TCNICAS DE MICROSCOPIA PARA QUANTIFICAO E IDENTIFICAO

DE MICRORGANISMO

DANIELLE DA SILVA MOREIRA* ; ULYSSES GARCIA CASADO LINS

1
Universidade do Grande Rio - Unigranrio, Acadmica do Curso de Cincias Biolgicas (Escola de Cincias da Sade); 2 Universidade
Federal do Rio de Janeiro, IMPG, Laboratrio de Biologia de Ultraestrura de Procariotos. * dani.moreira@ymail.com Rua Professor
Jos de Souza Herdy,1160. CEP 25071-200, Duque de Caxias, RJ.

RESUMO

Tcnicas de microscopia so fundamentais para processamentos de amostras para quantificao e

identificao de bactrias, elas possuem ampla aplicao na pesquisa e apresentam vantagens devido
obteno de resultados rpidos em relao outras tcnicas de microbiologia disponveis que dependem do
crescimento de microrganismos. Neste trabalho foram utilizadas a microscopia ptica de fluorescncia e
eletrnica de transmisso. As bactrias utilizadas para o processamento da microscopia foram Escherichia
coli, Desulfovibrio alaskensis e Candidatus Magnetoglobus Multicelulares.

Palavras-chave: Microscopia eletrnica de transmisso, Fluorescncia e Ultramicrotomia.

MICROSCOPY TECHNIQUES FOR QUANTIFICATION AND

IDENTIFICATION OF MICRO-ORGANISM

ABSTRACT

Microscopy techniques are essential for processing of samples for quantification and identification of
bacteria, they have wide application in research and have advantages because of the quick wins over other
techniques of microbiology available that depend on the growth of microorganisms. In this study we applied
the fluorescence microscopy and transmission electron microscopy. The bacteria used to process microscopy
were Escherichia coli, Desulfovibrio alaskensis and Candidatus Magnetoglobus Multicelulares.

Keywords: Transmission electron microscopy, Fluorescence and Ultramicrotomy.

INTRODUO desta tcnica o ganho de contraste, porm requer

Microscopia ptica de fluorescncia
Devido sua grande especificidade e
relativa facilidade de utilizao, a microscopia de
fluorescncia o mtodo de microscopia mais
freqentemente empregado em pesquisa
atualmente. Com o microscpio ptico de luz
equipado para microscopia de fluorescncia,
possvel examinar a distribuio de uma nica
espcie molecular em uma amostra e sob
condies especiais, e at mesmo detectar
molculas fluorescentes individualmente. A
microscopia de fluorescncia permite a
visualizao de molculas especficas que
apresentam fluorescncia na presena de luz de
excitao ultravioleta ou radiao eletromagntica
na faixa do visvel de baixo comprimento de
onda; emitem radiao com comprimento de onda
superior radiao incidente. A grande vantagem
custo adicional com aquisio de equipamentos.
Normalmente, as molculas no-fluorescentes so
marcadas com um corante fluorescente ou
fluorocromo, a fim de torn-los visveis.
Exemplos destes so DAPI (46-diamidino-2-
fenilindol) usado para marcar diretamente o DNA
nuclear ou rodamina, usada para marcar
indiretamente filamentos de actina citoplasmtica.
O microscpio de fluorescncia utiliza filtros
especiais, e emprega um mtodo especifico de
iluminao para produzir imagens atravs da luz
emitida a partir de molculas excitadas no
espcime. Os filtros so projetados para isolar
dois conjuntos de comprimentos de onda.
(Murphy, 2001).
Para utilizar o microscpio de
fluorescncia de maneira correta, o operador deve
ser capaz de selecionar o fluorocromo apropriado,

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filtro, e iluminao adequada para melhorar a
qualidade da fluorescncia.
A microscopia de fluorescncia pode ser
utilizada para vrios tipos de estudos biolgicos,
como determinao da distribuio intracelular de
macromolculas, estudo da dinmica dessas
macromolculas, mecanismos de reao de
transferncia de energia, determinao de
concentrao intracelular de ons, entre muitos
outros. (Leal, 2000).
Corantes fluorescentes ou fluorocromos
Para a aplicao da tcnica de microscopia
de fluorescencia na maioria das vezes utilizamos
o corante DAPI (46-diamidino-2-fenilindol) que
marcar o DNA. Quando associada a dupla-fita de
DNA, o DAPI tem a sua mxima absoro no
comprimento de onda de 358nm ( ultravioleta ) e
seu mximo de emisso de 461nm (azul).
Outros corantes utilizados foram o kit
BaclightTM (Molecular Probes), que um kit de
viabilidade celular LIVE/DEAD que utilizado
para fazer teste de viabilidade das amostras para
observao em microscopia de fluorescencia.
Esse kit utiliza uma mistura com dois marcadores:
o marcador verde fluorescente SYTO 9
(480/500nm excitao/emisso) e o marcador
vermelho fluorescente iodeto de propdeo
(490/638nm excitao/emisso). O SYTO 9
marca todas as bactrias presentes na amostra,
viveis e no viveis. Por outro lado, o iodeto de
propdeo penetra apenas em bactria com a
membrana celular danificada (inviveis),
causando a reduo do SYTO 9 quando ambos os
corantes esto presentes. Desse modo, quando h
uma mistura apropriada dos dois marcadores, as
bactrias que apresentam membrana celular
intacta (viveis) so marcadas em verde
fluorescente, enquanto as clulas que apresentam
danos na membrana celular (no viveis) so
marcadas em vermelho fluorescente.
Outra tcnica para deteco de bactrias
a hibridizao in situ fluorescente (FISH). Essa
tcnica bastante eficiente para a identificao de
bactrias especficas e anlise da organizao
espacial de comunidades microbianas complexas,
pois permite a observao de um grupo especfico
de bactrias em nvel celular dentro da
comunidade (Amann, Krumholz e Stahl, 1990). A
tcnica do FISH associada a mtodos de anlise
digital de imagens tem se tornado uma excelente
ferramenta no estabelecimento de protocolos de
enumerao de microrganismos grupos-
especficos em diferentes tipos de amostras
(Kampfer et al., 1996, Manser et al., 2006, Bottari
et al., 2006). Por ser uma tcnica independente de
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cultivo, permite de maneira mais adequada, a
determinao do nmero de determinado grupo de
microrganismo no ambiente, e a utilizao de
programas de anlise de imagens permitem uma
quantificao semi-automtica rpida sem a
introduo de erros associados ao operador. A
quantificao direta de microrganismos em
amostras microbianas estruturadas utilizando a
abordagem do FISH associado anlise digital de
imagens dificultada, pois as clulas esto
intimamente agregadas e a deteco de clulas
nicas complexo.
Nessa tcnica, baseia-se no principio de
que seqncias complementares dos cidos
nuclicos que se encontram em fita nica tm a
tendncia de, sob determinadas condies, formar
uma dupla hlice. Desse modo, utilizando-se
cidos nuclicos a associados a marcadores
possvel estudar a distribuio, o nvel da
expresso de genes especficos ou as transcries
dos genes. Como o DNA encontra-se em dupla
fita, necessrio primeiro abrir sua dupla hlice
para que a sonda possa hibridizar.
Microscopia eletrnica de transmisso
Os microscpios eletrnicos de
transmisso (MET) comerciais datam o inicio da
dcada de 40, e desta data at os anos 1970
tivemos o perodo ureo da microscopia
descritiva. Entretanto, hoje temos claro que a era
descritiva ou puramente morfolgica da
microscopia eletrnica j passou. O campo da
biologia celular, que esteve diretamente ligado
microscopia eletrnica desde o seu inicio,
desenvolveuse ao longo do tempo como um
campo multidisciplinar que utiliza a microscopia
eletrnica como uma entre muitas ferramentas.
Por outro lado, esta ferramenta tem se tornado to
sofisticada, que o mundo da microscopia tornou-
se praticamente independente como rea de
pesquisa, contribuindo significativamente para o
conhecimento da ultra-estrutura, bioqumica,
fisiolgica e chegando biologia molecular
atravs da localizao in situ de genes. Com o
estabelecimento do microscpio eletrnico como
ferramenta cientfica, os microbiologistas
ampliaram seu potencial de percepo de detalhes
estruturais, previamente limitados pelo
comprimento de onda da luz visvel.
No microscpio eletrnico de transmisso,
a imagem gerada por eltrons que so
transmitidos atravs do material observado. O
feixe resultante da passagem dos eltrons pela
amostra contm alguns eltrons originais que no
tiveram suas caractersticas alteradas e outros que,
ao passar pelo espcime, tiveram alterada a
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velocidade e a direo. Como os eltrons no
podem ser observados diretamente, a imagem no
microscpios eletrnicos de transmisso vista
atravs de uma tela fosforescente ou atravs da
sensibilizao de um filme ou cmera digital. O
feixe gerado pelo filamento vai produzir uma
imagem do material atravs de uma srie de lentes
eletromagnticas. As lentes eletromagnticas
geram campos magnticos que desviam a
trajetria dos eltrons. Quando desviados por
essas lentes eletromagnticas, os eltrons
assumem trajetrias helicoidais e vo focar a
imagem de um espcime colocado antes das
lentes num determinado ponto depois de
atravessarem a lente. A imagem projetada pelas
lentes sensibiliza uma tela fosforescente, que
transforma eltrons invisveis ao olho humano em
ftons, os quais podem ser observados
diretamente ou atravs de uma binocular. O
contraste funo da natureza do espcime e dos
ajustes feito no microscpio. De uma maneira
geral, o contraste de um determinado material
decorre dos elementos atmicos que ela possui,
conseqentemente da interao dos eltrons do
feixe com estes elementos. A utilizao de metais
pesados junto com o material cria um contraste
artificial, pois os ncleos mais pesados junto
esses elementos tendem a desviar mais os eltrons
do que materiais mais leves, como os
normalmente encontrados no material biolgico.
As tcnicas de preparo de amostras
biolgicas para microscopia eletrnica de
transmisso como etapas bsicas a fixao,
desidratao, polimerizao em resinas acrlicas,
obteno de cortes ao ultramicrtomo e
contrastao com metais pesados, foram
padronizadas aps diversos trabalhos pioneiros.
(Leal, 2000). Entretanto, todas estas etapas so
variveis, sendo recomendvel ajuste das tcnicas
para cada material a ser estudado.
Fixao
A etapa de fixao o processo atravs do
qual se preserva o estado original de um espcime
vivo, evitando-se ao mximo a introduo de
artefatos, ou seja, estruturas previamente
inexistentes formados a parti do processamento. A
funo do fixador imobilizar a estrutura celular
o mais prximo do estado natural e funcional da
clula, paralisando o metabolismo celular. Um
fixador deve criar vrias ligaes estveis entre os
componentes celulares e ter a capacidade de
penetrar rapidamente no material em estudo. Para
a observao morfolgica da amostra necessrio
a utilizao de solues fixadoras, que incluem
um fixador e um tampo, na preparao de
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amostras biolgicos para MET. A fixao das
amostras para o processamento da microscopia
eletrnica de transmisso em soluo tampo
cacodilato 0,1M pH 7,2. A soluo tampo uma
soluo que resite a mudanas de pH. O pH de
tamponamento afinado tem faixa de pH de 6,4 a
7,4, que a faixa fisiolgica de pH. O tampo
citado oferece vantagens na fixao de materiais
biolgicos quais sejam: resistncias
contaminao por bactrias durante a estocagem
das amostras (o tampo cacodilato possui arsnico
inviabilizando o crescimento de microrganismos),
a ausncia de ons fosfato que possam interferir
em estudos citoquimicos e permite adio de
clcio as solues fixadoras. Os fixadores
comumente utilizados na microscopia esto
listados abaixo.
Glutaraldedo
a substncia mais utilizada como fixador
em microscopia eletrnica e transmisso. Este
fixador pode ser utilizado sozinho ou em mistura
com outros fixadores, sendo diludo em
concentraes que variam de 1- 10% em solues
tampes (por ex. cacodilato e fosfato), resultando
numa melhor preservao das estruturas celulares
e oferecendo um maior contraste microscpico.
Entretanto, quando usado em tcnicas
imunolgicas, este fixador pode diminuir ou
eliminar o reconhecimento de protenas por
causar danos estruturais aos determinantes
antignicos (Glauert & Thornley, 1966).
Paraformaldedo
O formaldedo (CH2O) preserva menos a
estrutura celular que o glutaraldedo (C5H8O2)
por ser menos eficiente que estes em estabelecer
ligaes cruzadas, desse modo no sendo
recomendvel para estudos estruturais finos. Eles
reagem em ligao monovalente com os grupos
aminos de protenas. muito utilizado porque
atividades enzimticas e propriedades
imunognicas so menos prejudicadas pelo
formaldeido que por outros fixadores. Pode ser
utilizado em conjunto com o glutaraldeido.
Tetrxido de smio
O Tetroxido de smio (OsO4) estabiliza e
constrata especialmente os fosfolipideos
constituintes da membrana citoplasmticas. Atua
sobre os cidos graxos insaturados desses
fosfolipideos, sobre cidos que tem duplas
ligaes e no atua sobre o acido palmtico ou o
esterico que no tem duplas ligaes. Do mesmo
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modo que o glutaraldeido o smio diminui com o
tempo de fixao por se combinar com as
estruturas. Por isso deve sempre haver excesso de
smio.
Desidratao
A desidratao uma etapa de transio
que visa substituir a gua presente nas amostras
biolgicas por um fluido miscvel com as resinas
de incluso que so, em sua grande maioria,
hidrofbicas. A desidratao consiste em
inmeras lavagens em acetona ou etanol, em
concentraes progressivamente aumentadas at
atingir o grau absoluto. Embora parea uma etapa
banal, durante esse processo que muitos
artefatos podem ser gerados, podendo resultar na
perda de detalhes da amostra que podem levar a
uma interpretao errada, devido principalmente a
extrao de material celular.
Resina
A resina serve como um suporte seco da
amostra e, assim, observao de suas estruturas
internas no microscpio eletrnico de
transmisso. A resina deve possuir caractersticas
que facilitem a infiltrao e, depois de
polimerizada, deve ser possvel a contrastao dos
cortes e estes devem ser resistentes incidncia
do feixe eletrnico do microscpio. Vrios meios
de incluso so comercializados por firmas
especializadas, elas so divididas em dois grupos:
o das resinas epxi e o das resinas acrlicas.
Resina Epxi
Resina plstica de polimerizao a quente.
E so importantes na preparao dos cortes finos,
por permitir a preservao estrutural do material e
serem extremamente estveis sob ao do feixe de
eltrons. Entretanto, a natureza hidrofbica dessas
resinas afeta a preservao antignica do material,
causando diminuio dos sinais de marcao. A
polimerao feita a 60C por 48-72horas
Resina acrlica
Unicryl TM
derivado do metacrilato e foi
desenvolvida para ser utilizada indiferentemente
em microscopia de luz ou microscopia eletrnica.
A resina no interage nem forma ligaes
cruzadas com protenas ou cidos nuclicos
expostos na incluso, favorecendo a deteco
posterior destes componentes. Esta resina
compatvel com todos os solventes normalmente
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usados na desidratao. A resina pode ser
polimerizada por temperatura de 50C 60C ou
por luz UV a baixa temperatura (-20C).
Ultramicrotomia
uma etapa critica do processamento e
seu sucesso depende de todas as etapas anteriores,
de um bom ultramicrotomo, uma navalha de
qualidade e do domnio do usurio, o que s pode
ser atingindo com a pratica.
A espessura dos cortes avaliada pela cor
que mostram quando flutuam pela superfcie da
gua da cuba da navalha, e que se devem
interferncia entre os raios luminosos refletidos
na face superior e interior. Para a ultramicrotomia
pode ser utilizada navalha de diamante que so
muito resistentes e durveis, desde que no
cortem materiais que contenham incluses muito
duras, porm muito caras ou navalha de vidro que
so frgeis necessitando substituio
freqentemente, sua maior desvantagem.
A extremidade do bloco que contm o
material deve ser aperfeioada como uma
pirmide, que pode ser feita mo com uma
gilete ou em equipamentos como o Piramitome da
LKB. A navalha deve encontrar primeiro a base
maior da pirmide, assim o sofrer menor presso.
O importante que a face da pirmide esteja bem
alinhada navalha para que ela no seja
danificada. Os cortes so recolhidos em uma
grade em geral de cobre, mas que pode ser de
nquel ou ouro, quando houver tratamento com
reagentes que reajam com cobre. As grades
podem ter 2,3 ou 3,05 mm de dimetro e convm
verificar qual o tamanho correspondente para o
microscpio.
Contrastao
Os elementos predominantes em amostras
biolgicas so o carbono, hidrognio, oxignio e
nitrognio, que possuem nmero atmico
pequeno e por isso no so capazes de desviar os
eltrons do feixe na formao da imagem do
microscpio eletrnico de transmisso, gerando
uma imagem de baixo contraste. Para intensificar
o contraste na imagem observada no microscpio
eletrnico, os cortes ultrafinos so incubados em
solues de sais de metais pesados que reagem
com os componentes celulares. As duas
substncias mais utilizada para esse
processamento so o acetato de uranila e o citrato
de chumbo.
O acetato de uranila reage com vrios
componentes celulares, especialmente cidos
nuclicos. Pode ser empregado tanto antes da
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desidratao ou diretamente sobre os cortes. As
grades so colocadas em uma soluo aquosa de
acetato de uranila 2,5% durante 15 - 20 minutos,
protegido da luz. As grades so lavadas em gua
destilada e colocadas em papel de filtro. A grade
incubada em um recipiente com parafilme, onde
so colocadas gotas de citrato de chumbo, uma
para cada grade, junto com pastilhas de hidrxido
de sdio (NaOH) para diminuir a concentrao de
CO2, durante 2 a 5 minutos, lavando com gua
destilada e secando com filtro de papel. Os
componentes podem variar de acordo com o
objetivo de estudo.
O presente estudo teve como objetivo a
familiarizao de diversas tcnicas de
microscopia para identificao e quantificao de
microrganismo e o preparo de amostras para
microscopia ptica de fluorescncia e eletrnica
de transmisso.
METODOLOGIA
Preparo das amostras utilizadas nas
tcnicas descritas
Para quantificao de bactrias por DAPI e
pelo kit LIVE/DEAD Baclight (Molecular
Probes) foram utilizadas culturas de Escherichia
coli crescidas em meio Luria-Bertani por 12 horas
a 37 C. A composio do meio Meio Luria-
Bertani (LB). Esse meio feito com 10g Triptona,
5g de extrato de levedura e 10 g de NaCl para
1000 mL de gua destilada. Depois que os
reagentes descritos acima so solubilizados, o pH
ajustado para 7,0 com NaOH 1N, o volume
ajustado para 1000 mL e o meio ento
autoclavado.
A cultura de bactrias de Desulfovibrio
alaskensis foi cedida pela Prof. Lucy Seldin. A
gua do mar e as bactrias magnetotticas foram
obtidas no laboratrio do Prof. Ulysses Lins.
Microscopia de fluorescncia
Na microscopia de fluorescncia foram
utilizadas tcnicas para quantificao de bactrias
utilizando o microscpio Zeiss Axioplan 2 (Carl
Zeiss, Alemanha), com lmpada de mercrio de
100W, conjunto de filtros para DAPI, FITC e
filtro 9 (480/500nm excitao/emisso) e filtro 3
(490/635nm excitao/emisso) e equipado com
cmera digital (AnaliSYS GmbH, Alemanha).
Para contagem de microrganismo
aproximadamente 20-30 campos aleatrios foram
adquiridos em 2 transectos perpendiculares entre
si. O valor absoluto foi calculado levando em
considerao a rea total observada e a quantidade
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de amostra, os valores so expressos em relao
ao volume de amostra.
Quantificao de bactrias totais por DAPI
As amostras de bactrias foram fixadas em
soluo de formaldedo 4% em tampo PBS, a
mesma foi filtrada em membrana de
com PBS e armazenado a -20C. A amostra foi
observada no microscpio ptico Zeiss Axioplan
2 equipado para fluorescncia. Vinte campos
aleatrios da membrana foram fotografados e os
microorganismos foram contados de modo semi-
automtico utilizando o programa ImageJ (NIH-
USA).
Hibridizao in situ (FISH)
Para hibridizao, as amostras foram
incubadas em tampo de hibridizao (0,9 M
NaCl; 5mM Na2EDTA; 20mM Tris-HCl [pH
7,0]; 0,1% dodecil sulfato de sdio [SDS], 5 ng de
formamida). A formamida responsvel pela
especificidade da hibridizao; quanto maior sua
concentrao, maior a especificidade da FISH.
Grupos de sondas especficas para eubactrias
(EUBI 5 GCT GCC TCC CGT AGG AGT
3`, EUBII 5` GCA GCA GCC ACC CGT AGG
TGT 3`, EUB III 5 GCT GCC ACC CGT
AGG TGT 3) e bactrias redutoras de sulfato
(BRS) (SRB Db 5 CGG CGT TGC TGC GTC
AGG 3) foram utilizadas.
Aps a incubao a 46C por
aproximadamente 16 horas, as amostras foram
lavadas em tampo de lavagem (5 mM
Na2EDTA; 20mM Tris-HCl [pH 7,0]; 0,1%
dodecil sulfato de sdio [SDS]; 112 mM NaCl)
pr-aquecido e, logo aps, lavadas gentilmente
em gua Milliq para a retirada do tampo de
lavagem. As amostras foram coradas com DAPI
(1 g ml-1) por 5 minutos, lavada com PBS 1x,
secas ao ar e montadas em lmina com meio de
montagem N-propilgalato. Seu armazenamento
foi feito a -20C. As sondas usadas foram
marcadas fluorescentemente na extremidade 5
com Alexa 488 para BRS e Alexa 594 para
eubactrias. Foi realizado tambm nessas
amostras em tampo de hibridizao com 20% de
formamida.
Anlise de imagens
As imagens foram adquiridas pelo
microscpio de fluorescncia Axioplan 2
Pgina 5
utilizando o Software AnaliSYS (Soft Imaging
System), sendo essas imagens de formato TIF
com resoluo 1280x1024 pixels. As clulas
contidas nas imagens foram contabilizadas
utilizando o plugin ITCN do software gratuito
ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
No plugin ITCN alguns parmetros
numricos podem ser mensurveis para que uma
contagem automtica seja feita. Sendo assim uma
contagem semi-automtica foi realizada
padronizando a medida de clula e de threshold.
O primeiro passo abrir a imagem atravs do
ImageJ. Depois disso, a imagem precisa ser
binarizada para que a contagem possa ser
realizada. Ento o plugin ITCN aberto e a
medida de clula e o threshold so definidos. O
tamanho mnimo entre clulas foi estipulado
dependendo da imagem a ser contabilizada. Um
teste de aceitabilidade foi realizado para verificar
a capacidade do programa em contar
automaticamente as clulas. O valor definido de
threshold utilizado foi de 0.7. O tamanho mnimo
de clula padronizado foi de 9 pixels,
equivalentes 3 m, onde a equivalncia de 60
pixels representava 20 m em cada imagem. Os
microorganismos foram contados
automaticamente utilizando o programa ImageJ.
Os resultados foram expressos em nmero de
microorganismos por ml de amostra.
Para determinar a concentrao de clulas
da amostra necessrio converter os valores de
clulas por campo para clulas/ml. Para isso, os
nmeros de clulas contabilizados por campo so
divididos pela rea do campo em m2 delimitada
cmera e pelo Software AnaliSIS. Com a lente
objetiva de 100x a rea equivale a 5733,2 m2.
Aps a contagem, foi gerada uma figura
mostrando as clulas contadas e uma tabela
contendo o nmero de clulas e a densidade por
campo. Os resultados da contabilizao foram
separados em forma de grfico definindo a mdia
dos valores e o devido erro padro. Para a
construo do grfico o utilizou-se o programa
Prisma 4.
Microscopia eletrnica de transmisso
As amostras foram fixadas em
glutaraldedo 2,5% em tampo cacodilato de
sdio 0,1M em gua da lagoa estril, pH 7,2.
Aps a fixao a 4oC overnight, foram realizadas
trs lavagens de aproximadamente 15 minutos
usando tampo cacodilato de sdio 0,1 M, pH 7,2.
Aps as lavagens, foi feita a ps-fixao, no
escuro, em tetrxido de smio 1% em tampo
cacodilato de sdio 0,1M em gua da lagoa estril
por 1 hora temperatura ambiente. Novas
Sade & Amb. Rev., Duque de Caxias, v.5, n.2, p.01-11, jul-dez 2010.
lavagens usando o mesmo tampo foram
realizadas e as amostras foram ento desidratadas
em acetona 30%, 50%, 70%, 90% e 100% (trs
vezes) por aproximadamente 15 minutos cada,
temperatura ambiente. Posteriormente, a etapa de
impregnao com resina PolyBed 812 seguiu-se
as etapas temperatura ambiente: overnight em
uma soluo de acetona/resina 2:1, 8h em soluo
acetona/resina 1:1, overnight em soluo de 1:2,
8h em resina pura. A polimerizao ocorreu a
60oC em estufa por 48 a 72 horas. Os cortes
ultrafinos foram feitos em um ultramicrtomo
Reichert Ultracut com navalha de diamante e
contrastados em uma soluo aquosa de acetato
de uranila 2,5% durante 20 minutos, protegido da
luz e citrato de chumbo por 1 minuto e
observados no microscpio FEI Morgagni em 80
KV.
RESULTADOS
DAPI
A quantificao direta realizada na amostra
de Escherichia coli atravs do uso do corante
DAPI (Figura 1) foi expressa no grfico abaixo,
mostrando a eficincia na tcnica.
Figura 1 - Micrografia de fluorescncia de
Escherichia coli corada com o fluorocromo DAPI.
A barra de escala indica 20m.
Contagem de clulas por DAPI
8.010 5
6.010 5
Clulas/ml
4.010 5
2.010 5
0
Grfico 1. Quantificao de clulas na amostra
atravs do uso do fluorocromo DAPI.
Pgina 6
Teste de viabilidade alaskensis mostraram que concentrao ideal de
formamida para as sondas utilizadas nesse
O resultado obtido atravs da tcnica de trabalho de 30%. Como esperado a sonda para
viabilidade (Figura 2) nas amostras mostrou que o bactria redutora de sulfato no marca E.coli
nmero das clulas viveis 87% ao numero total quando 20% de formamida utilizado no tampo
de clulas da amostra. de hibridizao (Figura 5). No entanto, note que a
marcao de bactria redutora de sulfato
utilizando 20% de formamida no muito
especfica, pois um bastonete grande, que no
Desulfovibrio alaskensis, est marcado, indicando
que a reao est sendo inexpecfica (Figura 6).
Oportunamente a cultura obtida de D. alaskensis
estava contamidada por uma bactria no redutora
de sulfato, o que facilitou a determinao da
melhor concentrao de formamida para o uso das
sondas aqui descritas. Nas amostras em que a
concentrao de formamida foi aumentada para
30%, a hibridizao da sonda de bactria redutora
de sulfato se mostrou mais especfica.
Apesar de a sonda para bactrias ter
funcionado bem em 20 % de formamida, a sonda
para bactria redutora de sulfato apresentou certa
Figura 2 - Micrografia de fluorescncia de inespecifidade. Como essas sondas sero
Escherichia coli corada com o kit Baclight utilizadas em conjunto, a melhor opo
(Molecular Probes). A barra de escala indica 20 encontrada foi de aumentar a concentrao de
m. formamida para 30%, uma vez que nessa
concentrao todas as sondas apresentaram
Teste de viabilidade especificidade e eficincia na marcao (Figura 7
250 e 8).
Viveis
Nmero de bactrias/ml

200 No-viveis
Microscopia eletrnica de transmisso
150
O processamento das amostras para
100
microscopia eletrnica de transmisso pode gerar
50 inmeros artefatos e, conseqentemente
concluses equivocadas. Algumas caractersticas
0
que devem ser observados na amostra como
s

is

garantia de boa preparao so membranas

ei

ve
v

i
Vi

-v

continuas e ausncias de extrao no citoplasma.

o
N

Durante o processamento da amostra todas as

Grfico 2 - Quantificao de bactrias viveis na
amostra de Escherichia coli.
Hibridizao in situ (FISH)
Na Hibridizao in situ fluorescent foram
utilizadas sondas especficas para identificao de
eubactrias marcadas com Alexa 594 (Tabela 1),
que emite fluorescncia em vermelho, e sonda
especfica para identificao de bactria redutora
de sulfato marcadas com Alexa 488 (Tabela 1),
que emite fluorescncia em verde. Controles sem
sonda foram feitos para verificar
autofluorescencia da amostra (Figura 3 e 4). Os
resultados obtidos atravs da FISH com as
amostras de Escherichia coli e Desulfovibrio
etapas so criticas para alcanar um resultado
satisfatrio.
Amostras mal fixadas podem levar ao
aumento do volume da clula e extrao de
componentes citoplasmticos. A desidratao,
assim como, a infiltrao mal feita da amostra
tambm pode levar a extrao de componentes
celulares, bem como a existncia de regies
celulares no preenchidas com resina (Figura 9).
Atravs da observao dos cortes das
amostras foi possvel observar que a membrana da
clula estava contnua e que o citoplasma celular
no estava extrado, o que garantia as concluses
a a respeito das estruturas intracelulares observadas.
No caso das bactrias magnetotticas possvel
observar a presena de organelas denominadas
magnetossomos (Figura 10, setas).

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 Essas estruturas so formadas por
nanocristais magnticos de xido de ferro
(Fe3O4) ou sulfeto de ferro (Fe3S4) envoltos por
membranas lipoproteica.

Tabela 1 - Sondas utilizadas para a tcnica de Hibridizao in situ fluorescent.

Stio alvo no
Sonda Seqncia (5-3) Grupo alvo FA (%)b NaCl mMc Referncia
rRNAa
EUB338 -I Stahl and
GCTGCCTCCCGTAGGAGT 16S, 338355 Eubacteria 30 112
Alexa 594 Amann 1991

EUB338-II Daims et al.

GCAGCCACCCGTAGGTGT 16S, 338355 Eubacteria 30 112
Alexa 594 1999

EUB338-III Daims et al.

GCTGCCACCCGTAGGTGT 16S, 338355 Eubacteria 30 112
Alexa 594 1999

BRS das -
Amann et al.
SRB385 Proteobacterias
1992 e
CGGCGTCGCTGCGTCAGG 16S, 385402 e algumas 30 112
Alexa 488 Ramnsing et
bactrias gram-
al. 1994
positivas
a
Posio de acordo com a numerao em E. coli
b
Concentrao de formamida no tampo de hibridizao
c
Concentrao de NaCl no tampo de lavagem

Figura 3. Controle sem sonda de Desulfovibrio alaskensis, (a) marcao para bactria redutora de sulfato, (b)
sonda para bactria.

Figura 4. Controle sem sonda de Escherichia coli, (a) marcao para bactria redutora de sulfato, (b) sonda
para bactria.

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Figura 5. FISH de amostras de Escherichia coli com formamida 20%, (a) marcao com DAPI, (b) sonda
para bactria, (c) sonda para bactria redutora de sulfato. A barra de escala indica 20m.

Figura 6. FISH de amostras de Desulfovibrio alaskensis com formamida 20%, (a) marcao com o
fluorocromo DAPI, (b) sonda para bactria, (c) sonda para bactria redutora de sulfato. A barra de escala
indica 20 m.

Figura 7. FISH de amostras de Escherichia coli com formamida 30%, (a) marcao com o fluorocromo
DAPI, (b) sonda para bactria, (c) sonda para bactria redutora de sulfato. A barra de escala indica 20

Figura 8. FISH de amostras de Desulfovibrio alaskensis com formamida 30%, (a) marcao com o
fluorocromo DAPI, (b) sonda para bactria, (c) sonda para bactria redutora de sulfato. A barra de escala

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Recebido em / Received: 2011-01-26

Aceito em / Accepted: 2011-03-21

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