germinativo sotto lo stimolo delle citochine si
ha il fenomeno della commutazione di classe: cio
avviene una delezione genetica ordinata, partendo
dall'assetto genico del linfocita riarrangiato, grazie a
queste sequenze di switch a monte di ogni singolo
segmento genico (tranne che di C delta) delle catene costanti si appaiano tra di loro e viene tagliato il DNA
che interposto. Quindi necessario per l'avvento dello switch che vengano indotte dalle citochine delle
proteine che legano il DNA, in particolare queste regioni di commutazione. Alcune citochine legano
determinato zone, altre ne legano altre.
Per esempio: l'IFN gamma indurr delle proteine che si legano ad una determinata regione di switch che
determiner una particolare delezione genica e la creazione di una Ig di una particolare sottoclasse
chiamata gamma-3. Quando poi il linfocita B
sottoposto a questi fenomeni di delezione il DNA
interposto tra le sequenze tagliate viene eliminato e il
linfocita inizier ad esporre delle Ig utilizzando la
costante gamma-3 diventando IgG3; potr subire altri
stimoli dalle chemochine e dalle citochine e andare
incontro ad ulteriori commutazioni di classe con
ulteriori delezioni di altri segmenti posso ottenere
dalla IgG3 delle IgA (a valle del segmento
precedentemente deleto).
Il fenomeno della commutazione avviene dentro al
centro germinativo.

Mutazioni Puntiformi

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Oltre al fenomeno della commutazione di classe avvengono altri eventi che consentono l'ampliamento del
repertorio. Infatti il centro germinativo sito di elevata proliferazione e questo fenomeno causa mutazioni
puntiformi ad una frequenza molto elevata (circa 1/1000 basi pu mutare) e questo determina degli errori
nelle sequenze delle porzioni variabili causando un aumento del repertorio dei linfociti. Quindi attraverso lo
switch e tali mutazione si ha un'ampia gamma di variabilit sulla quale poggiare la produzione di anticorpi
ad alta affinit.
Linfociti T non hanno questo tipo di possibilit: essi hanno un repertorio che si forma a livello del timo e poi
una volta che maturano non possono pi variare il repertorio, mentre i linfociti B hanno la possibilit di
modificare l'affinit e la specificit del recettore per gli antigeni delle regioni ipervariabili sia delle catene
pesanti sia di quelle leggere. Il fenomeno quindi determinato dalla frequenza di mutazioni. Infatti tale
frequenza a carico dei geni per le IgG molto pi elevata rispetto a quella dei geni per le IgM, perch in
genere le IgM sono le prime ad essere prodotte, non sono create nel centro germinativo e non mutano
particolarmente. Se noi vacciniamo un individuo esso produce delle IgG con una certa affinit, affinit che
crescer se lo vaccineremo una seconda volta e cos via per le volte successive.

Se facciamo la biopsia del linfonodo i centri germinativi sono molto chiari e sono dati dalla risposta dei
linfociti ai rispettivi antigeni. Il centro germinativo nasce 7 giorni dopo la risposta antigienica, quindi ci va un
certo tempo per elaborare la risposta immunitaria e tale centro germinativo neoformato dura circa 2
settimane cos da permettere l'eliminazione della malattia.

Quindi da linfociti T vergini che sono presenti nel circolo e che raggiungono il l'infondo hanno una
particolare molecola, CD45ra che una isoforma del CD45, presente su tutti i linfociti T vergini. Tali linfociti
esprimono anche elevati livelli di selectina che permette loro di interagire con le cellule endoteliale della
HEV tramite dei carboidrati presenti su queste cellule endoteliali, cos possono marginare e raggiungere la
parte corticale del linfonodo ed interagire con cellule dendritiche, attivarsi. Si abbassa poi l'espressione
delle selectine-L che impedisce loro di fuoriuscire; in parallelo cambiano l'isoforma del CD45 (da CD45ra a
CD45ro), cos da permettere la migrazione dei linfociti verso i tessuti per trovare il loro bersaglio.
I linfociti B immaturi sono prodotti a livello del midollo e hanno sulla superficie cellulare le IgM dapprima e
poi dopo essere maturati le IgD: alcuni raggiungono poi il follicolo (CD5-); altri la zona marginale (CD5+) che
dopo aver riconosciuto l'antigene vanno incontro ad una rapida espansione senza aver bisogno dei T-helper
e diventano immediatamente delle plasmacellule che producono IgM a bassa affinit, una volta che escono
dal linfonodo raggiungono il midollo, producono IgM per qualche tempo e poi vanno in apoptosi, hanno
una vita breve.
Diversa invece la sorte dei linfociti B dei follicoli perch una parte delle IgM pu essere captata dalle
cellule follicolari dendritiche, anche se in realt sulle cellule follicolari dendritiche si legano soprattutto IgG,
per questi linfociti B che stanno nei follicoli possono incamerare l'antigene e presentarlo ai T-helper cos
che questi gli diano gli input per espandersi clonalmente (espansione clonale) cosicch possano andare
incontro a mutazioni successive ed espansioni del BCR.
Le opzioni del linfocita B attivato sono:
diventare plasmacellule
diventare cellule B della memoria
andare incontro ad apoptosi

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Le plasmacellule hanno la vita molto pi lunga di quelle della zona marginale e sono aiutate nella loro
sopravvivenza da alcune citochine come l'IL-6, poi vanno nel midollo e producono Ig ad alta affinit e di
varie classi a seconda dello stimolo che hanno subito.

Antigene: tutto ci che pu essere riconosciuto da un anticorpo o da un linfocita, quindi un generatore di


anticorpi.
E' un termine dal significato relativo perch la
capacit del sistema immunitario di riconoscere un
antigene dipende da alcuni fattori:
genetico: produzione del repertorio diversa in
ognuno di noi;
dipendenti dal modo e via di penetrazione: ogni
via d'ingresso intrapresa dall'antigene verso il
nostro corpo genera una risposta differente;
dosi di antigene entrate: magari son cos basse da
non fare neppure scattare il meccanismo ma anche
questo esempio relativo, infatti in alcuni casi la presenza dell'antigene pu indurre una reazione
immunitaria, in altri casi invece pu indurre tolleranza e quindi senza causare reazione immunitaria;
Eterogeneit dell'antigene: dipende da quanto complesso, da quanti determinanti antigienici espone
sulla sua superficie. In vivo pu essere indotta una risposta policlonale da parte di una sola proteina e
questo fenomeno spiegabile con il fatto che diversi cloni riconoscono diverse parti della proteina. Il
concetto dell'eterogeneit dell'antigene messo in relazione con la sua complessit nella composizione
chimica, infatti generalmente un antigene diventa capace di indurre una risposta immunitaria pi marcata
se pi complesso: molecole molto semplici vengono riconosciute male, l'ideale infatti un antigene di
grandi dimensioni, eterogeneo e che abbia una complessa composizione chimica.

Durante le vaccinazioni i vaccini devono essere mischiati con alcune sostanze dette adiuvanti, perch
mischiando le due cose il sistema immunitario riesce a riconoscere meglio l'antigene e a scatenare una
risposta immunitaria maggiore.

Aptene: sostanza con la capacit di legarsi al TCR o agli anticorpi, ma non un antigene perch da solo non
riesce ad indurre una risposta anticorpale perch una molecola molto piccola, semplici dal punto di vista
chimico.
Per ottenere una risposta dobbiamo coniugare l'aptene con un'atra proteina chiamata carrier cos il
sistema immunitario riesce a produrre anticorpi diretti contro questo dimero innescando una risposta
immunitaria (concetto usato per i vaccini).

Quando abbiamo parlato di antigene abbiamo


parlato di determinante antigenico o epitopo:
piccola parte di antigene che lega l'anticorpo
specifico attivando la risposta. La presenza di una
risposta policlonale molto utile al nostro sistema

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immunitario in quanto se un virus, ad esempio, muta un determinante la risposta anticorpale sussiste
grazie al fatto che pi cloni diversi riconoscono lo stesso patogeno tramite determinanti antigenici diversi.
Cos un antigene un mosaico di tanti determinanti antigenici: l'antigene tutto ci che pu essere
riconosciuto, mentre il determinante antigenico ci che riconosciuto da un singolo recettore del sistema
immunitario.
Alcuni determinanti nascono dal fatto che la proteina sia ripiegata in un certo modo e vengono definiti
determinanti conformazionali (se la struttura venisse srotolata l'anticorpo non sarebbe pi in grado di
riconoscerlo). Tuttavia alcuni epitopi di un antigene sono detti determinanti sequenziali, cio possono
essere riconosciuti da un anticorpo solo nella loro sequenza amminoacidica.
Gli anticorpi riescono a riconoscere fino a 6 - 7 residui saccaridici e riescono a riconoscere sequenze che
vanno dai 6 ai 20 amminoacidi, queste sono le sequenze che vengono chiamate lineari. Per un antigene
non determinato solo per sequenze lineari, infatti pu essere avvolto su se stesso in conformazione
terziaria che riconosciuta da un anticorpo.
In generale la maggior parte degli epitopi riconosciuti di tipo conformazionale, infatti logico che i
linfociti B riconoscano le proteine nella loro forma nativa che la maggior parte delle volte tridimensionale.

Un antigene ha una valenza: il numero massimo di molecole anticorpali che possono legarsi a tale antigene,
tale numero pu (ma non sempre cos) corrispondere al numero degli epitopi presenti su quell'antigene.

Anche gli anticorpi hanno una valenza:


anticorpi monomerici: valenza 2 perch hanno 2 siti di riconoscimento per l'antigene
anticorpi polimerici: le IgM da 2 a 10; le IgA sono dimerici possono avere valenza fino a 4.

Assorbimento di antisieri polivalenti


Da siero immune (o antisiero) ricavato utilizzando gli antigeni per immunizzare un individuo e prelevandone
il siero che avr gli Ab per questi Ag.
Se prendo invece una molecola antigenica che non contiene un determinante che prima conteneva, e
faccio reagire con il siero immune, riesco a rimuovere gli anticorpi che non sono quelli contro quel
determinante, ho creato un siero contro un unico determinante, monoclonale. La stessa cosa la posso fare
imbevendo una sostanza solida che contenga tutti i determinanti eccetto uno cosicch io possa assorbire
tutti gli anticorpi specifici per gli epitopi che non mi interessano lasciando in soluzione solo quelli specifici
per l'epitopo che mi interessa.
Antigeni Naturali
Gli antigeni in natura possono essere proteine (e quindi gli antigeni quando inducono la risposta
immunitaria sono detti IMMUNOGENI). Pi sono grandi le proteine e pi inducono risposte immunitarie
buone: una proteina che pesa meno di 1000 dalton in genere non immunogena.
Proteine dal peso intermedio da 1000 a 6000 dalton sono poco immunogene cos ho bisogno di adiuvanti
per scatenare una buona risposta immunitaria.
Oltre i 6000 dalton si parla di proteine dal grande peso molecolare e risultano invece molto immunogene.
Ci sono poi delle proteine molto eterogenee che offrono svariati epitopi e sono molto immunogene, altre
invece sono una ripetizione di tanti segmenti peptidici tutti uguali e non sono molto immunogene perch i
determinanti diversi non sono molti (per esempio polisaccaridi); il discorso del peso molecolare perci
relativo, se ho una proteina grande pi probabile che abbia pi epitopi. Nei globulo rossi, e nei
microorganismi ci sono dei polisaccaridi (antigeni eterofili polisaccaridici) conosciuti come antigeni di
Forssmann che inducono una risposta non particolarmente intensa. La stessa cosa avviene per i lipidi che
sono sostanzialmente una ripetizione di atomi di carbonio e risultano molto poco immunogenici. Gli acidi

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Immunologia - Lezione 15 - 03.05.13 - Novelli
nucleici sono ripetuti e funzionano come apteni essendo molto piccoli. Molti pazienti malati di Lupus
Eritematoso Sistemico hanno degli anticorpi contro le nucleoproteine dei globuli rossi: quando si formano
gli eritrociti e vengono espulsi i loro nuclei, si formano degli anticorpi contro il DNA: il DNA da solo poco
immunogenico, per in genere il DNA associato a delle proteine (nucleoproteine) che i T-helper
riconoscono e si creano cos dei Linfociti T-helper contro tali proteine che aiutano i linfociti B a creare
anticorpi contro il DNA (in questo caso il DNA sarebbe un aptene, ma la proteina fa da carrier e lo rende
riconoscibile e immunogenico): cos si creano degli immunocomplessi molto pericolosi per i pazienti affetti
da Lupus Eritematoso Sistemico.

Antigeni Artificiali
C' poi la possibilit di creare artificialmente
antigeni e fare in modo che gli anticorpi siano
diretti verso determinate strutture.
Se prendiamo una proteina che esprime un
residuo di tirosina e la facciamo reagire legandolo
covalentemente con del para aminobenzene
arsonato (il PABA una molecola batterica,
intermedio della sintesi dellacido folico, che noi
non produciamo, ma assumiamo dallesterno), in
presenza di nitrato di sodio; otteniamo un
composto altamente reattivo. Questa molecola
che in genere un aptene, se legato alla
proteina, pu essere usata per produrre anticorpi contro di lei poich il PABA fa da carrier e permette a
questo aptene di essere immunogenico. Addirittura in laboratorio si possono creare molecole che
distinguono un gruppo chimico sula stessa molecola in posizione orto meta e para: in questa maniera
possiamo creare antigeni artificiali che determinano una risposta immunitaria molto specifica.

Altri composti Immunogenici


Gli omopolimeri sono poco immunogenici mentre gli eteropolimeri sono pi immunogenici.
Gli amminoacidi aromatici come la Tyr sono molto pi immunogenici rispetto alle proteine che non ne
hanno.
Adiuvanti
Quando un antigene non molto immunogenico possiamo usare gli adiuvanti: infatti quasi tutti i vaccini
sono somministrati con adiuvanti per aumentare l'immunogenicit. Ce ne sono di diverso tipo che vanno da
olii minerali o da batteri (per esempio: adiuvante di Freund, formato da una miscela di olii minerali e
batteri morti, i quali attivano l'immunit innata e le cellule dendritiche attraverso i TLRs). Il loro scopo di
facilitare il riconoscimento dell'antigene da parte della cellule B e T attraverso l'attivazione delle APC.

La stessa cosa la fanno gli oli minerali che creano


delle dispersioni di antigene e queste emulsioni
sono pi facilmente captabili dalle cellule che
fagocitano, per esempio i macrofagi mangiano con
molta pi facilit un'emulsione oleosa e la
presentano con molta pi facilit ai linfociti.
E' famoso il bacillo di Calmette-Guerin che
composto dal batterio della TBC (attenuato per

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immunizzare contro la tubercolosi) (anche utile da utilizzare come adiuvante in quanto i batteri contengono
molte sequenze CpG non metilate che abbiamo visto attivano molto bene i TLR attivando l'immunit
innata).
Un altro adiuvante molto potente il lipopolisaccaride che presente sui batteri ed legato da CD14
presente su macrofagi ed presente su membrane delle cellule APC.
Sono usati anche molto gli idrossidi dAlluminio che permettono di fagocitare l'antigene con molta pi
efficienza da parte di macrofagi e cellule dendritiche.
Anche lo squalene attiva i fagociti (intermedio della sintesi di colesterolo, non rilasciato nelluomo).

Possiamo invece usare le citochine che attivano specificatamente e molto bene le cellule APC e macrofagi:
Citochine, chemochine proinfiammatorie che attivano molto bene le APC.
Vari tipi di agenti che reclutano o fanno maturare le cellule dendritiche come il GM-CSF o altre sostanze
simili che le fanno fagocitare, maturare e le rendono capaci di fornire il costimolo ai linfociti T.
Gli acidi nucleici a doppia elica che attivano la via dei TLR e determinano il rilascio dell'interferon che un
ottimo modulatore.

Quindi mischio queste sostanze (adiuvanti) agli antigeni per migliorare la loro capacit di indurre una
risposta immunitaria.

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Ipersensibilit
Cosa succede quando la risposta immunitaria diventa inappropriata o eccessiva? Si parla di
immmunopatologia. Queste reazioni eccessive possiamo classificarle in 4 prototipi di danno immunologico.
Questi danni sono dovuti a danni da anticorpi, o dovuti ai linfociti T.

I danni fatti dagli anticorpi vengono classificati in 3 diversi tipi :

>>Tipo I, danni mediati da IgE, ipersensibilit immediata (danno che si verifica nel giro di minuti dal contatto
dell' antigene);
>>Tipo II, IgG , determina dei danni litici alle cellule (nel giro 5-8 ore dall' incontro dell' antigene);
>>Tipo III, IgG, danni da immunocomplessi che formano dei reticolati insolubili (giorni) .

Poi abbiamo il quarto tipo di ipersensibilit, ma dovuta ai linfociti di tipo T:


>> Tipo IV, ipersensibilit ritardata (48-72 ore).

Reazione di ipersensibilit di I tipo


Definita come allergia o atopia: fenomeno che riguarda circa il 40 % della popolazione. Un antigene
generalmente innoquo, definito allergene, in alcuni individui diventa la causaa della malattia (es. asma).
Questo tipo di danno mediato da anticorpo Ig E; dimostrato da esperimenti che gli immunologi chiamano
"trasferimento adattivo": si prendono animali da laboratorio e trasferiamo degli anticorpi IgE specifici per un
dato anticorpo nel topolino; poi prendiamo gli antigeni e li trasferiamo anch'essi nel topolino e succede che
questo topolino che prima non era allergico adesso sviluppa l'allergia. Quindi sono questa classe di IgE che
scatenano questa ipersensibilit.
Nel corso della nostra vita ingeriamo moltissime proteine di cui noi siamo tolleranti ma alcune di queste
proteine possono essere allergeni per particolari persone e scatenare ipersensibilit immediata.
Come sono fatti gli allergeni?
sono delle proteine che vengono viste dai linfociti T
sono a basso peso molecolare
possiedono unelevata solubilit
agiscono a dose molto bassa
sono molto stabili
vengono captate molto bene da tessuti ricchi di cellule dentritiche e scatenano riposte T. Scatenano
risposte T quando esse sono prive di segnali infiammatori. I segnali infiammatori sopratutto quelli mediati
dai TOLL LIKE RECEPTORS attivano risposta proinfiammatoria attraverso il rilascio di citochine (interferone
gamma e IL12). Queste inducono risposte T-helper di tipo 1: in questo contesto non si sviluppano quasi mai
risposte di ipersensibilit immediata per. Se un allergene viene captato da cellule dentritiche in assenza di
segnali proinfiammatori (non attraverso la mediazione dei TLR) la risposta immunitaria viene orientata verso
una risposta T-helper 2 (questo favorisce l'innesco di risposte di tipo IgE).
Come si determina questo quadro antiinfiammatorio?
Si determina quando un allergene viene captato da un antigen presenting cells (soprattutto CD) e a causa
dell'ambiente antiinfiammatorio produce una citochina IL10. IL10 una tipica proteina antiinfiammatoria
che contrasta l'effetto di citochine proinfiammatorie e aiuta l'attivazione dei linfociti T helper da parte delle
antigen presenting cells (in particolare il tipo 2, viene favorita la differenzazione dei linfociti dei CD4 helper
che producono IL4 e IL13 ).

Quindi il primo passo: l'allergene viene presentato in un contesto antiinfiammatorio, c' poco IL12, e in
presenza di IL10 abbiamo la differenziazione dei linfociti in linfociti T-helper2 .

Il secondo passo: necessario che l'antigene sia riconosciuto da anticorpo di classe Ig E e non solo. Infatti
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questo anticorpo per scatenare questa risposta, deve essere legato a particolari recettori presenti in
mastociti e basofili. Questi recettori sono ad alta affinit per l'IgE. Quindi quando un individuo viene esposto
a un allergene per la prima volta allora questo allergene viene captato dalle cellule dentritiche e viene
indotta una risposta T-helper 2, vengono prodotti degli anticorpi. I T helper 2 spingono lo switch delle
immunoglobuline verso Ig E: queste IgE si vanno a legare su basofili prevalentemente. La prima volta non
succede nulla, ma questi basofili caricati su con IgE sono delle BOMBE perch quando l'antigene entra per la
seconda volta si lega alle Ig E (crea legame crociato fra le IgE) e
stimola i basofili a secernere il contenuto dei granuli.
Quindi durante la prima volta abbiamo un fenomeno di
sensibilizzazione dove l'antigene non scatena risposta patologica.
Alla base del fenomeno dell'ipersensibilit immediata c' la
differenziazione in linfociti T helper 2: questi linfociti in presenza
di questo allergene sono stimolati da recettori Notch (legato da
Jagged) a sintetizzare IL4 . Questa IL4 spinge i linfociti T helper 2 a differenziarsi in linfociti che fanno IL4:
questa interleuchina uno dei fattori citochinici che si lega alle sequenze segnali dei geni delle porzioni
costanti dell'anticorpo per attivare lo switch isotipico.
Quindi nelle cellule dentritiche sappiamo che Delta indotto da stimoli che sono pescati da recettori TCR
mentre Jagged un segnale che indipendente da TLR. In un contesto di poca infiammazione le cellule
dentritiche usano Jagged per legare Notch e i linfociti vengono spinti verso il Thelper 2.

Quando abbiamo questo legame, la coda citoplasmatica si taglia e diventa un fattore trascrizionale e cos
abbiamo l'aumento della trascrizione del gene per IL4. In un contesto di poca infiammazione viene prodotta
IL10 che aiuta i linfociti a differenziarsi in TH2 che si mettono a produrre IL4 e IL13. Questi TH2 sono linfociti
T che hanno la caratteristica di esprimere il recettore per IL4 e attraverso questo stimolo si mettono a
differenziarsi in cellule grandi produttrici di queste citochine:
IL4 che aiuta lo switch isotipico;
IL5 che agisce su eosinofili reclutandoli;
GM-CSF che agisce su midollo, su precursori delle cellule mieloidi;
IL10 citochina antiinfiammatoria che regola negativamente risposte TH-1.

Quindi attraverso queste citochine i TH2 controllano l'espansione, il differenziamento dei linfociti B. Quindi
IL4 e IL13 rilasciate da TH2 hanno azione sui linfociti B specifici per questo allergene che si differenziano in
plasmacellule e secernenano Ig E specifiche per questo allergene. La produzione di IgE di tipo solubile un
problema quando si legano a questi recettori ad alta affinita: presente su basofili ed eosinofili. Significa che
avendo un affinit molto elevata, le Ig E attaccate a queste recettore, si staccano molto difficilmente e ne
determinano la prontezza alla risposta. Queste cellule sono ricche di granuli che contengono mediatori
dell'infiammazione (istamina, eparina, leucotrieni) e quindi la loro esocitosi determina i fenomeni di allergia
molto velocemente. Molti di loro sono sentinelle tissutali: sulla cute, sul tessuto mucoso del tratto
respiratorio e intestinale.
Per scatenare il rilascio dei granuli allora necessario che l'antigene sia legato da anticorpi molte volte,
ovvero si verifica il fenomeno del crosslinking (legame crociato) di molti anticorpi con vari determinanti
antigenici. Quando questi recettori sono stimolati in questa maniera dall'antigene allora abbiamo la
degranulazione di tutte le sostanze solubili citate prima. Le sostanze rilasciate agiscono su muscolatura liscia
(istamina), alcune sulla permeabilt vascolare (determinano edema), ci sono leucotrieni che reclutano altri
granulociti nel punto in cui si verifica la reazione. Quando la reazione avviene a livello sistemico abbiamo
una massiccia azione sulla muscolatura liscia che determina blocco respirazione e schock anafilattico:
quindi un fenomeno potente che viene mediato da anticorpi di tipo IgE.
Se l 'allergene viene ri-introdotto abbiamo il crosslinking dell' IgE e allora degranulazione!

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Alcuni di noi soffrono di pi di allergia , altre meno. Perch?

(1) Polimorfismo HLA: certi HLA non presentano quel allergene, altri si. Se legano con un' affinit
molto elevata, allora la risposta molto pi potente. Quindi non tutta la popolazione uguale dal punto di
vista HLA: alcuni possono favorire la risposta TH2 e altri no;
(2) La presenza di TCR in grado di legare con alta affinit l'allergene possono essere diversi da individuo
a individuo. Non tutti abbiamo gli stessi TCR e questo dipende dalla maturazione nel timo: alcuni di noi
potranno avere durante la maturazione timica una selezione dei cloni che magari legano ad elevata affinit
quel peptide in quel allegene. Quindi alcuni di noi si trovano dei TCR che legano molto bene determinati
antigeni e hanno una risposta pi sostenuta: c' una variabilit individuale.
(3) Genetico. Ci sono alcuni individui che sono predispositi a produrre pi IL10, IL4, IL13 perch ci sono
dei polimorfismi a livello dei promotori. Viene quindi influenzare la trascrizione e quindi per alcuni individui
abbiamo produzione diversa di queste citochine.
(4) Microambiente: vari stimoli ambientali inibiscono lo sviluppo dei linfociti TH2 (TBC, LEBBRA, ALTRE
INFEZIONI BATTERICHE) inducendo la produzione di IL12 e di INFgamma. L' attivazione dei TH2 non avviene
quando siamo in una condizione dove ci sono tanti stimoli ai TCR in condizioni proinfiammatorie. Chi vive in
condizione di costante presenza di patogeni intracellulare ha un attivazione del sistema TLR molto spiccato e
quindi una produzione di citochine proinfiammatorie che bloccano la risposta allergica: quindi in queste
situazione i TH2 non si attivano (chi vive in campagna ha una risposta TH1 molto sostenuta e questo blocca
l'allergia).

Da un punto di vista clinico esistono delle differenze tra le allergia dovute al punto 1- 2 e ai punti 3-4. Le
allergie dovute ai difetti di polimorfismo HLA e TCR sono poco controllabili dal punto di vista clinico mentre
sul punto 3 e 4 possiamo agire di pi. Quindi da un punto di vista clinica la sindrome dell' ipersensibilit
immediata dipende da tre fattori:
quantit delle Ig E presenti
via di introduzione dell' antigene
dose

Se l'antigene sistemico e quindi diffuso in tutto l'organismo l'anafilassi ( questo fenomeno di


ipersensibilit) molto grave e prende le sembianze dell'anafilassi sistemica (definita da Portier e Richet:
ana= contro filassi= protezione).
Se l'antigene introdotto localmente allora si determinano fenomeni di allergia e prendono caratteristica di
edemi , riniti, asma, orticaria.
Gli allergeni non sono solo il polline, ma anche feci di acari, veleni di insetto o anche farmaci tipo penicillina.

Che effetti abbiamo quando queste sostanze vengono introdotte?

a livello dell' apparato digerente la degranualzione determina vomito, stimolo peristalsi, secrezione
gastrica. Si ha eliminazione contenuto dellapparato digerente e fenomeni di orticaria;
a livello apparato respiratorio ho aumento di secrezione, diminuizione del diamentro dei bronchioli,
tosse --> asma, rinite.

Diagnosi finalizzata a conoscere la natura di questi allergeni attraverso test cutanei che durano circa 20
minuti. Oppure andare a valutare la presenza di IgE specidiche per un determinato antigene: test immuno
enzimanico per misurare contenuto IgE specifiche per quel antigene.

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La terapia consiste nellabolire l'esposizione all'antigene, e anche desensibilizzare l'individuo trattandolo
con dose sempre pi alte di allergene e questo paralizza la risposta di linfociti B e T che diventano tolleranti.
Possiamo creare dei peptidi che legano e bloccano, antagonizzando il legame delle IgE con il recettore
specifico per la Fc delle IgE: si legano al posto delle IgE eabbiamo mastociti che non riescono a degranulare.
Oppure somministare localmente delle citochine (somministrando interferone o favorendo la risposta TH1)
spingiamo il sistema immunitario a fare una risposta pi Th1 che blocca e antagonizza la risposta TH2. Poi
esistono anticorpi monoclonali Omalizumab che blocca le IgE: somministrato come spry blocca le IgE e
dunque la risposta di ipersensibilit immediata.

Terapia sintomatica: abbiamo l'uso del Di Sodio cromoglicano che ha azione sullattivazione di mastociti e
basolifili e blocca il flusso di calcio che innescato dal cross linking. Oppure cortisone che blocca sintesi
citochine e mediatori infiammatori. Poi abbiamo antistaminici che bloccano il legame istamina con il suo
recettore e impediscono la sua azione oppure epinefrina che viene utilizzata per bloccare la muscolatora
liscia

Reazione di ipersensibilit di tipo II


E' mediata da anticorpi, sopratutto IgG. Determinano danni litici su cellule: alcuni antigeni possono essere
legati da IgG e questo legame determina effetti litici diretti, induce quindi perdita di cellule.. Se questi
anticorpi riconoscono antigeni su cellule possono ucciderle attraverso l 'azione del complemento, si forma il
complesso di attacco alla membrana che buca le cellule. Quindi abbiamo azione DIRETTA DEGLI ANTICORPI
che hanno riconosciuto antigene su superficie cellulare. Pi schematicamente:
danno mediato da anticorpi senza intervento di nessun altro fattore: azione diretta degli anticorpi.
poi abbiamo un altro tipo di danno dove gli anticorpi attivano il complemento e cos forma il
complesso di attacco alla membrana con lisi osmotica delle cellule che hanno legato il complemento:
citotossicit mediata dal complemento.
quando il complemento si fissa agli anticorpi e alla superficie cellulare sappiamo che leucociti
possiedono recettori per complemento. Qui si pu attivare l'azione dei granulociti che hanno recettori per il
complemento: scatena la granulazione di queste cellule e scaricano all' esterno le loro sostanze che possono
uccidere le cellule su cui si sono legati gli anticorpi su cui si fissato il complemento. Questa modalit
prende il nome di citotossicit cellulare dipendente dal complemento. Le cellule che hanno il recettore per
il complemento scaricano i granuli che contengono materiale che provoca lisi di queste cellule(CDCC). Sui
macrofagi, su granulociti e linfociti B esistono dei recettori per il complemento.
un altro tipo di tossicit sempre dipendente dal legame anticorpo-antigene mediata dai recettori
per Fc (presente per esempio in cellule NK). Queste cellule che hanno lantigene sono legate da anticorpi
IgG: poi le cellule con recettore Fc possono legarvisi (sono cellule citotossiche, killer o granulociti) e avviene
citotossicit mediata da recettori per Fc detta ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity).
Questo recettore un recettore a bassa affinit espresso in cellule NK (CD16) ma anche su macrofagi,
neutrofili e eosinofili. Quindi il legame tra le IgG (che hanno legato gli antigeni) e i recettori stimola le NK, i
macrofagi, gli eosinofili, i granulociti a scaricare all'esterno il contenuto dei granuli e distruggere le cellule
riconosciute dall'anticorpo.

Quindi queste risposte sono caratterizzate da danni litici alle cellule; in gran parte mediata da IgG ma nel
caso dei danni mediato solo da complemento possono essere mediati da IgM.

quadri patologici :
- molte malattie autoimmuni contro antigeni presenti in tessuti .Es:
Sindrome di Goodpasture che una gromerulo nefrite dove nei glomeruli renali abbiamo la deposizione di
anticorpi che determinano la lisi cellulare e cosi si ha nefrite;
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Trombocitopenia dove si hanno anticorpi contro piastrine con loro lisi e eliminazione: si ha difficolt di
coagulazione;
Febbre reumatiche dove si generano anticorpi contro parete dei streptococchi: abbiamo un mimetismo
molecolare perch questi antigeni sono molto simili agli antigeni presenti sul muscolo cardiaco. Quindi
questi anticorpi si depongono anche su muscolo cardiaco, portano all'attivazione del complemento lisi con
danni cardiaci;

- sono comuni quando ci sono trasfusioni di sangue

- reazione verso antigeni Rh dei globuli rossi (eristoblastosi fetale) dove la mamma che Rh negativa,
immunizzata in una precedente gravidanza, produce anticorpi contro il feto Rh positivo: lisi eritrociti fetali;

- caratteristico del quadro del rigetto iperacuto dei trapianti: dovuto al fatto che gli anticorpi preesistenti del
ricevente reagiscono contro il tessuto ricevuto.

Reazione di ipersensibilit di tipo III


Determinata da anticorpi ma pi precisamente da immuncomplessi. Durante la risposta immunitaria
l'antigene pu complessarsi con l'anticorpo e questo forma reticolati che possono essere insolubili! Quindi
si determina sempre una produzione cronica di bassa quantit di anticorpi che si complessa con l'antigene
(abbiamo visto che c' una curva di precipitati che dipende dalla concentrazione di anticorpo e antigene;
importante che lanticorpo sia bivalente). Inizialmente quando c' molto antigene e poco anticorpo non si
formano gli immunocomplessi, ma si arriva a una situazione di equilibro dove si formano gli
immunocomplessi, e poi quando gli anticorpi aumentano di concentrazione la curva scende. Per cui in
condizioni in cui abbiamo infezioni persistenti che non si risolvono, croniche, fenomeni autoimmunitari
(anche qui abbiamo una continua produzione di Ig perch si ha una risposta contro auto antigeni),
situazione in cui c' inalazione ripetuta di sostanze provenienti dall'esterno, noi abbiamo produzione
continua di basse concentrazioni di anticorpo che portano a formazione di immunocomplessi. Quindi questi
immunocomplessi sono nel circolo ma quando diventano grossi a livello dei capillari non riescono pi a
passare e si concentrano qui e si ha la vasculite, fenomeno infiammatorio dovuto alla deposizione di questi
immunocomplessi che non riescono pi a essere eliminati. Quando l'esposizione all'antigene costante
abbiamo una situazione di questo genere con formazione di questo aggregato che precipita e determina
danno tissutale.
Gli immunocomplessi normalmente vengono eliminati dai globuli rossi perch essi possiedono il recettore
per il complemento. Infatti negli immunocomplessi si pu depositare anche il complemento: il recettore
presente sui globuli rossi fa si che questo immunocomplesso possa essere trasferito nel fegato e nella milza
per poi essere fagocitatato dai fagociti. Quindi anche gli stessi fagociti possono partecipare all'eliminazione
di questi immunocomplessi perch anche loro hanno il recettore per il complemento e gli stessi recettori
per i frammenti cristalizzabili delle immunoglobuline.

Possiamo avere vari quadri patologici quando siamo in presenza di grande quantit di antigene. Possiamo
avere questa formazione di immunocomplessi quando abbiamo infezioni persistenti croniche che
determinano mancata produzione dell'antigene e quindi la produzione di alte concentrazioni di anticorpo.
Oppure un quadro patologico del lupus eritematoso sistemico che una malattia autoimmunitaria dove
vengono prodotti anticorpi contro il Dna dei globuli rossi, si formano immunocomplessi contro antigeni che
non possono venir eliminati e quindi questi determinano danni alle cellule e agli organi. E' determinata dal
fatto che i reticolociti durante il loro differenziamento verso i globuli rossi perdono il Dna e allora
quest'ultimo considerato un antigene: questi anticorpi vengono prodotti contro il Dna (questo non pu
venire smaltito) che persiste e si formano questi complessi antigene-anticorpo che si depositano su cute
(formando edemi , o a livello di vari organi bloccando il loro funzionamento.

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Immunologia - Lezione 16 - 07.05.13- Novelli

Durante la deposizione dei immunocomplessi viene scatenata una risposta infiammatoria: soprattutto
quando si attiva il complemento abbiamo visto che si generano dei frammenti C5a C3a C4a che hanno
capacit proinfiiammatoria perch sono delle vere e proprie chemochine che reclutano fagociti nel punto
dove si sono formati immunocomplessi. Quindi quando abbiamo formazione e precipitazione di
immunocomplessi abbiamo anche attivit chemiotattica mediata dai frammenti del complemento: quindi
abbiamo un aumento dell'attivit PROinfiammatoria. Naturalmente le cellule reclutate hanno recettori per
Fc di IgG e vengono attivate da questo legame. Chi coinvolto da questi fenomeni? I monociti, neutrofili,
mastociti tissutali: queste cellule iniziano a produrre chemochine e fattori chemotattitici che sostengono il
quadro infiammatorio .
Quindi si crea situazione complessa, quando gli immunocomplessi sono legati a fattori del complemento si
ha:

- danno tissutale dovuto a deposizione;

- formazione dei frammenti C3a C4a C5a che determinano la chemiotassi: questa recluta cellule
infiammatorie;

- queste cellule infiammatorie sono stimolate e iniziano a produrre citochine proinfiammatorie che
attivano piastrine e si ha il fenomeno della coagulazione che determina dei MICROTROMBI;

- vengono reclutati neutrofili e granulociti nel punto in cui si sono formati immunocomplessi e si
predispongono a fagocitare ma non riescono a fagocitare perch non ci sono dei microorganismi da
mangiare e si crea un quadro di fagocitosi frustatata: rilasciano il contenuto dei loro granuli all' esterno e
cos si ha danno tissutale ;

- parallelamente il quadro infiammatorio porta all'aumento della vascolarizzazione, fuoriescono non solo le
cellule ma anche le immunoglobuline e questo determina un ulteriore deposizione di immunocomplessi.

Questo quadro si autosostiene, abbiamo un circolo continuo di deposizione di immunocomplessi e


attivazione dei meccanismi infiammatori e questo porta a dei danni molto gravi sia a livello dei reni sia a
livello di articolazioni.

Reazione di ipersensibilit di tipo IV


Danno fatto dai linfociti T e viene detta ipersensibilit di tipo ritardato (si verifica tra 48-72 h
dall'esposizione all'antigene). Detta anche DTH (DELETED TIGHT HYPERSENSITIVITY).

Questi linfociti sono comunque responsabili di ipersensibilit chiamata da contatto;

Un altro tipo di questa ipersensibilit la reazione alla tubercolina. Quando un individuo


sensibilizzato che ha incontrato il micobatterio della tubercolosi, si fa un inoculo intradermico di una
proteina del micobatterio della tubercolosi, dopo 48-72h si verifica la classica reazione infiammatoria nei
confronti della tubercolina (dovuta al fatto che i linfociti T reagiscono contro questa proteina, producono
citochine e chemochine che reclutano leucociti nel punto in cui avvenuto l' inoculo della proteina e cos si
determina edema e reazione infiammatoria tipica);

Un altro tipo la reazione granulomatosa. Reazione che si verifica durante esposizione a


determinate infezioni come il micobatterio della tubercolosi. Nel linfonodo, nel polmone, nel fegato si

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Immunologia - Lezione 16 - 07.05.13- Novelli
determina un aggregato di cellule T e macrofagiche che hanno fagocitato il microbo che forma il granuloma:
questa reazione finalizzata ad impedire al microbo fagocitato di disperdersi e di diffondersi nell' organismo
attraverso il circolo sanguigno ;

Reazioni di ipersensibilit al Nichel: creano risposte T dipendenti di tipo ritardato .

Pazienti che si sono ammalati di tubercolosi o che si sono vaccinati verso il micobatterio hanno una
ipersensibilit ritardata all'antigene della tubercolina. In generale tutte le malattie caratterizzate da un forte
infiltrato linfocitario hanno un quadro di risposta simile a quello caratteristico dell'ipersensibilit ritardata.
Quindi molte malattie come la tubercolosi, la lebbra,infezioni da listeria, funghi, vermi danno un quadro di
ipersensibilita ritardata. Ci pu anche essere una risposta di tipo ritardato alla penicillina, lo stesso rigetto
acuto dei trapianti caratterizzato da questa risposta, alcuni malattie autoimmuni caratterizzate da un forte
infiltrato linfocitario come il diabete mellito autoimmune (nel tipo 1 si ha infiltrazione dei linfociti T nei
confronti delle cellule beta del pancreas con distruzioni delle cellule che producono insulina). Alcuni modelli
sperimentali di encefalite allergica in cui si determina la reazione di linfociti T nei confronti delle cellule del
SNC prendono le caratteristiche dell' ipersensibilit di tipo ritardata.

Quindi l' ipersensibilit alla tubercolosi un quadro in cui abbiamo una prima fase detta afferente in cui
l'individuo viene sensibilizzato: il microorganismo penetra, abbiamo l'infezione e formazione del granuloma.
Mentre nella vaccinazione non si genera un granuloma, in entrambi i casi si genera dei linfociti T della
memoria che circolano nei lifonodi e nel circolo. La formazione del granuloma fondamentale per eliminare
il micobatterio e impedisce la sua dispersione nel circolo sanguigno. Quindi abbiamo attivazione macrofagi
che iniziano a produrre citochine proinfiammatorie che attivano altri macrofagi che favoriscono la
formazione del granuloma.

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Immunologia - Lezione n17 10.05.13 Novelli

IPERSENSIBILITA di TIPO RITARDATO (continua da lezione precedente)

Per quanto riguarda lipersensibilit alla tubercolina si era visto che, innanzitutto, questa ipersensibilit
prevede un primo processo di sensibilizzazione che avviene quando un micobatterio penetra
nellorganismo infettandolo, oppure quando un individuo viene vaccinato con il micobatterio e si genera
tutta una serie di reazioni che coinvolgono linfociti T, ovvero si formano linfociti T della memoria che vanno
in circolo. Per quanto riguarda linfezione naturale, si ha la formazione di una tipica struttura chiamata
GRANULOMA, finalizzata alleliminazione del micobatterio. Nel circolo degli individui sensibilizzati ci sono
delle cellule T della memoria che sono specifiche per antigeni della tubercolina. Il micobatterio, per
scatenare una risposta immunitaria, viene riconosciuto dai recettori TCR (Toll-like receptor) di tipo II,
generando una risposta infiammatoria da parte delle cellule dellimmunit innata, che porta a produzione
di citochine infiammatorie, TNF-, IFN-. Le citochine e soprattutto linterferone sono essenziali affinch
si formi il granuloma, struttura tipica che si pu determinare nel punto in cui avvengono le infezioni (ad
esempio nel fegato, nel linfonodo, nel polmone o altri organi), in cui i macrofagi che hanno fagocitato il
micobatterio si organizzano al centro, circondati dai linfociti T che producono citochine infiammatorie. Il
granuloma finalizzato alleliminazione del micobatterio in quel punto specifico, da parte dei macrofagi e
quindi impedire la diffusione del batterio per via sistemica. Vi sono individui che, presentando mutazioni a
carico dei recettori per linterferone o per le citochine (es. IL-12), nascono senza capacit di trasmettere il
segnale dell IFN-, o di riceverlo, e quindi sono incapaci di formare il granuloma, diventando molto sensibili
allinfezione da parte di micobatteri. In questi casi linfezione diventa gravissima perch, non potendosi
formare il granuloma, il batterio va in circolo, portando gravi infezioni che spesso colpiscono il sistema
nervoso centrale e portano a morte questi individui.
Ci che avviene quindi : riconoscimento del micobatterio da parte dei TLR a livello dei macrofagi, che
producono citochine pro-infiammatorie e attivano a loro volta altri macrofagi che producono TNF, IL-12 e
potenziano lazione dei linfociti Th1 e delle cellule NK, che di seguito potenziano ancora di pi i macrofagi
(tramite produzione di citochine). In sostanza si crea un circuito di attivazione in cui il macrofago attivato
collabora con i linfociti Th1 e le cellule NK per amplificare la sua stessa attivazione. I macrofagi attivati
attivano gli enzimi del burst respiratorio, producendo H2O2 e NO ed eliminando i batteri che si trovano nel
citoplasma o nei vacuoli di fagocitosi.

LINFOCITI Th1
La reazione di ipersensibilit ad effetto ritardato vede quindi coinvolti i linfociti Th1, gi visti poich
caratterizzati dalla presenza del recettore per l IFN- e dal recettore per lIL-12. Questi sono dei grandi
produttori di interferone, di citochine, di fattori che stimolano le colonie dei granulociti macrofagi e di IL-2.
Attivandosi, sono in grado di produrre citochine e favorire lattivazione e la differenziazione dei linfociti T
citotossici (ad esempio in caso di infezione virale). Hanno, come visto prima, capacit di attivare anche
macrofagi tramite linterferone , aumentando la capacit di eliminare i patogeni intracellulari. Sempre
tramite linterferone sono in grado di modificare latteggiamento delle cellule endoteliali, aumentando
ladesivit e di conseguenza la marginazione dei granulociti che devono andare nel punto in cui presente il
patogeno. In generale mediano tutti fenomeni legati alla resistenza di patogeni endocellulari, come i
micobatteri che possono provocare la lebbra, la tubercolosi oppure alcuni parassiti come la Leishmania, che
penetrano nelle cellule e proliferano allinterno; per eliminare questi patogeni necessario eliminare le
cellule che hanno fagocitato il batterio e questo avviene essenzialmente grazie all IFN-, prodotto appunto
dai linfociti Th1.

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Immunologia - Lezione n17 10.05.13 Novelli
La produzione di interferone favorisce inoltre la maturazione delle cellule NK, che sono in grado di attivarsi
e uccidere maggiormente bersagli infettati da virus, quindi sono anche queste responsabili
dellipersensibilit ritardata.

GRANULOMA
gi stato detto che il granuloma una struttura importante che si determina quando si viene infettati, ad
esempio, da micobatteri. Ha una struttura tipica, osservabile al microscopio ottico (oppure tramite biopsia
in un paziente che stato infettato), caratterizzata dalla presenza al suo interno di cellule epitelioidi
caratterizzate da un abbondante citoplasma, che sono di fatto dei macrofagi tissutali che in alcuni casi
diventano, fondendosi tra loro, cellule multinucleate (cellule multinucleate di Langhans). Il micobatterio
fagocitato si trova allinterno di queste cellule multinucleate. Lantigene quindi presente e stimola
continuamente queste cellule ad esercitare la fagocitosi e ad uccidere i micobatteri fagocitati. Ci avviene
in cooperazione con i linfociti che sono presenti nel granuloma e con altri granulociti. Il linfociti in questione
sono i linfociti T, che riconoscono lantigene, producono linterferone che in grado di attivare queste
cellule epitelioidi per leliminazione del batterio.
Quando manca questa struttura, a causa di un difetto di trasmissione del segnale dellIFN- o per bassi
livelli di IL-12, si ha un aumento della suscettibilit: i pazienti si infettano con il micobatterio, non si forma il
granuloma e di conseguenza il batterio entra in circolo e pu raggiungere vari organi, ad esempio il SNC, in
cui pu dare origine a delle meningiti spesso letali.
Affinch il granuloma si formi occorrono dalle 48 alle 72 h, al fine di ottenere una reazione di ipersensibilit
ritardata.
importante ricordare che da quando stato scoperto, allinizio degli anni 90, che la base della
suscettibilit ereditaria al micobatterio della tubercolosi era dovuta ad alterazioni del gene dellIFN- e del
suo recettore + IL-12 e il suo recettore, stato chiaro che queste due citochine sono fondamentali per
attivare i macrofagi e permettere loro di eliminare il micobatterio della tubercolosi. Quando questi sistemi
non funzionano, lindividuo risulta suscettibile allinfezione del M. tubercolosis ma anche di altri micobatteri
ambientali che normalmente non sono patogeni ma lo diventano in soggetti suscettibili. Il motivo proprio
lincapacit di formare il granuloma.

REAZIONE ALLA TUBERCOLINA


Laltro esempio classico dellipersensibilit ritardata la reazione alla tubercolina. Negli individui
sensibilizzati, che hanno incontrato il micobatterio, se viene fatta uniniezione intradermica di una proteina
derivata dal Mycobacterium tubercolosis, a livello di cute si scatena una reazione alla tubercolina, tipica
appunto di una ipersensibilit di tipo ritardato. Questa reazione dovuta al fatto che la tubercolina
intradermica captata dalle cellule di Langherans, che sono cellule dendritiche immature con elevatissima
capacit di fagocitare. Queste cellule, una volta captata la tubercolina, vanno nel linfonodo drenante e
presentano alle cellule T della memoria lantigene. Le cellule T della memoria, che sono gi state
sensibilizzate dalla tubercolina, si attivano e determinano una reazione a livello del punto di inoculo della
tubercolina intradermica, che basata sul fatto che vengono prodotte delle citochine che determinano la
formazione di un infiltrato cellulare. Questo si forma perch a livello del punto di inoculo si sviluppa un
arrossamento della cute causato da una variazione dellattivit dellendotelio, con fuoriuscita di acqua,
formazione di edema e richiamo di granulociti che fuoriescono dai vasi (endotelio attivato), raggiungendo il
punto in cui stimolato un infiltrato di linfociti CD8 e CD4, i quali a loro volta attivano i macrofagi.
Successivamente si ha, tramite questi macrofagi attivati, un fenomeno di fibrosi che porta lentamente alla
scomparsa delledema. Tutto questo avviene nel giro di pochi giorni, ma la reazione di ipersensibilit di tipo
ritardato si svolge nel giro di 48-72 ore da quando stato introdotto lantigene.

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In questo fenomeno hanno un ruolo molto importante anche le chemochine, prodotte dai linfociti T della
memoria, che reclutano i granulociti e altre cellule responsabili della reazione infiammatoria.

LA TOLLERANZA
La tolleranza un punto importante nellimmunologia, gi incontrato e definito nel discorso sulla
maturazione timica dove si determina la tolleranza centrale, con cui i linfociti vengono educati a non
reagire contro il self. Naturalmente esiste una tolleranza periferica, poich alcuni linfociti T si sottraggono
alla tolleranza centrale (ad esempio alcuno antigeni tissutali non vengono visti a livello timico) e quindi si
possono generare dei linfociti autoreattivi. Esistono quindi dei meccanismi per indurre la tolleranza anche
in questi linfociti.
Le risposte immunitarie specifiche sono basate sul fatto che viene generato casualmente un vastissimo
repertorio di recettori per lantigene, sia di tipo T che di tipo B. viene usato quindi un meccanismo di
casualit per generare i recettori in modo da cercare di prevedere ci che non riesce a prevedere.
Non esiste una definizione precisa di tolleranza, ma si pu affermare che sia un po il buco nero del
repertorio delle specificit e delle immunoglobuline, ovvero quello che non siamo in grado di riconoscere
nel nostro repertorio. Tutto quello che non si riesce a riconoscere attraverso la generazione casuale dei
recettori, determina tolleranza: quando si incontrano antigeni che non siamo in grado di riconoscere,
diventiamo tolleranti e la risposta immunitaria non scatta.
Il self (quindi i nostri antigeni e proteine) creato da eventi genetici perch sono i geni, che codificano per
le nostre proteine, che determinano quello che il self. Il self viene imparato dal Sistema Immunitario:
durante lo sviluppo il SI riconosce quello che self e quindi impara ad essere tollerante.
Non esiste per definizione quello che self e quello che non self dal punto di vista GENETICO, quindi non
possiamo prevedere quello che non nostro. Di conseguenza, la definizione di tolleranza dovuta al
fatto che durante la maturazione esiste una casualit nella generazione del repertorio di recettori che
prevedono quello che noi non conosciamo. Se ci sono dei buchi neri, allora abbiamo tolleranza.
Dal punto di vista pratico vi sono diverse modalit di tolleranza; i linfociti B e T diventano tolleranti
attraverso meccanismi un pochino differenti.

TOLLERANZA DEI LINFOCITI T


Tutte le informazioni riguardo la tolleranza dei linfociti T sono arrivate a met degli anni 50, perch
venivano studiati attentamente i trapianti di cute, a causa del fatto che, al termine della guerra, vi erano
moltissimi casi di ustioni nei soldati e il governo americano stanzi milioni di dollari per poter fare trapianti
di cute. Questi trapianti hanno portato anche alla definizione di tolleranza neonatale.
La prima osservazione di tolleranza dei linfociti T fu fatta da un veterinario, il dottor Owen, che
aveva studiato gemelli dizigoti di vitellini Freemartin. I gemelli erano distinti da un punto di vista
genetico ma, in realt, condividevano la placenta e il loro circolo era in comune. il dottore osserv
che questi vitellini, avendo in comune la circolazioni, erano tolleranti luno con laltro. Fu la prima
evidenza che in qualche maniera si impara a essere tolleranti durante la gravidanza, lo sviluppo.
Nel 1945 si dimostr che la tolleranza verso il self viene imparata dal nostro organismo. Se si
prendono animali con una deficienza genetica per C5 (componente 5 del complemento) e poi si
immunizzano con il complemento, questi formano anticorpi contro il complemento stesso. Questo
significa che hanno perso la capacit di essere tolleranti contro il self.
Nel 1950 iniziarono i trapianti di cute e divenne chiaro il fenomeno della tolleranza neonatale. Se si
prendono due topolini neonati di diverso ceppo e si effettuano trapianti di cute su questi topolini, il
tessuto attecchisce, poich subito dopo la nascita non sono ancora in grado di effettuare una

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risposta immunitaria (il SI non ancora particolarmente sviluppato quindi si osserva tolleranza
maggiore subito dopo la nascita).
Attraverso la tecnologia del DNA ricombinante vennero costruiti in laboratorio i cosiddetti topi
transgenici. Sono stati fatti topi transgenici con lo stesso recettore per i linfociti T quindi stesse Ig
trasdotte. stata quindi bloccata lespressione degli altri geni per il TCR, per esclusione allelica.
Attraverso la tecnologia del DNA ricombinante si in grado di costruire topi con il 99% di TCR tutti
uguali, perch si blocca il riarrangiamento. Su questi topolini sono stati fatti esperimenti per
indurre tolleranza, dimostrando ancora una volta che la tolleranza viene imparata durante lo
sviluppo. (Il prof non spiega come si sia dimostrato)

Esiste una tolleranza centrale e una tolleranza periferica. I meccanismi di tolleranza periferica dei linfociti T
sono:
1. La tolleranza periferica dei linfociti T avviene, per esempio, attraverso fenomeni di ANERGIA.
Quando i linfociti immaturi, a livello neonatale, interagiscono con cellule dendritiche che hanno
un assetto tollerogenico (immature, che non possiedono le molecole di co-stimolazione) si
innesca un segnale di anergia, che consiste nel fatto che la loro capacit di attivarsi viene
bloccata per alcuni giorni, o anche alcuni mesi. Questo un meccanismo tramite cui i linfociti
immaturi riconoscono degli antigeni self presentati dalle cellule dendritiche, che vengono per
tollerati.
2. Un secondo meccanismo per linduzione di tolleranza nei linfociti T quello del suicidio
apoptotico degli stessi linfociti. Se le cellule T, in periferia, riconoscono antigeni presentati da
cellule dendritiche che sono in grado di attivarli, questi vengono attivati ma muoiono per
apoptosi (attraverso il meccanismo FAS-FAS LIGANDO). Individui con problemi al sistema Fas-Fas
L soffrono di malattie linfo-proliferative, in cui aumenta moltissimo il numero dei linfociti in
circolo; hanno delle sindromi tipo quella del Lupus eritematoso sistemico, con produzione di
anticorpi e formazione di immunocomplessi che si depositano poich la loro proliferazione non
controllata dal sistema Fas-Fas L. Un linfocita killer pu essere attivato da un antigene ed
esprimere sulla superficie cellulare tutta una serie di recettori che mediano la morte apoptotica:
FAS, TRAIL (recettore della stessa famiglia del TNF), TNF e FAS LIGANDO. Un linfocita T killer,
differenziato in effettore o cellula della memoria, che ha un recettore per il TCR pu avere
diverse molecole che scatenano lapoptosi se stimolate. Quando il recettore T killer reagisce
contro il self, la cellula che presenta lantigene stimola questi recettori : FAS tocca il FAS L, TRAIL
tocca il recettore di TRAIL, TNF tocca il recettore TNF, inoltre anche lATP pu mediare fenomeni
di morte cellulare programmata, legandosi a diversi recettori. In realt, normalmente il linfocita T
uccide le cellule bersaglio ma, quando si attivano molto queste cellule, i linfociti attivati possono
venire a contatto tra di loro. A questo punto il linfocita T attivato pu: interagire con lo stesso
FAS L della stessa cellula, quindi subire un segnale di morte cellulare AUTOCRINO, oppure avere
unazione FRATRICIDA: quando i linfociti attivati reagiscono contro un antigene, questi linfociti
fratelli si toccano tra di loro (poich uno esprime FAS e laltro esprime FAS L), provocando la
morte del linfocita che esprime FAS. Quindi FAS molto importante perch migrando sui raft
lipidici determina un meccanismo di apoptosi cellulare. La mancanza di questi meccanismi causa
una mancata capacit nel mantenimento dellomeostasi del numero di linfociti attivati che
possono quindi iperproliferare, generando fenomeni di autoimmunit.
3. Ruolo dei T regolatori -> A livello timico, quando i linfociti che hanno prodotto un recettore ad
alta affinit per lHLA+PEPTIDE, questi possono andare incontro a diversi destini:
a. Suicidio per apoptosi
b. Attivazione del fattore trascrizionale FOX-P3 e trasformazione in un cellula T-reg

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c. Conversione in cellula NK
d. Rifare il TCR
I T-reg sono, insieme alle dendritiche tollerogeniche, quelli che permettono la tolleranza
periferica. Hanno unalta affinit per lantigene e quindi impediscono ai linfociti autoreattivi di
legare lantigene. Quello che avviene che quando una cellula dendritica matura, in un tessuto
linfoide secondario, esprime degli antigeni self, questi possono essere visti da linfociti killer o
linfociti Th autoreattivi, ma il linfocita T-reg inibisce la loro attivazione. Ci avviene perch i
linfociti T-reg competono con i TK e i Th e, avendo unaffinit pi alta, spiazzano gli altri linfociti
autoreattivi, legandosi allantigene. Questo meccanismo genera quindi una tolleranza, attraverso
il rilascio di citochine inibitorie rilasciate dai linfociti T-reg, soprattutto lIL-4 e lIL-10, che
spengono la reazione immunitaria bloccando la capacit delle cellule dendritiche di attivare i
linfociti T. Si blocca la fase effettrice delle cellule NK e dei Th, in modo simultaneo.
Questo meccanismo molto importante, come dimostrato dalle conseguenze di eventuali difetti
genetici che portano a difetti dellattivit T-regolatoria. In questi casi infatti si determinano
fenomeni di autoimmunit molto molto gravi. Ad esempio, in caso di difetti genetici dei fattori
trascrizionali di FOX-P3 si determina una malattia autoimmune molto grave in cui gli individui
soffrono contemporaneamente di moltissime autoimmunit in diversi organi; questo dovuto al
fatto che la mancanza di FOX-P3 impedisce ai linfociti T-regolatori di spegnere la reazione
immunitaria. Si ha un quadro di autoimmunit generalizzata, molto grave.
Moltissime malattie autoimmuni sono correlate ad una scarsa, o poco efficiente, attivit
regolatoria. Per esempio, andando a vedere il sangue periferico di molti pazienti che soffrono di
sclerosi multipla, si pu misurare, in laboratorio, la capacit dei T-reg di spegnere la risposta
immunitaria. Si fanno dei test in cui si prende il sangue dellindividuo, si separano i linfociti T e
ancora i linfociti T regolatori, in quanto questi hanno sulla loro superficie cellulare alti livelli del
recettore per lIL-2. Una volta separati i linfociti T-reg possiamo fare dei test attivando i linfociti T
di un individuo contro un antigene, in presenza di quantit crescenti di linfociti T-Reg. Quello che
si osserva che, mettendo elevate quantit di T-reg sui linfociti che devono rispondere allAg, si
blocca la risposta immunitaria. Se si prendono i linfociti del sangue periferico in individui affetti
da sclerosi multipla e si misura lattivit regolatoria, spesso si vede che questattivit diminuita
e molto pi deficitaria rispetto ad individui sani. Questo spiega come la mancata funzione di
queste cellule possa essere responsabile dellinsorgenza di malattie autoimmuni.

LIGNORANZA IMMUNITARIA
Molto importante, nel discorso sulla tolleranza, il concetto di ignoranza immunitaria. Noi abbiamo
peptidi self e non self che possono essere non tollerati perch ci sono linfociti T specifici che dovrebbero
riconoscerli ma, essendo espressi in talmente bassa quantit, non riescono ad attivare una risposta
immunitaria. Questi peptidi non tollerati non sono abbastanza espressi per poter reagire con un numero
critico di recettori per lantigene, richiesti per attivare un linfocita T. Immaginiamo di avere un peptide
teoricamente immunogeno ma che non scatena nessuna risposta immunitaria, perch espresso a livelli
troppo bassi: si genera una situazione di tolleranza definita, in questo caso, ignoranza immunitaria. C il
peptide immunogeno, c il TCR in grado di riconoscerlo ma, nonostante questo, non si scatena risposta
immunitaria perch la quantit di peptidi espressa sulla membrana cellulare troppo bassa. La quantit
insufficiente di peptide pu essere dovuto a:
Peptide poco espresso sulle tasche dellHLA, quindi generato in quantit basse.
Il peptide si lega male alle tasche dellHLA, non ha unaffinit particolarmente alta ed instabile.
La cellula stessa esprime poco HLA; avendo poche molecole di HLA, si hanno di conseguenza pochi
peptidi legati ad esse.

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Lattivazione sempre correlata ad un numero critico di interazione con i TCR per poter dar luogo alla
reazione; se questa interazione non avviene con un numero sufficiente di PEPTIDI-HLA, il linfocita non
raggiunge la soglia per poter scatenare la reazione.
Esistono 30.000 geni nel nostro DNA, che codificano per 100.000 proteine che, a loro volta, danno luogo a
30 milioni di peptidi. Vi sono 100.000 molecole di MHC per ogni cellula che devono stimolare circa 1000
TCR.
Ricordiamo che lignoranza un fatto dinamico e pu essere in qualche maniera superata: aumentando
lespressione del peptide o dellHLA. Questo avviene quando ad esempio abbiamo infezioni virali o
batteriche, abbiamo un up-regolazione dellMHC che pu quindi essere espresso di pi. Molte malattie
immunitarie insorgono dopo uninfezione virale o batterica, poich viene superata questa ignoranza
immunitaria dei peptidi self, che diventano allimprovviso presentanti e si scatena la risposta.
Riassunto dei punti precedenti:
La non risposta dei linfociti T agli antigeni self detta tolleranza. Questa pu avvenire attraverso due
modalit :
1. Tolleranza centrale, che prevede leliminazione di tutti i cloni autoreattivi attraverso apoptosi,
rielaborazione dei TCR e attivazione dei T-reg, eventi che avvengono nel timo. Qui si ha il
contatto dei linfociti T con gli antigeni self presentati, anche sotto lo stimolo di fattori
trascrizionali che fa aumentare lespressione ectopica di molti antigeni periferici nel timo.
2. Tolleranza periferica, in cui possiamo avere:
Anergia dei linfociti maturi. Durante il periodo neonatale i linfociti appena prodotti sono
ancora immaturi e non sono in grado di essere completamente attivati dalle cellule
dendritiche. Questi linfociti vengono anergizzati e la loro attivit viene sospesa per un
certo periodo (giorni o mesi).
Suicidio apoptotico, quando lantigene self viene riconosciuto si scatena una risposta
immunitaria con attivazione oligoclonale dei linfociti T attivati ma, attraverso un
meccanismo FAS-FAS L, questa viene spenta.
Soppressione dominante da parte dei T-Reg che, quando i linfociti T autoreattivi
riconoscono degli antigeni self, si attivano e riescono a bloccare la loro attivazione,
competendo per laffinit dellantigene nei confronti delle cellule dendritiche.
3. importante il fenomeno dellignoranza immunitaria, determinata dal fatto che lantigene
autoreattivo esiste e pu essere riconosciuto perch ci sono dei cloni in grado di vederlo ma, in
questo caso, non c attivazione perch sia il peptide che le molecole MHC sono espresse a livelli
troppo bassi.

TOLLERANZA DEI LINFOCITI B


I meccanismi dei linfociti B sono diversi: stanno nel midollo, non sono sottoposti alleducazione timica e
non vedono lantigene legato allMHC ma hanno il loro recettore e contattano antigeni self nellorganismo.
Per quanto riguarda la tolleranza centrale, il meccanismo che avviene quasi sempre che il linfocita viene
spinto a rifare il BCR.
Esistono tre meccanismi per la tolleranza:
Eliminazione clonale, spesso questo avviene quando c unelevata affinit dellantigene self per il
BCR, questo spinge il linfocita B allapoptosi.
Anergia, i linfociti B possono essere anergizzati dal contatto con gli antigeni self (paralisi funzionale
del linfocita B)
Rielaborazione del BCR. Spesso un linfocita che ha riarrangiato la catena pesante, si espande e
successivamente monta la catena leggera ma, se incontra un antigene self, viene spinto a rifare il
BCR, soprattutto a livello della catena leggera. Questo processo viene definito receptor editing.
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Circa un quarto dei linfociti B che circolano sono stati sottoposti al receptor editing. I linfociti B
sono sensibili ai segnali apoptotici. Se laffinit tra un antigene e il BCR diventa molto elevata, i
linfociti immaturi che esprimono la molecola B220 e le IgM in membrana, ma non ancora le IgD, ed
esprimono la molecola CD23 (in grado di farli interagire con le cellule follicolari dendritiche),
subiscono un segnale apoptotico e allora provano a riarrangiare il BCR, soprattutto la catena
leggera. Cercano quindi di generare una IgM che non sia troppo affine per questo antigene. Grazie
a questo meccanismo, un quarto dei nostri linfociti andato incontro a riarrangiamento
secondario, che stato indotto dal pericolo di andare in apoptosi.

AUTOIMMUIT
Argomento connesso con la tolleranza quello dellautoimmunit. Esiste un equilibro dinamico tra la
tolleranza e lautoimmunit; quando si diventa meno tolleranti verso il self si diventa pi propensi a
sviluppare delle autoimmunit di tipo patologico. Chiaramente bisogna considerare che esistono fattori che
controllano la tolleranza e fattori che controllano lautoimmunit. Per quanto riguarda i fattori che
regolano la tolleranza, vi uneducazione centrale e una periferica. Tutti questi meccanismi sono controllati
da fenomeni quali lignoranza dellantigene, la delezione clonale che elimina i cloni autoreattivi e paralisi
funzionale (anergia). Per evitare che venga persa la tolleranza vi sono sistemi di regolazione raffinati, di
soppressione della risposta attraverso le cellule T regolatorie. Molto importante, in quanto permette
linduzione della risposta contro il self, la mancanza di segnali di pericolo: risaputo che per indurre una
risposta immunitaria, spesso quello che aiuta sono segnali anti-TLR, attivabili da batteri ad esempio, che
scatenano segnali di pericolo. Spesso gli antigeni self sono contenuti nei tessuti, quindi non c
infiammazione e questa mancanza di pericolo non mette in condizioni, le cellule dendritiche che possono
presentare lAg self, di attivare i linfociti T. inoltre, la mancanza di segnali di pericolo, fa si che nel nostro
organismo vi sia una situazione di scarsa infiammazione, mancano le citochine pro-infiammatorie che
aiutano la maturazione delle cellule dendritiche, che quindi non sono ancora pronte per presentare
lantigene. Tutto questo quadro aiuta il mantenimento della tolleranza.
Lautoimmunit pu essere spinta dal fatto che, soprattutto per una parte della nostra esistenza, noi
abbiamo un continuo rinnovo degli antigeni self. Questo rinnovo continuo non si pu eliminare. Inoltre, nei
linfociti B, si possono indurre fenomeni di anergia che sono solo transitori, non sono definitivi, quindi il
linfocita B pu essere anergizzato nei confronti di un Ag self per alcuni mesi ma poi pu perdere questa
anergia e sar quindi in grado di scatenare una risposta immunitaria. Viviamo quindi in un equilibrio
dinamico tra fattori che favoriscono la tolleranza e altri fattori che, invece, permettono la risposta
immunitaria contro gli antigeni self.
Vi sono sostanzialmente due tipi di autoimmunit:
Autoimmunit sistemica, ovvero fenomeni che riguardano lattivazione del SI contro antigeni che
sono molto diffusi nellorganismo, oppure contro diversi antigeni simultaneamente. Un esempio di
malattia autoimmunitaria sistemica il Lupus eritematoso sistemico, in cui si scatena una reazione
di anticorpi contro il DNA nucleare che presente in tutto lorganismo.
Autoimmunit organo-specifica, in cui lautoimmunit diretta contro determinati organi che
esprimono determinati antigeni che scatenano i linfociti autoimmuni (ad esempio nel pancreas,
nella tiroide ecc..).
Parlando di autoimmunit ci si riferisce al fatto che vengono prodotti anticorpi o che vengono attivati dei
linfociti che sono in grado di reagire contro costituenti propri del nostro organismo (definizione operativa di
autoimmunit).
Lautoimmunit un fenomeno importantissimo, con conseguenze mediche e sociali. Dal punto di vista
economico stato calcolato, per esempio, che negli Stati Uniti lartrite reumatoide causa un danno di 1000

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miliardi di dollari allanno, dovuto allinvalidit al lavoro, cure mediche ecc.. Spesso si tratta di malattie
croniche, quindi i costi per la cura sono molto elevati.
Per linsorgenza delle malattie autoimmuni vi sono delle cause, meccanismi eziologici che causano la
malattia, poi vi sono anche meccanismi patogenetici, che spiegano come avviene il processo attraverso cui
insorgono le malattie.
Vi sono diverse cause ezologiche:
Aumentato rilascio di antigeni che normalmente sono tollerati, contemporaneamente alla
produzione di citochine pro-infiammatorie. Quindi si ha uninfiammazione nel contesto di un
aumentato aumento di antigeni potenzialmente autoreattivi.
Reattivit crociata tra Ag self e Ag estranei: alcuni antigeni self sono molto simili ad antigeni
estranei; pu succedere che venga attivata una risposta anticorpale contro un antigene estraneo
ma, in realt, questa risposta immunitaria si ritorce contro allorganismo perch comprende anche
gli antigeni self similari a quelli estranei selezionati per la risposta anticorpale. Esempio: alcune
persone hanno una risposta immunitaria nei confronti dello streptococco, producono anticorpi
contro antigeni del batterio che, per, sono molto simili ad alcune proteine cardiache; pu
succedere che questa risposta immunitaria si sposti a livello del miocardio, provocando danni alle
valvole cardiache.
Alterata espressione di antigeni ignorati, pu avvenire uninfezione virale che fa aumentare la
produzione di interferone, fa aumentare le molecole di MHC e questi antigeni, normalmente
ignorati, diventano improvvisamente visibili al SI.
Difetti di immunoregolazione, problemi a carico delle cellule regolatorie che permettono quindi la
reazione dei linfociti T autoreattivi.
Attivazione policlonale dei linfociti T, esistono alcune sostanze, ad esempio il LPS, che inducono
una risposta policlonale dei linfociti T. Alcune infezioni batteriche possono, attraverso il LPS,
scatenare unattivazione policlonale, quindi unespansione dei cloni dei linfociti T, alcuni dei quali
possono essere autoreattivi: ecco che questi cloni possono aggredire tessuti che presentano
antigeni self.

Si analizzeranno ora le cause in maniera approfondita.


1. AUMENTO DEL RILASCIO DI ANTIGENI NORMALMENTE TOLLERATI
Ad esempio, in uninfezione che determina un quadro infiammatorio con produzione di citochine,
gli antigeni del microorganismo o batterio, vengono rilasciati nei tessuti. I linfociti B, che
riconoscono questi antigeni, captano lAg attraverso il loro BCR e sono in grado di presentare gli
epitopi ai linfociti T che, quindi, si attivano.
Si ha dapprima un fenomeno di endocitosi, mediata dalle Ig, quindi si accumula lantigene,
attraverso il pumping-up dei linfociti B che concentrano questo antigene self che normalmente
poco concentrato. Lantigene pu essere presentato su molecole di MHC di classe II a linfociti che
normalmente sono ignoranti. Se si in presenza di citochine infiammatorie, questo crea il
presupposto per lattivazione del linfocita T, che si attiva e coopera con i linfociti B, determinando
linnesco di una risposta autoreattiva.

2. FENOMENO DELLA CROSS-REATTIVIT


Dovuto al fatto che si determina unautoreattivit crociata tra antigeni estranei e antigeni self.
Lesempio tipico quello della proteina basica della mielina bovina: quando noi inoculiamo, in
topolini, la proteina basica della mielina bovina, in questi topi si genera unencefalopatia allergica
sperimentale. Si induce una risposta autoimmune che pu determinare, ad esempio, la paralisi di
questi topolini. Nella stessa maniera, se noi inoculiamo la tireoglobulina di coniglio, nei topolini di
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laboratorio induciamo dei danni alla tiroide, con induzione di tiroidite. Questo accade perch
vengono stimolati dei linfociti Th nuovi, che mettono in condizione i linfociti autoreattivi di
scatenare una risposta (linfociti che normalmente non sono autoreattivi proprio perch non hanno
la collaborazione degli helper). Il meccanismo, in entrambi i casi, genera una reazione contro e
proteine dellorganismo ospite (cross-reazione). Abbiamo linfociti Th nuovi che vengono attivati,
usando dei carrier nuovi: nel primo esempio la proteina basica della mielina il carrier per dei
peptidi nuovi, che vengono riconosciuti dai linfociti Th e stimolano la risposta dei linfociti B del
topo.
Chiaramente lantigene deve essere cross-reagente, nel senso che deve essere presente in
entrambe le specie (ospite e fonte).
Esempio: abbiamo due parti diverse dellantigene. Una parte che cross-reagisce e una parte che
uguale a quella del self. Nella proteina basica della mielina bovina, una parte sar diversa e una
sar simile a quella del topo. Questo tipo di antigene scatena una risposta perch la cellula
presentante lAg, lega questo antigene e riconosce la parte diversa. Di conseguenza si attiva e
avviene endocitosi, quindi contro la parte diversa si attivano nuovi linfociti Th. Questi ultimi, a loro
volta producono citochine e sono in grado di stimolare la produzione di anticorpi contro il
determinante antigenico che NON riconosciuto dai linfociti. Abbiamo quindi due tipi di
determinanti antigenici: uno che non riconosciuto dai linfociti T e laltro che riconosciuto. La
parte diversa genera una risposta, visto come non-self; i linfociti Th che normalmente non
avevano mai collaborato per produrre anticorpi contro la parte diversa, ora si possono attivare. Il
linfocita T autoreattivo a questo punto in grado di essere stimolato a produrre degli anticorpi
contro il self. Il linfocita B riconosce lantigene ma non pu proseguire perch non ha il linfocita
helper che collabora. Pu farlo solo se c un cellula APC che presenta, al linfocita T , laltro
determinante antigenico, in modo da permettere poi lazione dei linfociti B.
Questo un meccanismo usato anche nella vaccinazione, in cui magari non riusciamo a fare
anticorpi contro determinati antigeni e allora sfruttiamo il fatto di mescolare lantigene con degli
altri determinanti helper che possono attivare i linfociti T ed innescare la risposta immunitaria.
Questo pu succedere anche in situazioni di autoimmunit, in cui il linfocita B autoreattivo
quiescente perch non pu attivarsi, ma se trova un linfocita Th che lo attiva, questo si mette a fare
anticorpi.

3. ALTERATA ESPRESSIONE DEGLI ANTIGENI NORMALMENTE IGNORATI.


A livello degli epiteli, le cellule presentano molecole MHC di tipo I con degli antigeni self che
normalmente sono ignorati dal nostro SI. Pu succedere che un virus infetti queste cellule epiteliali,
producendo una prima risposta di tipo innato, attraverso la produzione di interferone che viene
prodotto nella cellula infetta, rilasciato per proteggere le cellule vicine. Questa produzione a
seguito dellinfezione virale ha un effetto sul promotore dei geni delle molecole MHC, che vengono
cos trascritte in misura maggiore. Sulle cellule, dopo un po, ci sar quindi una maggior
concentrazione di molecole MHC che esprimono questo antigene. In questo modo, liper-
espressione dellantigene si avvera e questo stesso antigene, normalmente ignorato, diventa
visibile dai linfociti T. Il peptide presentato da una maggior espressione di molecole MHC diventa
visibile ai linfociti CD8 che, in presenza di citochine infiammatorie, possono differenziarsi in linfociti
citotossici, dando perci origine ad un meccanismo autoimmunitario.
In seguito ad infezione virale, le cellule morte possono far rilasciare lantigene self nellorganismo.
Cos, in seguito ai meccanismi di morte cellulare, gli antigeni precedentemente ignorati possono
essere captati dai linfociti B e macrofagi e, in seguito alla presenza di interferone, possono favorire
la presentazione su molecole MHC di classe II. Questi antigeni ora possono essere presentati da

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cellule APC, provocando lattivazione dei linfociti T CD4. La conseguenza che questi linfociti
CD4,rilasciando citochine, possono attivare una risposta infiammatoria che a sua volta pu portare
allattivazione dei linfociti T citotossici e linfociti B, che iniziano a produrre anticorpi contro
lantigene (sono AUTOANTICORPI).
In sostanza, a causa di un aumento di espressione degli Ag prima ignorati, si pu avere: da una
parte la generazione di risposte citotossiche autoreattive (per aumentata espressione) e dallaltra
lattivazione i linfociti Th e la generazione di autoanticorpi contro lo stesso antigene (per
processazione ed espressione dellAg sulle molecole MHC di tipo II).

4. DIFETTI DI IMMUNOREGOLAZIONE.
Occorre fare riferimento al concetto del NETWORK IDIOTIPO ANTI-IDIOTIPO. C stato un
ricercatore norvegese che, nella met degli anni 80 vinse il premio Nobel per lImmunologia perch
teorizz questo network. Tale meccanismo consiste nel fatto che ogni risposta immunitaria, in cui si
abbia la produzione di un anticorpo, genera di conseguenza una molecola nuova (lanticorpo
prodotto) e questo porta alla produzione di un altro anticorpo, che sar contro liniziale anticorpo
prodotto. Quello che ha ipotizzato il ricercatore che cera una grande produzione, un enorme
network, di anticorpi che riconoscevano altri anticorpi. Lidiotipo il sito di legame di un antigene,
quindi se noi generiamo un anticorpo che ha un determinato sito di legame per lantigene, si pu
generare un altro anticorpo contro quel sito. Per cui lanticorpo che si forma lanti-idiotipo. Se noi
generiamo un anticorpo anti-idiotipo, questo avr a sua volta un anticorpo ANTI-ANTIIDIOTIPO che
sar sostanzialmente uguale al primo anticorpo, quello iniziale (ovvero allidiotipo). Si crea tutto un
network che ha un suo equilibrio. Questo meccanismo utilizzato anche nelle vaccinazioni, per
esempio contro lHIV, molto pericoloso da inoculare. Per se in vitro si fa un anticorpo anti-idiotipo
e si usa per immunizzare lindividuo, come usare lantigene.
Questo stesso meccanismo pu, per, creare danno contro proteine importanti del nostro
organismo, ad esempio si possono generare anticorpi contro linsulina, limitandone lazione
reagendo sui recettori stimolandone lattivit. Questi, scatenando una reazione autoimmune,
possono interferire con funzioni biologiche molto importanti.
Questo network avviene sempre nel nostro organismo ed importante per limitare la risposta
immunitaria ma, se viene ALTERATO, pu portare allora ad unautoimmunit.
Ab 1 Ab 2 Ab 3

IDIOTIPO ANTI-IDIOTIPO ANTI-ANTIIDIOTIPO


[Lanti-antiidiotipo, per essere complementare allanti-idiotipo, uguale allidiotipo]

5. ATTIVAZIONE POLICLONALE DEI LINFOCITI.


Quando dei linfociti B anergici incontrano il LPS, questo pu espandere la produzione di linfociti
autoimmuni. Dopo un po noi possiamo trovare delle IgM che riconoscono il nostro DNA oppure
delle altre Ig o altre strutture e si ha il fenomeno del Lupus eritematoso sistemico. Anche il virus
EBV (Epstein-barr virus) un attivatore policlonale; un virus a DNA, agente eziologico della
mononucleosi infettiva ma anche responsabile della trasformazione di linfociti B e determina
molti linfomi (soprattutto in alcune particolari popolazioni). Molti linfociti B possono reagire nei
confronti dellEBV, con espansione contemporanea di molti linfociti autoreattivi. Questi anticorpi
sono, in genere, transitori, a bassa affinit e sono soprattutto di tipo IgM e questo pu determinare
lattivazione dei linfociti.

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Un altro meccanismo, che pu agire sui linfociti T, che esistono degli antigeni definiti SUPER-
ANTIGENI, ovvero particolari antigeni che riconoscono le molecole MHC di classe II e attivano in
maniera policlonale i linfociti T. Alcuni esempi di super-antigeni possono essere varie tossine
batteriche (es. di Streptococco). Se noi veniamo stimolati da questi antigeni abbiamo una grande
espansione dei linfociti T, tra cui possono esserci linfociti autoreattivi che attaccano i tessuti, quindi
pu insorgere una risposta autoreattiva.

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Immunologia lezione n18 14.05.13 - Novelli

PATOGENESI DELLAUTOIMMUNIT
Alcuni malattie autoimmuni si possono verificare a causa di:
Uccisione di cellule che esprimono un antigene self contro cui viene generato un anticorpo,
attraverso lattivazione del complemento (meccanismo gi visto nell ipersensibilit di tipo II).
Esempio tipico di questo genere di meccanismo la lisi dei globuli rossi, che si risolve in una
malattia chiamata emoglobinuria parossistica notturna, nella quale si ha una diminuzione dei
globuli rossi dovuta alla loro eliminazione da parte degli anticorpi che hanno riconosciuto gli
antigeni self e hanno attivato il complemento.
Fagocitosi di cellule che siano state opsonizzate da anticorpi. Per esempio le piastrine possono
esprimere antigeni self che sono degli auto-anticorpi, possono essere riconosciute e ricoperte da
anticorpi che poi vengono legati da recettori FC degli anticorpi presenti sui fagociti. La fagocitosi
determina la riduzione di piastrine con determinazione di un quadro patologico definito
trombocitopenia autoimmune.
Riconoscimento su alcune cellule di auto-antigeni (antigeni self) che funzionano da recettori, come
nel caso della miastenia grave. Questa una malattia che determina limpossibilit dei muscoli di
contrarsi poich i recettori per lAch vengono bloccati da autoanticorpi: nel muscolo abbiamo sulla
superficie cellulare la presenza di recettori nicotinici dellAch, il neurone connesso con il muscolo
rilascia Ach e questa attiva il recettore determinando la contrazione. E possibile che questi recettori
funzionino come auto-anticorpi, bloccando questo recettore. Il risultato che il legame anticorpo-
recettore determina lendocitosi del recettore che quindi scompare dalla superficie cellulare. Lach
rilasciata dai neuroni a questo punto non pu pi interagire col recettore e non esercita pi il suo
effetto.
Stimolazione dei recettori da parte degli anticorpi, come nel morbo di Graves: le cellule della tiroide
che esprimono il recettore per lormone TSH (che stimola la tiroide) possono essere bersaglio di
autoanticorpi che in questo caso hanno funzione di stimolazione (agonisti). Gli anticorpi legano il
recettore e funzionano come se fossero degli ormoni, quindi stimolano la trasmissione del segnale
allinterno delle cellule tiroidee: questo determina una secrezione di ormoni tiroidei con un quadro
conseguente di ipertiroidismo.
Immunocomplessi, che possono determinare quadri patologici che vanno sotto il nome di lupus
eritematoso sistemico, malattia autoimmune chiamata cos perch esordisce con un tipico edema a
forma di farfalla sul viso, che gli antichi chiamavano lupus. Le sue complicanze pi gravi sono date
dagli immunocomplessi che si formano in seguito alla reaziona antigeneanticorpo, entrano in
circolo e quando arrivano a livello dei capillari, poich sono molto grandi, non riescono pi a
passare, si depositano a livello dei vasi, delle membrane basali e nelle giunzioni dermo-epidermiche:
precipitando in forma solubile sono responsabili di danni funzionali piuttosto seri legati
all'infiammazione con attivazione del complemento e alla generazione di frammenti C3A, C4A, C5A,
con funzione chemotattica; questo richiama i granulociti, che arrivano nel punto in cui si
depositato limmunocomplesso, cercano di fagocitarlo, avviene la fagocitosi frustrata, rilasciano il
contenuto dei loro granuli nel citoplasma determinando un danno ai tessuti. Si delinea un quadro
patologico piuttosto grave e cronico, perch lautoantigene non viene eliminato.
Linfociti T autoreattivi che possono riconoscere autoanticorpi, che possono essere espressi dalle
cellule determinando: infezione se sono T helper, morte se sono citotossici. In genere un ruolo
molto importante lo hanno i T helper, attraverso la produzione di citochine. Abbiamo quindi un
quadro molto numeroso di malattie mediato dai linfociti T:
o Artrite reumatoide: i linfociti T attaccano i linfociti della sinovia, le giunzioni si gonfiano, si
ha la distruzione della cartilagine e tutta una serie di complicazioni mediche piuttosto
importanti. Lautoimmunit tende a non risolversi perch lantigene sempre presente.
o Sclerosi multipla: i nostri neuroni sono ricoperti dalla guaina mielinica che contiene tutta
una serie di sostanze tra cui le lipoproteine che possono diventare bersaglio dei linfociti T a
livello del sistema nervoso centrale. Questo tipo di attacco fa s che alcuni linfociti di tipo
reattivo (in genere tipo TH1 e TH17) riescano a rompere la barriera ematoencefalica e a
passare nel SNC dove attaccano i neuroni determinando placche nel cervello responsabili di

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disfunzioni di vario tipo a livello motorio, a livello di parola, ecc...
o Encefalite autoimmune: ha un quadro patologico analogo alla sclerosi multipla. Riguarda
soprattutto modelli sperimentali come nel topolino dove si pu indurre encefalite
autoimmune con un quadro simile alla sclerosi multipla (modello murino per la sclerosi) e
usarla per studiare i meccanismi legati a questa patologia. Anche qui possiamo generare
una risposta di linfociti T contro le proteine della mielina.
o Diabete mellito insulino-dipendente (tipo 1): una delle pi importanti patologie
autoimmuni mediate dai linfociti T; determinato da auto-anticorpi che riconoscono
proteine delle isole beta del pancreas, determinandone laggressione da parte dei linfociti T
che infiltrano il pancreas. Vengono distrutte le cellule e si ha lincapacit di produrre
insulina. Il diabete di tipo 1 tipicamente autoimmune e lo distinguiamo da quello di tipo 2
insulino-indipendente che non ha cause di tipo autoimmune. Ha le sue basi nella mancanza
di insulina e causa alterazioni del metabolismo del glucoso, dovute al fatto che le cellule
Beta del pancreas sono distrutte dall infiltrazione dei linfociti T e al reclutamento di altre
cellule fagocitiche dovute al rilascio di citochine infiammatorie. La frequenza di questo
diabete 1/2000 persone ed caratterizzato dal fatto che attorno alle isole beta del
pancreas si hanno infiltrati di linfociti CD4 e CD8; gli auto-antigeni determinano
lattivazione di entrambe le sottopopolazioni. Queste cellule Beta del pancreas presentano
un espressione anomala di MHC classe II (lespressione di MHC su classe seconda ristretta
sulle cellule che presentano lantigene) che si pu notare facendo sezione di pancreas e
colorandola con anticorpi diretti contro MHC II. E importante sottolineare come i linfociti T
che determinano il danno alle cellule Beta del pancreas risparmino invece sia le cellule Alfa
(che producono glucagone), che le cellule Gamma (che producono somatostatina); questo
perch l auto-antigene specifico selettivamente presente sulle cellule Beta. In virt del
fatto che i linfociti CD4 si attivano nei confronti di alcuni antigeni, pu succedere che
essendo espressa la classe seconda ed essendo attivati i linfociti CD4, alcune cellule
distrutte possano essere fagocitate da cellule dendritiche che presentano lantigene e
queste possano presentare lantigene ai linfociti CD4 che, producendo citochine
infiammatorie, possono aiutare i linfociti T a produrre auto-anticorpi nei confronti delle
cellule Beta. Quindi si possono avere 2 tipi di anticorpi che vengono prodotti: sia auto-
anticorpi contro cellule Beta, sia auto-anticorpi diretti contro i linfociti. Esistono
caratteristiche genetiche che predispongono al diabete di tipo 1: in alcune regioni italiane la
frequenza di diabete di tipo 1 maggiore che in altre; si pensa che circa il 50% delle cause
siano di tipo genetico e che l altro 50% delle cause sia di tipo ambientale. La suscettibilit al
diabete mellito determinata da numerosi geni, per cui si parla di carattere poligenico.
Tuttavia la definizione di tutti questi caratteri genetici ancora in corso. A riguardo della
suscettibilit si pu dire che alcuni pazienti con diabete di tipo 1 si possono trovare tra gli
individui che, nellallele DQ-beta1 che codifica per le catene beta di questa molecola di
classe seconda, hanno in posizione 57 degli aa particolari: Alanina, Serina o Valina. Quindi
avere quei tre aa in posizione 57 predispone al diabete di tipo1. Al contrario non vi sono
individui col diabete di tipo 1 che abbiano in posizione 57 l'acido aspartico. Questo ci dice
che sulle catene alfa, quando si forma un legame salino tra acido aspartico e arginina,
cambia la struttura della tasca che diventa diversa rispetto a quando in questo residuo
sono presenti alanina, serina o valina: o il peptide che lega questa tasca e scatena la
risposta dei linfociti T non viene presentato quando le catene beta contengono lacido
aspartico, oppure le catene beta con acido aspartico presentano un peptide che elimina i
linfociti autoreattivi; nel primo caso possiamo avere difficolt a legare il peptide nella tasca,
nel secondo il peptide legato molto bene ma l interazione tra peptide e linfociti T
determina la loro eliminazione. Lavere alanina, valina e serina o non avere acido aspartico
da soli non sono situazioni che possono causare il diabete di tipo 1.
La predisposizione a malattie autoimmuni pu dipendere dal sesso: stato visto che la sclerosi multipla
tipicamente colpisce le donne in un rapporto di 10:1 rispetto agli uomini; al contrario un'altra malattia
autoimmune come la spondilite anchilosante , che determina limpossibilit di movimento di alcune
giunture soprattutto a livello dellanca, colpisce soprattutto gli uomini, cos come luveite. Il lupus

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eritematoso sistemico (LES) come l artrite reumatoide appartengono prevalentemente al sesso femminile
mentre il diabete di tipo 1 colpisce i 2 sessi con la stessa frequenza. Vi l'evidenza di ci ma non si
conoscono i meccanismi.
Unaltra evidenza molto chiara mette in rapporto lautoimmunit con gli aplotipi HLA: gli individui con allele
DR2 hanno il rischio di sviluppare la sclerosi multipla 5 volte maggiore rispetto agli altri. Nela spondilite
anchilosante importante lallele B27 che determina un rischio 87 volte maggiore. Lo stesso allele
responsabile anche dell uveite con un rischio 10 volte maggiore. Il LES ha correlazione negativa con l allele
DR3. Il DR4 invece correlato con l artrite reumatoide.

Per spiegare questa associazione tra HLA e malattie autoimmuni vi sono due differenti ipotesi:
Lassociazione dipende dallavere o no una tasca per presentare efficacemente il peptide auto-
antigenico. Si pu pensare che gli individui che si ammalano di sclerosi multipla e possiedono l'allele
DR2 siano pi capaci di presentare il peptide auto-antigenico ai linfociti T.
Lassociazione dipende dal fatto che MHC pi protide selezioni positivamente un TCR in grado di
reagire con auto-antigeni ignorati o nascosti.

VACCINI
La storia dei vaccini inizia nel 1100 in Cina dove si sviluppa la pratica della variolizzazione, pratica pericolosa
in cui si inoculavano sotto cute delle croste che provenivano da individui malati di vaiolo. Ogni tanto questa
pratica funzionava proteggendo dalla malattia, altre volte scatenava reazioni infiammatorie devastanti.
La svolta si ha nel 1796 quando Edward Jenner, medico scozzese, vaccin James Pitt, figlio del suo stalliere,
col vaiolo vaccino (materiale infetto proveniente da una mucca infettata con un virus di tipo bovino
chiamato vaccino). Si dimostr cos che era possibile immunizzare.
Nel 1870 Louis Pasteur vaccina i polli con un batterio attenuato (colera).
Nel 1884 sempre Pasteur produce il vaccino contro la rabbia.
Nel 1909 Calmette e Guerin creano il BCG, vaccino contro la tubercolosi basato sullunico batterio attenuato
per vaccinare contro la tubercolosi.
A met del secolo scorso viene ideato il vaccino contro la poliomielite, malattia che provoca paralisi.
Nel 1963 viene prodotto il vaccino contro il morbillo.
Nel 1977 si arriva ad un punto di svolta perch lorganizzazione mondiale della sanit dichiara il vaiolo
eradicato dalla faccia della terra.
Nel 1986 si ha il primo vaccino ricombinante: si usa una proteina ricombinante per vaccinare contro lepatite
B.
I vaccini sono il pi grande contributo che limmunologia abbia dato alla salute umana e alla medicina. Dopo
la scoperta di Jenner si sono trovati vaccini per:
Rabbia
Difterite

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Tetano
Colera
Peste
Tubercolosi
Pertosse
febbere gialla
influenza
A partire dalla seconda met del 900 ad oggi si riusciti ad immunizzare contro:
poliomielite
polmonite
vari tipi di epatite
meningite
varicella
morbillo
orecchioni
rosolia
tifo
encefalite
diarrea
papilloma virus (causa del tumore della cervice uterina)

Vaiolo
Si tratta di uninfezione veicolata dal Pox virus che:
1. penetra attraverso le vie respiratorie
2. diffonde attraverso i linfonodi
3. comincia a replicare uccidendo cellule dellepitelio e si raggiunge una fase in cui si assiste a una vera
e propria viremia (il DNA virale presente in circolo in maniera molto importante)
4. raggiunge fegato e milza replicandosi di nuovo e aumentando la viremia
5. raggiunge la cute e le mucose
6. fa s che si formino pustole dovute allinfezione parallela da parte di batteri
7. crea croste che alla fine diventano cicatrici deturpanti.
Jenner ebbe lidea perch osserv che chi era a contatto con le vacche, soprattutto i mungitori di latte,
erano protetti dal vaiolo. Jonatan Pitt viene immunizzato da Jenner, prima con il virus attenuato e poi
successivamente viene esposto a quello aggressivo, senza ammalarsi. Attualmente per questioni etiche non
si fanno esperimenti su umani.

Un vaccino ideale deve essere:


- Non pericoloso: non deve provocare alcuna malattia.
- Stabile: le preparazioni devono poter essere conservate a lungo possibilmente a temperature non
troppo basse, per poter essere utilizzati in quei luoghi dove non esistono strutture necessarie per la
conservazione a bassissime temperature.
- Economico: produzione accessibile a tutti i Paesi.
- Semplice da somministrare: requisito importante soprattutto nei Paesi in via di sviluppo, in modo
che non siano necessari medico o infermiera per la somministrazione.
- Indurre immunit molto persistente: evita un alto numero di richiami.

Si pu fare una classificazione su base storica dei vaccini. I primi vaccini consistevano in microrganismi vivi
attenuati (ad esempio lo si attenua passandolo pi volte in animali); il secondo modo utilizzato stato
quello di uccidere il microrganismo facendolo bollire (metodo che induce solo alcune vie immunitarie); un
altro metodo stato quello di usare le anatossine: molti batteri sono pericolosi tramite tossine, che
possono essere modificate chimicamente e rese non patogeniche. Pi recentemente sono stati utilizzati dei
componenti antigenici purificati e ultimamente sono stati sviluppati dei nuovi vaccini, ad esempio quelli
basati sugli antigeni ricombinanti prodotti tramite l'ingegneria molecolare. possibile anche fare dei vaccini

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chimerici, mettendo insieme pi antigeni e immunizzando un individuo contemporaneamente contro pi
patogeni. Si possono inoltre generare peptidi sintetici, purificando la proteina di un microorganismo
scegliendo solo i determinanti antigenici della risposta immunitaria, o vaccini anti-idiotipo. Possiamo infine
usare il DNA plasmidico (come avviene in vaccino contro i tumori) iniettandolo in via intramuscolare.

I vaccini che utilizzano i microrganismi uccisi sono stati ampiamente utilizzati, anche perch sono molto
facili da preparare visto che basta riscaldarli e sono molto economici. Sono anche abbastanza sicuri perch
si ha la certezza che un organismo ucciso, una volta inoculato, non pu riprodursi e quindi non pu
provocare la malattia. Inoltre sono facili da conservare anche a temperature relativamente basse, senza
per bisogno di utilizzare azoto liquido come invece necessario per un virus vivo. Ci sono dei limiti al loro
uso:
- Limmunogenicit: un microrganismo vivo sarebbe molto pi immunogeno di uno morto.
- Resa e durata della protezione immunitaria: sono necessari pi richiami.
- Scarsa immunit locale perch il vaccino ucciso lo possiamo somministrare tramite iniezione, e non
come somministrare un vaccino vivo (come per esempio quello della poliomielite, per via orale,
che scatena immunit locale a livello della mucosa del tratto respiratorio e intestinale). Inoculando
un vaccino morto non scateniamo una forte immunit locale che, come visto in precedenza, la pi
potente difesa che un vaccino possa scatenare.
- Non inducono i linfociti T killer perch non sono endogeni.
Il miglior vaccino possibile dovrebbe indurre sia una risposta da T helper sia una risposta citotossica.
Con un vaccino ucciso si producono dei buoni anticorpi ma non tanto dei linfociti T citotossici (CTL). Si
possono avere effetti collaterali perch i vaccini morti possono indurre risposte di vario tipo.
I vaccini vivi con virus attenuato, invece, sono costituiti da virus vivi che sono stati privati della loro
patogenicit. Simulano infezione naturale comportandosi in modo molto simile ai veri patogeni, per cui la
risposta immunitaria che si scatena ricorda molto la risposta immunitaria che verrebbe scatenata contro un
virus vivo non attenuato. Si ha protezione locale a livello delle mucose sia respiratoria che intestinale,
vengono prodotti dei CTL: il virus inoculato entra nelle cellule, le sue proteine vengono esposte su MHC I e
vengono generati dei linfociti killer contro le cellule infettate.
La dose con viene infettato lindividuo efficace nellindurre la risposta immunitaria senza che si debbano
somministare delle dosi enormi. Inoltre la protezione pi di lunga durata (generazione di memoria pi
lunga) e non si devono fare richiami continui o comunque frequenti. Limiti:
- Rischio retromutazione -> il virus privato della sua patogenicit che viene inoculato pu andare
incontro a fenomeni di retromutazione e diventare pericoloso; ad esempio nel caso del morbillo la
preparazione pu presentare retromutazione e causare la malattia, che pu essere anche grave.
Questo rischio stato recentemente molto limitato dal fatto che grazie a sistemi di biologia
molecolare si pu isolare il virus e fare una mutagenesi in vitro dei geni specifici per la patogenicit,
cos da avere preparazioni in cui il gene responsabile della patogenicit stato eliminato.
- Rischio dei contaminanti, che possono essere pericolosi, durante la preparazione.
- I vaccini vivi attenuati persistono nell'organismo quindi creano degli immunocomplessi che possono
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precipitare, diventare insolubili e patogenetici portando a situazioni simili all'autoimmunit.
- Limitata vitalit -> devono essere conservati a bassa temperatura, cio a - 80 o in bidoni di azoto
liquido che arrivano fino a 120; ci si pu fare solo in strutture organizzate e con una certa
capacit economica.
Le macromolecole purificate che si possono utilizzare sono solo alcune, in genere sono dei polimeri,
scheletri composti da tanti monomeri, per esempio di polisaccaridi; questi funzionano molto bene ma
dobbiamo ricordarci che i polisaccaridi sono antigeni timo indipendenti, quindi non portano la memoria
perch non avviene lo switch isotipico.

Le nuove frontiere prevedono lo sviluppo di vaccini con antigeni ricombinanti che utilizzano delle subunit
di alcuni virus, come nel caso dellepatite B: si usa una proteina, un antigene ricombinante, queste vengono
inoculate e non si ha pi il problema della pericolosit dellinoculare un virus infettivo; si hanno comunque
alcuni limiti, ad esempio nel caso delle proteine ricombinanti in cui i vaccini vengono processati come degli
antigeni esogeni e si ha generazione di risposta CD4 ma non risposta CD8, quindi si producono dei buoni
anticorpi, ma non dei linfociti T citotossici. Quindi nel caso del virus che penetra nelle cellule e viene
esposto sulle MHC di classe I, non abbiamo linfociti citotossici in grado di intervenire.

Per passare dai vaccini a virus uccisi a quelli a virus attenuati stato utile il vaccino anti poliomielite, che
colpisce i bambini piccoli e determina gravi paralisi.

Dal 1940, nel giro di pochi anni, si avuto un picco di casi nei neonati. Subito dopo gli anni '50 Salk produsse
un vaccino utilizzando il virus ucciso e poi inoculandolo: questo determin un abbassamento dei casi ma
non una scomparsa, proprio perch il vaccino ucciso e non d immunit locale. Alcuni anni dopo Sabin
fece un nuovo vaccino utilizzando il virus vivo attenuato (tutt'ora usato) dato per via orale con delle gocce. E
molto efficace perch stimola la stessa via di penetrazione del virus naturale e provoca una risposta locale
molto efficiente, genera CTL: la curva dei casi si notevolmente abbassata arrivando quasi a zero.

Un altro problema interessante che vi sono molte infezioni, soprattutto da batteri streptococchi e simili in
cui gli antigeni sono dei polisaccaridi della parete, molto patogenici. I polisaccaridi danno risposta
immunitaria che non dipende dai linfociti T, perch sono definiti timo indipendenti. Gli anticorpi che
vengono generati contro questi polisaccaridi sono soprattutto di tipo IgM a bassa affinit e danno un basso
titolo: immunizzare contro questi antigeni un problema perch manca un efficiente aiuto dei linfociti T
helper che non vedono questi antigeni. Questi polisaccaridi quindi non sono presentati dallMHC, che
presenta praticamente solo proteine. Per fare anticorpi efficienti per questi polisaccaridi viene usata
lingegneria genetica per costruire degli antigeni combinati di cui vi : il polisaccaride per cui si vuole
generare la risposta coniugato con un peptide che pu essere riconosciuto dai linfociti T helper. Quindi il

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vaccino contiene la parte polisaccaridica per cui si devono generare gli anticorpi e una parte peptidica
proteica che funziona come carrier visto dai T helper. Questo funziona molto bene perch cos i linfociti T
vedono lo zucchero attraverso il recettore delle cellule B, lo endocitano e quindi lo degradano, lo
concentrano e a questo punto lo esprimono su MHC II, dove viene presentata la parte peptidica; quindi
andando nel linfonodo i linfociti T possono cos attivarsi ed aiutare i linfociti B che si attivano per produrre
anticorpi contro la parte proteica. I linfociti T fanno switchare la classe, per cui contro questo zucchero non
si producono solo delle IgM, ma anche delle IgA (che vanno nelle mucose) e delle IgG. Ad esempio stato
fatto cos il vaccino contro lHaemofilus influenzae che procura la meningite. In questo modo vengono
generate delle cellule B della memoria che commutano di classe, cio fanno degli anticorpi che vedono la
parte polisaccaridica e si differenziano in plasmacellule producendo immunoglobuline ad alta affinit per i
polisaccaridi.

Unaltra modalit con cui si possono fare dei vaccini utilizzare dei vettori ricombinanti in cui si clona
dentro il DNA di antigeni contro cui si vuole immunizzare un individuo. Questo metodo presenta molti
vantaggi: induce unimmunit cellulare, perch un vettore viene incorporato dalle cellule, la proteina viene
tradotta nel citoplasma e quindi si producono dei CDL. Inoltre si possono fare dei vettori che contengono
pi antigeni: con lo stesso vettore possiamo clonare pi geni e quindi fare una risposta verso diversi
determinanti antigenici, anche di diversa origine, da diversi microrganismi. Limiti:
- Non possibile vaccinare gli individui con una preesistente immunit per questo vettore. Ad
esempio uno dei migliori vettori il virus del vaiolo, che per non pu essere utilizzato per persone
gi vaccinate contro il vaiolo.
- Non si possono fare richiami perch si determina unimmunit nei confronti del vettore. Il vettore
pu essere di origine virale, ma non si possono vaccinare individui immunodepressi perch il
vettore potrebbe scatenare una patologia anche molto grave. I batteri possono essere dei buoni
vettori, come ad esempio la salmonella, opportunamente resa non patogena, cos come il bacillo di
Calmette-Gurin.

Si possono anche fare vaccini con peptidi sintetici pi o meno lunghi che se somministrati generano
risposta immunitaria. Questo metodo era largamente usato negli anni 70 e 80 quando si studiavano molto
le basi molecolari dellantigenicit. In quegli anni si chiarita la composizione chimica, la forma
tridimensionale di molte molecole e come queste molecole potevano essere accessibili agli anticorpi: pi
idrofila pi accessibile. Inoltre importante la carica della molecola in questione e la sua configurazione
ottica. Tutto ci ha portato alla generazione di alcuni peptidi antigenici specifici. Della molecola antigenica si
sapeva tutto: quali erano gli epitopi sequenziali (determinati dalla sequenza amminoacidica lineare), quali
quelli conformazionali.
Si prende la proteina nativa e la si frammenta con enzimi che la digeriscono, si fa una sintesi di tutti i
possibili epta-peptidi presenti nella proteina, si va a vedere quali peptidi sono maggiormente riconosciuti da
anticorpi. Questa procedura ha molti vantaggi, perch si pu stabilire esattamente quali sono gli epitopi
contro cui si vuole generare una risposta anticorpale, si eliminano tutti gli anticorpi diretti contro epitopi
non importanti: si concentra la risposta immunitaria contro limmunogeno dominante, quello che pi
importante per scatenare la malattia. Dopo aver stabilito qual il determinante si possono attaccare questi
peptidi ad ununica molecola carrier (che peraltro favorisce la risposta dei T helper) che li veicoli: si
ottengono cos dei vaccini polivalenti di sintesi. Limiti:
- l solo peptide poco immunogenico, ragion per cui si usa anche un carrier.
- Peptidi diversi stimolano la risposta B e T: non facile avere una risposta coordinata tra i B e i T.

Nei vaccini con subunit multivalenti, chiamate SMAA, si ha un complesso con una matrice solida legato ad
un anticorpo monoclonale a cui stato legato un antigene. Certi antigeni vedono epitopi T che in altri
anticorpi monoclonali legano degli antigeni che invece siano specifici per i linfociti B. In questa maniera
disponiamo di subunit multivalenti in cui degli anticorpi veicolano questi antigeni che sono visti
contemporaneamente alcuni dai T e altri dai B e il risultato che danno una risposta immunitaria
coordinata per cui lepitopo T aiuta i linfociti B a fare anticorpi.

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Immunologia lezione n18 14.05.13 - Novelli

Unaltra subunit multivalente utilizzata per vaccinare una sostanza chiamata ISCOM che costituita da
dei complessi chiamati immunostimolatori. Si tratta di micelle lipidiche formate da fosfopeptidi che si
orientano con la testa idrofila al di fuori e la coda idrofobica all'interno. Dentro vengono messi i peptidi
contro cui si vuole generare una risposta immunitaria. Quando vengono inoculati le micelle si fondono con il
doppio strato lipidico delle membrane permettendo lingresso ai peptidi, che si trovano cos nel citoplasma:
si genera una risposta CTL. Per cui si pu vaccinare contro peptidi che normalmente non sono visti dai CTL.

Un altro metodo quello che d la possibilit di fare dei vaccini anti


idiotipo. Nel 1980 Niels Jerne fece studi sullantigene AB2 (antigene
contro lidiotipo): possediamo un antigene con un certo determinante
(triangolo rosso) che determinata la conformazione dellanticorpo Ab1
che pu generare la formazione di un secondo anticorpo, chiamato
Ab2 contro lidiotipo. Ab2 a sua volta determina la formazione di un
anticorpo Ab3 contro questidiotipo. Ab3 esattamente uguale ad
Ab1 e Ab2 esattamente uguale a allantigene.
Ad esempio contro lHIV si pu generare anticorpi anti HIV in vitro.
Questi anticorpi possono anche essere presi da un individuo
sieropositivo, da cui posso generare anticorpi anti idiotipo. possibile
cos fare dei vaccini in assoluta sicurezza stimolando unantigenicit
elevata, spesso superiore a quella dellantigene iniziale e fare vaccini a
partire da piccolissime quantit di siero.

Unaltra modalit quella di usare il DNA nudo; cio prendere il DNA


senza vettore e trasfettarlo nellanimale con delle pistole (G gun) che
sparano proiettili doro carichi di DNA. Con queste pistole si pu anche
decidere a quale distanza dalla cute introdurre il DNA. Con questa
modalit possibile trasfettare cellule in coltura primaria o cellule
differenziate nei tessuti: nella cellula in cui stato introdotto il DNA
viene prodotta la proteina che determina una risposta immunitaria. Dopo alcuni giorni o un mese la
proteina sparisce (la sua espressione solo transiente).

Si pu anche usare la via alimentare (farli mangiare o farli bere). Se si prende un virus che infetta le piante,
come ad esempio il virus del mosaico del tabacco e si clona dentro un antigene (come quello della rabbia
dei cani) si pu ottenere un vettore con del DNA incorporato. Se questo viene espresso possibile fare delle
proteine chimeriche. Questa metodica stata usata nel seguente modo: si infettano le piante di spinaci con
il virus del mosaico del tabacco clonato con il virus della rabbia. Gli spinaci sono stati fatti mangiare a un
topolino: il risultato che protetto dal virus della rabbia. E un vaccino semplice da somministrare visto
che avviene tramite la via alimentare.

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Immunologia- lezione n19 - 15.05.2013- Prof. Francesco Novelli

LE IMMUNODEFICIENZE

CLASSIFICAZIONI

Si conoscono due tipi di immunodeficienze: le immunodeficienze congenite e le immunodeficienze


acquisite. Le prime sono il prodotto di disfunzioni, in genere genetiche primarie, del sistema immunitario; le
seconde riguardano tutta una serie di situazioni, incluse le infezioni e i trattamenti medici, che causano
danni al nostro sistema immunitario. Come gi sappiamo, questultimo si evoluto e si evolve in stretta
connessione con il mondo microbico, in una situazione di competizione: man mano il sistema immunitario
progredito, i microbi hanno sviluppato nuovi meccanismi di difesa per evitare il riconoscimento e
leliminazione da parte di esso.
Alcuni esempi di questa battaglia sono:
Inibizione della fagocitosi, meccanismo principale attraverso cui il nostro sistema immunitario
elimina i microbi;
Inibizione della chemiotassi, contro cui i microbi hanno sviluppato molecole in grado di inibire
lazione di granulociti e leucociti impedendo loro l ingresso nel punto in cui in atto linfezione;
Inibizione dellendocitosi, attraverso cui i granulociti, leucociti e globuli bianchi invaginano i microbi.
I microbi producono molecole proteiche in grado di inibire le proteine che favoriscono
linvaginazione della membrana plasmatica e dunque lendocitosi;
Inibizione della migrazione dei lisosomi. Per il riconoscimento dellHLA importante lazione dei
lisosomi perch, attraverso il loro contributo enzimatico, degradano le proteine che verranno
successivamente montate sullHLA. Il blocco dellazione dei lisosomi porta alla mancata espressione
dei peptidi sulle molecole MHC e dunque ad un mancato riconoscimento da parte del sistema
immunitario.
Resistenza alla distruzione dei microrganismi fagocitati, messa in atto mediante lattivazione di
diversi meccanismi;
Fuga dal vacuolo. I microrganismi a livello del vacuolo (fagolisosoma) riescono a fuoriuscire
evitando la degradazione e lespressione del loro materiale a livello delle molecole MHC.

Blocco della fagocitosi significa dunque blocco della risposta immunitaria ed, in unultima analisi, di
immunodeficienza legata allincapacit di rispondere in maniera appropriata a pericoli esterni.
Anche limmunit specifica pu essere messa fuori gioco dal mondo microbico:
Variabilit antigenica (si conoscono 84 tipi di Streptococcus Pneumoniae). Piccole mutazioni a livello
amminoacidico nella sequenza peptidica critica dellantigene impediscono il legame con MHC e
dunque con i linfociti T.
Mutazioni. Contro il virus dellinfluenza necessario vaccinarsi ogni autunno perch i suoi geni
mutano e i peptidi che riescono a far produrre gli anticorpi neutralizzanti pi efficienti, possono
essere messi fuori gioco. In questo caso, con la vaccinazione non riusciamo ad indurre una
resistenza duratura proprio per questa continua mutazione del virus.
Variazioni sequenziali dellepitopo compromettono la risposta immunitaria;
Ricerca di rifugi, strategia a cui ricorre lHerpes Zooster che cerca rifugio nei nervi, tessuto dove il
MHC poco espresso e dove quindi il virus risulta protetto. Esso risiede in forma latente ed
integrato nel DNA a livello del tessuto nervoso; i suoi peptidi non vengono caricati su MHC-I, e si
rende poco visibile ai linfociti T citotossici.

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Le cause dellimmunodeficienza sono varie e non facile fare una classificazione schematica. Esse possono
essere divise in due grossi gruppi:
-ereditarie o primitive: dovute ad alterazioni intrinseche del sistema immunitario, mutazioni che provocano
un mancato sviluppo di componenti del sistema immunitario e che bloccano meccanismi biochimici e
molecolari importanti per la difesa del nostro organismo;
-acquisite o secondarie: sono conseguenti a diversi tipi di affezioni, per esempio date da virus, da alcuni
trattamenti medici e da malnutrizione. Questultima una tra le cause maggiori di immunodeficienza.

La classificazione generale delle immunodeficienze primarie pu attuarsi anche in base ai difetti che
possono colpire cellule del sistema immunitario o alcuni tipi di sieri. Questo dipende dal tipo di gene che
viene bloccato in fase di sviluppo, il difetto si avr a partire dal progenitore (sia di linfociti sia di globuli
bianchi).Le immunodeficienze primarie ,classificate in base al difetto che le determina,sono cos divise:
Il 50% delle immunodeficienze primarie che si conoscono, riguardano un blocco dei linfociti B e di
conseguenza un blocco della produzione anticorpale.
Il 25% riguarda immunodeficienze primarie date da difetti combinati a carico di linfociti B e T; in
questo caso i danni clinici molto pesanti perch si ha la messa fuori gioco di entrambi i sistemi B e T.
Il 7% riguarda quelle date da un malfunzionamento dei soli linfociti T
il 14% riguarda i fagociti
una piccola fetta di immunodeficienze dovuta a difetti del complemento.

FREQUENZA

Le immunodeficienze non sono malattie molto frequenti. Si considerino per esempio:


- il Deficit selettivo di IgA, che riguarda una specifica sottoclasse di immunoglobuline (IgA) e ha una
frequenza di 1/500- 2500 persone.
- Agammaglobulinopatia, presente in 1/50000. Questultimo un difetto a carico dei linfociti B per cui non
vengono prodotte immunoglobuline IgG.
- la SCID ( Severe Combined Immuno Deficiences, pronuncia schid) ,dovuta a difetti a carico dei linfociti B
e T , che ha una frequenza di 1/200.000 individui.

Nota storica: la prima descrizione clinica di una malattia da immunodeficienza risale al 1952 ed in
particolare venne fatta a Boston da Ogde Bruton, colonnello dellesercito americano. Si trattava di una
malattia causata da una mutazione a carico del gene che codifica per una chinasi espressa nelle cellule pre-
B, la chinasi di Bruton (Btk, Bruton Tyrosin chinase) il cui malfunzionamento determina la mancata
maturazione da cellula pre-b a linfocita B.

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CARATTERISTICHE

Alcune caratteriste sono comuni a tutte le immunodeficienze:


Infezioni croniche nei pazienti che non guariscono mai completamente neanche se trattati con
antibiotici;
Infezioni ricorrenti;
Infezioni da agenti opportunisti o insoliti (es. malattie da Mycoplasma che pu provocare
suscettibilit alla TBC, Polmoniti);
Guarigioni incomplete che tendono a cronicizzare.
Sviluppo di tumori (vari tipi). Quando si hanno difetti a livello immunitario la frequenza di contrarre
tumori aumenta.
Fenomeni di autoimmunit (soprattutto di natura anticorpale) che si sviluppano in individui con
immunodeficienza. Non ancora chiaro quale sia il nesso tra i due fenomeni. Si notato che in
alcune agammaglobulinemie si verifica uniperproduzione di IgM che si comportano come
autoantigeni.

Tramite modelli sperimentali si pu risalire al funzionamento del nostro sistema immunitario. Per esempio si
possono studiare i comportamenti dei topi KO (knockout), nei quali lespressione dei geni riguardanti
limmunit venga selettivamente silenziata (oppure nel caso in cui tali geni vengano distrutti). Comparando
il comportamento immunologico del topo in questa particolare situazione con limmunologia umana si
tenta di capire come questo sistema di difesa possa funzionare.
Molti difetti genetici dellimmunit sono associati al cromosoma X e colpiscono soprattutto i maschi; su
questo cromosoma troviamo molti geni riguardante limmunit.

IMMUNODEFICIENZE EREDITARIE
PRINCIPALI MALATTIE

DENOMINAZIONE DIFETTO FUNZIONE MANCANTE

Agammaglobulinemia BTK (Burton Tyrosine Kinase) Linfocita B


legata al sesso (X-linked) anomalia delle catene pesanti delle Il risultato una insufficiente risposta
o Sndr. Di Bruton immunoglobuline citoplasmatiche anticorpale, con conseguente aumento
che comporta l'incapacit per le della suscettibilit alle infezioni.
cellule pre-B di differenziarsi in
Linfociti B.
Agammaglobulinemia o Mancata produzione di IgG perch Switch isotipico
Sndr. da iperIgM c una mutazione a carico del Il linfocita non riesce a montare una
CD40L. Impossibilit di contattare il catena pesante di tipo gamma. I
CD40 nella cooperazione linf. B e T. pazienti di questo tipo riescono a
produrre anticorpi con IgM a basso
titolo e a non-memoria. La produzione
di IgM risulta comunque pi elevata
per compensare la mancanza di IgG. (
da qui Sndr. da iperIgM).
Deficit di varie classi di Ig Perdita di geni per alcuni isotipi. Vari tipi di disfunzioni
Alcuni geni che codificano per la Se manca IgG: poca fagocitosi, poche
catena di tipo possono essere difese contro batteri intracellulari.
deleti. Non ci sono IgG, non riesce a Se manca IgA: poca capacit di

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switchare nelle giusta sottoclasse rispondere ad attacchi virali, Ii virus
perch manca il gene per la porzione per esempio penetrano pi facilmente
costante. Pu capitare la stessa cosa a livello gastrointestinale.
per IgA.
Sndr. del linfocita nudo Mancanza di MHC di classe II -Incapacit di presentare peptidi
MHC non viene espresso sulle APC, a allesterno.
causa della mutazione d CIITA, -Mancano i Linfociti CD4: nel timo la
fattore trascrizionale indotto da IFN. selezione prevede linterazione tra
MHC-II e cellule epiteliali timiche. I
lifociti non possono differenziare
Mancanza di MHC di Mancanza di MHC di classe I Mancanza di Linfociti CD8
classe I Difetti a carico dei geni codificanti Si ha dopo la selezione positiva a livello
per TAP1 e TAP2, proteine canale delle cellule timiche. Blocco risposta
presenti sulla membrana del RER. La linfociti CD8 e blocco della loro
tapasina una molecola chaperon maturazione.
che accompagna il caricamento dei
peptidi e si associa a MHC-I nel RER
in attesa che si associ la 2-
microglobulina.
Sndr. Di Degeorge Aplasia dellepitelio timico Linfociti T
Non sviluppandosi completamente, i -Maggiore esposizione a infezioni virali,
linfociti T non sono espressi o lo batteriche, fungine.
sono poco. La poca espressione -Ci sono ceppi di topi (topi nudi) che
data dalla presenza di regioni hanno difetti a carico di un gene che
extratimiche che permettono la codifica per le cellule epiteliali timiche
proliferazione dei linfociti T o residui a livello della 3 e 4 tasca faringea. Il
di timo che in alcuni pazienti topo nasce atimico, e questo provoca
permangono. la mancanza di pelo in questi animali.
Vengono utilizzati come recipienti per
lo studio di tumori umani primari:
questi ultimi non vengono rigettati
data la mancanza di linfociti nel topo.
SCID X-linked Catena dell'IL2R e famiglia delle IL Linfociti B e T (mancata maturazione e
Il difetto si trova sul cromosoma X assenza).
dove il gene implicato codifica per la I bambini che nascono con questo
catena dell'IL2R, la catena comune difetto sono senza risposta
a molte interleuchine (IL7, IL9, IL21). immunitaria sia di tipo cellulare sia di
Questa catena lega a s molte tipo umorale. Si tratta di una malattia
citochine regolando molti passaggi quasi incompatibile con la vita. L'unico
maturativi: se il linfocita T non modo per curarli il trapianto di
risente di questi segnali va in midollo (che non sempre funziona) o la
apoptosi. terapia genica.
SCID autosomico Deficienza autosomica recessiva per linfociti T e B
le ricombinasi. I geni che codificano Ci sono topi che non hanno mutazioni
per RAG1 e RAG2 sono difettosi, non a carico di Rag1 e 2, danno
si ha ricombinazione VDJ sia per informazioni importanti per quanto
quanto riguarda il complemento (?) riguarda lo studio dei meccanismi
sia per quanto riguarda le immunitari.
immunoglobuline.

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SCID autosomico -Gene che codifica per Artemis Linfociti T e B
-Geni coinvolti nella ricombinazione
VDJ
-Mutazione della catena alfa del IL2R
( o CD25)
-Recettore dell'IL7
-Tirosinchinasi Jak3 associata a
questi recettori delle interleuchine

SCID autosomico Deficit di purino nucleoside Linfociti T


fosforilasi diminuiscono perch l'accumulo di
questi metaboliti tossico soprattutto
per i linociti. Immunodefiicenza di tipo
T.
SCID autosomico Deficit di adenosina deaminasi Linfociti T
diminuiscono perch l'accumulo di
questi metaboliti tossico soprattutto
per i linociti.
Terapia genica: nelle cellule staminali
di midollo osseo si riusciti ad inserire
un virus contenente il gene che
codifica per l'enzima funzionante.
Questo virus, diffondendosi tra le
cellule, permette a questi individui di
vivere normalmente.
Difetto dell'adesione dei Difetto nella produzione di catena -Estravasazione dei macrofagi e dei
leucociti (LAD) beta delle integrine, che leucociti
normalmente mediamo l'adesione -uccisione dei CTL: i linfociti citotossici
dei leucociti all'endotelio. Impedisce per poter agire devono avere un
il Rolling: quando l'endotelio viene contatto intimo con il loro bersaglio. Se
stimolato dalle citochine in caso di questo viene meno, i CTL non riescono
infiammazione, i leucociti a caricare i granuli contro il bersaglio.
normalmente possono aderire ai Se non c' contatto stretto non
vasi rotolando su di essi. riescono a degranulare. Non c' difesa
contro batteri e virus.
-cooperazione B-T: no attivazione B e T
e conseguente mancata produzione di
Ig. La presenza delle integrine di
primaria importanza nell'interazione
tra T e B nel linfonodo. Le conseguenze
funzionali sono devastanti.

Agranulocitosi congenita Diminuita produzione o mancanza di Neutrofili


G- CSF, fattore che stimola lo
sviluppo di colonie di granulociti.

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Malattia granulomatosa Deficit delle catene enzimatiche che -Uccisione da macrofagi e granulociti
cronica porta alla diminuita formazione di
specie radicaliche intermedie dell' O Questa malattia non letale,
(ROI). curabile. Terapia: Si pu aumentare la
Da alcune proteine mitocondriali produzione di ROI tramite la
della catena respiratoria non somministrazione di IFN. I ROI
vengono prodotti intermedi aumentano in modo da garantire un
dell'ossigeno e di conseguenza livello sufficiente per far funzionare i
abbiamo problemi nella fagocitosi granulociti.
da parte dei macrofagi e granulociti.
Atassia- teleangectasia Immunodeficienza B e assenza IgA e Degenerazione neurologica dovuta a
IgG Mutazione gene ATM malfunzionamento di linfociti T, il
paziente non riesce a stare in piedi,
difetti a livello vascolare.
Nome della malattia non Diminuita funzione T a causa della Radiosensibilit, i linfociti diventano
ancora definito mancanza di una chinasi. radioresistenti.
Mancanza del gene PI3K Predisposizione ai tumori
Sndr. Di Chediak-Higashi Proteina LYST mutata. Secrezione dei granuli e lisosomi
-Funzioni messe a repentaglio: le
cellule NK, CTL, Macrofagi, neutrofili
non funzionano;
-DC difettose;
Generale suscettibilit ai batteri
piogeni che hanno bisogno della
fagocitosi per essere eliminati (sono
batteri extracellulari)

Nome della malattia non Deficit Jak chinasi No T, no NK


ancora definito una malattia dovuta a difetti nella B normali ma ipogammaglobulinemia:
trasduzione dei segnali citochinici. produzione di poche Ig perch
mancano i linociti T.
Suscettibilit ereditaria Mutazione geni asse IL12/IFN No attivit macrofagi
alle infezioni da IFN una citochina che attiva i In genere i Macrofagi sono infettati dal
Micobatterio macrofagi; Micobatterio che viene inglobato ma
ILR12 promuove la produzione di non distrutto perch manca il segnale
IFN. da parte di IFN e IL12 per eliminarlo.
una malattia dovuta a difetti nella
trasduzione dei segnali citochinici.

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MALATTIE DOVUTE A DIFETTI DELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE

DENOMINAZIONE DIFETTO FUNZIONE MANCANTE


Deficit trasduzione del Mutazione del gene che codifica per Attivazione di CD4 e CD8
segnale TCR CD3 (alcune catene) e CD45, La trasduzione dei linfociti T difettiva
importante fosfatasi per far partire la quindi non abbiamo la capacit di attivare
trasduzione. CD4 e CD8. I linfociti T in questo caso sono
presenti, riescono a maturare ma non si
riescono ad attivare in seguito a segnali
antigenici.
Sndr. Di Wiskott- Mutazione del gene Wasp che Attivazione dei linfociti T e migrazione dei
Aldrich determina il mancato riarrangiamento leucociti.
dell'actina e del citoscheletro. Queste Durante le infezioni, i leucociti aderiscono
due strutture normalmente sono all'endotelio dei vasi e cercano di
presenti nei primi eventi fuoriuscirne tentando di modificare il
dell'attivazione dei linfociti T, quando citoscheletro. Questo non pu avvenire in
si forma la sinapsi immunologica. Il caso di questo deficit, cos i leucociti non
riarrangiamento importante per la riescono a raggiungere il sito dell'infezione.
trasduzione del segnale.

Sindrome -Deficit di Fas, Fas ligando Mancata inattivazione dei linfociti T.


linfoproliferativa -Deficit delle perforine, cio dei Fas e FasL spengono la risposta
granuli che portano all'uccisione da immunitaria; quando i linfociti aumentano
parte delle cellule NK e linfociti troppo di numero, i linfociti stessi
citotossici; esprimono queste molecole sulla
-Deficit nell'esocitosi dei granuli membrana mandando altri linfociti vicini in
citotossici. apoptosi, ricreando un equilibrio
(omeostasi). Se questo segnale di morte
difettoso, non si riesce ad inattivare la
risposta e si ha un gran numero di linfociti
attivati in circolo. Si hanno quadri
autoimmuni.
Deficit trasduzione del Difetto del gene NEMO coinvolto nella -Infezioni ricorrenti di vario tipo
segnale TLR trasduzione del segnale NFKB; -ridotta produzione di IFN/
Myd88 adattatore a valle dei TLR;
IKB un inibitore del NFKB;
IRAK 4

Agammaglobulinemia legata al sesso (x-linked):


Limmunodiffusione radiale un test eseguito sul siero mediante il quale si possono calcolare e dosare le Ig
presenti (test quantitativo). Questo test venne ideato da un genetista torinese Angelo Carbonara e da sua
moglie Giuliana Mancini. Nel caso di questa malattia le Ig non compaiono e rivelano un quadro clinico grave.
Facendo questo test sui bimbi affetti da questa malattia, si nota che quelli molto piccoli (primi mesi di vita)
sono normali perch sono ancora protetti dalle Ig materne ricevute per via transplacentare. I bambini,
crescendo, vanno incontro a numerose infezioni ricorrenti; la malattia risulta curabile. Le mamme di questi
bambini hanno inattivato lX che contiene il gene mutato, in circolo hanno dunque i linfociti B con il
cromosoma X che codifica per la tirosina chinasi funzionante.

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Ipogammaglobulinemia transitoria dellinfanzia (THI): unimmunodecienza caratterizzata da un ritardo
nel normale processo di sintesi delle IgG, eventualmente associato ad un difetto degli altri isotipi(
soprattutto IgA), che generalmente esordisce dopo il primo semestre di vita, quando il lattante perde gli
anticorpi materni acquisiti per via transplacentare durante le ultime settimane di gestazione. Tale
condizione deve essere distinta dallipogammaglobulinemia siologica dellinfanzia, che descrive il
siologico processo di riduzione delle IgG, conseguente alla perdita degli anticorpi materni 1-4, che si
realizza nei nati a termine tra il terzo ed il nono mese di vita, seguita poi da un progressivo incremento della
produzione anticorpale autoctona, no al raggiungimento di livelli di IgG analoghi a quelli delladulto,
intorno ai cinque anni di et. Diversamente, nei bambini con sospetta THI, i livelli di IgG non aumentano
come ci si aspetterebbe e rimangono bassi per let, normalizzandosi solo successivamente entro i 24-48
mesi di vita. Per sopperire a questa situazione di mancanza di Ig, necessario somministrare al bambino -
immunoglobuline. La diagnosi di Ipogammaglobulinemia viene solitamente confermata solo a posteriori
come transitoria, per il successivo normalizzarsi dei valori delle immunoglobuline.

Deficit di IgA : nei primi mesi di vita, le IgA materne vengono trasmesse al bambino con il colostro dopo di
che, a partire dal 3 mese queste Ig degradano e si ha un deficit perch il bambino non riesce ancora a
produrle. Il bambino risulta essere pi suscettibile a infezioni di tipo gastrointestinale.

Sindrome di DiGeorge: tra i segni caratteristici di questa sindrome si riscontra agenesia o ipoagenesia del
timo e conseguente mancanza o minor produzione di linfociti T. In questo tipo di paziente le zone in cui
normalmente i linfociti T si accumulano vengono a mancare (in particolare nella paracorticale dei linfonodi e
nei manicotti periarteriolari splenici).
Questi individui non sono completamente immunodeficienti perch nonostante il numero di linfociti T sia di
gran lunga inferiore allo standard, vi comunque cooperazione con i linfociti B che vengono ugualmente
prodotti.
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Deficit da adenosina deaminasi: si manifesta per attivit ridotta o assente dellenzima adenosina deaminasi
(ADA), coinvolto nella sintesi di acidi nucleici. Esso determina il passaggio da adenosina ad inosina e di
desossiadenosina a desossinosina. Se il gene che codifica per questo enzima mutato, ladenosina e
desossiadenosina si accumulano, per esempio a livello del midollo osseo, causando effetti di tossicit nei
linfociti T. Si ha unalterata sintesi di DNA allinterno dei linfociti T e B per accumulo di metaboliti. Il gene in
questione mappa sul cromosoma 2, la malattia non dunque legata al sesso. Si trasmette con modalit
autosomica recessiva. Il quadro clinico simile allimmunodeficienza di tipo SCID.
Il basso numero di linfociti determina suscettibilit a tutti i tipi di microorganismi accoppiata a danni
scheletrici e neurologici.
La cura attualmente proposta consiste nel trapianto di midollo osseo ma funziona solo nel 50% dei casi.
stata messa a punto una terapia con ADA ricombinante, che permette di introdurre il gene in questione
nelle cellule staminali del midollo mediante lutilizzo di un retrovirus. Il retrovirus infetta le cellule staminali,
si diffonde nel tessuto integrando il proprio DNA in queste cellule che riusciranno a produrre lenzima
funzionante.

Immunodeficienza del sistema fagocitario (granulociti e macrofagi):


I quadri clinici sono complessi e molto vari. Abbiamo solitamente stati febbrili, granulomi, ascessi, infezioni
cutanee, gengivali, a livello ungueale e di altro tipo. Queste situazioni sono dovuti a tre tipi di difetti:
Difetti a carico di mieloperossidasi, enzimi presenti nelle cellule mieloidi che portano alla
formazione di ROS;
Difetti in alcuni recettori delle citochine e del complemento;
Difetti di adesivit, ossia quando mancano le integrine, i macrofagi e i leucociti non possono
fuoriuscire dai vasi.
La malattia che pi rientra in questo contesto la malattia granulomatosa cronica dovuta allincapacit da
parte dei fagociti di produrre specie reattive dellO 2 per cui i granulociti ed i macrofagi non riescono ad
uccidere i batteri che hanno internalizzato. La malattia pu essere data del difetto del citocromo b
mitocondriale per cui non si formano n H 2 O 2, n radicali dellO 2 .
La malattia pu essere X-linked o non X-linked.
Somministrando IFN si ripristina la formazione di radicali liberi in quantit sufficienti a garantire il corretto
funzionamento di macrofagi e granulociti.

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Immunodeficienze del sistema del complemento:

N.B.: Per componenti terminali del complemento si intendono C6, C7, C8, C9, molecole che formano il
complesso di attacco alle membrane. Se si hanno questi difetti non si riescono a eliminare tutta una serie di
patogeni (vedi sopra) e ha mancata degradazione degli immunocomplessi.

SUSCETTIBILITA LEGATA AL MICOBATTERIO DELLA TUBERCOLOSI


Negli ultimi anni stata studiata la suscettibilit genetica al Micobatterio della tubercolosi.
Alcune popolazioni, tra le quali molte africane, sono suscettibili al micobatterio. Sono stati studiati molti
fattori genici ma non si mai riuscito a trovare il gene responsabile di questa suscettibilit. Allinizio degli
anni 90 un ricercatore francese, Casanova, riusc ad individuare una mutazione per la catena R1 che codifica
per lIFN-recettore in una paziente che presentava infezioni ricorrenti da micobatterio. Casanova riusc a
dimostrare che questa paziente era infettata dal batterio a causa di un difetto a carico di questo gene. La
scoperta stimol lanalisi di numerosi bambini che soffrivano di queste infezioni da Micobatterio; si trattava
soprattutto di bambini vaccinati con il vaccino di Calmette-Guerin.
In Francia e nei paesi del nord Africa la vaccinazione con BCC contro la tubercolosi obbligatoria. Tutti quei
bambini che presentavano difetti genetici a carico dellIFNy stavano bene fino a 3 anni di vita, poi venivano
vaccinati, ed il vaccino di Calmette-Guerin causava gravissime infezioni croniche, fino a determinare la
morte di alcuni di loro. I genetisti riscontrarono difetti non solo a carico del gene dellIFNy, ma anche difetti
di altri geni connessi con la trasduzione del segnale di IFNy, per esempio geni che codificano per STAT1, IL12,
IL12R. Mutazioni a carico di questi complessi causano tutte quante lo stesso fenotipo ossia la suscettibilit al
batterio.
Grazie a queste ricerche si cap limportanza di questi meccanismi per controllare questo tipo di patologia.

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LINTERFERONE
L IFNY una citochina, appartenente ad una famiglia di proteine chiamate interferoni. Se ne conoscono di
tre tipi: IFN , e . Sono proteine che inibiscono lRNA virale.
LIFN alfa e beta sono molecole piccole di 18-20 KDa, se ne conoscono di 23 tipi e, nel caso dellIFN ,
condividono lo stesso recettore. espresso su molte cellule ad esempio NK, macrofagi, linfociti e cellule
dendritiche. Il recettore per lIFN alfa e beta ubiquitario.
LIFN distinto dagli altri tipi perch consiste in una molecola di 146 a.a. con un peso molecolare che va dai
25 ai 35 KDa ( il diverso peso in funzione di una diversa glicosilazione), non ha nessuna omologia con INF
alfa e beta. Agisce sempre come un omodimero (un omodimero lega un recettore dellIFNy).
prodotto dai linfociti Th1, NK e CTL. Quando un antigene viene riconosciuto da una cellula che presenta
lantigene, questa cellula inizier a produrre IL12, soprattutto in un contesto di segnali pericolo mediato dai
TLR. IL12 agisce sul promotore dellIFNy a livello dei linfociti T, promuovendone la produzione di interferone.
Quando un linfocita T riconosce lantigene produce una molecola di IFN, ma se questo linfocita stimolato
dallIL12 produce 100, 1000, 10.000 molecole di IFN in pi nelle stesse condizioni. IL12 un potentissimo
amplificatore della produzione di IFNy. IFN svolge un ruolo biologico fondamentale: agisce sui macrofagi
attivandoli, agisce sui linfociti T favorendone la differenziazione in Th1, agisce sulle cellule endoteliali e ne
modula ladesivit. IFN a tutti gli effetti una molecola infiammatoria perch fa aumentare le molecole
MHC sulla membrana cellulare. La molecola B7, fondamentale per i costimoli, regola lespressione dei
recettori FC delle immunoglubuline e delle molecole di adesione. Inoltre, nei macrofagi Induce la
produzione di NO che responsabile delleliminazione dei batteri intracellulari fagocitati.
IFN possiede un recettore che consiste di due catene: la catena R1 ed R2.
La catena R1 lega linterferon ( una binding chain) ed sempre associata alla tirosin-chinasi Jak1, si trova
nel citoplasma ed ha una distribuzione ubiquitaria. La catena R2 responsabile dellinvio dei segnali al
nucleo. Se il recettore per lInterferon lega lIFN in forma dimerica ma non possiede la catena R2 associata, il

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segnale non viene trasmesso. Il segnale trasmesso attraverso la Jak2 associata alla R2. Queste due catene
trasducono il segnale attraverso STAT, in particolare STAT1, che si trova anchesso nel citoplasma. Questa la
trasmissione del segnale: un interferon dimerico lega due catene R1, il recettore R2 associato alle catene
coinvolto nel legame con INF; le STAT vengono reclutate tra le code citoplasmatiche di R1 e vengono
fosforilate, dimerizzano, e vanno nel nucleo dove geni specificamente attivati da IFN vengono trascritti.

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Immunologia - Lezione 20 17.05.2013. Novelli

ALTERAZIONI CONGENITE DEL COMPLEMENTO

Tra le mutazioni congenite del sistema immunitario vi sono anche difetti a carico di diversi fattori del
complemento, i quali hanno vari impatti sulla suscettibilit a infezioni. Le diverse alterazioni riguardano
diverse molecole:

C3:Una delle alterazioni pi importanti riguarda C3, il componente pi abbondante nel siero.
C3 si scinde in C3a e C3b e questultimo lega i batteri in maniera covalente per permetterne la
fagocitosi, perci quando assente o scarsamente presente il difetto maggiore quello di
opsonizzazione. Questo determina in primo luogo suscettibilit alle infezioni soprattutto di batteri
piogeni ( batteri che necessitano di essere fagocitati per essere eliminati), ma anche un difetto
nelleliminazione degli immunocomplessi, i quali si depositano a livello renale causando
malfunzionamento dei reni e glomerulo nefrite.
Fattori D,P,I,H: Vi sono anche difetti a carico di fattori responsabili della regolazione del
complemento ,come i fattori D e P, coinvolti nella formazione della C3convertasi nella via
alternativa, e i fattori I e H, la cui assenza causa difetti di opsonizzazione.
Lassenza di uno qualunque di questi fattori determina suscettibilit alle infezioni di batteri piogeni,
inoltre un difetto del fattore P associato a fenomeni di meningite fulminante, in quanto un
elemento importante nelleliminazione di microrganismi responsabili dellinfezione a livello del
sistema nervoso, mentre un difetto del fattore H pu anche causare una sindrome emoliticouretica
e una glomerulonefrite dovuta allaccumulo di immunocomplessi in questi tessuti.
C5,C6,C7: Altri difetti possono riguardare componenti terminali della cascata complementare,
quindi C5 C6 C7. Essi portano alla formazione del complesso di attacco alla membrana, perci la
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funzione principale che viene alternata la quella di batteriolisi (non pu avvenire senza il
complesso di attacco!). Questo determina una suscettibilit soprattutto nei confronti del batterio
Neisseria, che ha come conseguenza linsorgere di meningiti ricorrenti e artrite gonococcica .
C8: Ci pu essere un difetto nel frammento terminale C8 che pu essere dovuto allassenza di una
delle catene che lo costituiscono o una sua ridotta produzione. Anche in questo caso si hanno
infezioni ricorrenti e disseminate di Neisseria.
CR1,CR3: Vi possono essere differenze a carico dei recettori del complemento, come CR1 e CR3 .
CR1 viene espresso su emazie, neutrofili e monociti, perci quando assente determina un difetto
nelleliminazione degli immunocomplessi, i quali si depositano nei tessuti. Come conseguenza si ha
un quadro clinico che del tutto sovrapponibile a quello della malattia da immunocomplessi pi
conosciuta come Lupus Eritematoso Sistemico (LES).
Per quanto riguarda CR3 anchesso espresso su neutrofili e monociti e una sua alterazione
determina una difettiva fagocitosi e una difettiva azione degli enzimi lisosomiali, che causano
suscettibilit verso batteri piogeni e leucocitosi . E stato associato anche alla ritardata separazione
del cordone ombelicale.

AZIONE DELLINTERFERONE
IFN- una citochina eterodimerica che lega un
recettore a doppia catena IFNR.
Le due catene che lo costituiscono sono:
- R1, lega IFN-, sempre associato a JAK 1 ed
ubiquitario;
- R2, che associato a JAK2 ed il componente
attraverso cui avviene la trasduzione del segnale.
Quando l IFN- si lega, le JAK fosforilano i
recettori di coda di R1,dal citoplasma vengono
reclutate le STAT, le quali vengono fosforilate e
mandate nel nucleo come dimeri a trascrivere geni
specifici per lIFN.

Osserviamo cosa avviene in caso di infezione nei monociti, che sono le cellule pi sensibili allazione dell
IFN-. Ricordiamo che i monociti esprimo in membrana MHC di classe II, CD40 e IFN-R , mentre i linfociti
Th1 possiedo il recettore per linterleuchina 12 (IL12R).
-Infezione: il micobatterio viene fagocitato dal monocita grazie alla formazione di vescicole di endocitosi. In
seguito allinternalizzazione i peptidi derivati dalle proteine del micobatterio vengono presentati sulle
molecole MHC di classe II e resi riconoscibili dalle cellule T Helper, in particolare dai linfociti Th1.
-Riconoscimento dellantigene: le interazioni con il complesso MHC-peptide e tra CD40 e CD40L portano
allattivazione del linfocita Th1. A questo punto inizia la produzione di IFN-, che viene rilasciato e captato
dal monocita.
-Legame IFN- / IFNR: il segnale porta allattivazione di STAT1 e determina la trascrizione di geni
importanti, tra cui il gene dellinterleuchina 12. Questa citochina pu essere rilasciata e captata dal Th1, che
ne esprime il recettore.
-Loop: IL12 un potente amplificatore della produzione di IFN- , perci si crea un circuito tra le cellule che
presentano il micobatterio e il linfocita Th1: in seguito allattivazione viene prodotto l IFN-, che stimola la
produzione di IL12 nel macrofago, il quale a sua volta stimola una enorme produzione di IFN-, per cui la
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reazione viene molto amplificata.
Il risultato ultimo di questa interazione che i macrofagi trascrivono NOS (NO sintasi), che produce
monossido di azoto, e attivano gli enzimi della mieloperossidasi, che portano alla produzione di acqua
ossigenata e di radicali dellossigeno. In questo modo il macrofago in grado di uccidere i micobatteri.
Questa eliminazione avviene nella struttura chiamata granuloma.
IFN- e IL12 permettono la costruzione di questa struttura anatomica in cui allinterno troviamo le cellule
epitelioidi (cellule giganti multinucleate derivate dai macrofagi che hanno facogitato i micobatteri) e attorno
una corona di linfociti Th1. Questa organizzazione permette linterazione tra cellule epitelioidi e linfociti, che
ha come risultato leliminazione del micobatterio, e allo stesso tempo impedisce al patogeno di diffondersi,
entrare nei vasi e causare una infezione sistemica.

ALTERAZIONI NEL MECCANISMO DI PRODUZIONE E AMPLIFICAZIONE DELL IFN-

Allinizio degli anni 90 Jean-Laurent Casanova scopr una bambina con difetto della catena R1 dell IFNR e
che era affetta da suscettibilit ereditaria al micobatterio. Successivamente cerc altri casi di bambini aventi
lo questo difetto e identific tutta una serie di altre mutazioni a carico di queste vie.
Sono stati trovati altri bambini che avevano difetti di R2 e di STAT1 (che impediscono la trasduzione del
segnale), difetti genetici a carico di p40 (Il12 una proteina eterodimerica con due sub unit: p40 e p35) e
anche difetti a carico di una catena recettoriale per lIL12.
Questi pazienti o non erano in grado di sentire IFN- per mancanza delle catene del recettore o di STAT1
oppure non erano in grado di produrre grandi quantit di IFN- per via del difetto dellIL12.
Tutti questi difetti genetici determinano un unico fenotipo clinico, cio la suscettibilit al micobatterio,
anche quello ambientale, ma ci sono delle differenze:

I difetti della catene R1 e R2 e di STAT1 determinano una gravissima immunodeficienza, per cui
questi bambini non potevano essere guariti se non attraverso il trapianto di midollo e spesso molti
di loro morivano a causa delle infezioni ricorrenti.In questo caso il difetto non curabile.
Quando le alterazioni riguardano IL12 e IL12R possibile ovviare al problema tramite iniezioni
intradermiche di IFN- .
Infatti questi pazienti non riescono a produrre IFN- a livelli sufficienti a causa dellassenza dell
amplificazione data da IL12, ma il recettore e il resto della via sono funzionanti.
In questo caso si hanno forme pi levi di suscettibilit e il difetto curabile.
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IMMUNODEFICIENZE ACQUISITE

Le immunodeficienze acquisite sono distinguibili da quelle congenite poich secondarie ad altri eventi.
Possono essere dovuta a:
-cause iatogene, ovvero alla somministrazione di farmaci. Ad esempio le chemioterapie causano la morte
delle cellule del midollo e provocano pesanti immunodeficienze, oppure in caso di trapianto occorre
bloccare la risposta T per farlo attecchire, per cui si interviene con immunosoppressori molto potenti (come
ciclosporina A e inibitori del recettore per lIL2).
-malnutrizione, una delle cause di immunodeficienza pi diffusa nel mondo, soprattutto nelle aree dei
paesi poveri. Causa suscettibilit a molte infezioni e ha un impatto molto importante sul sistema
immunitario ( ad esempio la carenza di vitamina D determina di fenomeni di guida allimmunodeficienza).
-radiazioni, ad esempio i trattamenti radioterapici in pazienti con tumore aboliscono lattivit midollare,
poich uccidono i precursori dei linfociti e dei leucociti e non si ha pi risposta immunitaria ( n innata e n
adattativa).
Un esempio di immunodeficienza acquisita molto nota data dal virus dellHIV.

HIV
E determinata da un lentivirus umano che determina una Sindrome da Immunodeficienza Acquisita
(AIDS), esplosa a partire dai primi anni 80. In quel periodo in alcune citt in cui esistevano grandi comunit
di omosessuali vi fu una esplosione molto preoccupante di Pneumocystis Carinii. A quel tempo questi casi
erano inspiegabili perch questo fungo un agente innocuo per chi immunocompetente, ma per chi ha
difetti immunitari provoca polmoniti letali. Per questo sono state messe in moto una serie di ricerche che
nel giro di tre anni hanno portato allidentificazione del virus dellHIV. Si apr un dibattito su chi fosse stato
il primo scopritore del virus fra Gallo e Montagnier, alla fine la primogenitura fu assegnata al secondo.

INFEZIONE DA HIV

Il virus dellHIV si diffonde ed entra nellorganismo attraverso:


-sesso con persone infette;
-aghi infetti;
-emoderivati infetti;
-fluidi organici infetti (quali sangue, secreto vaginale, sperma, latte materno), ovvero fluidi che si trovano
nel circolo sanguigno e a livello delle mucose.
A questi livelli il virus viene captato dalle cellule dendritiche e portato nel linfonodo drenante, dove pu
replicare e infettare a sua volta i linfociti T presenti.
Per fare ci sfrutta due tipi di recettori:
-CD4, che si trova soprattutto sui linfociti TH ma anche, in piccola parte, sui macrofagi (linterazione avviene
tramite una proteina del capside chiamata p120);
-i recettori chemochinici CXCR4 e CCR5, il primo espresso prevalentemente sui linfociti T (soprattutto se
sono attivati), il secondo soprattutto su macrofagi e cellule dendritiche.
In seguito allinfezione i linfociti T vengono uccisi dal virus, mentre macrofagi e cellule dendritiche
diventano dei serbatoi di virus, che li trasportano nei linfonodi e che per lungo tempo possono funzionare
come veri e propri reservoir per infettare altri linfociti.

CICLO VITALE DELLHIV

Il virus possiede un envelope esterno in cui sono presenti alcune proteine molto immunogeniche (cio che
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inducono anticorpi), come gp41 e gp120, mentre allinterno si trovano una molecola di RNA e due
trascrittasi inverse.
-LEGAME AL CD4 E FUSIONE: Il virus si lega a CD4 o a uno dei recettori chemochinici (CXCR4 o CCR5)
presenti sulla superficie della cellula, lenvelope si fonde alla membrana e lRNA pu entrare nella cellula.
-AZIONE TRASCRITTASI INVERSA: A questo punto le trascrittasi inverse sintetizzano del cDNA virale, che si
va ad integrare nel nucleo come provirus.
-FASE QUIESCENZA: Alla fine di queste prime fasi il virus entra in una fase di quiescenza, ovvero non va
subito incontro a replicazione. Questo avviene solo quando la cellula infettata viene attivata (nel caso del
linfocita T quando questo riconosce un antigene).
-FASE DI ATTIVAZIONE: Avviene perch il pro virus ha delle lunghe sequenze terminali (long terminal
repeats) allinizio e alla fine del proprio genoma e che sono legate da NfkB.
Quindi quando il linfocita T viene attivato inizia la trascrizione delle proteine virali, a partire da quelle del
capside. Queste proteine poi si assemblano dando origine a nuovi virus, che uccidono la cellula e si
disperdono nellambiente.

CINETICA DELLATTIVAZIONE DAL PUNTO DI VISTA CLINICO

Linfezione da HIV segue varie fasi prima di determinare la Sindrome da Immunodeficienza Acquisita vera e
propria, infatti occorrono mesi o anni prima che questa insorga.
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-Tempo zero: la penetrazione del virus nellorganismo determina una infezione in genere asintomatica, in
seguito alla quale vengono attivati una serie di meccanismi di protezione naturale. Tra questi ce ne sono
alcuni riguardanti i recettori per le chemochine, per cui i recettori vengono occupati in modo da essere
saturi e non utilizzabili dal virus per entrare nelle cellule (ad esempio CCR5 lega delle chemochine
chiamate nella vecchia nomenclatura RANTES, MIP-1, e MIP-1).
Circa l1% popolazione caucasica omozigote per una mutazione del gene CCR5 che non causa danni alla
risposta immunitaria poich le chemochine usano pi recettori (si tratta di un sistema ridondante), ma
danno resistenza al virus in quanto non vi sono porte di ingresso, per cui il rischio di infettarsi molto basso.
Questo tipo di mutazione assente in Giapponesi e neri Africani.
-Alcuni giorni dopo: si ha una infezione parainfluenzale, ovvero una sorta di influenza lieve che passa
abbastanza velocemente.
-1-2 mesi dopo: inizia a esserci la produzione di anticorpi anti-gp120,. Questo dovuto al fatto che i linfociti
B ormai hanno riconosciuto lenvelope e hanno iniziato a produrre anticorpi di classe IgM e, dopo
lattivazione dei lifociti T, di classe IgG. La comparsa di questi anticorpi nel siero prende il nome di
SIEROCONVERSIONE e i pazienti infetti vengono definiti sieropositivi.
-Alcuni mesi dopo: lingresso di antigeni dallesterno porta allattivazione dei linfociti T infettati, il virus
inizia a replicarsi, le cellule infettate vengono uccise e nel siero inizia a comparire il DNA virale.
La carica virale presente nel siero prende il nome di viremia e pu essere misurata attraverso metodiche
molecolari quali la PCR.
Il meccanismo di eliminazione dei linfociti CD4 pu durare mesi o alcuni anni.
E importante sottolineare che la morte dei linfociti T avviene sia per lisi e apoptosi indotte dallazione
citotossica del virus, sia perch esprimono i peptidi virali nelle tasche delle molecole MHC I, perci vengono
riconosciuti da altri linfociti T citotossici ed eliminati. Vi sia un meccanismo virale che un meccanismo
intrinseco del sistema immunitario.
Inoltre i linfociti CD4, che sono le cellule pi colpite, tendono ad aggregarsi in sincizi multinucleati e questa
interazione ne causa la morte per apoptosi.
-Anni:la progressiva diminuzione di linfociti, soprattutto CD4, determina una grave deficienza immunitaria
progressiva che apre la porta a infezioni soprattutto di tipo opportunistico. I pazienti sviluppano
complicazioni da infezioni sia virali sia di funghi, che sono incontrollabili e possono essere letali.
Un esempio dato appunto dal Pneumocystis carinii, causa di polmoniti, ma vi anche unaltra
complicazione molto importante tipica dellHIV: i tumori.
Questi si sviluppano per via della la carenza di linfociti T che riduce limmunosorveglianza.
Vi sono due tipi di tumori tipici dei pazienti dellHIV:
Sarcoma di Kaposi, un rarissimo tumore del tessuto connettivo tipico dei pazienti con AIDS
conclamato. Determina delle lesioni cutanee molto grandi ed uno dei pi importanti motivi di
decesso degli individui affetti da HIV.
Linfomi B, cio tumori a carico dei linfonodi e delle cellule B che vi si trovano allinterno. Questi
pazienti soffrono di linfomi B molto aggressivi.

ANALISI CLINICA

Dal punto di vista clinico e diagnostico lo sviluppo della malattia viene monitorato basandosi su due
parametri:
-anticorpi presenti nel siero;
-n di CD4 nel sangue periferico.
Questultimo si pu misurare tramite un esame molto semplice e molto breve effettuato grazie ad una
macchina chiamata citofluorimetro.
Esistono anticorpi monoclonali diretti contro il CD4 o CD8 marcati con un fluorocromo come la fluoresceina,
la cui fluorescenza viene attivata da un laser ad una certa lunghezza donda. Questi anticorpi vengono fatti
legare alle cellule, che vengono poi fatte passare una alla volta attraverso un foro. Qui vengono colpite dal

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laser e, a seconda che possiedano o meno CD4, vengono deviate da una parte o dallaltra.
A questo punto la macchina calcola quanti CD4 e quanti CD8 sono presenti.
In genere nel sangue periferico di un individuo sano il rapporto tra CD4 e CD8 di 2:1, quando questo
rapporto comincia a scendere significa che i CD4 diminuiscono.
Il numero di queste cellule nel sangue periferico indice della progressione dellinfezione:

-Durante le prime fasi (infezione parainfluenzale) il numero superiore a 1000 cellule/ l. Il virus ne
causa una diminuzione progressiva, ma fino alla soglia di 500 cellule/ l NON determina
immunodeficienza.
-Nel giro di poche settimane il n di CD4 risale poich vengono prodotte nuove cellule, ma nel corso
dei mesi diminuisce nuovamente e quando si arrivano ad avere meno di 500 cellule/l si ha la fase
sintomatica.
-Il numero diminuisce ulteriormente fino ad arrivare alla soglia di 200 cellule/l , oltre la quale si ha
lAIDS conclamato . A quel punto lindividuo non pi in grado di rispondere a nessun tipo di
patogeno.
Naturalmente questa finestra pu durare alcuni mesi fino a dieci anni, allinizio molti pazienti
morivano presto, mentre adesso questa lasso di tempo si allungato moltissimo grazie a nuovi
farmaci che aggrediscono il virus.

Ci sono terapie costituite da cocktail di proteasi che tagliano l RNA virale e vengono somministrate ai
pazienti sieropositivi, permettendo loro di sopravvivere addirittura 10-20 anni in pi.
Nei paesi Occidentali questi farmaci sono somministrati dal sistema nazionale ed possibile controllare
abbastanza bene il virus dal punto di vista clinico, mentre nei paesi Africani, dove il virus ha infettato milioni
di persone, non ci sono i soldi necessari per questo tipo di terapie.

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Unaltra cosa interessante da notare la risposta immunitaria anticorpale al virus.
Per farlo osserviamo la viremia (viral load), che varia anchessa seconda delle varie fasi dellinfezione, e gli
anticorpi presenti nel siero.
Nei primi due mesi si ha un picco viremico, che si abbassa per via del fatto che il sistema immunitario riesce
ad eliminare parte dei virus attraverso i linfociti T citotossici.
In seguito linfezione diventa cronica e si ha una oscillazione della carica virale(non visibile in questo grafico)
dovuta al fatto che in questa fase, che pu durare fino a 12-13 anni, vi ancora un numero sufficiente di
CD4 e il sistema immunitario in grado di controllare il virus. Quando questo controllo viene perso la
viremia sale di molto per 2-3 anni fino ad arrivare a livelli massimali nellultima fase.
Il primo tipo di risposta data dal sistema immunitario la generazione CTL specifici contro lHIV, in seguito
vengono generati anticorpi contro proteine delenvelope, che sono in genere sempre alti, e anticorpi contro
una proteina del core chiamata p24.

VACCINI CONTRO LHIV

Sono circa ventanni che si effettuano ricerche in questo ambito, ma attualmente i risultati sono ancora
molto deludenti.
Vi sono varie problematiche:
1) il virus super mutante (come avviene per il virus influenzale), quindi non si sono ancora identificati degli
epitopi stabili contro cui generare una risposta immunitaria molto massiccia;
2)mancano dei modelli animali duttili, facili da studiare: il topo (animale piccolo e poco costoso) non si
infetta col virus dellHIV poich questo ha un tropismo selettivo per gli umani, perci occorre passare ai
primati, ma questi sono molto costosi, richiedono molto spazio e in pi alcuni di essi, come lo scimpanz,
non si infettano col virus, mentre altri possono essere infettati da dei virus dellimmunodeficienza della
scimmia, ma questi non determinano lo stesso quadro patologico osservabile nelluomo;
3) una volta trovato il vaccino non si saprebbe comunque come provarlo e su chi, dato che non facile
trovare volontari che si vogliano vaccinare contro il virus attenuato dellHIV.

IMMUNOLOGIA DEI TUMORI

Il discorso sui tumori in immunologia molto vasto, occorre ricordare soltanto che col termine tumore ci si
riferisce a situazioni patologiche, definite anche come cancro o come neoplasia, in cui si ha una
proliferazione incontrollata delle cellule, le quali non rispondo pi ai segnali di blocco del processo
proliferativo.

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Vi sono diversi tipi di tumori:
-solidi, cio che colpiscono determinati tessuti;
-leucemie, che colpiscono le cellule del sangue e quindi vanno in circolo.
Quando il tumore primario insorge a livello di alcuni organi (polmone, fegato, pancreas, ovaio,
mammella,ecc) spesso si pu intervenire dal punto di vista chirurgico ed eliminarlo, ma il tumore pu
recidivare e pu insorgere nuovamente nello stesso punto. Il problema maggiore dato dalle metastasi, che
originano da cellule provenienti dal tumore primario che raggiungo i vasi sanguigni e colonizzano altri
organi. In genere sono proprio le metastasi a causare la morte del paziente.

Vi sono diversi tipi di tumori e la nomenclatura molto variegata. Ad esempio ve ne sono alcuni definiti:
-sarcomi, che derivano dal mesoderma e quindi colpiscono losso, il tessuto adiposo, i fibroblasti, ecc..
(come ad esempio il sarcoma di Kaposi citato prima);
-carcinomi, tumori che derivano dallendoderma o dallectoderma e che quindi colpiscono la cute, le
ghiandole, gli epiteli,ecc
-tumori di cellule specializzate del sistema immunitario, tra cui:
Plasmacitomi (o mielomi), che derivano da una cellula B in stato di plasmacellula (che quindi che sta
producendo immunoglobuline). Vi una enorme proliferazione incontrollata di plasmacellule e
queste malattie sono devastanti. Ad esempio, nel mieloma multiplo ci sono diversi cloni di
plasmacellule che producono immunoglobuline e proliferano in maniera incontrollata tanto da
causare la distruzione del tessuto osseo.
Linfomi, che originano da tessuto linfoide secondario (linfociti T o B e loro precursori).
Generalmente il linfonodo che si gonfia e diventa molto grosso per via della proliferazione.
Leucemie, che colpiscono le cellule del sangue e sono di vari tipi a seconda che colpiscano la linea
mieloide o quella linfoide e che siano definite acute o croniche. Le acute insorgono violentemente e
sono molto devastanti, mentre le altre sono caratterizzate da una proliferazione molto pi lenta nel
tempo e da un quadro di malattia cronica che pu durare anche molti anni.
Vi sono inoltre i tumori indotti da virus, ritenuti interessanti dagli immunologi. Infatti se i virus inducono la
trasformazione tumorale, avranno degli antigeni che potranno essere considerati degli antigeni tumorali, i
quali possono essere dei bersagli per limmunoterapia.
Ci molto utile non solo per la cura, ma anche per la protezione dai tumori.
Esempio: vaccino per il Papilloma virus umano, causa di tumori al collo dellutero.

STUDIO DEI TUMORI

Si possono studiare le neoplasie attraverso la generazione di tumori che siano trapiantabili, ovvero che
possano essere prelevati da un paziente e trapiantati, ad esempio, in un topolino da esperimento.
Per costruire una linea cellulare tumorale si devono prelevare delle cellule dal tumore primario, impiantarle
in un topo nudo ( cio privo di cellule T) e aspettare che cresca. Una volta cresciuto lo si trapianta
nuovamente in altro topo e si ripete il passaggio per 3-4 volte. Alla fine queste cellule diventano immortali
e possono essere coltivate in vitro, congelate, scongelate ed eventualmente trapiantate anche in altri
animali. Senza questi passaggi,cio provando a coltivare il tumore direttamente in vitro, questo non
attecchisce.
Nella pratica medica adesso si usano anche i cosiddetti topi avatar, cio vengono prelevate delle cellule
dal tumore primario di un individuo e vengono impiantate in un topo nudo, che quindi diventa lavatar di
quel paziente. Una volta che cresce il tumore, questo topo viene sottoposto ad uno screening con migliaia
di farmaci che inibiscono vari pathway biochimici e si determina quale di questi siano selettivamente
utilizzabili per quel tumore. Dopo questo screening della durata di circa sei mesi si individuano uno o due
farmaci specifici con cui trattare il paziente. E una pratica molto costosa e, di conseguenza, ancora poco
diffusa.
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RELAZIONE TRA SISTEMA IMMUNITARIO E TUMORI

Nel corso della nostra vita le nostre cellule vanno incontro a mutazione molto sovente, ma vi un controllo
da parte del sistema immunitario in grado di bloccarle. Questo meccanismo comincia ad essere meno
funzionante col passare del tempo, perci quando invecchiamo molto pi facile che ci siano delle
insufficienze dal punto di vista del sistema immunitario.
Ci sono tante evidenze che fanno credere che si sia una immunosorveglianza del sistema immunitario sui
tumori, tra cui:
1)Sappiamo che stimolando il sistema immunitario attraverso citochine (come ad esempio IFN-) si pu far
aumentare il numero di molecole MHC di classe I sulla superficie delle cellule tumorali. Uno degli
escamotage che queste usano nei confronti del sistema immunitario appunto quello di nascondere lMHC
sulla superficie cellulare , analogamente ai patogeni, in modo da essere meno visibili. Se si misura
lespressione dei MHC I in un tumore in vivo si nota che molto inferiore a quella di un tessuto sano.
2) E possibile trovare un infiltrato leucocitario in una qualsiasi sezione di tumore in vivo prelevato con
biopsia e colorato con anticorpi opportuni. Sia i linfociti T (definiti i linfociti che infiltrato il tumore), sia
macrofagi, che i neutrofili si trovano spesso infiltrati tra le cellule tumorali, il che significa che tendiamo a
sviluppare una risposta immunitaria contro il tumore.
3) Nel siero dei pazienti si trovano tantissimi anticorpi diretti contro molti degli agenti associati ai tumori, il
che vuol dire che il sistema immunitario comincia a produrre anticorpi contro le cellule neoplastiche anche
molto precocemente, quando il tumore di piccolissime dimensioni.
4)Se si preleva del sangue di un paziente affetto da tumore, lo si utilizza per generare linfociti T citotossici in
vitro e, allo stesso tempo, si genera una linea cellulare dal tessuto colpita dalla trasformazione neoplastica,
si pu dimostrare che questi linfociti sono in grado di lisare le cellule autologhe del paziente in vitro.
In questo modo si dimostra che si possono generare linfociti T citotossici contro il tumore in vivo.
Questo apre tutta una discussione sul perch il sistema immunitario non sia per di proteggerci in via
definitiva contro il tumore, per cui spesso ci ammaliamo e soccombiamo alla malattia.

Ci sono vari tipi di interazioni tra il sistema immunitario e i tumori.


C una interazione iniziale, in cui il sistema immunitario sorveglia e blocca eventuali trasformazioni
neoplastiche, una interazione durante lo sviluppo e una quando il tumore si aggrava.
In questultimo caso spesso il sistema immunitario aiuta il tumore producendo fattori che ne favoriscono la
crescita.
Uno dei fenomeni che portano alla morte del paziente la cachessia, una sindrome in cui si ha perdita del
tessuto muscolare a causa allazione del TNF ( chiamato inizialmente cachessina).
Un altro fenomeno importante che si verifica la soppressione della risposta immunitaria al tumore da
parte di alcune cellule del sistema immunitario stesso. Ad esempio, i linfociti T regolatori bloccano la
risposta dei linfociti T effettori , mentre ci sono alcune sottopopolazioni di cellule mieloidi che diventano
delle cellule soppressorie.
Unaltra possibile interazione di tipo artificiale ed costituita dallimmunoterapia. Essa permette di
attivare il sistema immunitario tramite manovre mediche sia in maniera attiva (vaccinazione) che in
maniera passiva(trasferimento passivo di anticorpi o cellule del SI) per eliminare le cellule tumorali.

Gli immunologi nel corso degli anni si sono posti una serie di domande, alcune delle quali non hanno ancora
risposta. Non ancora molto chiaro se esista un controllo immunitario dei tumori, n se il sistema
immunitario controlli o favorisca lo sviluppo dei tumori oltre una certa dimensione (sappiamo che oltre 1-2
mm difficilmente vengono contrastati) o se sia possibile una vaccinazione terapeutica.

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APPROCCI STORICI ALLO STUDIO DEI TUMORI

A met degli anni 50 stata resa possibile la produzione dei topi inbred o singenici (ovvero topi aventi lo
stesso background genetico), molto utili per lo studio degli immunologi.
Per ottenerli si prende un topo selvatico (non utilizzabile per le ricerche immunologiche), lo si incrocia con
un fratello o un sorella e si ripete lo stesso con le dieci generazioni a venire.
Dopo questa serie di incroci i topi tendono ad avere lo stesso background genetico, quindi lo stesso HLA, ed
possibile effettuare dei trapianti di tessuti (e in particolare di tumori)senza avere allorisposta.
Se si facesse tra due topi selvatici il tumore verrebbe rigettato.
Grazie a questi topi singenici stato possibile condurre moltissimi esperimenti.

Esempio :si tratta un topo con metilcolantrene (un carcinogeno chimico), si aspetta che sviluppi un tumore
spontaneo e poi lo si espianta per farlo crescere in vivo e ottenere una linea cellulare.
Se si prende il topo singenico e vi si trasferisce il tumore indotto da metilcolantrene e poi si prendono le
cellule del topo originario e si sviluppano dei linfociti T citotossici nel topino che ha rigettato il tumore,
questo viene rigettato anche nel topo singenico.
Questo significa che linibizione del tumore su questo topo dovuta alla risposta immunitaria generata dai
linfociti T citotossici che noi trasferiamo e questi linfociti uccidono il tumore.
Ci vuol dire che il topo singenico sviluppa una risposta CTL che possiamo sfruttare che quindi possiamo
controllare il tumore.

Nella stessa maniera si possono fare delle vaccinazioni.


Se prendiamo il tumore che cresce in vitro, uccidiamo le cellule e immunizziamo il topolino, questo topo
dopo un po pu essere inoculato con le stesse cellule, ma il tumore non si sviluppa.
Ci significa che esistono degli antigeni in queste cellule tumorali che generano risposta immunitaria che
blocca il tumore.
Se invece si prende un topolino non vaccinato con le cellule morte e lo si inocula con le cellule vive, il
tumore si sviluppa.

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La conclusione di questi esperimenti che esistono degli antigeni tumorali riconosciuti dal sistema
immunitario che determinano una risposta, che possibile creare un vaccino contro il tumore e che
limmunit del tumore specifica per quegli antigeni.

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Immunologia - lezione 21 20-05-13- professor franco novelli

IMMUNO SORVEGLIANZA E IMMUNOTERAPIA

La scorsa volta sono stati analizzati degli esperimenti attraverso cui stato dimostrato lesistenza di
antigeni tumorali e in particolare modo la possibilit di creare delle vaccinazioni contro i tumori.
Il fatto che il sistema immunitario controlli il tumore messo in evidenza da una serie di evidenze indirette :

1) La biopsia, la sezione di un tumore primario che cresce in vivo (da un paziente o da un animale da
esperimento) molto facile attraverso listochimica poter mettere in evidenza come allinterno
delle cellule tumorali un diffuso infiltrato cellulare in cui vi sono linfociti t,macrofagi,neutrofili che
sono dentro il sito di crescita del tumore . oggi sappiamo che molti tumori, ad esempio il tumore
del retto, sono diagnosticati sulla base della qualit e della quantit dellinfiltrato di linfociti t.
Se il tumore contiene un infiltrato di linfociti t,della memoria,cd 4, cd 8 attivato questi pazienti sono
lungo sopravviventi e la prognosi buona.
Se linfiltrato scarso ,o fatto da cellule che sono immunodeviate dalla loro possibilit di reagire
contro il tumore, in genere la prognosi pi nefasta.
2) seconda evidenza il fenomeno dell iperplasia dei linfonodi. Nei linfonodi che drenano gli organi in
cui sta crescendo un tumore primario (ad esempio i linfonodi della testa del collo, del fegato, dei
polmoni) c uniperplasia.
Il linfonodo locale si gonfia perch c un arrivo cospicuo di cellule dendritiche che ,per esempio
,possono aver mangiato cellule tumorali andate incontro a apoptosi e , allinterno del linfonodo che
drena lorgano dove sta crescendo il tumore primario, quindi, vi un intensa attivit di
presentazione di antigeni tumorali ai linfociti t.
3) le citochine fanno aumentare lespressione di molecole mhc. Una delle strategie del tumore per
scappare dal sistema immunitario ,invece,quella di fare abbassare lespressione delle molecole di
istocompatibilit.

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Le citochine e in particolare modo gli interferoni ,TNF, rilasciate dalle cellule del sistema immunitario
hanno la capacit di fare aumentare lespressione di molecole mhc e quindi di rendere i peptidi tumorali
antigenici pi visibili al sistema immunitario.
Le citochine aumentano le molecole di adesione a livello dei leucociti e anche a livello del tumore.
Questo rende possibile un dialogo pi fitto tra il tumore e le cellule del sistema immunitario ; ci favorisce il
riconoscimento e lazione immunologica.

TEORIA DELLIMMUNOSORVEGLIANZA PRESUPPOSTI E EVIDENZE CONTRARIE

Queste evidenze hanno portato in torno agli anni 50 a elaborare la teoria dellimmunosorveglianza, una
teoria che sostiene che il sistema immunitario in grado di controllare i tumori, linsorgenza dei tumori
attraverso cellule dellimmunit innata e adattiva che sopprimono i tumori che insorgono.
Quindi quando il tumore relativamente piccolo il sistema immunitario lo controlla e lo sopprime.
Il sistema immunitario concorre anche nel modulare il tumore nel senso che anche se abbiamo un tumore
che cresce molto intensamente in una prima fase viene ridotto dallazione del sistema immunitario.
Il tumore tuttavia pu cambiare e dare alcune varianti che possono non riuscire a essere pi contrastate dal
sistema immunitario.
Questa insorgenza di varianti da parte del tumore resa possibile dallazione dellinterferone gamma che in
qualche maniera scolpisce il tumore eliminando tutta una serie di varianti in genere molto immunogeniche.
Questa pressione selettiva del tumore fa emergere varianti meno immunogeniche che sono viste male dal
sistema immunitario e quindi non adeguatamente contrastate con il passare del tempo.

I presupposti di questa teoria sono :

1)I tumori derivano da cellule normali attraverso mutazioni a livello del DNA che determinano la
produzione di proteine anomale. Queste protenie non sono self e vengono montati peptidi che il nostro
sistema immunitario riconosce come non self, generando una risposta immunitaria che grazie allazione
dei citotossici uccide le cellule neoplastiche.
2)Le cellule neoplastiche sono antigenicamente diverse dalle cellule normali da cui derivano (ad
esempio una cellula epiteliale che subisce una mutazione a livello del DNA nel suo corredo antigenico)e
questi antigeni diversi possono essere visti dal sistema immunitario.
3)Lincidenza dei tumori aumenta con let. Con let si determinano dei buchi nel repertorio del
sistema immunitario ,in quanto, i linfociti sono proni allapoptosi; molti di essi quindi nel corso della
vita vengono persi e ci facilita linsorgenza dei tumori con il passare degli anni.
4)Lincidenza dei tumori aumenta in pazienti immunodeficienti che sono quelli che si ammalano di HIV
che hanno una completa messa fuorigioco dellimmunit innata(dei linfociti t) e ci rende possibile
linsorgenza di tumori molto rari come il sarcoma di Kaposi o altri linfomi.
Pazienti trapiantati e trattati cronicamente con immunodepressivi (per bloccare la risposta T) hanno
pi possibilit di incombere in vari tipi di tumore. Pazienti che soffrono in modo grave di artride
reumatoide vengono trattati con farmaci come il cortisone che, alla lunga ,induce immunosoppressione
favorendo la comparsa di tumori.
Quadri di immunosoprressione fanno aumentare il rischio di insorgenza di tumori e quindi ci conferma
che il sistema immunitario controlla linsorgenza dei tumori.

Ci sono anche evidenze contro questa teoria:

1)Spesso la carcinogenesi un evento multifasico non necessariamente dovuto a una singola


mutazione. Ad esempio nel del tumore del pancreas sono richieste successive mutazioni che avvengono
nel corso di anni(anche 10) e spesso la prima mutazione non induce un immediata trasformazione
neoplastica. Inizialmente si hanno anomalie del comportamento delle cellule ma sono lesioni
preneoplastiche e queste devono accumularsi nel corso del tempo per dare origine a un fenotipo
neoplastico. Non quello che pensavano gli immunologi 50 anni fa.

194 di 213
2)Lesistenza di antigeni tumore specifico piuttosto discussa in quanto gli immunologi non hanno
mai, o comunque con difficolt, individuato un antigene che esclusivamente espresso sulle cellule
tumorali.
In genere si hanno antigeni tumore associato, come quelli che sono espressi durante lembriogenesi e, che
nei tessuti normali, normalmente sono repressi ma vengono riespressi in caso di tumore.
Ci sono anche antigeni associati ai virus perch sono i virus che trasformano una cellula e quindi lantigene
tumorale diventa di per s un antigene. Non si mai riusciti a identificare un antigene che sia
esclusivamente espresso sulle cellule tumorali e non su quelle normali.
Spesso gli antigeni che possono essere bersaglio delle terapie antitumorali sono bersaglio perch espressi
in quantit maggiore rispetto alle cellule normali(nelle cellule normali sono espresse in bassa quantit nelle
tumorali invece alta espressione).
3)esistono tumori infantili non spiegabili con questa teoria. Per esempio esistono forme di tumori
del sistema nervoso come il glioblastoma che colpiscono i bambini nei primi anni di vita oppure
leucemie infantili non spiegabili con la teoria dellimmunosorveglianza.
4) topi nudi di laboratorio che non possiedono timo,linfociti t non necessariamente si ammalano di
tumore, in quanto presentano meccanismi di compensazione, come ad esempio il possedere i
linfociti b che gli permettono di sopravvivere come topi immunocompetenti.
Un fatto simile stato osservato in alcuni casi in pazienti immunodeficienti che vivono per molti anni senza
ammalarsi di tumore( esempio quasi tutti i pazienti con sindrome di Digeorge).
Ci sono teorie a favore e contrarie.

ANTIGENI TUMORALI

Gli immunologi
in questi anni
stanno cercando
di individuare
antigeni tumorali
attraverso cui
bersagliare il
tumore (cio
scatenare una
risposta
immunitaria nei
confronti del
tumore).
Esistono due tipi
di antigeni
tumorali :

1) TSA: antigeni
tumore specifico
cio antigeni che
non sono cos
frequenti e la cui espressione ristretta alle sole cellule tumorali.
2)Antigeni tumore associati cio antigeni che sono anche espressi da cellule normali. Esiste quindi
una tolleranza nei loro confronti ,in genere di tipo centrale, mentre invece nei confronti dei TSA
non esiste tolleranza in quanto una volta che insorgono non sono visti nel timo durante
leducazione timica e quindi viene generata una risposta immunitaria nei loro confronti.
Gli antigeni tumore associati sono antigeni self, dove esiste una tolleranza a livello centrale.

Per dimostrare lesistenza di questi antigeni esistono due approcci sperimentali:

195 di 213
1)Dimostrare che esistono degli antigeni che siano effettivamente riconosciuti dai linfociti t( in
genere cd8 ma anche dai cd4).
2)dimostrare che degli antigeni inducono una risposta anticorpale nel paziente con tumore.

Entrambi questi approcci sono stati utilizzati in questi anni per identificare antigeni,che poi sono serviti per
elaborare terapie vaccinali nei confronti dei tumori.
Per capire come gli antigeni inducano una risposta di tipo t si pu utilizzare un approccio classico; applicato
nel caso del melanoma (tumore della cute).
Quando un paziente viene sottoposto a intervento chirurgico, per la rimozione del melanoma, si pu
prelevare una biopsia del tumore e metterla in coltura in vitro.
A questo punto si possono coltivare in vitro le cellule tumorali facendole proliferare; quindi queste cellule
che hanno proliferato si possono poi usare per scopi sperimentali.
In questo modo si genera una linea cellulare che cresce in vitro.
In questo approccio, parallelamente, allo stesso paziente da cui sono state estratte le cellule di melanoma
(per generare una linea in vitro), viene prelevato del sangue venoso periferico da cui vengono separati i
linfociti T(cd8).
La separazione avviene attraverso una procedura che prevede una centrifugazione su gradiente di faicol ,
un polimero che determina un gradiente di concentrazione per cui le cellule con una certa densit come le
cellule mononucleate del sangue periferico formano un anello a met provetta.
I linfociti t vengono a questo
punto prelevati e viene fatta
una cocoltura cio vengono
mischiati i linfociti prelevati
dal paziente con le sue cellule
tumorali.
Questo determina il
riconoscimento,se esiste, delle
cellule tumorali da parte dei
linfociti cd 8 .
Si generano cos dei potenziali
linfociti t citotossici(CTL)
antimelanoma.
Nel sangue periferico sono
anche presenti macrofagi oltre
che precursori dei linfociti cd8,
che sono della memoria e
quindi hanno bisogno di meno
requisiti per potere essere
stimolati contro il tumore
(non hanno bisogno del
costimolo e delle cellule
dendritiche che fagocitano).
Quindi basta un poco di
stimolo fatto dai macrofagi e se ci sono i precursori questi si attivano e si mettono a proliferare.
Parallelamente dalla linea in vitro noi possiamo fare una libreria genica.
Utilizzando enzimi di restrinzione possiamo tagliare tutto il DNA della cellula e costruire quindi una libreria
genica.
Da questa libreria genica possiamo generare dei fibroblasti trasfettati con il dna tumorale attraverso il
processo di transfezione.
I fibroblasti contengono molecole di mhc 1 e quindi i peptidi codificati da tutti questi Cdna vengono
montati sulle molecole di mhc 1.

196 di 213
A questo punto i linfociti coltivati, generati da una cocoltura, tra i linfociti prelevati dal sangue venoso del
paziente e le cellule tumorali, vengono utilizzati per fare esperimenti di lisi mettendo a contatto i linfociti
(coltivati con il melanoma) con i fibroblasti transfettati con il dna della libreria genica.
Alcuni di questi fibroblasti esprimeranno degli antigeni sulla superficie cellulare che saranno il prodotto dei
geni transfettati dalla libreria genica.
Se questi non vengono riconosciuti dai CTL non ci sar lisi. Se vengono riconosciuti si ha lisi.
Questi test di lisi sono fatti mettendo a contatto per 4 ore le cellule transfettate con i linfociti in presenza
di una soluzione di cromo radioattivo.
Se avviene la lisi i linfociti ammazzano le cellule che riconoscono e questultime muoiono. Viene rilasciato
nel sopranatante il cromo radioattivo e questo viene misurato attraverso un contatore di radiazioni.
Quindi il fibroblasto transfettato con lantigene, che stato riconosciuto dai linfociti ctl, e che dar una
risposta positiva al test di citotossicit, render possibile, attraverso la sequenza genica del Cdna
transfettato ,risalire alla sequenza dellantigene transfettato e conoscere quale proteina ha generato
questa risposta. Questo un modo per poter identificare.

Un altro modo per


identificare antigeni
tumorali che generano
una risposta citotossica
sempre stato fatto nei
pazienti con melanoma.
In questo caso il tumore
primario prelevato alla
biopsia contiene mhc di
classe 1 con tanti
peptidi nelle tasche.
Utilizzando un acido,
lacido tricloroacetico
quindi possibile
staccare i peptidi dalle
tasche mhc di classe 1
ottenendo da 10 mila a
50 mila peptidi.
Parallelamente si genera
una coltura mista tra i
linfociti del paziente e le cellule del melanoma e in questo modo si generano CTL antimelanoma. Questi ctl
riconoscono delle APC su cui sono stati caricati i peptidi che sono stati eluiti.
Questi peptidi che sono stati separati tramite cromatografia si danno da mangiare alle apc in vitro .
Queste li mangiano e li espongono sulle mhc.
A questo punto si va a vedere se i linfociti citotossici generati riconoscono e lisano queste cellule caricate.
Quando si identifica lapc che porta il peptide che ha generato una risposta di lisi positiva allora, a questo
punto, il peptide pu essere identificato attraverso spettrometria di massa.
Lo spettrometro di massa una macchina che possiede un tubo di volo in cui la proteina che viene
ionizzata viene spinta e accelerata in questo tubo e lo spettrometro di massa misura il rapporto carica/
massa, e attraverso un database elabora tutti i possibili peptidi con quelle caratteristiche e fa una
predizione dei peptidi e quindi della proteina che stiamo analizzando.
In questo modo noi possiamo identificare degli antigeni con cui possiamo fare vaccini o anticorpi, stimolare
e bloccare funzioni.

Antigeni tumorali principali identificati fino a ora:

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1)antigeni che
originano da geni
cellulari normalmente
silenti. Esistono
famiglie di antigeni
identificati attraverso
lapproccio dei CTL
che sono antigeni che
non abbiamo espressi
sui tessuti normali ma
che sono espressi, per
esempio, solo
nellembrione.
Quando lembrione si
sviluppa questi geni
sono espressi ma
quando lembrione
completo questi
antigeni vengono
repressi. In alcune cellule (ad esempio nella cute) ,in seguito a trasformazione neoplastica ,questi
antigeni vengono riespressi e possono funzionare come antigeni tumorali.
Ad esempio la famiglia Mage 1 presente in alta percentuale nel 50% dei melanomi e nel 25 % dei
carcinomi della mammella.
Sono stati generati vaccini contro Mage 1 per curare questi due tipi di tumore.

2) ci sono geni codificati da oncogeni o da geni che sopprimono il tumore.


Quindi oncogeni che promuovono la trasformazione neoplastica, che controllano la proliferazione
cellulare come K-ras,c-myc ,che hanno un ruolo importante nella trasformazione tumorale.
Questi geni possono essere mutati codificando per delle proteine che funzionano da oncogeni.
Questi geni possono essere alterati oltre che da mutazioni anche da processi di delezione e
traslocazione a carico del dna che portano alla produzione di proteine mutate che sono viste dal
sistema immunitario come antigeni tumorali.

Fra gli oncogeni ricordiamo bcr abl che un antigene specifico del tumore in grado di indurre una risposta
immunitaria efficace contro tale antigene.

La stessa cosa avviene per i tumor soppressor gene cio per i geni che sopprimono i tumori come ad
esempio la P53 che mutata in circa il 50 % dei tumori umani, e quindi il tumore cresce, i loro prodotti in
genere sono inattivi per possono funzionare come antigeni tumorali.
Gli antigeni codificati da oncogeni e tumor suppressor gene sono proteine cellulari che vengono presentate
sul mhc di classe 1 ,attivando quindi, una risposta ctl.
Possono anche essere presentate su mhc di classe 2, perch le cellule tumorali che vanno incontro a
apoptosi possono essere fagocitate dalle cellule dendritiche, e poi questultime, possono presentare gli
antigeni ai linfociti cd4.

Alcuni esempi di questi antigeni sono:


1)P21-ras presente nel 10% dei carcinomi
2)BCR-ABL :Una proteina che il prodotto del riarrangiamento tra i geni del recettore delle cellule
B e il protoncogene abl che determina una proteina da 210 kDa molto espressa ( e responsabile)
nelle leucemie mieloidi croniche.
3) p53 che mutata, un tumor suppressor gene espressa nel 70% di tutti i tumori umani

198 di 213
Ci sono poi antigeni che sono codificati dal genoma di virus,detti trasformanti in quanto determinano la
trasformazione neoplastica ,in alcuni modelli animali ma anche nelluomo.
Questi antigeni possono essere visti dal sistema immunitario e sono in grado di indurre una risposta
immunitaria anche molto potente.

Esempi di questi
virus sono:

1)i
papomavirus(co
me quello del
polioma e il virus
SV40) e gli
adenovirus:
provocano
tumore in roditori
neonati oppure in
roditori adulti
immunodeficIenti
.
Questi virus
inducono tumore
e le loro
particolari
proteine possono
essere viste come
antigeni specifici di virus oncogeni.
2) Un altro virus a DNA che produce trasformazioni neoplastiche il virus dellEbstein Barr che
quello della mononucleosi infettiva.
LEBV un virus che a tropismo per i linfociti B ed quindi in grado di generare tumori come il
linfoma B o come il linfoma di Burkitt e un carcinoma nasofaringeo piuttosto aggressivo.
LEbstein barr virus viene usato in laboratorio per la sua capacit trasformante;in particolare viene
utilizzato per la sua capacit di immortalizzare i linfociti B (prendendo il sangue periferico, e
metterlo in contatto con virus EBV, dopo 10 giorni i linfociti cominciano a proliferare, e possono
essere utilizzati come linea cellulare. Questi linfociti possono essere coltivati direttamente in vitro.
Gli immunologi utilizzano queste linee EBV perch servono come sorgente autologa per poter
utilizzare come APC per i linfociti T).
3)Il papilloma virus un virus a dna che responsabile del carcinoma della cervice uterina.
Lo studio di questo virus, ha permesso di identificare alcuni serotipi( come HP 16), che vengono
usati per vaccinare, in senso protettivo ,le adolescenti contro il papilloma virus al fine di prevenire
linsorgenza del tumore della cervice uterina.

Anche virus a RNA possono determinare la produzione di antigeni (tumorali,ndr):

1) antigene SRC prodotto dal virus del sarcoma di Rous che oncogenico nei confronti di cellule di
uccelli (polli)
2) oncogene MYC che dentro a un virus a RNA che determina la mielocitomatosi degli uccelli
3) oncogene K-RAS che trasportato dal virus responsabile del sarcoma murino di Kirsten.
Trasporta loncogene K-ras che determina nelluomo il 95% dei tumori al pancreas, ad esempio.

Questi virus ( a RNA,ndr) determinano la comparsa del tumore in maniera molto rapida: entro poche
settimane dallinfezione.

199 di 213
Esistono altri retrovirus (virus a RNA) che provocano tumori molto lentamente e che non hanno un
oncogene allinterno del loro genoma. Essi si inseriscono vicino a promotori importanti che possono venire
sregolati provocando cos una trasformazione neoplastica.
Il virus dellepatite B e il virus dell epatite c,ad esempio, possono integrarsi nel genoma vicino a geni
importanti per la proliferazione e deregolare la proliferazione portando all insorgenza di tumori al fegato,
ad esempio.

Tra i virus a RNA che provocano tumori bisogna ricordare HTPL1(human t-cell lyphotrophic virus 1) cio un
virus tropico per le cellule t (un poco simile all HIV) che si integra nelle cellule T, determinando una forma
molto aggressiva di leucemia a carico dei linfociti CD4.

Ci sono antigeni
codificati da geni
tessuto specifici, come
per esempio la
tirosinasi, gp1000, mart
1 che sono antigeni
espressi sia sui
melanociti che sul
melanoma e la loro
espressone alterata
(alta espressione) pu
determinare una
risposta immunitaria
che pu venire sfruttata
dal sistema
immunitario.
Alcuni antigeni self sono
iperespressi nei tumori.
Questi antigeni self
sono tollerati dal sistema immunitario ma se la loro espressione si alza, questa tolleranza viene meno ,per
fenomeni come ad esempio lignoranza immunitaria, si rompe la tolleranza e si genera una risposta
immunitaria contro di essi.
Nel siero di pazienti con melanoma molto facile trovare anticorpi specifici contro questi antigeni.

Una risposta immunitaria pu anche essere indotta su antigeni glicolipidici e glicoproteici alterati.
Un esempio di questa tipologia sono le mucine che sono dei proteoglicani.
Nei tumori viene deregolata lattivit degli enzimi che sono deputati alla sintesi delle catene laterali
glicidiche delle mucine.
La mucina MUC1 un antigene tumorale che viene montata sulla parte apicale della membrana delle
cellule duttali mammarie.
A causa dellattivit deregolata degli enzimi che regolano le catene laterali, queste sono modificate e quindi
MUC1 tumorale, molto diversa da quella espressa nella mammella normale, a causa della differenza delle
catene laterale.
Questa modificazione fa si che si formino nuovi epitopi a carico delle catene laterali. Ci viene visto come
una differenza antigenica da parte del sistema immunitario.

Antigeni tumore associati possono anche essere considerati gli antigeni quelli definiti di differenziazione:
la molecola CD10, presente nelle cellule ematopoietiche in alcuni stati di differenziazione. le cellule B ,ad
esempio, che passano da pre B a pro B o a cellule immature esprimono cd 10, che pu funzionare come
antigene tumore associato.
Le stesse immunoglobuline presenti sulla superficie delle cellule trasformate in una leucemia o in un
linfoma B possono funzionare da antigeni tumore associato.

200 di 213
Tutti una serie di vaccini contro il tumore delle cellule B sono stati generati attraverso le generazione di
anticorpi anti idiotipo.
Quindi questi si chiameranno vaccini idiotipici in quanto diretti contro lidiotipo delle immunoglobuline
montate sulla superficie delle cellule tumorali.
Lo stesso TCR (recettore delle cellule T) di una leucemia T CD4 pu essere considerato un antigene tumore
specifico [ ndr: secondo me associato ma riporto le parole del professore].

Poi ci sono antigeni che sono soprattutto riconosciuti da anticorpi.


E quindi possibile individuare altri antigeni tumorali che sono quelli che determinano una risposta di tipo B.
Alcuni di questi sono stati fatti attraverso limmunizzazione xeno genica.
In questa tecnica si
immunizza un
topolino con cellule
tumorali umane e
questi antigeni
possono indurre
delle risposte
anticorpali.
Attraverso la
caratterizzazione
degli anticorpi, si
possono poi
identificare degli
antigeni che sono
molto utili non tanto
per curare i tumori
ma quanto per la
diagnosi e in parte
anche per la terapia.
Esistono tutta una
serie di antigeni
oncofetali contro cui possibile generare anticorpi sia policlonali che monoclonali. Questi sono importanti
perch questi antigeni sono espressi durane la vita fetale e in questo periodo non sono antigenici.
Nei tessuti normali la loro espressione sempre molto bassa anche se pu aumentare in caso di fenomeni
infiammatori.
Durante la progressione neoplastica lespressione degli antigeni pu aumentare. Questo ci permette di
utilizzare gli anticorpi contro quellantigene per seguire la progressione di un tumore e valutare se un
tumore progredisce o regredisce ,in seguito a trattamento terapeutico (come chemioterapia), sfruttando la
presenza di questi marcatori.
Un classico antigene di questo tipo lalfa feto proteina che una proteina sintetizzata dal fegato fetale ,
durante lembriogenesi, e serve a rimpiazzare lalbumina.
Quando lindividuo formato e inizia a produrre albumina , lalfafetoproteina non viene pi prodotta.
Questa alfa feto proteina molto aumentata nel carcinoma epatocellulare, in molto carcinomi gastrici, nel
tumore del pancreas e nei tumori della linea germinale.
Attraverso gli anticorpi si pu monitorare la progressione di questi tumori andando a monitorare
lespressione dellalfa feto proteina.
Il grosso problema di queste monitorazioni, che alcuni fenomeni infiammatori fanno aumentare
lespressione di alfa feto proteina.
Ci sono, ad esempio , pazienti con cirrosi epatica che avranno elevati livelli di alfa feto proteina ma tale
dato non ci indica che ci sia una progressione tumorale a livello epatico.
Non abbiamo una funzione diagnostica, ma soprattutto abbiamo una funzione prognostica.
La stessa funzione posseduta dagli antigeni carcino embrionali come il CEA che pu essere sia rilasciato
(secreto, solubile) sia montato sulla membrana.

201 di 213
Lo si trova a livello della membrana di alcuni organi come lintestino, il fegato , il pancreas.(ndr:fetali)
Anche il CEA viene utilizzato come marcatore della progressione tumorale.
Il CEA viene prodotto nei primi sei mesi di gravidanza e nelladulto lo troviamo solo a livello della mucosa
del colon e nella mammella durante lallattamento. Il CEA un altro marcatore cellulare per valutare la
progressione del tumore.
Il CEA stato utilizzato per generare vaccini contro il pancreas perch si visto che immunizzando contro il
CEA si ottiene sia una risposta di tipo anticorpale che di linfociti (t).

MODALIT DI VISIONE ANTIGENI E RICONOSCIMENTO DI QUESTI DA PARTE DEL SISTEMA IMMUNITARIO

La prima modalit con


cui gli antigeni
vengono visti la
modalit diretta in cui
a causa di una
trasformazione
neoplastica o a causa
di una infezione virale
( con relativa
produzione di proteina
virale) ,
Si ha la produzione di
una proteina alterata
che finisce nel
proteasoma, dove
verranno generati
tanti peptidi antigenici
,che verranno caricati
attraverso Tap 1 o Tap
2 nel RER e saranno
infine montati su
molecole MHC 1.
Quindi le proteine alterate, attraverso presentazione diretta, vengono presentati su MHC di classe 1.
La seconda modalit di presentazione degli antigeni definita indiretta, in cui antigeni rilasciati da cellule
vive ,attraverso produzione e secrezione oppure rilasciate da cellule tumorali andate incontro a processo
apoptotico ,sono captate da APC professioniste(soprattutto cellule dendritiche e macrofagi attivati) e
presentate su MHC di classe 2 e
venendo poi riconosciute dai
linfociti cd4.

Il sistema immunitario riconosce gli


antigeni tumorali attraverso diversi
meccanismi:

1)i linfociti T che hanno un


determinato repertorio allinterno
dellorganismo e possono
riconoscere alcuni di questi
antigeni e generare dei precursori.
facile dimostrare che i linfociti t
possono riconoscere antigeni tumorali.
Possiamo ,ad esempio, prendere cellule tumorali di un tumore primario e coltivarle con dei linfociti
T dello stesso paziente ottenendo, tutta una serie di attivazioni dei linfociti Tche si possono mettere

202 di 213
in evidenza attraverso differenti strumenti che mettono in evidenza, come sia possibile stimolare in
vitro la proliferazione dei linfociti T contro antigeni tumorali.
Lattivazione dei T contro questi antigeni dipende molto da tutta una serie di molecole che tengono
stretti i contatti tra i T e le cellule che esprimono lantigene.
Per esempio se un tumore possiede molte molecole dadesione sulla superficie cellulare, il
contatto con le cellule T pu essere favorito e i linfociti T possono riconoscere degli antigeni
espressi a livello di queste cellule tumorali.
Stiamo parlando di T effettori che sono gi stati attivati contro lantigene e possono ,attraverso le
molecole di adesione, essere favoriti nel riconoscere gli antigeni sulle cellule tumorali.
I linfociti T in vivo possono accumularsi nel sito di crescita tumorale e questo avviene in genere
grazie anche al rilascio di chemochine che vengono prodotte dal tumore e nel microambiente
creano un sistema di gradiente chemiotattico che attrae i linfociti T nel sito di crescita.
Questa capacit di accumulo dei linfociti T nel sito di crescita tumorale molto importante perch
studiando questi infiltrati noi possiamo avere molte informazioni sul tipo di risposta immunitaria
che possiamo ottenere.
curioso osservare che il microambiente, che si genera quando cresce il tumore, composto non
solo dalle cellule tumorali ma anche da tutte le cellule che fanno parte dellambiente in cui il
tumore cresce, come ad esempio fibroblasti associati alle cellule tumorali. Questi possono
secernere sostanze che attirano i linfociti T e li guidano nella loro differenziazione. In alcuni casi
possiamo avere una differenziazione che favorisce le funzioni effettrici delle cellule T e quindi la lisi
del tumore, mentre in altri casi il microambiente tumorale pu favorire la differenziazione verso
un fenotipo delle cellule T meno effettore addirittura di tipo regolatorio con il blocco della risposta
T e la paralisi della risposta immunitaria.

2) le NK sono un altro tipo di cellule che riconoscono i tumori e hanno una naturale attivit
antitumorale, e riescono a riconoscere e uccidere cellule tumorali .
Le NK sono importanti nel controllo delle metastasi(effetto anti metastatico)soprattutto in tessuti
,come fegato e polmone,in cui sono molto abbondanti.
Se si eliminano le NK da un topolino di laboratorio attraverso un particolare antisiero che le
riconosce no nK oppure si usano i topi beige (che non hanno,geneticamente,cellule NK), in caso
di inoculo di un tumore ,ad esempio nel sottocutaneo, si osserva la crescita del tumore nel punto di
inoculo ma rapidamente questo metastatizza(in maniera pesante) nel fegato e nei polmoni.

3)I linfociti B riconoscono il tumore.


Il 30-50% dei pazienti con tumore posseggono anticorpi contro molti antigeni( sia conosciuti sia che
si pu caratterizzare)tumorali.
Si possono identificare facilmente anticorpi contro antigeni classici oppure si pu partire dal siero
dei pazienti con un determinato tumore, per andare a scoprire gli antigeni tumorali presenti,
partendo dagli anticorpi presenti nel suo siero. Questo processo da anticorpo a antigene permette
di caratterizzare gli antigeni associati a un determinato tumore.

Le cellule Nk,i linfociti T e i B sono responsabili delleliminazione del tumore.


I linfociti T portano alleliminazione del tumore attraverso linduzione di una risposta CD8 oppure
attraverso una risposta CD 4 che crea infiammazione e mette in moto i linfociti B che possono produrre
anticorpi che possono legare antigeni tumorali e scatenare una risposta citotossica dipendente sia dalle NK
sia dal complemento.
Le NK possono legare la cellula tumorale sia attraverso il riconoscimento dellantigene sia attivare una
citotossicit anticorpo dipendente che permette leliminazione delle cellule tumorali.
Il tumore viene contrastato quando di dimensioni molto piccole (micro metastasi,micro tumore viene
efficacemente contrastato) ma quando cresce molto il sistema immunitario non pi in grado di rigettarlo
e quindi avvengono tutta una serie di meccanismi che portano alla sopraffazione del sistema immunitario
del paziente da parte del tumore che non viene pi controllato.

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FASI DELLIMMUNOSORVEGLIANZA

La teoria dell immunosorveglianza prevede tre fasi:

la prima la fase di eliminazione:il sistema immunitario elimina il tumore.


Quando il tumore piccolo esprime antigeni molto immunogenici e il sistema immunitario genera una
risposta immunitaria molto efficace eliminando le cellule tumorali.
Il tumore tuttavia continua a crescere, e genera varianti genetiche , muta ancora,che possono essere meno
immunogeniche (anche perch quelle immunogeniche sono quasi tutte eliminate dal tumore), rimangono
quelle meno immunogeniche e queste cominciano crescere.
Ci, non succede subito in quanto c una fase di equilibrio in cui il tumore dormiente, essendo
contrastato dal sistema immunitario. In questa fase non cresce progressivamente ma rimane in uno stato
di equilibrio con il sistema immunitario.
Dopo la fase di equilibrio(che pu essere pi o meno lunga) c la fase di fuga(escape) dal sistema
immunitario e il tumore cresce e non riesce pi a essere contrastato dal SI, innesca una serie di meccanismi
e vince la battaglia.
Ci sono dei
meccanismi guidati
dal tumore che
sono responsabili
della fuga del
tumore dal sistema
immunitario :

1) il tumore riesce
in molte condizioni
a non esprimere il
peptide antigenico
perch o sintetizza
il peptide anti
genico in quantit
non cos elevate o
specialmente
perch incomincia
a diminuire
lespressione di
molecole HLA 1.
Questi geni HLA A,B,C vengono ,quindi, a essere meno espressi sulla membrana cellulare e il
peptide di conseguenza viene espresso meno e il sistema immunitario lo vede molto male.

2)nel tumore molto spesso muta il macchinario responsabile della presentazione antigenica su
classe 1: le proteine tap e tutta una serie di altre proteine ,che stanno nel reticolo, e che
contribuiscono alla presentazione vengono sintetizzate male o poco. Il sitema immunitario non
riesce a montare i peptidi antigenici su molecole di classe 1.
Questo tipico di un tumore che sta crescendo in maniera forte.

3)il tumore normalmente non possiede molecole costimolatorie.


Quando i linfociti T attivati riconoscono un tumore devono interagire con MHC di classe 1 ma
lefficacia di questa reazione e la sua persistenza nel tempo sono funzione della costimolazione
antigenica(realizzata attraverso CD28,B7).

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Questo implica quindi che i T non riescono a scatenare una risposta contro lantigene perch il
tumore non esprime molecole costimolatorie e il tumore riesce quindi a proliferare evitando la risposta
immunitaria.
4)alterazioni nei processi di presentazione dell antigene:
Pu venire meno la capacit di tap 1 di caricare antigeni oppure pu venire meno la capacit
delle molecole chaperonine di accompagnare la sintesi di mhc 1 in modo appropriato. Queste
alterazioni portano alla proliferazione del tumore.
5)il tumore produce dei fattori immunosoppressivi come ad esempio il TGF beta che una
citochina soppressoria che blocca lattivit dei linfociti T.
il TGF beta fa differenziare i T in T regolatori e quindi , un linfocita T che riconosce l antigene
tumorale in presenza di TGF beta pu diventare un T regolatorio e sopprimere cos la risposta di
altri linfociti T.
I tumori producono anche interleuchina 10 che una citochina che blocca le cellule che presentano
lantigene nella loro capacit di presentare lantigene stesso.
IL 10 non fa pi esprimere le molecole MHC di classe 1 e quindi IL 10 una citochina soppressoria
che pu essere prodotta dai tumori e generare un blocco della risposta.
6) i tumori riescono a creare un sistema immunoprivilegiato anche attraverso lespressione sulla
superficie cellulare di un ligando di Fas. Questo in grado di interagire con il recettore FAS
presente sui linfociti attivati ,nei linfonodi, e diretti contro lantigene portando alla morte per
apoptosi del linfocita in seguito a contatto con il tumore(contatto FAS-FASL).

A sua volta il sistema immunitario pu non essere in grado di reagire contro il tumore per vari fenomeni :

1) induzione dellanergia: un T attivato in assenza,per esempio, di opportune molecole


costimolatorie pu rispondere a un antigene tumorale diventando anergico
2) ignoranza immunologica :un peptide pu essere cos poco espresso in condizioni di mancata
presentazione di molecole MHC da diventare ignorato
3) le cellule T che infiltrano i tumori primari hanno dei difetti nella trasduzione del segnale e
quindi si attivano male ( molto facile da trovare sperimentalmente). Come gi dimostrato alla
fine degli anni 80, i linfociti T che infiltrano il tumore hanno la catena zeta che non viene
fosforilata . Questi linfociti ,quindi ,entrano in contatto con lantigene tumorale e non si ha la
fosforilazione della catena zeta e quindi viene bloccato il processo di attivazione del linfociti T.
4) I linfociti possono essere bloccati funzionalmente,sequestrati fisicamente e attraverso
particolari segnali e molecole si pu indurre lapoptosi dei linfociti. Quindi questi linfociti che
arrivano nella massa neoplastica possono venire sequestrati e possono essere indotti al blocco
funzionale dalle molecole prodotte dal tumore.
5) I tumori possono alterare lespressione delle molecole di adesione (come ad esempio il CD 28)
e quindi, impedire alle cellule T di funzionare propriamente e di penetrare profondamente nel
tumore. (da domanda : il tumore agisce sulle APC dove viene alterata la produzione di molecole
di adesione, il tumore rilascia fattori che per esempio diminuiscono il B7).
6) I tumori inducono dei linfociti tumore specifici ,dei precursori, che hanno per una bassa
frequenza (non sono numerosi) e quindi non si riescono a determinare mai una risposta
potente nei confronti del tumore. Gli antigeni quindi inducono questa risposta in maniera
naturale ma la frequenza talmente bassa che questi linfociti non possono eliminare il tumore.
Durante una vaccinazione si pu fare aumentare la frequenza di questi precursori T tumore
specifici attraverso una vaccinazione specifica contro un determinato antigene.
7) La presenza di T regolatori favorisce la crescita dei tumori. In moltissimi tumori umani e
sperimentali possibile fotografare la presenza di T regolatori dentro il tumore. La presenza di
questi T regolatori blocca, frustra, funzionalmente lattivit dei CTL( facilmente dimostrabile).
In una biopsia di carcinoma pancreatico si possono studiare i linfociti che infiltrano il tumore.
Nella mucosa sana (fuori dallarea tumorale) sono presenti TH1 e TH 17 capaci di attivit
citotossica,nella zona pi vicina al tumore troviamo TH 2 che producono caratteristiche
interleuchine e nella zona dentro al tumore troviamo TH 1 ,CTL e una marea di T regolatori che

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sono specifici per gli stessi antigeni dei TH 1, ma avendo unaffinit maggiore, bloccano tutta la
loro attivit citotossica ; quindi il tumore non viene eliminato.

Ci sono tutte una serie si strategie terapeutiche mirate a sopprimere i linfociti T soppressori, in
quanto si visto, che eliminando questi, il sistema immunitario, riesce a eliminare ben le cellule
tumorali.

Una seconda popolazione di cellule del sistema immunitario che sopprime il tumore sono le cellule
mieloidi soppressorie che sono cellule di origine mieloide.
Queste non sono linfociti T ma sono cellule di origine mieloide che infiltrano il tumore e producono
enzimi come larginasi che agisce sul metabolismo del triptofano dei linfociti T,
eliminandolo e facendo cos in modo che i linfociti T, che sono molto sensibili al triptofano, non
riescano pi a proliferare e muoiano.
Le cellule mieloidi soppressorie sono tipiche di tutti i tumori molto aggressivi.
Le cellule mieloidi soppressorie sono quelle che mettono fuori uso i vaccini anti tumore; quindi gli
immunologi stanno cercando strade per eliminarli selettivamente.
Le cellule mieloidi soppressorie mettono fuori uso i vaccini antitumore perch anche se si attivano bene
i linfociti T le cellulle soppressorie paralizzano la risposta.
Si sta quindi cercando di realizzare dei vaccini che contemporaneamente attivino la risposta T e
blocchino le cellule soppressorie mieloidi e bloccano o eliminando anche le cellule regolatorie.

IMMUNOTERAPIA DEI TUMORI

Sulla base delle conoscenze sviluppate gli immunologi hanno messo in cantiere tutta una serie si
strategie che vanno sotto il nome di immunoterapia dei tumori.
Questa teoria dice che i tumori possono essere curati o contrastati attraverso manovre di tipo
immunologico.
Ci sono terapie sia di tipo attivo che di tipo passivo.
Per terapia di tipo attivo si intendono terapie che immunizzano il paziente e possono attivare il sistema
immunitario a sviluppare risposte anti tumorali.
Le terapie passive trasferiscono passivamente al paziente anticorpi o cellule immunitarie per cercare di
aggredire il
tumore.
Nellimmunoterapi
a passiva possiamo
usare almeno 3 tipi
di cellule con scopi
terapeutici:

-possiamo
trasferire CTL
specifici per un
determinato
antigene. Questo
possibile perch se
abbiamo un
tumore possiamo
coltivarlo con i
linfociti T dello
stesso individuo ed
possibile in vitro
generare linfociti T

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citotossici. Al momento sono disponibile moltissime proteine ricombinanti citochine che permettono di
aumentare il numero di questi CTL fino a farli di diventare miliardi.
Alla fine questi CTL dopo che sono stati espansi vengono rinfusi nel paziente.
le cellule che possiamo trasferire sono le cellule T(citotossiche) partendo dalle cellule che infiltrano la
massa tumorale, che possono essere estratte, coltivate in colture mediante citochine ricombinanti, farli
diventare milioni o miliardi e poi trasferite al paziente.
Questo modo di trasferire cellule citotossiche in maniera passiva al paziente stato fatto per la prima
volta da un chirurgo americano di nome Steve Rosenberg che a met degli anni 80 ha utilizzato le NK
(che sono dei killer naturali)..
Egli ha preso le NK e le ha coltivate in vitro con altissime dosi di interleuchina 2 facendo si che le NK si
differenziassero in LAK(Lymphokind activated killer cell), una volta diventate milioni o miliardi,le ha poi
riinserite nel paziente. Le LAK sono cellule che non esistono in vivo ma solo in vitro e sono molto
aggressive. Rosenberg ha utilizzato queste metodica in pazienti con carcinoma renale avanzato ,anche
metastatico ,e in circa la met dei casi le cellule LAK hanno fatto regredire molto le masse tumorali.
Per questo tipo di terapia ci sono parecchie controindicazioni e effetti collaterali. Alcuni
pazienti sono, infatti, morti in quanto luso di alte dosi di interleuchine scatena fenomeni che
possono anche essere di tipo autoimmunitario grave. Quindi questa non diventata una prassi
frequente ma ci permette di capire come citochine e linfociti autologhi (del paziente) possano essere
utilizzati per bersagliare il tumore.

Unaltra modalit quella di utilizzare anticorpi. Nelloncologia gli anticorpi sono diventati una pratica
diffusa.
Il tumore della mammella nei pazienti HERB2 positivi ad esempio, viene trattato con anticorpi
monoclonali specifici per questo antigene, molti linfomi sono inoltre trattati con molecole che
bersagliano la molecola Cd 5 o altre molecole specifiche dei linfociti B .
Questa quindi una pratica molto diffusa.
gli anticorpi possono essere usati in differenti modi nellimmunoterapia dei tumori :
1) possono essere utilizzati per coniugare delle immunotossine, molecole tossiche. In questo caso
abbiamo un anticorpo, diretto contro un antigene specifico, a cui stato coniugato un veleno
come la ricina o la tossina difterica, quindi si pu indirizzare, attraverso lanticorpo verso un
antigene specifico, la ricina o la tossina difterica su quella determinata cellula. In questo modo si
pu ottenere leliminazione specifica della cellula che esprime quel determinato antigene
attraverso lanticorpo specifico.
2) Si pu coniugare lanticorpo con un farmaco(un chemioterapico ad esempio) e fare cos arrivare il
farmaco direttamente nel punto in cui presente quellantigene, eliminando cos gli effetti
collaterali dei farmaci che uccidono cellule che non sono tumorali
3) Lanticorpo pu essere coniugato con dei radioisotopi come dei beta emittenti che emettono
radiazioni a corta distanza e ci permette di raggiungere e eliminare il tumore attraverso
lemissioni delle radiazioni con il radioisotopo. Gli anticorpi specifici coniugati con radioisotopi
sono usati anche in diagnostica in quanto possono essere utilizzati per eseguire un analisi fine
delle cellule tumorali.

Tale approccio ha per delle difficolt in quanto non tutti gli anticorpi , diretti contro antigeni, sono
specifici, in quanto alcuni di questi possono essere presenti sulle cellule normale e questo pu creare dei
problemi.
Un altro problema riguardante luso degli anticorpi il fatto che i fagociti attraverso i recettori per lFcR
rimuovono anticorpi e li fagocitano;
Questi anticorpi possono poi essere portati nel fegato e se sono coniugati con farmaci possono dare
fenomeni di tossicit epatica.
Un ulteriore controindicazione alluso di anticorpi, quella che se si usano anticorpi generati nel topo per
fare anticorpi contro i tumori umani questi generano una risposta anticorpale e vengono bloccati.
Per ovviare a questo problema bisogna cercare di fare un anticorpo umanizzato che abbia le parti variabili
contro lantigene e le parti comuni umane al fine di non indurre una risposta immunitaria contro il tumore.

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Ulteriore problema che se si targetta ,con un anticorpo un antigene che non essenziale per la
riproduzione della cellula tumorale non si causa la morte di questultima ma si pu andare a selezionare un
clone di tumori che crescono meglio, si pu creare una selezione dei tumori non esprimono il mio antigene
ma che crescono pi aggressivamente.
Al fine di ovviare questa deriva, questo escape si pu curare attraverso pi anticorpi che sono diretti contro
molti antigeni.
Esistono poi anticorpi contro tutta una serie di molecole che vengono utilizzati soprattutto in ematologia .
Questi anticorpi sono non coniugati e vengono utilizzati per bersagliare le cellule tumorali.
Tra questi abbiamo:
1) anticorpi contro il cd 19 (tipica molecola dei linfociti b) utilizzata in caso di leucemia B
2) anticorpi contro cd 22 anchessa tipicamente espressa dai B e questi anticorpi bersagliano i
linfociti B neoplastici favorendone la loro eliminazione
3) anticorpi contro catena alfa del recettore dellinterleuchina 2 usati nel caso di leucemie T.

Questi anticorpi non coniugati funzionano bene e generano un meccanismo di citotossicit anticorpo
dipendente che fa eliminare le cellule tumorali.
Linterleuchina 2 pu anche essere usata come veicolo per coniugare tossine per quanto riguarda le
leucemie T ma questo approccio ha avuto dei risultati non particolarmente eclatanti.
Si possono anche usare, per limmunoterapia passiva anticorpi anti idiotipo.
Questi anticorpi possono essere generati nei conigli immunizzandoli contro delle cellule B umane per
generare degli anticorpi.
Questi sieri vengono poi depletati attraverso la metodica dell adsorbimento di reattivit contro le
immunoglobuline umane realizzando anticorpi anti idiotipo,che si possono utilizzare in vivo, scatenando
attraverso questo anticorpo dei meccanismi di lisi mediati dal complemento o mediante riconoscimento
cellulare .
Questi approcci hanno la controindicazione che il BCR pu mutare( anche normalmente) e quindi un clone
che esprime un determinato BCR leucemico pu mutare ,e quindi variare idiotipo, e ci fa si che lidiotipo
possa non essere pi riconosciuto dallo specifico anticorpo anti idiotipo, e bisogna farne un altro .

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IMMUNOTERAPIA ATTIVA
E un insieme di procedure atte a stimolare il Sistema Immunitario a reagire nei confronti dei tumori.
Abbiamo due metodologie distinte:

STRATEGIA ASPECIFICA: indipendente da un antigene specifico; alcuni microrganismi modificati


della tubercolosi (il nome non lho capito) possono indurre una reazione infiammatoria che in alcuni casi
pu far regredire il tumore. Pazienti con infezioni batteriche aventi un tumore hanno talvolta beneficiato di
una regressione tumorale: utilizzando queste sostanze batteriche (es.: estratto di micobatterio, che ha una
potente azione attivatoria nei confronti della risposta macrofagica e dei Th-1) la risposta aspecifica dei Th-1
produce IFN, utile alla regressione tumorale. Lo stimolo del Sistema Immunitario induce attivazione dei
macrofagi, delle cellule dendritiche e di ormoni timici. Questi ultimi hanno unazione a livello del timo,
inducono lo sviluppo dei linfociti T e ne inducono proliferazione e sopravvivenza pi lunga. Inoltre sono
state somministrate citochine da sole, sempre per favorire lespansione dei T: sono principalmente usate
IL-2 (che attiva i T e i NK), IFN (che incentiva la capacit killer dei NK) e TNF (con azione attivante sui NK).
Le citochine cos somministrate hanno per emivita breve in vivo, poich sono degradate velocemente a
livello renale, andrebbero somministrate di continuo. Si preferisce allora luso di microsfere di polimeri
biodegradabili, contenenti appunto le citochine, che cos non si degradano subito e vengono rilasciate in
modo regolato. Uneccessiva quantit di citochine inoculate causa tempeste citochiniche molto pericolose
che provocano infiammazione sistemica, shock di vari organi, abbassamento di pressione dovuto allazione
sugli endoteli e produzione massiccia di TNF che uccide molte cellule epatiche.
Negli anno 90 a Torino venne avviato un protocollo per la cura dei tumori della testa e del collo: veniva
somministrata IL-2 a bassissime dosi a livello dei linfonodi di testa e collo: anche a basse dosi questa
citochina si dimostrata efficace nella riduzione di tumori anche piuttosto grandi.
IFN correntemente usato nella cura del melanoma (il 50% dei melanomi sensibile a IFN e IFN), poich
esso, inoculato in modo sistemico, spinge il tumore a differenziarsi. TNF e soprattutto IFN, se inoculati in
dosi massicce o per troppo tempo come nel caso della terapia di Epatite C e B, inducono depressione anche
grave (agiscono quindi a livello del Sistema Nervoso Centrale) e stati febbrili. Probabilmente si determina
uno stato infiammatorio anche a livello cerebrale/nervoso che innesca la depressione.

STRATEGIA SPECIFICA: usiamo le cellule tumorali per indurre una reazione contro il tumore stesso.
Le cellule neoplastiche autologhe (derivanti cio dallo stesso paziente) possono essere trasferite in un topo
di laboratorio: esse contengono antigeni che possono sviluppare reazioni del sistema immunitario tese a
ridurre il tumore. Queste cellule tumorali sono portate allapoptosi, si preleva poi il sangue del topo e si
prelevano le cellule dendritiche che si sono generate nel frattempo. Facciamo mangiare alle cellule
dendritiche le cellule tumorali morte, esse si attivano e sono coltivabili ed espandibili. Una volta espanse le
cellule dendritiche si possono re-inoculare, attivano i T con risposta specifica -> otteniamo clamorose
riduzioni del volume neoplastico.
- Oppure si usano pezzi di cellule per indurre una risposta immunitaria specifica (da qui il nome della
strategia), in paziente o in animale da laboratorio: la tecnologia biomolecolare ci permette di
purificare peptidi/proteine derivanti da antigeni tumorali per la cura del melanoma, del cancro alla prostata
e della mammella.
- Si esegue uno studio di proteina sequenziata e analisi dei peptidi dominanti per trovare quali attivano
meglio i linfociti T.
- E usata la modificazione di cellule tumorali per inserirvi molecole che stimolano la risposta immunitaria o
esprimono meglio peptidi su MHC.
- Uso cellule autologhe o allogeniche (di un altro individuo anche non malato). Si esegue nelle cellule
tumorali una trasduzione di geni codificanti per citochine (IL2, IL4, IFN, GM-CSF) o per il recettore B7.
Cos facendo i tumori rilasciano queste sostanze o esprimono il recettore B7, possono dunque attivare i
linfociti T, facendosi attaccare dal sistema immunitario.
- Ci si pu servire di peptidi presentati da cellule specializzate (come macrofagi o cellule dendritiche che
attivano nei linfonodi la risposta immunitaria); a volte il tumore stimolabile.

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- Vaccinazione con DNA: una volta si usavano dei peptidi, ma ho il problema di dover fare un uptake di APC,
e di presentare efficacemente ai T lantigene. A oggi invece possiamo trasdurre il DNA di queste APC su
delle cellule del paziente (es.: iniezione intramuscolo) per indurre antigeni endogeni che generano una
risposta immunitaria.
- un altro metodo recente il trasferimento adottivo di linfociti T: in laboratorio cresco dei linfociti T aventi
un certo antigene, che poi amplifico e inoculo nel paziente.

APPROCCI SIEROLOGICI
Attraverso il siero del paziente, che spesso contiene degli anticorpi contro antigeni tumorali, selezionano
degli anticorpi che riconoscono uno specifico antigene. Posso utilizzare due metodiche:

1. 1. SEREX (SErological analysis of antigens


by Recombinant EXpression cloning):
prendo un paziente con melanoma e ne
faccio la linea cellulare, creo una libreria di
cDNA dal tumore. Questa libreria poi
trasfettata allinterno di fagi che esprimono
queste proteine, infettano batteri che sono
poi coltivati su piastre di Agar. I batteri
generano placche di lisi in seguito
allinfezione fagica, si trasferiscono su filtro
di cellulosa le proteine delle placche
facendo unimpronta della coltura. Ora ho
una fase solida su filtro delle proteine
insolubilizzate e degli antigeni: la piastra
lesca per pescare gli anticorpi del siero del
paziente, poich alcuni di essi riconoscono
lantigene.
2. Con una reazione tramite anticorpo
secondario o autoradiografia con segnale
radioattivo ricostruisco tutte le proteine
riconosciute dagli anticorpi. Con lo
spettrometro di massa (il cui
funzionamento spiegato bene pi avanti)
identifico la proteina riconosciuta, prima
trattata con tripsina.
Questo approccio ha un inconveniente:
derivando da una libreria di cDNA, gli
antigeni codificati non sono modificati in
modo post-traduzionale (es.: non sono
fosforilati n glicosilati);

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2. SERPA (analisi sierologica del


proteoma): non usa una libreria di cDNA, ma
si parte da un tessuto lisato di tumore.
Estraggo da esso delle proteine e faccio
una focalizzazione isoelettrica: essa consiste
nella separazione delle proteine poste in un
campo elettrico su una strip, che quindi si
dispongono a seconda della loro carica.
Successivamente sullo stesso filtro eseguo
una corsa elettroforetica (Western Blot) che
mi separa le proteine a seconda del loro
peso molecolare. Ottengo quindi una mappa
con coordinate definite da punto isoelettrico
e dalla massa. In questo caso si tiene conto
delle eventuali modificazioni post-
traduzionali! Infatti, ad esempio, una certa
proteina avr un PM simile ma diverso punto
isoelettrico rispetto a una proteina identica
con un gruppo fosfato.
Ottengo dei gruppi di proteine vicine (spots)
che sono riconosciuti dal siero del paziente
(es.: in slide si vedono le due proteine
cerchiate, che sono riconosciute in modo
specifico). Posso usare un siero di controllo,
di un individuo non affetto da tumore, per
vedere quali anticorpi in pi o in meno
riconoscono le proteine. Creo dunque un gel
di replica, lo coloro, estraggo le proteine degli spots specifici e le digerisco con tripsina.
Ora analizzo le proteine con lo spettrometro di massa: un tubo in cui le proteine sono ionizzate e fatte
volare allinterno della macchina che, calcolando la carica e il tempo di volo, risale ad uno spettro
individuale per ciascuna proteina. Tale spettro confrontato con quelli registrati su un database, ricavando
una probabilit di corrispondenza: quella pi alta mi identifica quasi certamente la proteina in oggetto. Per
effettuare una verifica posso usare un anticorpo diretto contro la proteina indicata come pi probabile e
vedere se esso la lega.
Ho identificato finalmente la proteina, che un antigene tumorale: ora se trovo unIgG che la riconosce
posso espandere lIgG. Abbiamo quindi trovato delle proteine che attivano i linfociti B e i TH.
Se seleziono un antigene che attiva solo i CTL non si ha una risposta molto efficace perch i CTL sono cellule
abbastanza delicate e muoiono senza laiuto delle citochine fornite dai Th.

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Esperimento di immunoterapia: TUMORE PANCREATICO


Il carcinoma pancreatico attualmente incurabile e con prognosi molto infausta: dal momento della
diagnosi la sopravvivenza di circa 6 mesi. Esso quasi del tutto resistente a radioterapia e chemioterapia,
non sono ancora stati trovati marcatori diagnostici precoci ma si identificano markers solo quando ormai il
tumore ha metastatizzato. Una speranza pu venire dallimmunoterapia.
Si estrae una linea cellulare derivante da un tumore pancreatico umano; se si fa un trasferimento di
anticorpi da sangue periferico si colorano molti spots della mappa: sono gli antigeni generati/riconosciuti
dal sistema immunitario dei malati di tumore pancreatico. Questi anticorpi sono anche usati per fare
una diagnosi del tumore pancreatico, che al momento uno dei passaggi pi complicati.
Prendiamo in esame la proteina -ENOLASI: essa una proteina multifunzionale.
- un enzima che sintetizza piruvato
- il recettore del plasminogeno: sulla membrana delle cellule e legando il plasminogeno lo concentra in
membrana, permettendo allattivatore urochinasico del plasminogeno di tagliarlo, cos da trasformarlo in
plasmina, che attiva la via per la degradazione della matrice extracellulare -> le cellule tumorali usano
questa proteina per scavarsi uno spazio dove poter crescere e metastatizzare
Se -enolasi iper-espressa (es.: durante uno
stato di ipossia generato dal tumore) i B e i T
la riconoscono e producono anticorpi. Una
volta identificata, -enolasi prodotta come
ricombinante; data da mangiare alle cellule
dendritiche, attiva una risposta immunitaria.
Prelevo sangue periferico con cellule mieloidi,
che hanno un recettore detto CD14: genero
dendritiche immature in coltura per 6 giorni
in presenza di citochine (GM-CSF e IL-4) e
ottengo delle cellule dendritiche cannibali che
mangiano tutto senza il recettore B7, non in
grado quindi di attivare dei linfociti T.
Somministro quindi l-enolasi, che attiva le
cellule dendritiche: ora sono in grado di
attivare i linfociti T. Studio le funzioni helper e
killer (ovvero rispettivamente la capacit di
produrre citochine e di fagocitare). Se si fa un test di proliferazione cellulare andando a vedere nella co-
cultura tra dendritiche (caricate con lantigene) e linfociti T (che possiamo separare in CD4 e CD8) vedo se i
T proliferano. Immettendo un isotopo dellidrogeno nella coltura, il Trizio, esso viene incorporato nel DNA
neosintetizzato dei nuovi T proliferanti: schiacciando questa coltura su un filtro e contando la radioattivit
essa proporzionale al numero di T neogenerati. L-enolasi attiva sia i CD4 che i CD8. Per vedere se si sono
attivati dei citotossici (CD8+) vengono messi a contatto con cellule di tumore pancreatico con lo stesso
aplotipo HLA (in genere A2, perch molto diffuso), con i linfociti T ed il cromo radioattivo. Il cromo si
incorpora nelle cellule tumorali. Se i T le uccidono il cromo si libera nel terreno di coltura ed leggibile.
IN VIVO: topi immunodepressi SCID in cui inoculo delle cellule tumorali sviluppano il tumore in pochi giorni,
poich questi topi non producono linfociti T. Se per inietto insieme alle cellule tumorali anche dei TK
specifici per lenolasi il tumore non cresce pi -> lenolasi usata come antigene.

VACCINAZIONE A DNA: Vettore murino con un clone di enolasi umana, vaccinazione di topolini.
Il modello migliore lanimale che sviluppa il tumore al pancreas spontaneamente, grazie alla mutazione di
k-RAS, modificato geneticamente, inespresso dal promotore del gene, PDX1: otteniamo uno sviluppo di
tumore molto simile a quello umano con una penetranza del 90%. Oltre alla mutazione di k-RAS posso
inserire anche una mutazione di p53, che rende la crescita tumorale pi rapida e aggressiva. Il modello
molto rappresentativo: inietto 3 volte il cDNA nel muscolo e uso poi lelettroporazione (ovvero dopo
linoculo sono somministrate brevi scariche elettriche tramite un elettroporatore per facilitare la
trasduzione di cDNA nelle cellule muscolari). Posso usare anche una specie di pistola detta Gene Gun che
spara nel derma a una distanza regolabile il cDNA in proiettili doro.
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Ora il topo immunizzato. Si preleva il siero e si sacrificano alcuni topini, a cui viene prelevata la milza, per
vedere la risposta specifica al tumore: si ha un incremento significativo della sopravvivenza, ben il 30% di
aspettativa di vita in pi nei topi vaccinati.

MECCANISMI DI VACCINAZIONE
Nei topi vaccinati abbiamo le seguenti risposte:
- Attraverso la vaccinazione si attivano gli anticorpi anti-enolasi (stimolati i linfociti B che differenziano in
plasmacellule): gli anticorpi uccidono con citotossicit dipendente dal complemento.
- Le risposte T attivate dai topi vaccinati sono di tipo Th1 e Th17, quindi sono prodotti IFN, IL17 e TNF
(questultimo induce senescenza cellulare tumorale). Si spingono inoltre i T a fare switch isotipico verso
IgG-1 e IgG-2A, che attivano bene il complemento e la citotossicit.
- Viene paralizzata la mobilit delle cellule soppressorie mieloidi (Mieloid-Derived Suppressor Cells) create
dal tumore, che producono molecole inibenti i linfociti T.
- E diminuita la popolazione di T regolatori, che da attivi riducono la risposta immunitaria
- In generale, promossa la risposta effettrice e inibita la risposta soppressoria

I targeting dei T regolatori e dei T soppressori sono transienti: questo il motivo per cui i topi vaccinati
muoiono comunque. Luso di terapie combinate potrebbe un giorno sopperire a questa carenza.

I CTL non sono molto importanti nella risposta: in vivo non risultano nel filtrato tumorale (non ci sono buoni
anticorpi anti-CD8+). Il tipo di antigeni che attiva il CD4 dei Th a volte pi efficace di quando si usano i CTL,
con riduzione della massa tumorale molto maggiore. Se il CTL non dispone di IL-7 e di IL-2 prodotte dai Th,
esso non riesce a sopravvivere a lungo e a espletare la sua funzione.

FINE
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