Ciclo Do Azoto

Cristina Maria Teixeira Milito
ESTUDO DO CICLO DO AZOTO

UMA APLICAO PARA O ENSINO
FACULDADE DE CINCIAS
UNIVERSIDADE DO PORTO
Departamento de Botnica
Faculdade de Cincias da Universidade do Porto
Porto - 2004

FACULDADE DF. CINCIAS

i,NIVER5ID*0[ DO PORTO
Porto - 2004

Dissertao de Mestrado em Biologia para o Ensino

submetida Faculdade de Cincias da Universidade do Porto
Porto - 2004
AGRADECIMENTOS
Ao concluir este trabalho, no podia deixar de agradecer a todos aqueles que, de uma
ou outra forma, contriburam para a sua elaborao:
Prof. Dra. Ana Maria Parente Delgado, pela orientao deste trabalho, pela disponibilidade
e incentivo.
Ao Prof. Dr. Antnio Gil Pereira de Castro, pela co-orientao deste trabalho.
Aos amigos, pela disponibilidade e apoio.
Aos meus Pais, pelo apoio, compreenso e confiana sempre presentes ao longo da minha
vida. Sem eles, nada seria possvel.
Ao Ricardo, por tudo.

RESUMO
ii
RESUMO
O ciclo do azoto desempenha um papel fondamental na manuteno do equilbrio da

biosfera. O azoto molecular o gs mais abundante na atmosfera terrestre, porm, as formas
combinadas de azoto so relativamente escassas no solo e na gua. O azoto um constituinte
importante de protenas, cidos nucleicos e coenzimas. Poucos seres vivos, no entanto, podem
usar o azoto atmosfrico directamente como fonte de azoto. Assim, a disponibilidade dos
compostos azotados nos ecossistemas est largamente dependente das actividades metablicas
dos microrganismos que realizam as transformaes cclicas do azoto, permitindo a sua
reciclagem no ambiente. Este ciclo reveste-se assim de um enorme interesse, dada a sua
importncia na manuteno da qualidade de vida do nosso planeta. Ao longo dos anos, o ciclo
do azoto tem vindo a sofrer diversas alteraes em consequncia das actividades humanas.
Uma vez que os compostos azotados so essenciais para os seres vivos e a sua disponibilidade
fundamental para o funcionamento dos ecossistemas, o impacto humano representa um srio
perigo. A sociedade tem de ser sensibilizada para este problema, o que passa obrigatoriamente
pela compreenso da importncia do ciclo do azoto. Esta aco de sensibilizao deve ter
como parceiro privilegiado a escola. A escola pode promover em toda a comunidade escolar a
compreenso da intensa actividade dos ecossistemas e dos diversos processos que contribuem
para o seu equilbrio dinmico.
No presente trabalho, foram aprofundados os conhecimentos acerca das actividades

desenvolvidas pelos microrganismos nos principais processos que definem o ciclo do azoto,
nomeadamente, a fixao do azoto atmosfrico, a amonificao, a nitrificao, a
desnitrificao e a oxidao anaerbia do amonaco. Microrganismos responsveis por vrios
destes processos foram isolados ou detectados em amostras adequadas. Um especial relevo foi
dado ao estudo da oxidao anaerbia do amonaco, bem como aos microrganismos
responsveis por este processo, que se sabe pertencerem aos Planctomycetes. A tcnica de
hibridizao in situ com fluorescncia (FISH), utilizando uma sonda oligonucleotdica
especfica, permitiu a deteco de Planctomycetes na comunidade microbiana presente nas
amostras de lamas primrias provenientes de uma Estao de Tratamento de guas Residuais.
Rhizobium sp., bactria responsvel pela fixao simbitica do azoto atmosfrico foi isolada a
partir de ndulos radiculares de Ornithopus pinnatus, uma planta leguminosa vulgarmente
designada por serradela-delgada. Nitrosomonas sp. e Nitrobacter sp., bactrias nitrificantes
responsveis, respectivamente, pela oxidao do amonaco e do nitrito, foram isoladas a partir
iii
de amostras de solo, utilizando meios selectivos. O sistema de identificao API 20E permitiu
identificar, a partir de amostras de solo, diversas bactrias envolvidas na reduo
desassimilatria do nitrato, nomeadamente Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter,
Pasteurella e Moraxella, com capacidade de reduzir o nitrato a azoto molecular
(desnitrificao), Serratia e Escherichia coli, com capacidade de reduzir o nitrato a nitrito e
Enterobacter, que realiza a amonificao do nitrito.
Os resultados deste estudo, incluindo a parte terica e experimental, foram usados para
desenvolver uma proposta de aplicao em processos de ensino-aprendizagem, segundo as
orientaes curriculares para o 3Ciclo do Ensino Bsico e Secundrio. Deste modo, foi
elaborada uma proposta de aplicao, sob a forma de uma planificao a mdio prazo do
processo de ensino-aprendizagem, que procurou englobar diversos aspectos relevantes do
ciclo do azoto, salientando as actividades desenvolvidas pelos microrganismos e a sua
importncia no equilbrio dos ecossistemas.
iv
ABSTRACT
V
ABSTRACT
The nitrogen cycle plays an important role in the maintenance of the balance of the
biosphere. Molecular nitrogen is one of the most abundant gases in the earth atmosphere;
however, the combined forms of nitrogen are relatively scarce in the soil and water. Nitrogen
is an important component of proteins, nucleic acids and many coenzymes. However, very
few living organisms can directly use atmospheric nitrogen as a nitrogen source. Therefore,
the availability of nitrogenous compounds in the ecosystems is widely dependent on the
metabolic activities of microorganisms involved in the nitrogen cyclic. The understanding of
the nitrogen cycle is of main interest, given its importance in the maintenance of the life
quality in our planet. Since the nitrogenous compounds are essential for the living organisms
and their availability is fundamental for the functioning of the ecosystems, the human impact
represents a serious danger. In fact, the nitrogen cycle has been suffering several alterations
associated with human activities. Thus, a sustained development promoting the balance of the
ecosystems is required. Human beings should be familiar with this problem, and understand
the importance of the nitrogen cycle. This action should have the school as a privileged
partner. The school can promote in the whole school community the understanding of the
intense activity of the ecosystems and of all the processes that contribute to its dynamic
balance.
In the present work, we expanded our knowledge concerning the activities of
microorganisms in the main processes that define the nitrogen cycle: namely the fixation of
atmospheric nitrogen, the ammonification, the nitrification, the denitrification and the
anaerobic ammonium oxidation. Microorganisms responsible for several of these processes
had been isolated or detected in appropriated samples. The anaerobic ammonium oxidation
has had a special highlight, as well as microorganisms responsible for it, belonging to
Planctomycetes. The fluorescence in situ hybridization (FISH) with specific oligonucleotide
probe, allowed the detection of Planctomycetes among the bacterial community in samples of
activated sludge from a wastewater treatment plant. Rhizobium sp., a symbiotic
nitrogen-fixing bacterium, was isolated from root nodules of Ornithopus pinnatus.
Nitrosomonas sp. and Nitrobacter sp., nitrifying bacteria, respectively, responsible for the
ammonium and nitrite oxidation, were isolated from soil samples, using selective culture
media. The identification system API 20E allowed the identification, from soil suspensions,
of several bacteria involved in the dissimilatory nitrate reduction, namely Pseudomonas,
Flavobacterium, Achromobacter, Pasteurella and Moraxella, which reduce nitrate to
vi
molecular nitrogen (denitrifcation), Serratia and Escherichia coli, which reduces nitrate to
nitrite and Enterobacter, which carry out the nitrite ammonification.
The results of this study, including the theorical and experimental components, had
been used to develop a proposal for the teaching-learning processes, according the curricular
guiding for the "3 Ciclo do Ensino Bsico e Secundrio". In summary, we develop a proposal
of a teaching-learning process, including several relevant aspects concerning the nitrogen
cycle, the activities developed by microorganisms and its importance to the balance of the
ecosystems that should be implemented in the teaching core curriculum.
vii
RSUM
viii
RSUM
Le cycle de l'azote joue un rle essentiel dans la manutention du quilibre de la

biosphre. L'azote molculaire est un des majeurs composs gazeux dans l'atmosphre
terrestre; cependant, les formes combines d'azote sont relativement rares dans le sol et eau.
L'azote est un composant important de protines, acides nucliques et beaucoup de
coenzymes. Cependant, trs peu d'tres vivants peuvent utiliser directement de l'azote
atmosphrique comme une source de l'azote. Par consquent, la disponibilit de composs
azots dans les cosystmes est largement dpendante sur les activits mtaboliques de
micro-organismes que ralisent les transformations cycliques de l'azote et que permet son
recyclage dans l'environnement. La comprhension du cycle de l'azote est de grand intrt,
donn son importance dans la manutention de la qualit de la vie dans notre plante. Le cycle
de l'azote a souffert des plusieurs modifications associes avec les activits humaines. Comme
les composs azots sont essentiels pour les organismes et leur disponibilit est fondamentale
pour le fonctionner des cosystmes, l'impact humain reprsente un danger srieux. Donc, un
dveloppement soutenu qui encourage la balance des cosystmes est exig. La socit devrai
tre familier avec ce problme et comprend l'importance du cycle de l'azote. Cette action
devrait avoir l'cole comme un partenaire privilgi. L'cole peut encourager dans la entire
communaut scolaire la comprhension de l'intense activit des cosystmes et de tous les
processus qui contribuent sa balance dynamique.
Dans le prsent travail, nous avons approfondi notre connaissance propos des
activits de micro-organismes dans les principaux processus qui dfinissent le cycle de
l'azote: savoir la fixation d'azote atmosphrique, l'ammonification, la nitrification, la
dnitrification et l'oxydation anarobie de l'ammoniac. Micro-organismes responsable pour
plusieurs de ces processus avait t isol ou t dtect dans les chantillons appropris. Un
spcial relief a t donn l'tude de l'oxydation anarobie de l'ammoniac, ainsi qu'aux
micro-organismes responsable pour lui, que se sait appartenir au Planctomycetes. La
technique de hybridation in situ fluorescence (FISH) avec sonde oligonucleotide spcifique
a permis la dtection des Planctomycetes dans la communaut bactrienne des chantillons de
boues actives d'une installation de traitement des eaux rsiduelles. Rhizobium sp., une
bactrie que fixe d'azote atmosphrique en symbiose, a t isol de nodosits racinaires de
Ornithopus pinnatus. Nitrosomonas sp. et Nitrobacter sp., bactries nitrifiant responsable,
respectivement, pour l'oxydation de l'ammoniac et du nitrite, ont t isols d'chantillons du
sol, en utilisant des moyens de la culture slectifs. Le systme de l'identification API 20E a
ix
permis l'identification de plusieurs bactries impliques dans la rduction dissimilative du
nitrate, savoir Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Pasteurella et Moraxella,
qui rduit le nitrate en azote molculaire (dnitrification), Serratia et Escherichia coli, qui
rduisent le nitrate en nitrite et Enterobacter, qui ralise l'ammonification du nitrite.
Les rsultats de cette tude, compris les composants theorical et exprimentaux,
avaient t utiliss pour dvelopper une proposition d'application pour processus de
l'enseignement- apprentissage, en accordant le guider scolaire pour "3 Ciclo do Ensino
Bsico e Secundrio". Dans rsum, nous dveloppons une planification d'un processus de
l'enseignement- apprentissage, y compris plusieurs aspects pertinents propos du cycle de
l'azote, les activits dveloppes par micro-organismes et son importance dans l'quilibre des
cosystmes qui devraient tre rendus effectif dans le programme scolaire.
x
NDICE
xi
NDICE
1. INTRODUO 1
1.1. Os desafios da Educao 3
1.2. Cincia e Educao 4
1.3. Importncia do ciclo do azoto e do seu estudo 8
1.4. Enquadramento educativo do tema nas orientaes curriculares do Ensino
Bsico (3 o Ciclo) e do Ensino Secundrio 9
1.5. Objectivos 11
2. O CICLO DO AZOTO 12
2.1. Fixao do azoto atmosfrico 14
2.1.1. Sistema enzimtico nitrogenase 17
2.1.2. Desenvolvimento da simbiose Rhizobium - plantas leguminosas 21
2.1.3. Fixao simbitica do azoto atmosfrico 25
2.2. Amonificao 26
2.3. Nitrificao 27
2.3.1. Bactrias nitrificantes 31
2.4. Reduo assimilatria e desassimilatria do nitrato. Desnitrificao 32
2.5. Oxidao anaerbia do amonaco 36
3. ALTERAES ANTROPOGNICAS N O CICLO D O AZOTO - CAUSAS E

CONSEQUNCIAS 43
3.1. Impacto humano na fixao do azoto 44
3.2. Impacto na atmosfera 45
3.3. Impacto nos ecossistemas terrestres 47
3.4. Impacto nos ecossistemas aquticos 48
3.5. Necessidade de um desenvolvimento sustentvel 49
4. MATERIAL E MTODOS 51
4.1. Deteco de Planctomycetes 52
4.1.1. Fixao das amostras 52
4.1.2. Imobilizao em lminas 52
xii
4.1.3. Sonda oligonucleotdica e corantes utilizados 53
4.1.4. Hibridizao in situ com fluorescncia (FISH) 53
4.1.5. Colorao com DAPI 54
4.1.6. Microscopia 54
4.2. Isolamento de Rhizobium sp 54
4.2.1. Obteno de culturas puras de Rhizobium sp 54
4.2.2. Colorao de Gram 55
4.3. Isolamento de bactrias nitrificantes 56
4.3.1. Obteno de culturas puras de bactrias nitrificantes 56
4.4. Isolamento de bactrias com capacidade de reduzir o nitrato 57
4.4.1. Identificao de microrganismos com o sistema API 20E 57
5. RESULTADOS E DISCUSSO 59
5.1. Deteco de Planctomycetes 60
5.2. Isolamento de Rhizobium sp 63
5.3. Isolamento de bactrias nitrificantes 64
5.4. Isolamento de bactrias com capacidade de reduzir o nitrato 65
6. APLICAO NO PROCESSO DE ENSINO-APRENDIZAGEM 72
6.1. Uma aplicao para o ensino 79
7. CONCLUSO 81
8. BIBLIOGRAFIA 83
xiii
1. INTRODUO
ESTUDO DO CICLO DO AZOTO. UMA APLICAO PARA O ENSINO. 1

INTRODUO
1. INTRODUO
Actualmente o ensino das Cincias visa a compreenso da Cincia e da Tecnologia,

das suas inter-relaes, das suas implicaes na sociedade e, ainda, do modo como os
conhecimentos sociais se repercutem nos objectos de estudo da Cincia. A Educao em
Cincia, para alm da aprendizagem de um conjunto de conhecimentos e de processos
cientficos, preocupa-se tambm em garantir que tais aprendizagens se tornem teis no
dia-a-dia, numa perspectiva de aco, no sentido de contriburem para o desenvolvimento
pessoal e social dos indivduos, num contexto de sociedades tecnologicamente desenvolvidas
que se querem abertas e democrticas. Trata-se de facto de valorizar objectivos educacionais e
no objectivos instrucionais. Assim, cada vez maior o apelo abordagem de
situaes-problema que possam permitir a construo slida de conhecimentos e a reflexo
sobre os processos da Cincia e da Tecnologia, bem como as suas inter-relaes com a
Sociedade e o Ambiente. Este tipo de abordagem pretende facultar uma aprendizagem nos
domnios cientfico e tecnolgico que possibilite uma melhor informao para decidir e agir
responsavelmente. Na verdade, trata-se de desmistificar a Cincia, ajudando o aluno a
compreender os percursos da construo do conhecimento cientfico, bem como das suas
mltiplas facetas. O aluno colocado numa situao de cidado activo que tem de
desempenhar papis e partilhar responsabilidades com os seus pares. Trata-se de olhar a
educao cientfica no s em Cincia, mas tambm atravs da Cincia e sobre a Cincia,
como promotora de culturas cientficas, mais humanizada, mas tambm mais prxima da
sociedade futura, num mundo tecnologicamente avanado e alfabetizado cientificamente.
Tudo isto exige necessariamente uma grande segurana do professor, no que respeita aos
contedos cientficos envolvidos, para ser capaz de descodificar as respostas dos alunos,
detectar obstculos, ajudar a mudar, enfim, para estar disponvel, o que justifica perfeitamente
um necessrio investimento na sua formao contnua.
A temtica do ciclo do azoto, objecto de estudo deste trabalho, torna possveis todos
estes aspectos, permitindo abordagens inseridas no movimento
Cincia-Tecnologia-Sociedade-Ambiente, quer pelos contedos pertinentes, nomeadamente
os desenvolvimentos mais recentes da Cincia, quer pelo pluralismo metodolgico que
possibilita, nomeadamente a componente experimental envolvida, factores importantes para
imprimir realismo ao processo de ensino-aprendizagem, essencial para a motivao dos
alunos. Sendo assim, neste trabalho realizou-se pesquisa no mbito do ciclo do azoto e, a
E S T U D O D O CICLO D O AZOTO. U M A APLICAO PARA O ENSINO. 2

INTRODUO
partir deste estudo, procedeu-se elaborao de uma proposta de aplicao em processos de

ensino-aprendizagem, de acordo com as orientaes curriculares vigentes.
1.1. Os desafios da Educao
No despontar de um novo sculo, a educao considerada como um instrumento

indispensvel humanidade para que esta possa alcanar os to desejados ideais de paz,
liberdade e justia social. A educao desempenha um papel fundamental no desenvolvimento
contnuo das pessoas e das comunidades e deve ser encarada como uma via primordial para
que esse desenvolvimento seja pleno e autntico, de modo a fazer excluir a pobreza, a
injustia social, as opresses e as guerras. A educao deve, atravs do conhecimento, da
experincia e da construo duma cultura pessoal, ensinar a viver melhor e tem como misso
permitir que todos os indivduos, sem excepo, desenvolvam os seus talentos e
potencialidades criativas, de modo a que cada um seja capaz de se responsabilizar por si
mesmo e pela realizao do seu projecto pessoal. As polticas educativas devem ter como
principais objectivos no s um permanente enriquecimento dos conhecimentos e da
capacidade tcnica, mas principalmente uma estruturao slida da pessoa e das relaes entre
indivduos, entre grupos e entre naes. S desse modo podero contribuir para um
desenvolvimento humano sustentvel, para a compreenso mtua entre os povos, ou seja, para
a construo de um mundo melhor (Delors et ai, 1998).
Apesar dos sistemas educativos formais darem prioridade aquisio de
conhecimentos em detrimento de outras formas de aprendizagem, a educao deve ser olhada
como um todo. Nessa concepo, as reformas educativas devem procurar inspirao e
orientao, tanto para a elaborao dos programas, como para a definio de novas polticas
pedaggicas.
A educao deve organizar-se volta de quatro pilares fundamentais: aprender a
conhecer, em que se procura associar a uma vasta cultura geral a possibilidade de aprofundar
os conhecimentos num pequeno nmero de matrias; aprender afazer, a fim de se adquirir
no s qualificao profissional, mas uma competncia mais ampla que permita ao indivduo
enfrentar um grande nmero de situaes e que facilite o trabalho em equipa; aprender a viver
em comunidade, a fim de se desenvolver a compreenso pelo outro e a percepo de formas
de interdependncia, respeitando os valores do pluralismo, compreenso mtua e paz;

INTRODUO
aprender a ser para um bom desenvolvimento da prpria personalidade, capacidade de

autonomia, avaliao e responsabilidade pessoal. Cada vez mais os instrumentos de
aprendizagem e os contedos educativos devem possibilitar um melhor desenvolvimento de
competncias que permitam uma melhor qualidade de vida, capacidade de avaliao e tomada
de decises, tendo em conta o acesso a dimenses to importantes da educao como a
tico-cultural, cientfico-tecnolgica e a econmico-social. Por outras palavras, o direito e o
dever de educao exprimem-se por uma efectiva aco formativa, destinada a promover o
desenvolvimento da personalidade e valorizao individual, a igualdade de oportunidades, a
superao das desigualdades e o progresso social, com vista consolidao de uma vivncia
colectiva livre, responsvel e democrtica. A educao deve promover o desenvolvimento do
esprito democrtico e pluralista, formando cidados capazes de julgarem, com esprito crtico
e criativo, a sociedade em que se integram e de se empenharem activamente no seu
desenvolvimento, em termos mais justos e sustentveis. A educao cabe fornecer a
cartografia de um mundo complexo e constantemente agitado e, simultaneamente, a bssola
que permita navegar atravs dele.
1.2. Cincia e Educao
O ensino da Cincia est freqentemente centralizado nos produtos da Cincia,

enfatizando a informao de factos. Trata-se de uma viso empirista da Cincia - a Cincia
pronta - em que esta considerada um processo de recolha de informao acerca dos
fenmenos, elaborando-se leis e teorias, perenes e infalveis. Assim, feita ao aluno uma
descrio desse conhecimento, como um produto, sem ter em conta os processos subjacentes
sua elaborao, por vezes complexos e sinuosos. Esta viso de Cincia irrealista e est
completamente ultrapassada, sendo necessrio pr em prtica uma viso racionalista,
construtivista e externalista de Cincia, de modo a reverter a insatisfao geral e ensinar
Cincia como uma actividade slida e realista de resoluo de problemas (Cachapuz, 1992).
A viso da Cincia em construo enfatiza o processo de pesquisa, apresentando os
problemas com que os cientistas se debateram e o modo como os resolveram, explicando o
processo de resoluo, um percurso no linear e nada mstico, mas sim marcado pela inveno
e criatividade. Qualquer contexto social, cultural ou poltico influencia o rumo da
investigao cientfica. Sendo assim, o ensino da Cincia, especialmente da Biologia, no
deve ficar confinado ao produtofinal.No se transmite a verdadeira essncia cientfica de um
E S T U D O D O CICLO DO AZOTO. U M A APLICAO PARA o ENSINO. 4

INTRODUO
modo exclusivamente terico e livresco, enfatizando a memorizao. O ensino da Cincia

deve reflectir o seu carcter construtivo e dinmico. A investigao cientfica implica a
resoluo de problemas e o mesmo deve verificar-se no ensino da Cincia. Assim, o aluno
no deve ser um mero receptor de informao, mas antes ter um papel activo e construir o seu
conhecimento, tal como os cientistas construram o conhecimento cientfico. O aluno deve ser
envolvido nos processos da Cincia, isto , deve colocar questes, pesquisar, recolher dados,
colocar hipteses e reiniciar o processo sempre que necessrio. A educao em Biologia s
est completa quando envolve uma experincia em primeira mo com produo e aplicao
de conhecimentos cientficos (Chalmers, 2000). A resoluo de problemas realistas facilita a
compreenso de conceitos que de outra forma se tornam vagos e abstractos. Os alunos passam
a percepcionar os contedos como meios necessrios ao pensamento. Trata-se de mudar
atitudes, de envolver cognitiva e afectivamente os alunos, sem condues muito marcadas
pelo professor, garantindo que a aprendizagem se tomar til no dia-a-dia numa perspectiva
de aco. Esta metodologia coloca assim a nfase na compreenso, quer de ideias cientficas,
quer de mtodos de trabalho. A par da aprendizagem de conceitos, estimula-se assim o
desenvolvimento do pensamento, de capacidades de raciocnio e de competncias de
comunicao verbal. Segundo esta pedagogia, s existe uma forma do aluno aprender
Cincia: experimentando a natureza da construo do conhecimento cientfico. A abordagem
de situaes-problema do quotidiano permite reflectir sobre os processos da Cincia e da
Tecnologia, bem como as suas inter-relaes com a Sociedade e o Ambiente. As experincias
de ensino Cincia-Tecnologia-Sociedade-Ambiente mostram ser esta uma via promissora em
termos de maior motivao e melhor preparao dos alunos para darem uma resposta mais
adequada aos problemas cientfico-tecnolgicos do mundo contemporneo (Cachapuz et ai,
2001).
A sociedade de informao hoje instalada gera uma imensa corrente de informao

que exige uma contnua consolidao e actualizao de conhecimentos e apela compreenso
da Cincia. Deve promover-se o desenvolvimento de competncias socio-cognitivas e de
pesquisa de informao que permitam que o aluno se torne um elemento activo da sociedade,
capaz de gerir a informao que recebe, capaz de tomar decises e conduzir o seu destino num
mundo onde a mudana cada vez mais rpida. A literacia cientfica fundamental para o
exerccio pleno da cidadania. A escola deve formar para a sociedade do conhecimento. A
cultura geral que todos devem desenvolver pressupe a aquisio de um certo nmero de
conhecimentos e a apropriao de um conjunto de processos fundamentais enquadrados por
uma perspectiva que coloca em primeiro plano o desenvolvimento de capacidades de

INTRODUO
pensamento e de atitudes favorveis aprendizagem. A clarificao de competncias

sustenta-se num conjunto de valores e de princpios necessrios qualidade de vida pessoal e
social de todos os cidados como a construo e a tomada de conscincia da identidade
pessoal e social; a participao na vida cvica de forma livre, responsvel, solidria e crtica; o
respeito e a valorizao da diversidade dos indivduos e dos grupos quanto s suas opes e
pertenas; a valorizao de diferentes formas de conhecimento, comunicao e expresso; o
desenvolvimento do sentido de apreciao esttica do mundo; o desenvolvimento da
curiosidade intelectual, do gosto pelo saber, pelo trabalho e pelo estudo e a valorizao das
dimenses relacionais da aprendizagem e dos princpios ticos que regulam o relacionamento
com o saber e com os outros (Cachapuz et ai, 2001).
Esta nova perspectiva de ensino, centrada numa concepo epistemolgica marcada

pela Nova Filosofia da Cincia, valoriza assim metodologias de trabalho activas, de
co-responsabilizao, de participao e empenhamento, o trabalho inter-pares e de partilha.
Preconiza-se o desenvolvimento de competncias em diversos domnios, como o
conhecimento, raciocnio, comunicao e atitudes. Segundo a perspectiva proposta, estas
competncias so desenvolvidas, quer pela anlise e discusso de situaes problemticas,
quer pelo trabalho em equipa, pela anlise e debate de descobertas cientficas,
evidenciando-se os xitos e fracassos e a influncia da sociedade, quer pela resoluo de
problemas, tratamento de dados, planeamento de abordagens de trabalho, quer pela vivncia
de situaes que desenvolvam capacidades de exposio de ideias, argumentao, partilha de
informao, curiosidade, seriedade no trabalho, reflexo crtica e avaliao do mesmo
(Cachapuz et ai, 2001).
A Educao para os Valores em Cincia constitui um aspecto fundamental da nova
perspectiva proposta. Trata-se de humanizar a Cincia e a Tecnologia. O professor tem de
utilizar materiais que permitam fomentar a discusso e equacionar questes filosficas,
existenciais, ticas ou culturais capazes de mostrar aos alunos que as questes da sociedade
lhes dizem respeito. A discusso em torno de questes desta ndole ajuda a fortalecer laos de
solidariedade entre os alunos, na busca de respostas comuns, ajuda a ver que nem todos
pensam da mesma forma, em virtude de quadros culturais e sociais diversificados, ajuda a
construir uma democracia mais participada, finalidade essencial da Escola numa sociedade
propensa ao alheamento. Trata-se de ajudar os alunos a transformar a informao em
conhecimento. Trata-se de mudar e reestruturar atitudes e comportamentos. talvez o
principal desafio desta perspectiva de ensino por pesquisa que procura metodologias para uma
aco tolerante, ldica, mas exigente e de rigor (Cachapuz et ai, 2001).
E S T U D O D O CICLO D O AZOTO. U M A APLICAO PARA o ENSINO. 6

INTRODUO
Cabe ao professor abordar os contedos com base em situaes e problemas do

quotidiano, organizando e promovendo actividades de aprendizagem orientadas para o
questionamento da realidade, a integrao e troca de saberes, valorizando situaes de
interaco e de expresso oral e escrita, apoiando o aluno na descoberta das diversas formas
de organizao da sua aprendizagem. Deve ainda organizar o ensino prevendo a pesquisa,
seleco e tratamento de informao que permita ao aluno fazer escolhas, confrontar pontos
de vista e resolver problemas, desenvolvendo a autonomia, a responsabilizao e a
criatividade.
O professor deve ajudar os alunos a fazer a transio do contexto de turma enquanto
um todo para pequenas equipas de aprendizagem, alm de orientar as equipas medida que
elas trabalham. Num ambiente cooperativo, os alunos desenvolvem o respeito pelos outros e a
apreciao mtua, aprendendo a aceitar pessoas com heranas culturais e condies de
trabalho diferentes. A cooperao desenvolve a comunicao, promovendo a criao de ideias
e a influncia mtua, para que a partir de um pensamento individual seja possvel um
pensamento colectivo. As comunidades encontram-se interdependentes e, como tal,
necessrio um elevado nvel de cooperao entre os indivduos, de modo a construir e manter
a solidez democrtica da sociedade (Arends, 1995).
As Cincias Naturais contribuem de forma particular para o desenvolvimento destas
competncias e atitudes. A mudana tecnolgica acelerada e a globalizao do mercado
exigem indivduos com uma capacidade de aprender ao longo da vida. A Cincia transformou
no s o ambiente natural, mas tambm o modo como pensamos sobre ns prprios e sobre o
mundo. Os processos que utiliza so um valioso contributo para o desenvolvimento do
indivduo. O papel da Cincia e da Tecnologia no nosso dia-a-dia exige uma populao com
conhecimento e compreenso suficientes para entender e seguir debates sobre temas
cientficos e tecnolgicos e envolver-se em questes que estes temas colocam, quer para eles
como indivduos quer para a sociedade como um todo. O ensino em Cincia, atravs da
Cincia e sobre a Cincia assim fundamental.
ESTUDO DO CICLO DO AZOTO. UMA APUCAO PARA o ENSINO. 7

INTRODUO
1.3. Importncia do ciclo do azoto e do seu estudo
O ciclo do azoto desempenha um papel importante na manuteno do equilbrio da

biosfera. Tem sido alvo de investigaes desde o sc. XIX e os conhecimentos obtidos tm
tido diversos interesses, desde a rentabilizao das produes agrcolas at compreenso e
remediao de diversos problemas ambientais, como a poluio hdrica, a destruio da
camada de ozono e o aquecimento global.
O azoto o principal componente da atmosfera terrestre e extremamente importante
para os seres vivos. Enquanto que nos ciclos do oxignio, carbono e hidrognio intervm
microrganismos, plantas e animais, o ciclo do azoto est largamente dependente das
actividades metablicas de microrganismos. Apesar da possibilidade de fixao qumica de
azoto para a produo de fertilizantes, a capacidade de fixao de azoto atmosfrico para a
assimilao em biomassa est restrita quase exclusivamente a um nmero limitado de
microrganismos. So processos microbianos nicos que definem o ciclo do azoto e afectam
directamente a disponibilidade dos diversos compostos azotados nos ecossistemas. Os
microrganismos intervm em todos os processos, permitindo a reciclagem do azoto no
ambiente. Da, o interesse no estudo das actividades desenvolvidas por tais microrganismos,
dada a importncia destes processos na manuteno da qualidade de vida no nosso planeta.
Ao longo dos anos as actividades humanas tm vindo a interferir com o ciclo do azoto.
Uma vez que os compostos azotados so essenciais para os seres vivos e a sua disponibilidade
fundamental para a organizao e funcionamento dos ecossistemas, o impacto humano
representa um srio perigo. As actividades humanas so responsveis pelo aumento global do
azoto e tambm pela crescente mobilidade dos compostos azotados no solo e na gua,
originando em larga escala, consequncias ambientais srias.
Torna-se necessrio sensibilizar cada vez mais a sociedade para a necessidade de um
desenvolvimento sustentvel, em equilbrio com os ecossistemas. A escola deve participar
activamente nesta necessidade, criando hbitos ambientais saudveis que passam
obrigatoriamente pela compreenso da importncia do ciclo do azoto e dos microrganismos a
ele associados. Os alunos devem compreender a intensa actividade dos ecossistemas, onde os
seres nascem e morrem continuamente, onde os fluxos de energia e os ciclos da matria
ocorrem ininterruptamente e vrios fenmenos e processos contribuem para o seu equilbrio
dinmico, do qual transparece uma imutabilidade apenas aparente.

INTRODUO
1.4. Enquadramento educativo do tema nas orientaes curriculares do

Ensino Bsico (3o Ciclo) e do Ensino Secundrio
A anlise da estrutura curricular do Ensino Bsico (3 o Ciclo) e do Ensino Secundrio e

respectivos programas permite constatar que a temtica do ciclo do azoto pode ser abordada
nas disciplinas de Cincias Fsicas e Naturais (3 o Ciclo - Ensino Bsico), Ecologia
(10 ano - Ensino Secundrio) e Biologia (12 ano - Ensino Secundrio).
A rea disciplinar de Cincias Fsicas e Naturais, atravs dos contedos cientficos que
explora, incide em diversos campos do saber. Apela para o desenvolvimento de vrias
competncias, sugerindo ambientes de aprendizagem diversos e pretende contribuir para o
desenvolvimento da literacia cientfica dos alunos. O Currculo Nacional do Ensino Bsico
tem subjacente a ideia estruturante de que Viver melhor no planeta Terra pressupe uma
interveno humana crtica e reflectida, visando um desenvolvimento sustentvel que, tendo
em considerao a interaco cincia, tecnologia, sociedade e ambiente, se fundamente em
opes de ordem social e tica e em conhecimento cientfico esclarecido sobre a dinmica
das relaes sistmicas que caracterizam o mundo natural e sobre a influncia dessas
relaes na sade individual e comunitria (Normas do Ministrio da Educao, 2001). No
fundo, pretende-se alargar os horizontes da aprendizagem, proporcionando aos alunos no s
o acesso aos produtos da Cincia mas tambm aos seus processos, atravs da compreenso
das potencialidades e limites da Cincia e das suas aplicaes tecnolgicas na Sociedade.
Alm disso, pretende-se uma tomada de conscincia quanto ao significado cientfico,
tecnolgico e social da interveno humana na Terra, o que poder constituir uma dimenso
importante em termos de uma desejvel educao para a cidadania.
De acordo com as orientaes curriculares desta rea disciplinar, conclui-se que o
investimento no estudo do ciclo do azoto pode efectuar-se ao nvel dos temas organizadores
Sustentabilidade na Terra e Viver melhor na Terra.
No tema Sustentabilidade na Terra, os alunos devem tomar conscincia da
importncia de actuar ao nvel do sistema Terra, de forma a no provocar desequilbrios,
contribuindo para uma gesto regrada dos recursos existentes. O ciclo do azoto enquadra-se
no sub-tema Ecossistemas (Interaces seres vivos-ambiente/Fluxo de energia e ciclo de
matria), podendo ser tambm focado nos sub-temas Perturbaes no equilbrio dos
ecossistemas e Gesto sustentvel dos recursos.

INTRODUO
O tema Viver melhor na Terra visa a compreenso de que a qualidade de vida implica
sade e segurana numa perspectiva individual e colectiva. A biotecnologia, rea relevante na
sociedade cientfica e tecnolgica em que vivemos, ser um conhecimento essencial para a
qualidade de vida. O ciclo do azoto ou qualquer das suas vertentes pode ser abordado como
problemtica na realizao de projectos inseridos no sub-tema Cincia e Tecnologia e
qualidade de vida.
O Ensino Secundrio compromete-se com o aumento da qualidade das aprendizagens,
no respeito pela pluralidade e equilbrio dos seus fundamentos. Valoriza-se a aquisio de
conhecimentos, o desenvolvimento das competncias vocacionais, a capacidade de pensar
cientificamente os problemas, a interiorizao de uma cultura de participao e
responsabilidade, a plena conscincia das opes que potenciam a liberdade e o
desenvolvimento dos alunos como indivduos e como cidados. Deve proporcionar-se o
desenvolvimento de projectos educativos e curriculares diversificados, de forma a encontrar
solues educativas ajustadas s aspiraes e perfis de competncias dos alunos (Normas do
Ministrio da Educao, 2003).
A disciplina de Ecologia insere-se na componente de formao cientfico-tecnolgica
do Curso Tecnolgico de Ordenamento do Territrio e Ambiente. Ao longo do programa,
verifica-se a preocupao de conduzir consciencializao das consequncias das aces do
homem sobre o ambiente e o desenvolvimento de uma atitude crtica. Num contexto de
rpidas mudanas econmicas, sociais e culturais, em que a globalizao disso uma
consequncia, tem vindo a tornar-se cada vez mais premente a adopo de uma viso de
desenvolvimento sustentvel. Nesta perspectiva, pretende-se garantir que a satisfao das
necessidades das geraes presentes no comprometam o futuro das geraes seguintes,
desenvolvendo uma perspectiva ecolgica promotora do equilbrio natural.
De acordo com o programa da disciplina, conclui-se que a abordagem do ciclo do
azoto pode efectuar-se ao nvel da unidade didctica Estrutura e Funcionamento dos
Ecossistemas.
A disciplina de Biologia constitui uma das opes de formao especfica do Curso
Geral de Cincias Naturais. Considera-se que os propsitos da educao em Biologia devem
ser dirigidos para a educao cientfica dos cidados. Importa que os jovens fiquem
preparados para enfrentar com confiana as questes cientfico-tecnolgicas que a sociedade
lhes coloca, que sejam capazes de ponderar criticamente os argumentos em jogo, de modo a
formularem juzos responsveis e, assim, participarem nos processos de tomada de deciso.
As finalidades do programa de Biologia do 12 ano decorrem das definidas para o prprio
E S T U D O DO CICLO DO AZOTO. U M A APLICAO PARA o ENSINO. 10

INTRODUO
ensino secundrio, da adopo de referenciais de valor relativos a princpios orientadores do

ensino das cincias e, tambm, do papel dos conhecimentos de Biologia no mundo actual.
De acordo com o programa da disciplina, conclui-se que a abordagem do ciclo do
azoto pode efectuar-se ao nvel da unidade didctica Preservar e Recuperar o Meio Ambiente.
1.5. Objectivos
Com o presente trabalho pretendeu-se aprofundar os conhecimentos acerca das

actividades desenvolvidas por microrganismos nos principais processos do ciclo do azoto,
dando especial relevo ao processo de oxidao anaerbia do amonaco. Este processo apenas
foi descoberto nos anos 90 e constitui assim uma recente rea do conhecimento.
Face s questes ambientais que a sociedade enfrenta actualmente e necessidade
cada vez mais urgente de sensibilizao para um desenvolvimento sustentvel, considerou-se
importante aprofundar os conhecimentos acerca das causas e consequncias do impacto
antropognico no ciclo do azoto.
Pretendeu-se tambm detectar a presena de microrganismos do grupo dos
Planctomycetes, onde se incluem os responsveis pela oxidao anaerbia do amonaco,
utilizando a tcnica de hibridizao in situ com fluorescncia, em amostras apropriadas, e
ainda identificar microrganismos responsveis por processos fundamentais do ciclo do azoto,
nomeadamente afixaode azoto atmosfrico, a nitrificao e a desnitrificao.
Dado que este trabalho se insere no Mestrado em Biologia para o Ensino, procurou-se
desenvolver formas de aplicao da pesquisa efectuada em processos de ensino-aprendizagem
que permitam uma melhor compreenso do ciclo do azoto.
Deste modo, pretendeu-se realizar um trabalho numa rea temtica considerada de
interesse para o ensino, aprofundando os conhecimentos e fazendo pesquisa cientfica, e usar
esse estudo como proposta de ensino dentro das orientaes curriculares em vigor.

2. O CICLO DO AZOTO

O CICLO DO AZOTO
2. O CICLO DO AZOTO
O azoto molecular ou dinitrognio (N2) o composto gasoso mais abundante na

atmosfera terrestre, constituindo cerca de 80% da sua composio. Apesar de tal abundncia,
o azoto molecular termodinamicamente muito estvel, no sendo utilizado directamente pela
grande maioria dos organismos como fonte de azoto. Apenas algumas espcies de procariotas
possuem capacidade de fixar o azoto atmosfrico. Os restantes seres vivos dependem da
disponibilidade de formas combinadas deste elemento. O azoto um constituinte essencial de
protenas, cidos nucleicos e muitas coenzimas, de modo que as tranformaes cclicas dos
compostos azotados que definem o ciclo do azoto so de extrema importncia. Os
microrganismos realizam um papel primordial no ciclo do azoto, definido por processos
microbianos nicos que afectam directamente a disponibilidade dos diversos compostos
azotados nos ecossistemas.
Durante muitos anos foram considerados e estudados vrios processos fundamentais
do ciclo do azoto, tais como a fixao do azoto atmosfrico, a amonificao, a nitrificao, a
desnitrificao e as actividades desenvolvidas pelos microrganismos nesses processos. Porm,
s recentemente foi descoberto e descrito um novo processo, designado por oxidao
anaerbia do amonaco, bem como os microrganismos capazes de o realizar.
O azoto atmosfrico pode ser fixado abioticamente por descargas luminosas ou
elctricas, por radiao ultravioleta, por combusto e pela produo industrial de fertilizantes
azotados. Estes processos no biolgicos possuem pouca representatividade na fixao total
do azoto, pois cerca de 90% do azoto fixado biologicamente. A fixao biolgica do azoto
atmosfrico realizada, tanto por bactrias que vivem livremente nos seus habitats, como por
bactrias que estabelecem relaes de simbiose com diversas plantas. Neste processo, o azoto
atmosfrico reduzido a amonaco o qual ento incorporado em compostos orgnicos.
A decomposio microbiana de compostos orgnicos azotados, resultantes do
metabolismo animal, como a ureia e o cido rico, ou da morte dos seres vivos, resulta na
libertao de amonaco. Este processo designa-se amonificao. Parte deste amonaco pode
ser perdido por volatilizao para a atmosfera ou pode, sob a forma de io amnia (NEU*), ser
assimilado por vrios organismos. Em solos neutros e bem drenados, o amonaco que no foi
incorporado em compostos orgnicos pode ser oxidado a nitrato, processo designado
nitrificao. A nitrificao um processo aerbio realizado por um grupo de bactrias,
designadas bactrias nitrificantes, em duas etapas sucessivas, que so respectivamente, a
oxidao do amonaco a nitrito e a oxidao do nitrito a nitrato.

O CICLO DO AZOTO
Algum nitrato produzido por nitrificao, por no ser adsorvido pelas partculas do
solo, pode ser rapidamente removido, no entanto, parte deste nitrato assimilado por plantas,
fungos e muitas bactrias. Neste processo, designado reduo assimilatria do nitrato, o
nitrato reduzido a amonaco e usado para o crescimento.
Em condies de anaerobiose, certas bactrias so capazes de usar o nitrato como
aceitador final de electres. Neste processo de reduo desassimilatria do nitrato, o nitrato
pode ser reduzido a azoto gasoso (N2) e/ou xidos de azoto gasosos (NO, N2O), processo
designado desnitrifcao, que ocorre frequentemente em solos alagados, onde a difuso de
oxignio limitada. Porm, algumas bactrias anaerbias facultativas apenas reduzem o
nitrato a nitrito, o qual pode ento ser convertido em amonaco por outros procariotas. Este
processo designa-se amonificao do nitrito.
Recentemente, um novo processo foi descoberto e designado por oxidao anaerbia
do amonaco (Anaerobic Ammonium Oxidation - "anammox"). Neste processo, o amonaco
oxidado a azoto molecular, sendo o nitrito o aceitador de electres.
So estes processos microbianos nicos que definem o ciclo do azoto e que vo ser em
seguida desenvolvidos com mais pormenor.
2.1. Fixao do azoto atmosfrico
A fixao biolgica do azoto atmosfrico consiste na reduo de azoto molecular (N2)

a amonaco (NH3), o qual convertido numa forma orgnica. Este processo realizado tanto
por bactrias que vivem livremente nos seus habitats, como por bactrias que estabelecem
relaes de simbiose com diversas plantas.
As bactrias fixadoras de azoto de vida livre constituem um grupo diversificado que
inclui anaerbios obrigatrios (Clostridium spp, Desulfovibrio spp e Pseudomonas
aotogenis), anaerbios facultativos (Bacillus asterosporus, Bacillus azophila, Enterobacter e
Klebsiella), aerbios (Azotobacter, Azospirillum, Azomonas inslita, Aerobacter aerogenes,
Derxia gummosa e Beijerinckia) e fototrficos (Chromatium vinosum, Chlorobium
thiosulfatophilum, Rhodomicrobium vannielii e Rhodospirillum rubrum). No entanto, estas
bactrias contribuem apenas para uma pequena poro do azoto fixado
anualmente (Lim, 1998). Algumas destas bactrias como Azotobacter, Azomonas e Derxia so

O CICLO DO AZOTO
comuns em solos e guas com pH neutro ou alcalino, em regies temperadas, enquanto que
outras como Beijerinckia so cido-tolerantes e so consideradas as bactrias fixadoras de
azoto de vida livre predominantes no solo (Atlas, 1997).
A fixao do azoto atmosfrico tambm pode ser realizada por bactrias que
estabelecem relaes de simbiose com plantas leguminosas. E o caso de Rhizobium,
Bradyrhizobium, Allorhizobium, Azorhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium. A fixao
simbitica do azoto realiza-se a taxas duas a trs vezes superiores s taxas de fixao
registadas por bactrias de vida livre. A relao de simbiose estabelecida entre estas bactrias
e as plantas leguminosas muito importante para a manuteno da fertilidade dos solos. As
bactrias penetram a raiz das plantas e induzem a formao de ndulos radiculares (Figura
2.1) aonde ocorre a fixao de azoto atmosfrico (Atlas, 1997).
Figura 2.1: Raiz nodulada de Trifolium subterraneum (adaptado de Madigan et ai, 1997).
Cerca de 90% das plantas leguminosas apresentam capacidade de nodulao, no

entanto, existe uma marcada especificidade entre as espcies de plantas leguminosas e as
espcies bacterianas. Vrias espcies de Rhizobium so capazes de estabelecer simbioses com
legumes (Tabela 2.1). O grupo de espcies de Rhizobium com capacidade de infectar um
grupo de legumes relacionados designado grupo de inoculao cruzada. Esta especificidade
determinada por um conjunto de genes bacterianos, designados genes nod.
ESTUDO DO CICLO DO AZOTO. UMA APUCAO PARA O ENSINO. 15

O CICLO DO AZOTO
Tabela 2.1: Exemplos de diversas espcies de Rhizobium e respectivas plantas hospedeiras

Espcie de Rhizobium Planta hospedeira
Rhizobium leguminosarum Pisum, Lathyrus, Vicia
Rhizobium phaseoli Phaseolis vulgaris, P. multiflorus, P. angustifolius
Rhizobium trifolii Trifolium spp
Rhizobium lupini Lupinus spp, Ornithopus sp
Rhizobium japonicum Vigna sp
Rhizobium meliloti Melilotis spp, Medicago spp, Trigonella spp
Outra associao simbitica ocorre entre Actinomycetes do gnero Frankia e plantas

actinorrizais como, por exemplo, Alnus (amieiro), Casuarina (pinheiro australiano),
Elaeagnus (oliveira outonal), Ceanothus (lils da Califrnia) e Myrica (loureiro), sendo
actualmente conhecidas mais de 180 espcies. As bactrias do gnero Frankia so bactrias
filamentosas, de Gram-positivo, constitudas por hifas septadas com 0,5-2,0 um de dimetro e
que produzem numerosos esporos. Determinadas pores das hifas diferenciam-se em clulas
especializadas na fixao de azoto que so denominadas vesculas. As bactrias invadem o
hospedeiro atravs dos plos radiculares, induzindo a formao de ndulos radiculares,
designados actinorrizas (Figura 2.2). Estas bactrias tambm possuem capacidade de formar
vesculas e fixar azoto quando vivem livremente no solo.
Figura 2.2: Um exemplar jovem de amieiro {Alnus glutinos) (A). Parte do sistema radicular
evidenciando actinorrizas 03) (adaptado de Stanier et ai, 1987).
ESTUDO DO CICLO DO AZOTO. UMA APLICAO PARA o ENSINO. 16

O CICLO DO AZOTO
Uma outra simbiose a que ocorre entre a cianobactria Anabaena azollae e o feto de
gua Azolla. Esta associao simbitica tem sido usada, h vrios sculos, para o
enriquecimento de solos de cultivo do arroz, com o objectivo de aumentar o teor em
compostos azotados disponveis para assimilao por estas plantas. Anabaena produz clulas
especializadas, designadas heterocistos, aonde ocorre a fixao do azoto, a taxas de fixao
cerca de dez vezes superiores s registadas por bactrias de vida livre. O feto desenvolve-se,
utilizando o azoto fixado pela cianobactria, e por morte dos componentes da simbiose ficam
disponveis no solo compostos azotados, que vo ser assimilados pelas plantas do arroz. A
ocorrncia deste processo em cada estao de cultivo permite elevados nveis de produo
sem necessidade da aplicao de fertilizantes azotados (Lim, 1998).
2.1.1. Sistema enzimtico nitrogenase
A fixao biolgica do azoto atmosfrico catalisada pelo sistema enzimtico

nitrogenase, de acordo com a seguinte reaco
N 2 + 8e~ + 8 ^ + nMgATP - * 2NH3 + H2 + nMgADP + nPj
O sistema nitrogenase constitudo por duas metaloprotenas, designadas

dinitrogenase ou protena MoFe (220.000 daltons) e dinitrogenase redutase ou protena Fe
(64.000 daltons). A dinitrogenase constituda por dois polipeptdeos distintos, (X2P2 (duas
cadeias a e duas cadeias |3) e contm dois grupos metlicos activos, designados grupo P e
cofactor ferro-molibdnio (coFeMo). O grupo P constitudo por 8 tomos de ferro e 7-8
tomos de enxofre (FegS?^). O cofactor ferro-molibdnio (coFeMo) constitudo por 7
tomos de ferro, 9 tomos de enxofre, um tomo de molibdnio e uma molcula de
homocitrato (FeySMo-homocitrato) (Figura 2.3). O grupo P funciona como aceitador
intermedirio de electres que so transferidos para o grupo coFeMo, o qual funciona como o
local de reduo do azoto molecular.
A dinitrogenase redutase constituda pelo polipeptdeo 72 (duas cadeias y). Cada
cadeia polipeptdica possui dois tomos de ferro e dois tomos de enxofre que se organizam
num grupo designado Fe4S4 (Figura 2.3). A principal funo da dinitrogenase redutase a

O CICLO DO AZOTO
hidrlise de Mg-ATP e a transferncia de electres do grupo Fe4S4 para o grupo P da

dinitrogenase.
Dinitrogenase redutase Dinitrogenase

(protena Fe) (protena MoFe)
P P
Mo
OS O Fe O Homocitrato
Figura 2.3: Representao esquemtica do sistema enzimtico nitrogenase (adaptado de Atlas, 1997).
A reduo de azoto atmosfrico exige, alm de uma grande quantidade de ATP

(devido aos vrios ciclos de transferncia de electres para a reduo da ligao tripla da
molcula N2), Mg (para a hidrlise de ATP) e um agente redutor, que geralmente a
ferredoxina. Os electres so transferidos da ferredoxina para o grupo Fe4S4 da dinitrogenase
redutase. Esta transferncia seguida de hidrlise de ATP e transferncia de electres para a
dinitrogenase. Por cada electro transferido so hidrolisadas duas molculas de Mg-ATP.
Estas molculas no sofrem hidrlise enquanto no se formar o sistema enzimtico
nitrogenase, ou seja, enquanto no houver ligao da dinitrogenase redutase com a
dinitrogenase. Finalmente, os electres so transferidos para o azoto molecular (N2) que
reduzido a amonaco (NH3) (Figura 2.4). Este processo exige uma quantidade considervel de
ATP (Lim, 1998).

O CICLO DO AZOTO
Fd (OX)
/ """^N. /^~ "^"X / N z + 8H*

Fd (red)'*"/ \ / \ /
I dinitrogenase redutase 51_ dinitrogenase coFeMo]
nMgATP^\ / \ / \
nMgADP + nP,
Figura 2.4: Diagrama do processo de reduo de azoto atmosfrico pelo sistema enzimtico nitrogenase.
Os electres so transferidos da ferredoxina reduzida [Fd (red)] para a dinitrogenase redutase. Esta
transferncia seguida de hidrlise de ATP e transferncia dos electres para a dinitrogenase (adaptado
de Stanier et ai, 1987).
O sistema nitrogenase extremamente sensvel ao oxignio, sendo irreversivelmente

inactivado mesmo por exposio a baixas concentraes. Embora ambas as metaloprotenas
possam ser inactivadas pelo oxignio, a dinitrogenase redutase bastante mais sensvel. Os
mecanismos de proteco do sistema nitrogenase so diversos e especficos e variam de
microrganismo para microrganismo. Frequentemente, mais do que um mecanismo pode
ocorrer num mesmo microrganismo mas cada um deles depende das condies ambientais
durante a fixao do azoto atmosfrico. Alguns desses mecanismos de proteco do sistema
nirogenase podem resumir-se em:
i. Desenvolvimento em ambientes anaerbios
Bactrias anaerbias facultativas, como Klebsiella e Enterobacter, e anaerbias
estritas, como Clostridium, geralmente fixam o azoto em anaerobiose, mantendo
assim activo o sistema nitrogenase.
il Barreiras fsicas de proteco
Derxia gummosa, bactria aerbia fixadora do azoto que cresce em solos tropicais da
sia, Africa e Amrica do Sul, produz uma cpsula polissacardica que restringe o
fluxo de oxignio para o interior da clula. Azotobacter vinelandii produz uma

O CICLO DO AZOTO
cpsula de alginato, cuja sntese condicionada pela concentrao de oxignio. A

estrutura desta cpsula varia significativamente conforme as condies ambientais,
tornando-se mais compacta de modo a formar uma barreira efectiva para impedir a
difuso de oxignio. Em Anabaena o sistema nitrogenase localiza-se em clulas
especializadas, denominadas heterocistos. A baixa concentrao de oxignio mantida
nos heterocistos deve-se presena de um invlucro, constitudo por glicolpidos,
lipopolissacardeos e polissacardeos, que retarda a difuso do oxignio para o interior
da clula.
iii. Eliminao metablica do oxignio
Bactrias aerbias e algumas bactrias anaerbias facultativas diminuem os nveis
de oxignio, aumentando a actividade respiratria. Azotobacter possui uma elevada
taxa respiratria, removendo assim rapidamente o oxignio, de modo a impedir a
inactivao do sistema nitrogenase e produzindo uma grande quantidade de ATP.
A presena de hidrogenases permite a oxidao do H2 produzido durante a
fixao de azoto, consumindo assim oxignio e produzindo ATP.
zv. Proteco conformacional do sistema nitrogenase
Azotobacter vineland e Azotobacter chroococcum sintetizam uma protena,
designada Shethna ou FeSII. Esta protena um homodmero e contm dois grupos
2Fe-2S. A formao de um complexo entre o sistema nitrogenase e esta protena evita
a inactivao irreversvel do sistema nitrogenase. Presume-se que o grupo 2Fe-2S e
resduos de lisina da protena Shethna estejam implicados na interaco electrosttica
entre esta protena e o sistema nitrogenase. A concentrao elevada de oxignio
promove uma alterao conformacional da protena Shethna, facilitando a sua ligao
com o sistema nitrogenase e a formao de um complexo inactivo. Quando a
concentrao de oxignio diminui, este complexo dissocia-se e o sistema nitrogenase
recupera a actividade.
v. Sntese de novo do sistema nitrogenase, alterando o equilbrio entre a inactivao e a
sntese
A sntese de novo do sistema nitrogenase foi descrita em cianobactrias unicelulares
e filamentosas e permite manter um equilbrio entre a sua sntese e a inactivao pelo
oxignio (Soto-Urza et ai, 2002).

O CICLO DO AZOTO
2.1.2. Desenvolvimento da simbiose Rhizobium - plantas leguminosas
A simbiose entre Rhizobium sp. e as respectivas plantas hospedeiras envolve

interaces moleculares complexas. No solo, as bactrias so atradas para a proximidade do
sistema radicular da planta hospedeira por substncias presentes no exsudado radicular,
nomeadamente, aminocidos, cidos dicarboxlicos e flavonides. A ligao entre as bactrias
e os plos radiculares envolve uma protena especfica de adeso, designada ricadesina, que
est presente na superfcie das clulas bacterianas, e lectinas e complexos de clcio presentes
na superfcie dos plos radiculares. Os flavonides vo induzir a expresso de genes de
nodulao nas bactrias, designados genes nod. Os produtos de expresso destes genes so
enzimas envolvidas na sntese de lipoligossacardeos especficos, denominados factores Nod.
Estes compostos so libertados pelas clulas bacterianas e vo provocar o enrolamento dos
plos radiculares e consequentemente envolver as bactrias (Figura 2.5).
sistema radicular com

ndulos radiculares
9 plo radicular
as bactrias mulnplicam-se c
diferenciam-se em bacterides
plo radicular iniciando

o enrolamento
a infeco progride formao de um filamento de

peneirando at ao crtex infeco por onde as bactrias
radicular invadem a planta
Figura 2.5: Representao esquemtica do processo de formao de ndulos radiculares

(adaptado de Pelczar et ai, 1993).

O CICLO DO AZOTO
A infeco da planta inicia-se com a penetrao de um grupo de bactrias no plo

radicular, em locais aonde a parede celular foi hidrolizada. Esta penetrao acompanhada da
invaginao da membrana citoplasmtica, formando-se assim um tubo que contm as
bactrias e que designado filamento de infeco (Figura 2.5). O filamento de infeco
penetra o crtex radicular, atravessando as clulas corticais. Ao atravessar uma clula, o
filamento de infeco ramifica-se e forma vesculas que contm as bactrias. As paredes do
filamento e das vesculas apresentam continuidade com a membrana citoplasmtica da clula
hospedeira. As bactrias so ento libertadas no citoplasma, individualmente ou em pequenos
grupos, sendo a membrana envolvente designada membrana peribacteride.
O desenvolvimento do ndulo inicia-se quando o filamento de infeco atinge uma
clula tetraplide do crtex radicular. Esta clula e as clulas diplides vizinhas so
estimuladas a dividirem-se activamente, formando um tumor ou ndulo. As bactrias invadem
apenas as clulas tetraplides e o tecido diplide no infectado vai constituir o crtex do
ndulo. As bactrias dividem-se e diferenciam-se morfolgica e fisiologicamente, originando
formas irregulares, designadas bacterides (Figuras 2.5 e 2.6) (Atlas, 1997).
Figura 2.6: Bacterides de Bradyrhizobium japonicum no interior de um ndulo

radicular de soja (6000x) (adaptado de Atlas, 1997).

O CICLO DO AZOTO
Os bacterides no possuem capacidade de se dividirem, mas podem persistir

metabolicamente activos por longos perodos. O crescimento e diferenciao dos bacterides
conduz ao desenvolvimento de formas fixadoras de azoto, designadas simbiossomas (Prescott
et ai, 2002). Componentes especficos dos ndulos, como o sistema enzimtico nitrogenase e
a leghemoglobina, protena que protege este sistema enzimtico relativamente ao oxignio,
so ento sintetizados, completando o processo de nodulao (Stanier et ai, 1987). A
leghemoglobina responsvel pela colorao vermelha no interior dos ndulos e sintetizada
conjuntamente pela bactria e pela planta hospedeira. O grupo heme produzido nos
simbiossomas e a globina produzida pela planta. Quando o interior de um ndulo radicular
apresenta uma colorao avermelhada isso significa que o ndulo est activo, pois esta
colorao indicadora da presena de leghemoglobina e consequentemente da capacidade de
fixao do azoto atmosfrico (Figura 2.7). O interior de ndulos jovens, se ainda no foi
sintetizada a leghemoglobina, apresenta uma colorao branca acinzentada. Os ndulos
envelhecidos e j inactivos apresentam o interior verde e acabam por se destacar do sistema
radicular.
Na simbiose Rhizobium - plantas leguminosas, os mecanismos de proteco do sistema
nitrogenase esto por um lado relacionados com a produo de leghemoglobina, que
responsvel pelo fornecimento de O2 aos simbiossomas de modo a manter activo o sistema
nitrogenase, e por outro lado com os tecidos vegetais que funcionam como barreira fsica
difuso de O2. O acesso do oxignio ao crtex interno do ndulo restringido por uma
camada de clulas com parede espessa e com poucos espaos intercelulares que constitui uma
barreira de difuso. Por outro lado, as clulas infectadas do ndulo formam um tecido
compacto, que reduz intensamente os nveis de O2 (Soto-Urza et ai, 2002).
Figura 2.7: Ndulos radiculares de trevo ( esquerda) e de soja ( direita) evidenciando o

interior rosado (adaptado de Madigan et ai, 1997).

O CICLO DO AZOTO
O desenvolvimento da simbiose entre Rhizobium sp. e a planta leguminosa hospedeira

tem sido intensamente estudado e sabe-se que envolve a expresso coordenada de diversos
genes da bactria e da planta. Os genes envolvidos na formao dos ndulos radiculares so
colectivamente designados genes "noduliri". Estes genes so essenciais para a infeco da raiz
da planta e para a nodulao e dividem-se em duas classes. Uma classe inclui os genes
responsveis pela composio qumica da superfcie da clula bacteriana, nomeadamente os
genes responsveis pela sntese de exopolissacardeos (genes exo), lipopolissacardeos (genes
Ips), polissacardeos capsulares e P-l,2-glucanos (genes ndv). Os genes exo e os genes Ips
admite-se poderem determinar a especificidade da planta hospedeira. A outra classe de genes
inclui os genes responsveis pela nodulao (genes nod). Na maior parte das espcies de
Rhizobium os genes nod localizam-se em plasmdeos, designados plasmdeos Sym, onde
tambm se localizam os genes nife os genes fix, que esto envolvidos na sntese do sistema
nitrogenase. A maior parte dos genes nod apenas so induzidos na presena da planta, sendo
necessria para a sua induo a excreo de flavonides pela planta. Os genes nod codificam
um conjunto de lipoligossacardeos, designados factores Nod, que induzem vrias respostas
do sistema radicular da planta hospedeira. O gene nodD o nico gene nod expresso por
Rhizobium no estado de simbiose ou de vida livre. A protena NodD, resultante da expresso
do gene nodD, em combinao com os flavonides produzidos pela planta induz a expresso
dos restantes genes nod.
A planta, como resultado da expresso dos genes nod, produz protenas designadas
nodulinas, que so responsveis pelo desenvolvimento e fisiologia dos ndulos radiculares.
Diferentes nodulinas so produzidas sequencialmente ao longo do processo de nodulao.
Numa fase inicial, as nodulinas produzidas so responsveis pela especificidade entre as
bactrias e a planta hospedeira. Numa fase mais tardia, outras nodulinas esto envolvidas na
sntese de protenas especficas, tais como a leghemoglobina. Nodulinas como a uricase, a
glutamina sintetase e a sacarose sintetase esto envolvidas na assimilao de azoto e de
carbono, sendo muito importantes para o equilbrio das trocas de nutrientes entre as bactrias
e a planta (Atlas, 1997).
Apesar da maioria das plantas leguminosas formar ndulos fixadores de azoto nas suas
razes, algumas espcies desenvolvem este tipo de ndulos no caule (Figura 2.8). As
leguminosas com ndulos caulinares ocorrem preferencialmente em regies tropicais, onde os
solos so deficientes em azoto, devido a lixiviao e intensa actividade biolgica. Uma

O CICLO DO AZOTO
associao deste tipo a que corre entre Sesbania rostrata e Azorhizobium caulinodans. Esta
planta existe em solos pantanosos ou sujeitos a inundaes peridicas. Os ndulos formam-se
geralmente na poro submersa do caule ou nas regies imediatamente acima do nvel da
gua. O processo de nodulao semelhante ao que ocorre na formao de ndulos
radiculares (Madigan et ai, 1997).
Figura 2.8: Ndulos caulinares em

Sesbania rostrata (adaptado de
Madigan et ai, 1997).
2.1.3. Fixao simbitica do azoto atmosfrico
A simbiose entre espcies de Rhizobium e as respectivas plantas hospedeiras muito

importante para os parceiros intervenientes, pois ambos beneficiam com esta associao.
Os bacterides dependem completamente da planta para a obteno de fontes de
energia para a fixao de azoto atmosfrico (N2). A planta fornece aos bacterides os
compostos orgnicos necessrios para a produo de ATP. Os principais compostos orgnicos
transportados para os bacterides so intermedirios do ciclo do cido ctrico, particularmente
o succinato, o malato e o fumarato, que so usados como dadores de electres para a produo
de ATP (Figura 2.9).
Como resultado da fixao do azoto atmosfrico (N2) produzido amonaco (NH3).
Apesar dos bacterides possurem capacidade de assimilao do amonaco em compostos
orgnicos azotados, os nveis das enzimas assimilatrias so bastante baixos. Pelo contrrio,
estas enzimas esto presentes em nveis elevados no citoplasma das clulas vegetais. Assim, o
amonaco transportado do bacteride para a planta assimilado nas clulas vegetais como
glutamina pelo sistema glutamina sintetase/glutamato sintetase. No entanto, substncias como

O CICLO DO AZOTO
alantona, cido alantico, asparagina e 4-metilenoglutamina so tambm sintetizadas pela

planta e transportadas para os tecidos (Madigan et ai, 1997).
Citoplasma la
ptnbicterid
I
4 Amao&cido*
NittopnM /^
^ Ww 1 W^ J > *^
transporte
<ie electres
/
O, . Lb cvu O.. Lb
Lb LtaheiDo afo bm Ladu

Urridw
0,-Lb
FUt-i
Figura 2.9: Diagrama das principais reaces metablicas e trocas de nutrientes que ocorrem no bacteride
(adaptado de Madigan et ai, 1997).
2.2. Amonificao
A decomposio microbiana de compostos orgnicos azotados, resultantes da morte

dos seres vivos ou do metabolismo animal, como a ureia e o cido rico, resulta na libertao
de amonaco. Este processo designado amonificao. A primeira fase deste processo a
hidrlise de protenas e cidos nucleicos. A protelise mediada por enzimas produzidas por
muitos fungos e algumas bactrias como Cl ostridium, Pseudomonas e Bacil l us, libertando
aminocidos. Estes compostos so depois degradados por processos de respirao ou
fermentao (Pelczar et ai, 1993).

O CICLO DO AZOTO
2.3. Nitrificao
Nos solos o amonaco (NH3), que no foi incorporado em compostos orgnicos por
microrganismos e plantas ou que no perdido por volatizao para a atmosfera, vai ser
convertido em nitrato (NO3) por bactrias, designadas bactrias nitrificantes. Este processo
designa-se nitrificao.
A nitrificao realiza-se em duas etapas sucessivas que so respectivamente a
oxidao do amonaco (NH3) a nitrito (NO2") e a oxidao do nitrito (NO2") a nitrato (NO3").
A oxidao de amonaco a nitrito mediada por duas enzimas, designadas respectivamente
monoxigenase do amonaco (MOA), que uma enzima membranar, e oxidorredutase da
hidroxilamina (OHA), que uma enzima periplasmtica. A monoxigenase do amonaco
catalisa a oxidao do amonaco a hidroxilamina. A hidroxilamina posteriormente
convertida em nitrito numa reaco catalisada pela oxidorredutase da hidroxilamina:
NH4+ + H+ + 2e" + 0 2 -> NH2OH + H 2 0

MOA
NH2OH + H 2 0 -* N0 2 " + 5H+ + 4e"

OHA
l
0 2 + 2H+ + 2e" -+ H 2 0
Na reaco mediada pela monoxigenase do amonaco so necessrios dois electres

exgenos para a reduo do oxignio. Estes electres resultam da oxidao da hidroxilamina e
so fornecidos monoxigenase do amonaco a partir da oxidorredutase da hidroxilamina, via
citocromo c e ubiquinona. Assim, por cada quatro electres resultantes da oxidao de
amonaco a nitrito, apenas dois atingem a oxidase terminal (citocromo aa^), libertando-se dois
protes. Esta reaco estabelece uma fora proto-motriz atravs da membrana e o ATP
produzido por quimiosmose (Figura 2.10). Durante esta etapa, ocorre um grande consumo de
oxignio (4,33 mg (Vmg N H / oxidado) (Madigan et ai, 1997).

O CICLO DO AZOTO
Periplasms Membrana Citoplasma
NO,H + 4H + NI-LO
H
V y +H,O
NH2OH+H20
OHA
MOA
NH3+02+2H+
4e-
% 0 2 + 4H+
2H+
H+
Figura 2.10: Representao esquemtica do processo de oxidao do amonaco.

MOA - monoxigenase do amonaco, OH A - oxidorredutase da hidroxilamina, Q - ubiquinona
(adaptado de Madigan et ai, 1997).
A segunda etapa do processo de nitrificao a oxidao de nitrito a nitrato. Esta

reaco catalisada pela enzima oxidase do nitrito (ONi):
N0 2 " + H 2 0 - N0 3 " + 2H + + 2e"

ONi
V2 0 2 + 2H + + 2e" -> H 2 0
Os electres percorrem uma curta cadeia de transporte at oxidase terminal. Os

citocromos c e a esto presentes na cadeia de transporte de electres destas bactrias. Por
aco da citocromo aai oxidase estabelecida uma fora proto-motriz, sendo o ATP
produzido por quimiosmose (Figura 2.11) (Madigan et ai, 1997).

O CICLO DO AZOTO
Periplasms Membrana Citoplasma
20H-
ATPase
Figura 2.11: Representao esquemtica do processo de oxidao do nitrito.

ONi - oxidase do nitrito (adaptado de Madigan et al, 1997).
No processo de nitrificao, o amonaco e o nitrito so usados como dadores de

electres para a produo de ATP. No entanto, a oxidao destes compostos azotados
inorgnicos produz quantidades relativamente baixas de ATP, sendo, portanto, necessrias
grandes quantidades destes compostos para ocorrer o crescimento bacteriano.
Consequentemente, a magnitude do processo de nitrificao tipicamente muito elevada,
enquanto que a taxa de crescimento bacteriano geralmente baixa (Atlas, 1997). Esta
limitao da quantidade de ATP produzida relaciona-se com os potenciais de reduo dos
dadores de electres envolvidos no processo. O potencial do par NH2OH/NH3
aproximadamente 0 v, enquanto que o potencial do par NO3/NO2" muito elevado, cerca de
+0,43 v. Estes valores relativamente elevados implicam a entrada de electres na cadeia de
transporte, nas fases finais do processo, o que limita a quantidade de ATP produzida por cada
par de electres introduzido (Madigan et ai, 1997).
Alguns dos factores ambientais que controlam a nitrificao e o crescimento
bacteriano so o oxignio, a temperatura e o pH. A nitrificao um processo aerbio, sendo
inibida em anaerobiose. As bactrias nitrificantes crescem a temperaturas moderadas, entre
20 e 30C, e a valores de pH entre 7,5 e 8,2.
A nitrificao sem dvida um processo com muita importncia ecolgica no solo,
pois o nitrato a forma azotada preferencialmente utilizada pelas plantas para a assimilao
de azoto. O enriquecimento do solo em nitratos por este processo poderia reduzir a

O CICLO DO AZOTO
necessidade de utilizao de fertilizantes comerciais. No entanto, o nitrato possui carga

negativa e no se liga s partculas do solo carregadas negativamente, sendo facilmente
lixiviado, ao contrrio dos ies amnia que possuem carga positiva e so retidos pelas
partculas do solo (Figura 2.12).
Figura 2.12: Representao esquemtica do

processo de lixiviao do io nitrato (N03~). Os
ies amnia (NU,*) com carga positiva ligam-se
s partculas do solo carregadas negativamente,
sendo retidos. Os ies nitrato com carga negativa
no se ligam s partculas do solo e so
facilmente lixiviados (adaptado de Atlas, 1997).
lenol fretico
Assim, a transferncia de formas azotadas inorgnicas, como nitratos e nitritos, da

superfcie dos solos para reservatrios freticos subterrneos apresenta como consequncias,
por um lado, uma reduo da produtividade (devido ao empobrecimento do solo em
compostos azotados necessrios para o crescimento das plantas) e, por outro lado, a
ocorrncia de problemas de Sade Pblica (devido ao enriquecimento dos lenis freticos
em nitritos e nitratos). A ingesto de gua com elevados nveis de nitritos e nitratos apresenta
srios riscos para o Homem. Os nitritos podem reagir com compostos aminados, originando
nitrosaminas altamente carcinognicas. Os nitratos podem ser reduzidos a nitritos no tubo
digestivo, particularmente no estmago. O estmago de um adulto normal apresenta um pH
cido, o que minimiza a probabilidade de ocorrer tal reduo. No entanto, o estmago dos
bebs apresenta pH menos cido, o que promove a reduo de nitrato a nitrito. Os nitritos so
absorvidos no intestino, provocando a converso de hemoglobina em metemoglobina, ineficaz
no transporte de oxignio. Elevados nveis de metemoglobina provocam metemoglobinemia
ou sndrome do beb azul, que pode causar a morte (Atlas, 1997).

O CICLO DO AZOTO
2.3.1. Bactrias Nitrificantes
Em 1890, Winogradsky conseguiu o isolamento de bactrias responsveis pelo

processo de nitrificao, comprovando que se trata de um processo microbiano. O isolamento
destas bactrias revelou-se bastante difcil, principalmente pela abundncia no solo de outros
procariotas com taxas de crescimento mais elevadas. As bactrias nitrificantes so um grupo
de bactrias de Gram-negativo, quimiolitotrficas obrigatrias que esto presentes nos solos e
em habitats aquticos e so, de ponto de vista ecolgico, consideradas de grande importncia.
As bactrias nitrificantes pertencem famlia Nitrobacteriaceae e incluem dois grupos
distintos, responsveis pelas diferentes etapas do processo de nitrificao: Nitrosomonas,
Nitrosolobus, Nitrosococcus, Nitrosospira e Nitrosovibrio que realizam a oxidao de
amonaco a nitrito e Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina e Nitrospira que realizam a
oxidao de nitrito a nitrato.
As bactrias envolvidas na oxidao do amonaco a nitrito apresentam morfologia
variada (esfrica, elipside, em bastonete, espiralada ou lobular) e so mveis (Tabela 2.2).
Todas as espcies so aerbias e, de um modo geral, a temperatura ptima de crescimento
de 30C e o pH ptimo situa-se no intervalo 7,5-8,0. Estas bactrias distribuem-se por uma
grande variedade de solos, oceanos, rios, lagos e sistemas de tratamento de guas residuais
(Atlas, 1997; Madigan et ai, 1997).
Tabela 2.2: Caractersticas dos vrios gneros de bactrias responsveis pela oxidao do amonaco a nitrito.
Caractersticas Nitrosomonas Nitrosococcus Nitrosolobus Nitrosospira Nitrosovibrio
Em bastonete
Esfrica a Fortemente
Morfologia Em bastonete Lobular ligeiramente
elipside espiralada
encurvado
Dimenses 0,7-1,5 x 1,5-1,8 x 1,0-1,5 x 0,3-0,8 x 0,3-0,4 x
(um) 1,0-2,4 1,7-2,5 1,0-2,5 1,0-8,0 1,1-3,0
1 ou mais la6
1 ou 2 flagelos Flagelos 1 flagelo polar
Mobilidade flagelos flagelos
polares pertricos ou subpolar
sub-polares pertricos
Organizao das Sistema Membranas
Clulas
membranas membranar perifricas ou
compartimentadas Invaginaes
intracitoplasmticas perifrico vesculas
Contedo GC do
45-53 49-50 54 54 54
DNA (mol %)

O CICLO DO AZOTO
As bactrias responsveis pela oxidao do nitrito a nitrato apresentam forma esfrica,

em bastonete ou espiralada, podendo apresentar ou no mobilidade (Tabela 2.3). A
temperatura ptima de crescimento de 28C e o intervalo de pH adequado ao crescimento
de 5,8-8,5, sendo o valor ptimo entre 7,6-7,8. Encontram-se distribudas nos solos, habitats
de gua doce, oceanos, pntanos, sistemas de tratamento de guas residuais, monumentos
histricos e rochas (Atlas, 1997; Madigan et ai, 1997).
Tabela 2.3: Caractersticas dos vrios gneros de bactrias responsveis pela oxidao do nitrito a nitrato.
Caractersticas Nitrobacter Nitrococcus Nitrospina Nitrospira
Bastonete Ligeiramente
Morfologia Bastonetes curtos Esfrica
longo espiralada
Dimenses 0,5-0,8 x 0,3-0,4 x 0,3-0,4 x
1,5
(fim) 1,0-2,0 1,7-6,6 0,8-1,0
1 ou 2 flagelos
Mobilidade 1 flagelo polar
sub-polares
Organizao das Vesculas
Tbulos em
membranas achatadas
arranjo aleatrio
intracitoplasmticas perifricas
Contedo GC do
59-62 61 58 50
DNA (mol %)
2.4. Reduo assimilatria e desassimilatria do nitrato. Desnitrifcao.
O nitrato produzido por nitrificao constitui a principal fonte de azoto disponvel para
assimilao pelas plantas, fungos e bactrias. Nas clulas, o nitrato reduzido a amonaco, o
qual ento assimilado. Este processo designa-se reduo assimilatria do nitrato. A
magnitude deste processo proporcional necessidade de azoto para o crescimento, pois o
amonaco no excretado.
Algumas bactrias anaerbias facultativas podem utilizar o nitrato, em vez do
oxignio, como aceitador final de electres. Neste processo desassimilatrio, o nitrato
reduzido como resultado de respirao anaerbia (respirao do nitrato). Certas bactrias,

O CICLO DO AZOTO
como Escherichia coli, apenas so capazes de reduzir o nitrato a nitrito, de acordo com a
seguinte reaco:
N0 3 " + 2e" + 2H+ - N0 2 " + H 20
Mas, outras bactrias, como certas espcies de Pseudomonas, Pasteurel l a, Moraxell a,

Spirillum, Thiobacil l us e Bacillus reduzem o nitrato a xido nitroso (N2O) e N2. Este processo
designado desnitrifcao:
2N0 3 " + 10e" + 12H * -* N 2 + 6H 2 0
Neste processo, tambm pode ocorrer acumulao de nitrito. Do ponto de vista

ambiental, a acumulao de nitrito preocupante por poder contribuir para a formao de
nitrosaminas carcinognicas. Porm, algumas bactrias, especialmente do gnero Cl ostridium,
podem reduzir o nitrito a amonaco, numa via de reduo desassimilatria, sendo este
processo designado amonificao do nitrito. Neste processo, o nitrito reduzido a amonaco,
de acordo com a seguinte reaco:
N0 2 " + 6e" + 8ff -* NH 4+ + 2H 2 0
Esta reaco catalizada pela redutase do nitrito. Trata-se de uma enzima solvel que contm
cinco grupos heme c. Esta reaco considerada um mecanismo de proteco, pois o nitrito
para valores de pH inferiores a 6,0 pode ser convertido em cido nitroso que possui efeitos
mutagnicos (Madigan et ai, 1997).
A desnitrifcao um processo que envolve uma sequncia de reaces em que
participam quatro enzimas, denominadas redutase do nitrato (RN), redutase do nitrito (RNi),
redutase do xido ntrico (RNO) e redutase do xido nitroso (RN2O). A pseudoazurina (PAZ)
uma pequena molcula com cobre que funciona como dador de electres para as redutase do
nitrito e do xido nitroso (Figura 2.13). A actividade destas enzimas severamente inibida na
presena de oxignio, da a desnitrifcao ser um processo anaerbio.

O CICLO DO AZOTO
Periplasma
Citoplasma
Figura 2.13: Representao esquemtica do processo de desnitrifcao. RN - redutase do nitrato,

RNi - redutase do nitrito, RNO - redutase do xido ntrico, RN 2 0 - redutase do xido nitroso,
PAZ - pseudoazurina.
O primeiro passo da desnitrifcao a reduo de nitrato (NO3") a nitrito (NO2"),

catalizada pela redutase do nitrato. Foram identificados dois tipos desta enzima, uma
membranar, com trs sub-unidades (120, 60 e 20 kDa), que utiliza a ubihidroquinona no
transporte de electres e cujo centro activo est orientado para o citoplasma, e uma enzima
solvel que se localiza no periplasma e formada por duas sub-unidades (94 e 19 kDa).
Assume-se que molibdnio funcione como centro activo na reduo do nitrato a nitrito.
O segundo passo a reduo do nitrito (NO2) a xido ntrico (NO), catalizada pela
redutase do nitrito. So conhecidos dois tipos desta enzima, uma que um trmero e contm
cobre como cofactor (dois tomos de cobre por monmero) e outra que um dmero e contm
um grupo heme c e um grupo heme di por cada monmero (Figura 2.14). Admite-se que a
enzima com cobre seja tambm capaz da reduo de xido ntrico (NO) a xido nitroso
(N 2 0).
Figura 2.14: Estrutura tridimensional do

trmero da redutase do nitrito isolado de
Alcaligenes faecalis. Os tomos de
cobre esto representados como esferas
verdes.

O CICLO DO AZOTO
A reduo de xido ntrico (NO) a xido nitroso (N2O) catalizada pela redutase do
xido ntrico, localizada na membrana citoplasmtica. Esta enzima constituda por uma
sub-unidade de 16 kDa que possui um grupo heme c e por outra de 53 kDa que possui um
grupo heme b. A ltima etapa da desnitrificao a reduo de xido nitroso (N2O) a azoto
molecular (N2). Esta reaco catalizada pela redutase do xido nitroso, localizada no
periplasma. Esta enzima contm oito tomos de cobre distribudos em dois monmeros de
aproximadamente 70 kDa cada (Cervantes-Carrillo et ai, 2000).
A maioria das bactrias desnitrificantes so anaerbias facultativas e heterotrficas. Os
gneros bacterianos que incluem estirpes desnitrificantes so Achromobacter, Actinomyces,
Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Aquaspirillum, Arthobacter, Bacillus, Branhamella,
Campylobacter, Cellulomonas, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium,
Chromobacterium, Cytophaga, Erwinia, Eubacterium, Flavobacterium, Geodermatophilus,
Gluconobacter, Halobacterium, Halococcus, Hyphomicrobium, Kingella, Klebsiella,
Leptothrix, Micrococcus, Moraxella, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Pasteurella,
Pseudomonas, Paracoccus, Peptococcus, Photobacterium, Propionibacterium, Proteus,
Rhizobium, Rhodobacter, Salmonella, Shigella, Spirillum, Staphylococcus, Streptomyces,
Thermothrix, Thiobacillus, Thiomicrospira e Vibrio (Stanier et al, 1987; Drysdale et al,
1999).
As condies ambientais podem realizar um papel importante no processo de
desnitrificao. Por exemplo, grandes quantidades de matria orgnica, temperaturas elevadas
(25 a 60 C) e valores de pH entre 6,0 e 9,0 favorecem no solo o processo de desnitrificao
(Pelczare/a/, 1993).
A desnitrificao um processo de elevado impacto ecolgico. Apesar de provocar a
remoo de nitratos do solo, diminuindo a produtividade agrcola, a desnitrificao
importante para assegurar a reciclagem de azoto nos ecossistemas. O nitrato um io
extremamente solvel, sendo constantemente lixiviado do solo e acumulado nas massas de
gua. Se no ocorresse desnitrificao, a reserva de azoto da Terra estaria acumulada nos
oceanos. A desnitrificao tambm mantm a potabilidade da gua, pois elevadas
concentraes de nitratos podem ser txicas (Stanier et ai, 1987).

O CICLO DO AZOTO
2.5. Oxidao anaerbia do amonaco
A oxidao anaerbia do amonaco, conhecida como processo "anammox" (anaerobic

ammonium oxidation), foi recentemente descoberta e contribuiu para uma melhor
compreenso do ciclo do azoto. Este processo autotrfico, estritamente anaerbio e
contribui significativamente (cerca de 70%) para a reciclagem do azoto nos oceanos.
Neste processo, o amonaco (NH3) oxidado a azoto molecular (N2), sendo o nitrito o
aceitador de electres (e a hidrazina e a hidroxilamina os intermedirios) (Figura 2.15):
NH3 + N0 2 " + Ff - N2 + 2H 20
Figura 2.15: Mecanismo proposto para a oxidao anaerbia do amonaco. A hidroxilamina (NH2OH)
e o amonaco (NH 3) so convertidos em hidrazina (N2H 4) pela hidrolase da hidrazina (HHZ). A
hidrazina oxidada a azoto molecular (N2) pela oxidase da hidrazina (OHZ), libertando 4 electres. Os
4 electres so utilizados para a reduo do nitrito (N02") pela redutase do nitrito (RNi), originando
hidroxilamina.
O nitrito (NO2) reduzido a hidroxilamina (NH 2OH ) numa reaco catalizada pela
redutase do nitrito (RNi):
N0 2 " + 5FT" + 4e~ - NH 2OH + H 2 0

O CICLO DO AZOTO
A hidroxilamina e o amonaco so convertidos em hidrazina (N2H 4) pela hidrolase da

hidrazina (HHZ):
NH2OH + NH 3 - N2H 4 + H 2 0
A oxidao da hidrazina a azoto molecular catalisada pela oxidase da hidrazina

(OHZ):
N2H4 -> N 2 + 4H + + 4e"
Esta reaco liberta quatro electres que vo ser utilizados para a reduo do nitrito a
hidroxilamina.
A oxidase da hidrazina (OH Z) foi inicialmente considerada semelhante
oxidorredutase da hidroxilamina de Nitrosomonas. No entanto, a oxidase da hidrazina
apresenta menor massa molecular (183 kD) e a sequncia dos seus aminocidos nica. Esta
enzima apresenta actividade apenas em condies de anaerobiose e constitui cerca de 10% do
total das protenas celulares. constituda por trs subunidades a e cada uma destas
subunidades possui oito citocromos c. Esta enzima possui capacidade de catalisar a oxidao
da hidrazina e da hidroxilamina (Jetten et ai, 2002).
O processo "anammox" influenciado pelas condies ambientais, nomeadamente a
temperatura, o pH, a concentrao de oxignio e a de nitrito. Este processo favorecido por
temperaturas entre 6 e 43C e pH entre 6,7 e 8,3, sendo o valor ptimo 8,0. Sendo um
processo anaerbio, inibido mesmo para baixas concentraes de oxignio (presso parcial
de 0,5%). Concentraes de nitrito superiores a 5mM inibem o processo "anammox", mas a
adio de qualquer um dos intermedirios, hidrazina ou hidroxilamina, contraria este efeito
(Strouse/a/, 1999).
A possibilidade da existncia deste processo era reconhecida desde 1975 pelos
cientistas, no entanto, as bactrias responsveis nunca tinham sido identificadas e eram
referidas como litotrficos em falta na natureza ("the l ithotrophs missing in nature")
(Strous, 1999). A utilizao de um meio de cultura apropriado para o crescimento de
microrganismos estritamente autotrficos, em sistema SBR (sequencing batch reactor),
permitiu a obteno de biomassa suficiente para a identificao destas bactrias. O DNA
extrado de suspenses celulares foi amplificado por PCR, usando como "primer" um rDNA
16S universal. A anlise filogentica da sequncia de rDNA 16S dominante permitiu a

O CICLO DO AZOTO
identificao das bactrias como Planctomycetes. Uma bactria "anammox" identificada foi
denominada Brocadia anammoxidans. "Brocadia" refere-se ao local de descoberta
(Gist-brocades em Delft, Holanda) e "anammoxidans" reflecte as propriedades metablicas
desta bactria (Jetten et ai, 2002).
A sequncia de rDNA 16S foi ento utilizada para produzir sondas oligonucleotdicas
para aplicao na hibridizao in situ com fluorescncia (FISH). Esta tcnica permitiu a
identificao de uma outra bactria envolvida na oxidao anaerbia do amonaco, em
sistemas de tratamento de guas residuais, que foi designada Kuenenia stuttgarttiensis. Estes
dois quimioautotrficos anaerbios pertencem a grupos monofilticos claramente separados,
apresentando menos de 90% de semelhanas na sequenciao de rDNA 16S. No entanto,
possuem uma estrutura celular semelhante e produzem hidrazina a partir de hidroxilamina
exgena. Foram observadas algumas diferenas fenotpicas, nomeadamente diferente
tolerncia aos nveis de nitrito e de fosfato.
As bactrias "anammox" apresentam uma taxa de crescimento extremamente lenta.
Por exemplo, Brocadia anammoxidans apresenta um tempo de duplicao de 10,6 dias (Jetten
et ai, 2002). Recentemente, foi identificado um novo gnero de bactrias "anammox". Em
Pitsea, no Reino Unido, a anlise da biomassa de uma Estao de Tratamento de guas
Residuais (ETAR) demonstrou uma elevada actividade "anammox", assim com a produo de
hidrazina e hidroxilamina. A biblioteca genmica obtida a partir desta biomassa permitiu
identificar dez sequncias de rDNA 16S caractersticas de Planctomycetes. Quatro dessas
sequncias relacionavam-se com sequncias de bactrias "anammox" conhecidas, mas
estavam mais prximas da raiz do ramo evolutivo dos Planctomycetes. A hibridizao in situ
com fluorescncia (FISH), com sondas oligonucleotdicas especficas para estas quatro
sequncias, mostrou que duas espcies, pertencentes ao mesmo gnero, constituam mais de
99% da populao de Planctomycetes que, por sua vez, constitua 20% da populao
microbiana total. A identificao destas espcies como tpicas bactrias "anammox" foi
realizada por microscopia electrnica e anlise lipdica. As duas espcies foram designadas
Scalindua brodae (em homenagem ao qumico austraco Engelbert Broda, o primeiro a
considerar a hiptese da existncia da oxidao anaerbia do amonaco) e Scalindua wagneri
(em homenagem ao microbiologista alemo Michael Wagner que muito contribui para o
estudo da ecologia e filogenia deste processo). Simultaneamente, no Mar Negro, foi
identificada uma nova espcie deste gnero, denominada Scalindua sorokinii. Com habitats
to diferentes, Scalindua possivelmente o gnero "anammox" identificado com maior
distribuio (Schimdt et ai, 2003).

O CICLO DO AZOTO
Os trs gneros identificados partilham o mesmo ancestral comum, mas encontram-se

evolutivamente muito separados. O gnero Scalindua apresenta cerca de 85% de semelhanas
na sequncia de rDNA 16S com Brocadia. No entanto, os trs gneros so fisiolgica e
morfologicamente semelhantes (Schimdt et ai, 2003). Todas as bactrias "anammox"
pertencem a um grupo de bactrias com caractersticas muito particulares, os Planctomycetes,
que recentemente foi considerado como o grupo bacteriano mais ancestral, podendo mesmo
situar-se na base da rvore evolutiva Bacteria. Os Planctomycetes apresentam forma esfrica
ou oval e reproduzem-se por gemulao. A maioria destas bactrias possui ciclos de vida nos
quais as clulas ssseis sofrem gemulao, originando clulas mveis. Estas so flageladas e
movimentam-se por algum tempo at se fixarem e iniciarem novo ciclo.
A parede celular dos Planctomycetes no possui peptidoglicano, sendo essencialmente

proteica. A ausncia de peptidoglicano comprovada pela resistncia destas bactrias a
antibiticos que inibem a sua sntese, como a penicilina G, ampicilina, vancomicina e
ciclosserina. A ausncia de peptidoglicano uma caracterstica que refora a ancestralidade
destas bactrias. A sntese de peptidoglicano ser posterior divergncia do ramo evolutivo
dos Planctomycetes. A superfcie celular dos Planctomycetes apresenta estruturas
crateriformes. Estas estruturas so reentrncias com uma orla sobrelevada, constitudas por
arranjos circulares de natureza proteica. Os Planctomycetes apresentam citoplasma
diferenciado, com diferentes compartimentos membranares aparentemente com diferentes
funes. Algumas bactrias, como Pirullela e Gemmata obscuriglobus, possuem um "corpo
nuclear" delimitado por duas membranas e que contm o nucleide. A ocorrncia desta
estrutura nos Planctomycetes, filogeneticamente pertencentes ao domnio Bacteria, sugere
vrios cenrios evolutivos. Um que esta estrutura seja homloga do ncleo dos eucariotas e
represente uma caracterstica partilhada com um ancestral proto-eucariota comum; outro que
resulte de evoluo convergente e represente uma estrutura anloga ao ncleo dos eucariotas
(Fuerst, 1995).
As bactrias "anammox" apresentam um plano celular bsico, definido pela ocorrncia

de trs compartimentos membranares designados repectivamente anamoxosoma, riboplasma e
parifoplasma (Figura 2.16). O anamoxosoma, que o compartimento mais interno, no possui
ribossomas nem DNA, delimitado por uma membrana simples e representa cerca de 30% do
volume celular. A regio central do anamoxosoma apresenta um conjunto organizado de
tbulos com 13 nm de dimetro. neste compartimento que ocorre a reaco "anammox". A
oxidase da hidrazina est presente apenas no interior do anamoxosoma, indicando que a
compartimentalizao nestes Planctomycetes bioquimicamente funcional.

O CICLO DO AZOTO
Recentemente, descobriu-se que a membrana que delimita o anamoxosoma

constituda por lpidos com elevado teor de ciclobutano. Provavelmente, estes lpidos
conferem membrana uma excepcional densidade e elevada resistncia difuso de solutos,
ajudando reteno dos intermedirios txicos hidrazina e hidroxilamina.
O riboplasma o compartimento intermdio e delimitado externamente por uma
membrana designada membrana intracitoplasmtica. Neste compartimento localizam-se o
nucleide e ribossomas. Externamente ao riboplasma, localiza-se o parifoplasma. Este
compartimento delimitado externamente pela membrana citoplasmtica e no possui
ribossomas nem DNA, mas apresenta algum RNA (Lindsay et al, 2001).
Em ecossistemas com baixa concentrao de oxignio, como por exemplo em
interfaces aerobiose/anaerobiose, a actividade das bactrias "anammox" est dependente da
actividade das bactrias aerbias que oxidam o amonaco. Nestas condies, as bactrias
aerbias oxidam o amonaco a nitrito, mantendo a concentrao de oxignio baixa. Por sua
vez, as bactrias "anammox" convertem o nitrito produzido e o restante amonaco em azoto
molecular. Neste tipo de ecossistemas, as bactrias aerbias que oxidam o nitrito no foram
detectadas. Aparentemente, estas bactrias no conseguem competir com as bactrias aerbias
que oxidam o amonaco, nem com as bactrias "anammox". De modo que nestes ecossistemas
as bactrias aerbias que oxidam o amonaco e as bactrias "anammox" coexistem e formam
uma comunidade estvel. Outras interaces podem ocorrer em ambientes anaerbios, dada a
versatilidade metablica das bactrias aerbias que oxidam o amonaco. Muitas destas
bactrias so tambm anaerbios facultativos. Por exemplo, Nitrosomonas eutropha possui

O CICLO DO AZOTO
capacidade de oxidar o amonaco (NH3) em anaerobiose, usando tetrxido de azoto (N 2 0 4 )

como agente oxidante. A hidroxilamina (NH2OH) e o xido ntrico (NO) so os produtos
desta reaco (Figura 2.17).
Figura 2.17: Oxidao anaerbia e aerbia do

NH,OH + H,0
amonaco por Nitrosomonas eutropha. O tetrxido
de azoto (N204) o agente oxidante para a
converso do amonaco a hidroxilamina (NH2OH)
e xido ntrico (NO). Na presena de oxignio, o
xido ntrico oxidado a N0 2 (N204). MOA:
monoxigenase do amonaco.
O xido ntrico no metabolizado e quando na presena de oxignio oxidado a

NO2, proporcionando o agente oxidante (N2O4) enzima monoxigenase do amonaco. A
hidroxilamina posteriormente oxidada a nitrito. O nitrito produzido utilizado em
anaerobiose como aceitador de electres, conduzindo formao de azoto molecular (N2).
Estas bactrias podem utilizar uma variedade de dadores de electres (hidrognio, piruvato e
amonaco) para a reduo do nitrito. A enzima responsvel pela reduo de nitrito a xido
ntrico uma redutase do nitrito com cobre. Para evitar a acumulao de xido ntrico,
extremamente citotxico, Nitrosomonas eutropha possui potencial gentico para sintetizar
uma redutase do xido ntrico membranar, que cataliza a reduo do xido ntrico a xido
nitroso que posteriormente convertido em azoto molecular (Schimdt et ai, 2002).
A taxa mxima de converso do amonaco em anaerobiose Nitrosomonas eutropha
cerca de 2 nmol N H / min"1 (mg protena)"1, valor muito inferior ao registado para Brocadia
anammoxidans (60 nmol NrLt+ min"1 (mg protena)"1), mas suficiente para permitir a
sobrevivncia em perodos prolongados de limitao de O2 (Jetten et ai, 2002).
A coexistncia de bactrias aerbias que oxidam o amonaco e de bactrias
"anammox" em sistemas com baixas concentraes de oxignio permite a remoo de
amonaco em guas residuais numa s fase, com a realizao simultnea das respectivas
reaces. Recentemente, tem sido desenvolvido um sistema designado CANON (Completely
Autotrophic N-removal Over Nitrite) para aplicao em guas residuais industriais, lamas
primrias ou gases com elevado teor de amonaco (> 0,2 g/l) e baixo teor de carbono orgnico
(C:N<0,15).

O CICLO DO AZOTO
Este sistema envolve duas fases sucessivas. A primeira fase uma nitrificao parcial,
ou seja, a oxidao do amonaco a nitrito. Nesta fase, cerca de 50% do amonaco oxidado a
nitrito por bactrias nitrificantes:
2NH4+ + 1.502 -* NH4+ + N0 2 " + H 2 0 + 2H+
A segunda fase a oxidao anaerbia do amonaco. O amonaco e o nitrito so

convertidos em azoto molecular por bactrias "anammox":
NH4+ + N0 2 " - N 2 + 2H 2 0
O primeiro reactor "anammox" desenvolvido localiza-se na estao de tratamento de

guas residuais de Dokhaven, em Roterdo, e iniciou o seu funcionamento em Junho de 2002.
Este sistema permite a reduo dos custos operacionais em cerca de 90%, a diminuio da
emisso de CO2 em mais de 88% e a diminuio das necessidades energticas.

3. ALTERAES ANTROPOGENICAS NO CICLO DO
AZOTO - CAUSAS E CONSEQUNCIAS

A L T E R A E S A N T R O P O G N I C A S N O C I C L O D O A Z O T O - C A U S A S E C O N S E Q U N C I A S
3. ALTERAES ANTROPOGNICAS NO CICLO DO

AZOTO - CAUSAS E CONSEQUNCIAS
As actividades humanas tm causado um aumento global da quantidade de azoto que

circula entre o mundo vivo, o solo, a gua e a atmosfera. Esta alterao representa um srio
impacto para os ecossistemas, pois o azoto um elemento essencial para os seres vivos e a
sua disponibilidade adquire uma importncia crucial para a organizao e funcionamento dos
ecossistemas. Em excesso, o azoto converte-se num factor poluente, alterando o equilbrio
ecolgico dos ecossistemas.
A maioria das actividades humanas responsveis pelo aumento do azoto global
verifica-se escala local, como a produo e utilizao de fertilizantes azotados e a utilizao
de combustveis fsseis. No entanto, estas actividades no s aumentaram a quantidade de
azoto no ambiente, como tambm incrementaram o movimento global das vrias formas
azotadas atravs do ar e da gua. Devido a este aumento da mobilidade, o azoto em excesso
origina srias consequncias ambientais a longo prazo e em larga escala. De um modo geral,
as alteraes antropognicas no ciclo do azoto provocam um aumento da taxa de entrada de
azoto no ciclo terrestre deste elemento; um aumento da concentrao global de xidos de
azoto, gases potenciadores do efeito de estufa; uma perda de micronutrientes do solo, como
clcio e potssio, essenciais para a manuteno a longo prazo da fertilidade dos solos; a
acidificao substancial dos solos e guas e um aumento do transporte de compostos azotados
pelos rios e sua acumulao nos esturios e zonas costeiras, com o consequente efeito
poluente e perda acelerada de diversidade biolgica (Vitousek et ai, 1997).
3.1 Impacto humano na fixao do azoto
As actividades humanas aceleraram claramente a taxa de fixao do azoto atmosfrico,

duplicando a sua transferncia anual para formas azotadas disponveis para assimilao pelos
seres vivos. Os principais responsveis por este fenmeno so a produo de fertilizantes
azotados, a combusto de combustveis fsseis e o cultivo de espcies leguminosas em
simbiose com bactrias fixadoras de azoto.
A fixao industrial do azoto para a produo de fertilizantes representa a maior
contribuio humana para o ciclo global deste elemento. Este processo surgiu na Alemanha,
durante a Primeira Guerra Mundial e aumentou exponencialmente desde 1940. O crescimento

populacional e a crescente urbanizao indicam que a produo e utilizao destes

fertilizantes continuar a aumentar.
A combusto de combustveis fsseis, como o carvo e o petrleo, liberta para a
atmosfera azoto previamente fixado em formaes geolgicas, sob a forma de xidos de
azoto, como o xido ntrico. No entanto, na combusto a altas temperaturas tambm ocorre a
fixao directa de pequenas quantidades de azoto atmosfrico.
Aproximadamente 1/3 da superfcie terrestre utilizada para a agricultura e o Homem
substituiu grandes reas de vegetao natural por monoculturas de leguminosas, o que
aumentou consideravelmente a taxa de fixao do azoto atmosfrico nesses terrenos e a
quantidade de formas azotadas biologicamente disponveis.
Alm de incrementar a fixao do azoto atmosfrico e a libertao de azoto de
reservatrios geolgicos, as actividades humanas tambm provocam a libertao de azoto de
reservatrios biolgicos, contribuindo para o aumento da disponibilidade de formas azotadas.
Os principais meios de mobilizao incluem a combusto de biomassa, o desbravamento de
terrenos e sua converso para cultivo e a drenagem de solos hmidos, com a consequente
oxidao de matria orgnica (Vitousek et ai, 1997).
3.2. Impacto na atmosfera
O impacto humano no ciclo do azoto reflecte-se tambm a nvel atmosfrico,

especificamente pelo aumento da emisso, transporte, reaco e deposio de compostos
azotados gasosos, como xido nitroso (N2O), xido ntrico (NO) e amonaco (NH3).
Algumas actividades humanas afectam directamente a atmosfera, como por exemplo, a
combusto de materiais fsseis e outros processos a altas temperaturas que libertam xido
ntrico (NO). Outras actividades aumentam indirectamente a emisso de gases azotados, como
por exemplo, a fertilizao agrcola que aumenta a concentrao de amonaco (NH3)
volatilizvel no solo, a taxa de nitrificao e, consequentemente, a de desnitrificao,
aumentando a emisso de gases azotados do solo e da gua.
Os compostos azotados gasosos originam diversos efeitos ambientais. Por exemplo, na
estratosfera, o xido nitroso (N2O) contribui para o efeito de estufa por absoro de radiao
infravermelha. O xido nitroso pode sofrer fotlise ou reagir com oxignio e assim catalisar a
depleo da camada de ozono. Diversas fontes contribuem para o aumento do xido nitroso,

ALTERAES ANTROPOGNICAS NO CICLO DO AZOTO - CAUSAS E CONSEQUNCIAS
como por exemplo a aplicao de fertilizantes, lenis freticos ricos em nitratos, solos
saturados em nitratos, combusto de biomassa, desbravamento de terras e fabrico industrial de
diversos produtos, como cido ntrico e poliamidas.
O xido ntrico (NO) afecta a concentrao do agente oxidante maioritrio na
atmosfera, o radical hidroxilo (OH") e catalisa a formao fotoqumica do smog. Quando a
concentrao de xido ntrico elevada, a oxidao de monxido de carbono (CO), de metano
(CH4) e outros hidrocarbonetos volteis desencadeia a produo de ozono troposfrico,
componente txico do smog (Figura 3.1). O produto final da oxidao de xido ntrico, o
cido ntrico (HNO3), o principal constituinte da chuva cida. Diversas actividades
contribuem para a emisso de xido ntrico, mas a principal certamente a combusto, quer
de combustveis fsseis, quer de biomassa. Cerca de 80% das emisses de xido ntrico so
de responsabilidade humana.
E missies fugithas -, .
1% v Outros
Resduos \ cK
3% Figura 3.1: Contribuio por
sector para as substncias
percursoras de ozono
troposfrico (adaptado do
Industria
3C% Relatrio do Instituto do
Ambiente, 2002).
I-ansportes
5C%
O amonaco (NH3) funciona como um agente neutralizante na atmosfera,

influenciando o pH de aerossis, do vapor de gua e da precipitao atmosfrica. Cerca de
70% das emisses de amonaco so devidas a actividades humanas. Verifica-se um elevado
nvel de volatilizao de amonaco a partir de fertilizantes agrcolas, resduos domsticos
animais e combusto de biomassa (Vitousek et ai, 1997).
Em Portugal, no ano 2000, 44% das emisses de xidos de azoto (NOx) foram devidas
ao sector dos transportes. As emisses destes compostos foram das que registaram um maior
crescimento, o qual foi proporcional ao nmero de veculos em circulao. Os principais
problemas ambientais provocados pelo aumento destas emisses esto relacionados com o
aquecimento global e a ocorrncia de nveis crticos de xidos de azoto a nvel local e
regional (Relatrio do Instituto do Ambiente, 2002).

3.3. Impacto nos ecossistemas terrestres
As taxas de produo e acumulao de biomassa nos ecossistemas so limitadas pela

disponibilidade de azoto e sabe-se que as actividades humanas tm vindo a aumentar esta
disponibilidade nos ecossistemas terrestres. Este aumento tem importantes implicaes no
ciclo global do carbono, dado que afecta a amplitude do crescimento vegetal e a quantidade
de carbono retida em ecossistemas terrestres. Trabalhos experimentais realizados na Europa e
na Amrica indicaram que grande parte do azoto retido em ecossistemas terrestres estimula a
assimilao de carbono. No entanto, quando um ecossistema atinge o ponto de saturao em
azoto, a sua capacidade de produo limitada, ou seja, cessa o aumento da produo vegetal
e da assimilao de carbono em resposta ao aumento da disponibilidade de azoto. Neste
ponto, o potencial de reteno de azoto do ecossistema est limitado e a perda de azoto para a
gua e atmosfera aproxima-se da entrada total de azoto, anulando os efeitos da fertilizao. O
aumento da disponibilidade de azoto desencadeia o aumento da mobilidade de nitratos. A
perda de nitratos, por lixiviao e por desnitrificao, provoca a perda de caties essenciais e
a acidificao de solos e guas. Por lixiviao, os nitratos arrastam consigo elementos com
carga positiva, como os caties clcio, magnsio e potssio. Por sua vez, a acidificao do
meio facilita a mobilizao de alumnio inorgnico que txico. O ecossistema comea ento
a ser limitado por outros recursos. Este conjunto de acontecimentos provoca a reduo da taxa
fotossinttica e a consequente diminuio do crescimento e aumento da mortalidade das
espcies vegetais e de toda a cadeia alimentar associada. O aumento da disponibilidade de
azoto pode, assim, provocar uma alterao dramtica das espcies dominantes e reduzir
marcadamente a diversidade dos ecossistemas.
No Reino Unido, investigaes realizadas mostraram que a aplicao de fertilizantes

azotados favorece o domnio de algumas espcies que esto melhor adaptadas a nveis
elevados de azoto. Este efeito causou uma reduo acentuada do nmero de espcies nas reas
com maior nvel de fertilizao. Na Holanda, onde a disponibilidade de compostos azotados
provocada por aco humana das mais elevadas do mundo, ecossistemas completos foram
alterados devido a esta mudana das espcies dominantes, tendo ecossistemas de elevada
diversidade sido convertidos em ecossistemas de menor diversidade, como florestas, que
esto melhor adaptadas a elevados nveis de azoto (Vitousek et ai, 1997).
ESTUDO DO CICLO D O AZOTO. U M A APLICAO PARA O ENSINO. 47

3.4. Impacto nos ecossistemas aquticos
A aco humana no ciclo do azoto tambm se faz sentir nos ecossistemas aquticos,
verificando-se um aumento da concentrao global de azoto, especialmente de nitratos. A
concentrao de nitratos na maioria dos rios do nordeste americano aumentou trs a dez vezes
no ltimo sculo. Esta tendncia tambm se verifica nos principais rios da Europa e, em cerca
de 1000 lagos da Noruega, aonde a concentrao de nitratos duplicou em menos de uma
dcada. Estima-se que o fluxo global de azoto nos ecossistemas aquticos do Atlntico Norte
tenha aumentado desde os tempos pr-industriais entre duas a vinte vezes.
A concentrao e o fluxo de nitratos nestes ecossistemas esto relacionados com a
densidade populacional humana nas suas margens. As actividades humanas constituem uma
rede de entradas de azoto que engloba o uso de fertilizantes, o cultivo de leguminosas em
simbiose com bactrias fixadoras de azoto e a deposio de xidos de azoto da atmosfera.
Em Portugal, o aumento da concentrao de nitratos nos rios est relacionada com a
descarga de guas residuais, sem tratamento prvio, e tambm ao predomnio dos fertilizantes
azotados na actividade agrcola (Figura 3.2) (Relatrio do Instituto do Ambiente, 2002).
Nitratos (mg/IJ
6
Figura 3.2: Concentrao de nitratos em rios

portugueses (adaptado do Relatrio do
Instituto do Ambiente, 2002).
O aumento da concentrao de nitratos foi observado em lenis freticos de muitas

regies agrcolas, devido ao uso excessivo de fertilizantes azotados. A longa permanncia de
nitratos nas guas subterrneas implica uma diminuio da qualidade da gua para consumo,
podendo mesmo representar um grave problema de sade pblica quando os nitratos atingem
nveis elevados.

O cido ntrico (HNO3) e o amonaco (NH3) contribuem para a acidificao dos

ecossistemas aquticos. A converso de xido ntrico em cido ntrico provoca a acidificao
das guas de um modo directo. Como resultado da assimilao e da oxidao do amonaco
libertam-se ies YC que alteram o pH. A acidificao resultante condiciona os diversos
processos do ciclo do azoto nos ecossistemas aquticos.
O aumento de azoto inorgnico em ecossistemas aquticos pode causar eutrofizao,
um processo que representa talvez a maior ameaa integridade destes ecossistemas, pois
produz efeitos substanciais na sua composio e funcionamento. Nestes ecossistemas, a
produtividade primria controlada pela entrada de compostos azotados. O azoto em excesso
estimula o crescimento de algas e plantas aquticas. A consequente decomposio destes
organismos provoca uma diminuio do oxignio dissolvido na gua, podendo causar hipoxia
(baixos nveis de O2) ou anoxia (ausncia de O2) em guas estratificadas. Baixos nveis de O2
conduzem morte de outros seres vivos e tornam imprpria a qualidade da gua para
consumo humano. A eutrofizao est assim associada a uma perda significativa da
diversidade biolgica. Sabe-se que diversos ecossistemas so afectados por este fenmeno.
Por exemplo, uma evoluo de anoxia no Mar Bltico e no Mar Negro e de hipoxia no Mar do
Norte so conhecidas desde 1950 (Vitousek et ai, 1997).
3.5. Necessidade de um desenvolvimento sustentvel
As alteraes antropognicas mais significativas no ciclo do azoto esto

intrinsecamente associadas produo de alimentos. A agricultura intensiva moderna exige
grandes quantidades de fertilizantes azotados e a humanidade necessita de prticas agrcolas
intensivas de modo a fazer face ao crescimento populacional. Evitar que a produo e
aplicao de fertilizantes azotados aumente exponencialmente torna-se assim um difcil
desafio. No entanto, existem estratgias para controlar a utilizao de fertilizantes azotados,
bem como para reduzir a mobilidade dos compostos azotados, diminuindo o impacto regional
e global. Um modo de reduzir o consumo de fertilizantes aumentar a sua eficincia.
Aproximadamente metade da quantidade de fertilizantes utilizados perdida para a atmosfera
ou removida pela gua, sob a forma de N2, xidos de azoto ou nitratos. A dissoluo do
fertilizante na gua de irrigao, a sua aplicao abaixo da superfcie do solo e a temporizao
das mltiplas aplicaes de acordo com as necessidades da cultura, reduz 1/3 do fertilizante

azotado necessrio e cerca de dez vezes a perda de xido nitroso e de xido ntrico. O
desenvolvimento e a implementao global de prticas similares devem ser prioritrios, pois
estas constituem uma oportunidade de reduzir os custos da produo alimentar e as alteraes
antropognicas nos ecossistemas. tambm importante reduzir a lixiviao de compostos
azotados das zonas fertilizadas que contribui para a eutrofizao dos ecossistemas aquticos.
Um modo de o conseguir atravs da manuteno da vegetao circundante aos cursos de
gua que retm naturalmente os compostos azotados. A reduo das emisses de gases
azotados resultantes da combusto de combustveis fsseis tambm exige melhoramentos na
eficincia do processo (Vitousek et ai, 1997).
As actividades humanas causam sem dvida srias consequncias no ambiente. A taxa
de fixao de azoto praticamente duplicou no ltimo sculo. A concentrao de gases
responsveis pelo efeito de estufa e percursores de smog e chuva cida tm vindo a aumentar.
Os solos sofrem acidificao e depleo de nutrientes essenciais sua fertilidade. Os
aquferos destas regies sofrem de igual modo acidificao e o azoto em excesso
transportado pelos rios, acumulando-se nos esturios e zonas costeiras, causando o declnio
dos recursos pisccolas. A diminuio da biodiversidade evidente quer nos ecossistemas
terrestres, quer nos ecossistemas aquticos.
De modo que se torna clara a urgncia de uma tomada de medidas nacionais e
internacionais respeitantes s alteraes antropognicas do ciclo do azoto, de modo a diminuir
as alteraes globais e o seu impacto, numa perspectiva de desenvolvimento sustentvel cada
vez mais pertinente.

4. MATERIAL E MTODOS

MATERIAL E MTODOS
4. MATERIAL E MTODOS
4.1. Deteco de Planctomycetes
A deteco de Planctomycetes foi realizada em amostras de lamas primrias de uma

Estao de Tratamento de guas Residuais de Matosinhos (ETAR Mi). As lamas primrias
resultam do tratamento primrio dos efluentes, sendo naturalmente ricas em matria orgnica
e microrganismos. A tcnica usada para a deteco de Planctomycetes foi a hibridizao in
situ com fluorescncia (FISH) (Amann et al, 1990; Zarda et al, 1997; Neef et al, 1998).
4.1.1. Fixao das amostras
Amostras de lamas primrias foram fixadas em paraformaldedo 4%, durante 1 hora a

4C. Aps centrifugao a 3000 rpm durante 5 minutos, as amostras foram lavadas em
tampo fosfato salino (0,13 M NaCl, 7 mM Na 2 HP0 4 , 3 mM NaH 2 P0 4 , pH 7,2). Em seguida,
as amostras foram novamente centrifugadas e armazenadas em etanol 95%, podendo ser
guardadas nestas condies durante vrios meses a -20 C.
4.1.2. Imobilizao em lminas
A imobilizao das amostras fixadas para a hibridizao in situ foi realizada em

lminas de gelatina. Para obteno de lminas de gelatina, as lminas de vidro foram
mergulhadas por breves instantes numa soluo de gelatina 0,1% e KCr(S4)2 0,01% a 70 C.
As lminas foram depois secas ao ar, podendo ser armazenadas a 4 C durante vrios meses.
Em cada lmina de gelatina, foram colocados 10 \ da amostra. Aps secagem ao ar, as
amostras foram desidratadas, em sries ascendentes de etanol (50%, 80% e 95%), durante 3
minutos cada e novamente secas ao ar.

MATERIAL E MTODOS
4.1.3. Sonda ogonucleotdica e corantes utilizados
A sonda utilizada na hibridizao in situ foi a sonda Pla5a (Sigma) que especfica
para o rRNA 16S de Planctomycetes, posio 45-62, com a sequncia
5'-GACTTGCATGCCTAATCC. O corante Cy3 (Amersham Biosciences) uma cianina
mono-reactiva com fluorescncia laranja que se liga convalentemente aos grupos amino da
sonda Pla5a. A conjugao do Cy3 com a sonda ogonucleotdica foi realizada por adio de
1,5 ml de tampo carbonato de sdio 0,1 M (pH9,0) ampola contendo a sonda; desta
soluo, retiraram-se 0,5 ml que foram adicionados ampola contendo o corante Cy3. Para
utilizar na hibridizao in situ com fluorescncia, a concentrao da sonda Pla5a foi ajustada
para 50 ng/ul.
O corante utilizado para a colorao da comunidade microbiana presente nas amostras
foi 4',6-diamino-2'-fenilindole (DAPI) (Sigma), especfico para o DNA, na concentrao
0,1 ug/ml.
4.1.4. Hibridizao in situ com fluorescncia (FISH)
Todo o processo de hibridizao foi realizado em cmara escura, de modo a evitar a

dissipao da fluorescncia do corante. A cmara de hibridizao foi mantida humidificada,
atravs de papel de filtro embebido em tampo de hibridizao. Sobre cada amostra
imobilizada em lmina de gelatina foram colocados 25 ul de uma mistura constituda por
24 ul de tampo de hibridizao e 1 ul da sonda Pla5a (50 ng/ul) conjugada com Cy3. As
amostras foram depois colocadas na cmara de hibridizao a 37 C, durante 4 horas. Em
seguida, foram lavadas com tampo de lavagem durante 10 minutos a 37 C, em cmara
escura. Aps repetio da lavagem e passagem por gua destilada, as amostras foram secas ao
ar e submetidas colorao com DAPI.
Tampo de hibridizao: 0,9 M NaCl; 20 mM Tris-HCl; 5 mM EDTA; 0,01% SDS; 30% formamida;
pH 7,2.
Tampo de lavagem: 102 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; 0,01% SDS; pH 7,2.

MATERIAL E MTODOS
4.1.5. Colorao com D API
A contestao com DAPI foi realizada a seguir ao ltimo passo da tcnica de

hibridizao. As amostras foram cobertas com 20 ul de uma soluo 0,1 ug/ml de DAPI
durante 5 minutos, seguindo-se uma lavagem rpida com gua destilada e secagem ao ar.
4.1.6. Microscopia
A observao do material foi feita com um microscpio de epifluorescncia Nikon

Optiphot-2, com lmpada de mercrio HB-10101AF Nikon, e equipado com os filtros
MBE14104 (EPI-FL FILTER BLOCK B-2A BA520/DM510/EX450-490) para o Cy3 e
MBE14100 (EPI-FL FILTER BLOCK UV-2A BA420/DM400/EX330-380) para o DAPI.
Como meio de montagem foi utilizado Citifluor. As observaes foram registadas com o
sistema digital de imagem de alta resoluo Nikon Digital Camera DXM1200F acoplado ao
microscpio e software Nikon ACT-1 v. 2.62.
4.2. Isolamento de Rhizobium sp.
4.2.1. Obteno de culturas puras de Rhizobium sp.
Ndulos radiculares de Ornithopus pinnatus, uma planta leguminosa vulgarmente

designada por serradela-delgada (Figura 4.1) que cresce tipicamente em habitats de clima
temperado, foram utilizados para o isolamento de Rhizobium sp. As razes foram lavadas em
gua corrente, de modo a remover as partculas de terra, colocadas em gua de Javel 20%
durante 5-10 minutos e lavadas com gua destilada e esterilizada. Em seguida, os ndulos
radiculares foram destacados e seccionados em condies de assepsia. Por impresso de
seces dos ndulos radiculares foi efectuada a inoculao em meio de cultura apropriado
para isolamento de Rhizobium sp. (DSMZ). A incubao das culturas foi realizada a 25 C,
durante 24 horas.
Meio de cultura para isolamento de Rhizobium sp.: 1% manitol; 0,1% extracto de levedura;
0,02% MgS04; 0,05% K2HP04;
alguns gros FeCl3; 1,5% agar; pH 6,7.

MATERIAL E MTODOS
Figura 4.1: Exemplar de Ornithopus pinnatus (A). Parte do sistema radicular com ndulos (B).
4.2.2. Colorao de Gram
Amostras das culturas puras obtidas foram observadas a fresco e aps serem
submetidas colorao de Gram. Seguidamente, foram desidratadas em sries ascendentes de
etanol (70%, 90% e 100%) e xilol. Como meio de montagem foi utilizado Entellan (Merck).
A observao foi feita com um microscpio Nikon Eclipse E600 e as observaes foram
registadas com sistema digital de imagem de alta resoluo Nikon Digital Camera
DXM1200F acoplado ao microscpio e software Nikon ACT-1 v. 2.62.
Colorao de Gram: Violeta cristal 2% - 15 segundos; lavagem com gua destilada; etanol 95% -
3 minutos; lavagem com gua destilada; soluo de iodo (iodo 0,33%; iodeto
de potssio 0,66%) - 15 segundos; lavagem com gua destilada; etanol 95% -
1 minuto; lavagem com gua destilada; safranina 0,25% - 30-60 segundos;
lavagem com gua destilada.

MATERIAL E MTODOS
4.3. Isolamento de bactrias nitrificantes
4.3.1. Obteno de culturas puras de bactrias nitrificantes
Amostras de solo de jardim foram utilizadas para o isolamento de bactrias

nitrificantes em meios de cultura selectivos. A partir de suspenses preparadas com solo,
procedeu-se inoculao do meio de cultura para isolamento de bactrias nitrificantes
(Pelczar et ai, 1993). A incubao das culturas, primeiro em meio lquido, com agitao,
depois em meio slido, foi realizada a 25 C, no escuro, durante 1-2 semanas.
Meio de cultura para isolamento de bactrias nitrificantes: 0,2% (NH4)2S04; 0,1% K 2 HP0 4 ;
0,05% MgS0 4 ; 0,04% FeS0 4 ;
0,04% NaCl; 0,1% CaC0 3 ;
0,l%MgCO 3
As culturas obtidas foram ento utilizadas para a inoculao de meios de cultura para o
isolamento de Nitrosomonas sp. e de Nitrobacter sp. (LGC Promochem) nas mesmas
condies anteriormente descritas. Amostras das culturas puras obtidas foram submetidas ao
procedimento indicado em 4.2.2.
Meio de cultura para isolamento de Nitrosomonas sp.: 0,3% (NH^SC^; 0,05% K 2 HP0 4 ;
0,005% MgS0 4 ; 0,0004% CaCl2;
0,01% soluo Fe/EDTA;
2,5% Vermelho Cresol (0.0005%).
Manter pH a 8,2-8,4 durante o crescimento com soluo esterilizada de K 2 C0 3 50%.
Soluo Fe/EDTA: 0,14% EDTA; 0,5% FeS0 4 .7H 2 0; 0,05% H 2 S0 4 (concentrado).
Meio de cultura para isolamento de Nitrobacter sp.: 0,05% CaCl2 2%

0,05% MgS0 4 .7H 2 0 20%
0,1% Ferro quelatado 0,1%
0,05% soluo de metais
0,05%NaNO2 41,4%
0,02% K 2 HP0 4 1,74%
Soluo de metais: Na2MoO .2H 2 0 0,01%; MnCl2.4H20 0,02%; CoCl2.6H20
0,0002%; ZnS0 4 .7H 2 0 0,01%; CuS0 4 .5H 2 0 0,002%

MATERIAL E MTODOS
4.4. Isolamento de bactrias com capacidade de reduzir o nitrato
Suspenses de solo de jardim foram usadas para inocular agar nutritivo (NA). A
incubao das culturas foi realizada a 25 C, durante 18-24 horas. A partir das culturas mistas
obtidas procedeu-se, atravs de tcnica do riscado, ao isolamento dos diferentes
microrganismos presentes. Cada uma das culturas puras obtidas foi submetida aos testes do
sistema API 20E (BioMrieux), de modo a identificar as espcies bacterianas capazes de
reduzir o nitrato. Aps a identificao, amostras de cada uma das culturas pretendidas foram
submetidas ao procedimento indicado em 4.2.2.
Meio de cultura NA: 0,3% extracto de carne; 0,5% peptona; 1,5% agar.
4.4.1. Identificao de microrganismos com o sistema API 20E
O API 20 E um sistema para a identificao de Enterobacteriaceae e outros bacilos

de Gram-negativo no fastidiosos que utiliza testes bioqumicos padronizados e
miniaturizados e uma base de dados. A galeria API 20 E comporta 20 microtubos que
contm substratos desidratados. Os microtubos so inoculados com uma suspenso
bacteriana que reconstitui os meios. A incubao efectuada a 25 C, durante 18-24 horas.
As reaces produzidas durante o perodo de incubao traduzem-se pelas mudanas de cor
espontneas ou reveladas aps a adio de reagentes. A leitura destas reaces permite a
obteno de um perfil numrico que possibilita a identificao atravs da consulta de um
Catlogo Analtico. Na ficha de resultados, os testes so separados por grupos de trs e um
valor 1, 2 ou 4 indicado para cada um. Adicionando no interior de cada grupo os valores
que correspondem a reaces positivas, obtm-se 7 algarismos; a reaco da oxidase que
constitui o 21 teste afectada com o valor 4 quando positiva. Adicionalmente, foi
efectuado o teste da reduo do nitrato que realizado no tubo GLU. A tabela seguinte
descreve as reaces envolvidas nos vrios testes, assim como os resultados possveis.

MATERIAL E MTODOS
Tabela 4.1: Quadro de leitura dos testes de identificao API 20E

Testes Descrio Resultados
Negativo Positivo
ONPG hidrlise do p-galactosdeo-ortonitrofenil pela P-galactosdase incolor amarelo

com libertao de nitrofenol
ADH degradao da arginina em ornitina, amonaco e C0 2 pela amarelo vermelho/alaranjado
hidrolase da arginina
LDC degradao da lisina em cadaverina pela amarelo vermelho/alaranjado
descarboxilase da lisina
ODC degradao da ornitina em putrescina pela amarelo vermelho/alaranjado
descarboxilase da ornitina
CIT utilizao do citrato de sdio como nica fonte de carbono verde plido/amarelo azul esverdeado/azul
H2S reduo do tiossulfato de sdio com produo de H2S incolor/acizentado depsito negro/orla
fina
URE degradao da ureia pela urease com libertao de amonaco e amarelo vermelho/alaranjado
co2
TDA desaminao do triptofano pela desaminase do triptofano com amarelo castanho
produo de cido indolepirvico avermelhado
IND produo de ndole como resultado do metabolismo do incolor/verde rosa
triptofano plido/amarelo
VP produo de acetona, intermedirio na fermentao do incolor rosa/avermelhado
butanodiol
GEL liquefaco da gelatina pela gelatinase no difuso do difuso do pigmento
pigmento negro negro
GLU fermentao/oxidao da glucose com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
MAN fermentao/oxidao do manitol com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
INO fermentao/oxidao do inositol com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
SOR fermentao/oxidao do sorbitol com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
RHA fermentao/oxidao da ramnose com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
SAC fermentao/oxidao da sacarose com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
MEL fermentao/oxidao da melibiose com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
AMY fermentao/oxidao da amigdalina com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
ARA fermentao/oxidao da arabinose com produo de cido azul/azul esverdeado amarelo
OX presena da citocromo oxidase incolor violeta
St N0 2 " amarelo vermelho
N03 reduo do nitrato com produo de <^"
^ " ^ N2 laranja/vermelho amarelo
ESTUDO DO CICLO DO AZOTO. UMA APLICAO PARA O ENSINO. 5 8

5. RESULTADOS E DISCUSSO

RESULTADOS E DISCUSSO
5. R E S U L T A D O S E D I S C U S S O
5.1. Deteco de Planctomycetes
As lamas primrias de uma Estao de Tratamento de guas Residuais (ETAR)

apresentam elevados nveis de matria orgnica e uma natural diversidade e abundncia de
microrganismos. Tais caractersticas permitem consider-las como amostras ideais para
detectar a presena de Planctomycetes, incluindo muito provavelmente alguns dos
responsveis pela oxidao anaerbia do amonaco. A presena de Planctomycetes em lamas
primrias da ETAR Mi foi detectada atravs da tcnica de hibridizao in situ com
fluorescncia.
A hibridizao das amostras com a sonda Pla5a, especfica para Planctomycetes,
marcada com o fluorocromo Cy3, permitiu a observao microscpica de Planctomycetes,
enquanto que a colorao com o fluorocromo DAPI, especfico para o DNA, permitiu a
observao microscpica de toda a comunidade microbiana presente. A realizao destas duas
tcnicas em sequncia na mesma amostra, apresentou como principal vantagem a
possibilidade de, aps a observao microscpica de toda a populao microbiana presente na
amostra, se distinguir, atravs do uso de fluorocromos e filtros adequados, quais os membros
dessa comunidade que pertencem aos Planctomycetes.
Na tcnica de hibridizao in situ com fluorescncia (FISH), a fixao com
paraformaldedo 4%, comparativamente a outros fixadores, confere uma maior estabilidade s
clulas bacterianas (Zarda et ai, 1997). A utilizao de lminas de gelatina permitiu uma
melhor distribuio da amostra. A percentagem de formamida e a temperatura de hibridizao
e de lavagem foram consideradas as mais convenientes para a deteco de Planctomycetes
(Neeetal, 1998).
Os resultados obtidos mostraram que na comunidade microbiana presente nas
amostras e corada com o fluorocromo DAPI (Figuras 5.1-8a) era possvel distinguir membros
dos Planctomycetes, cujas clulas apresentavam fluorescncia laranja (Figuras 5.1-8b). Os
Planctomycetes presentes nas lamas primrias da ETAR Mi ocorreram como clulas esfricas
ou ovides, com dimetros em mdia volta de 1 um, isoladamente ou em grupos. Em todas
as amostras estudadas foram observados Planctomycetes isolados (Figuras 5.1-6b), embora
tambm se observassem ligados a agregados de partculas ou grupos de clulas (Figuras 5.7b
e 5.8b).

10um
l.(a) (b)
Figura 5.1-4: Deteco de Planctomycetes em amostras de lamas primrias da ETAR Mj. (a) e (b): campos
idnticos de observao por microscopia de epifluorescncia: (a) colorao com DAPI (0,l|im/ml); (b)
hibridizao in situ com a sonda Pla5a marcada com Cy3.
E S T U D O D O C I C L O D O A Z O T O . U M A A P L I C A O P A R A O E N S I N O . 61
8. (a) (b)
Figura 5.5-8: Deteco de Planctomycetes em amostras de lamas primrias da ETAR M t . (a) e (b): campos
idnticos de observao por microscopia de epifluorescncia: (a) colorao com DAPI (0,1 um/ml); (b)
hibridizao in situ com a sonda Pla5a marcada com Cy3.
Estes resultados permitem concluir que a hibridizao in situ pode ser um instrumento
valioso para analisar uma populao especfica, neste caso de Planctomycetes, na comunidade
bacteriana presente num determinado habitat. Esta tcnica descrita h mais de uma dcada
(Giovannoni et ai, 1988; DeLong et ai, 1989; Amann et ai, 1990) considerada muito
atractiva para a deteco e identificao de Planctomycetes tendo, nos ltimos anos, sido
aplicada com sucesso em variados habitats, incluindo solos e sistemas de tratamentos de
guas residuais (Pernthaler et ai, 2001).
5.2. Isolamento de Rhizobium sp.
Culturas puras de Rhizobium sp. foram obtidas, usando como inoculo colnias isoladas
aps impresso de seces dos ndulos radiculares na superfcie de meio slido apropriado
para o isolamento de Rhizobium sp. A incubao foi realizada a 25 C e aps 24 horas,
observaram-se colnias circulares, lisas, sem pigmentao e com aspecto viscoso que foram
utilizadas como inoculo para a obteno de novas culturas.
A morfologia das clulas de Rhizobium sp. submetidas colorao de Gram foi
observada por microscopia ptica de campo claro. Os resultados obtidos mostraram bactrias
com forma bacilar, associadas aos pares, em cadeia ou em grupos mais ou menos densos,
coradas de Gram-negativo (Figura 5.9). No interior das clulas de Rhizobium sp.
observaram-se pequenos grnulos com forma esfrica constitudos por poli-P-hidroxibutirato.
Figura 5.9: Clulas de Rhizobium sp. submetidas colorao de Gram.

A morfologia das clulas, o resultado da colorao de Gram, o crescimento em meio

apropriado e a morfologia das colnias forneceram informao suficiente para demonstrar o
isolamento com sucesso de Rhizobium sp. a partir de ndulos radiculares de Ornithopus
pinnatus.
5.3. Isolamento de bactrias nitrifcantes
Culturas puras de Nitrosomonas sp. e de Nitrobacter sp. foram obtidas a partir de

colnias isoladas em meio especfico para o isolamento de Nitrosomonas sp. e de
Nitrobacter sp. Aps incubao a 25 C durante 1-2 semanas, observaram-se colnias
circulares, sem pigmentao e de dimetro muito reduzido.
A morfologia das clulas de Nitrosomonas sp. e de Nitrobacter sp. submetidas
colorao de Gram, foi observada por microscopia ptica de campo claro. Os resultados
obtidos mostraram bactrias com forma bacilar, com dimenses bastante reduzidas e coradas
de Gram-negativo (Figuras 5.10e5.11).

Figura 5.11: Clulas de Nitrobacter sp. submetidas colorao de Gram.
A morfologia e dimenses das clulas, o resultado da colorao de Gram, o

crescimento em meio selectivo e a morfologia das colnias fornecem informao suficiente
para demonstrar o isolamento com sucesso de Nitrosomonas sp., responsvel pela oxidao
do amonaco a nitrito, e de Nitrobacter sp., responsvel pela oxidao do nitrito a nitrato, a
partir de amostras de solo.
5.4. Isolamento de bactrias com capacidade de reduzir o nitrato
A partir das amostras de solo de jardim foram isoladas 36 estirpes bacterianas, oito das
quais foram identificadas, atravs do sistema API 20E, como pertencentes a gneros
bacterianos com capacidade de reduzir o nitrato (Figuras 5.12-5.19). O teste NO3 da galeria
API 20E de especial importncia, pois permite testar a capacidade de reduo do nitrato,
com produo de nitrito (NO2") ou de azoto molecular (N2). A leitura do resultado foi
realizada no tubo GLU. Aps a adio dos reagentes, o desenvolvimento de uma cor vermelha
indica a presena de nitrito. Uma reaco negativa (cor amarela) pode ocorrer devido
produo de azoto molecular (eventualmente assinalada pela presena de microbolhas), sendo
necessrio confirmar este resultado. Aps a adio de zinco em p, o desenvolvimento de
uma cor amarela indica a presena de N2, enquanto que uma cor avermelhada indica uma
reaco negativa, isto , os nitratos presentes no tubo foram reduzidos a nitritos.

DNPO " AOfcf LDC QD3 ir.TT H25 UH TDA

Vii
^WMWgaw
Figura 5.12: Resultado do teste API 20E para o gnero identificado como Pseudomonas (aps
adio de zinco no tubo GLU).
ULHE TD IND LVJ LGEU GLUAMAN~ NO SOR A

RHA SAC M E L A AMY AR
Figura 5.13: Resultado do teste API 20E para o gnero identificado como Flavobacterium (aps
Figura 5.14: Resultado do teste API 20E para o gnero identificado como Achromobacter (aps
ion' use am. l i i i i * UHE f Mf:w
Figura 5.15: Resultado do teste API 20E para o gnero identificado como Moraxella (sem adio de
zinco no tubo GLU).
Figura 5.16: Resultado do teste API 20E para o gnero identificado como Pasteurella (aps adio
de zinco no tubo GLU).

, A; I ****! tari '

A A
iU. CLU MAN IN SOH RHA SAC MEL * * ^ * V ARA
Figura 5.17: Resultado do teste API 20E para a espcie identificada como Escherichia coli (sem
Figura 5.18: Resultado do teste API 20E para o gnero identificado como Serrada (sem adio de
zinco no tubo GLU).
Figura 5.19: Resultado do teste API 20E para o gnero identificado como Enterobacter (aps
Os resultados obtidos com o sistema API 20E permitiram concluir que as bactrias
isoladas do solo e que possuam capacidade de reduzir o nitrato (NO3") a azoto molecular (N2)
pertenciam aos gneros Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Moraxella e
Pasteurella, enquanto que as que possuam capacidade de reduzir o nitrato (NO3") a nitrito
(N0 2 ) foram identificadas como Escherichia coli e Serratia. Foi tambm isolado
Enterobacter que possui capacidade de realizar a amonificao do nitrito.
A morfologia das bactrias com capacidade de reduzir o nitrato, isoladas e
identificadas atravs do sistema API 20E, foi observada por microscopia ptica de campo
claro, aps a realizao de colorao de Gram.
Os resultados obtidos mostraram que as bactrias identificadas como pertencentes ao
gnero Pseudomonas surgiram como bacilos de Gram-negativo, longos e direitos, com
dimenses de 0,5 um de largura e 1,2 um de comprimento (Figura 5.20).

As bactrias identificadas como pertencentes ao gnero Flavobacterium surgiram

como bacilos de Gram-negativo, com extremidades arredondadas e com dimenses em mdia
de 0,5 um de largura e 0,8 um de comprimento (Figura 5.21).
As bactrias identificadas como pertencentes ao gnero Achromobacter surgiram
como bacilos de Gram-negativo, com dimenses em mdia de 0,4 um de largura e 0,7 um de
comprimento (Figura 5.22).
As bactrias identificadas como pertencentes ao gnero Moraxella surgiram como
bacilos de Gram-negativo, com dimenses em mdia 0,5 um de largura e 1,3 um de
As bactrias identificadas como pertencentes ao gnero Pasteurella surgiram como
bacilos de Gram-negativo, com dimenses em mdia de 0,5 um de largura e 1,3 um de
As bactrias identificadas como Escherichia coli surgiram como bacilos de
Gram-negativo, com dimenses em mdia de 0,5 um de largura e 1 um de comprimento
(Figura 5.25).
As bactrias identificadas como pertencentes ao gnero Serratia surgiram como
bacilos de Gram-negativo, com dimenses em mdia de 0,4 um de largura e 0,7 um de
As bactrias identificadas como pertencentes ao gnero Enterobacter surgiram como
bacilos de Gram-negativo, com dimenses em mdia de 0,4 um de largura e 1 um de
Figura 5.20: Clulas de Pseudomonas submetidas colorao de Gram.

Figura 5.21: Clulas de Flavobacterium submetidas colorao de Gram.
Figura 5.22: Clulas de Achromobacter submetidas colorao de Gram.
I v* v,
-o
^ At
I*
Figura 5.23: Clulas de Moraxella submetidas colorao de Gram

(a) (b)
Figura 5.24: Clulas de Pasteurella submetidas colorao de Gram.
Figura 5.25: Clulas de Escherichia col i submetidas colorao de Gram.
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*
v
10um * *
.V
(a) (b)
Figura 5.26: Clulas de Serrada submetidas colorao de Gram.

Figura 5.27: Clulas de Enterobacter submetidas colorao de Gram.
Os resultados deste estudo mostraram que o solo um ambiente rico para o isolamento
de bactrias e que pode ser um material de estudo bastante simples para que alunos do 3 o
Ciclo do Ensino Bsico e Secundrio o utilizem para isolar e caracterizar bactrias envolvidas
no ciclo do azoto.
As galerias API 20E, mostraram ser um instrumento valioso para a identificao de
bactrias do solo e, pela sua aplicao simples e acessvel, podem ser facilmente utilizadas
pelos alunos a este nvel, permitindo que estes identifiquem algumas bactrias envolvidas no
ciclo do azoto, presentes no solo.

6. APLICAO NO PROCESSO DE ENSINO-APRENDIZAGEM

APLICAO NO PROCESSO DE ENSINO-APRENDIZAGEM
6. APLICAO NO PROCESSO DE ENSINO-APRENDIZAGEM
A temtica do ciclo do azoto, objecto de estudo deste trabalho, engloba uma vasta rea
do conhecimento e a sua aplicao em processos de ensino-aprendizagem abrangente,
permitindo uma diversidade de percursos pedaggicos.
O ciclo do azoto pode ser abordado na sua globalidade, como exemplo de um ciclo
biogeoqumico, ou pode ser focalizado qualquer um dos processos que o integram, bem como
os microrganismos intervenientes. Esta temtica permite tambm enquadrar uma componente
experimental, importante no ensino da Cincia, bem como fazer uma ligao entre os avanos
cientficos e a sua aplicao tecnolgica.
Seja qual for a finalidade do processo de ensino-aprendizagem, procurou-se
desenvolver um trabalho com interesse pedaggico, capaz de constituir um recurso de
informao/inspirao para professores e tambm para alunos.
Relativamente ao conjunto de aces, estratgias e actividades a planificar pelo
docente para o adequado desenvolvimento das competncias em causa, reconhece-se que a
deciso final sobre a melhor alternativa a seguir ser do professor, em funo das finalidades
do seu ensino, dos alunos, da natureza do tema e do nvel de tratamento do mesmo. No
entanto, consensual a utilizao de um conjunto de metodologias, nomeadamente a
organizao do ensino com base em materiais e recursos diversificados, dando ateno a
situaes do quotidiano, prevendo a experimentao de tcnicas, instrumentos, formas de
trabalho diversificados e a utilizao de fontes de informao diversas e das tecnologias da
informao e comunicao. A promoo intencional de actividades dirigidas observao e
ao questionamento da realidade e integrao de saberes permitem ao aluno fazer escolhas,
confrontar pontos de vista e resolver problemas, rentabilizando a autonomia,
responsabilizao e criatividade. A organizao de actividades cooperativas de aprendizagem
e projectos orientados para a integrao e troca de saberes permitem que os alunos tomem
conscincia de si, dos outros e do meio ambiente.
Como j foi referido anteriormente, a temtica do ciclo do azoto pode ser abordada nas
disciplinas de Cincias Fsicas e Naturais (3 o Ciclo do ensino Bsico), Ecologia (10 ano
Ensino Secundrio) e Biologia (12 ano Ensino Secundrio).
Relativamente s Cincias Fsicas e Naturais, o ciclo do azoto enquadra-se nos temas
organizadores Sustentabilidade na Terra e Viver melhor na Terra.
E S T U D O D O CICLO D O AZOTO. U M A APLICAO PARA o ENSINO. 73

No tema Sustentabilidade na Terra, optar pela incluso da temtica do ciclo do azoto

permite estabelecer um fio condutor pertinente entre os vrios sub-temas envolvidos. Esta
temtica deve ser explorada numa perspectiva de educao ambiental. A questo central Por
que esto os ecossistemas em equilbrio dinmico? pode estar subjacente aos percursos
educativos que visem a compreenso dos mecanismos fundamentais do funcionamento e
equilbrio dos ecossistemas, tendo em vista o desenvolvimento de aces que contribuam para
a sustentabilidade na Terra.
No sub-tema Interaco seres vivos - ambiente, o estudo das relaes interespecficas
permite enquadrar os diversos exemplos de relaes simbiticas no mbito do ciclo do azoto.
Sugere-se a discusso de exemplos concretos observados directamente (o que perfeitamente
possvel no que diz respeito s plantas leguminosas envolvidas) ou atravs de imagens.
No sub-tema seguinte, Fluxos de energia e ciclo de matria, deve ser realada a
existncia nas comunidades de grupos de seres vivos com actividades que possibilitam a
reciclagem permanente da matria orgnica. Estabelecendo uma ponte com o sub-tema
anterior, no qual foram referidos seres vivos intervenientes no ciclo do azoto, sugere-se agora
a interpretao de um esquema simplificado do ciclo do azoto, a ttulo exemplificativo dos
ciclos biogeoqumicos.
Seguem-se as Perturbaes do equilbrio dos ecossistemas. A poluio constitui uma
das principais causas do desequilbrio dos ecossistemas. Fontes de poluio, agentes
poluentes e consequncias da poluio so vertentes a serem exploradas neste sub-tema.
Sugere-se o contacto dos alunos com problemas reais, podendo constituir temas de discusso,
por exemplo, o efeito de estufa, o buraco do ozono, as chuvas cidas, entre outros. Ou seja, as
alteraes antropognicas do ciclo do azoto, as suas causas e consequncias, enquadram-se
perfeitamente neste contexto, estabelecendo continuidade com o facto de o ciclo do azoto ter
sido o exemplo de um ciclo biogeoqumico, permitindo uma viso sistmica e integradora de
saberes.
No sub-tema Gesto sustentvel dos recursos, a questo norteadora Como podemos
contribuir para a sustentabilidade da Terra? constitui uma base de trabalho adequada para a
realizao de actividades de pesquisa. Uma actividade interessante uma visita de estudo a
uma Estao de Tratamento de guas Residuais (ETAR), proporcionando aos alunos o
contacto com diferentes processos, nomeadamente biolgicos, pelos quais possvel o
tratamento das guas residuais. Aqui, inserida novamente a temtica do ciclo do azoto,
seguindo a linha condutora estabelecida at ento, realando-se o envolvimento dos processos
de nitrificao e desnitrificao no tratamento de guas residuais, bem como a importncia

APLICAO N O PROCESSO DE ENSINO-APRENDIZAGEM
dos microrganismos responsveis. Esta abordagem permite relacionar o conhecimento

cientfico com as aplicaes tecnolgicas com vista rentabilizao dos recursos e
sustentabilidade na Terra. Permite ainda abordar os conhecimentos mais recentes relativos ao
ciclo do azoto, a oxidao anaerbia do amonaco, e a possibilidade da sua utilizao para um
tratamento mais eficaz das guas residuais.
Seja qual for a abordagem escolhida pelo professor, o estudo do ciclo do azoto
enquadra-se licitamente nas orientaes curriculares e competncias a desenvolver definidas
pelo Ministrio da Educao (Tabela 6.1).
Tabela 6.1: Competncias essenciais definidas no Currculo Nacional do Ensino Bsico para Cincias Fsicas e
Naturais.
Sustentabilidade na Terra
Reconhecimento de que a interveno humana na Terra, ao nvel da explorao, transformao e gesto sustentvel dos
recursos, exige conhecimento cientfico e tecnolgico em diferentes reas.
Discusso sobre as implicaes do progresso cientfico e tecnolgico na rentabilizao dos recursos.
Compreenso de que a dinmica dos ecossistemas resulta de uma interdependncia entre seres vivos, materiais e processos.
Compreenso de que o funcionamento dos ecossistemas depende de fenmenos envolvidos, de ciclos de matria, de fluxos
de energia e da actividade de seres vivos, em equilbrio dinmico.
Reconhecimento da necessidade de tratamento de materiais residuais, para evitar a sua acumulao, considerando as
dimenses econmicas, ambientais, polticas e ticas.
Reconhecimento da importncia da conservao da variabilidade de espcies para a manuteno da qualidade ambiental.
Tomada de deciso face a assuntos que preocupam as sociedades, tendo em conta factores ambientais, econmicos e
sociais.
Divulgao de medidas que contribuam para a sustentabilidade na Terra.
O tema Viver melhor na Terra permite uma viso mais alargada e at transversal e
transdisciplinar da temtica do ciclo do azoto. Esta pode ser abordada como problemtica na
realizao de projectos a desenvolver em ligao com a rea Projecto inseridos no sub-tema
Cincia e Tecnologia e Qualidade de Vida. Neste mbito, possvel relacionar todos os
conceitos envolvidos, desde a importncia da diversidade dos microrganismos e dos processos
biolgicos no equilbrio dos ecossistemas, at s vrias causas da alterao desse equilbrio e
suas consequncias ou s vias de preveno e tratamento. Aqui ser importante referir as
Estaes de Tratamento de guas Residuais e os processos biolgicos nelas envolvidos,
nomeadamente o processo mais recentemente descoberto, a oxidao anaerbia do amonaco.
Assim, possvel uma abordagem num movimento Cincia-Tecnologia-Sociedade-Ambiente,
integrando os saberes e inovaes de um modo realista e apelativo. Uma vez que a Area
Projecto possui uma dimenso temporal prpria e mais alargada existe a possibilidade de
ESTUDO DO CICLO D O AZOTO. U M A APLICAO PARA o ENSINO. 75

APLICAO N O PROCESSO DE ENSINO-APRENDIZAGEM
inserir uma componente experimental adequadamente adaptada pelo professor de acordo com
a situao de ensino-aprendizagem.
Seja qual for o caminho escolhido pelo professor, o estudo do ciclo do azoto
enquadra-se licitamente nas orientaes curriculares e competncias a desenvolver definidas
pelo Ministrio da Educao (Tabela 6.2).
Tabela 6.2: Competncias essenciais definidas no Currculo Nacional do Ensino Bsico para Cincias Fsicas e
Naturais.
Viver melhor na Terra
Reconhecimento da necessidade de desenvolver hbitos de vida saudveis e de segurana, numa perspectiva biolgica,
psicolgica e social.
Reconhecimento da necessidade de uma anlise crtica face s questes ticas de algumas das aplicaes cientficas e
tecnolgicas.
Conhecimento das normas de segurana e de higiene na utilizao de materiais e equipamentos de laboratrio e de uso
comum, bem como o respeito pelo seu cumprimento.
Compreenso de como a cincia e da tecnologia tm contribudo para a melhoria da qualidade de vida.
Compreenso dos conceitos essenciais relacionados com a utilizao de recursos e proteco ambiental que devem
fundamentar a aco humana no plano individual e comunitrio.
Valorizao de atitudes de segurana e de preveno como condio essencial em diversos aspectos relacionados com a
qualidade de vida.
A nvel do ensino secundrio, a abordagem de conceitos pode efectuar-se a um nvel

mais profundo.
Em Ecologia (10 ano), o estudo do ciclo do azoto pode efectuar-se ao nvel da
unidade Estrutura e Funcionamento dos Ecossistemas, permitindo atingir as competncias
definidas pelo Ministrio da Educao (Tabela 6.3).
Tabela 6.3: Competncias essenciais definidas no Programa de Ecologia - 10 Ano.

Estrutura e Funcionamento dos Ecossistemas
Perceber que o mundo vivo depende da circulao de materiais atravs dos ecossistemas.
Compreender que os nutrientes minerais circulam na biosfera em ciclos fechados.
Compreender que os ciclos biogeoqumicos envolvem compartimentos biolgicos, geolgicos e qumicos, com tempos de
residncia distintos.
Perceber o papel do ciclo do azoto na circulao dos nutrientes.
Compreender o papel dos microrganismos na absoro dos nutrientes pelas plantas.
Discutir as alteraes provocadas pelo Homem nos ciclos biogeoqumicos e as suas consequncias nos sistemas naturais.
Reflectir sobre o efeito das actividades humanas sobre os ciclos biogeoqumicos.
Desenvolver uma atitude favorvel relativamente manuteno da qualidade do ambiente.
ESTUDO DO CICLO DO AZOTO. UMA APLICAO PARA O ENSINO.

Pretende-se a formao de indivduos conscientes dos problemas ambientais e da

necessidade de assegurar um desenvolvimento sustentvel, sendo necessria a aquisio de
um conjunto de conhecimentos sobre o funcionamento dos processos relevantes para o
funcionamento dos ecossistemas. O ciclo do azoto surge como exemplo de ciclo
biogeoqumico mas, a este nvel, pode ser abordado de um modo mais complexo,
aprofundando-se quer os vrios processos, quer a contribuio dos vrios grupos de
microrganismos. A importncia prtica deste assunto pode ser demonstrada recorrendo a
fenmenos actuais que actuam em escala global relacionados com alteraes provocadas pelo
Homem nos ciclos biogeoqumicos, designadamente chuvas cidas, buraco do ozono, excesso
de azoto. Este tipo de abordagem permite uma viso integradora, estabelecendo a ponte entre
o conhecimento e a aco.
Em Biologia (12 ano), esta temtica pode ser inserida na unidade Preservar e
Recuperar o Meio Ambiente, numa perspectiva de educao ambiental, sendo a nfase
colocada nos contaminantes do meio ambiente e seus efeitos fisiolgicos e no tratamento de
resduos (Tabela 6.4).
Tabela 6.4: Competncias essenciais definidas no Programa de Biologia - 12o Ano.

Preservar e Recuperar o Meio Ambiente
Identificao dos principais contaminantes ambientais e suas fontes e avaliao dos seus riscos para a sade.
Compreenso das consequncias dos contaminantes nos ecossistemas.
Recolha e organizao de dados de natureza diversa sobre sistemas utilizados para diminuir as emisses para a atmosfera e
tratamento de resduos.
Compreenso do papel dos seres vivos na reciclagem de materiais.
Compreenso da utilizao de microrganismos para a diminuio da matria orgnica presente nos resduos.
Aplicao de conhecimentos para interpretar problemticas com impacto social;
Problematizao de situaes do dia-a-dia.
Reflexo e desenvolvimento de atitudes crticas, conducentes a tomadas de decises fundamentadas sobre problemas
ambientais causados pela actividade humana.
Valorizao dos avanos cientfico-tecnolgicos na preservao do meio ambiente.
Reconhecimento que o crescimento demogrfico, a degradao ambiental e os avanos cientficos e tecnolgicos
condicionam a qualidade de vida do Homem.
Partindo da questo central Que solues para os efeitos da actividade humana sobre
o ambiente?, podem formular-se novas questes orientadoras, tais como Que actividades
humanas tm contribudo para a contaminao da atmosfera, solo e gua? Quais os
principais contaminantes ambientais? Quais os seus efeitos no ambiente? E nas pessoas? Os
alunos podem identificar e analisar situaes de desequilbrio ambiental. Ter interesse a

interpretao de quadros, grficos e/tabelas e esquemas relativos ao funcionamento das

Estaes de Tratamento de guas Residuais. A visita a uma ETAR promove a compreenso
dos diferentes processos envolvidos no tratamento de resduos e a importncia dos
microrganismos na reciclagem de materiais. Mais uma vez, pode estabelecer-se a ligao
entre os avanos da Cincia e a sua implicao na sociedade.
Seguidamente, apresenta-se uma planificao para um conjunto de aulas que de
alguma forma resume os diversos aspectos anteriormente desenvolvidos.

6.1. Uma aplicao para o ensino
Estrutura e Funcionamento dos Ecossistemas - Ciclo do Azoto

Preservar e Recuperar o Meio Ambiente
Planificao a mdio prazo
Questes
Competncias/Valores/Atitudes Estratgias
orientadoras
Conhecer o funcionamento dos Dilogo com a turma: reflexo sobre a
processos naturais mais relevantes importncia do azoto para os seres vivos.
para o funcionamento dos Introduo ao ciclo do azoto: interpretao de

ecossistemas. Como se caracteriza o um esquema geral do ciclo do azoto.
Desenvolver capacidades de ciclo do azoto? Trabalho por pesquisa: diviso da turma em
abstraco e de raciocnio lgico grupos de trabalho - cada grupo efectuar
necessrias procura de solues. pesquisa sobre um dos processos do ciclo do
Quais os vrios azoto focados anteriormente.
Pesquisar, seleccionar e
processos do ciclo do
organizar informao, com recurso Interaco grupai: cada um dos grupos
azoto?
a mltiplas fontes. apresenta turma os resultados da sua pesquisa.
Utilizar de forma crtica e Elaborao conjunta de um quadro-sntese
responsvel as tecnologias de sobre o ciclo do azoto:
informao e de comunicao. Processo Descrio Microrganismos
Qual o papel dos
Desenvolver o sentido de Fixao
microrganismos no
responsabilidade e de conscincia biolgica do
ciclo do azoto?
crtica necessrio participao azoto
activa face aos desafios ambientais atmosfrico
que se colocam. Amonificao
Participar nas discusses e Nitrificao
tomadas de deciso ponderando os Desnitrificao

riscos ambientais.
Promover a formao de Reflexo acerca da diversidade dos

indivduos conscientes dos microrganismos envolvidos e da sua
problemas ambientais e da importncia - concretizar a sua existncia atravs
necessidade de assegurar um de imagens de vrios microrganismos.
desenvolvimento sustentvel. Como se caracteriza a Aprofundar a importncia das bactrias que
Desenvolver o sentido de relao de simbiose estabelecem simbiose com plantas leguminosas
cooperao, de respeito e de entre bactrias para a assimilao de compostos azotados.
esprito de equipa necessrio ao fixadoras do azoto Exemplos de simbioses entre bactrias
exerccio de uma cidadania atmosfrico e as fixadoras de azoto atmosfrico e plantas
interventiva. plantas leguminosas? leguminosas: visualizao de imagens de

Compreender que o mundo sistemas radiculares com ndulos,
vivo depende da circulao de [os alunos podem procurar obter plantas com
materiais atravs dos ecossistemas. ndulos radiculares e se possvel pode

proceder-se a um trabalho laboratorial para
Reconhecer a importncia do
observao de Rhizobium].
azoto no mundo vivo.
Interpretao do esquema representativo da
Compreender o papel do ciclo
Como se formam os formao de ndulos radiculares explicao da
do azoto na circulao de
ndulos radiculares? dinmica envolvida nas diversas fases.
nutrientes.
Dinmica metablica da relao de simbiose:
Conhecer os diversos
benefcios para a bactria e para a planta.
processos envolvidos no ciclo do
azoto. O conhecimento cientfico uma construo
permanente - processo recentemente descoberto:
Compreender o papel dos
oxidao anaerbia de amonaco
microrganismos no ciclo do azoto.
("anammox") - descrio geral.
Reconhecer a importncia da
Completar o quadro-sntese sobre o ciclo do
diversidade biolgica no equilbrio
azoto elaborado anteriormente com este novo
dos ecossistemas.
processo.
Conhecer os novos avanos
Quais so as Reflexo sobre o efeito das actividades
cientficos no mbito do ciclo do
alteraes provocadas humanas no ciclo do azoto - identificao de
azoto.
pelo Homem no ciclo problemas ambientais relacionados, pesquisa,
Discutir as alteraes
do azoto? recolha de dados, anlise e interpretao dos
provocadas pelo Homem no ciclo
mesmos.
do azoto e as suas consequncias.
Quais so as suas Elaborao de um quadro-sntese com
Compreender o papel dos seres
consequncias? apresentao de solues sugeridas pelos alunos:
vivos na reciclagem de materiais.
Poluente Origem Efeito Soluo
Desenvolver uma atitude
Como solucionar
consciente, crtica e fundamentada
alguns desses
face aos efeitos das actividades
problemas
humanas sobre o ambiente.
ambientais?
Perspectivar solues que
contribuam para o equilbrio Qual a importncia [Quando abordada a questo dos efluentes e do
ecolgico. dos avanos seu tratamento (ETAR), salientar o papel dos
Desenvolver uma atitude cientfico-tecnolgicos microrganismos no tratamento de guas residuais
favorvel relativamente na preservao do e a aplicao dos avanos cientficos
manuteno da qualidade do meio ambiente? ("anammox")].
ambiente.

7. CONCLUSO

CONCLUSO
7. CONCLUSO
O estudo realizado no mbito do ciclo do azoto permitiu aprofundar os conhecimentos

acerca dos diferentes processos que o caracterizam, com especial relevo para os
microrganismos e reaces enzimticas envolvidas, assim como a dinmica entre os diversos
processos e a sua importncia ecolgica. Um desses processos, a oxidao anaerbia do
amonaco ("anammox"), por ser um processo descoberto na ltima dcada e portanto uma
promissora rea de pesquisa cientfica, foi um processo que mereceu um interesse muito
especial neste estudo.
A componente experimental realizada neste trabalho envolveu a tcnica de
hibridizao in situ com fluorescncia (FISH), que actualmente tem demonstrado um enorme
potencial para a deteco de Planctomycetes. Esta tcnica permitiu que em amostras
provenientes de uma estao de tratamento de guas residuais fosse detectada a presena de
bactrias deste grupo. Alguns Planctomycetes so responsveis pela oxidao anaerbia do
amonaco, de modo que a deteco de Planctomycetes nas amostras utilizadas revestiu-se de
grande interesse e encoraja o desenvolvimento de futuros estudos para a sua identificao.
As restantes tcnicas utilizadas neste trabalho permitiram o isolamento de outros
microrganismos envolvidos no ciclo do azoto. Ao contrrio da hibridizao in situ com
fluorescncia, de maior complexidade, este conjunto de metodologias pode ser transposto
para processos de ensino-aprendizagem, sendo de salientar que, dada a disponibilidade
temporal e conceptual exigidas, se enquadram perfeitamente num contexto de projecto.
Considerando o ciclo do azoto na sua totalidade ou em qualquer uma das suas partes,
de acordo como os objectivos definidos para a situao de ensino-aprendizagem em questo, a
utilizao das tcnicas e dos resultados obtidos neste trabalho permitir a concretizao de
conceitos por vezes abstractos, numa perspectiva de diversidade biolgica e importncia dos
microrganismos no equilbrio dos ecossistemas. Deste modo, os conhecimentos tericos e
prticos adquiridos no mbito do estudo do ciclo do azoto contribuiro decisivamente para
melhorar o desempenho dos agentes envolvidos no processo de ensino-aprendizagem: o
professor, directamente, pelo investimento na formao, actualizao de saberes e sua
mobilizao na prtica docente, e o aluno, como reflexo desse investimento, com uma melhor
compreenso da temtica em estudo.

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Ao Ricardo, por tudo.

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No presente trabalho, foram aprofundados os conhecimentos acerca das actividades

Le cycle de l'azote joue un rle essentiel dans la manutention du quilibre de la

3. ALTERAES ANTROPOGNICAS N O CICLO D O AZOTO - CAUSAS E

6. APLICAO NO PROCESSO DE ENSINO-APRENDIZAGEM 72

6.1. Uma aplicao para o ensino 79

ESTUDO DO CICLO DO AZOTO. UMA APLICAO PARA O ENSINO. 1

Actualmente o ensino das Cincias visa a compreenso da Cincia e da Tecnologia,

E S T U D O D O CICLO D O AZOTO. U M A APLICAO PARA O ENSINO. 2

partir deste estudo, procedeu-se elaborao de uma proposta de aplicao em processos de

1.1. Os desafios da Educao

No despontar de um novo sculo, a educao considerada como um instrumento

E S T U D O D O CICLO D O AZOTO. U M A APLICAO PARA O ENSINO. 3

aprender a ser para um bom desenvolvimento da prpria personalidade, capacidade de

1.2. Cincia e Educao

O ensino da Cincia est freqentemente centralizado nos produtos da Cincia,

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modo exclusivamente terico e livresco, enfatizando a memorizao. O ensino da Cincia

A sociedade de informao hoje instalada gera uma imensa corrente de informao

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pensamento e de atitudes favorveis aprendizagem. A clarificao de competncias

Esta nova perspectiva de ensino, centrada numa concepo epistemolgica marcada

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Cabe ao professor abordar os contedos com base em situaes e problemas do

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1.3. Importncia do ciclo do azoto e do seu estudo

O ciclo do azoto desempenha um papel importante na manuteno do equilbrio da

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1.4. Enquadramento educativo do tema nas orientaes curriculares do

A anlise da estrutura curricular do Ensino Bsico (3 o Ciclo) e do Ensino Secundrio e

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ensino secundrio, da adopo de referenciais de valor relativos a princpios orientadores do

Com o presente trabalho pretendeu-se aprofundar os conhecimentos acerca das

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O azoto molecular ou dinitrognio (N2) o composto gasoso mais abundante na

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2.1. Fixao do azoto atmosfrico

A fixao biolgica do azoto atmosfrico consiste na reduo de azoto molecular (N2)

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Cerca de 90% das plantas leguminosas apresentam capacidade de nodulao, no

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Tabela 2.1: Exemplos de diversas espcies de Rhizobium e respectivas plantas hospedeiras

Outra associao simbitica ocorre entre Actinomycetes do gnero Frankia e plantas

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2.1.1. Sistema enzimtico nitrogenase

A fixao biolgica do azoto atmosfrico catalisada pelo sistema enzimtico

N 2 + 8e~ + 8 ^ + nMgATP - * 2NH3 + H2 + nMgADP + nPj

O sistema nitrogenase constitudo por duas metaloprotenas, designadas

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hidrlise de Mg-ATP e a transferncia de electres do grupo Fe4S4 para o grupo P da

Dinitrogenase redutase Dinitrogenase

A reduo de azoto atmosfrico exige, alm de uma grande quantidade de ATP