Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Cincias Exatas

Departamento de Qumica

Victor Hugo de Oliveira Munhoz

Anlise Estrutural e Topolgica de

Peptdeos Bioativos em Meios Biomimticos
de Membranas

Belo Horizonte, 2012

UFMG/ICEx/DQ - 889
T. 387

VICTOR HUGO DE OLIVEIRA MUNHOZ

Anlise Estrutural e Topolgica de Peptdeos Bioativos

em Meios Biomimticos de membranas

Tese apresentada ao Departamento de

Qumica do Instituto de Cincias Exatas da
Universidade Federal de Minas Gerais
como requisito parcial para a obteno do
grau de Doutor em Cincias Qumica
Orgnica

Belo Horizonte

2012
Agradecimentos

Sou muito grato aos meus orientadores: professores Dorila Pil Veloso e Antnio Flvio
de Carvalho Alcntara por me guiarem e me apoiarem desde os tempos de graduao, me
ajudando a superar as dificuldades que eu porventura encontrava durante o caminho.

I am very thankful to Professor Burkhard Bechinger for accepting me in his lab during
one year and for the advises and discussions during my work before, during and after my stay in
Strasbourg and mostly guiding me into the Solid State NMR world.

Agradeo bastante ao professor Marcelo Porto Bemquerer pelas discusses cientficas e

sugestes valiosas dadas ao longo deste trabalho.

Agradeo ao professor Fbio Ceneviva Lacerda Almeida pelo enorme auxlio dado
durante os experimentos de RMN presentes nesta tese e em outros trabalhos e pelas valiosas
sugestes dadas.

Agradeo ao CNPq e CAPES pelas bolsas, e UFMG e ao Departamento de Qumica.

Agradeo ao professor e amigo Jarbas Magalhes Resende por todo apoio, pelos
ensinamentos em RMN e clculos estruturais, sugestes e experincias compartilhadas ao longo
de muitos anos.

Agradeo enormemente Regina Ado pela imensa ajuda nos experimentos de ITC e
pelas timas sugestes e palpites dados.

Sou bastante grato ao professor Rodrigo Moreira Verly por anos de amizade, apoio
mtuo e por compartilharmos diversas histrias, como a viagem Rssia, Portugal e por sempre
se prontificar a me ajudar nos momentos mais desesperadores.

Agradeo bastante, tambm, a Mariana Torquato Quezado de Magalhes por sempre

trocar idias, experincias e diversos outros tpicos, sempre ensinando um pouco o mundo da
bioqumica e me fazendo lembrar, que embora falemos lnguas um pouco diferentes,
cientificamente falando, nos referimos sempre mesma coisa.

Agradeo ao professor Carlos Bloch, por me possibilitar o estudo dos peptdeos com os
quais trabalho nessa tese.

i
 Um grande obrigado ao Professor Jos Dias de Souza Filho, por me ajudar imensamente
em minha formao acadmica, me puxando cada vez mais para o mundo da Ressonncia
Magntica Nuclear, alm das muitas experincias e histrias compartilhadas ao longo desses anos
em congressos ao redor do Brasil e do mundo.

I am very grateful for Christopher Aisenbrey and Evgeniy Salnikov for the enormous help
during my stay in Strasbourg, without which I wouldnt be able to perform a fraction of the
experiments, and also for Jesus Raya, for patiently teaching me the know-hows of solid-state
NMR and also for his high-quality tomatoes.

I am also very thankful to the ones Ive worked in Strasbourg: Arnaud, for the help on
CD experiments and NMR, Philippe Bertani for the aid on NMR experiments and discussion, I
also thank to the lab mates Anna Itkin, Barbara Perrone, lise Glattard, Omar Riffi, Matthias
Michalek and Delphine Hatey for receiving me very well, for the friendship and also for helping
me in the work and in many other matters!

Agradeo aos meus colegas de laboratrio. Ao Samuel pela ajuda nas snteses e
purificaes e ao Bruno, Naira e Danniel pela ajuda e pelas conversas nos tempos de folga, que
me ajudaram bastante a manter a cabea no lugar.

Agradeo aos meus amigos do Departamento de Qumica: Geone, Viviane, Tiago,

Roberta, Laura e Giovanni pelas conversas, almoos e bons momentos no geral.

Agradeo aos meus grandes e velhos amigos e parceiros Caio, Daniel, Luiz Max Steel,
Bruno Piruka, Alan Terra, Daniel Bowie, Jucas, Rodrigo e tambm Mrcia, Silvo, Nazareth e
Marcos pelo apoio, conversas, noitadas, discusses, festas, pelo Chicoteia, Jeov, que eu
prometo escrever mais de dois textos por ano, pelas longas conversas musicais, e por tudo mais
que no caberia em poucas pginas!

Agradeo aos novos e grandes amigos que tive o prazer de conhecer esse ano: aos amigos
do Ram (Paim, Betto, Edu e Lo), por terem me trazido de volta msica, aos amigos do Espao
Fluxo (Ana, Phanho, Diego, Paulinha, Carou, Mari, Gabi, Camila, Amandita e Renato Negro),
pelo apoio, conversas, festas e tudo mais, Fabola, pelo apoio e por compreender meus sumios
pr-tese, s grandes amigas Miriam e Tita, pelas diversas conversas e sadas, Ana Luiza, pelo
grande suporte e preocupao, ao Marcus (por morar no centro da cidade e por me indicar vrios
timos livros), Valria, Ana Queirz e Luiz Ramos, pelas experincias musicais, de shows, sadas

ii
Resumo

Este trabalho consiste no estudo de estrutura e interao com meios mimticos de

membrana dos peptdeos antimicrobianos Distinctina, heterodmero composto de duas cadeias
polipeptdicas (cadeia 1 e cadeia 2) ligadas covalentemente por meio de uma ligao de dissulfeto
entre resduos de cistena, e isolada de secrees epiteliais de anuros da espcie Phyllomedusa
distincta, nativa da Mata Atlntica brasileira; Hilaseptina P2 (HSP2) e das fenilseptinas,
constitudas pelo par de epmeros [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe2]-Fenilseptina (D-
Phes), todas as trs isoladas de glndulas epiteliais de anuros da espcie Hypsiboas punctatus,
nativa da Floresta Amaznica. Todos esses peptdeos apresentam considervel atividade contra
bactrias Gram-positivas e Gram-negativas e, por isso, h interesse em se estudar o mecanismo
pelo qual essas substncias exercem essa atividade biolgica. O modelo de mecanismo mais
aceito para esse tipo de peptdeo, denominado modelo de Shai-Matsuzaki-Huang (Matsuzaki,
1999; Shai, 1999; Huang, 2000; Yang, 2000; Papo, 2005) leva em conta forte influncia da
estrutura dos peptdeos sobre suas atividades biolgicas. Tendo isso em vista, surge a necessidade
de se estudar as estruturas dessas biomolculas para se elucidar o mecanismo de suas atividades
antimicrobianas.

Os peptdeos em questo foram estudados a nvel estrutural utilizando-se tcnicas de

Dicrosmo Circular (CD) e Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) em soluo. Resultados
mostraram que todos eles apresentam estruturas terciria ordenadas, ricas em -hlice e de
carter altamente anfiptico. O modelo estrutural do peptdeo distinctina, embora tenha
apresentado ordenao considervel levando-se em conta cada cadeia monomrica
separadamente, no apresenta orientao relativa entre as duas cadeias muito bem definida.
Resultados de CD, no entanto, indicam forte estruturao -helicoidal, tanto do heterodmero
quanto de suas cadeias monomricas individuais, apesar de sugerir que a interao peptdeo
fosfolipdeo se d por meio de um equilbrio envolvendo mais de dois estados. Para a HSP2,
resultados de CD em vesculas unilamelares e RMN em 2,2,2-trifluoretanol (TFE) mostraram
alto contedo de -hlice e os modelos obtidos a partir da RMN apresentam ainda alto grau de
anfipaticidade. Estudos de RMN em DPC das fenilseptinas levaram a modelos tambm ricos em
-hlice, sendo que a D-Phes mostrou grau de estruturao ligeiramente maior que a L-Phes.

iii
 Os experimentos de RMN em fase slida foram realizados para a HSP2 e as fenilseptinas,
com amostras mecanicamente orientadas contendo bicamadas do fosfolipdeo 1-palmitoil-2-
oleoilfosfatidilcolina (POPC) e os respectivos peptdeos seletivamente marcados com 15N e 2H. A
partir da medio de propriedades anisotrpicas como deslocamento qumico de 15N e
desdobramento quadrupolar de 2H, foi possvel determinar as possveis orientaes das
estruturas calculadas com base nos dados de RMN em soluo e inferir a respeito da maneira pela
qual a interao peptdeo-membrana ocorre. Para a HSP2, a anlise conjunta dos resultados de
RMN em soluo e em fase slida mostrou que o peptdeo interage fortemente com a bicamada,
de forma que sua face hidrofbica est em contato direto com o interior aliftico da estrutura
fosfolipdica e orientado quase totalmente paralelo superfcie da bicamada. Os epmeros L-Phes
e D-Phes, embora tenham estruturas tercirias prximas, mostraram orientaes bastante
diferentes entre si, evidenciando que os peptdeos interagem com membrana de formas distintas.

Uma outra parte do trabalho diz respeito aos estudos termodinmicos da interao
peptdeo-lipossoma da HSP2 por meio da tcnica de Calorimetria de Titulao Isotrmica (ITC).
Esses estudos mostraram que a interao em questo fortemente dependente da concentrao
do peptdeo no meio e que, apesar de possuir um carter mais eletrosttico em um momento
inicial, que envolve a aproximao do peptdeo com a membrana, ela mantida principalmente
por interaes do tipo hidrofbicas entre os resduos de cadeia lateral apolares e o interior
aliftico da bicamada fosfolipdicas. A anlise conjunta de todos os resultados obtidos por
diferentes metodologias permitiu construir um modelo mais detalhado para a interao entre o
peptdeo e a membrana bacteriana.

iv
Abstract

This work consists of studies on the structure and interactions with membrane-mimetic
media of the antimicrobial peptides distinctin, an heterodimer composed of two peptide chains
(chain 1 and chain 2) covalently bonded through a dissulfide bond and isolated from the skin of
Phyllomedusa distincta anurans, native from the Brazilian Atlantic Forest; Hylaseptin P2 (HSP2)
and the phenylseptins [L-Phe2]-Phenylseptin (L-Phes) and [D-Phe2]-Phenylseptin (D-Phes), all
three isolated from Hypsiboas punctatus anurans, found on the Amazon tropical forest. All these
peptides show considerable activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria,
reason why there is growing interest in better understanding the mechanistic pathway these
molecules follow on exerting their biological activities. The most widely accepted model for such
mechanism is the Shai-Matsuzaki-Huang model (Matsuzaki, 1999; Shai, 1999; Huang, 2000; Yang,
2000; Papo, 2005), which takes into account a strong influence of the peptides structures on their
biological activities. Hence the need to study these peptides on a structural level in order to
propose a consistent model.

The aforementioned peptides had their structures studied and determined by means of
Circular Dichroism (CD) and solution Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The results showed
that all peptides presented well-ordered tertiary structures, all of them also quite rich on -helical
secondary structure and with a sharp amphipathic character. Distinctins structural model, albeit
showing considerable ordering when taking into account each monomeric chain separately, did
not present a very well-defined overall orientation of one chain in relation to the other. The CD
results, however, indicated stark -helical structuration for both the chains as well as for the
heterodimer, although it suggests that the interaction between the peptide and the phospholipid
is better described as an equilibrium with more than two states. For the HSP2, the results of the
CD experiments on small unilamelar vesicles and the NMR experiments in 2,2,2-triluoroethanol
(TFE) showed a high content of -helix and the models derived from the NMR data also showed
a sheer amphipathic character. For the phenylseptins, the NMR experiments in DPC also led to
-helix-rich structures, being that D-Phes showed a slightly higher structuration degree than L-
Phes.

The solid-state NMR experiments were performed for HSP2 and the two phenylseptins,
with mechanically-oriented samples containing 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine (POPC)
v
bilayers and the peptides selectively-labeled with 15N and 2H. From the measurements of
anisotropic properties such as 15N chemical shifts, and 2H quadrupolar splitting, it was possible to
calculate the possible orientations for the structure determined from the solution NMR data. For
HSP2, the concomitant analysis of both solid-state and solution NMR results showed that the
peptide interacts strongly with the bilayer, in way such that its hydrophobic side is in direct
contact with the phospholipids aliphatic chains and in a quasi-paralell orientation in relation to
the bilayers surface. The epimers L-Phes and D-Phes, albeit showing very similar tertiary
structures, their calculated orientations are significantly different, which suggests that these
peptides interact with the bilayer in distinct manners when comparing one to the other.

Another part of this work comprises the study of the HSP2 peptide-lyposome
interactions thermodynamics through Isotermal Titration Calorimetry (ITC). These studies
showed that the interaction in question is strongly dependent on the concentration of the peptide
on the media and that, in spite of having a sharp electrostatic character at an initial moment
which consist on the approximation of the peptide to the membrane, it is mostly maintained by
hydrophobic interactions between the non-polar sidechains and the membranes hydrophobic
core. The analysis of these results together with the NMR ones, allowed us to build a more
complete and detailed model for the interaction between the peptide and the bacterial
membrane.

vi
Suma rio
Lista de Abreviaturas e Acrnomos ..................................................................................................1

Tabela de Aminocidos .....................................................................................................................3

Apresentao .....................................................................................................................................4

1.Introduo ......................................................................................................................................5

1.1. Estrutura peptdica .................................................................................................................5

1.2. Peptdeos Antimicrobianos................................................................................................... 10

1.2.1. Relao estrutura-atividade de peptdeos antimicrobianos. .......................................... 14

1.3. Sntese em fase slida de peptdeos pela estratgia Fmoc. ................................................... 15

1.4. Caractersticas angulares de estruturas de protenas e peptdeos......................................... 18

1.5. Determinao de estruturas de protenas e peptdeos ......................................................... 21

1.5.1. Dicrosmo Circular ........................................................................................................ 21

1.5.2. Ressonncia Magntica Nuclear em soluo ................................................................. 22

1.5.3. Ressonncia Magntica Nuclear no estado slido ......................................................... 40

1.5.4 Caracterizao termodinmica do processo de interao peptdeo/membrana por

calorimetria de titulao isotrmica (ITC) .............................................................................. 43

2. Materiais e Mtodos .................................................................................................................... 45

2.1. Materiais ............................................................................................................................... 45

2.2 Mtodos ................................................................................................................................. 47

2.2.1. Procedimento Geral ....................................................................................................... 47

2.2.2. Sntese das fenilseptinas e da Hilaseptina P2 ................................................................. 51

2.2.3. Reao de Formao da Distinctina............................................................................... 52

2.2.4. Preparao de Vesculas para Experimentos de Dicrosmo Circular (CD) ................... 53

 2.2.5. Experimentos de Dicrosmo Circular ............................................................................ 53

2.2.6. Processamento e Anlise de Experimentos de RMN em Soluo ................................. 54

2.2.7. Preparao das amostras para RMN no estado slido ................................................... 55

2.2.8. Experimentos de RMN no estado slido ....................................................................... 56

2.2.9. Simulao de parmetros da RMN em fase slida e determinao da orientao dos

peptdeos em bicamadas lipdicas ............................................................................................ 57

2.2.10 Preparao de Lipossomas para Experimentos de Calorimetria Isotrmica de

Titulao (ITC) ........................................................................................................................ 58

2.2.11. Calorimetria de Titulao Isotrmica .......................................................................... 60

3. Resultados e Discusso ................................................................................................................ 63

3.1. Sntese em Fase Slida dos Peptdeos Distinctina, Hilaseptina P2 (HSP2) e Fenilseptinas L-
Phes e D-Phes .............................................................................................................................. 63

3.1.1. Sntese da Distinctina .................................................................................................... 63

3.1.2. Sntese e Purificao da Hilaseptina P2 (HSP2) ............................................................. 69

3.1.3. Sntese da [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes)....................................................................... 73

3.2. Estudos por Espectroscopia de Dicrosmo Circular (CD) dos Peptdeos Distinctina,
Hilaseptina P2 (HSP2) e Fenilseptinas L-Phes e D-Phes ............................................................. 75

3.2.1. Estudos por CD da Distinctina ...................................................................................... 75

3.2.2. Estudos por CD da Hilaseptina P2 (HSP2) .................................................................... 79

3.3. Determinaes Estruturais por Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) em Soluo dos
Peptdeos Distinctina, Hilaseptina P2 (HSP2) e Fenilseptinas L-Phes e D-Phes ......................... 80

3.3.1. Determinao Estrutural da Distinctina por RMN em Soluo .................................... 81

3.3.2. Determinao Estrutural da Hilasptina P2 (HSP2)...................................................... 101

3.3.3. Determinao Estrutural da [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e da [D-Phe2]-Fenilseptina

(D-Phes) por RMN em Soluo ............................................................................................. 109
 3.3.4. Clculo e Validao Estrutural a partir dos Dados de RMN em Soluo ................... 116

3.3.5. Estudos Topolgicos da Interao Peptdeo-Bicamada Fosfolipdica por Ressonncia

Magntica Nuclear (RMN) em Fase Slida ........................................................................... 124

3.4. Caracterizao Termodinmica do Processo de Interao Peptdeo/Membrana por

Calorimetria de Titulao Isotrmica ....................................................................................... 134

3.4.1 Determinao da entalpia de interao peptdeo-membrana ...................................... 134

4. Concluso .................................................................................................................................. 144

4.1. Distinctina e Cadeias 1 e 2 ............................................................................................... 144

4.2. Hilseptina P2 (HSP2) ........................................................................................................ 146

4.3. [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe2]-Fenilseptina (D-Phes) ............................... 147

4.4. Consideraes Finais ........................................................................................................ 148

5. Referncias Bibliogrficas .......................................................................................................... 150

Lista de Abreviaturas e Acro nomos
ACN Acetonitrila
APD Banco de dados de peptdeos
antimicrobianos, do ingls Antimicrobial
Peptide Database
1D Unidimensional
2D Bidimensional
3D Tridimensional
CD Dicrosmo Circular, do ingls Circular
Dichroism
CLAE Cromatografia lquida de alta eficincia
COSY Espectroscopia de correlao, do ingls
Correlation
Co Spectroscopyy
DCM Diclorometano
DIC N,N- diisopropilcarbodiimida
DMF N,N-dimetilformamida
D-Phes [D-2Phe]-Fenilseptina
DPC dodecilfosfocolina, do ingls
dodecylphosphocholine
DQF-COSY espectroscopia de correlao com filtro de
duplo quantum, do ingls Double-
Quantum Filtered COSY
DSS 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfonato de
sdio
E. COSY COSY editado
EM Espectrometria de massas
FID decaimento livre da induo, do ingls
Free Induction Decay
Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonila
HOBt 1 - hidroxibenzotriazol
HSP2 Hilaseptina P2
HSQC coerncia heteronuclear de simples-
quantum, do ingls Heteronuclear Single-
Quantum Coherence
ITC calorimetria de titulao isotrmica do
ingls Isothermal Ttiration Calorimetry


Constante de acoplamento escalar
Coeficiente de partio
L-Phes [L-2Phe]-Fenilseptina
LUVs Vesculas grandes unilamelares, do ingls
Large Unilamellar Vesicles
MALDI Dessoro/ionizao de matriz assistida
por laser, do ingls Matrix Assisted
Laser Dessorption/Ionization
MLVs Vesculas multilamelares do ingls Multi
Lamellar Vesicles
NOESY espectroscopia de efeito nuclear
 Overhauser, do ingls Nuclear
Overhauser Effect Spectroscopyy
PDB banco de dados de protenas, do ingls
Protein Data Bank
P:L Razo peptdeo:lipdeos
RMN Ressonncia Magntica Nuclear
POPC 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina


POPG 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol
calor de diluio relativa interao


peptdeo-lipdeo
calor total relativo interao peptdeo-



lipdeo
quantidade de calor relativa interao
peptdeo-lipdeo
QUEEN validao quantitativa de restries
experimentais de RMN, do ingls
Quantitative
Qu Evaluation of Experimental
NMR Restraints
RDC acoplamentos dipolares residuais, do
ingls Residual Dipolar Coupling
RMSD raiz quadrada dos desvios mdios
quadrados, do ingls Root Mean Square
Deviation,
SA arrefecimento simulado do ingls
simulated annealing
SDS dodecilsufato de sdio, do ingls Sodium
Dodecyl Sulphate
SUVs vesculas unilamelares pequenas, do
ingls Small Unimolecular Vesicules
TFA cido trifluoroactico
TFE 2,2,2-trifluoroetanol
TIS tri-isopropilsilano
TOCSY espectroscopia de correlao total, do
inls Total
To Correlation Spectroscopyy
TOF tempo de vo, do ingls time of flight
tr tempo de reteno
Tris tris-hidroxiaminometilmetano
Tabela de Aminoa cidos

Smbolo de Smbolo de Massa monoisotpica

Aminocido
uma letra trs letras

cido asprtico D Asp 115,026

cido glutmico E Glu 129,042

Alanina A Ala 71,037

Arginina R Arg 156,101

Asparagina N Asp 114,042

Cistena C Cys 103,009

Fenilalanina F Phe 147,068

Glicina G Gly 57,021

Glutamina Q Gln 128,058

Histidina H His 137,058

Isoleucina I Ile 113,084

Leucina L Leu 113,084

Lisina K Lys 128,094

Metionina M Met 131,040

Prolina P Pro 97,052

Serina S Ser 87,032

Tirosina Y Tyr 163,063

Treonina T Thr 101,047

Triptofano W Trp 186,079

Valina V Val 99,068

Apresentaa o

Esta tese teve como objetivo estudar a estrutura e a interao com meios mimticos de
membrana de quatro peptdeos antimicrobianos: Distinctina, heterodmero composto de duas
cadeias polipeptdicas (Cadeia 1 e Cadeia 2) ligadas covalentemente por meio de uma ligao de
dissulfeto entre resduos de cistena; Hilaseptina P2 (HSP2) e das fenilseptinas, constitudas pelo
par de epmeros [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe2]-Fenilseptina (D-Phes). Todos esses
peptdeos apresentam considervel atividade contra bactrias Gram-positivas e Gram-negativas e,
por isso, h interesse em se estudar o mecanismo pelo qual exercem essa atividade biolgica. O
modelo de mecanismo mais aceito para esse tipo de peptdeo, denominado modelo de Shai-
Matsuzaki-Huang (Matsuzaki, 1999; Shai, 1999; Huang, 2000; Yang, 2000; Papo, 2005) leva em
conta forte influncia da estrutura dos peptdeos sobre suas atividades biolgicas. Tendo isso em
vista, surge a necessidade de se estudar as estruturas dessas biomolculas para se elucidar o
mecanismo de suas atividades antimicrobianas.

Este trabalho consta da Introduo, que apresenta uma breve explanao dos
fundamentos tericos das diversas tcnicas utilizadas, constituindo o Captulo 1;.da Parte
Experimental, que relatada no Captulo 2; de um terceiro captulo, abrangendo Resultados e
Discusso, de uma Concluso e, por fim, das Referncias Bibliogrficas.
1.Introdua o
1.1. Estrutura peptdica

Os peptdeos so biomolculas que contm de dois a dezenas de resduos de aminocidos

(Quadro 1.1, p. 6) ligados covalentemente, atravs de ligaes peptdicas entre um grupo
carboxila de um aminocido e um grupo amino de outro por meio de uma reao de
condensao. Como resultado dessa reao, a cadeia peptdica possui duas terminaes
diferentes: uma extremidade amino (grupamento alfa-amino), denominada de extremidade N-
terminal e uma extremidade carboxi (grupamento alfa-caboxila), tambm denominada
extremidade de C-terminal. Por conveno, a extremidade N-terminal considerada como o
incio de uma cadeia peptdica e a extremidade C-terminal, o seu final. Uma cadeia peptdica
constituda por um conjunto formado pela repetio regular dos quatro tomos que compem a
ligao peptdica (C, O, N, H) por toda a sua extenso, que denominado cadeia principal, e de
uma parte varivel, dependente do resduo de aminocido presente, que corresponde s distintas
cadeias laterais, representadas como  na Figura 1.1 (Nelson & Cox, 2002).

R2
O O

H2N NH
NH OH

R1 O R3

ligao
Terminao Terminao
peptdica
amnica carboxi

Sentido da cadeia

cadeias laterais representadas como .

Figura 1.1. Representao esquemtica de uma sequncia peptdica de um tripeptdeo, com as
 O
NH2 O O O
H3C
HN NH OH H2N HO
OH OH OH
NH2 O NH2 O NH2
NH2

Alanina Arginina Asparagina cido Asprtico

(Ala) A (Arg) R (Asn) N (Asp) D

O NH2 O
O O CH3 O
HS OH O OH
HO OH H3C OH
NH2 NH2
O NH2
NH2

R Cistena cido Glutmico Glutamina

OH Valina
(Cys) C (Glu) E (Gln) Q
(Val) V
NH2

O
Nome O
H
O CH3 O
H2N OH H3C
(Abreviao) OH N OH
NH2
OH
NH2 HO NH2
Smbolo N

Glicina Histidina Tirosina Isoleucina

(Gly) G (His) H (Tyr) Y (Ile) I

O O O O
H
H3C H2N N S
OH OH OH H3C OH
CH3 NH2 NH2 NH2

Leucina Lisina Prolina Metionina

(Leu) L (Lys) K (Pro) P (Met) M

O
CH3 O O
O OH
HO OH OH NH2
HO OH
NH2 NH2
NH2 NH

Serina Fenilalanina
Treonina Triptofano
(Ser) S (Phe) F
(Thr) T (Trp) W

Quadro 1.1. Estrutura e nomenclaturas dos aminocidos comumente encontrados em protenas

e peptdeos.

Os peptdeos so classificados de acordo com quatro nveis estruturais: estruturas

primrias, secundrias, tercirias e quaternrias. Denomina-se estrutura primria apenas a
sequncia de resduos de aminocidos do peptdeo, em geral representada do grupo N-terminal
para o C-terminal (Berg et al., 2006).

A estrutura secundria indica conformao local de alguma poro de um polipeptdeo.,

constituindo formas ou padres mais recorrentes, sendo que os mais importantes so a -hlice e
a folha-. A adoo dessas diferentes formas ocorre devido variao dos ngulos diedros  e
(Figura 1.2, p. 7) que, por sua vez, bastante influenciada tanto pelo meio em que se encontra a
protena quanto pela sua estrutura primria.
Figura 1.2. Representao dos ngulos de toro dos resduos de aminocido.

A estrutura -hlice (Figura 1.3) formada por ligaes hidrognio, atravs da interao
intramolecular entre o oxignio da carbonila e o hidrognio do grupo amino das ligaes
peptdicas. A ligao de hidrognio proporciona uma hlice em torno de um eixo imaginrio,
tendo entre cada volta da hlice, uma distncia de cerca de 5,4 , ou, aproximadamente, 3,6
resduos de aminocidos (Berg et al., 2006).

Figura 1.3. Quatro modelos de -hlice, mostrando diferentes aspectos de sua estrutura. (a)
formao de -hlice em torno de um eixo; (b) modelo bola e vareta, explicitando as ligaes
hidrognio intracadeias; (c) -hlice vista de uma de suas terminaes, olhando-se para baixo
atravs do eixo longitudinal; (d) viso lateral da -hlice pelo modelo espao preenchido (Nelson
& Cox, 2002, p. 127).

A existncia de forma helicoidal em protenas depende das cadeias laterais,

desempenhando um papel importante na estabilizao ou desestabilizao da -hlice. Resduos
de aminocidos com cadeias laterais com a mesma carga (positiva ou negativa) que estejam
muito prximos entre si podem desestabilizar a forma devido a interaes repulsivas. Resduos
de prolina e glicina apresentam normalmente impedimento para a ocorrncia de formas
helicoidais. No caso do resduo de prolina, o tomo de nitrognio faz parte de um anel rgido,
impedindo a rotao em torno da ligao   e, consequentemente, a ocorrncia de forma
helicoidal. Alm disso, a ausncia de hidrognio ligado ao nitrognio do resduo de prolina no
proporciona estabilizao de formas helicoidais por ligaes hidrognio. No caso da glicina, a
flexibilidade conformacional desfavorece a forma helicoidal, proporcionando frequentemente a
ocorrncia de formas globulares ou, simplesmente, a ausncia de uma forma preferencial em
sequncias polipeptdicas que a contenham (Nelson & Cox, 2002).

A ocorrncia de forma helicoidal pode ser influenciada tambm pelos dipolos oriundos
das carbonilas. Assim, dipolos eltricos presentes nas ligaes peptdicas e nas cadeias laterais
resultam em interaes eletrostticas com as extremidades da cadeia polipeptdicas,
desestruturando formas helicoidais (Nelson & Cox, 2002).

Na estrutura secundria do tipo folha-, as cadeias polipeptdicas apresentam uma

disposio em zigue-zague. Essas cadeias podem ser dispostas lado-a-lado, formando estruturas
que se assemelham a folhas. Nesse caso, as ligaes de hidrognio so formadas entre resduos
das cadeias polipeptdicas adjacentes. As ligaes hidrognio ocorrem entre resduos distantes
entre si na cadeia, podendo ocorrer tambm entre cadeias diferentes. O emparelhamento de
resduos resultante desse tipo de interaes pode resultar em dois padres diferentes de
disposio das fitas-: a forma antiparalela e a forma paralela, ambas mostradas na Figura 1.4 (p.
9). Na forma antiparalela, as fitas- encontram-se em sentidos contrrios, enquanto que, na
paralela, essas cadeias peptdicas encontram-se dispostas de forma alinhada quanto ao sentido
(i.e. N para C). Esse tipo de estrutura secundria, no entanto, no costuma ser muito comum em
peptdeos constitudos por poucos resduos de aminocido, sendo mais recorrentes em protenas
de altas massas moleculares (Nelson & Cox, 2002).
 .

Figura 1.4.
1.4 Estruturas de cadeias polipeptdicas, mostrando em (a) a conformao -
antiparalela, em que os tomos de carbono, oxignio e nitrognio do esqueleto peptdico no se
encontram alinhados (como pode ser visto pela perspectiva lateral) e em (b) a conformao
paralela. (Nelson & Cox, 2002, p. 129).

Outro padro de estrutura secundria denominado de dobra (Figura 1.5), sendo um

elemento de conexo entre fragmentos de resduos apresentando conformaes -antiparalelas.
A estrutura apresenta um dobramento de 180, envolvendo geralmente quatro resduos de
aminocido. O oxignio da carbonila entre o primeiro e o segundo resduo forma uma ligao
hidrognio com o hidrognio do grupo amino localizado a trs ou quatro resduos de distncia.
Os demais grupos presentes na sequncia no participam da formao dessa estrutura secundria
(Figura 1.5a). Outro tipo de dobra pode ser formado tambm pela adoo da conformao cis de
resduos de prolina, conforme mostrado na Figura 1.5b (Nelson e Cox, 2002).

(a)

Figura 1.5. (a) Estrutura geral de uma dobra , indicando os quatro resduos de aminocidos
(representados envoltos nos crculos azuis) que a constituem. (b) formas em que os resduos de
prolina podem se encontrar (cis e trans). (Nelson e Cox, 2002, p. 130).
 Denomina-se de estrutura terciria ao arranjo tridimensional de todos os tomos em uma
protena. A estrutura terciria indica o arranjo espacial relativo entre os motivos estruturais
definidos como estruturas secundrias, bem como o arranjo tridimensional de regies entre tais
motivos.

Peptdeos contendo duas ou mais cadeias polipeptdicas ligadas entre si adotam arranjos
com subunidades em complexos tridimensionais. Esse nvel mais elevado de organizao
denominado estrutura quaternria (Nelson & Cox, 2002).

1.2. Peptdeos Antimicrobianos

Peptdeos antimicrobianos so componentes de sistemas de imunodefesa inatos a

diversos organismos multicelulares. Sua ampla distribuio em diversas espcies, tanto do reino
animal quanto do reino vegetal sugere o importante papel que essas substncias tm na evoluo
de organismos multicelulares complexos. Apesar de estarem presentes nesses organismos h
muitas eras, essas substncias tm mantido eficientemente seus papis imuno-defensivos.

Existe uma diversidade enorme de peptdeos antimicrobianos. O banco de dados de

peptdeos antimicrobianos (APD Antimicrobial Peptide Database,
http://aps.unmc.edu/AP/main.php) registra atualmente 1518 peptdeos, sendo que 98
apresentam propriedades antivirais, 442 propriedades antifngicas, 1168 antibacterianas e 98
mostram atividade anticncer. Os peptdeos antimicrobianos podem se diversificar
principalmente pela composio e estrutura. Tais caractersticas refletem a adaptao das
espcies ao microambiente em que vivem. Uma classe importante destas substncias os
peptdeos anfipticos lineares ou dimricos encontrados em muitas espcies, inclusive plantas,
anfbios, insetos ou humanos (Bevins & Zasloff, 1990).

Os anfbios apresentam uma enorme diversidade desses peptdeos (Csordas & Michl,
1970; Hoffmann et al., 1983). Na pele de anuros encontram-se muitos peptdeos biologicamente
ativos, sendo os peptdeos antimicrobianos considerados como os mais avanados participantes
do sistema imunolgico desses animais (Boman, 1995; Zasloff, 2002). Em 1999, foi descrito o
isolamento de diversos peptdeos antimicrobianos isolados da pele de anuros da espcie
Phyllomedusa distincta (Batista et al., 1999), dentre eles a distinctina (Batista et al., 2001),
peptdeo heterodimrico, com ambas as cadeias amidadas na extremidade C-terminal, cuja
estrutura primria encontra-se representada na Figura 1.6 (p. 11).
 ENREVPPGFTALIKTLRKCKII
NLVSGLIEARKYLEQLHRKLKNCKV

Figura 1.6. Sequncia peptdica da distinctina, com a representao da ligao dissulfeto entre os
resduos de cistena.

Considerando os resultados de testes de atividade biolgica, verificou-se que a distinctina

possui atividade antimicrobiana contra diversos tipos de bactria, Gram-positvas ou Gram-
negativas (Batista et al., 2001). Alm disso, vrios outros estudos foram feitos, como dicrosmo
circular (CD) e espectroscopia na regio do infravermelho (IV), que indicaram grande presena
de estruturas secundrias do tipo folha-, alm da ocorrncia em menor escala da estrutura
secundria -hlice (Batista et al., 2001). O estudo por ressonncia magntica nuclear (RMN) em
meio aquoso forneceu estruturas tridimensionais do peptdeo, indicando a predominncia de
estruturas -hlice nas cadeias, porm com uma interao entre as molculas da distinctina, duas
a duas, sugerindo a presena do peptdeo na forma tetramrica (Raimondo et al., 2005),
conforme mostrado na Figura 1.7.

a)

b)

Figura 1.7. Estruturas obtidas por RMN do heterodmero distinctina em gua. Em (a)
representado o conjunto de estruturas sobrepostas, visualizando-se somente a cadeia principal
das estruturas, com a formao do tetrmero envolvendo duas molculas da distinctina. A
Cadeia 1 est representada em azul-escuro e verde escuro, e a Cadeia 2, em ciano e verde-claro,
de acordo com a subunidade de distinctina em que se encontram. Em (b) mostrada a estrutura
tetramrica mais representativa, com a Cadeia 1 em roxo e a Cadeia 2 em vermelho (Raimondo
et al., 2005).
 Recentemente, parte do mecanismo de interao com membranas fosfolipdicas foi
elucidada por meio de estudos de RMN em estado slido, onde pde-se identificar uma
conformao distinta da obtida por RMN em soluo (Resende et al., 2009). Esse estudo indica
que a distinctina altera significativamente sua conformao quando interage com a bicamada
fosfolipdica, interagindo em sua forma monomrica (diferentemente da forma tetramrica
descrita em ambiente aquoso), com as cadeias orientadas paralelamente uma em relao outra,
de forma que as N-terminaes encontram-se em posies opostas entre si conforme mostrado
na Figura 1.8.

Figura 1.8. Representao do peptdeo distinctina (cadeias laterais polares em verde e apolares
em azul) interagindo com bicamada lipdica (representada em cinza) (Resende et al., 2009).
Outra classe de peptdeos antimicrobianos isolados de pele de anuros a das fenilseptinas.
Esses peptdeos foram isolados de anuros da espcie Hypsiboas punctatus, nativas da Floresta
Amaznica. Dois peptdeos compem essa recm-descoberta classe: [L-2Phe]-Fenilseptina (L-
Phes) e [D-2Phe]-Fenilseptina (D-Phes). Esses dois peptdeos, tambm amidados na extremidade
C-terminal e cujas estruturas primrias esto representadas na Tabela 1.1, constituem um par de
epmeros, e diferenciam-se pela configurao do segundo resduo de fenilalanina (F2, ou 2Phe,
conforme a nomenclatura utilizada para esses peptdeos). Na L-Phes, encontra-se presente o
esteroismero L da fenilalanina e na D-Phes, o estereoismero D. A caracterstica que define esta
nova classe de peptdeos o alto contedo de resduos de fenilalanina, presente na extremidade
N-terminal, constituindo um motivo estrutural conservado cuja sequncia Phe-Phe-Phe.
Ambos os peptdeos so encontrados na secreo epitelial dessa espcie de anuro.

Tabela 1.1. Sequncia de aminocidos dos peptdeos L-Phes e D-Phes, com as numeraes dos
resduos de aminocido seguindo a ordem convencional da extremidade N-terminal C-
terminal, com a amidao desta ltima representada pelo grupo NH2 direita da representao
do ltimo resduo
 O isolamento desses peptdeos est descrito em (de Magalhes et al., 2012) e foram
estudadas, tambm, no mesmo trabalho, as propriedades gustativas, bem como as atividades
antimicrobianas dessas substncias. Em relao s propriedades gustativas, muitos dos peptdeos
antimicrobianos isolados da pele de anuros apresentam o sabor amargo quando experimentado
por humanos e este sabor normalmente associado com resduos de cadeias laterais
hidrofbicas, em especial resduos de fenilalanina (Ishibashi, 1988; Kim, 2006; Maehashi, 2009).
Alm da influncia do carter hidrofbico dos resduos de aminocido, foi observado que a
localizao desses resduos na cadeia polipeptdica tambm determinante para o sabor amargo
(Lelj, 1980; Otagiri, 1985). Essa propriedade gustativa evidencia o possvel papel dessas
substncias no mecanismo de defesa contra certos predadores, uma vez que o sabor amargo
propiciado por esses peptdeos tornaria o sabor de indivduos dessa espcie repulsivo para certos
predadores. Dessa maneira, o papel biolgico desses peptdeos no seria apenas relativo defesa
desses animais contra agentes patognicos, mas contra potenciais predadores.

De fato, tais propriedades aversivas devido ao sabor amargo foram observadas para
ambos os peptdeos quando testados em camundongos geneticamente modificados que no
possuem o canal no-seletivo Trpm5, que teria papel importante na percepo do amargor em
mamferos (Rossler, 1998; Perez, 2002) e comparando os resultados com os observados em
camundongos que possuem tal canal. Apesar da diferena estrutural no motivo que teria
influncia sobre o sabor amargo (Phe-Phe-Phe), no foram observadas diferenas entre o
potencial aversivo das duas substncias (de Magalhes et al., 2012).

Por outro lado, os resultados de atividade antimicrobiana mostraram considervel

diferena entre os dois epmeros. D-Phes apresentou atividade duas vezes maior contra bactrias
S. aureus (concentrao inibitria mnima (CIM) de 32,5 M para D-Phes e de 65,5 M para a L-
Phes) e oito vezes maior para X. axonopodis que a L-Phes (de Magalhes et al., 2012). Esses
resultados indicam que a diferena na configurao do carbono alfa do resduo de F2 tem
considervel eficcia nas atividades bactericidas das fenilseptinas, uma vez que se percebe forte
influncia da estruturao de peptdeos antimicrobianos em geral no momento da interao com
os agentes patognicos sobre suas respectivas atividades biolgicas, conforme ser discutido no
item 1.2.1 (p. 14).

Tambm isolado de anuros da espcie Hypsiboas punctatus, o peptdeo Hilaseptina P2

(HSP2, cuja sequncia mostrada na Tabela 1.2, p. 14) apresenta considervel atividade
antimicrobiana contra bactrias Gram-positivas e Gram-negativas (Bloch Jr., 2011). Trata-se de
um peptdeo ainda indito na literatura, que apresenta grande homologia em sua estrutura
primria, com outros peptdeos encontrados na pele de anuros como a Dermadistinctina K
(Verly et al., 2009)e as prprias fenilseptinas. Alm disso, a representao da sua molcula na
projeo de Edmundson (Figura 1.9) mostra que este peptdeo, na forma -helicoidal, apresenta
estrutura altamente anfiptica, sendo, portanto, coerente com as propriedades normalmente
observadas em peptdeos antimicrobianos de peles de anuros.

Tabela 1.2. Sequncia de aminocidos dos peptdeos HSP2, com a numerao dos resduos de
aminocido seguindo a ordem convencional da extremidade N-terminal C-terminal, com a
amidao desta ltima representada pelo grupo NH2 direita da representao do ltimo
resduo

Figura 1.9. Representao do peptdeo HSP2 na projeo de Edmundson, com os resduos

apolares em amarelo, os positivamente carregados em verde, os negativamente carregados em
roxo, os polares no-carregados em azul e os resduos de glicina em rosa.

1.2.1. Relao estrutura-atividade de peptdeos antimicrobianos.

O motivo de se estudarem as preferncias conformacionais de peptdeos reside no fato de
a estrutura daqueles que so antimicrobianos estar intrinsecamente relacionada ao seu
mecanismo de ao. Vrios estudos dessa nova classe de substncias biologicamente ativas
mostraram que muitos desses peptdeos exercem sua atividade por meio de permeabilizao de
membranas bacterianas (Bechinger, 1999; Vogt et al., 1999). Grande parte desses peptdeos adota
preferencialmente formas -helicoidais em meios que mimetizam membranas (Wright, 1989;
Wthrich, 1989; Clore & Gronenborn, 1991). Acredita-se que a permeabilizao da membrana
facilitada pela adoo dessa estrutura secundria (Westerhoff et al., 1989).

O modelo de mecanismo que explica a atividade da maior parte dos peptdeos

antimicrobianos o modelo Shai-Matsuzaki-Huang (SMH) (Matsuzaki, 1999; Shai, 1999; Yang et
al., 2000) que prope a interao do peptdeo com a membrana, seguida por deslocalizao de
lipdeos, alterao da estrutura da membrana e, em alguns casos, a entrada do peptdeo no
interior da clula. Entretanto, no se sabe de forma detalhada o mecanismo, especialmente como
se d a interao entre peptdeo e membrana. Para explicar essa etapa, surgiram vrias hipteses,
incluindo despolarizao da membrana (Westerhoff, Juretic et al., 1989), formao de poros
(Bierbraum & Sahl, 1985; Yang, Weiss et al., 2000), ativao de processos como a induo de
hidrolases que degradam a parede celular (Bierbraum & Sahl, 1985), desordenamento da
estrutura da bicamada lipdica (Matsuzaki, 1999) e destruio da clula por interiorizao do
peptdeo (Kragol et al., 2001).

Tendo em vista a necessidade de se elucidar, de forma completa, os mecanismos de ao

desses peptdeos, necessria a determinao de suas estruturas tridimensionais em condies
que mimetizem meios fisiolgicos.

1.3. Sntese em fase slida de peptdeos pela estratgia Fmoc.

A sntese em fase slida baseia-se na construo de uma cadeia peptdica, resduo a
resduo, sobre um suporte slido insolvel. Esse mtodo tem algumas vantagens claras:
possibilita separar as cadeias peptdicas intermedirias somente pela retirada de solventes ou por
filtrao e utiliza um menor volume de solventes, em comparao com as snteses em soluo.
Esse mtodo consiste em acoplamentos de aminocidos, lavagens da resina e desprotees dos
grupos N-terminais sucessivos, sendo possvel automatizar todo o procedimento. Pelo fato de
sempre se utilizar reagentes em excesso, os rendimentos dessa modalidade de sntese so, em
geral, consideravelmente altos. Contudo, existem algumas desvantagens, tais como a perda
sucessiva de rendimento quando um determinado acoplamento for incompleto e o acmulo de
impurezas na resina, que pode ocasionar reaes secundrias com o produto, e especialmente a
formao de produtos com deleo de resduos de aminocidos (Chan & White, 2000).
 Em geral, para se certificar do sucesso das reaes, utilizam-se testes qualitativos simples
e de fcil execuo de forma a poderem ser utilizados a cada acoplamento ou desproteo. O
teste mais utilizado para esse fim o Teste de Kaiser (Troll & Cannan, 1953), que identifica
aminas primrias na estrutura por meio de uma variao da colorao da resina.

Toda sntese em fase slida, independentemente da estratgia empregada, tem o mesmo

fundamento. Primeiramente, todas as resinas empregadas tm uma base polimrica insolvel e
ligada a ela, vrios grupos reativos, denominados ligantes, que iro reagir com os aminocidos e
prend-los ao suporte insolvel. Todos os aminocidos utilizados tm seus grupos reativos
(amino ou carboxila e alguns grupos de cadeias laterais) protegidos para no ocorrerem muitas
reaes secundrias. Os grupos protetores da extremidade responsvel pelo acoplamento
(extremidade amino ou carboxi) devem ser lbeis em um meio que no cause a desproteo dos
grupos protetores das cadeias laterais, de forma que estes ltimos devem permanecer ligados aos
resduos de aminocidos at o final da sntese, sendo denominados protetores permanentes. Cada
derivado de aminocido da sequncia adicionado cadeia pelo grupo no protegido, sendo que,
ao final do acoplamento, tem-se a outra extremidade ainda protegida. feita, ento, a
desproteo dessa extremidade e o subsequente acoplamento do prximo resduo. Ao final da
sntese, feita a clivagem do peptdeo, separando-o da resina, e, concomitantemente, a
desproteo de todos os grupos protetores das cadeias laterais. A Figura 1.10 mostra uma
representao esquemtica da sntese de peptdeos em fase slida, com a ligao do grupo
resina, que a mais amplamente utilizada.

Figura 1.10. Representao esquemtica do incio da sntese de peptdeos em fase slida.

Modificado de http://www.cem.com.
 A estratgia Fmoc uma metodologia que envolve o uso do 9-fluorenilmetiloxicarbonila
(Fmoc, Figura 1.11) como protetor do grupo -amino. Esse grupo removido facilmente em
meio bsico, enquanto que os grupos protetores das cadeias laterais devem ser lbeis em meio
cido. Em geral, utiliza-se para a desproteo uma soluo de piperidina e, para a clivagem final,
emprega-se cido trifluoroactico (TFA), que provoca a quebra da ligao entre o peptdeo e a
resina e retira os grupos protetores das cadeias laterais, alm de ser uma substncia
extremamente voltil, podendo ser retirada do meio por evaporao simples. Juntamente com os
derivados de aminocidos so utilizados compostos denominados ativadores, que ativa o
componente carboxlico que ir reagir com a extremidade N-terminal desprotegida.
Comumente, utilizam-se compostos como carbodiimidas, sais de fosfnio ou urnio e
hidroxibenzotriazol como ativadores. Os principais ativadores utilizados nessa estratgia de
sntese so mostrados na Figura 1.12 (p. 18).

Figura 1.11. Grupo protetor 9-fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc) de terminao -amino.

Figura 1.12. Reagentes ativadores da carbonila mais utilizados na sntese em fase slida de
peptdeos, na estratgia Fmoc.

1.4. Caractersticas angulares de estruturas de protenas e

peptdeos

Apesar de essas biomacromolculas possurem uma gama enorme de possibilidades

conformacionais, normalmente apenas uma pequena frao das possibilidades de estruturao
possvel, devido a diversos fatores estruturais, como repulses estricas, aromaticidade,
interaes eletrostticas, de Van der Waals e ligaes hidrognio, dos tipos intra e
intermoleculares. Em seu estado nativo, ou seja, temperatura ambiente, em soluo e sem
interaes com outra protena, para a maior parte desses compostos, as distribuies dos ngulos
diedros da cadeia principal (, e ) so restritas a apenas alguns valores.

O ngulo o ngulo relativo ligao peptdica, envolvendo os tomos   

  1    1 (Figura 1.2, p. 7), e dependente do tipo de resduo de aminocido. Devido
ao fato de ser uma ligao amdica e apresentar efeitos de ressonncia, a ligao peptdica possui
um carter parcial de ligao dupla. Isso significa que sua rotao livre no possvel, o que
resulta em uma geometria da ligao peptdica sempre perto da planaridade. Normalmente, o
ngulo tem o valor de 180, caracterizando uma conformao trans. Entretanto, conformaes
cis ( = 0) tambm so encontradas, e so consideradas como parte importante na funo da
protena. Resduos de prolina, em especial, tm uma tendncia maior a adotar essa conformao,
principalmente em seu lado N-terminal, conforme mostrado na Figura 1.5 (p. 9). De fato, estudos
que se basearam em consideraes termodinmicas, estimam que, em peptdeos acclicos,
aproximadamente 30% das ligaes entre um resduo de prolina e um outro resduo de
aminocido qualquer podem estar na forma cis, enquanto que apenas 1,5% de ligaes peptdicas
entre dois resduos que no sejam prolinas apresentam esse tipo de conformao (Weiss et al.,
1998).

Outra caracterstica interessante do ngulo diedro da ligao peptdica que, na

realidade, existe uma distribuio de valores de ao redor de seu valor ideal. Anlises de diversas
estruturas proticas resolvidas por difrao de raios-X mostraram que o desvio-padro desse
ngulo de toro de 5,6, o que resulta em desvios de planaridade de at 12 (Morris et al.,
1992; MacArthur & Thornton, 1996; Wilson et al., 1998).

Os ngulos  e , por sua vez, representam variveis mais importantes nas estruturas
dessas biomacromolculas. Suas combinaes caracterizam principalmente a estrutura
secundria de peptdeos e protenas e, at mesmo, estruturas tercirias. Com base em
consideraes estricas, Ramachandran e colaboradores (Ramachandran et al., 1963) mostraram
que combinaes de  e dos resduos de aminocido das cadeias polipeptdicas so restritas a
certas faixas de valores, que podem ser visualizadas no chamado diagrama de Ramachandran
(Figura 1.13, p. 20).
Figura 1.13. Diagramas de Ramachandran especficos para os resduos (a) Gly, b) Pro, c) Val, d)
Ala e (e) diagrama de Ramachandran generalizado. De (a) a (d), d) as cores azul e amarela
representam as regies mais favorecidas do digrama, a cor verde, as regies adicionalmente
permitidas, a cor cinza as regies generosamente permitidas e a cor branca, a regio proibida. Em
(e) as cores vermelha, amarela, marrom-claro e branca representam as regies mais favorecidas,
adicionalmente permitidas, generosamente permitidas e proibidas. Figuras (a) a (d) obtidas pelo
iCing para a estrutura de cdigo PDB 1A24 e figura (e) obtida pelo programa PROCHECK, para
a estrutura de cdigo PDB 1A1P.

Alm das restries estricas, os ngulos e  exibem preferncias de combinaes entre

si que dependem do tipo de resduo envolvido e dos elementos de estrutura secundria,
resultando em uma distribuio mais especfica desses ngulos diedros. Como ser discutido
posteriormente, o diagrama de Ramachandran tem extrema importncia na anlise estrutural de
modelos experimentais e puramente tericos de peptdeos e protenas.

1.5. Determinao de estruturas de protenas e peptdeos

Com o objetivo de se obter um melhor entendimento das funes biolgicas e
mecanismos de ao de peptdeos e protenas, tornou-se imprescindvel a determinao de
estruturas tridimensionais em diversas condies. Muitas so as tcnicas que so capazes de
fornecer tais informaes, porm a Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) vem-se consolidando
cada vez mais como uma poderosa ferramenta para obteno de dados estruturais de peptdeos e
protenas em variados meios. Porm, previamente ao estudo estrutural por RMN, so realizados
rotineiramente experimentos de Dicrosmo Circular (CD) com o objetivo de obter informaes a
respeito de sua estrutura secundria e equilbrio entre diferentes estados conformacionais de
peptdeos e protenas em um dado ambiente a ser empregado no experimento de RMN.

1.5.1. Dicrosmo Circular

A espectroscopia de dicrosmo circular (CD) baseia-se na absoro preferencial de uma
das componentes circulares da luz plano-polarizada por grupos cromforos de uma amostra
opticamente ativa. Entrando em contato com a amostra, essa luz passa a apresentar certa
diferena de fase entre as amplitudes de suas componentes circulares (Brahms & Brahms, 1980;
Cantor & Timasheff, 1982). Essa diferena denominada elipticidade, , podendo assumir
valores positivos ou negativos, dependendo da componente preferencialmente absorvida.

A espectroscopia CD muito utilizada no estudo estrutural de peptdeos. Nesta classe de

substncias, o grupo cromforo de maior importncia o grupo amida   =  
 , correspondente ligao peptdica. Apesar de existir influncia de grupos aromticos
pertencentes s cadeias laterais de determinados resduos de aminocido, a anlise das
absorbncias das ligaes peptdicas que fornece informaes valiosas a respeito da estrutura
secundria dos peptdeos.

A intensidade e energia referentes s absores desses cromforos dependem dos valores

adotados pelos ngulos diedros  e (Figura 1.2, p. 7). Isso ocorre porque esses ngulos diedros
definem as condies de coplanaridade dos orbitais envolvidos na ligao peptdica. Como os
valores desses ngulos dependem das interaes intramoleculares, do estado de agregao e das
interaes que o peptdeo pode fazer com o solvente, as absores so dependentes das
conformaes adotadas.

Atravs do estudo por CD, pode-se inferir sobre a predominncia das estruturas
secundrias -hlice e folha- ou a ausncia de um padro estrutural recorrente (denominado
estrutura randmica). Cada estrutura secundria (ou ausncia dela) corresponde a determinadas
transies eletrnicas que implicam em absorbncias, de sinal positivo ou negativo em
determinado comprimento de onda (). A determinao da estrutura secundria predominante
ou estrutura secundria mdia realizada por comparao com espectros padres de CD de
outras amostras cujas estruturas secundrias so conhecidas e bem definidas. Essa comparao
realizada por meio de clculos de desconvoluo (Cantor, 1982; Sreerama, 2000), em que se
considera que o espectro CD uma combinao linear de diferentes caractersticas espectrais
induzidas pela estrutura secundria de um peptdeo. Esses espectros de CD padres e suas
respectivas absores e transies so mostrados na Figura 1.14.

Estrutura Transio /nm

Randmico n* Positivo a 212

* Negativo a 195

Folha * Positivo a 196

n* Negativo a 218

-hlice * Positivo a 192

* Negativo a 209
n* Negativo a 222

randmicas e , a estruturas folha-.

Figura 1.14. Espectros padro de dicrosmo circular, em que se refere -hlice; r, a estruturas

1.5.2. Ressonncia Magntica Nuclear em soluo

A ressonncia magntica nuclear (RMN) uma tcnica que tem sido usada de forma
crescente para a elucidao estrutural de biomacromolculas como peptdeos, protenas e cidos
nuclicos (Cavanagh et al., 2006), especialmente devido a sua versatilidade em proporcionar a
obteno de dados nos mais diversos meios, alm de fornecer informaes a respeito de aspectos
mais dinmicos da estrutura, bem como estados de agregao e reatividade de stios. A RMN tem
sido uma ferramenta poderosa para determinar a estrutura de peptdeos e protenas ativos em
membranas, sendo empregada nas fases lquida e slida.

Apenas oito anos aps a primeira descrio do efeito do spin nuclear por Isidor Rabi em
1939 (Gil, 1987), estudos de elucidao estrutural de substncias orgnicas foram realizados com
amostras slidas e lquidas (Gntert, 1998). Em 1954, Jacobson e colaboradores utilizaram pela
primeira vez a RMN em soluo para estudar uma biomacromolcula, investigando o efeito do
solvente nas propriedades do DNA (Jacobson et al., 1954). Nesse estudo empregando RMN de
1H, verificou-se que a alta viscosidade presente em solues de DNA deve-se formao de
camadas de hidratao com uma ordenao superior da gua pura. Em 1957 foi obtido o
primeiro espectro de RMN de 1H de uma protena, a ribonuclease (Saunders et al., 1957). At
1965 foram publicados 30 trabalhos descrevendo aplicaes da RMN a biomacromolculas. No
incio da dcada de 1970 havia 200 publicaes e, em 1980, esse nmero se aproximava a 4.000
publicaes, utilizando informaes dos espectros de RMN em uma dimenso (RMN 1D) para
investigar propriedades especficas dessas estruturas (Gntert, 1998).

Os primeiros trabalhos que utilizaram a RMN para a obteno de estruturas

tridimensionais de biomacromolculas datam do incio da dcada de 1980. A determinao
estrutural do glucagon (Braun et al., 1981) e o estudo conformacional de uma toxina de escorpio
em soluo aquosa (Arseniev et al., 1984) foram realizados aplicando-se RMN a metodologias de
restries conformacionais. Um trabalho de maior complexidade foi realizado por Zuiderweg e
colaboradores, que analisaram a influncia do lac repressor na estrutura de trs cadeias na forma
-helicoidal (Zuiderweg et al., 1984). Posteriormente, foram realizadas a elucidao estrutural da
aI-purotionina, com resultados similares obtida por difrao de raios-X (Clore et al., 1986) e a
determinao do inibidor protease IIA (Williamson et al., 1985).

A partir de meados da dcada de 1980, verificou-se o uso crescente de RMN em duas

dimenses (RMN 2D) na anlise tridimensional de biomacromolculas. Apesar da converso de
dados obtidos dos mapas de contornos de RMN em informaes estruturais no ser um
procedimento trivial, o uso de mtodos computacionais, incluindo refinamentos baseados em
simulaes tericas, tem sido uma ferramenta importante nesses estudos. Esses mtodos
computacionais tiveram maior aceitao aps a determinao estrutural do tendamistato por
RMN (Kline et al., 1986), com resultados similares aos obtidos por raios-X (Pflugrath et al., 1986).
Nessa mesma poca, Wthrich introduziu a metodologia de atribuio sequencial, baseada na
identificao de sequncias nicas de resduos em cadeias polipeptdicas e de cidos nuclicos
(Wthrich, 1986). Atravs dessa metodologia pde-se sistematizar a obteno de informaes
estruturais dos mapas de contornos de RMN 2D. Desde ento, a espectroscopia de RMN e sua
aplicao nos estudos de biomacromolculas desenvolveram-se consideravelmente, obtendo-se
espectros em aparelhos de altas resolues e mapas de contornos multidimensionais sem
sobreposio de sinais.

Uma diversificao crescente de tcnicas de RMN combinadas a mtodos computacionais

tem sido verificada para determinao estrutural de biomacromolculas, justificando uma reviso
dos seus usos em anlises configuracional e conformacional. Assim sendo, a seguir so descritas
as principais metodologias da RMN na determinao estrutural de peptdeos, abordando as
restries conformacionais a partir de dados de RMN, as informaes estruturais contidas em
mapas de contornos de RMN 2D, a anlise sistemtica de conformaes locais, as consistncias
dos dados para atribuies estereoespecficas no determinadas diretamente pelos dados de
RMN, a converso dos parmetros obtidos experimentalmente em informaes tridimensionais,
clculos tericos de otimizao de geometria das estruturas resultantes e as metodologias de
anlise para validar ou no o modelo final.

1.5.2.1 Atribuio Sequencial

O mtodo de atribuio sequencial foi proposto por Kurt Wthrich em 1986 (Wthrich,
1986) e, utilizando da combinao de espectros bidimensionais, permite a obteno de
informaes sobre as conectividades intra e inter-residuais de tomos de hidrognio. Os espectros
COSY ou TOCSY permitem obter conectividades intrarresiduais, atravs das ligaes
(acoplamento escalar J), permitindo, dessa forma, a identificao do sistema de spins de cada
resduo na sequncia peptdica. No mapa de contornos NOESY, as conectividades obtidas se do
atravs do espao (devidas relaxao cruzada via dipolo-dipolo), podendo ser tanto do tipo
intrarresidual quanto inter-residual ( ," Figura 1.15b, p. 25). Nessa etapa, so identificadas as
correlaes NOE do tipo sequencial ( ,   1,  ,   1 e  ,   1), que permitem
identificar quais resduos de aminocido esto ligados entre si. Alm disso, so utilizados
concomitantemente mapas de contorno de experimentos heteronucleares como 1H,13C-HSQC e
1H,15N-HSQC, por exemplo. Esses experimentos ajudam a resolver problemas de ambiguidade
de atribuio que podem ser resultantes de sobreposies dos sinais.
 CH O

a) N-Terminal N C C N C-Terminal
i i

H H H

d (i,i+3)

b) i
H 2C
i
O
i+1
H2C
i+1
O
i+2
H 2C
i+2
O
i+3
H 2C
i+3
O
i+4
N C C N C C N C C N C C N
d N dN
H H H H H H H H H
d NN
d N (i,i+2)
d N (i,i+3)
d N (i,i+4)

Figura 1.15. Representao de possveis interaes entre tomos de hidrognio intraresiduais (a).
(a)
Esquema da representao de NOEs tpicos de estrutura secundria -hlice (b).
(b)

Tendo sido determinada a estrutura primria da protena ou peptdeo, tem-se incio

atribuio de correlaes NOE caractersticas de cada estrutura secundria. Como neste trabalho,
estudou-se somente peptdeos com estruturas secundrias do tipo -hlice, a Figura 1.15 mostra
apenas os NOEs tpicos dessa estrutura secundria.

Por fim, tendo sido atribudos os sinais relativos estrutura secundria, passa-se
atribuio de NOEs referentes a estruturas terciria e quaternria. Devido ao fato de esses nveis
estruturais no apresentarem padres recorrentes como as estruturas secundrias, a atribuio de
sinais nessa etapa, bem como o tratamento posterior dos dados, bem mais trabalhoso, como
ser discutido nos estudos realizados para este trabalho.

1.5.2.2 Converso de dados de RMN para informaes estruturais

tridimensionais
Ao contrrio das tcnicas de difrao, grande parte dos resultados espectroscpicos da
RMN no usada diretamente na determinao das estruturas secundria e terciria de peptdeos
e protenas. Para tal, restries geomtricas conformacionais so calculadas a partir desses dados
e, subsequentemente, usadas para o clculo das estruturas (Wthrich, 1986; Cavanagh et al.,
2006)
 Existem atualmente trs principais classes de restries estruturais que podem ser
distinguidas: restries de distncia, restries de ngulos diedros (ou ngulos de toro) e
restries orientacionais.

1.5.2.2.1 Restries de distncia

As restries de distncia podem ser divididas em duas classes principais: restries
derivadas de NOEs e restries de ligao hidrognio, diferenciando-se entre si tanto pela
metodologia utilizada na aquisio dos dados de RMN quanto pelo seu efeito no clculo final das
estruturas.

Como comentado na seo anterior, as restries derivadas de NOEs tm como princpio

o fato de, no efeito nuclear Overhauser, a transferncia de magnetizao ocorre pelo espao, o
que propicia dois ncleos interagirem entre si, mesmo que eles estejam distantes entre si na
estrutura primria do peptdeo. Alm disso, a intensidade ou volume $ do sinal de NOE
dependente do valor mdio da sexta potncia do inverso da distncia % entre os dois ncleos  e
& que interagem entre si, multiplicado por um fator '() , que leva em conta efeitos globais e
movimentos internos moleculares, conforme representado pela Equao 1.1.

$ = % +, '()  (Eq.
(Eq. 1.1)

Embora seja possvel calcular diretamente os volumes dos sinais de NOE pela Equao
1.1, muito mais comum classificar os NOEs de acordo com sua intensidade: fortes, mdios e
fracos (Markley et al., 1998), correspondendo, respectivamente, a limites superiores de distncia
de 2,80, 3,40 e 5,00 . Embora, primeira vista, essa metodologia possa parecer menos precisa
que a converso pela Equao 1.1, a classificao semiquantitativa dos NOEs reflete melhor as
incertezas experimentais advindas de efeitos como difuso de spin e dinmicas locais, bem como
erros de integrao dos sinais e sobreposies nos espectros (Nabuurs et al., 2004). importante
notar que vrios tratamentos so utilizados para uma converso mais efetiva dos sinais, levando
em conta diversos fatores, como por exemplo degenerescncias espectrais de grupos metila e
anis aromticos em resduos de aminocido (Fletcher et al., 1996; Guntert, 1998).

As restries de ligao hidrognio tambm levam em conta valores mximos e mnimos

de distncia, porm, ao contrrio das restries de distncia derivadas de correlaes NOE, um
conjunto de duas restries considerado conjuntamente, conforme mostrado na Figura 1.16 (p.
27). Esses limites mximos e mnimos de distncia so estipulados de forma que os tomos que
participam desse tipo de interao (tomo doador de eltrons e hidrognio aceptor de eltrons)
tenham entre si distncias consideradas timas para que ocorra a ligao de hidrognio (entre 1,8
e 2,0 ). Em estruturas -hlice, este tipo de restrio de grande utilidade, uma vez que so
observadas comumente ligaes de hidrognio inter-residuais na cadeia principal dos tipos ,
  3; ,   4 e ,   5, entre tomos de hidrognios amdicos e oxignios carbonlicos, conforme
mostrado na Figura 1.17.

H
1,8 < dOH< 2,0

N
O 2,7 < dOH< 3,0

Figura 1.16. Limites de valores de distncia para as restries de ligao de hidrognio em

ligaes peptdicas.

Figura 1.17. Estrutura -hlice determinada univocamente, com representao, em tubo

amarelo, das trs restries de ligao de hidrognio possveis de ocorrer. Figura retirada de
(Nabuurs, Spronk et al., 2004).
Os tomos que participam da ligao hidrognio podem ser determinados por
experimentos que permitam identificar tomos de hidrognio que no sofrem troca com
deutrio (ou que troquem mais lentamente) em solventes prticos deuterados (Wagner &
Wuthrich, 1982; Konrat et al., 1999), por valores de deslocamento qumico (Wishart et al., 1992),

 
 

1 41
ou constantes de acoplamento do tipo e (Cordier & Grzesiek, 1999;
Cordier et al., 1999).
1.5.2.2.2. Restries de ngulos diedros
Assim como as distncias interatmicas, os ngulos  e podem ter tambm seus
valores restritos, com base em dados advindos de experimentos de RMN. Tradicionalmente,
utilizam-se valores de constante de acoplamento escalar do tipo 4
, que podem ser convertidos
em valores angulares por meio da relao de Karplus (Karplus, 1959), descrita na Equao 1.2:

 = 6 cos    : cos   

5
(Eq. 1.2)

em que corresponde ao ngulo de toro entre os quatro tomos envolvidos e os trs

parmetros 6, : e  so empiricamente determinados, utilizando-se modelos de estruturas
provenientes de experimentos de difrao de raios-X.

4
Os valores de so obtidos normalmente por experimentos de RMN de 1H
unidimensionais acoplados e, quando h resoluo espectral suficiente, tcnicas como DQF-
COSY, TQF-COSY e E.COSY (Griesinger et al., 1985; Mujeeb et al., 1999) e Phase Sensitive
COSY (Delaglio et al., 2001) so empregadas. Entretanto, experimentos de RMN de 1H
unidimensionais so muitas vezes inviveis, devido grande sobreposio de sinais e os
experimentos DQF-COSY, TQF-COSY e E.COSY no costumam fornecer resultados
satisfatrios, em especial quando se trabalha com macromolculas em abundncia natural, em
que, muitas vezes, as correlaes cruzadas no exibem estrutura fina e a maior parte das
diagonais dos multipletos se sobrepem (Delaglio et al., 2001). Alm disso, a converso desses
dados em restries deve ser feita de forma manual, sem levar em considerao a impreciso do
experimento, devido falta de algoritmos que realizem esse tipo de converso. No caso do Phase
Sensitive COSY, possvel realizar a converso dos valores de constante de acoplamento 4
em
restries, mas os diversos tratamentos que devem ser dispensados ao espectro para que se
extraiam as restries, tornam essa tcnica um tanto proibitiva e pouco utilizada.

As restries angulares podem, no entanto, ser obtidas por meio de valores de

deslocamento qumico dos tomos pertencentes cadeia principal do peptdeo em estudo. Os
programas que realizam essa converso so TALOS (Cornilescu et al., 1999) e sua verso mais
recente TALOS+ (Shen et al., 2009). Ambos os programas baseiam-se no fato de que os valores
de deslocamento qumico so grandezas extremamente sensveis ao ambiente qumico em que se
encontra o ncleo (Vranken & Rieping, 2009). Assim sendo, combinaes dos ngulos diedros 
e contribuem significativamente para os valores de deslocamento qumicos dos tomos que
compem a cadeia principal da biomolcula. Esses programas fazem uso de uma base de dados
de deslocamentos qumicos de tomos de protenas cujas estruturas foram elucidadas com alta
resoluo, utilizando diversos clculos e tratamentos estatsticos e determinam com preciso as
restries angulares.

1.5.2.2.3. Restries orientacionais

Todas as restries geomtricas descritas anteriormente so de curto alcance. Embora elas
muitas vezes sejam suficientes para a determinao estrutural de protenas globulosas e peptdeos
de massas moleculares baixas, o mesmo no pode ser dito para biomolculas com geometria
mais linear. Nesses casos, faz-se necessria a obteno de informaes geomtricas de longo
alcance envolvendo especialmente suas extremidades (Clore et al., 1999). Uma grandeza medida
por RMN que permite a obteno de informaes dessa natureza o acoplamento dipolar entre
ncleos. Acoplamentos dipolares dependem tanto da distncia entre dipolos magnticos quanto
de suas orientaes em relao ao campo magntico externo ;<. Entretanto, em solues
isotrpicas, a dependncia do valor do acoplamento dipolar em relao a ;< nula, devido ao
fato de as amostras solubilizadas no adquirirem ordenao em razo da rotao das suas
molculas e do movimento browniano (Lipsitz & Tjandra, 2004).

Na forma cristalina, porm, devido s significativas restries de movimento das

biomolculas, bem como ao total alinhamento de vetores dipolo magntico em relao a ;<, os
acoplamentos dipolares resultantes so demasiadamente grandes, a ponto de interferirem na
anlise de RMN. Dessa maneira, a medida dessas grandezas em amostras na forma cristalina
bastante difcil e impraticvel na maioria dos casos. No entanto, possvel ordenar amostras em
meios lquidos fracamente orientados como cristais lquidos e bicelas, o que faz com que os
acoplamentos dipolares sejam pequenos e mensurveis, sendo assim denominados de
acoplamentos dipolares residuais (RDC). Esse acoplamento relaciona-se diretamente s colises
entre molculas da amostra e do solvente, resultando em uma ordenao mnima e acoplamento
dipolar mensurvel (Tjandra & Bax, 1997). Os RDCs podem ser medidos pelos mapas de
contornos 1H,15N-HSQC ou 1H,13C-HSQC sem desacoplamento na dimenso do carbono ou
nitrognio, respectivamente (Figura 1.18, p. 30).
Figura 1.18. Mapas de contornos 1H,15N-HSQC: (a) desacoplado em ambas as dimenses, com
desdobramentos 15N-1H no observados; (b) sem desacoplamento na dimenso 15N, em soluo
isotrpica, com desdobramentos 15N-1H iguais ao acoplamento escalar 15N-1H (~92 Hz); (c) sem
desacoplamento na dimenso 15N, meio parcialmente orientador, desdobramentos 15N-1H
somados aos RDCs.

1.5.2.2.4. Construo dos modelos estruturais a partir dos dados de restrio

conformacional: Arrefecimento Simulado
Aps se obterem as restries conformacionais, elas so utilizadas para o clculo dos
modelos estruturais. Diversas metodologias de clculo foram utilizadas desde os primeiros
trabalhos de determinao estrutural por RMN, sendo que os protocolos mais largamente
empregados so o clculo em geometria de distncias (Braun et al., 1981; Havel & Wthrich,
1984) o clculo por funes-alvo variveis (Braun & Go, 1985) e o arrefecimento simulado,
tambm conhecido pela expresso em ingls simulated annealing (Nilges et al., 1988; Brunger et
al., 1997). A metodologia mais largamente utilizada, no entanto o arrefecimento simulado.

O arrefecimento simulado um procedimento de minimizao de energia baseado em

dinmica molecular. O nome desse mtodo deriva de uma tcnica comum em metalurgia para
preparo de estruturas metlicas mais resistentes e estveis por meio de aquecimentos rpidos
alternados com resfriamentos lentos e controlados. Durante o clculo dos modelos, essa variao
de temperatura simulada teoricamente, mostrando-se bastante eficiente para a obteno de
estruturas estveis (Brunger et al., 1990). A Figura 1.19 (p. 31) mostra um exemplo das mudanas
de conformao sofridas durante uma simulao de SA. Como resultado so obtidas geometrias
com energias prximas ao mnimo global da estruturas estudadas (Nilges et al., 1988).
(a)
(b)

alta temperatura baixa temperatura

Figura 1.19. Representao das mudanas sofridas por uma molcula durante o processo de
clculo por recozimento simulado: (a) na conformao e (b) na energia (Nilges, 2001).
Apesar de o arrefecimento simulado ser bastante eficiente e rpido na busca de mnimos
locais de baixa energia, todo o clculo estrutural feito sem considerar efeito algum do solvente
ou de qualquer outra molcula. Uma conseqncia disso pode ser a gerao de estruturas de
baixas energias, mas que no condizem com o sistema real, uma vez que o solvente tem efeito
considervel sobre a estruturao dessas biomolculas. Para contornar isso, recomendvel
analisar detalhadamente os parmetros de qualidade estrutural e realizar refinamentos em
solvente explcito, conforme ser descrito na prxima seo.

1.5.2.2.5. Anlise, Validao e Qualidade Estrutural.

A converso de informaes de RMN de protenas em estruturas tridimensionais tem se
mostrado dependente de metodologias computacionais, bem como os subsequentes
refinamentos e anlises. Se essas informaes no forem suficientes para se obterem estruturas
definidas ou se as geometrias resultantes forem inconsistentes com essas restries, ento se deve
determinar novamente o conjunto de dados de entrada at que se obtenha uma geometria
satisfatria. Logo aps se obter esse conjunto de estruturas, estas so submetidas etapa
posterior de anlise, para determinar o grau de disperso entre os confrmeros calculados, para
inferir a qualidade do conjunto resultante de estruturas e, por fim, validar ou no o mtodo.

1.3.2.2.6. Violaes de Restries

Uma violao de restrio significa que o algoritmo utilizado no satisfez as condies
conformacionais impostas pelas restries. A maior parte dos erros inerentes aos clculos pode
levar a dois tipos de violao. A violao randmica verificada normalmente ao final dos
clculos, ocorrendo em regies diferentes de apenas algumas conformaes obtidas. Quando o
desvio dos valores finais das variveis geomtricas no difere consideravelmente das restries,
essas violaes randmicas no comprometem a anlise conformacional. Contudo, a
discrepncia muito grande entre as geometrias finais e as restries conformacionais
correspondentes pode surgir de erros em etapas anteriores ou do fato de que os dados utilizados
no foram suficientes para gerar um grupo definido de conformaes similares.

As violaes consistentes so assim consideradas caso ocorram em aproximadamente

75% das conformaes do conjunto final calculado, indicando falhas mais graves em regies
definidas, principalmente na atribuio nos mapas de contornos de RMN. Esse tipo de violao
pode advir de inconsistncias nos dados de entrada, erros de atribuio, problemas de calibrao
das intensidades de sinais NOE, ou a presena de diversos monmeros no meio em que foram
adquiridos os dados. O nmero e magnitude das violaes de restrio de um conjunto de
conformaes podem indicar o grau de concordncia entre os dados experimentais e os modelos
tericos empregados. Entretanto, a interpretao desse nmero de violaes pode ser dificultada
pelos critrios de seleo das conformaes baseada em energia.

Os programas computacionais de identificao de violaes utilizam um parmetro

denominado valor de corte. As distncias ou ngulos abaixo do valor de corte no so
considerados violaes, porm, aqueles valores acima so tratados como violaes. Isto permite
avaliar se, no conjunto final de geometrias de uma estrutura, h violaes de restries. No
entanto, a utilizao de um valor de corte demasiado grande pode encobrir restries oriundas
de violaes consistentes, resultando em anlises estruturais incorretas. Assim sendo, torna-se
apropriada tambm a verificao de ocorrncia de violaes de restrio a valores de corte mais
baixos.

As geometrias geradas a partir das informaes dos dados de RMN podem apresentar
violaes estruturais, resultando em imprecises de algumas regies especficas do conjunto de
geometrias geradas ou, at mesmo, em estruturas tercirias totalmente incorretas. Desta forma, a
validao das geometrias obtidas pelas informaes dos dados de RMN torna-se muito
importante para que a anlise conformacional tenha um grau satisfatrio de qualidade.

Os programas utilizados no clculo estrutural possuem uma gama de algoritmos que

medem a qualidade dos resultados da anlise. Este no um procedimento trivial, pois envolve
aspectos como a qualidade da teoria ou modelo, amostragem e convergncia dos resultados, bem
como a exatido do campo de fora, a eficincia e adequao do software utilizado nos clculos
(Spronk et al., 2004). A validao pode resultar em uma concordncia entre o experimento e o
modelo. Isso pode indicar que a simulao reflete realmente o sistema experimental, a tcnica de
simulao utilizada insensvel propriedade estudada ou houve compensao de erros. Por sua
vez, a no concordncia entre os resultados tericos e experimentais pode ser devida ao modelo
estar incorreto, a um campo de fora inadequado, no convergncia da simulao, a problemas
e a usos incorretos do software, a dados incorretos, ou at mesmo uma estrutura pouco comum
(Van Gunsteren, 1998).

1.5.2.7. Contedo de Informao como Parmetro de Qualidade

Devido ao fato de a determinao estrutural de peptdeos e protenas por RMN depender
de uma densa rede de restries geomtricas de vrios tipos, existe uma tendncia em considerar
que quanto maior for o nmero de restries utilizadas, melhor a qualidade do modelo
construdo. Nem sempre isso verdade. Em um estudo feito com cinco estruturas de protenas
depositadas no PDB (Nabuurs et al., 2003), observou-se que cerca de 30% das restries de
distncia desses peptdeos so do tipo intrarresidual, uma porcentagem prxima das restries
longa distncia (restrio entre tomos de hidrognio separados entre si por mais de quatro
resduos na sequncia polipeptdica). Entretanto, enquanto o conjunto de restries longa
distncia for responsvel por cerca de 30% das informaes estruturais, o conjunto das
intrarresiduais conteria no mximo 0,4% dessa informao. Interessantemente, o conjunto de
restries de ligao de hidrognio, que constitua, no mximo, 7,5% de todas as restries, for
responsvel por cerca de 30% da informao estrutural do modelo.

Essa diferena entre o impacto de diferentes tipos de restrio sobre o conjunto final de
estruturas deve-se principalmente ao fato de as estruturas que servem de entrada para o clculo
j serem previamente parametrizadas, com valores fixos de comprimento de ligao, hibridizao
e relaes angulares timos j definidos. Portanto, grande parte das informaes estruturais a
curta distncia est definida antes mesmo de o clculo ter incio. A essas restries que contm
pouca informao estrutural, d-se o nome de restries redundantes.

Assim como existem restries que contm pouca ou nenhuma informao a respeito da
estrutura, existem aquelas que, sozinhas, so responsveis pela maior parte da estrutura terciria
da macromolcula. Essas restries so denominadas de restries inconsistentes e devem ser
examinadas cuidadosamente, uma vez que elas podem ser resultantes de uma atribuio
incorreta, ou podem simplesmente ser a nica restrio encontrada para certa caracterstica
geomtrica presente na estrutura.

A determinao do contedo de informao em um conjunto de restries realizada

pelo programa QUEEN (Quantitative Evaluation of Experimental NMR Restraints) (Nabuurs,
Spronk et al., 2003). O clculo da informao em si feito tendo como base a Teoria da
Informao desenvolvida por Claude E. Shannon (Shannon, 1948) e desenvolvido em espao de
distncia, em vez do espao cartesiano.

O desenvolvimento completo da metodologia utilizada para a determinao do grau de

informao das restries est fora do escopo deste trabalho, mas, de forma simplificada, a
tcnica empregada consiste na utilizao da incerteza  da Teoria da Informao e subsequente
definio de uma medida de incerteza para cada tomo ( ), que pode ser expandida para uma
incerteza da estrutura (=>
"?
?"@ ), ao se considerar que as incertezas atmicas so grandezas
independentes entre si (para mais detalhes, consultar Nabuurs et al., 2003). Por fim, a informao
total (A
B
@ , Eq.1.3) contida em um conjunto de  restries experimentais dada pela equao
1.3:

A
B
@ = =>
"?
?"@|D =>
"?
?"@|E (Eq 1.3)

em que =>
"?
?"@|D a incerteza da estrutura sem nenhuma restrio experimental e
=>
"?
?"@|E a incerteza da estrutura com  restries experimentais.

Similarmente, a informao (A" , Eq.1.4) de uma nica restrio experimental % pode ser
definida da seguinte maneira:

A" = =>
"?
?"@ =>
"?
?"@|" (Eq 1.4)
1.4

em que =>
"?
?"@|" a incerteza da estrutura, dada uma restrio % e =>
"?
?"@ , a incerteza da
estrutura antes da adio da restrio %.

Podem ainda ser desenvolvidos dois conceitos mais teis na prtica: a unicidade de
informao (A?," , Eq.1.5) e a informao mdia (AF=," , Eq.1.6). A unicidade, ou informao
nica, referente a uma restrio % definida como a informao adicionada por essa restrio,
tendo-se conhecimento das demais restries ( %) no conjunto de dados:

A?," = =>
"?
?"@|E+" =>
"?
?"@|E (Eq 1.5)
1.5
 A importncia de uma restrio, considerando-se a totalidade do conjunto de restries,
obtida calculando-se o contedo mdio de informaes amostrado pelo conjunto de dados
completo (AF= ). A informao mdia da restrio pode ser calculada para um conjunto de 
restries pela mdia do contedo de informao em cada permutao possvel da lista de
restries:

AF=," = =>
"?
?"@ =>
"?
?"@|" (Eq. 1.6)

Essas duas grandezas so utilizadas para identificar possveis restries incorretas ou

pouco suportadas pelo conjunto total de restries (Nabuurs et al., 2005) e devem, sempre que
possvel, ser analisadas conjuntamente, uma vez que a unicidade permite identificar restries
inconsistentes ou que simplesmente constituem a nica fonte de informao para uma
caracterstica estrutural. No entanto, se houver, por exemplo, duas restries que contm alto
grau de informao, mas que so mutuamente coerentes, o clculo de unicidade no ser capaz
de identific-las como restries de alta informao (e.g. duas restries do tipo G ,   4 e
G ,  4, mesmo que sejam as nicas restries caractersticas de -hlice em uma
determinada estrutura e que, por isso, contm alto grau de informao, no sero identificadas
como tal pelo clculo de unicidade, por serem mutuamente coerentes). O parmetro informao
mdia, no entanto, apesar de isoladamente no promover uma distino fcil de restries
inconsistentes, capaz de identificar o impacto das restries sobre a estrutura, mesmo se estas
constiturem um conjunto consistente entre si.

1.5.2.2.8. Parmetros estatsticos utilizados na anlise da qualidade estrutural

A maioria dos mtodos que analisa a qualidade estrutural de peptdeos utiliza grandezas
estatsticas para quantificar a distribuio dos dados geomtricos dos modelos, bem como sua
normalidade em relao a estruturas consolidadas e determinadas em alta resoluo. Este tpico
explica sucintamente alguns desses parmetros utilizados na anlise estrutural e que foram
empregados neste trabalho.

Z--score
1.5.2.2.8.1. Z
O Z-score um dos principais parmetros utilizados pelo programa WHATIF,
possibilitando julgar quando determinada propriedade de uma estrutura pode ser considerada
boa, ruim ou anormal (Hooft et al., 1997; Linge et al., 2003). O Z-score relaciona um valor x de
um parmetro a uma distribuio gaussiana de um banco de dados (Equao 1.7). Nesta equao,
HI e JHI  so respectivamente a mdia e o desvio padro desse valor. Pelos valores de Z-
score calculados sabe-se quais dados so valores isolados (outliers), ou seja, quais so improvveis
de ocorrer.

H HI
K= (Eq. 1.7)
JHI 

O RMS Z-score permite a anlise da qualidade dos dados e do Z-score, verificando se a

distribuio de valores tem mais ou menos valores isolados que o esperado e dado pela
Equao 1.8. O parmetro K o Z-score definido pela Equao 1.7 para a observao &, sendo
que  o nmero total de observaes.

P K 
LMK = N (Eq.

(Eq. 1.8)

1.5.2.2.8.2. Desvio Quadrtico Mdio (RMSD Root Mean Square Deviation)

O desvio quadrtico mdio (RMSD) uma grandeza utilizada geralmente para quantificar as
diferenas entre as geometrias de um conjunto de estruturas tericas. Os clculos do RMSD
dependem da forma da funo restringente. A funo potencial bi-harmnica inclui todos os
desvios em relao a uma distncia definida. No caso da funo do tipo potencial de poo
quadrado, so considerados somente os desvios que se encontrarem fora dos limites superior e
inferior (Brunger, Adams et al., 1997), resultando a Equao 1.9. O parmetro Q a distncia
calculada para a restrio k no modelo R, %Q>? o limite superior da restrio S e %QT o limite
inferior da restrio S. A soma calculada para todas as " restries de distncia e para todos os
Nm modelos. Como resultado, tem-se a medida mdia da diferena das posies entre os tomos
nas estruturas.

Q > %Q>? Z[ = `Q %Q>? a

1
] \

LM =W X XZ[  com ^%QT <  %Q>? Q = 0 (Eq.

UV
" F
%Q < %Q Q = `%Q Q a
(Eq. 1.9)
QP P T T

O valor de RMS no fornece informaes sobre a consistncia dos dados experimentais,

tampouco corresponde necessariamente ao espao conformacional permitido pelas restries
conformacionais. Alm disso, a amostragem das geometrias pelo algoritmo de clculo pode estar
viciada, com restries de geometria em acordo com os dados, mas que diferem
significativamente das resultantes do clculo estrutural. Isso pode ocorrer quando so
empregadas poucas geometrias para o tratamento estatstico. De modo geral, a
qualidade/confiabilidade dos resultados desse mtodo est relacionada menor disperso das
geometrias e, consequentemente, a valores menores de RMS. Normalmente, um valor de RMS
at 3 sugere forte similaridade entre as geometrias (Tsai, 2002). Entretanto, importante
salientar que um valor baixo de RMSD no necessariamente sinnimo de um conjunto
estrutural de alta qualidade. Se o conjunto de restries utilizado no clculo contiver restries
erradas, essas incorrees se propagaro igualmente por todas as estruturas que compem o
conjunto final do modelo, fazendo com que ele possua um RMSD baixo, mas com geometria
incorreta. ainda mais importante notar que um valor de RMSD muito baixo, em muitos casos,
no desejvel. Vale a pena lembrar que grande parte das estruturas resolvidas por RMN foi
determinada em soluo e, portanto, espera-se que o modelo que representa o sistema que foi
medido reflita caractersticas de molculas em soluo. Dessa maneira, espera-se que essas
molculas possuam certo grau de mobilidade estrutural. Em outras palavras, valores baixos de
RMSD significam que o modelo pode estar superestimando a preciso da tcnica experimental,
ou a estruturao da macromolcula. De fato, j foi proposto que, em prol de uma qualidade
estrutural maior e tambm de modelos mais realistas, o RMSD seja maximizado, mas ao mesmo
tempo, mantendo a conformidade com os dados derivados dos experimentos (Spronk et al.,
2003).

1.5.2.2.8.3. Distribuio de ngulos Diedros

Combinaes dos ngulos diedros  e so indicadores importantes da qualidade da
conformao de regies definidas de cadeias peptdicas. Conforme visto anteriormente, as
possveis combinaes desses dois ngulos esto restritas por fatores estricos a certas regies do
diagrama de Ramachandran (Figura 1.13e, p. 20). A anlise da qualidade dos modelos feita
geralmente com base nas classificaes de combinaes dos ngulos  e em quatro regies do
diagrama: as regies mais favorveis, as adicionalmente permitidas, as generosamente permitidas
e a proibida. A regio adicionalmente permitida indica conformaes permitidas nos limites
extremos para os contatos atmicos desfavorveis. A regio generosamente permitida reflete
conformaes que so permitidas somente se houver certa flexibilidade nos ngulos de ligao.
Na regio proibida, as conformaes so quase totalmente impedidas por fatores estricos.
 Em geral, para quantificar a distribuio de pontos no diagrama de Ramachandran,
utilizam-se Z-scores calculados tanto para cada resduo quanto para a cadeia peptdica.
Normalmente, utilizam-se valores de Z-score combinados representao grfica do diagrama
de Ramachandran. A Figura 1.20 mostra um exemplo da relao entre a distribuio de ngulos
em um diagrama de Ramachandran e o valor de Z-score.

Figura 1.20. Relao entre o valor de Z-score e a distribuio de pontos no diagrama de

Ramachandran. (a) Diagrama de Ramachandran com Z-score = 1,8 e (b) com Z-score = -8,3. As
regies favorveis, adicionalmente permitidas, generosamente permitidas e proibidas, esto
representadas, respectivamente, por cinza-escuro, cinza-mdio, cinza-claro e branco. Figura
retirada de (Spronk, Nabuurs et al., 2004).

Os dados em regies proibidas podem significar conformaes anormais ou erros de

clculo, o que ser verificado apenas pela anlise dos dados de entrada. Os resduos de D-
aminocidos so um exemplo de valores em regies proibidas que no necessariamente
constituem um erro. Todavia, resduos em regies permitidas do diagrama de Ramachandran
no significam necessariamente ausncia de erros. Em todos os casos, os Z-scores calculados,
bem como a disperso desses valores no diagrama, devem ser levados em considerao.

Uma validao pode ser baseada tambm nos ngulos . Conforme discutido
anteriormente, esse ngulo pode assumir valores de 0 (forma cis) e 180 (forma trans) devido ao
carter parcial de ligao dupla entre o carbono e o nitrognio da ligao peptdica, porm
observa-se certo desvio de planaridade, de at 12. Na verdade, a presena desse desvio
desejvel em um conjunto de estruturas, o que quase nunca observado em estruturas
determinadas por RMN. Isso ocorre devido ao fato de as estruturas de entrada do clculo serem
parametrizadas, com os valores de definidos previamente. Alm disso, o campo de fora
utilizado no clculo no permite normalmente variaes em torno desse ngulo. Outra
dificuldade presente nesse tipo de determinao de estruturas que, a menos que especificado o
contrrio, todas as ligaes peptdicas esto na forma trans.

1.5.2.2.8.4. Normalidade da Cadeia Principal

Outra grandeza considerada neste trabalho foi a normalidade da cadeia principal. Trata-se
de um parmetro de definio simples, mas de grande utilidade na anlise das estruturas
calculadas. Ela consiste basicamente na descrio da cadeia principal das estruturas calculadas,
em relao a um banco de dados de estruturas de alta resoluo. O clculo desse parmetro
consiste em comparar as posies relativas dos  de cinco resduos sequenciais, com todas as
posies dos G de cinco resduos sequenciais na base de dados de referncia. A medida da
normalidade da cadeia principal medida geralmente pelo nmero de sequncias de cinco
resduos similares na base de dados. Por conveno, todos os resultados so normalizados, sendo
o valor mximo 80 e o valor mnimo zero.

1.5.2.2.9. Refinamento de estruturas

O refinamento de estruturas no clculo a partir de dados de RMN consiste basicamente
em submet-las a outro procedimento de clculo que possua um campo de fora mais realista,
ainda mantendo as restries geomtricas derivadas de dados experimentais. Essa etapa tem-se
tornado essencial, uma vez que grande parte dos problemas encontrados em estruturas
determinadas por RMN so originrias do campo de fora aplicado durante o clculo inicial. Uma
das principais causas disso que, a fim de diminuir o tempo computacional despendido na
determinao estrutural, vrias simplificaes tiveram que ser feitas, resultando, por exemplo,
em tratamentos pouco realistas de interaes eletrostticas e de Van der Waals, o que pode levar
as estruturas de RMN a possurem alto nmero de sobreposies estericamente desfavorveis
entre diversos grupos e padres de ligao de hidrognio longe da situao tima.

O refinamento pode ser feito considerando tanto o solvente de forma explicita (Linge et
al., 2003) e considerando a molcula no vcuo, porm com mtodos mais eficientes de
minimizao de energia e de variao de posies atmicas, alm do campo de fora mais realista
mencionado anteriormente (Schwieters et al., 2003; Schwieters et al., 2006). Ambas as
metodologias consistem, em termos gerais, de dinmica molecular, com restries de posio
determinadas pela lista de restries geomtricas, e com variaes de temperatura, a fim de
minimizar a energia das estruturas.

1.5.3. Ressonncia Magntica Nuclear no estado slido

Neste tpico sero mostradas algumas das possveis utilizaes da RMN em fase slida para o
estudo de peptdeos reconstitudos em bicamadas fosfolipdicas orientadas em relao ao campo
magntico externo. Embora esta seo trate apenas de uma das metodologias de estudo usando a
RMN, outras so relatadas na literatura para amostras pulverizadas, na forma cristalina, ou em
bicamadas no orientadas.

Para amostras contendo o peptdeo e a bicamada fosfolipdica e orientadas em relao ao

campo magntico do espectrmetro, a RMN em fase slida tem sido utilizada para estudar e
deduzir a orientao e topologia de biomacromolculas. Para tanto so usados peptdeos
marcados com 15N e 2H, quando possvel, associados a bicamadas lipdicas (Cross, 1997; Munster
et al., 2002; Aisenbrey et al., 2010).

Combinando resultados advindos de experimentos de RMN de 15N e de 2H, possvel obter

informaes sobre a orientao de peptdeos helicoidais em relao s membranas mimticas,
isto , sobre a topologia da interao peptdeo-membrana. Essa combinao propicia, assim, uma
investigao mais completa relacionando parmetros estruturais e topolgicos de peptdeos, bem
como de peptdeos associados s membranas, com seus mecanismos de ao biolgica.

1.5.3.1 Fundamentao Terica

A espectroscopia de RMN em fase slida pode ser utilizada para identificar a disposio
espacial adotada por peptdeos em amostras orientadas com respeito direo do campo
magntico. Esta tcnica fornece informaes valiosas em relao dinmica, ao ambiente
eletrnico local, natureza das ligaes intra- e intermoleculares e estrutura molecular
(Bechinger et al., 1999). A caracterstica mais pronunciada dos espectros de RMN em fase slida
frequentemente devida s contribuies anisotrpicas do deslocamento qumico e das interaes
dipolares e quadrupolares (Laws et al., 2002).

Os espectros de RMN em fase slida mostram geralmente linhas largas devidas

principalmente s interaes dipolo-dipolo e tendem a exibir um alto grau de sinais sobrepostos
(Duer, 2004). Novos mtodos e tcnicas esto sendo desenvolvidos para melhorar a resoluo
espectral, tais como a utilizao de marcadores isotpicos, espectroscopia de RMN
multidimensional, desacoplamento de ncleos e outros mtodos que so utilizados para
selecionar interaes entre spins nucleares (Ketchem et al., 1994).

O deslocamento qumico em RMN no estado slido tratado matematicamente como

um tensor, representado por um elipside como mostrado na Figura 1.21 a e b. O tensor
tratado em um sistema de eixos cartesianos de tal forma que ele possa ser descrito pelas trs
componentes (J, J e J44), conforme mostrado na Figura 1.21aa, para o ncleo de 15N

relativamente ao eixo principal da estrutura helicoidal de um peptdeo. O deslocamento qumico

detectado pelo espectrmetro de RMN denominado Jff , sendo definido como a projeo da
componente tensorial J44 no eixo do campo magntico externo ;< (Figura 1.21b)
b).
b) Definindo-se
ngulos de Euler (, e ) para descrever transformaes do tensor deslocamento qumico em

outro sistema de coordenadas, pode-se chegar relao angular de Jff com e , conforme
mostrado na Equao 1.10.

a) b)

(b) mostrando os ngulos de Euler e entre as componentes tensoriais e

Figura 1.21. Representao do tensor de deslocamento qumico de 15N na cadeia peptdica (a) e

o deslocamento qumico detectado, Jff (Bechinger & Sizun, 2003).

na forma elipsoidal (b),

Jff = J sen cos   J sen sen  J44 cos (Eq 1.10)

Devido ao fato de a componente J44 ser aproximadamente paralela ao eixo principal da

hlice em estruturas -helicoidais (REF), possvel, portanto, definir o ngulo como sendo o
ngulo formado entre o eixo principal da hlice e o campo magntico externo ;<. Para o caso de
amostras em que a normal da bicamada fosfolipdica est alinhada paralelamente a ;<, pode-se
afirmar, por extenso, que refere-se ao ngulo entre o eixo principal da hlice e a normal da
bicamada fosfolipdica presente na amostra. Devido a essa dependncia entre a orientao do
peptdeo e o deslocamento qumico de 15N, essa grandeza um indicador sensvel da orientao
do eixo da hlice com relao bicamada lipdica, propiciando inferir informaes de topologia
da interao peptdeo-membrana (Bechinger & Seelig, 1991). Peptdeos -helicoidais
transmembrana exibem ressonncia de 15N com deslocamentos qumicos maiores que 200 ppm
(Fig. 1.22aa), ao passo que peptdeos orientados paralelamente superfcie da bicamada
fosfolipdica so caracterizados por deslocamentos qumicos de 60 a 80 ppm (Figura 1.22b
b)
(Aisenbrey & Bechinger, 2004).

a)

b)

1.22. Representaes do peptdeo -helicoidal interagindo de forma transmembrana (a) e

Figura 1.22

magntico externo ;<. Para ambas as orientaes do peptdeo so mostradas, direita, os

paralelamente superfcie da bicamada fosfolipdica (b) cuja normal coincide com o campo

espectros de RMN de 15N simulados (Bechinger & Sizun, 2003).

Enquanto resultados de anisotropia do deslocamento qumico de 15N fornecem

informaes a respeito da orientao do eixo principal da hlice em relao bicamada
fosfolipdica, a anlise de espectros de RMN de 2H relativos a amostras contendo o peptdeo com
um resduo de alanina, isotopicamente marcado com trs tomos de deutrio, na metila da
cadeia lateral, permite a definio da orientao da ligao  m da alanina em relao ao
eixo principal da hlice. Isso possvel devido ao fato de o grupo metila possuir rpido
movimento rotacional temperatura ambiente, fazendo com que os ncleos de 2H sejam
quimicamente equivalentes e com que o tensor resultante seja coincidente com o vetor da
ligao  m .

Em meios mimticos de membrana hidratados, o peptdeo helicoidal difunde em torno

da normal da membrana, de forma que a ligao  m mova-se descrevendo um cone de
semi-ngulo  relativamente a esta direo, sendo denominado ngulo polar de rotao interna.
A grandeza medida em experimentos de RMN de 2H para amostras com o peptdeo incorporado
em bicamadas fosfolipdicas o acoplamento quadrupolar de deutrio (no ), que dependente
tanto do ngulo polar  quanto do ngulo  que descreve a orientao da normal da bicamada
em relao ao campo magntico ;<, conforme mostrado na Equao 1.11,
 3 q  r 3 cos  1 3 cos  1
no = (Eq.
2 2 2
(Eq. 1.11)

em que q  r a constante de acoplamento quadrupolar de deutrio.

Os resultados obtidos por RMN de 15N e 2H so complementares entre si, sendo

utilizados para descrever a orientao do peptdeo helicoidal em relao bicamada fosfolipdica,
atravs da determinao das variveis (Eq. 1.10, p. 41) e  (Eq. 1.11). Uma descrio mais
detalhada a respeito de como essa orientao calculada apresentada no item 2.2.8, p. 56.

1.5.4 Caracterizao termodinmica do processo de interao

peptdeo/membrana por calorimetria de titulao isotrmica (ITC)

A calorimetria de titulao isotrmica (ITC) constitui-se em uma excelente tcnica para

caracterizar interaes em soluo, visto que possvel obter o perfil termodinmico completo
destas interaes, mesmo sendo interaes de afinidades baixas (Seelig, 1997; White et al., 1998).

A anlise do perfil das curvas calorimtricas e dos parmetros termodinmicos obtidos,

combinada com as propriedades fsico-qumicas dos compostos e as caractersticas do processo de
interao, permitem compreender como as espcies interagem.

Um passo importante na caracterizao da interao peptdeo-membrana conhecer a natureza e

a magnitude das energias livres de interao, separ-las nas suas componentes entlpica (u ) e
entrpica (u M), sendo possvel tambm obter a espontaneidade destas interaes (u v ), o
coeficiente estequiomtrico da interao (w) e a constante de partio ( ). Na calorimetria de
titulao isotrmica, estes parmetros termodinmicos so obtidos a partir de dados
experimentais combinados com modelos matemticos.

Nos experimentos de titulao calorimtrica isotrmica, podem ser efetuados dois tipos de
titulao, com razes molares peptdeo:lipdeo (P:L) distintas. No primeiro tipo, o lipossoma,
com concentrao elevada, colocado na clula de titulao, sendo adicionadas quantidades fixas
de peptdeo: A razo P:L permanece muito baixa, de modo a no ocorrer saturao da
membrana pelo peptdeo. O peptdeo adicionado distribui-se entre a fase aquosa e lipdica de
maneira semelhante no decorrer da titulao. O calor liberado ou absorvido em cada injeo
praticamente constante, visto que h excesso de lipdeo. Para obter a quantidade de calor (

relativa interao peptdeo-lipdeo, deve-se subtrair o calor de diluio ( ) do peptdeo e do
lipdeo, obtidos em experincias independentes, do calor total  , conforme Equao 1.12
abaixo:


=  
A variao da entalpia experimental ou de interao =x  do processo a razo entre o calor
(Eq. 1.12)


da interao e o nmero de mols de peptdeo (w=  em cada injeo, conforme a Equao
1.13:



=x  =
w=
(Eq. 1.13)

No segundo tipo de titulao o peptdeo colocado na clula e titulado com volumes

fixos da suspenso de lipossomas. Verifica-se ao longo da titulao que a quantidade de calor
envolvida se torna cada vez menor, dado que se relaciona com a quantidade de peptdeo ainda
livre na clula aps cada injeo de suspenso de lipossoma. A quantidade de peptdeo que
interage com a membrana diminui a cada injeo e a diminuio da rea dos picos da curva de
titulao est relacionada com o processo de interao e insero do peptdeo na membrana. No
final da titulao verifica-se, por vezes, uma inverso no sinal do calor envolvido, indicando que
todo o peptdeo interagiu com a membrana e que h um excesso de lipdeo. Assim, os ltimos
picos representam o calor de diluio da suspenso de lipossomas, nas condies finais do ensaio
de titulao.
2. Materiais e Me todos

2.1. Materiais

Todas as pesagens para as snteses foram feitas em balana analtica Metler (Barueri,
Brasil), modelo AE166, com preciso de 0,0001.

Em todas as snteses, foi utilizada a resina Rink-amide, da marca Iris Biotech GmbH
(Marktredwitz, Alemanha) com grau de substituio de 0,63 mmol/g.

Os derivados de aminocidos tendo Fmoc como grupo protetor da extremidade N-

terminal foram adquiridos das marcas Iris Biotech GmbH, Novabiochem-Merck (Darmstadt,
Alemanha) e Sigma-Aldrich (St. Louis, Estados Unidos).

A lavagem da resina antes e depois das etapas de desproteo foi feita com
dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM) e 2-propanol (IPA) alternadamente.

O DMF utilizado foi da marca SYNTH, sendo previamente purificado por destilao a
presso reduzida.

O DCM utilizado foi das marcas SYNTH (So Paulo, Brasil) e MERCK (Darmstadt,
Alemanha) .

O IPA utilizado foi da marca SYNTH.

Nas etapas de acoplamento, utilizaram-se como reagentes ativadores o 1-

hidroxibenzotriazol (HOBT), da marca Novabiochem-Merck, e a N,N-dimetilcarbodiimida
(DIC), da marca Sigma-Aldrich. Os solventes utilizados para a solubilizao desses reagentes
foram DMF e DCM, respectivamente.

Para a desproteo dos grupos N-terminais antes de cada acoplamento, utilizou-se uma
soluo 20% v/v de 4-metil-piperidina (da marca Merck) em DMF.

Para uma avaliao qualitativa das reaes de acoplamento e desproteo, foi utilizado o
teste de Kaiser (Kaiser et al., 1970), que emprega trs solues: KCN 0,01 M em piridina, fenol 0,8
M em etanol e ninhidrina 3 mM em piridina, adicionadas em pequenos volumes, na proporo
1:2:1, respectivamente, e, em seguida, aquecia-se o sistema a cerca de 100C por
aproximadamente 4 min.

Para a clivagem dos peptdeos da resina e remoo dos grupos protetores das cadeias
laterais, utilizou-se como reagente o triisopropilsilano (TIS), da marca Iris Biotech solubilizado
em uma soluo composta por cido trifluoroactico (TFA) e gua, na proporo de
aproximadamente 19:1 (v:v).

A purificao dos produtos de sntese foi realizada em cromatografia lquida de alta

eficincia (CLAE). O mtodo de identificao de substncias utilizado foi deteco por
ultravioleta na faixa 210-215 nm. A purificao foi realizada em escala semipreparativa, enquanto
que a escala analtica foi utilizada para se obtere perfis iniciais da amostra.

Para a cromatografia lquida, utilizou-se um cromatgrafo Varian (Santa Clara, Estados

Unidos), modelo ProStar 210, com detector na regio do ultravioleta do modelo ProStar 330 e
uma vlvula de injeo da marca Idex-Rheodyne (Oak Harbour, Estados Unidos)

A coluna analtica utilizada foi uma Microsorb 100-5 C18 2504,6 mm e a coluna
semipreparativa utilizada foi uma Dynamax 100-5 C18 25010 mm, acompanhadas,
respectivamente, de loops de 5 L e 250 L.

Para as fases mveis da CLAE foram utilizadas solues de 0,1% v/v de TFA, em gua
MILLI-Q, e de 0,08% v/v de TFA, em acetonitrila, para compor os gradientes utilizados.

A gua em nvel de pureza Milli-Q foi obtida em aparelho QPAK, da marca Millipore-
Merck (Billerica, Estados Unidos).

Os espectros de dicrosmo circular (CD) foram obtidos em um aparelho JASCO modelo J-

810 (Easton, Estados Unidos), com um sistema de controle acoplado de temperatura da marca
Peltier Jasco modelo PFD-425S.

Os fosfolipdeos utilizados nos experimentos de calorimetria (ITC) e de dicrosmo

circular, com grau de pureza de 99%, foram adquiridos da Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster,
Estados Unidos). Para a preparao dos lipossomas foram utilizados 1-palmitoil-2-oleoil-sn-
glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicina (POPG) e uma mistura
3:1 (mol:mol) destes fosfolipdeos.
 Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos no Centro Nacional de Ressonncia
Magntica Nuclear (CNRMN), no Centro de Cincias da Sade da UFRJ em um equipamento
Bruker modelo AVANCE III , operando a uma frequncia de 800,13 MHz para hidrognio.
Como solvente, foram utilizadas solues de 2,2,2-trifluoretanol-d2 (TFE) em gua Milli-Q, sem a
presena de tampo e solues aquosas com a presena de micelas de dodecilfosfocolina (DPC)
na concentrao de 10 mM. Para a aquisio dos espectros, utilizou-se uma soluo de 4 mM de
cada peptdeo e o volume utilizado dessa soluo foi de aproximadamente 0,5 mL. O padro
utilizado para referncia interna foi o 2,2-dimetil-2-isopentano-5-sulfonato de sdio (DSS)
(Aldrich) para os espectros de 1H e de 13C.

Para os peptdeos estudados, foram realizados experimentos de TOCSY, utilizando-se a

sequncia de pulsos MLEV, NOESY e 1H,13C-HSQC editado, apenas para a distinctina e
fenilseptinas.

O tempo de mistura para a aquisio do mapa de contornos 2D 1H 1H NOESY foi de

120 ms. O experimento de TOCSY teve um tempo de mistura de 80 ms.

Os espectros de RMN em fase slida foram obtidos na Universidade de Strasbourg, no

Laboratrio de RMN e Biofsica de Membranas, nos equipamentos Bruker AVANCE 400 wide-
bore (para 31P e 15N) e Bruker AVANCE 300 wide-bore (para 2H).

2.2 Mtodos

2.2.1. Procedimento Geral

Todos os peptdeos estudados foram sintetizados em fase slida, utilizando a estratgia
Fmoc (Chan, 2000), iniciando-se do resduo de aminocido C-terminal em direo extremidade
N-terminal, de forma a serem obtidas cadeias com as extremidades C-terminais amidadas. As
snteses foram realizadas em seringas com filtro sinterizado acoplado regio interna prxima a
sua ponta.
2.2.1.1. Preparao da Resina
O primeiro procedimento da sntese envolveu a preparao da resina. Isto foi feito
primeiramente colocando-se a resina (Rink-amide, 0,63 mmol/g) seca no recipiente em que a
reao ocorreu. Em seguida, verteu-se sobre a resina um pequeno volume de DCM, o suficiente
para que ela fosse totalmente coberta pelo solvente. A resina ficou em contato com o DCM por
cerca de 10 min. Ao fim desse perodo, removeu-se o solvente por suco a vcuo e o processo
foi repetido por mais trs vezes. Essa etapa importante, pois o DCM aumenta o volume de
contato da resina, o que facilita o acoplamento dos aminocidos.

2.2.1.2. Desproteo da Resina

Aps o preparo acima descrito, procedeu-se desproteo da resina. Assim como os
derivados de aminocidos, resinas que originam peptdeos amidados na extremidade C-terminal
encontram-se protegidas pelo grupo Fmoc. A remoo desse grupo foi feita utilizando-se uma
soluo de 4-metil-piperidina em N,N-dimetilformamida (DMF), na concentrao 20% v/v. Esta
soluo para a desproteo foi adicionada ao recipiente de reao, a um volume suficiente para
cobrir toda a resina. Submeteu-se a seringa agitao moderada, duas vezes durante 15 min e,
em seguida, removeu-se a soluo de 4-metil-piperidina por suco a vcuo. Este procedimento
deve garantir a desproteo de toda a resina, para que no haja diminuio do rendimento final
da reao. Em seguida, lavou-se a resina com DMF, 2-propanol (IPA) e DCM, nesta ordem e
alternadamente, por trs vezes. Por fim realizou-se o teste de Kaiser para averiguar a desproteo
da resina. Nesse caso, o teste deve ser positivo, ou seja, os gros da resina devem estar bem azuis.
Esse procedimento de preparo da resina encontra-se resumido no Esquema 2.1.

Esquema 2.1. Preparao da resina amidada, com grupo protetor Fmoc, para a sntese de
peptdeos.
2.2.1.3. Sntese dos peptdeos
Feita a preparao da resina, deu-se incio sntese propriamente dita, que consiste em
acoplamentos consecutivos dos derivados de aminocido resina. A cada acoplamento, verteu-se
sobre a resina desprotegida uma soluo contendo o derivado de aminocido (Fmoc-aminocido)
e as substncias ativadoras dissolvidos em DCM e DMF na proporo 1:1 (v:v). Para as duas
cadeias, utilizaram-se como ativadores 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) e N,N-
diisopropilcarbodiimida (DIC), que foram misturados a cada derivado de aminocido a ser
acoplado nas mesmas quantidades de equivalente molar. O recipiente de sntese foi ento
submetido agitao moderada durante todo o tempo de reao. Ao final, realizaram-se quatro
lavagens com DMF, IPA e DCM intercaladas, tal qual a lavagem feita na etapa de preparao da
resina e, em seguida, o teste de Kaiser que, aps a reao de acoplamento, deve apresentar
resultados negativos, ou seja, os gros da resina devem ser claros, em suas cores originais. Se o
resultado for negativo, submete-se o sistema desproteo do grupo amino do ltimo resduo
acoplado. Caso contrrio, deve-se repetir a reao de acoplamento at que o teste seja negativo.
A desproteo foi feita utilizando-se uma soluo 20% v/v de 4-metilpiperidina adicionada sobre
a resina, a um volume suficiente para cobri-la completamente. O sistema foi, em seguida,
submetido agitao moderada. Em geral, a desproteo realizada em duas etapas de 12 min
cada, sendo que a soluo para a desproteo retirada do frasco entre as duas etapas.
Novamente, realizou-se o teste de Kaiser e, em seguida, acoplou-se o prximo derivado de
aminocido. As etapas desse procedimento repetiram-se at que todos os resduos de aminocido
fossem acoplados. Ao fim da sntese, a resina (com a cadeia peptdica ligada a ela) submetida
clivagem e desproteo dos grupos protetores permanentes, liberando, ento, o peptdeo
amidado na extremidade C-terminal. Este protocolo ilustrado no Esquema 2.2.

Esquema
Esquema 2.2. Organograma do protocolo utilizado nas snteses dos peptudeos. Acopla-se um
derivado de aminocido e aps o acoplamento tem-se um resduo de aminocido.
2.2.1.4. Clivagem dos peptdeos
Todos os peptdeos foram clivados com soluo de 95,0% de cido trifluoroactico (TFA),
2,5% de gua deionizada (grau Milli-Q) e 2,5% de triisopropilsilano (TIS), seguindo-se o
protocolo padro de clivagem da estratgia de sntese Fmoc (Chan, 2000). Para se realizar a
clivagem, utilizou-se um volume dessa soluo de 10 a 25 mL/g de peptidil-resina. Adiciona-se
esse volume ao frasco em que se encontrava a resina a ser clivada e manteve-se o frasco sob
agitao moderada durante o tempo de reao, que , em geral, de 1,5h a 3 h. Ao final, o
peptdeo encontra-se solubilizado nessa soluo de clivagem juntamente com os produtos de
reao entre os grupos protetores das cadeias laterais e os nuclefilos sequestradores de
carboctions e no mais ligado resina. Separou-se, ento, a fase lquida da resina, transferindo-a
para um tubo Falcon e submetendo-a a ao de nitrognio gasoso para evaporar o TFA, de forma
a restar, na fase lquida, basicamente gua, o peptdeo e os demais produtos secundrios.
Considera-se que se chegou a esta condio quando o volume da soluo de clivagem no mais
se reduzir. Foi ento adicionado ao tubo certo volume (aproximadamente 10 mL) de ter
diisoproplico previamente resfriado em banho de gelo. O sistema centrifugado e as fases slida
e lquida so separadas. Novamente, adicionou-se o ter diisoproplico ao slido restante e, mais
uma vez, centrifuga-se a amostra e separou-se o lquido do slido, repetindo-se este passo por
pelo menos mais trs vezes. Quando o slido estava bem compactado, ele foi dissolvido em gua
deionizada e a amostra foi, por fim, liofilizada, para o produto ser caracterizado e purificado. O
procedimento de clivagem est representado no Esquema 2.3.

Esquema 2.3 Representao do protocolo da reao de clivagem dos peptdeos

2.2.2. Sntese das fenilseptinas e da Hilaseptina P2

As fenilseptinas (L-Phes e D-Phes) e Hilaseptina P2 (HSP2), cujas sequncias encontram-

se na Tabela 2.1, foram sintetizadas utilizando-se 143,6 mg de resina da marca Rink-amide, com
grau de substituio 0,63 mmol/g, para obter cerca de 150 mg de peptdeo bruto ao final da
sntese. Utilizou-se, para todos os reagentes envolvidos nas snteses, uma quantidade de quatro
equivalentes molares em relao quantidade esperada do produto final. Como ativadores foram
utilizados, para cada acoplamento, 55,4 mg de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) anidro e 57 L de
N,N-diisopropilcarbodiimida (DIC). Foram utilizados ainda derivados de aminocidos com as
cadeias laterais protegidas quando necessrio. Para os experimentos de RMN no estado slido,
foram sintetizados peptdeos marcados isotopicamente em determinados stios, sendo que, para
L-Phes e D-Phes, os resduos marcados foram L-9 (15N) e A-10 (2H3) e, para HSP2, os resduos A-
16 (C-2H3) e L-18 (15N), conforme mostrado na Tabela 2.1.

Tabela 2.1. Sequncias dos peptdeos estudados, em que L-F e D-F representam,
respectivamente, os resduos de aminocido fenilalanina com os estereoismeros L e D do
resduo de fenilalanina, e o grupo -NH2 ao final das sequncias indicam a amidao da
extremidade C-terminal. A letra H indica a extremidade amino-terminal no modificada. Os
resduos em negritos representam os aminocidos marcados com 15N e os sublinhados, os com o
grupo metila deuterado

Nome Sequncia Peptdica

L-Phes H-F(L-F)FDTLKNL
LAGKVIGALT-NH2
D-Phes H-F(D-F)FDTLKNL
LAGKVIGALT-NH2
HSP2 H-GIGDILKNLAKAAGKAAL
LHAVGESL-NH2

As condies de reao foram as mesmas para todos os acoplamentos, variando-se

somente o derivado de aminocido utilizado em cada etapa. O tempo de reao para o primeiro
acoplamento de cada sntese foi de 3,5 h e, para os demais acoplamentos, foi de cerca de 1,5 h.
Aps o trmino das snteses, deu-se incio etapa de clivagem e desproteo dos grupos
protetores permanentes. As clivagens foram realizadas utilizando-se a soluo descrita
anteriormente.
2.2.3. Reao de Formao da Distinctina

O peptdeo heterodimrico distinctina foi sintetizado por meio da reao de condensao

por formao de ligao dissulfeto entre as Cadeias 1 e 2, previamente sintetizadas por meio de
sntese em fase slida, pela estratgia Fmoc. A dimerizao deu-se por oxidao ao ar, incubando-
se as cadeias, previamente purificadas, a uma concentrao de 5 mg/mL cada, em uma soluo
aerada, tamponada por 10 mM de bicarbonato de amnio, a pH 8,3. A soluo foi agitada por 24
h temperatura ambiente e, em seguida, neutralizada com cido actico diludo.

A formao do produto foi acompanhada por CLAE, injetando-se alquotas do meio

reagente no aparelho, durante certos intervalos de tempo. Para o acompanhamento da reao,
utilizou-se o gradiente descrito na Tabela 2.2, em que as Cadeias 1 e 2 apresentam,
respectivamente, tempos de reteno de 20,0 min e 20,7 min. Foi monitorado o aparecimento de
um pico a 22,2 min (produto de dimerizao) e o aumento de sua intensidade com o passar do
tempo, acompanhado da diminuio de intensidade dos picos relativos s Cadeias 1 e 2.

A frao relativa a esse tempo de reteno foi coletada em uma coluna semipreparativa
de fase reversa, do tipo C-18 (Grace Vydac 218TP54). Essa frao foi liofilizada e analisada por
espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF UltraFlex III, Bruker Daltonics.

Tabela 2.2. Gradiente utilizado para o acompanhamento cintico da reao de dimerizao da

distinctina. O fluxo para este gradiente foi de 1,0 mL/min

Tempo (min) TFA, 0,1% em gua (%) TFA, 0,08% em gua (%)
0 100 0
15 60 40
55 40 60
60 0 100
65 0 100
2.2.4. Preparao de Vesculas para Experimentos de Dicrosmo
Circular (CD)

As vesculas dos fosfolipdeos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1-

palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicina (POPG) para os experimentos de CD foram preparadas
dissolvendo-se a quantidade apropriada dessas substncias em DCM, misturando-se as solues
resultantes at apresentarem aspecto homogneo. O filme lipdico foi preparado durante a
remoo do solvente presso reduzida. O solvente residual foi removido por suco a vcuo
por aproximadamente 1 h e os filmes foram, em seguida, hidratados com gua.

Vesculas unilamelares grandes foram preparadas submetendo-se a suspenso a oito ciclos

de congelamento em nitrognio lquido, seguidos por aquecimento em gua a 27 C. A
suspenso resultante foi, ento, submetida a um processo de extruso, por 10 vezes, atravs de
duas membranas de policarbonato de 100 nm.

2.2.5. Experimentos de Dicrosmo Circular

Os experimentos de CD foram adquiridos na presena de POPC:POPG 3:1 (mol:mol) e

TFE para as Cadeias 1 e 2 da distinctina, em um espectropolarmetro Jasco-715, utilizando-se
uma cubeta retangular de quartzo, de caminho tico de 1,0 mm em gua deionizada. Todos os
espectros foram adquiridos na faixa de 260 a 190 nm, utilizando-se uma largura de banda de 5,0
nm para os experimentos com vesculas e 2,0 nm para os experimentos com TFE, com resoluo
de 0,2 nm, 100 nm/min de velocidade e 4 s de tempo de resposta. Medidas de linha de base
foram realizadas em todos os dias de experimento para averiguar a estabilidade do instrumento.
Todos os espectros obtidos constituem uma mdia de cinco leituras, com o branco (linha de base
do aparelho e dos solventes e vesculas utilizados) subtrado.

Para os experimentos, prepararam-se solues estoque de concentraes 480 M para as

Cadeias 1 e 2 e 430 M para a distinctina, bem como para a mistura de vesculas de fosfolipdeos
(1 mM). As concentraes dos peptdeos foram de, aproximadamente, 30-40 M, com os valores
exatos calculados por medidas de absoro em trs diferentes comprimentos de onda (205, 209 e
220 nm). Vrios espectros foram adquiridos pela adio em pequenos volumes, da soluo de
lipdeos soluo dos peptdeos.

A desconvoluo tanto dos experimentos em TFE quanto dos experimentos em vesculas,

foi conduzida pelo programa CDPro (Sreerama & Woody, 2004) a fim de estimar o percentual de
estruturas secundrias em cada meio.

2.2.6. Processamento e Anlise de Experimentos de RMN em Soluo

A converso e processamento dos dados de RMN foram feitos pelo programa NMRPipe
(Delaglio et al., 1995). A interpretao dos mapas de contorno foi efetuada no programa
NMRView 5.0 (Johnson, 1994). Todos os programas e algoritmos utilizados nesta etapa foram
criados para serem executados em plataforma Linux, e foram executados na distribuio Fedora,
verses 9, 10 e 11.

As restries de distncia foram obtidas diretamente por meio dos sinais de NOE. Os
volumes desses sinais foram determinados por integrao, utilizando-se a metodologia de
calibrao proposta por Gntert e colaboradores (Gntert et al., 1991). Essa etapa foi efetuada
pelo programa NMRView 5.0, sendo que os sinais relativos a grupos metila tiveram suas
intensidades divididas por trs.

As restries angulares foram obtidas pelo programa TALOS+ (Shen, Delaglio et al.,
2009), por meio da anlise dos valores de deslocamento qumico dos tomos da cadeia principal
C, H, C, N, HN e C, em relao a um banco de dados de deslocamentos qumicos desses
tomos em estruturas de protenas determinadas em alta resoluo.

O clculo do conjunto de estruturas obtidas por anlise de RMN foi realizado utilizando-
se o programa Xplor-NIH verso 2.17 (Schwieters et al., 2003) e o algoritmo de arrefecimento
simulado (simulated annealing) em coordenadas cartesianas sa_new.inp para a distinctina, e o
algoritmo de arrefecimento simulado em espao de ngulos de toro nmr_torsion.inp (Rice &
Brunger, 1994; Stein et al., 1997). Utilizou-se uma estrutura de partida randmica gerada pelo
algoritmo generate_input e com uma topologia protein.top e parametrizaes protein.par, que
levava em conta a terminao amidada da extremidade C-terminal de ambas as cadeias.
 Os clculos de arrefecimento simulado tiveram como parmetros temperatura inicial de
1000 K, nmero total de etapas (steps) a altas temperaturas igual a 14.000, nmero total de etapas
durante cada resfriamento igual a 6.000. O resfriamento simulado foi feito de 50 em 50 K at que
se chegasse a uma temperatura de 100 K. O clculo foi realizado em trs etapas principais: uma
levando em conta valores de limite de violao de restries de distncia e angulares de 0,5 e
5, respectivamente, a etapa seguinte considerando um valor de 0,3 e 3 para esses limites e
uma etapa final, considerando limites de violao de 0,1 e 1. Considerou-se o clculo
concludo somente quando as vinte estruturas mais estveis no apresentaram mais violaes
sistemticas em nenhum dos limites estipulados.

Para anlise dos conjuntos de restries geomtricas, utilizou-se o programa QUEEN

(Nabuurs et al., 2003), concomitantemente inspeo visual das violaes das restries
geomtricas.

Todos os clculos estruturais foram realizados para serem geradas 200 estruturas. Desse
nmero, foram selecionadas as 20 estruturas de menor energia total e, por meio dos programas
MOLMOL (Koradi et al., 1996), elas foram agrupadas de modo a se obter a melhor sobreposio
das estruturas. Dessas estruturas sobrepostas, foi obtido o valor de RMSD (Root Mean Square
Deviation, desvio quadrtico mdio) para parte da validao do clculo.

A validao e anlises estruturais foram feitas atravs da pgina iCing

(http://nmr.cmbi.ru.nl/icing/iCing.html#file), utilizando-se as metodologias dos programas
PROCHECK (Laskowski et al., 1996) e WHAT IF (Vriend, 1990), bem como os critrios de
classificao do programa CING (Common Interface for NMR Strucure Generation).

2.2.7. Preparao das amostras para RMN no estado slido

Para os estudos de RMN em estado slido, foram utilizadas amostras dos peptdeos
orientados em bicamada lipdica de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), cada
amostra contendo diferentes propores de peptdeo e fosfolipdeo, conforme mostrado na
Tabela 2.3 (p. 56).
Tabela 2.3. Relao das massas de peptdeo e fosfolipdeo (POPC) utilizadas nas amostras de
RMN no estado slido, com suas respectivas porcentagens molares

Massa de Massa de Porcentagem molar do peptdeo em

Peptdeo
peptdeo POPC POPC

L-Phes 12 mg 151 mg 3%

D-Phes 11 mg 138 mg 3%
HSP2 12 mg 122 mg 3%

Inicialmente, dissolveu-se o peptdeo em cerca de 2 mL de 2,2,2-trifluoroetanol (TFE) e

mediu-se o pH utilizando papis indicadores. Para isso, distribuiu-se uma pequena quantidade da
soluo alcolica resultante sobre o papel e, aps a evaporao do solvente, o papel foi
umedecido com gua desionizada para determinar o pH do sistema em meios com alto grau de
hidratao. O pH foi ento ajustado a pH7 com volumes mnimos de solues de cido clordrico
ou hidrxido de sdio 1 mol/L. Em seguida, na mesma soluo, dissolveu-se a quantidade pesada
de POPC e a soluo resultante foi submetida a um fluxo brando de nitrognio gasoso at que o
sistema se tornasse ligeiramente viscoso. Em seguida, distriburam-se volumes aproximadamente
iguais da mistura de peptdeo e fosfolipdeo sobre 15 a 25 placas de vidro ultrafinas (8 22 mm,
Marienfeld, Lauda-Knigshofen, Alemanha) e submeteram-se as amostras a presso reduzida por
uma noite para retirar todo o TFE presente. As amostras foram ento transferidas para uma
cmara de hidratao com umidade relativa de 93% e deixadas a hidratar por cerca de sete dias.
Por fim, as placas de vidros foram empilhadas e seladas com fita teflon e plstico.

2.2.8. Experimentos de RMN no estado slido

Experimentos de RMN de 31P desacoplados de hidrognio das amostras de bicamadas

lipdicas orientadas foram realizados a 162 MHz em um espectrmetro Bruker AMX400 wide-
bore, utilizando-se uma sonda comercial esttica de ressonncia dupla para RMN no estado
slido. Medidas foram efetuadas para a orientao da normal da membrana paralela ao campo
magntico externo. Uma sequncia de pulsos de eco de Hahn foi empregada. Os seguintes
parmetros foram utilizados: janela espectral de 75 kHz, tempo de aquisio de 13,6 ms, 2.048
pontos, pulsos de 90 com largura de 2,5 s, intervalo de tempo de eco de 40 s, intervalo de
tempo de espera de 5 s e 64 transientes. Uma soluo de cido fosfrico a 85% (em volume) foi
utilizada como referncia externa (0 ppm).

Experimentos de RMN de 15N desacoplados de hidrognio foram adquiridos a 40 MHz

em um espectrmetro Bruker AMX400 wide-bore, utilizando-se uma sonda comercial E-free de
ressonncia dupla para RMN no estado slido. Medidas foram conduzidas para orientao
normal da membrana paralela ao campo magntico externo. Os seguintes parmetros foram
empregados: pulsos de 90 com largura de 8 s, tempo de chaveamento de campo de 700 s,
intervalo de tempo de espera de 3,5 s, 512 pontos de domnio de tempo, 18.000 aquisies e
janela espectral de 33 kHz. Utilizou-se como referncia externa uma amostra de 15NH4Cl em cujo
espectro h um sinal em 41,5 ppm.

Espectros de RMN de 2H em fase slida foram obtidos no espectrmetro Bruker AMX400

wide-bore (peptideo L-Phes), e em um espectrmetro Bruker Avance 300 wide-bore (demais
peptdeos) utilizando-se uma sonda esttica comercial de ressonncia tripla. Medidas foram
realizadas para orientao da normal da membrana paralela ao campo magntico externo.
Utilizou-se uma sequncia de eco quadrupolar com os seguintes parmetros: 2H B1 de 50 kHz,
tempo de eco de 40 s, janela espectral de 100 kHz, 4.096 pontos, 80.000 transientes e intervalo
de tempo de repetio de 1 s. Os espectros foram calibrados com relao 2H2O no valor de 0
ppm, e a sequncia de eco foi averiguada pelo formato do espectro de uma amostra de plexiglass
deuterado. Funes exponenciais de apodizao correspondentes a um alargamento de linha de
300 Hz foram aplicadas antes da transformada de Fourier.

2.2.9. Simulao de parmetros da RMN em fase slida e determinao

da orientao dos peptdeos em bicamadas lipdicas

Os possveis alinhamentos dos peptdeos foram calculados usando-se o programa

Mathematica (Wolfram Research, Inc.) e as estruturas PDB dos peptdeos foram orientadas de
acordo com as relaes angulares calculadas, utilizando-se o programa PyMOL (The PyMOL
Molecular Graphics System, V. 0.99, Schrdinger, LCC). Para a orientao das estruturas,
primeiro alinhou-se o vetor da hlice do peptdeo com o eixo z, e, em seguida, realizaram-se as
rotaes referentes ao ngulo polar de rotao interna e ao ngulo de inclinao (Figura 2.1),
nesta ordem.
(coincidente com a normal da membrana) e do vetor y, definido como eixo principal da hlice.
Figura 2.1. Representao de um peptdeo -helicoidal, com a representao do eixo z

O ngulo , ngulo de inclinao, definido pela orientao de y em relao a z, e , ngulo

polar de rotao interna, o semi-ngulo do cone formado pela rotao da ligao  m em
torno da normal da bicamada fosfolipdica.

2.2.10 Preparao de Lipossomas para Experimentos de Calorimetria

Isotrmica de Titulao (ITC)

Para a preparao dos lipossomas, foram utilizados uma mistura de POPC e POPG 3:1
(mol:mol) destes fosfolipdeos. As membranas mimticas (lipossomas) foram preparadas sob a
forma de vesculas unilamelares de dimetro aproximadamente 100 nm. A preparao destes
lipossomas envolveu quatro fases distintas.

2.2.10.1. Obteno do filme lipdico

A quantidade de fosfolipdeo utilizada foi calculada de modo a fornecer a concentrao de
35 mM. O fosfolipdeo foi dissolvido em clorofrmio e o excesso de solvente foi eliminado com
um fluxo brando de N2 gasoso. O filme lipdico obtido aps eliminao do excesso de solvente foi
mantido sob presso reduzida, em rotavapor, a 30 C, durante 3h, para completa secagem.

2.2.10.2. Hidratao do filme lipdico

O filme seco foi hidratado com soluo de tampo Tris-HCl, de pH 7,6 e aquecido em
banho de gua termostatizado durante 1h, a 30 oC. O aquecimento da suspenso lipdica foi
alternado com a agitao em vortex para assegurar o descolamento total do filme das paredes do
balo, obtendo-se nesta fase vesculas multilamelares (MLVs).

2.2.10.3. Ciclos de aquecimento/congelamento (Freeze/Taw)

A suspenso de fosfolipdeos foi transferida para um tubo Falcon de 15 mL e as vesculas
multilamelares (MLVs) foram submetidas a cinco ciclos de congelamento-descongelamento
(freeze-taw): mergulhou-se o tubo em nitrognio lquido para congelamento muito rpido da
suspenso e, em seguida, no banho de gua termostatizado temperatura referida at o
completo descongelamento.

2.2.10.4. Extruso
Aps os ciclos de congelamento-descongelamento, a suspenso foi submetida vrias
vezes, a 30 C, por um extrusor termostatizado (Figura 2.2), equipado com membranas de
policarbonato (Nucleopore, Pleasanton, CA, Estados Unidos) com poros de dimetros
decrescentes. A extruso foi efetuada sob presso com N2, cinco vezes com cada uma das
membranas de 400 nm e 200 nm, sob presso de 4 e 8 atm de N2, respectivamente, e dez vezes
pela membrana de 100 nm, sob presso de 12 atm de N2, para obteno das vesculas
unilamelares grandes (LUVs).

Figura 2.2. Extrusor com capacidade para 10 mL (Lipex Biomembranes, Vancouver, BC,
Canad), podendo ser operado em uma faixa larga de temperatura por ligao a um banho de
gua termostatizado circulante. A presso N2 (g) permite a passagem rpida da amostra atravs
da membrana de policarbonato
 A suspenso de lipossomas foi mantida sob refrigerao a 4 oC at a sua utilizao, por um
perodo nunca superior a 12 h. As suspenses preparadas foram sempre usadas no perodo de
cinco dias aps preparao, para no comprometer a integridade e tamanho mdio das vesculas.
A concentrao foi determinada para cada preparao, pelo mtodo de Bartlett, tambm
conhecido como mtodo do fosfomolibdato (New, 1990). A distribuio de tamanhos das
vesculas unilamelares grandes (LUVs) obtidas aps extruso foi determinada por espalhamento
de luz dinmica (Dynamic Light Scattering DLS).

2.2.11. Calorimetria de Titulao Isotrmica

As experincias de titulao calorimtrica isotrmica foram efetuadas no calormetro VP-

ITC da Microcal-GE Healthcare (Piscataway, Estados Unidos). Para efetuar a caracterizao
termodinmica dos sistemas membranas modelo/peptdeos, foram feitos dois tipos de ensaios de
ITC:

Em um tipo, a suspenso de lipossomas de concentrao elevada colocada na clula

calorimtrica, sendo titulada com a soluo do peptdeo. Neste ensaio, a razo
peptdeo/lipossoma muito baixa, no ocorrendo assim saturao nem alteraes significativas
da morfologia da membrana. A quantidade de calor envolvida constante em todas as injees
(praticamente todo o peptdeo titulado particiona para a membrana) e a entalpia mdia da
interao (
) pode ser calculada pela rea mdia dos picos observados, dividida pelo nmero
de mol de peptdeo por injeo.

No outro tipo de ensaio, a soluo do peptdeo colocada na clula calorimtrica em

concentrao baixa e pequenos volumes da soluo do lipossoma so injetados. A concentrao
de lipossoma varia significativamente ao longo da titulao, observando-se diminuio
progressiva da rea de pico com a diminuio da quantidade de peptdeo disponvel para a
partio. A partir deste tipo de experincia podem ser construdas curvas de interao para obter
simultaneamente a constante de partio,  e a variao de entalpia da interao (
).

A entalpia de diluio deve ser medida em ensaios independentes, em que a soluo de

peptdeo (ou soluo de lipossoma) titulada em tampo, nas mesmas condies das
experincias anteriores com o respectivo titulante. Esta entalpia, se no for desprezvel, deve ser
comparada com a obtida nas injees finais da titulao ou, at com a obtida por ajuste, para
testar a validade dos efeitos interao/diluio, subjacente correo com entalpia de diluio
determinada em ensaios independentes. Aps subtrao do calor de diluio obtm-se as
entalpias de interao, que so analisadas por modelos termodinmicos de interao adequados
aos sistemas estudados.

2.2.11.1. Titulaes efetuadas no calormetro VP-ITC

No calormetro VP-ITC mostrado na figura 2.3 (p. 62) foram efetuadas as titulaes de
lipossomas de POPC:POPG (3:1, mol:mol), com o peptdeo HSP2. Nas experincias de titulao
isotrmica com este calormetro, foi seguido o protocolo descrito a seguir, para assegurar uma
boa preciso e exatido nos resultados:

As amostras para serem colocadas na clula e na seringa foram desgaseificadas num

aparelho Microcal apropriado (Figura 2.3, p. 62). A primeira injeo foi de 3 L, um volume
menor do que o das injees subsequentes, porque o sistema automtico de enchimento da
seringa causa impreciso no volume da primeira injeo e, alm disso, h difuso durante o
perodo de estabilizao antes do incio da titulao. Esta injeo no considerada na avaliao
dos resultados calorimtricos, embora a quantidade de soluto injetado o seja.

A clula de referncia continha solvente idntico ao da clula de amostra. A concentrao da

amostra do titulante a ser usada depende das caractersticas do processo em estudo. Como regra
de partida, pode considerar-se que ela deve ser de 10 a 30 vezes maior que a concentrao do
titulado para garantir a cobertura de todo o processo.

Os parmetros experimentais so inseridos no programa VPViewer que faz aquisio dos

dados e o controle da operao do aparelho. O programa Origin-ITC (Microcal-GE Healthcare,
Piscataway, Estados Unidos) foi usado para o tratamento inicial dos resultados, fornecendo a rea
integrada e a variao de entalpia observada, por mol de titulante (ou titulado, escolha do
operador), assim como as concentraes de titulante e titulado na clula, aps cada injeo. Com
estes resultados, foi feito o ajuste de curvas que descrevam o processo em estudo, com vista
obteno dos parmetros termodinmicos que o caracterizam.
 B

A C
Figura 2.3. (A) Computador usado no controle da experincia de titulao e para a
aquisio de dados. (B) Calormetro VP-ITC com seringa giratria. (C) perspectiva do
aparelho com bomba a vcuo, agitao e controle de temperatura para desgaseificao
das amostras..

As experincias de calorimetria de titulao isotrmica foram conduzidas com os

lipossomas na seringa em concentraes de 30-35 mM e os peptdeos na clula, com
concentraes de 340 M a 2 mM. O nmero de injees variou entre 10 e 50 e os volumes de
injees variaram entre 5 a 27 L. O volume efetivo da clula do calormetro usado de 1,4244
mL. Os ensaios de titulao experincias foram efetuados a 25 e 35 oC.

A constante de partio (z ) e a respectiva variao de entalpia para o processo de

interao peptdeo/membrana foram obtidas usando um modelo de partio simples (p. 136).
3. Resultados e Discussa o

3.1. Sntese em Fase Slida dos Peptdeos Distinctina,

Hilaseptina P2 (HSP2) e Fenilseptinas L-Phes e D-Phes

3.1.1. Sntese da Distinctina

A distinctina foi sintetizada em duas etapas, a primeira constituiu-se na sntese em fase
slida das duas cadeias (estrutura primria representada na Tabela 3.1, utilizando-se a estratgia
Fmoc. A uma segunda constituiu-se na reao de formao da ligao dissulfeto entre os resduos
C19, da Cadeia 1, e C45, da Cadeia 2.

Tabela 3.1. Sequncia dos monmeros Cadeias 1 e 2 da distinctina

Monmero Sequncia Peptdica

Cadeia 1 H-ENREVPPGFTALIKTLRKCKII-NH2

Cadeia 2 H-NLVSGLIEARKYLEQLHRKLKNCKV-NH2

A primeira etapa foi realizada anteriormente, estando descrita em Munhoz (2008). A

reao de sntese do heterodmero constituiu-se de uma reao de oxidao ao ar. Para isso,
foram preparados volumes iguais de 2 mL de duas solues tampo NH4HCO3 a 10 mM, pH 8,3,
cada uma com um dos peptdeos (cadeia 1 ou 2) concentrao de 5 mg/mL. As duas solues
foram ento misturadas em um nico recipiente e o meio reagente foi mantido sob agitao, em
contato com ar, por cerca de 24 h. Como a reao demora um perodo considervel de tempo,
esta etapa necessitou ser submetida a um controle cintico, o qual foi feito por CLAE. O
acompanhamento foi realizado com injees em longos intervalos de tempo, mantendo-se
sempre o gradiente representado na Tabela 3.2 (p. 64) Pde-se observar, simultaneamente, a
diminuio na intensidade de absoro nos picos correspondentes s cadeias 1 e 2 (tempo de
reteno de 20,0 e 20,7 min, respectivamente) e a intensificao na absoro do pico relativo ao
heterodmero (tempo de reteno de 22,2 min), conforme mostrado na Figura 3.1 (p. 64).
Tabela 3.2. Gradiente utilizado para o acompanhamento cintico da reao de dimerizao da
distinctina. O fluxo para este gradiente foi de 1,0 mL/min

Tempo (min) TFA, 0,1% em gua (%) TFA, 0,08% em acetonitrila (%)

0 100 0
15 60 40
55 40 60
60 0 100
65 0 100

Figura 3.1. Cromatogramas CLAE do acompanhamento da reao de formao do heterodmero

distinctina coletados em diversos intervalos de tempo durante a reao, mostrando os tempos de
reteno das Cadeias 1 e 2 (20,0 min e 20,7 min, respectivamente) e o tempo de reteno do sinal
supostamente relativo ao heterodmero (22,2 min).

Devido ao fato de os tempos de reteno relativos aos monmeros estarem prximos aos
observados nas suas anlises cromatogrficas individuais sob as mesmas condies de gradiente,
considerou-se que os sinais com os tempos de reteno observados correspondem s cadeias
separadas. A frao correspondente ao produto com tempos de reteno 22,2 foi coletada e
analisada por espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF (Figura 3.2, p. 65). Entretanto, apesar
de se observar um sinal a [M]+ = 5478 g/mol correspondente massa molecular da distinctina,
percebem-se tambm diversos outros sinais, de intensidades comparveis ao da distinctina,
indicando que, apesar de no cromatograma estar presente apenas um sinal no tempo de reteno
22,2, a frao correspondente a esse sinal , na verdade, constituda por uma mistura de diversos
compostos.
Intens. [a.u.] 5477.836

a)
800

5905.959

600

400

200

0
5000 6000 7000 8000 9000 10000
m /z
Intens. [a.u.]

2948.671

2000
b)

1500

2522.457

1000

500

0
1500 2000 2500 3000 3500
m/z

Figura 3.2. Espectro de massas da amostra da soluo da reao de formao da distinctina

coletada em tempo de reteno 22,2 min para espcies de massa maior que 4 kg/mol (a) e
espcies de massas menores que 4 kg/mol (b).
(b) Esto indicadas quatro espcies principais, com
valores de m/z 5906, 5478, 2949 e 2522.
 A frao coletada a 22,2 min foi ento submetida novamente a uma anlise
cromatogrfica. Desta vez, utilizou-se um cromatgrafo do tipo UFLC e, utilizando-se um
gradiente de 10% a 80% de acetonitrila 0,08% TFA e com fluxo de 0,4 mL/min, realizou-se uma
varredura de temperatura, de 40 a 80 C, com incrementos de 10 C, conforme mostrado na
Figura 3.3. O sinal nico observado a temperatura ambiente desdobra-se em trs sinais distintos
com o aumento de temperatura. Isso pode se deve ao fato de peptdeos que interagem com
membrana possurem uma tendncia considervel em se agregar. Com o aumento da
temperatura, algumas das interaes responsveis pela agregao so quebradas, podendo-se,
assim, separar os diferentes estados de agregao entre as diferentes molculas do peptdeo que
compem a frao analisada.

Figura 3.3. Cromatogramas de UFLC das amostras da soluo da reao de formao da

distinctina coletada a um tempo de reteno de 22,2 min, mostrando o perfil das curvas em
funo da temperatura de anlise. As cinco fraes coletadas para anlise de espectrometria de
massas esto representadas pelos nmeros 1 5.
Todas as fraes foram coletadas separadamente e analisadas por espectrometria de
massas MADI-TOF/TOF. A Figura 3.4a (p. 67) mostra os espectros de massa de cada frao no
modo linear, onde se pode observar sinais relativos a espcies de massas moleculares maiores e a
Figura 3.4b (p. 67), no modo refletido onde se encontram os sinais relativos a espcies de massas
moleculares menores.
 a) 1

b) 1

Figura 3.4. Espectro de massas das fraes 1 5 coletadas na anlise pelo UFLC, com variao de
temperatura, para espcies de massa maior que 4 kg/mol (a) e espcies de massas menores que 4
kg/mol (b).
(b)

Pela anlise da Figura 3.4 podem ser percebidos vrios outros sinais alm do sinal [M]+ =
5480 g/mol, relativo ao on molecular da distinctina. As espcies do contaminante mais
abundante na maior parte das amostras corresponde aos sinais [M]+ = 3010 g/mol, [M+H]+ =
3011 g/mol, [M]2+ = 1505 g/mol e [M+H]2+ = 1506 g/mol. A massa molar de [M]+ dessa espcie
difere cerca de 56 g/mol da massa do on molecular da Cadeia 2 ([M]+ = 2954 g/mol), podendo
corresponder a essa cadeia com um grupo protetor terc-butila (tBu) na cadeia lateral de algum
resduo de aminocido. Possivelmente, a etapa de clivagem no foi suficiente para desproteger a
cadeia lateral de algum resduo da Cadeia 2. Outro contaminante encontrado possui o sinal
referente ao on molecular em [M+H]+ = 5909 g/mol, atribudo ao homodmero formado pela
condensao entre duas molculas da Cadeia 2. Alm disso, puderam ser identificados sinais
relativos s Cadeias 1 e 2 em suas formas monomricas [M]+ = 2527 g/mol e [M]+ = 2954 g/mol,
respectivamente. As espcies encontradas em cada frao esto listadas na Tabela 3.3. Embora
seja bem provvel que estas espcies estejam presentes em pequenas quantidades em mais
alguma outra frao, a nica frao cuja resoluo do espectro de massas permitiu a identificao
dessas espcies foi a frao 5.

Tabela 3.3. Relao das espcies encontradas em cada frao cromatogrfica, na anlise a 80C
de acordo com a numerao de sinais representada na Figura 3.4 (p. 67)

Frao Espcie presente*

1 CH2-tBu
2 CH2-tBu
3 CH2-tBu, Homodim-CH2
4 Dtn, Homodim-CH2
5 Dtn, CH1*, CH2*
* CH2-tBu = Cadeia 2 com um grupo protetor terc-butila ligado a uma cadeia lateral de algum
resduo de aminocido; Homodim-CH2 = Homodmero formado pela condensao de duas
molculas de Cadeia 2; Dtn distinctina; CH1 = Cadeia 1; CH2 = Cadeia 2.

Nas fraes 1 a 3, a espcie mais abundante foi a Cadeia 2 com o grupo terc-butila (CH2-
tBu). A distinctina, por sua vez, foi identificada somente nas fraes 4 e 5. Embora a distinctina
aparente estar mais abundante na frao 4, pela anlise dos cromatogramas e ionogramas, a nica
frao que contm a distinctina em um grau de pureza aceitvel para anlise a frao 5. Essa
frao foi coletada e liofilizada para ser ento submetida aos estudos por RMN.
3.1.2. Sntese e Purificao da Hilaseptina P2 (HSP2)

A sntese do peptdeo HSP2 foi feita manualmente, pela estratgia Fmoc (Chan & White,
2000). O sentido de acoplamento apresentado na Tabela 3.4. O acoplamento e a desproteo
foram acompanhados pelo teste de Kaiser, um teste qualitativo para a identificao de aminas
primrias. Assim, a presena de grupos amino livres na sequncia peptdica evidenciada pela cor
prpura nos gros em que o teste realizado. Conforme mostrado tambm na Tabela 3.4, foi
realizada uma sntese do peptdeo isotopicamente marcado com 15N no resduo L18, e com 2H3
na cadeia lateral do resduo de A16 para a realizao dos experimentos de RMN em fase slida
(item 3.3.4.1, p. 116).

Tabela 3.4. Sequncia peptdica do peptdeo HSP2, com o sentido de acoplamento dos
aminocidos, com o resduo de aminocido isotopicamente marcado com 15N representado em
negrito e o resduo de aminocido isotopicamente marcado com 2H3 representado sublinhado

Peptdeo Sequncia peptdica

HSP2 G I G D I L K N L A K A A G K A A L H A V G E S L

sentido do
acoplamento

A Tabela 3.5 mostra as quantidades dos demais reagentes utilizados para cada etapa, bem
como os resultados de acoplamento e desproteo atravs dos testes de Kaiser. Em determinadas
etapas, foram necessrios reacoplamentos devido a resultados insatisfatrios do teste de Kaiser,
conforme indicado na Tabela 3.6 (p. 70). Aps a concluso da sntese, foi realizada a etapa de
clivagem, utilizando-se a soluo descrita anteriormente (p. 46) sobre a resina. Foram obtidos 286
mg do peptdeo bruto ao final da sntese, consistindo em 95% de rendimento.

Tabela 3.5. Quantidade dos reagentes utilizada na sntese do peptdeo HSP2

Reagente/Suporte Polimrico Quantidade

Resina Rink 0,63 mmol/mg 98,4 mg
HOBt 38,0 mg
DIC 39 L
 A Tabela 3.6 apresenta o acompanhamento da sntese manual em todos os seus
acoplamentos. O acompanhamento fez-se necessrio para identificar reaes incompletas que
so detectadas pelo teste de Kaiser. Neste teste a presena de grupo amino livre caracterizada
pela colorao azulada da resina. Dessa forma, ao fim de cada etapa de acoplamento e de
desproteo do grupo amino, foram realizados testes de Kaiser.

Tabela 3.6.
3.6 Acompanhamento da sntese de HSP2

Teste de Kaiser
Ordem do Derivado de Tempo de
Excesso
Acoplamento Aminocido reao (h)
Acoplamento Desproteo

1 Fmoc-Leu-OH 4 3 ---- +++

2 Fmoc-Ser(tBu)-OH 4 1,5 ---- +++

3 Fmoc-Glu(tBu)-OH 4 1,5 ---- +++

4 Fmoc-Gly-OH 4 1,5 ---- +++

5 Fmoc-Ala-OH 4 1,5 ---- +++

6 Fmoc-Ser(tBu)-OH 4 1,5 ---- +++

7 Fmoc-His(Trt)-OH 4 1,5 ---- +++

8 Fmoc-Leu-OH 4 1,5 +++

Reacoplamento Fmoc-Leu-OH 4 2,5 ---- +++

9 Fmoc-Ala-OH 4 1,5 ---- +++

10 Fmoc-Ala-OH 4 2,5 ---- +++

11 Fmoc-Lys(Boc)-OH 4 1,5 +++

Reacoplamento Fmoc-Lys(Boc)-OH 4 2 --- +++

12 Fmoc-Gly-OH 4 2 ---- +++

13 Fmoc-Ala-OH 4 2 ---- +++

14 Fmoc-Ala-OH 4 2 ---- +++

15 Fmoc-Lys(Boc)-OH 4 2 ---- +++

16 Fmoc-Ala-OH 4 2 ---- +++

17 Fmoc-Leu-OH 4 2 ---- +++

18 Fmoc-Asn(Trt)-OH 4 2 +++

Reacoplamento Fmoc-Asn(Trt)-OH 4 2,5 +++

Reacoplamento Fmoc-Asn(Trt)-OH 5 3 ---- +++

 19 Fmoc-Lys(Boc)-OH 4 2 ---- +++

20 Fmoc-Leu-OH 4 2 ---- +++

21 Fmoc-Ile-OH 4 2 ++-

Reacoplamento Fmoc-Ile-OH 4 2,5 ---- +++

22 Fmoc-Asp(tBu)-OH 4 2 ---- +++

23 Fmoc-Gly-OH 4 2 ---- +++

24 Fmoc-Ile-OH 4 2 +++

Reacoplamento Fmoc-Ile-OH 4 2 ---- +++

25 Fmoc-Gly-OH 4 2 ---- +++

+ Resultado positivo, indicativo da presena de grupo amina livre. - Resultado negativo, indicativo da
ausncia de grupo amina livre. Desproteo no realizada devido necessidade de reacoplamento.

A reao de clivagem do peptdeo foi realizada em meio cido (TFA) para a clivagem
simultnea da ligao peptidil-resina e remoo dos grupos protetores das cadeias laterais. No
entanto, a mistura de clivagem e o tempo de reao so dependentes da sequncia de cada
peptdeo, uma vez que diferentes grupos protetores de cadeias laterais requerem diferentes
tempos e condies de reao para sua completa remoo e que cadeias de aminocidos mais
susceptveis a reaes com carboctions requerem a adio de sequestradores desses
carboctions. Neste caso, as condies de clivagem para o peptdeo HSP2 esto apresentadas na
Tabela 3.7.

Tabela 3.7. Mistura de clivagem e tempo de reao para o peptdeo HSP2

Peptdeo Tempo de Reao(h) Mistura de Clivagem

95%TFA, 2,5% gua,

HSP2 2
2,5% TIS

Logo aps a clivagem, o peptdeo foi liofilizado e pesado, correspondendo a um

rendimento bruto de cerca de 91%. Em seguida, o produto da sntese foi submetido anlise por
CLAE. Foi preparada uma soluo de concentrao 1 mg/mL e foram injetados 20 L da soluo
no cromatgrafo. O gradiente de fase mvel utilizado encontra-se representado na Tabela 3.8 (p.
72).
Tabela 3.8. Gradiente utilizado (fluxo de 1,0 mL/min) para a anlise do produto obtido da sntese
do peptdeo HSP2

Tempo (min) gua 0,1% TFA (%) Acetonitrila 0,08% TFA (%)
0 95 5
10 75 25
30 60 40
35 0 100
40 0 100

A Figura 3.5 mostra o cromatograma do produto sntese do peptdeo HSP2. Nessa figura,
pode-se observar um sinal de alta intensidade a um tempo de reteno de 17,1 min,
correspondendo a 32% da soluo de acetonitrila 0,08% TFA. De modo geral, percebe-se uma
sntese sem grandes quantidades de produtos laterais de natureza peptdica, com um produto
principal bem abundante, conforme observado no cromatograma.

Figura 3.5. Cromatograma do produto de sntese do peptdeo HSP2, utilizando-se o gradiente

descrito na Tabela 3.8 (coluna Microsorb C18, solventes H2O:TFA 0,1% e Acetonitrila:TFA
0,08%).

A Figura 3.6 (p. 73) mostra o espectro de massas obtido para o produto bruto da sntese.
Nele, pode-se observar a presena de um sinal de m/z aproximadamente 2418 g/mol,
correspondente ao peptdeo HSP2 o sinal a m/z igual a aproximadamente 2640 g/mol
corresponde ao peptdeo ligado ao grupo Fmoc na extremidade N-terminal.

Figura 3.6. Espectro de massas do produto de sntese do peptdeo HSP2.

3.1.3. Sntese da [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes)

A sntese do peptdeo L-Phes foi feita de forma anloga de HSP2, sendo que a sequncia
peptdica deste, bem como a indicao do sentido de acoplamento seguido na sntese,
encontram-se na Tabela 3.9.

Tabela 3.9. Sequncia peptdica do peptdeo L-Phes, com a ordem de acoplamento dos
aminocidos, com o resduo de aminocido isotopicamente marcado com 15N representado em
negrito e o resduo de aminocido isotopicamente marcado com 2H3 representado sublinhado

Peptdeo Sequncia peptdica

L-Phes F F F D T L K N L A G K V I G A L T
Sentido do acoplamento
 A sntese de L-Phes ocorreu sem necessidade de reacoplamentos, conforme mostrado na
Tabela 3.10, mantendo-se durante toda a sntese o excesso de 4 dos reagentes e o tempo de
acoplamento de 1,5 h, com exceo do primeiro acoplamento, cuja durao foi de 3 h.

Tabela 3.10.
3.10. Acompanhamento da sntese de L-Phes

Tempo de Teste de Kaiser

Ordem do Derivado de
Excesso reao
Acoplamento Aminocido
(h) Acoplamento Desproteo

1 Fmoc-Thr(tBu)-OH 4 3 ---- +++

2 Fmoc-Leu-OH 4 1,5 ---- +++

3 Fmoc-Ala-OH 4 1,5 ---- +++

4 Fmoc-Gly-OH 4 1,5 ---- +++

5 Fmoc-Ile-OH 4 1,5 ---- +++

6 Fmoc-Val-OH 4 1,5 ---- +++

7 Fmoc-His(Trt)-OH 4 1,5 ---- +++

8 Fmoc-Lys(Boc)-OH 4 1,5 --- +++

9 Fmoc-Gly-OH 4 1,5 ---- +++

10 Fmoc-Leu-OH 4 1,5 ---- +++

11 Fmoc-Ala-OH 4 1,5 ---- +++

12 Fmoc-Lys(Boc)-OH 4 1,5 ---- +++

13 Fmoc-Leu-OH 4 1,5 --- +++

14 Fmoc-Thr(tBu)-OH 4 1,5 ---- +++

15 Fmoc-Asp(tBu)-OH 4 1,5 ---- +++

16 Fmoc-Ala-OH 4 1,5 ---- +++

17 Fmoc-Lys(Boc)-OH 4 1,5 ---- +++

18 Fmoc-Ala-OH 4 1,5 ---- +++

+ Resultado positivo, indicativo da presena de grupo amina livre. Resultado negativo, indicativo da ausncia de
grupo amina livre.

A clivagem de L-Phes foi feita sob as mesmas condies realizadas para a clivagem do
peptdeo HSP2 (Tabela 3.7, p. 71).

A Figura 3.7 mostra o perfil cromatogrfico do produto obtido aps a sntese, em que
pode-se observar um tempo de reteno de 15,3 min, correspondente ao peptdeo L-Phes.
Figura 3.7. Cromatograma do produto de sntese do peptdeo L-Phes, utilizando-se o gradiente
descrito na Tabela 3.8, p. 72 (coluna Microsorb C18, solventes H2O:TFA 0,1% e Acetonitrila:TFA
0,08%).

3.2. Estudos por Espectroscopia de Dicrosmo Circular (CD) dos

Peptdeos Distinctina, Hilaseptina P2 (HSP2) e Fenilseptinas L-
Phes e D-Phes

3.2.1. Estudos por CD da Distinctina

Na primeira etapa, as conformaes das Cadeias monomricas 1 e 2 da distinctina, assim
como as do prprio dmero, foram avaliadas, tanto em solventes que mimetizam membranas
quanto na presena de vesculas de fosfolipdeos. Enquanto que, em soluo aquosa, as cadeias
polipeptdicas apresentam predominantemente conformaes randmicas, uma propenso alta
formao de hlice observada com a adio de TFE (Figuras 3.8A e B, p. 77). Esse solvente
conhecido por favorecer a formao de estruturas -helicoidais caso haja, por parte do
polipeptdeo, uma propenso em adotar esse tipo de conformao (Sonnichsen et al. 1992).
Quando a porcentagem de TFE aumentada de 10% para 20% (v/v), o contedo de -hlice da
Cadeia 1 aumenta at 50%. Aumento de porcentagem de TFE mostra pouco efeito na
estruturao da cadeia peptdica. A Cadeia 2, em contraste, chega a apresentar 77% de sua
estrutura como -hlice na presena de TFE/gua 60/40 (v/v) (Figuras 3.8B e 3.9, p. 77). A
titulao de ambas as cadeias caracterizada por um ponto isobstico, que um indicativo de
que as estruturas randmica e -hlice podem ser caracterizadas por um equilbrio entre dois
estados (Figuras 3.8A e 3.8B, p. 77).

Deve-se notar que artefatos advindos do espalhamento da luz limitam a concentrao das
vesculas de lipdeo que podem ser adicionadas soluo peptdica. O baixo grau de formao de
-hlice da Cadeia 1, na presena de POPC (Figura 3.8F, p. 77), indica, provavelmente, que
somente uma pequena poro de peptdeo est associada com os fosfolipdeos zwiterinicos.
Observaes similares, com base em valores de constantes de particionamento em membranas,
foram relatadas para outros peptdeos antimicrobianos (Matsuzaki et al., 1991, Wenk et al., 1998,
Wieprecht et al., 1999).

A Figura 3.8C (p. 77) mostra o espectro de CD de 33 M de Cadeia 1, aumentando-se a

concentrao de vesculas POPC/POPG (3:1, mol:mol). Na presena de 10 M de fosfolipdeos,
um mnimo em 201 nm observado e a desconvoluo dos dados indicam um contedo de -
hlice de apenas 5%. Quando a concentrao lipdica aumenta gradativamente, o espectro de CD
passa a adotar feies caractersticas de conformaes helicoidais, com um mximo em 197 nm e
mnimos em 209 nm e 223 nm. A desconvoluo dos dados sugere um contedo de -hlice de
cerca de 17%, na presena de 50 M de fosfolipdeos e de aproximadamente 23% a concentraes
de lipdeo de 250 M. Interessantemente, um ponto isobstico somente pode ser definido a
concentraes de lipdeo maiores ou iguais a 50 M, indicativo de que transies estruturais da
soluo para o estado associado lipdeo-peptdeo envolvem mais de dois estados
conformacionais.

A Figura 3.8D (p. 77) mostra os espectros de CD de 33 M da Cadeia 2 a quantidades

crescentes de vesculas POPC/POPG (3:1, mol:mol). Enquanto o espectro adquirido a
concentraes de lipdeo de 10 M exibe pouca atividade tica, as caractersticas relativas a -
hlices aumentam com a adio das vesculas lipdicas, com as propores calculadas de 15%,
18%, 29% e 31%, na presena de 20 M, 50 M, 150 M e 250 M de POPC/POPG (3:1,
mol:mol), respectivamente. Esses resultados indicam que a Cadeia 2 exibe uma propenso maior
a estruturaes helicoidais quando comparada Cadeia 1, a razes peptdeo-lipdeo similares, o
que provavelmente reflete seu melhor particionamento em membranas (veja tambm Figura
3.8F, p. 77).

A Figura 3.8E (p. 77) mostra os espectros de CD da distinctina a 39 M na presena de

quantidades crescentes de vesculas POPC/POPG (3:1, mol:mol). Em contraste com as cadeias
individuais, um perfil da curva caracterstica de -hlice pode ser observada na presena de 10
M de fosfolipdeos (contedo de hlice de 20%). Quando a concentrao de lipdeos
aumentada ainda mais, contribuies de -hlice de cerca de 41% so observadas na com 150 M
e 250 M de fosfolipdeos. Finalmente, a Figura 3.8F mostra espectros de CD obtidos na presena
de vesculas de POPC. Pode-se notar que o formato da curva assemelha-se bastante ao da curva
obtida na presena de POPC/POPG (3:1, mol:mol) (Figura 3.8E).

Figura 3.8. Espectros de dicrosmo circular de 10 M da Cadeia 1 (A) e Cadeia 2 (B) em gua
(quadrados pretos preenchidos), 10% TFE (tringulos, em verde), 20% TFE (crculos vazados, em
azul), 30% TFE (crculos preenchidos, em magenta) e 60% TFE (crculos vazados, em marrom).
(C) Espectros que resultaram da titulao de vesculas pequenas unilamelares POPC:POPG (3:1,
mol:mol) soluo da Cadeia 1. A concentrao inicial do peptdeo de 33 M e diminui a 29
M devido adio do lipdeo. (D) Titulao do lipdeo em 38 M a 27 M de Cadeia 2, e (E) em
39 M a 36 M da distinctina. As concentraes de lipdeos so 10 M (quadrados preenchidos,
em preto), 150 M (crculos preenchidos, em magenta), 250 M POPC:POPG (quadrados
vazados, em marrom). (F) espectros de CD de 7 M da Cadeia 1 (tringulos, em verde), 7 M da
Cadeia 2 (crculos vazados, marrom), e 20 M da distincina (crculos vazados, em azul) na
presena de 350 M POPC na forma de vesculas unilamelares pequenas.
 O contedo de -hlice como uma funo da concentrao de fosfolipdeos mostrado
na Figura 3.10 (p. 79) para ambas as cadeias individuais e para o heterodmero distinctina. Pode-
se observar que a 150 M POPC/POPG (mol/mol), ambas as Cadeias 1 e 2 atingiram seu
contedo mximo de hlice. Para a distinctina, essa saturao ocorre para concentraes de cerca
de 250 M com o contedo de -hlice observado a 650 M similar ao de 250 M (dados no
mostrados).

Enquanto o grau de formao de -hlices das cadeias individuais em misturas

TFE/gua aumenta com a concentrao de lcool, atingindo valores altos e seguindo um
equilbrio entre dois estados, a situao na presena de fosfolipdeos um tanto mais complexa e
caracterizada por equilbrios entre vrios estados. Provavelmente o formato da curva do espectro
de CD afetado por agregao de vesculas de POPC/POPG quando a associao de peptdeos
catinicos resulta na neutralizao das cargas negativas dos lipdeos, ou quando os lipdeos
agregam-se entre si.

A adio de 390 M de POPC na forma de vesculas unilamelares soluo aquosa das

Cadeias 1 e 2 da distinctina, respectivamente, causa somente um pequeno aumento na
conformao helicoidal. O baixo grau de formao de -hlice pode indicar que somente uma
pequena quantidade do peptdeo est associada aos fosfolipdeos zwiterinicos, conforme
indicam estudos feitos com peptdeos antimicrobianos catinicos semelhantes.

Figura 3.9. Contedo de -hlice das Cadeias 1 e 2 obtido por espectroscopia de CD como funo
da porcentagem de TFE em gua.
Figura 3.10. Contedo de -hlice das Cadeias 1 e 2 e da distinctina obtido por espectroscopia de
CD como funo da concentrao de lipdeos POPC:POPG (3:1, mol:mol).

3.2.2. Estudos por CD da Hilaseptina P2 (HSP2)

Foram realizados experimentos de CD para o peptdeo HSP2 para verificar se, na

presena de fosfolipdios, o peptdeo adotaria uma estrutura em -hlice, como comumente
ocorre para peptdeos antimicrobianos (Zasloff, 2002). Os experimentos foram realizados
aumentando-se gradativamente a concentrao de vesculas unilamelares pequenas (SUVs),
compostas por POPC e POPG na proporo 3:1 (mol:mol). A Figura 3.11 (p. 80) mostra os
espectros de CD do peptdeo em soluo e na presena de concentrao mxima de vesculas.
Em soluo e sem a presena de fosfolipdios, o peptdeo encontra-se totalmente desestruturado.
Em meios com grande concentrao de vesculas, o peptdeo passa a adotar uma estrutura quase
altamente helicoidal. Esse comportamento esperado uma vez que a forma helicoidal da HSP2
consideravelmente anfiptica (Figura 1.9, p. 14), caracterstica fundamental para se dar a
interao do peptdeo com vesculas ou membranas fosfolipdicas.
Figura 3.11. Espectros de CD da HSP2, em soluo a pH 7,4 contendo tampo Tris-HCl a
100mM (linha azul) e em soluo, na presena de vesculas de POPC/POPG 3:1, mol:mol (linha
vermelha).

3.3. Determinaes Estruturais por Ressonncia Magntica

Nuclear (RMN) em Soluo dos Peptdeos Distinctina,
Hilaseptina P2 (HSP2) e Fenilseptinas L-Phes e D-Phes

As estruturas de todos os peptdeos, Distinctina, Hilaseptina-P2 (HSP2), [L-Phe2]-

Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe2]-Fenilseptina (D-Phes) foram determinadas por meio da
estratgia de assinalamento sequencial a partir da anlise dos mapas de contorno de
experimentos bidimensionais de RMN, conforme proposto por Wuthrich (Wuthrich, 1986).
Dessa forma, o mapa de contornos TOCSY foi utilizado para identificar sinais referentes aos
tomos de hidrognio no-lbeis de cada resduo de aminocido. Concomitantemente a essa
atribuio, foram atribudos tambm os sinais de carbono hidrogenado por meio da anlise do
mapa de contornos 1H-13C-HSQC editado. Esse assinalamento foi auxiliado pela atribuio de
correlaes sequenciais do tipo  ,   1,  ,   1 e m ,   1 no mapa de contornos
NOESY, que permitiu identificar a posio de cada resduo na estrutura primria de cada
peptdeo. Aps essa etapa, foram identificadas as correlaes mdia e, caso existissem, longa
distncia, bem como as correlaes intrarresiduais de cada molcula. Em seguida, realizaram-se
os procedimentos de anlise das listas de restries, clculo e validao, conforme descrito na
Introduo. Para ambos os peptdeos, construram-se as listas com base em pseudotomos ao
invs de serem consideradas atribuies esteroespecficas. Essa estratgia foi adotada de forma a
evitar possveis interpretaes incorretas por parte do programa Xplor-NIH devido a diferenas
de nomenclatura em relao ao programa NMRView. A aproximao por pseudotomos, nesse
caso, no acarreta grande perda de resoluo, uma vez que, ao contrrio de protenas e sistemas
proteicos, ambos os peptdeos no apresentam enovelamento suficiente para que essa
simplificao surta efeito considervel sobre os conjuntos de estruturas calculados.

3.3.1. Determinao Estrutural da Distinctina por RMN em Soluo

A anlise dos dados de RMN em da distinctina soluo foi, em grande parte, dificultada
por sobreposies e, em menor escala, por trocas qumicas. A Figura 3.12 (p. 82) mostra a regio
N do mapa de contornos TOCSY, onde se pode perceber uma baixa disperso de sinais.
Algumas dessas sobreposies puderam ser resolvidas por anlise do mapa de contornos 1H-13C-
HSQC (Figura 3.13, p. 82), embora em alguns resduos, os sinais relativos aos tomos das cadeias
principais de ambas Cadeias 1 e 2 no puderam ser precisamente identificados, como por
exemplo, os sinais pertencentes aos resduos L16, R17, R32, E33, L38 e K41 (numerao mostrada
na Tabela 3.11). No mapa de contornos NOESY a sobreposio mostrou-se mais problemtica,
sendo necessria uma anlise mais criteriosa das principais regies estudadas (Figura 3.14, p. 83),
levando-se em conta os sinais atribudos no mapa de contornos TOCSY.

Tabela 3.11.
3.11. Sequncia de aminocidos da distinctina, com suas respectivas numeraes
utilizadas durante a anlise dos experimentos de RMN em soluo
conectividades intrarresiduais dos tipos  .
Figura 3.12 Mapa de contornos TOCSY da distinctina (600 MHz; TFE-d2:H2O 1:1, ) mostrando

mostrando conectividades intrarresiduais   .

Figura 3.13. Mapa de contornos 13C,1H HSQC da distinctina (600 MHz; TFE-d2:H2O 1:1, v:v)
mostrando conectividades inter-residuais dos tipos: (a)  ,   1,  ,   2,  ,   3 e
Figura 3.14. Mapas de contornos NOESY da distinctina (600 MHz; TFE-d2:H2O 1:1, v:v)

 ,   4; (b) m ,   1.

 Aps o final da atribuio, foi construda uma lista de restries de distncia, contendo
258 restries intrarresiduais, 121 sequenciais, 103 de mdio alcance e cinco a longo alcance. Essa
lista foi submetida anlise pelo programa QUEEN, que forneceu os resultados mostrados na
Figura 3.15 (p.90). Esses resultados mostram que, dentre todas as restries, duas constituem
valores atpicos: H39 HD#/I13 HD1# ( ) e L12 HD1#/L25 HN ( ), ambas com limites
superiores de distncia de 5,00 . Essas duas restries apresentaram ambos valores de unicidade
e informao mdia altos. Alm disso, podem ser observados dois agrupamentos diferentes na
Figura 3.15a (p. 85), destacados como grupos 6 e :. Em 6, encontra-se a maior parte das
restries, enquanto que, em B, encontram-se apenas quatro restries, representadas na Tabela
3.12 (p. 85), juntamente com seus respectivos valores de informao mdia.

Duas consideraes merecem ser feitas a respeito dos dois outliers e do agrupamento :.
Primeiramente, os sinais de NOE que originaram as restries  e  somente puderam ser
atribudos de um lado da diagonal no mapa de contornos NOESY, devido a problemas de linha
de base ou, simplesmente, porque s estavam presentes de um lado da diagonal, o que lhes
garantiu um valor alto de unicidade. Alm disso, o alto grau de informao contida nessas
restries, no corroborado por nenhuma outra, garantiu, ainda, a esses dados, um alto valor de
informao mdia. Levando em conta o fato de que os sinais no apareceram nos dois lados da
diagonal e os seus respectivos valores de informao, h uma probabilidade considervel de que
esses sinais sejam, na verdade, artefatos ou sinais devido presena de mltiplas conformaes
presentes na amostra. Os sinais pertencentes ao agrupamento :, entretanto, puderam ser
atribudos em ambos os lados da diagonal, garantindo a eles valores praticamente nulos de
informao nica, mas, mesmo assim, o valor relativamente alto de informao mdia mostra
que, embora essas restries sejam consistentes entre si, elas tm um forte impacto sobre a
estrutura final. Esses dados a respeito do agrupamento :, no entanto, no indicam
necessariamente que as restries que o constituem sejam provenientes de atribuies
equivocadas ou de artefatos do espectro. Essas restries foram as nicas restries intercadeias
encontradas e que, por consequncia, so as nicas responsveis pela orientao de uma cadeia
em relao outra. Em outras palavras, essas restries so as nicas que definem uma estrutura
quaternria, enquanto as demais restries definem as estruturas secundria e terciria de cada
cadeia. Dessa forma, totalmente plausvel que essas restries contenham um valor alto de
informao na estrutura final do peptdeo, uma vez que esto ausentes restries orientacionais
que poderiam validar ou no os dados do agrupamento :. Sendo assim, decidiu-se por, a
princpio, manter essas restries nos clculos subsequentes, enquanto que as restries  e
 foram retiradas. Um exemplo do impacto dessas restries sobre a estrutura final do peptdeo
mostrado na Figura 3.15, em que as restries so mostradas na forma de tubos amarelos,
conectando os tomos entre os quais as distncias so restringidas. A Figura 3.16a (p. 86) mostra
todas as restries, enquanto que as Figuras 3.16b e 3.16c (p. 86) mostram as restries dos
outliers e do agrupamento :, respectivamente.

a) b)

da distinctina, mostrando a aglomerao dos pontos em dois grupos, 6 e :, e as duas restries

Figura 3.15. (a) Grfico de informao nica por informao mdia da primeira lista de restries

outliers identificadas: H39 HD#/I13 HD1# e L12 HD1#/L25 HN. (b) Grfico de unicidade pelo
ndice de cada restrio da primeira lista de restries da distinctina, mostrando as duas restries
de maior valor de unicidade.

3.12. Relao das restries pertencentes ao agrupamento : representado na Figura 3.16a

(p. 86) e seus respectivos valores de informao mdia (AF= )
Tabela 3.12.

Restrio AF=
C19 HA/C45 HN 6,61
C45 HN/C19 HA 6,02
C19 HA/C45 HB# 5,46
C45 HB#/C19 HA 5,14
 a)

b)

c)

Figura 3.16. Representao das restries de distncia (tubos amarelos) em uma estrutura da
distincitina calculada com essas restries. Em (a) esto representadas todas as restries de

agrupamento :.
distncia determinadas, em (b) esto representados os outliers e, em (c), c) as restries do

Entretanto, no se pode afirmar quais dessas restries so ou no corretas com base

apenas nas anlises de suas informaes, uma vez que um contedo alto de informao sugere a
presena de restries incorretas, mas no se pode afirmar que uma restrio incorreta com
base somente em seu contedo de informao nica. Isso torna necessria uma avaliao mais
detalhada das restries e de seus efeitos sobre o conjunto final de estruturas, levando-se em
conta tambm as violaes ocorridas durante o clculo das estruturas e parmetros de qualidade
estrutural. As violaes presenciadas foram identificadas pelo prprio programa Xplor-NIH e sua
anlise consistiu em mapear as regies com maior nmero de violaes, que constituem regies
com maior probabilidade de estarem incorretas. Os parmetros de qualidade estrutural foram
obtidos pelo servidor iCing, utilizando-se os programas PROCHECK (Laskowski, Rullmannn et
al., 1996) e WHATIF (Vriend, 1990). A Figura 3.17 (p. 88) mostra os resultados para o conjunto
inicial de estruturas, do qual faz parte o modelo apresentado na Figura 3.16 (p. 86). Na Figura
3.17a (p. 88) esto as sequncias das duas cadeias, com cada resduo de aminocido representado
pela conveno de trs letras e colorido com as cores verde, laranja ou vermelha. Esse esquema
de trs cores diz respeito qualidade da regio que compreende cada resduo de aminocido,
sendo que a cor verde indica uma regio de boa qualidade, a cor laranja indica qualidade mediana
ou uma regio pobre em informaes estruturais e a cor vermelha, qualidade estrutural ruim ou
estruturao pouco comum.
 a)

b) c)
c)

Figura 3.17. Resultados da anlise de qualidade estrutural e validao dos modelos calculados
para a distinctina utilizando-se a primeira lista de restries. (a) Resumo da anlise para cada
resduo de aminocido. As cores verde, laranja e vermelho representam, respectivamente,
estrutura de boa qualidade, estrutura de qualidade mediana ou regio com pouca informao
estrutural e estrutura de qualidade baixa, ou pouco comum. (b) b) Resultados do programa
WHATIF, relativos qualidade de empacotamento, Z-score do grfico de Ramachandran e de
Janin, e normalidade da cadeia principal e dos rotmeros. (c) Diagrama de Ramachandran, obtido
pelo programa PROCHECK. Cada ponto corresponde a um determinado resduo de algum dos
vinte modelos. Os pontos que se encontram em regies generosamente favorecidas e em regies
proibidas so representados em vermelho.

Pode-se notar, pela anlise da Figura 3.17a, que grande parte dos resduos apresenta
estruturao possivelmente incorreta, salvo uma minoria de segmentos que apresentaram
conformaes aceitveis. A Figura 3.17b mostra em mais detalhes os problemas encontrados nas
estruturas calculadas atravs de grficos de algumas grandezas relacionadas com caractersticas
estruturais de peptdeos e protenas. O grfico de qualidade de empacotamento mostra se h
eventuais sobreposies de grupos e se a vizinhana desses grupos condizente com sua
caracterstica (e.g. polar, apolar, aromtica, carregada positiva ou negativamente, etc.). Valores
de qualidade de empacotamento menores que -5 apontam erros potenciais na estrutura, como
observado em especial na Cadeia 1. O grfico de qualidade do grfico de Ramachandran (Fig.
17.b, p. 88) mostra a coerncia das distribuies de ngulos de toro em relao s distribuies
desses ngulos de toro em vrias protenas em um banco de dados. Regies com valores abaixo
de -1,2 so consideradas como merecedoras de uma anlise mais detalhada, e as com valores
abaixo de -1,3 podem ser encaradas como possivelmente erradas. Pela anlise desse grfico, pode-
se perceber que grande parte da Cadeia 1 est potencialmente errada e que aos resduos da
Cadeia 2 foram atribudos valores prximos de -1,2, indicando um desvio menor, porm
considervel em relao s distribuies de ngulos diedros normalmente observadas nesse tipo
de biomolculas. O grfico de normalidade da cadeia principal tambm mostra o desvio da
estrutura do peptdeo em relao a um banco de dados de biomolculas proteicas. Contudo, na
determinao dessa grandeza so levados em conta segmentos maiores da cadeia polipeptdica,
possibilitando uma avaliao mais abrangente do desvio da normalidade estrutural. Ao analisar
essa grandeza, consideram-se valores abaixo de trs como indicativos de desvio grande da
normalidade, segmentos com valores maiores que trs e menores que 10 so considerados pouco
comuns e, portanto, merecedores de uma anlise mais criteriosa. Valores acima de 10 so
considerados como bons. O valor mximo para essa grandeza 80. A Cadeia 1, em quase sua
totalidade, apresenta valores de normalidade da cadeia principal prximos a zero, exceo de
uma pequena regio compreendida entre os resduos I14 e R17, que apresentaram valores
maiores ou iguais a 10. A Cadeia 2 tambm apresentou resultados pouco satisfatrios, com a
maior parte dos valores menores que 10. A normalidade dos rotmeros e o Z-score de Janin so
anlogos normalidade da cadeia lateral e qualidade do diagrama de Ramachandran, porm
aplicados aos ngulos diedros das cadeias laterais. Para a normalidade dos rotmeros,
consideram-se valores problemticos aqueles menores que -0,5 e, para o Z-score de Janin, os
valores menores que -0,9. Analisando-se tambm esse grfico, percebem-se diversos segmentos
problemticos em relao s cadeias laterais.

Por fim, a figura 3.17c (p. 88) mostra a distribuio dos ngulos diedros  e por resduo
e para cada um dos 20 modelos calculados. Pode-se observar que vrios pontos se agrupam na
regio caracterstica de formas -hlice, mas ainda assim encontram-se bastante dispersos,
indicando a presena de uma hlice bastante distorcida. O mais problemtico, no entanto, que
apenas uma pequena frao dos pontos encontra-se nas regies mais favorecidas (cerca de 34%),
enquanto que a maioria (cerca de 47%) encontra-se em regies adicionalmente permitidas. Alm
 de outra grande parcela estar distribuda em regies generosamente permitidas ou totalmente
proibidas, indicando conformaes estericamente improvveis.

Com base nas informaes obtidas por essas anlises, foi construda ento uma nova lista,
excluindo-se inicialmente os valores atpicos e foram realizadas novas anlises com o programa
QUEEN. A Figura 3.18a mostra o grfico de informao nica por informao mdia, onde se
pode observar que as restries do agrupamento : passaram a ter, nessa nova lista, valores de
informao mdia prximos de 10, o que seria esperado, uma vez que essas so as nicas
restries que dizem respeito estrutura quaternria do peptdeo e que o programa QUEEN leva
em conta todas as informaes de fundo durante a anlise, ou seja, o contedo de informao de
cada restrio nunca considerado de forma independente em relao s demais restries ou s
constries inerentes prpria estrutura (comprimentos e ngulos de ligao, por exemplo).
Alm disso, percebe-se com maior clareza a disperso dos dados, com restries para ambos os
valores de unicidade e informao mdia relativamente altos (maiores que 1). Essas restries,
apresentadas nas Figuras 3.18a e 3.18b, e listadas na Tabela 3.13 (p. 91), no entanto, so tipos de
restrio comumente observados em estruturas ricas em -hlice, o que o caso da distinctina,
como pode-se inferir pelo estudo de dicrosmo circular.

b)
a)

Figura 3.18. (a) Grfico de informao nica por informao mdia para a segunda lista de

informaes nica e mdia, destacando o agrupamento : presente tambm na Figura 3.16a (p.
restries da distinctina, mostrando os pontos relativos s restries com os maiores valores de

91). (b) Grfico de unicidade pelo ndice de cada restrio, mostrando as duas restries com os
maiores valores de informao nica.
restries da distinctina, com seus respectivos valores de informao mdia (AF= ), informao
Tabela 3.13.
3.13. Relao das restries destacadas nas Figuras 3.18a e 3.18b, relativa lista de

nica ou unicidade (A? ) e limite superior de distncia (R>? 

Restrio Descrio da Restrio AF= A? R>? ()

4
{
C45 HN/L42 HA 2,21 1,94 5,00

|
P6 HD#/R3 HB# 1,70 1,70 2,80

,
K18 HA/I21 HN 2,35 1,68 2,80

}
H39 HA/L42 HB# 1,80 1,36 2,80

~
K18 HN/K14 HA 2,40 1,04 5,00
L35 HN/A31 HA 2,26 0,97 2,80

A restrio 4 envolve o resduo de aminocido C45, que participa da ligao dissulfeto

com o resduo C19 e a restrio } tambm envolve um resduo prximo ligao dissulfeto,
K18. Essas regies prximas aos resduos de cistena nesse peptdeo tm uma tendncia em
apresentar um grau de distoro e, tambm de mobilidade. Isso leva a uma menor estruturao
dessa rea e, por consequncia, um menor nmero de correlaes NOE. Isso, logicamente, leva a

proximidades da ligao dissulfeto ter um grau maior de informao. A restrio

um menor nmero de restries nessas regies e, dessa forma, qualquer restrio encontrada nas

} em especial, por si s j carregaria uma informao estrutural maior, uma vez que ela do
tipo G ,   4, caracterstica apenas de estruturas do tipo -hlice. Dessa forma, para definir
melhor a estrutura do peptdeo seria necessrio obter experimentalmente outras restries
geomtricas, como restries angulares, de ligao de hidrognio e orientacionais. A restrio R4
tambm diz respeito a uma regio potencialmente menos estruturada, devido presena de dois
resduos de prolina. Sendo assim, a restrio pode tanto ser a nica relevante encontrada nessa
regio ou o sinal que originou essa restrio pode ter sido originado de trocas conformacionais,
que so frequentes em regies sem estrutura secundria definida. Essas restries, portanto,
merecem uma anlise mais detalhada, conforme o proposto adiante.

As restries | , , e ~ , por sua vez, so restries comumente encontradas em

espectros NOESY de peptdeos e protenas essencialmente -helicoidais, porm o valor de limite
superior de distncia (R>? ) dessas restries demasiado baixo para estruturas helicoidais
regulares. Observando-se, ainda, as restries simtricas a essas (cujas correlaes NOE foram
atribudas do outro lado da diagonal do mapa de contornos), percebem-se discrepncias entre os
valores de R>? entre elas. A restrio simtrica a | tem um valor de R>? igual a 2,80 ,
enquanto que as simtricas a , e ~ tm valores de R>? iguais a 5,00 (dados no mostrados).
Essa diferena entre os limites superiores pode dever-se ao fato de haver distores de linha de
base ou sobreposies ao sinal em apenas um dos lados da diagonal, prejudicando a integrao
dos NOEs.

Esses resultados foram, durante todo o processo de triagem das restries, analisados
juntamente com as violaes encontradas e com os dados de sada do iCing. A lista final obtida
pelas anlises foi utilizada para os clculos, sendo que, no caso das restries com limite superior
diferente dos seus simtricos, foi considerada em cada lista ou a restrio ou a sua simtrica, para
verificar qual seria a mais coerente em relao ao conjunto total de restries. Essa estratgia
permitiu que se chegasse a um conjunto de restries mutuamente coerentes e que fossem
capazes de definir com resoluo relativamente alta um conjunto de estruturas do peptdeo. A
cada clculo, foi tambm verificada a resoluo de cada conjunto de estruturas por meio do
RMSD e da varincia circular.

Na lista utilizada para o clculo final foram consideradas 258 correlaes intrarresiduais,
83 correlaes sequenciais, 66 correlaes distncia mdia e 2 correlaes distncia longa. As
correlaes convencionais (i.e. correlaes comumente encontradas em estruturas secundrias
definidas) do tipo sequencial e distncia mdia para as Cadeias 1 e 2 esto resumidas nas Figuras
3.19a e 3.19b (p. 93), respectivamente. Todas as correlaes distncia longa foram correlaes
intercadeia, sendo elas as seguintes: C45 HB#/C19 HA e C45 HN/C19 HA, sendo que ambas
resultaram em sinais fracos de NOE, gerando, portanto, restries com limite superior de
distncia de 5,00 . Foram encontradas as seguintes correlaes no convencionais envolvendo
os resduos P6 e F9: P6 HD# / F9 HA e F9 HN / P6 HD#. Ambas as correlaes deram origem a
restries com limites superiores de distncia de 5,00 .
a) b)

Figura 3.19. Tabela de NOEs com as restries caractersticas de estrutura secundria -hlice de
a) Cadeia 1 e b) Cadeia 2 da distinctina.

A Figura 3.20 e a Tabela 3.14 (p. 94) mostram a anlise de informao nas restries da
lista utilizada para o clculo final do conjunto de estruturas da distinctina. Pode-se perceber que
as restries que contm os maiores valores de informao nica so as restries do tipo N (i,
i+4) que, como foi dito anteriormente, so restries caractersticas de -hlice. Como no foi
utilizado no clculo nenhum outro tipo de restrio que defina essa estrutura secundria,
esperado que essas restries contenham um maior grau de informao.

Figura 3.20. Grfico de unicidade pelo ndice de cada restrio na lista utilizada para o clculo
final da distinctina, mostrando as restries com os maiores valores de informao nica.
informao nica, ou unicidade, (A? ), e limite superior de distncia (R>? )
Tabela 3.14
3.14. Relao das restries destacadas na Figura 3.20 com seus respectivos valores de

Restrio Descrio da Restrio Iuni lsup ()

R9 A9 HA/I13 HN 1,42 5,00
R10 A44 HN/R40 HA 1,31 5,00
R11 K18 HA/I22 HN 0,90 5,00
R12 C45 HA/L42 HA 0,73 5,00

O conjunto das vinte estruturas mais estveis desse clculo est representado na Figura
3.21. Apesar de a lista de restries ser consistente, considerando-se os teores de informao, as
restries de distncia no foram suficientes para definir uma orientao relativa para as
estruturas contendo as duas cadeias como um todo. No entanto, a sobreposio individual das
cadeias mostra que elas, quando consideradas separadamente, apresentam-se bem definidas, com
valores RMSD de 0,67 e 1,01 para as Cadeias 1 e 2, respectivamente. Para a distinctina como
um todo, foram observados valores de RMSD de 3,48 , valor bastante alto, devido pouca
orientao entre as cadeias.

Figura 3.21. Conjunto das 20 estruturas mais estveis da distinctina, com melhor sobreposio,
calculadas utilizando a lista final, com o protocolo de arrefecimento simulado.

Aps o fim do clculo, o conjunto das vinte estruturas mais estveis foi submetido
validao pelo servidor iCing, conforme mostrado na Figura 3.22 (p. 96). A Figura 3.22a (p. 96)
mostra que esto ainda presentes vrios resduos de aminocido com estruturao possivelmente
incorreta (indicados em vermelho) e com qualidade mdia (indicados em laranja). No entanto,
nesse conjunto de estruturas, j se pode perceber maior quantidade de resduos com estruturao
boa (em verde), em comparao com o primeiro conjunto de estruturas calculadas. Pode-se
notar, tambm, que os resduos em vermelho concentram-se em regies especficas. Na Cadeia 1,
esses resduos com piores estruturaes esto presentes prximo dobra na cadeia principal, na
regio das prolinas, inferida pelos NOEs encontrados nesse segmento, e tambm nas
proximidades da extremidade C-terminal. Na Cadeia 2, os resduos presentes em regies de
conformaes consideradas erradas ou improvveis esto prximos s terminaes, exceto os
resduos G7 e L28. Os resduos com a cor laranja podem ser resultado das limitaes em serem
obtidas mais restries (de distncia ou no) devido ao grande nmero de sobreposies entre os
sinais nos mapas de contorno. Em relao aos resultados do WHATIF, representados na Figura
3.22b (p. 96), pode-se tambm perceber uma melhora significativa, especialmente na
normalidade da cadeia principal, embora se possa observar uma ligeira melhora tambm nos
parmetros de qualidade do diagrama de Ramachandran e na qualidade de empacotamento.
Entretanto, no se pode dizer que houve melhoras no Z-score de Janin. De fato, muitas vezes os
mtodos de arrefecimento simulado no mostram muita eficincia na estabilizao de
conformaes de cadeias laterais (Spronk et al., 2004). O diagrama de Ramachandran na Figura
3.22c (p. 96) possibilita uma viso melhor do aumento de qualidade em relao ao primeiro
conjunto calculado. Nele, os pontos encontram-se mais agregados na regio de tpica -hlice,
sendo que 73,6% dos pontos encontram-se nas regies mais favorecidas do diagrama, e apenas
5,1% esto situados em regies generosamente permitidas ou proibidas.
a)

c)
b) Diagrama de Ramachandran
dtn-modelo2-final (20 modelos)

(graus)

(graus)
Estatsticas do Diagrama
Resduos em regies mais favorecidas [A,B,L]
Resduos em regies adicionalmente permitidas [a,b,l,p]
Resduos em regies generosamente permitidas [~a,~b,~l,~p]
Resduos em regies proibidas

Nmero de resduos no-glicina e no-prolina

Nmero de resduos de extremidades (exceto Pro e Gly)
Nmero de resduos glicina (mostrados como tringulos)
Nmero de resduos prolina

Nmero total de resduos

Figura 3.22. Resultados da anlise de qualidade estrutural e validao dos modelos calculados
para a distinctina utilizando-se a ltima lista de restries. (a) Resumo da anlise para cada
resduo de aminocido. As cores verde, laranja e vermelho representam, respectivamente,
estrutura de boa qualidade, estrutura de qualidade mediana ou regio com pouca informao
estrutural e estrutura de qualidade baixa, ou pouco comum. (b) Resultados do programa
WHATIF, relativos qualidade de empacotamento, Z-score do grfico de Ramachandran e de
Janin, e normalidade da cadeia principal e dos rotmeros. (c) Diagrama de Ramachandran, obtido
pelo programa PROCHECK. Cada ponto corresponde a um determinado resduo de algum dos
vinte modelos. Os pontos que se encontram em regies generosamente favorecidas e em regies
proibidas so representados em vermelho.

Finda a anlise de validao, procedeu-se ao refinamento das 200 estruturas calculadas.

Novamente, escolheram-se as vinte estruturas mais estveis para compor o modelo da distinctina
que se encontra representado na Figura 3.23. primeira vista, j se pode perceber maior variao
conformacional, resultando em uma diminuio na preciso do conjunto de estruturas. Essa
diminuio pode ser observada tanto para a distinctina em sua totalidade (que passou a ter um
RMSD de 3,73 ), como para as cadeias separadas (com valores de RMSD de 0,77 e 1,80 , para
as Cadeias 1 e 2, respectivamente). A diminuio da preciso dos conjuntos de estruturas
considerando-se as cadeias individuais pode dever-se ao fato de as formas em -hlice presentes
nos modelos serem anfipticas, o que dificulta sua estabilizao em meios puramente aquosos, ao
contrrio do que ocorreria em meios ricos em TFE ou em fosfolipdeos. Sendo assim, um
refinamento em gua poderia causar uma desestabilizao de estruturas desse tipo,
especialmente em regies pouco definidas por restries derivadas de dados de RMN, que esto
mais suscetveis a caractersticas do campo de fora aplicado durante o clculo. Em contrapartida,
apesar de ser muitas vezes tido como no desejvel pela literatura de RMN, o aumento dos
valores de RMSD pode ser tambm interpretado como uma caracterstica positiva, uma vez que
a amostragem conformacional da molcula no espao tambm aumenta. Isso particularmente
importante, uma vez que muitas estruturas com valores de RMSD baixos superestimam a
preciso do experimento, subestimando a caracterstica dinmica da molcula no sistema
estudado.

Figura 3.23. Viso estereoespacial do conjunto das 20 estruturas mais estveis da distinctina, com
melhor sobreposio, calculadas utilizando a lista final, com o protocolo de arrefecimento
simulado.

Porm, o resultado mais significativo, foi a qualidade estrutural da molcula do peptdeo,

como mostra a Figura 3.24 (p. 99). Percebeu-se uma melhora considervel na qualidade total da
molcula, caracterizado por mais resduos de aminocido representados em verde na Figura
3.24a (p. 99). A qualidade de empacotamento e a do diagrama de Ramachandran apresentaram
melhoras considerveis, bem como a normalidade da cadeia principal e as distribuies dos
ngulos diedros de cadeias laterais (Figura 3.24b, p. 99). A melhora da qualidade da estruturao
da cadeia principal, no entanto, melhor percebida pelo diagrama de Ramachandran da Figura
3.24c (p. 99). Observa-se uma distribuio angular bem mais coerente com a forma helicoidal
inferida pelos experimentos de CD, com os pontos bem mais aglomerados na regio
caracterstica de -hlice. Alm disso, percebe-se uma populao maior em regies mais
favorecidas (80,1%) em comparao com os resultados de validao obtidos anteriormente. Alm
de o refinamento ter aumentado a populao de pontos nas regies mais favorecidas do diagrama
de Ramachandran, percebeu-se o comportamento inverso para as regies generosamente
favorecidas e proibidas, que, neste caso, possuem juntas apenas 3,7% do total de pontos.
Desconsiderando-se as extremidades e as proximidades dos resduos de prolina, tem-se 93,7% de
pontos em regies mais favorveis e apenas 1,2% dos pontos em regies desfavorveis, valores
caractersticos de modelos de alta qualidade estrutural.
a) Anlise Baseada nos Resduos de Aminocido
Cadeia 1

Cadeia 2

b) c)
Diagrama de Ramachandran
dtn-modelo2-final-ref (20 modelos)

(graus)

(graus)
Estatsticas do Diagrama
Resduos em regies mais favorecidas [A,B,L]
Resduos em regies adicionalmente permitidas [a,b,l,p]
Resduos em regies generosamente permitidas [~a,~b,~l,~p]
Resduos em regies proibidas

Nmero de resduos no-glicina e no-prolina

Nmero de resduos de extremidades (exceto Pro e Gly)
Nmero de resduos glicina (mostrados como tringulos)
Nmero de resduos prolina

Nmero total de resduos

Figura 3.24. Resultados da anlise de qualidade estrutural e validao dos modelos calculados
para a distinctina utilizando-se a ltima lista de restries e posteriormente refinados em gua. (a)
Resumo da anlise para cada resduo de aminocido. As cores verde, laranja e vermelho
representam, respectivamente, estrutura de boa qualidade, estrutura de qualidade mediana ou
regio com pouca informao estrutural e estrutura de qualidade baixa, ou pouco comum. (b)
Resultados do programa WHATIF, relativos qualidade de empacotamento, Z-score do grfico
de Ramachandran e de Janin, e normalidade da cadeia principal e dos rotmeros. (c) Diagrama de
Ramachandran, obtido pelo programa PROCHECK. Cada ponto corresponde a um determinado
resduo de algum dos vinte modelos. Os pontos que se encontram em regies generosamente
favorecidas e em regies proibidas so representados em vermelho.
Esse resultado permite apontar as regies tidas como problemticas pelas tcnicas de
validao. As extremidades das cadeias peptdicas em geral apresentam maior grau de liberdade
em relao aos segmentos mais estruturados dos peptdeos. Como nessas regies normalmente
so encontrados poucos dados que levem a restries geomtricas, o protocolo de arrefecimento
simulado muitas vezes encontra mnimos de energia que no so necessariamente realistas, uma
vez que, devido s baixas restries experimentais, as conformaes desses segmentos dependem
muito mais do campo de fora aplicado durante o clculo, em comparao s demais regies.
Tanto a regio prxima ao resduo de prolina, onde se localiza uma dobra acentuada na cadeia
principal, quanto as vizinhas ligao dissulfeto apresentam, tambm, um grau de liberdade
relativamente alto. No entanto, esses segmentos so, alm disso, pouco comuns, o que lhes
confere uma problemtica maior na etapa de validao estrutural. O fato de se tratarem de
estruturas pouco convencionais permite que estes segmentos sejam muitas vezes classificados
como incorretos em vez de simplesmente incomuns. Isso ocorre porque a maior parte dos
mtodos de validao leva bastante em conta bancos de dados com diversas estruturas em
resoluo alta de protenas. As conformaes presentes nessas estruturas proteicas dos bancos de
dados so consideradas corretas, enquanto que conformaes locais diferentes das observadas
nessas estruturas so consideradas incorretas. Sendo assim, no se pode afirmar que as estruturas
dessas regies estejam corretas com base somente na afirmao de que se tratam de
conformaes pouco usuais, mas tambm no se devem descartar as evidncias desse tipo de
estruturao observadas nos experimentos de RMN.

Embora o modelo final calculado no possa ainda representar de modo fiel a molcula do
peptdeo estudado, pode-se certamente afirmar que uma boa parcela da estrutura do peptdeo j
foi elucidada. Entretanto, futuros experimentos so necessrios, principalmente para determinar
a orientao relativa entre as duas cadeias. Para tal, deve-se pesquisar um meio que diminua a
variao conformacional do peptdeo. Isso pode ser conseguindo tanto variando-se parmetros
como temperatura, pH e natureza do tampo, por exemplo, como introduzindo-se bicelas para
forar uma certa orientao no peptdeo, possibilitando, assim, a aquisio de dados de
acoplamento dipolar residual, que podem ser convertidos em restries orientacionais. Alm
disso, seria interessante realizar experimentos que forneam outros tipos de restrio, como
experimentos heteronucleares de melhor resoluo, para que se possam obter com maior
preciso os valores de deslocamento qumico para serem convertidos em restries angulares, ou
experimentos de COSY-DQF ou Phase Sensitive COSY, que tambm podem fornecer valores de
restries angulares e experimentos que possibilitem o clculo de restries de ligao de
hidrognio.
3.3.2. Determinao Estrutural da Hilasptina P2 (HSP2)
A atribuio dos sinais nos mapas de contorno relativos ao peptdeo HSP2 deu-se
seguindo a estratgia de atribuio sequencial proposta por Wuthrich (Wthrich, 1986). Dessa
forma, primeiramente, foram identificados os padres de spin caractersticos no mapa de
contornos TOCSY. A Figura 3.25 mostra a regio em que se observam correlaes dos
hidrognios alfa e de cadeias laterais com os hidrognios amidcos de cada aminocido. Como a
transferncia de magnetizao que d origem ao mapa de contornos TOCSY ocorre somente
entre tomos de carbono hidrogenados, as correlaes observadas nesse experimento so apenas
intrarresidual, ou seja, cada sistema de spin observado na regio que a Figura 3.25 compreende
refere-se apenas a um resduo de aminocido, pois entre cada resduo h uma carbonila,
pertencente ligao peptdica. Sendo assim, possvel identificar claramente sistemas de spin e
atribu-los a certos aminocidos.

Figura 3.25. Sistemas de spins caractersticos na regio do mapa de contornos TOCSY do

peptdeo HSP2, em que se encontram as correlaes intraresiduais de hidrognios alfa e de
cadeias laterais com hidrognios amdicos das ligaes peptdicas (600 MHz; 4 mM de HSP2 em
soluo 40% de TFE-d2 em H2O).
 Conforme mostrado na Figura 3.25 (p. 101), alguns sistemas de spin caractersticos
podem ser prontamente identificados no mapa de contornos TOCSY. Os trs sistemas de spin do
tipo AX correspondem aos trs resduos de glicina (G3, G14 e G22), sendo que esperado que
correlaes referentes ao resduo N-terminal (G1) no apaream no mapa de contornos TOCSY,
devido alta mobilidade normalmente apresentada por resduos nas extremidades de cadeias
polipeptdicas. Dois sistemas de spin do tipo A3X tambm podem ser facilmente identificados e
corresponderiam a dois resduos de alanina. Entretanto, devido grande quantidade desse tipo
de resduo na sequncia polipeptdica (seis resduos de alanina no total), no possvel
determinar a qual deles correspondem os sistemas de spin identificados.

Um sistema do tipo A3B3MX verificado nas correlaes envolvendo o hidrognio

amdico relativo ao deslocamento qumico 8,16 ppm, e bastante caracterstico de resduos de
valina. No caso, esse sistema corresponderia ao resduo V21. Correlaes envolvendo o
hidrognio amdico com deslocamento qumico em 7,50 ppm poderia apresentar tambm um
sistema de spin do tipo A3B3MX. porm, devido ao fato de uma das correlaes corresponder a
um sinal de intensidade menor que os demais (correlao do hidrognio amdico com o
hidrognio de deslocamento qumico 1,18 ppm), possvel que se trate de um sistema de spin do
tipo A3MPT(B3)X, caracterstico de resduos de isoleucina, podendo corresponder, a priori, tanto
ao resduo I2 quanto ao I5. O fato de o sistema de spin referente ao hidrognio com
deslocamento qumico 8,16 ppm estar muito bem definido, corrobora a hiptese de que o outro
sistema de spin seja referente a um resduo de isoleucina.

Trs sistemas de spin do tipo AMX podem ser facilmente identificados, conforme
mostrado na Figura 3.25 (p. 101), correspondendo aos resduos D4, N8, H19, ou S24. Por fim, um
sistema de spin do tipo A3B3MX relativo a correlaes envolvendo o hidrognio amdico de
deslocamento qumico 7,96 ppm verificado nessa regio do mapa de contornos. Sistemas de
spin desse tipo so caractersticos de resduos de glutamina, cido glutmico e metionina. Como
existe apenas um resduo de cido glutmico na sequncia de HSP2, esse sistema de spin
corresponde ao resduo E23.

Alm da anlise dos padres TOCSY descrita acima, a identificao dos sistemas de spin
foi feita considerando-se tambm os deslocamentos qumicos tendo como base as anlises
estatsticas apresentadas no banco de dados BMRB (Biological Magnetic Resonance Data Bank,
http://www.bmrb.wisc.edu).
 A identificao dos resduos pode ser feita por meio das correlaes observadas no mapa
de contornos NOESY, em especial as correlaes do tipo sequencial, do tipo  ,   1,
 ,   1 e m ,   1. Alm disso, como se sabe que o peptdeo adota uma estrutura

secundria do tipo -hlice, possvel utilizar correlaes NOE caractersticas desse tipo de
conformao, tais como  ,   2,  ,   2,  ,   3,  ,   4 e m ,   3,
como forma de identificao de determinados resduos. As regies do mapa de contornos
NOESY em que se encontram estas correlaes esto mostradas na Figura 3.26 (p. 104, regio
que compreende correlaes do tipo  ), Figura 3.27 (p. 105, correlaes do tipo  e m ) e
Figura 3.28 (p. 106, correlaes do tipo m ). Dessa maneira, o resduo E23 identificado no mapa
de contornos TOCSY apresenta uma correlao NOE sequencial do tipo  ,   1 (Fig. 3.26,
p. 104) com o resduo de sistema de spin AX (caracterstico de resduos de glicina) com
deslocamento qumico do hidrognio amdico de 8,25 ppm, sendo, portanto, possvel identificar
o resduo G22.

O resduo G22, por sua vez, apresenta uma correlao do tipo m ,   1 (Fig. 3.27, p.
105) com o resduo de sistema de spin A3B3MX, identificado como V21, confirmando, assim, a
atribuio previamente proposta. possvel ainda, identificar uma correlao do tipo  com o
resduo de sistema de spin do tipo AMX com deslocamento qumico de hidrognio amdico de
8,12 ppm, caracterizando-se, assim, uma correlao NOE  ,   3, e propiciando a
identificao do resduo H19.
soluo 40% de TFE-d2 em H2O) mostrando conectividades inter-residuais dos tipo  .
Figura 3.26.
3.26 Regio do mapa de contornos NOESY de HSP2 (600 MHz; 4 mM de HSP2 em

Correlaes do tipo m ,   1 envolvendo os hidrognios beta de H19 tornaram

possvel a identificao do deslocamento qumico do hidrognio amdico do resduo A20. O
deslocamento qumico do hidrognio alfa desse resduo pde ser identificado por meio da
correlao m ,   3 envolvendo os sinais relativos ao resduo E23 (Fig. 3.28, p. 106). O
resduo L18 pde ser identificado pelas correlaes do tipo m ,   1 (Fig. 3.27, p. 105) e
 ,   1 (Fig. 3.26) com os hidrognios da H19 e m ,   3 com os tomos de hidrognio
da V21 (Fig. 3.28, p. 106).
 Embora seja possvel atribuir o hidrognio alfa da A16, pela correlao m ,   3 com
a H19 (Fig. 3.28, p. 106), as regies em que se encontram as correlaes relativas aos resduos de
aminocidos K15, A16 e A17 apresentam muitas sobreposies de sinais, prejudicando, portanto,
a atribuio desses resduos de aminocido. No entanto, possvel identificar uma correlao do
tipo  entre a L18 e o resduo de aminocido com sistema de spin AX cujo hidrognio amdico
apresenta deslocamento qumico de 8,12 ppm (Fig. 3.27, p. 110). Esta correlao apresenta
intensidade relativamente baixa, o que bastante comum em NOEs do tipo  ,   2,
 ,   4 em estruturas -helicoidais. Analisando-se a sequncia de aminocidos de HSP2,
pode-se atribuir esse sistema de spin AX ao resduo G14 e confirmar a correlao em questo
como sendo do tipo  ,   4.

soluo 40% de TFE-d2 em H2O) mostrando conectividades inter-residuais dos tipo  e m .

Figura 3.27. Regio do mapa de contornos NOESY de HSP2 (600 MHz; 4 mM de HSP2 em
 O hidrognio amdico do resduo G14, por sua vez, apresenta correlao do tipo
 ,   1 com o hidrognio amdico (de deslocamento qumico 8,48 ppm) pertencente a um
sistema de spin do tipo A3X, caracterstico de resduos de alanina, sendo possvel, portanto
afirmar que este sistema de spin corresponde ao resduo A13. Ainda levando-se em conta as
correlaes com a G14, possvel identificar uma correlao do tipo  ,   1 com a K15 que,
por sua vez, apresenta uma correlao do tipo m ,   1 com a A16, possibilitando a
atribuio do hidrognio amdico deste ltimo. A A17 pde ser identificada a partir da correlao
entre seus hidrognios beta e os hidrognios alfa da G14, caracterizando um NOE do tipo
m ,   3. Os hidrognios amdico e alfa da A17 podem ser facilmente atribudos pelo mapa
de contornos TOCSY, atravs da identificao do sistema de spin A3X.

O hidrognio amdico do resduo A13, por sua vez, apresenta correlaes do tipo
 ,   1 com o hidrognio amdico da A12 e  ,   2 com a K11 (Fig. 3.26, p. 104). A
atribuio da K11 confirmada pela presena de uma correlao do tipo m ,   1 com A12
(Fig. 3.27, p. 105). Este tipo de correlao tambm identificada entre os resduos K11 e A10,
permitindo a atribuio deste ltimo, que confirmada por outras correlaes envolvendo o
resduo A10, como  ,   1 com K11 (fig. 3.26, p. 104) e  ,   3 com o resduo A13 (fig.
3.27, p. 105).

soluo 40% de TFE-d2 em H2O) mostrando conectividades inter-residuais dos tipo m .
Figura 3.28. Regio do mapa de contornos NOESY de HSP2 (600 MHz; 4 mM de HSP2 em
 O resduo L9 foi identificado com base nas correlaes do tipo  ,   1,  ,   1
e m ,   1 com o resduo A10 (Figs. 3.26, p. 104, e 3.27, p. 105, respectivamente) e o resduo
N8, atravs dos NOEs com os resduos L9 ( ,   1,  ,   1 e ,   1), A10
( ,   2,  ,   2), A11 ( ,   3 e m ,   3) e A12 ( ,   4), alm do
prprio sistema de spin do tipo AMX, condizente com o resduo de asparagina. Devido ao fato de
no haver sobreposio de sinais com as correlaes envolvendo N8, foi possvel atribuir diversas
correlaes com outros resduos, possibilitando a identificao destes. Essas correlaes so:
 ,   1 com a K7 (Fig. 3.26, p. 104),  ,   1 e  ,   3 com K7 e I5,
respectivamente (Fig. 3.27, p. 105), m ,   3 com I5 (Fig. 3.28, p. 106) e m ,   1 com K7
(Fig. 3.27, p. 105). O resduo I6 pde ser atribudo com base nos NOEs  ,   1 com K7 e I5
(Fig. 3.26, p. 104),  ,   1 e  ,   3 com I5 e L9, respectivamente, e m ,   1 com
I5.

Correlaes envolvendo o resduo I5 tambm permitiram a identificao de diversos

outros sinais e, por consequncia, de outros resduos de aminocidos. As correlaes envolvendo
I5 foram:  ,   1 e  ,   2, com D4 e G3, respectivamente (Fig. 3.26, p. 104),
 ,   1 e  ,   3 com D4 e I5, respectivamente (Fig. 3.27, p. 105), m ,   3 com I2
(Fig. 3.28, p. 111) e m ,   1 com D4 (Fig. 3.27, p. 104). As atribuies relativas a D4 puderam
ser confirmadas pelo sistema de spin AMX apresentado (Fig. 3.25, p. 106, deslocamento qumico
do hidrognio amdico de 7,68 ppm) e com correlaes do tipo  ,   1 com G3 (Fig. 3.26, p.
104) e  ,   1 e  ,   2 com G3 e I2, respectivamente (Fig. 3.27, p. 104).

As atribuies relativas a G3 e I2 foram confirmadas pelos NOEs entre esses dois

resduos, sendo-os, especificamente,  ,   1 e m ,   1 (Fig. 3.27, p. 105). No mapa de
contornos NOESY apenas, observou-se uma correlao de um resduo de sistema de spin AX
com o hidrognio amdico de I2. Atriburam-se estes sinais ao resduo G1, dada a correlao
 ,   1 (Fig. 3.27, p. 105) e o sistema de spin caracterstico de resduos de glicina.

O resduo L25 pde ser identificado pelas correlaes m ,   3 com G22 (Fig. 3.28, p.
106) e dNN(i, i+1) com dois tomos de hidrognio de deslocamentos qumicos 6,85 ppm e 7,16
ppm, que foram identificados como sendo aqueles pertencentes carboxamida terminal. Alm
disso, L25 ainda apresenta correlaes do tipo  ,   1 e m ,   1 (Fig. 3.27, p. 105) com
um resduo de aminocido cujo sistema de spin do tipo AMX. Alm disso, os valores de
deslocamento qumico de seus hidrognios beta so relativamente altos, se comparados com os
valores usualmente encontrados em outros resduos de aminocido (os valores obtidos foram
3,97 ppm e 3,98 ppm). Esses altos valores de deslocamento qumico de hidrognios pertencentes
a um grupo metileno so caractersticos de resduos de serina. Dessa maneira, o resduo S24 pde
ser, por fim, atribudo.

Todos os resduos puderam, assim, ser atribudos com base nessa anlise, como se
observa na Figura 3.29, que representa a regio relativa s correlaes intrarresiduais de
hidrognios amdicos com os demais hidrognios de cada resduo de aminocido do mapa de
contornos TOCSY. O resumo das correlaes NOE sequenciais e caractersticas de estruturas -
hlice, que foram utilizadas para a determinao da estrutura tridimensional de HSP2,
apresentado na Figura 3.30, p. 109.

Figura 3.29.
3.29 Regio do mapa de contornos TOCSY de HSP2 (600 MHz; 4 mM de HSP2 em
soluo 40% de TFE-d2 em H2O) mostrando conectividades intrarresiduais envolvendo os
tomos de hidrognio amdicos.
Figura 3.30. Resumo das correlaes NOE sequenciais e caractersticas de estruturas -helicoidais
encontrados no mapa de contornos NOESY para HSP2 (600 MHz; 4 mM de HSP2 em soluo
40% de TFE-d2 em H2O). As correlaes sequenciais encontram-se representadas pelos
retngulos cheios e as correlaes de mdio alcance so representadas por linhas. As espessuras
desses elementos so proporcionais intensidade dos sinais NOEs a que correspondem.
Analisando o conjunto de correlaes NOE mostrado na Figura 3.30, pode-se perceber
que h uma grande quantidade de NOEs caractersticos de estruturas -hlice, em especial
correlaes do tipo  ,   3,  ,   4 e m ,   3, indicando a presena dessa
estrutura secundria em praticamente toda a extenso da cadeia polipeptdica de HSP2.

3.3.3. Determinao Estrutural da [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e da

[D-Phe2]-Fenilseptina (D-Phes) por RMN em Soluo
As atribuies dos sinais relativos aos peptdeos L-Phes e D-Phes foram feitas
conjuntamente, em DPC (4 mM do peptdeo em 40 mM de DPC-d38) e baseadas nas atribuies
realizadas por Magalhes a partir de espectros da L-Phes e D-Phes em TFE, descritas em sua tese
de doutorado (de Magalhes, 2011). A comparao com os espectros previamente obtidos foi
essencial devido ao fato de os mapas de contorno TOCSY adquiridos para os peptdeos em DPC
no apresentarem boa relao sinal/rudo dos sinais. Entretanto, algumas informaes a respeito
do sistema de spin dos deslocamentos qumicos de alguns resduos de aminocido puderam ser
obtidas.

Dessa maneira, a atribuio foi realizada com base principalmente nos mapas de
contorno NOESY e HSQC editado. Os sinais relativos a cada resduo de aminocido e s
interaes dipolares entre os ncleos 1H foram identificados por meio da metodologia de
assinalamento sequencial, de forma anloga explanada na seo 3.3.2 (p. 100), para o peptdeo
HSP2. As atribuies das correlaes intrarresiduais encontram-se apresentadas na Figura 3.31.
a)

b)

Figura 3.31. Regies do mapa de contornos TOCSY relativas s correlaes intrarresiduais

envolvendo os tomos de hidrognios amdicos de cada resduo de aminocido para (a) L-Phes e
(b) D-Phes (800 MHz; 2 mM do peptdeo em 40 mM de DPC-d38).
 A anlise simultnea dos dois espectros mostrou-se de grande auxlio para os
assinalamentos, uma vez que os deslocamentos qumicos observados para os hidrognios de
resduos mais distantes da extremidade N-terminal variaram pouco (Fig. 3.31, p. 110). Devido ao
fato de os deslocamentos qumicos de tomos dos hidrognio alfa e de 13C de resduos mais
distantes do resduo F2 terem sido mais conservados em comparao com os deslocamentos
qumicos de tomos de hidrognios amdicos, grande parte da atribuio de sinais foi baseada
principalmente na anlise comparativa dos mapas de contorno 1H,13C-HSQC (Fig. 3.32). Os
resduos F2 puderam ser facilmente assinalados devido maior variao dos deslocamentos
qumicos dos hidrognios alfa e amdicos ( = 4,44 ppm e  = 9,43 ppm para a L-Phes, e 
= 4,24 ppm e  = 7,80 ppm, para a D-Phes). Demais deslocamentos qumicos de ncleos de 1H
e 13C de L-Phes e D-Phes so mostrados no Anexo A.

a) b)

Figura 3.32. Mapas de contorno 1H,13C-HSQC editados dos peptdeos (a) L-Phes e (b) D-Phes
(800 MHz; 2 mM do peptdeo em 40 mM de DPC-d38)

As Figuras 3.33 (p. 112), 3.34 (p. 113) e 3.35 (p. 114) mostram, respectivamente, as regies
caractersticas de correlaes do tipo  ,  e m , e m dos mapas de contorno NOESY de
ambos os peptdeos.
 a)

b)

do peptdeo em 40 mM de DPC-d38) mostrando correlaes inter-residuais do tipo  .

Figura 3.33. Regio do mapa de contornos NOESY de (a) L-Phes, e (b) D-Phes (800 MHz; 2 mM
 a)

b)

do peptdeo em 40 mM de DPC-d38) mostrando conectividades inter-residuais dos tipos  e

Figura 3.34. Regio do mapa de contornos NOESY de (a) L-PHes e (b) D-Phes (800 MHz; 2 mM

m .
 a)

b)

do peptdeo em 40 mM de DPC-d38) mostrando conectividades inter-residuais do tipo m .

Figura 3.35.
3.35 Regio do mapa de contornos NOESY de (a) L-Phes e (b) D-Phes (800 MHz; 2 mM

A Figura 3.36 (p. 115) apresenta o resumo das correlaes NOE sequenciais e
caractersticas de estruturas -helicoidais encontradas nos mapas de contorno NOESY, para os
peptdeos L-Phes e D-Phes.
 a)

b)

Figura 3.36.
3.36 Resumo das correlaes NOE sequenciais e caractersticas de estruturas -helicoidais
encontradas no mapa de contornos NOESY (800 MHz; 2 mM peptdeo em 40 mM DPC-d38) para
(a) L-Phes e (b) D-Phes. As correlaes sequenciais encontram-se representadas pelos retngulos
cheios e as correlaes de mdio alcance so representadas por linhas. As espessuras desses
elementos so proporcionais intensidade dos sinais NOEs a que correspondem.

Pela anlise dos conjuntos de correlaes relativas a L-Phes e D-Phes, uma grande
quantidade de NOEs caractersticos de -hlices, evidenciando a presena dessa estrutura
secundria em grande parte de ambas as cadeias peptdicas, embora a maior quantidade de NOEs
presentes na regio prxima extremidade N-terminal da D-Phes indica uma maior estruturao
deste peptdeo em relao a L-Phes.

3.3.4. Clculo e Validao Estrutural a partir dos Dados de RMN em

Soluo
Os clculos foram realizados utilizando restries semiquantitativas, de acordo com a
intensidade dos NOEs observados entre pares de ncleos de 1H, cujas distncias interatmicas
so definidas por estas restries durante o clculo dos modelos das estruturas peptdicas. Para os
peptdeos L-Phes e D-Phes, foram utilizadas tambm restries de ngulos diedros derivadas de
valores de deslocamento qumico de tomos da cadeia principal, calculadas pelo programa
TALOS+ (Shai et al., 2009). As listas de restrio obtidas foram submetidas ao programa QUEEN
para validao em relao a seus respectivos contedos de informao estrutural e, por fim,
submetidas ao clculo.

O clculo foi realizado utilizando-se o protocolo de arrefecimento simulado (simulated

annealing), baseado em dinmica de ngulos de toro (Rice et al, 1994; Stein et al., 1996). Para o
refinamento da HSP2, apenas, no foram utilizados valores de deslocamentos qumicos de 13C
para a definio dos potenciais de fora mdia, baseados nos bancos de dados do Xplor-NIH,
devido ao fato de haver apenas resultados de RMN relativos a ncleos de 1H para este peptdeo.

3.3.4.1. Clculo e Validao Estrutural da Hilaseptina P2 (HSP2)

A lista utilizada para o clculo dos modelos para HSP2 constituiu-se de 182 restries de
distncia, sendo 89 restries do tipo intrarresidual, 54 do tipo sequencial e 39 restries de
alcance mdio. A anlise por contedo de informao realizada pelo programa QUEEN
mostrada na Figura 3.37 (p. 117). Pode-se perceber que as restries de maior contedo de
informao (15.HA/19.HN, 13.HA/17.HN, 9.HA, 13.HN) referem-se a restries que tm maior
peso na definio de uma estrutura -helicoidal, durante o clculo do modelo, ou seja, so as
restries derivadas de correlaes NOE que so bastante caractersticas desse tipo de estrutura
secundria. Como no foram utilizadas restries de ngulos diedros ou de ligaes de
hidrognio, esperado que este tipo de restrio tenha um contedo de informao maior que as
demais. Como este peptdeo estrutura-se em meio mimtico de membrana na forma -
helicoidal, coerente no considerar esse tipo de restrio como incorreta, apesar do alto valor
de unicidade dada pelo programa QUEEN.

Figura 3.37. Diagrama de unicidade por ndice das restries utilizadas no clculo de
determinao estrutural dos modelos para o peptdeo HSP2.

As vinte estruturas de menores energias esto mostradas na Figura 3.38 e pode-se

perceber claramente que a forma -helicoidal adotada em praticamente toda a extenso da
cadeia polipeptdica. Alm do mais, bastante evidente o carter anfiptico desta hlice, que est
de acordo com o que comumente observado em peptdeos antimicrobianos helicoidais.

a) b)

Figura 3.38. Conjunto das vinte estruturas de menor energia do peptdeo HSP2, visualizado a)
lateralmente, e b) frontalmente, com as cadeias laterais hidroflicas representadas em azul, e as
hidrofbicas em verde.
 O conjunto das estruturas apresentou um RMSD de 0,41 para a sobreposio de
estruturas na regio compreendida entre os resduos V5 e L25 e a validao mostrou qualidade
estrutural elevada, conforme o mostrado na Figura 3.39, de acordo com a classificao ROG (Red
Orange Green) adotada pelo iCing. Todos os resduos de aminocido foram classificados com a
cor verde (significando alta qualidade estrutural), com exceo do resduo V25, que foi
representado pela cor vermelha, indicando qualidade estrutural baixa (Figura 3.39). A razo disso
foi devido distribuio dos valores dos ngulos diedros da cadeia lateral, de acordo com as
combinaes angulares definidas no diagrama de Janin. O motivo dessa distribuio angular
insatisfatria possivelmente deve-se ao fato de no haver restries de distncia suficientes para
definir uma determinada estruturao da cadeia lateral de V25 durante o clculo estrutural. Nos
casos em que no h restries geomtricas, a qualidade do modelo depende somente do campo
de fora utilizado para o clculo. Apesar de esse campo de fora contemplar bem algumas
caractersticas eletrnicas, eletrostticas e estricas, quando utilizadas restries geomtricas, ele
muito realista quando no esto presentes tais restries, mesmo com o refinamento, que se
baseia em minimizaes energticas mais eficientes e campos de fora mais completos. Dessa
forma, a qualidade baixa devido conformao adotada pela cadeia lateral de um resduo
terminal, que normalmente tem maior variabilidade estrutural, no compromete o modelo
calculado, uma vez que as restries obtidas a partir de dados experimentais so mutuamente
coerentes e convergem para uma estrutura do tipo -hlice.

Figura 3.39. Classificao por resduos do peptdeo HSP2, de acordo com suas respectivas
qualidades estruturais, de pelo critrio ROG adotado pela interface iCing, em que verde indica
boa qualidade estrutural e vermelho indica qualidade insatisfatria.

A Figura 3.40 (p. 119) mostra a distribuio de ngulos  e dos resduos de aminocido
no diagrama de Ramachandran, mostrando 99% dos resduos com combinaes dos valores
desses ngulos pertencentes a regies mais favorecidas, sendo os demais 1% distribudos em
regies permitidas, evidenciando, mais uma vez a qualidade estrutural elevada das estruturas
obtidas.
Figura 3.40. Diagrama de Ramachandran das vinte estruturas de menores energias para o
peptdeo HSP2. A regio mais favorecida representada em vermelho, a adicionalmente
permitida, em amarelo, a generosamente permitida, em amarelo claro, e a regio proibida, em
branco. 99% dos resduos apresentaram combinaes angulares pertencentes regio mais
favorecida, 0,5%, a regies adicionalmente permitidas e 0,5%, a regies generosamente
permitidas.

3.3.4.2. Clculo e Validao Estrutural da [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes)

Para a determinao estrutural de L-Phes, foram utilizadas 237 restries de distncia
(dentre as quais 119 so do tipo intrarresidual, 61 do tipo sequencial e 57 so restries de alcance
mdio) e 32 restries angulares, derivadas de valores de deslocamento qumico de 1H e de 13C
de tomos da cadeia principal do peptdeo. Mais uma vez, restries derivadas de correlaes
NOE bastante caractersticas de estruturas -hlice apresentaram altos ndices de unicidade
(7.HN/3.HA, 5.HN/2.HA, 12.HN/8.HA, 17.HB#/14.HA e 8.HN/4.HA, Figura 3.41, p. 120), que
poderiam ser ainda melhor embasadas utilizando-se restries advindas de dados experimentais
relativos a ligaes de hidrognio ou acoplamentos dipolares residuais, por exemplo.
Figura 3.41. Diagrama de unicidade por ndice das restries utilizadas no clculo de
determinao estrutural dos modelos para o peptdeo L-Phes.

O conjunto das vinte estruturas de menor energia mostrado na Figura 3.42, sendo
evidente o contedo elevado de estrutura secundria do tipo -hlice. Percebe-se, ainda, uma
grande convergncia geomtrica entre as estruturas, refletida, tambm, no RMSD obtido, de 0,36
para um alinhamento da cadeia principal, entre os resduos D4 e T18.

a) b)

Figura 3.42. Conjunto das 20 estruturas de menor energia do peptdeo L-Phes, visualizado a)
lateralmente, e b) frontalmente, com as cadeias laterais hidroflicas representadas em azul, e as
hidrofbicas em verde.

A classificao de cada resduo pelo critrio ROG do iCing mostrada na Figura 3.43 (p.
121). Os resduos D4, L9 e T18 foram classificados como laranja, indicativo de uma possvel
qualidade estrutural baixa. Novamente, a possvel deficincia estrutural apontada na
distribuio angular das cadeias laterais desses resduos, sendo a possvel causa o baixo nmero
de restries envolvendo tomos dessas cadeias laterais.

Figura 3.43. Classificao por resduos do peptdeo L-Phes, de acordo com suas respectivas
qualidades estruturais, pelo critrio ROG adotado pela interface iCing, em que verde indica boa
qualidade estrutural e laranja indica qualidade estrutural mediana.

A Figura 3.44 mostra o diagrama de Ramachandran da L-Phes, em que 100% dos resduos
possuem combinaes dos ngulos  e dentro da rea definida como mais favorvel (regio
em vermelho).

Figura 3.44. Diagrama de Ramachandran das vinte estruturas de menor energia para a L-Phes. A
regio mais favorecida apresentada em vermelho, a adicionalmente permitida, em amarelo, a
generosamente permitida, em amarelo claro, e a regio proibida, em branco. 100% dos resduos
apresentaram combinaes angulares pertencentes regio mais favorecida.
3.3.4.3. Clculo e Validao Estrutural da [D-Phe2]-Fenilseptina (D-Phes)
A determinao estrutural da D-Phes foi realizada utilizando-se um conjunto de 215
restries de distncia (122 do tipo intrarresidual, 51 do tipo sequencial e 42 de alcance mdio) e
26 restries angulares. Similarmente aos peptdeos L-Phes e HSP2, os clculos de unicidade do
QUEEN mostraram apenas restries caractersticas de -hlice como responsveis pelo maior
nmero de informaes estruturais (Figura 3.45).

Figura 3.45. Diagrama de unicidade por ndice das restries utilizadas no clculo de
determinao estrutural dos modelos para o peptdeo D-Phes.

As 20 estruturas de menor energia, que compem o modelo para a D-Phes so mostradas

na Figura 3.46. tambm evidente o alto grau de sobreposio da cadeia principal desse
conjunto de estruturas (tambm alinhadas na regio compreendida entre os resduos D4 e T18),
que refletido no RMSD calculado, cujo valor de 0,43 .

a) b)

Figura 3.46. Conjunto das 20 estruturas de menor energia do peptdeo D-Phes, visualizado a)
lateralmente, e b) frontalmente, com as cadeias laterais hidroflicas representadas em azul, e as
hidrofbicas em verde.
 Em relao ao modelo estrutural da L-Phes (Figura 3.42, p. 120), pode-se averiguar que o
conjunto de estruturas para a D-Phes apresenta um carter anfiptico ainda mais acentuado que
seu homlogo, comparando-se as vises frontais de ambos os peptdeos (Figura 3.42b, p. 120, e
Figura 3.46b, p. 122, para L-Phes e D-Phes, respectivamente), com os resduos de aminocido F1
e F2 mais concentrados na face hidrofbica da hlice. Alm disso, percebe-se uma menor
variabilidade conformacional das cadeias laterais desses resduos de aminocido na D-Phes em
relao L-Phes, acentuando-se, dessa maneira, o carter anfiptico da primeira.

A Figura 3.47 mostra a classificao por resduo da D-Phes pela interface iCing, indicando
boa qualidade estrutural, indicando apenas qualidade mediana para os resduos I14, A16 e L17. O
desvio apontado em relao s relaes angulares comumente observadas em cadeias
polipeptdicas localiza-se na cadeia principal e provavelmente devido distoro da hlice na
regio prxima extremidade C-terminal, conforme observado na Figura 3.46a (p. 122). Apesar
de a estrutura secundria em questo apresentar um leve desvio em relao a sua forma ideal, as
combinaes angulares observadas no violam as condies estricas em que se fundamenta o
diagrama de Ramachandran. Dessa forma, essa distoro foi considerada como uma
caracterstica estrutural, pois esta fundamentada em resultados experimentais de RMN em
soluo.

Figura 3.47. Classificao por resduos do peptdeo D-Phes, de acordo com suas respectivas
qualidades estruturais, pelo critrio ROG adotado pela interface iCing, em que verde indica boa
qualidade estrutural e laranja indica qualidade estrutural mediana.

O diagrama de Ramachandran para a D-Phes apresentado na Figura 3.48 (p. 124),

mostrando grande parte das combinaes angulares relativas cadeia principal na regio mais
favorecida, embora em duas das 20 estruturas o resduo F2 apresenta combinaes de  e que
se encontram na regio proibida do diagrama. Isso no necessariamente indica erro estrutural,
uma vez que o resduo F2 trata-se do estereoismero D da fenilalanina e o diagrama de
Ramachandran foi construdo tendo como base nos estereoismeros L de aminocidos. Sendo
assim, esperado que outliers como estes sejam observados no caso de D-aminocidos.
Figura 3.48. Diagrama de Ramachandran das 20 estruturas de menor energia para a D-Phes. A
regio mais favorecida representada em vermelho, a adicionalmente permitida, em amarelo, a
generosamente permitida, em amarelo claro, e a regio proibida, em branco. 98,9% dos resduos
apresentaram combinaes angulares pertencentes regio mais favorecida, 0,4% a regies
adicionalmente permitidas e 0,7% regio proibida.

3.3.5. Estudos Topolgicos da Interao Peptdeo-Bicamada

Fosfolipdica por Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) em Fase
Slida

3.3.5.1. Estudo da Hilaseptina P2 (HSP2) por RMN em Fase Slida

Para o estudo de RMN em fase slida de HSP2, foram utilizados peptdeos
isotopicamente marcados com 15N no resduo de leucina na posio 18 (L18) e com 2H3 na metila
do resduo de alanina na posio 16 (A16).

O espectro de RMN de 31P desacoplado de 1H (Figura 3.49, p. 125) mostra um sinal em

um maior valor de deslocamento qumico de intensidade muito maior que os demais sinais,
indicando uma boa orientao da bicamada lipdica.
Figura 3.49. Espectro de RMN de 31P desacoplado de 1H de amostra contendo o peptdeo HSP2
reconstitudo em bicamadas mecanicamente orientadas de POPC (1,5% em mol de HSP2 em
POPC) a 93% de umidade relativa (161,9 MHz).
A Figura 3.50 mostra o espectro de RMN de 15N desacoplado de 1H para a HSP2. O
espectro apresenta apenas um sinal de alta intensidade, indicando a que a maior parte das
molculas de peptdeo encontra-se alinhada paralelamente superfcie da bicamada, em uma
orientao principal. O deslocamento qumico observado foi de 74 ppm. A presena de apenas
um sinal majoritrio indcio de que o peptdeo segue preferencialmente uma orientao
quando interage com a bicamada fosfolipdica.

Figura 3.50. Espectro de RMN de 15N desacoplado de 1H de amostra contendo o peptdeos HSP2
em bicamadas mecanicamente orientadas de POPC (1,5% em mol de HSP2 em POPC) a 93% de
umidade relativa (40,6MHz)..
 O espectro de RMN de 2H de HSP2 apresentado na Figura 3.51. O valor de
desdobramento quadrupolar de deutrio observado de 27 kHz, mostrando, tambm, evidncia
de que o peptdeo possui uma orientao preferencial ao interagir com a bicamada.

Figura 3.51. Espectro de RMN de 2H de amostra contendo o peptdeo HSP2 em bicamadas

mecanicamente orientadas de POPC (1,5% em mol de HSP2 em POPC) a 93% de umidade
relativa (61,4 MHz).

A partir dos valores de deslocamento qumico de 15N e desdobramento quadrupolar de

deutrio, prosseguiu-se com a determinao das possveis orientaes do peptdeo na bicamada.
As relaes angulares que definem essa orientao encontram-se representadas na Figura 3.52.

Figura 3.52. Alinhamentos possveis do peptdeo HSP2 em bicamada de POPC (1,5% em mol de
HSP2 em POPC), apresentados em funo do ngulo de inclinao e do ngulo polar de rotao
interna. Os pontos em azul representam orientaes que concordam com o desdobramento
quadrupolar de 2H e os pontos em vermelho representam as orientaes em concordncia com o
deslocamento qumico experimental de 15N. Os pontos de interseo, indicados por algarismos
romanos, mostram orientaes que concordam simultaneamente com os dois parmetros e,
portanto, representam as possveis orientaes do peptdeo nas bicamadas lipdicas.
 a) b)

Figura 3.53. Representao dos possveis alinhamentos indicados na Figura 3.52 (p. 126), para
HSP2, com estruturas vistas (a) de lado e (b) de frente. Os resduos apolares esto representados
em verde e os resduos polares, em azul. A bicamada lipdica encontra-se representada pela rea
em azul claro.

Na Figura 3.53, pela interao da face hidrofbica com o interior aliftico da bicamada,
pode-se considerar que a orientao VI, com o eixo da hlice paralelo superfcie da estrutura
fosfolipdica, a mais provvel. Entretanto, percebe-se que, nessa topologia h ainda uma
insero dos resduos polares E23 e S24 no meio hidrofbico. Isso pode ser consequncia do fato
de a estrutura utilizada para a determinao das orientaes derivar de resultados de RMN com o
peptdeo dissolvido em TFE, meio que normalmente induz estruturas -helicoidais. A utilizao
de uma estrutura adquirida com o peptdeo em contato com fosfolipdeos poderia fornecer
resultados mais precisos acerca da orientao preferencial. Outro ponto que merece ser
levantado que essa determinao topolgica no leva em conta questes dinmicas do peptdeo
e, como esses resduos de aminocido encontram-se em uma regio prxima C-terminao,
possvel que questes dinmicas tenham influncia significativa sobre esses resduos e que essa
regio no se encontra necessariamente em contato com o interior hidrofbico durante todo o
tempo que ocorre a interao peptdeo-membrana.
3.3.5.2. Estudo da [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe2]-Fenilseptina (D-
Phes) por RMN em Fase Slida

Primeiramente, foram realizados experimentos de RMN de 31P desacoplados de 1H. Os

espectros tanto de L-Phes quanto de D-Phes mostram sinais com maior valor de deslocamento
qumico de intensidade muito maior que os demais sinais (Fig. 3.54), indicando uma boa
orientao da bicamada lipdica. O espectro de L-Phes (Fig. 3.54a) mostra um terceiro sinal
imediatamente ao lado do sinal principal, que indica degradao da bicamada lipdica, embora,
devido sua intensidade, pode-se concluir que a degradao mnima e no influencia
significativamente os resultados dos demais experimentos realizados.

a)

b)

Figura 3.54. Espectros de RMN de 31P desacoplados de 1H, de amostras contendo os peptdeos (a)
L-Phes e (b) D-Phes, em bicamadas mecanicamente orientadas de POPC (3% em mol dos
peptdeos em POPC) a 93% de umidade relativa (161,9 MHz).
A Figura 3.55 mostra os espectros de RMN de 15N desacoplados de 1H para a L-Phes (Fig.
3.55a, p. 129) e D-Phes (Fig. 3.55b, p. 129). Os deslocamentos qumicos observados para ambas as
amostras foram bastante prximos entre si (76 ppm para L-Phes e 74 ppm para D-Phes), o que
indica orientaes das respectivas hlices similares entre si.
a) b)

Figura 3.55. Espectros de RMN de 15N desacoplados de 1H de amostras contendo os peptdeos (a)
L-Phes e (b) D-Phes em bicamadas mecanicamente orientadas de POPC (3% em mol dos
peptdeos em POPC) a 93% de umidade relativa (40,6 MHz).
Os espectros de 2H de ambas as fenilseptinas encontram-se na Figura 3.56. Os valores de
desdobramento quadrupolar de deutrio observados so bastante diferentes (36 kHz para a L-
Phes, Fig. 3.56a, e 27 kHz para a D-Phes, Fig. 3.56b, indicando uma diferena significativa entre
os ngulos azimutais de rotao, o que indica que as maneiras com que cada peptdeo ancora-se
membrana se diferenciam significativamente entre si.

a) b)

Figura 3.56. Espectros de RMN de 2H de amostras contendo os peptdeos (a) L-Phes e (b) D-Phes
em bicamadas mecanicamente orientadas de POPC (3% em mol dos peptdeos em POPC) a 93%
de umidade relativa (61,4 MHz).

Com os valores de deslocamento qumico de 15N e desdobramento quadrupolar de

deutrio, foi possvel realizar o clculo de orientaes possveis do peptdeo na membrana. As
relaes angulares que definem essa orientao para a L-Phes encontram-se representadas na
Figura 3.57 e, para a D-Phes, na Figura 3.59 (p. 131). As aplicaes dessas orientaes sobre as
estruturas dos peptdeos encontram-se representada nas Figuras 3.58 (p. 131) e 3.60 (p. 132) para a
L-Phes e D-Phes, respectivamente. As estruturas utilizadas para a determinao das topologias
orientacionais mais provveis foram os modelos de menor energia cujas geometrias foram
determinadas com base nos resultados de RMN em soluo, na presena de DPC. As estruturas
foram primeiramente alinhadas em relao ao eixo z, levando em conta o eixo principal da -
hlice compreendida entre os resduos D4 e L17. O alinhamento foi realizado utilizando-se o
programa GROMACS 4.4 (Van Der Spoel et al., 2005), pelo vetor paralelo ao sentido da ligao
  da amida pertencente ligao peptdica entre os resduos N8 e L9.

Figura 3.57. Alinhamentos possveis do peptdeo L-Phes em bicamada de POPC, apresentados

em funo do ngulo de inclinao e do ngulo polar de rotao interna. As curvas em azul
representam orientaes que concordam com o desdobramento quadrupolar de 2H e as curvas
em vermelho representam as orientaes em concordncia com o deslocamento qumico
experimental de RMN de 15N. Os pontos de interseo, indicados por algarismos romanos,
mostram orientaes que concordam simultaneamente com os dois parmetros e, portanto,
representam as possveis orientaes do peptdeo nas bicamadas lipdicas.
 a) b)

Figura 3.58. Representao dos possveis alinhamentos indicados na Figura 3.57, para L-Phes,
com estruturas vistas a) de lado e b) de frente. Os resduos apolares esto representados em verde
e os resduos polares, em azul. A bicamada lipdica representada pela rea em azul claro.

Figura 3.59. Alinhamentos possveis do peptdeo D-Phes em bicamada de POPC, apresentados

em funo do ngulo de inclinao e do ngulo polar de rotao interna. Os pontos em azul
representam orientaes que concordam com o desdobramento quadrupolar de 2H e as curvas
em vermelho representam as orientaes em concordncia com o deslocamento qumico
experimental de RMN de 15N. Os pontos de interseo, indicados por algarismos romanos,
mostram orientaes que concordam simultaneamente com os dois parmetros e, portanto,
representam as possveis orientaes do peptdeo nas bicamadas lipdicas.
 a) b)

Figura 3.60. Representao dos possveis alinhamentos indicados na Figura 3.59, para D-Phes,
com estruturas vistas (a) lateral e (b) frontal. Os resduos apolares esto representados em verde e
os resduos polares, em azul. A bicamada lipdica encontra-se representada pela rea em azul
claro.

Analisando-se a Figura 3.58 (p. 131) pela anfipaticidade das estruturas, pode-se concluir
que, para o peptdeo L-Phes, as orientaes mais favorecidas so as IV e V, devido ao fato de
grande parte dos resduos apolares estarem em contato direto com a bicamada fosfolipdica,
sugerindo interaes menos energticas do peptdeo com o meio mimtico de membrana.
Entretanto, devido ao fato de a orientao IV promover uma melhor insero dos resduos de
fenilalanina (hidrofbicos) e menor insero da extremidade C-terminal, em que se encontra o
resduo hidroflico treonina (T18) no interior hidrofbico da bicamada fosfolipdica, pode-se
considerar esta como sendo a orientao mais provvel. Com base nos mesmos critrios, pela
anlise da Figura 3.60, pode-se concluir que a orientao mais provvel para D-Phes seria a
orientao II, pois trata-se da nica em que as cadeias laterais de resduos polares no se
encontram inseridas no interior da bicamada. Apenas as cadeias laterais de resduos como lisina
encontram-se parcialmente inseridas no meio hidrofbico na representao da Figura 3.60. Isso
sugere que a cadeia lateral desse resduo interage com a interface da bicamada, que polar. Alm
disso, os resduos de fenilalanina encontram-se quase totalmente inseridos na bicamada,
sugerindo um ancoramento que facilitaria a interao do entre o peptdeo e os fosfolipdeos.

interessante comparar os dois peptdeos epimricos em relao suas respectivas

orientaes mais provveis. Primeiramente, observa-se que, para a D-Phes, a insero dos
resduos de fenilalanina (F1, F2 e F3) no meio fosfolipdico se d de maneira mais efetiva do que
para a L-Phes, em que o resduo F1 (considerando as orientaes IV, Fig. 3.58, p. 131 e II, Fig.
3.60, p. 132, para a L-Phes e D-Phes, respectivamente) no estaria sequer em contato com a
regio hidrofbica da bicamada, considerando a estrutura esttica utilizada para a simulao
orientacional. Esses resultados sugerem um melhor ancoramento na bicamada por parte da D-
Phes em comparao com a L-Phes. Essa interao diferencial da D-Phes com o meio mimtico
de membrana muito possivelmente deve-se ao estereoismero D do resduo F2, que induziria
uma conformao da extremidade N-terminal mais propensa a se inserir de forma mais efetiva no
interior hidrofbico de agrupamentos fosfolipdicos. Ancoramentos como esse so normalmente
bastante importantes para o exerccio da atividade biolgica de peptdeos antimicrobianos, uma
vez que eles promovem uma interao mais forte com a membrana bacteriana. De fato, esses
resultados so coerentes com os testes antimicrobianos realizados com ambos os peptdeos (de
Magalhes, 2012), em que se observa uma atividade bactericida maior por parte da D-Phes em
relao L-Phes. Esse ancoramento mais efetivo teria um papel importante nessa diferena de
atividade.

No entanto, a configurao do  do resduo de F2 na D-Phes no teria uma influncia na

extremidade N-terminal apenas, mas tambm na prpria orientao da hlice. Isso evidente
tanto pelas imagens relativas s orientaes mais provveis quanto pelo prprio espectro de 2H.
Enquanto os resultados dos experimentos de RMN de 15N indicam ngulos de inclinao
relativamente prximos entre os peptdeos, a diferena dos valores de desdobramento
quadrupolar de deutrio aponta que os peptdeos adotam ngulos polares de rotao interna
significativamente diferentes quando da interao deles com a bicamada fosfolipdica. Uma
anlise das Figuras 3.58 (p. 131) e 3.60 (p. 132) realmente mostra que a interao da regio
helicoidal da D-Phes com o meio mimtico de membrana se d de forma mais efetiva em
comparao com a mesma regio do peptdeo L-Phes. Por fim, uma outra caracterstica
geomtrica interessante a ligeira distoro da hlice apresentada nas estruturas da D-Phes. Essa
distoro aparentemente promove uma maior insero da cadeia lateral da L17 na bicamada,
fazendo, ao mesmo tempo, com que o resduo T18 fique em contato com a interface aquosa, e
no com o interior hidrofbico. Nos modelos para a L-Phes, em que tal distoro no
encontrada, o resduo T18 encontra-se inserido no meio apolar da bicamada. Essa caracterstica
possivelmente influencia a melhor interao da D-Phes em relao a seu homlogo.

Alm disso, analisando as larguras de linha dos sinais nos respectivos espectros de RMN
de 2H de L-Phes e de D-Phes, verifica-se que elas so diferentes, se apresentando maior para o
primeiro peptdeo. Isso pode ser devido a diferenas de mobilidade de cada peptdeo no meio
utilizado. Sendo assim, poder-se-ia inferir que, enquanto D-Phes apresentaria basicamente uma
orientao majoritria, devido menor largura de linha dos sinais (Fig. 3.56b, p. 129), L-Phes
interagiria com a bicamada em grande parte seguindo a orientao calculada, mas haveria uma
populao considervel de molculas interagindo com a bicamada seguindo outras orientaes.
Essa inferncia est em concordncia com os dados de ensaios biolgicos (de Magalhes et al.,
2012), que mostram maior atividade antimicrobiana para a D-Phes, uma vez que interaes
peptdeo-membrana mais fortes refletem a adoo de uma orientao preferencial das molculas
do peptdeo em relao bicamada fopsfolipdica. Por outro lado, a maior mobilidade de L-Phes,
revelada pelos sinais de RMN mais largos, devidos maior populao de orientaes
moleculares, resulta em interaes peptdeo-membranas mais fracas, sendo condizente com a
menor atividade biolgica verificada para este epmero.

3.4. Caracterizao Termodinmica do Processo de Interao

Peptdeo/Membrana por Calorimetria de Titulao Isotrmica
Neste trabalho, o processo de interao dos peptdeos HSP2 com membranas mimticas
de POPC:POPG (modelo de membrana bacteriana) foi estudado por calorimetria de titulao
isotrmica, com o objetivo de determinar os parmetros termodinmicos (u , u M, u v e  ),
o grau de interao I e o coeficiente estequiomtrico da interao (w).

3.4.1 Determinao da entalpia de interao peptdeo-membrana

As curvas mostradas na Figura 3.61 (A e B), p. 135, representam o tipo de titulao

descrito na introduo, com baixas razes P:L para o peptdeo HSP2 e lipossomas de
POPC/POPG.
 A B

Tempo (min) Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 10 20 30 40 50

0,6
0

0,4
cal/s

cal/s
-5

0,2

-10
0,0
0
4,4
kcal/mol (peptdeo injetado)

kcal/mol peptdeo injetado

-2
4,0
-4 3,6
-6 3,2

-8 2,8
2,4
-10
2,0
-12
1,6
-14
1,2
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,0000 0,0004 0,0008 0,0012 0,0016 0,0020
Razo molar Razo Molar

Figura 3.61. Curvas da titulao calorimtricas do lipossoma de POPC:POPG (3:1,

mol:mol) (35 mM) com o peptdeo HSP2. A: injeo de 16 L do peptdeo HSP2 na
concentrao 2 mM. B: injeo de 27 L HSP2 na concentrao 340 M.

Tanto na Figura 3.61A quanto na Figura 3.61B a concentrao do lipdeo na clula era 35
mM com volume a igual a 1,4244 mL (volume efetivo). Entretanto, observa-se que a interao
depende da concentrao de HSP2.

Na Figura 3.61A em que a concentrao de HSP2 era 2 mM e o volume injetado 16 L, a

razo P:L variou de 1:1,548 (primeira injeo) a 1:78 (ltima injeo) com a entalpia de interao
exotrmica. Na Figura 3.61B, esta mesma razo variou de 1:5,383 a 1:556, com a concentrao
do peptdeo de 340 M e injees de 27 L e entalpia de interao endotrmica. Na Tabela 3.15
(p. 136) so mostrados os valores da variao de entalpia de interao obtidos.

O valor positivo para a variao da entalpia, quando a concentrao do peptdeo 340

M pode ser justificada pela baixa razo P:L. A energia envolvida na dessolvatao do peptdeo
maior do que a energia de interao e insero do peptdeo na membrana, no sendo, neste caso,
entalpicamente favorvel (Tabela 3.15). O processo endotrmico que se observa sugere um
processo de agregao do peptdeo na superfcie da membrana.
Tabela 3.15
3.15. Entalpia de interao de HSP2 com POPC:POPG 3:1(mol:mol)

y(K
(KJ/mol de peptdeo)
Peptdeo/carga Concentrao do peptdeo
POPC:POPG (3:1)

HSP2/+1 2 mM -52,14

HSP2/+1 340 M +12,32

De acordo com a Tabela 3.15, os valores das entalpias obtidas indicam uma interao
peptdeo/lipdeo entalpicamente favorvel. Numa primeira aproximao, estes valores
representam a interao eletrosttica entre o peptdeo e o lipdeo negativo da membrana e tm a
magnitude dependente da carga do peptdeo HSP2.

As curvas de titulao obtidas das experincias em que o peptdeo est na clula e

titulado com lipdeo so mostradas nas Figuras 3.62A e 62-B.

A B
Tempo (min)
Tempo (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

0
0
cal/s

-2 -5
cal/s

-4
-10

1,0
0,8
kcal/mol de lipdeo injetado
kcal/mol de lipdeo injetado

0,6 0,5
0,4
0,2 0,0
0,0
-0,2 -0,5
-0,4
-1,0
-0,6
-0,8
-1,5
-1,0

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 -2,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
Razo molar
Razo molar

Figura 3.62. Curvas calorimtricas da titulao do peptdeo HSP2 850 M com com
injees de 6 L de lipossomas de POPC:POPG (3:1, mol:mol) (35 mM). A: T= 25 C;
B: T= 35 C.

Nos experimentos de titulao mostrados nas Figuras 3.62 A e B, a razo P:L variou de
1:0,2 (incio da titulao) a 1:6.3 (final da titulao). A razo peptdeo/lipdeo baixa ao longo de
toda a titulao, verificando-se, neste caso, a saturao do lipossoma injetado na clula de
titulao. A estequiometria da reao (w), calculada a partir da razo molar no ponto de inflexo
da curva de titulao, aproximadamente 2,5, indicando que cada molcula de peptdeo est
envolvida por 2,5 molculas de lipdeo no lipossoma. de se notar a influncia da temperatura
na interao peptdeo-membrana. Tanto a 25 C (Figura 3.62a, p. 136) quanto a 35 C (Figura
3.62B, p. 136), a saturao ocorre com o mesmo nmero de injees, j que a concentrao do
peptdeo utilizada em ambas as titulaes a mesma. No entanto, observa-se uma melhor
interao na titulao efetuada a 35 C tanto pelo formato da curva de titulao, quanto pela
quantidade de calor liberada, a qual foi maior na titulao a 35 C. Esta observao pode ser
explicada pela maior flexibilidade das cabeas e mobilidade das cadeias carbonadas na
temperatura de 35 C, facilitando a interao e insero do peptdeo na membrana.

O valor da entalpia experimental =x  D , que neste caso representa a entalpia do

processo de interao (partio), obtido pelo somatrio dos calores r , de cada injeo (aps
descontada a contribuio da diluio no processo, que neste caso foi obtida como o valor mdio
dos r dos ltimos picos, tomados quando o valor de r , estabiliza num valor positivo) dividido
pelo nmero de mols de peptdeo total na clula `w= a, de acordo com a Equao 3.1,
apresentada a seguir:

QP r
 =
B
w=
(Eq.3.1)

A partir do clculo da variao de entalpia pela equao 3.3 e com o conjunto de

equaes 3.5 e 3.6 (Quadro 3.1, p. 139) calcula-se a constante de partio  (aps a correo dos
efeitos eletrostticos, que afetam a concentrao de peptdeo na membrana). Com o valor de
 calculado foram obtidos os valores da variao da energia livre (v D) e da variao de
entropia M D. Os valores destes parmetros, obtidos para o peptdeo HSP2 so mostrados na
Tabela 3.16 (p. 143).

O processo de interao do peptdeo HSP2 em lipossomas de POPC:POPG foi avaliado

considerando-se o efeito global (contribuio dos efeitos hidrofbicos e eletrostticos em
simultneo) refletido no calor liberado por injeo (processo de partio simples), j que tanto o
peptdeo quanto os lipossomas tm cargas.
 A distribuio do peptdeo entre a fase aquosa e a fase lipdica governada pela energia
de transferncia, isto , pela variao de energia de Gibbs (v U ) na passagem de uma fase para a
outra. (White & Wimley, 1999; Wieprecht & Seelig, 2002; Seelig, 2004). A exata localizao do
peptdeo na membrana influenciada fundamentalmente pela natureza das interaces
electrostticas, polares e apolares que se estabelecem.

A variao de energia de Gibbs (Eq. 3.2) de todo o processo pode ser obtida atravs do
coeficiente de partio,  :

v = v D  Rw (Eq. 3.2)

3.2

Numa situao de equilbrio, onde v = 0; tem-se a Equao 3.3 ento:

v D = Rw ou v D = Rw55.5 (Eq.

Eq. 3.3)
3.3

Na Equao 3.3 pode-se incluir o factor 55.5 que representa a contribuio translacional
(entrpica) das molculas de gua para a energia livre do processo de partio (Hoffman, 1974;
Holtzer, 1995).

A partir dos valores de v, obtm-se os valores de u M D, pela Equao 3.4:

v D =  D M D (Eq.
Eq. 3.4)
3.4

A variao da entalpia  D, relacionada com o processo de partio, pode ser calculada de acordo
com a Equao 3.1, a partir dos dados experimentais obtidos por ITC (Seelig, 1997; Wieprecht et
al., 1999),
 w=

=

=
w=
(3.5)

=

= X r  D w= (3.6)
QP

w=
=,@

= '

`1 =

a
$)=
(3.7)

$)=
'

=
`$)=  $ a
(3.8)

w

= $ 

(3.9)

w=

I =
w

(3.10)

I =  =,@
 (3.11)

Quadro 3.1. Conjunto de equaes usadas no clculo de  a partir dos dados experimentais de
titulao calorimtrica isotrmica, em que r o calor envolvido em cada injeo (j subtrado
do calor de diluio) e w= o nmero total de mols de peptdeo na clula do calormetro.

No decurso da titulao, a frao de peptdeo ligado, membrana, =


dada pela
Equao 3.5 do Quadro A, onde w=

a quantidade, em mols, de peptdeo ligado aps a  
injeo. Se em cada injeo temos uma quantidade de calor trocada, r , pode-se combinar as
Equaes 3.1. e 3.5 e expressar a frao ligada em funo da entalpia do processo de interao,
conforme a equao 3.6.

A partir do valor de =


pode-se estimar a quantidade de peptdeo que permanece livre
na soluo aquosa, aps o equilbrio de partio a qual pode ser calculada pela Equao 3.7.

A concentrao =,@

deve ser corrigida por um factor de diluio '

(Equao 3.8) no
caso de se usar o VP-ITC, porque o volume efetivo da clula (1.4244 mL) mantm-se, mas h
uma diluio do peptdeo pela quantidade injetada (volume esse que expulso da clula). O
volume efetivo da clula calorimtrica $)= ,  o nmero da injeo e $ o volume injetado.
 medida em que a titulao prossegue, a quantidade de lipdeo injetada na clula
calorimtrica aumenta. A quantidade de lipdeo, w

, presente na clula, e a concentrao 

,
em mol, do lipdeo na seringa na injeo  so contabilizados de acordo com a equao 3.9.

Pode-se calcular a frao de partio peptdeo/lipdeo, I , da Equao 3.10, pela razo

entre a quantidade, em mol, de peptdeo ligado w=

e a quantidade, em mol, de lipdeo w

,
aps cada injeo.

Se a interao do peptdeo com a membrana corresponder a um processo de partio

simples (em que se considera que o pepttdeo, ou est na soluo, ou est na membrana lipdica),
a curva da frao de partio I em funo da concentrao do peptdeo em soluo aquosa
=,@

deve ser linear e o declive desta curva fornece o valor da constante de partio,  ,
conforme a Equao 3.11 (Breukink et al., 2000). Neste caso, os efeitos de carga (eletrostticos) e
hidrofbicos so considerados em conjunto.

A representao grfica da frao de peptdeo HSP2 ligada I  membrana mimtica de

POPC:POPG em funo da concentrao do peptdeo livre na fase aquosa, =,@ 
apresentada nas Figuras 3.63 (A e B, p. 142). A Figura 3.63 A (p. 142) representa os dados obtidos
na titulao calorimtrica isotrmica a 25C e a Figura 3.63 B (p. 142) representa os mesmos
dados, obtidos a 35C. Na Tabela 3.16 (p. 143) esto mostrados os valores dos parmetros
termodinmicos da interao peptdeo/membrana, obtidos por ITC.

Observa-se uma relao linear entre I e =,@ com um bom coeficiente de correlao
nos dois casos. Os valores de  (Tabela 3.16, p. 143) obtidos atravs das inclinaes das retas
tem valores semelhantes para o mesmo peptdeo, tanto a 25C, quanto a 35C. Este resultado
sugere que, no processo de partio h uma significativa contribuio do efeito hidrofbico e
que a interao electrosttica no dominante. De fato, a carga nominal do peptdeo HSP2 +1
e este petdeo tem uma conformao bastante anfiptica (Figuras 1.9, p. 15 e 3.46, p. 127), o que
facilita a sua insero na membrana lipdica.

Nos valores negativos encontrados para o  D (Tabela 3.16, p. 143) esto somadas as
interaes eletroststicas e hidrofbicas do peptdeo HSP2 com os lipdeos da membrana. Estes
valores tambm contabilizam as ligaes de H intramoleculares da estrutura em hlice do
peptdeo formada no momento da interao com a membrana. A magnitude desta interao foi
influenciada pela temperatura, j que o maior valor  D foi obtido a 35C. Como descrito
anteriormente, o aumento da temperatura aumenta a mobilidade das cabeas e das cadeias
carbonadas do lipdeo, facilitando a insero do peptdeo.

Em relao aos valores de M D observa-se na Tabela 3.16, p. 143, que os valores so

positivos, indicando a contribuio da componente entrpica no processo de partio do
peptdeo para a membrana. Esta observao est de acordo com o processo de interao e
insero do peptdeo na membrana que envolve algumas etapas: inicialmente o peptdeo
atrado para a superfcie da membrana por efeito eletrosttico e esta interao geralmente
dirigida pela entalpia. Em seguida, o peptdeo que se encontrava desestruturado, na fase aquosa,
estrutura-se em -hlice ou folha- (este processo , geralmente, entalpicamente favorvel).
 A

6000
-1

4000
Xb / mM.mol

2000

0
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12
Cpep,aq / mM

10000

8000

6000
-1
Xb / mM.mol

4000

2000

0
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14
Cpep, aq / mM

Figura 3.63. Representao grfica da frao ligada do peptdeo em funo da

concentrao do peptdeo livre em fase aquosa para o HSP2 a 850 M em membranas

titulao a 35 C ; valor de R2 = 0,9989. Os valores de  foram obtidos a partir das

lipdicas de POPC:POPG (3:1) 35 mM. A: titulao a 25 C ; valor de R2 = 0,9993. B: A:

inclinaes das curvas.

Tabela 3.16.
3.16. Valores dos parmetros termodinmicos experimentais obtidos por ITC para HSP2

 D M D v D
Concentrao
do peptdeo
Peptdeo (M) Kp (kJ/mol de (kJ/mol de (kJ/mol de
peptdeo) peptdeo) peptdeo)
(P:L)

850
HSP2 25 C 6,88x104 -6,76 30,80 -37,56
(1:0,2-1:5,2)
850
HSP2 35 C 6,94x104 -13,64 25,20 -38,64
(1:0,2-1:5,2)

Por ltimo, o peptdeo insere-se no ncleo hidrofbico da membrana e esta insero pode
ser entalpicamente dirigida pelas ligaes de H e as interaces de van der Waals formadas, mas
tambm pode ser governada entropicamente por efeito hidrofbico (Seelig, 1997; Seelig, 2004). A
entropia do processo inclui a mudana conformacional do peptdeo e a perda de gua da camada
de solvatao (aumento dos graus de liberdade rotacional e translacional das molculas de gua)
durante a insero. Desta maneira o balano entalpico e entrpico do processo de interao
peptdeo/membrana pode favorecer a entropia.

A maior componente entrpica M D  na interao com a membrana foi verificada

temperatura de 25 C. A diferena encontrada justificada pelo menor valor da entalpia, em
relao temperatura de 35 C.

Os valores negativos da energia de Gibbs v D  confirmam que o processo partio

energeticamente favorvel, indicando que o peptdeo particiona espontaneamente para a
membrana.
4. Conclusa o
No trabalho apresentado nesta tese, foram realizados experimentos de naturezas distintas
e complementares para elucidar aspectos estruturais e termodinmicos de trs peptdeos
antimicrobianos (Distinctina, Hilaseptina P2, abreviada como HSP2, [L-Phe2]-Fenilseptina e [D-
Phe2]-Fenilseptina, abreviados como L-Phes e D-Phes, respectivamente). As metodologias
empregadas foram Dicrosmo Circular (CD), RMN em soluo, RMN em fase slida e
Calorimetria de Titulao Isotrmica (ITC) e todas forneceram informaes valiosas e
complementares entre si para se entender de forma mais completa as propriedades dessas
substncias que possibilitam o exerccio de suas atividades biolgicas que, no caso, so atividades
antimicrobianas.

4.1. Distinctina e Cadeias 1 e 2

Em relao distinctina, os estudos de CD mostraram que ambos os monmeros

(Cadeias 1 e 2) estruturam-se em meios mimticos de membrana, embora nenhuma estruturao
significativa possa ser identificada em gua. Resultado semelhante foi obtido para o heterodmero
distinctina, que se estrutura consideravelmente bem em meio vesicular. Entretanto, diferenas
foram observadas quando se comparou o contedo de estruturas -hlice obtido em
experimentos em 2,2,2-trifluoretanol (TFE). Tais resultados podem indicar que a interao do
heterodmero com meios mimticos de membrana (no caso, vesculas fosfolipdicas) em soluo
pode ser melhor descrita como um equilbrio envolvendo mais de uma espcie termodinmica,
devido ausncia de um ponto isosbsticos (ou isodicrico). Embora os resultados de RMN em
fase slida descritos em Magalhes e colaboradores em 2009 mostrem que a distinctina interage
com bicamadas fosfolipdicas com as cadeias orientadas quasi-paralelamente entre si, esse estudo
no leva em conta o equilbrio termodinmico dessa interao e esse carter est refletido nos
resultados obtidos por CD. O conjunto de modelos obtido a partir de dados de RMN em soluo
da distinctina em TFE reflete de certa maneira esse dinamismo estrutural, mostrando grande
variabilidade da orientao de uma cadeia em relao outra. Alm disso, no foram observadas
correlaes NOE de longo alcance entre as duas cadeias. Embora a ausncia dessas correlaes
no implique necessariamente que o peptdeo adote uma conformao com as cadeias
monomricas orientadas paralelamente entre si, esses resultados evidenciam que no h
interaes intercadeia suficientemente fortes para estabilizar uma estrutura quaternria tal qual a
observada para a distinctina em gua (Raimondo et al., 2005). Comportamento semelhante foi
observado para o peptdeo homodimrico Homotarsinina (Verly, 2010), em que espectros
obtidos com a substncia em gua mostram correlaes intercadeia bem definidas que refletem
uma estruturao do tipo coiled coil, ou super-hlice, mas espectros deste peptdeo em DPC no
mostram tais NOEs intercadeia, levando a um modelo cuja orientao das unidades
monomricas no bem definida.

Por fim, os resultados de RMN em soluo da distinctina mostram que a melhor

estratgia a ser tomada para o estudo deste peptdeo em soluo seria utilizar meios que induzam
a uma ordenao da sua molcula, como, por exemplo, bicelas. Dessa forma, seria possvel obter
valores de orientao entre as cadeias levando em conta, ainda, o aspecto dinmico da
conformao molecular quando em soluo. Esses resultados ajudariam na descrio da
interao peptdeo-membrana bacteriana, especialmente se aliados aos dados estruturais pr-
existentes. No momento da redao deste trabalho, esto, ainda, em curso, estudos
termodinmicos por ITC da distinctina e de suas cadeias monomricas quando interagem com
lipossomas. Estes estudos podem no s fornecer informaes extremamente relevantes das
interaes em si, mas tambm da termodinmica envolvida na mudana conformacional dos
peptdeos quando passam de um meio totalmente aquoso para outro meio rico em fosfolipdeos.
Alm disso, seria possvel estudar o papel da ligao dissulfeto sobre a atividade antimicrobiana,
bem como a possvel sinergia entre as Cadeias 1 e 2 da distinctina no que diz respeito sua
atividade bactericida.

Todas estas observaes mostram que, embora se tenha informaes definidas a respeito
das estruturaes da distinctina e das Cadeias 1 e 2 em meios mimticos aos quais elas exercem
suas atividades biolgicas, a elucidao do mecanismo relativo s suas propriedades
antimicrobianas ainda necessita de diversos outros estudos, e de importncia significativa para a
compreenso da natureza dessa nova classe de antibiticos qual pertencem os peptdeos
antimicrobianos isolados da pele de anuros.
4.2. Hilseptina P2 (HSP2)

Para este peptdeo, os experimentos de CD mostraram que, embora o peptdeo seja

majoritariamente desestruturado em meio totalmente aquoso, ele apresenta contedo elevado
de -hlice quando se encontra em meio fosfolipdico. Este tipo de comportamento, como j
comentado, bastante comum em peptdeos antimicrobianos, especialmente com de hlices
anfipticas, que propiciam interaes mais efetivas com membranas bacterianas. De fato, os
resultados obtidos por RMN na presena de TFE mostram que o peptdeo tem maior propenso
em adotar a forma -helicoidal e que esta estrutura bastante anfiptica, o que coerente tanto
com os resultados de CD quanto com as caractersticas estruturais de outros peptdeos
antimicrobianos isolados da pele de anuros. Os estudos de RMN em fase slida permitiram
determinao da orientao mais provvel (orientao VI, Fig 3.53, p. 132) desse peptdeo no
meio de bicamada fosfolipdica e mostraram que a estruturao adotada por HSP2 tem papel
importante na interao entre este peptdeo e fosfolipdeos.

Os estudos por ITC forneceram informaes complementares a respeito da interao

entre HSP2 e lipossomas, podendo-se extrair concluses a respeito da estequimetria dessa
interao, bem como os parmetros termodinmicos envolvidos. Interessantemente, os
resultados mostraram que a eficcia dessa interao depende bastante da concentrao do
peptdeo, ou melhor, da razo peptdeo:lipdeo. Em situaes em que essa razo baixa, a
interao no entalpicamente favorecida e a anlise desses dados parece sugerir que a
capacidade de agregao da HSP2 tem um papel significativo no exerccio de sua atividade
biolgica. Outro dado interessante que pde ser extrado a respeito da natureza dessa interao
que majoritariamente de natureza hidrofbica, considerando a anfipaticidade da hlice, embora
interaes de natureza eletrostticas tenham papel importante em uma interao preliminar
entre a HSP2 e o lipossoma, responsvel pela aproximao inicial do peptdeo ao meio
fosfolipdico.

Agrupando-se os resultados obtidos para a HSP2, pode-se chegar a uma imagem mais
geral a respeito da maneira pela qual o peptdeo interage com a membrana. A presena de
resduos carregados positivamente em meio fisiolgico, como a lisina, na sequncia de
aminocidos de HSP2 teria papel fundamental na aproximao inicial do peptdeo com a
membrana bacteriana, porm, aps essa aproximao inicial, a interao seria mantida por
fatores relativos hidrofobicidade e relacionados diretamente face hidrofbica da hlice. Essas
observaes so bastante coerentes tanto com os resultados de RMN em soluo, que mostrou
uma estruturao em -hlice anfiptica, quanto com a topologia da orientao determinada por
RMN em fase slida, que mostra que o modelo obtido experimentalmente pode ser utilizado
com sucesso para descrever a relao estrutura-atividade dessa substncia.

Apesar de algumas caractersticas que podem levar atividade antimicrobiana de HSP2

terem sido elucidadas por estes experimentos, o estudo do mecanismo pelo qual se d essa
atividade ainda est no incio. Primeiramente, deve-se levar em conta que os experimentos de
RMN em soluo foram realizados com o peptdeo na presena de TFE. Embora os resultados
obtidos nesse meio possam ser a princpio utilizados para explicar estruturaes em membranas,
a utilizao de resultados obtidos com o peptdeo na presena de micelas de DPC pode fornecer
modelos mais precisos para serem submetidos s restries orientacionais obtidas por estudos de
RMN em fase slida e, por fim construir-se uma imagem mais completa da interao do peptdeo
com a membrana. A utilizao de meios que no sejam o TFE importante pelo fato de se ter
uma melhor noo da presena ou ausncia de uma estruturao definida nas extremidades da
cadeia polipeptdica, bem como da natureza dessa estrutura, uma vez que este solvente pode de
certa maneira forar a estruturao em -hlice dessas extremidades quando, em meio
fisiolgico, elas no possuam tal conformao. A determinao mais precisa da geometria dessas
terminaes importante devido ao fato de elas muitas vezes interagirem com o interior
hidrofbico das membranas, agindo como se fossem ncoras e potencializando a capacidade de
interao do peptdeo. No entanto, pode-se considerar que os resultados obtidos em TFE
fornecem informaes extremamente relevantes a respeito do papel da estrutura secundria em
questo (que foi observada nos experimentos de CD) na atividade biolgica da HSP2. No
momento da escrita dessa concluso, os experimentos em DPC j haviam sido realizados, mas
ainda no analisados e atribudos.

4.3. [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe2]-Fenilseptina (D-

Phes)

Os resultados obtidos para as fenilseptinas permitiram no s chegar a concluses a

respeito de alguns aspectos envolvidos em seus mecanismos de ao, mas tambm analisar a
influncia de uma epimerizao perto de uma das extremidades da cadeia peptdica sobre a
estrutura e interao com fosfolipdeos. Resultados obtidos por RMN em soluo mostraram que
ambos os peptdeos adotam estruturas ricas em -hlice, mas exceto por uma estruturao
ligeiramente maior da D-Phes, no foram observadas diferenas significativas entre os modelos
para cada peptdeo. Os resultados de RMN em fase slida, no entanto, mostram que h diferena
considervel na orientao desses peptdeos quando de suas interaes com bicamadas
fosfolipdicas. Aplicando-se as restries orientacionais sobre os modelos obtidos por RMN em
soluo na presena de micelas de DPC, pde-se observar que, embora ambas as estruturas
satisfaam o critrio de que a face hidrofbica de suas hlices anfipticas interaja com o interior
aliftico da bicamada, a insero da extremidade N-terminal da D-Phes, que apresenta o motivo
Phe-Phe-Phe caracterstico das fenilseptinas, maior, sugerindo um melhor ancoramento do
peptdeo na bicamada lipdica. Esse melhor ancoramento seria devido ao fato de o segundo
resduo de Phe ser o estereoismero D e bastante coerente com o fato de a D-Phes apresentar
maior atividade antimicrobiana que seu epmero, a L-Phes, sugerindo tambm, um melhor
empilhamento aromtico na D-Phes que na L-Phes

Futuramente, seria interessante descobrir aspectos adicionais relativos a essa interao

diferenciada a partir de experimentos como ITC e simulaes de Dinmica Molecular, que
podem fornecer informaes complementares em relao termodinmica da interao e
tambm detalhes a nvel atmico e a variao temporal de certas propriedades. Entretanto, os
resultados de RMN puderam com sucesso conciliar as caractersticas estruturais de ambos os
peptdeos com os dados de atividade biolgica existentes.

4.4. Consideraes Finais

Com base no arsenal de mtodos existentes para o estudo estrutural e termodinmico dos
peptdeos, foi possvel elucidar alguns aspectos a respeito da estruturao e atividade biolgica
dessas substncias. A determinao geomtrica de peptdeos antimicrobianos tem se mostrado
bastante importante no entendimento de suas respectivas atividades biolgicas. Entretanto,
cada vez mais necessrio o uso de outras tcnicas para se construir um melhor modelo de
mecanismo de atividade para as substncias que apresentem grande potencial de aplicao
farmacolgica. A utilizao de RMN no estado slido de amostras orientadas, em especial, pode
fornecer resultados extremamente importantes em relao maneira pela qual essa interao
ocorre e que dificilmente poderia ser obtida experimentalmente por outra tcnica. Embora ainda
haja certas limitaes no que tange a RMN, sua utilizao tem-se mostrado fundamental para a
compreenso de diversos aspectos relativos a peptdeos e protenas no geral. Essa capacidade da
RMN ainda mais potencializada quando utilizada em conjunto com outras tcnicas como ITC,
que fornece informaes termodinmicas, as quais aliadas s informaes estruturais permitem a
construo de modelos mais precisos e completos sobre a atividade biolgica dessas substncias.
5. Refere ncias Bibliogra ficas

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174
 Anexo A
Tabelas de Deslocamento Qumico de L-Phes e D-Phes
posio  carbonila para cada resduo de aminocido de L-Phes
Tabela A1. Valores de deslocamento qumico de ncleos pertencentes cadeia principal e

Resduo de Deslocamento HN 7,983

tomo
Aminocido Qumico (ppm) CA 56,084
HN HA 4,477
N8
CA 57,629 CB 38,524
HA 4,453 HB1 2,962
F1
CB 39,352 HB2 2,864
HB1 3,234 HN 8,258
HB2 3,063 CA 58,015
HN 9,428 HA 4,087
CA 61,106 L9
CB 42,006
HA 4,427 HB1 1,857
(L-)F2
CB 39,299 HB2 1,625
HB1 3,540 HN 8,613
HB2 3,229 CA 55,582
HN 8,805 A10 HA 3,925
CA 61,187 CB 18,112
HA 4,124 HB# 1,469
F3
CB 38,689 HN 8,225
HB1 3,145 CA 47,430
HB2 3,086 G11
HA1 4,085
HN 7,918 HA2 3,787
CA 57,289 HN 7,801
HA 4,314 CA 58,899
D4
CB 40,244 HA 4,204
HB1 2,738 K12
CB 32,484
HB2 2,804 HB1 2,115
HN 7,901 HB2 1,913
CA 66,281 HN 8,065
T5 HA 3,980 CA 66,734
CB 68,465 V13 HA 3,664
HB 4,208 CB 31,774
HN 8,022 HB 2,268
CA 58,158 HN 8,457
HA 3,910 CA 65,147
L6
CB 41,475 I14 HA 3,689
HB1 1,583 CB 37,758
HB2 1,535 HB 1,948
HN 8,150 G15 HN 8,288
CA 60,563 CA 46,985
K7
HA 3,751 G15 HA1 3,936
CB 32,150 HA2 3,836
HB1 1,828 HN 7,762
K7 A16
HB2 1,749 CA 54,160
A1
 HA 4,273
CB 18,707
HB# 1,551
HN 7,858
CA 56,444
HA 4,262
L17
CB 43,189
HB1 1,897
HB2 1,619
HN 7,767
CA 62,286
T18 HA 4,320
CB 70,301
HB 4,355

A2
posio  carbonila para cada resduo de aminocido de D-Phes
Tabela A2. Valores de deslocamento qumico de ncleos pertencentes cadeia principal e

Resduo de Deslocamento HA 4,303

tomo
Aminocido Qumico (ppm) CB 38,399
N8
HN HB1 2,978
CA 56,854 HB2 2,874
HA 4,242 HN 8,240
F1
CB 39,638 CA 58,031
HB1 3,375 HA 4,092
L9
HB2 3,162 CB 42,091
HN 7,798 HB1 1,864
CA 5,012 HB2 1,704
(D-)F2
HA HN 8,573
CB 41,516 CA 55,605
HB1 2,564 A10 HA 3,933
HB2 2,389 CB 18,268
HN 9,248 HB# 1,499
CA 61,546 HN 8,220
HA 3,862 CA 47,432
F3 G11
CB 38,480 HA1 3,794
HB1 3,015 HA2 4,086
HB2 2,911 HN 8,290
HN 8,889 CA 58,752
CA 56,925 HA 4,222
K12
HA 4,144 CB 32,687
D4
CB 38,368 HB1 2,128
HB1 2,763 HB2 1,921
HB2 2,658 HN 8,095
HN 7,679 CA 66,744
CA 66,054 V13 HA 3,653
T5 HA 3,974 CB
CB 68,915 HB 2,272
HB 4,044 HN 8,491
HN 7,514 CA 65,075
CA 57,930 I14 HA 3,689
HA 3,967 CB 37,798
L6
CB HB 1,957
HB1 1,840 HN 8,290
HB2 1,780 CA 47,057
G15
HN 8,280 HA1 3,947
CA 60,459 HA2 3,841
HA 3,203 HN 7,788
K7
CB 32,168 CA 54,182
HB1 1,852 A16 HA 4,281
HB2 1,735 CB 18,889
HN 8,109 HB# 1,557
N8
CA 55,948 L17 HN 7,881
A3
 CA 56,302
HA 4,268
L17 CB 43,147
HB1 1,901
HB2 1,630
HN 7,782
CA
T18 HA 4,341
CB
HB

A4
 Anexo B
Apresentaes de Trabalhos em Congressos
1. RESENDE, J. M., MUNHOZ, V. H. O., AISENBERY, C., MORAES, C. M., VERLY, R. M,
BERTANI, P., FERREIRA, A. C., PIL-VELOSO, D., BECHINGER, B.
Membrane Structure and Conformational Changes During Bilayer-Association of the Antibiotic
Heterodimeric Peptide Distinctin by Oriented Solid-State NMR Spectroscopy 12th NMR USERS
MEETING-3rd IBEROAMERICAN NMR MEETING, 2009, Angra dos Reis.
EXTENDED ABSTRACT BOOK. Rio de Janeiro: AUREMN, 2009. v.12. p.97 - 98
Keywords: Phyllomedusa distincta, Antimicrobial Peptide, Nuclear Magnetic Resonance
Knowledge areas : Proteins,Spectroscopy,Structure, Conformation and Stereochemistry
Additional references : Brasil/English.

2. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, RESENDE, J. M., ALMEIDA, F. C. L., PIL-VELOSO, D.

Structural Determination by NMR of the Antimicrobial Peptide Distinctin In: 12th NMR USERS
MEETING-3rd IBEROAMERICAN NMR MEETING, Angra dos Reis.
EXTENDED ABSTRACT BOOK. Rio de Janeiro: Auremn, 2009. v.12. p.169 - 170
Keywords: Phyllomedusa distincta, Antimicrobial Peptide, Nuclear Magnetic Resonance
Knowledge areas : Proteins,Spectroscopy,Structure, Conformation and Stereochemistry
Additional references : Brasil/English.

3. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, Pil-Veloso, D., Alcntara, A. F. C.

Structural Determination by NMR Spectroscopy and Conformational Analysis of Chain 2 of
Distinctin, an Antimicrobial Peptide from Phyllomedusa distinct Anurans In: EUROMAR
Magnetic Resonance Conference, 2008, So Petersburgo.
Book Of Abstracts. So Petersburgo: St. Petersburg State University, 2008. v.1. p.28 - 28
Keywords: Nuclear Magnetic Resonance, Antimicrobial Peptide, Phyllomedusa distincta
Knowledge areas : Structure, Conformation and Stereochemistry,Spectroscopy,Proteins
Additional references : Rssia/English. Meio de divulgao: Impresso

4. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, Pil-Veloso, D., Alcntara, A. F. C.

Structural Determination by NMR Spectroscopy and Conformational Analysis of Chain 1 of
Distinctin, an Antimicrobial Peptide from Phyllomedusa distinct Anurans In: EUROMAR
Magnetic Resonance Conference, 2008, So Petersburgo.
Book Of Abstracts. So Petersburgo: St. Petersburg State University, 2008. v.1. p.27 - 27
Keywords: Nuclear Magnetic Resonance, Antimicrobial Peptide, Phyllomedusa distincta
Knowledge areas : Structure, Conformation and Stereochemistry,Spectroscopy,Proteins
Additional references : Rssia/English. Meio de divulgao: Impresso

Presentations in Events

1. MUNHOZ, V. H. O., DE PAULA, S. F. C., RESENDE, J. M., PIL-VELOSO, D.,

BECHINGER, B.
Structural and Orientational Determination of the Antimicrobial Peptide Hylaseptin P2 in
Membrane-Mimicking Environment, 2011. (Presentation,Presentations in Events)
Keywords: Antimicrobial Peptide, Solid State NMR Spectroscopy
Additional references : Brasil/Portuguese. Meio de divulgao: Impresso; Local: Hotel do Frade; Cidade: Angra dos
Reis; Evento: 13th Nuclear Magnetic Resonance Users Meeting; Inst.promotora/financiadora: AUREMN

2. MUNHOZ, V. H. O., MAGALHAES, M. T. Q., VERLY, R. M, DE PAULA, S. F. C.,

AISENBERY, C., RESENDE, J. M., BECHINGER, B., PIL-VELOSO, D., BLOCH JR, C.
Structural and Orientational Determination of the Antimicrobial Peptide Phenylseptin in
Membrane-Mimicking Environment, 2011. (Congress,Presentations in Events)
Keywords: Antimicrobial Peptide, Nuclear Magnetic Resonance, Solid State NMR Spectroscopy
Knowledge areas : Proteins,Structure, Conformation and Stereochemistry
Additional references : Brasil/Portuguese; Local: Hotel do Frade; Cidade: Angra dos Reis; Evento: 13th Nuclear
Magnetic Resonance Users Meeting; Inst.promotora/financiadora: AUREMN

3. MUNHOZ, V. H. O., MAGALHAES, M. T. Q., VERLY, R. M, DE PAULA, S. F. C., RESENDE,

J. M., AISENBERY, C., PIL-VELOSO, D., BLOCH JR, C., BECHINGER, B.
Structural and Orientational Study of Peptide Phenylseptin in Micellar Environment, 2011.
(Presentation,Presentations in Events)
Additional references : China/English; Cidade: Beijing; Evento: 12th International Congress on Amino Acids, Peptides
and Proteins; Inst.promotora/financiadora: Amino Acids

4. MUNHOZ, V. H. O., ASSUNCAO, B. A., DE PAULA, S. F. C., RESENDE, J. M., PIL-

VELOSO, D., BECHINGER, B.
Topological Determination of the Antimicrobial Peptide Hylaseptin P2 in Oriented

B1
Bilayers, 2011. (Presentation,Presentations in Events)
Additional references : China/English. Meio de divulgao: Impresso; Cidade: Beijing; Evento: 12th International
Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins; Inst.promotora/financiadora: Amino Acids

5. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, RESENDE, J. M., ALMEIDA, F. C. L., PIL-VELOSO, D.

Structural Determination by NMR of the Antimicrobial Peptide Distinctin, 2009.
(Congress,Presentations in Events)
Keywords: Phyllomedusa distincta, Antimicrobial Peptide, Nuclear Magnetic Resonance
Knowledge areas : Proteins,Spectroscopy,Structure, Conformation and Stereochemistry
Additional references : Brasil/English; Local: Hotel do Frade; Cidade: Angra dos Reis, RJ; Evento: 12th NMR USERS
MEETING-3rd IBEROAMERICAN NMR MEETING; Inst.promotora/financiadora: AUREMN

6. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, Bemquerer, M. P., Pil-Veloso, D.

Sntese em fase slida e caracterizao da Distinctina, peptdeo antimicrobiano isolado
de Phyllomedusa distincta, 2008. (Congress,Presentations in Events)
Keywords: Sntese de Peptdeos em Fase slida, Peptdeos Antimicrobianos, Phyllomedusa distincta
Knowledge areas : Organic Synthesis,Cromatografia
Additional references : Brasil/Portuguese. Meio de divulgao: Impresso; Local: Hotel Monte Real Resort; Cidade:
guas de Lindia; Evento: XXXI Reunio Anual da SBQ; Inst.promotora/financiadora: Sociedade Brasileira de Qumica

7. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, Pil-Veloso, D., Alcntara, A. F. C.

STRUCTURAL DETERMINATION BY NMR SPECTROSCOPY AND CONFORMATIONAL
ANALYSIS OF CHAIN 2 OF PHYLLOMEDUSA DISTINCTA AN ANTIMICROBIAL PEPTIDE
FROM PHYLLOMEDUSA DISTINCTA ANURANS, 2008. (Congress,Presentations in Events)
Keywords: Nuclear Magnetic Resonance, Antimicrobial Peptide, Phyllomedusa distincta
Knowledge areas : Structure, Conformation and Stereochemistry,Spectroscopy,Proteins
Additional references : Rssia/English. Meio de divulgao: Impresso; Local: St. Petersburg State University; Cidade:
So Petersburgo; Evento: EUROMAR Magnetic Resonance Conference; Inst.promotora/financiadora: EUROMAR

8. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, Pil-Veloso, D., Alcntara, A. F. C.

STRUCTURAL DETERMINATION BY NMR SPECTROSCOPY AND CONFORMATIONAL
ANPHYLLOMEDUSA DISTINCTA ANURANS.ALYSIS OF CHAIN 1 OF DISTINCTIN, AN
ANTIMICROBIAL PEPTIDE FROM PHYLLOMEDUSA DISTINCTA ANURANS, 2008.
(Congress,Presentations in Events)
Keywords: Nuclear Magnetic Resonance, Antimicrobial Peptide, Conformational Analysis
Knowledge areas : Structure, Conformation and Stereochemistry,Proteins,Spectroscopy
Additional references : Brasil/Portuguese. Meio de divulgao: Impresso; Local: St. Petersburg State University; Cidade:
So Petersburgo; Evento: EUROMAR Magnetic Resonance Conference; Inst.promotora/financiadora: AMPERE,

B2
 Anexo C
Artigos Publicados e Submetidos
Artigos Publicados

Georgescu, J.; Munhoz, V. H. O., Bechinger, B. NMR Structures of the Histidine-Rich Peptide
LAH4 in Micellar Environments: Membrane Insertion, pH-Dependent Mode of Antimicrobial
Action, and DNA Transfection. Biophys. J. (2010) 99, 2507-2515

Resende, J. M., Moraes, C. M., Munhoz, V. H. O., Aisenbrey, C., Verly, R. M., Bertani, P., Cesar,
A., Pil-Veloso, D., Bechinger, B. Membrane structure and conformational changes of the
antibiotic heterodimeric peptide distinctin by solid-state NMR spectroscopy. Proc. Natl. Ac. Sci.
(2009), 106, 16639-16644.

Artigos Submetidos

de Magalhes, M. T, Verly, R. M., Munhoz, V. H. O., Prates, M. V., de Arajo, I. E., Bloch Jr., C.
Phenylseptins: D- and L-amino acid Containing Peptides that Combine Aversive Gustatory
Properties with Antimicrobial Activities Isolated from the Skin Secretion of Hipsyboas punctatus.
(artigo submetido).

C1