UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD RECURSOS NATURALES RENOVABLES

INGENIERIA CONSERVACION SUELOS Y AGUA

ACTIVIDAD BACTERICIDA Y FUNGICIDA DEL EXTRACTO DE CORTEZA Y

HOJA DE Calycophyllum spruceanum (Capirona)

ALUMNA : CAMONES CELESTINO, Olivia

DOCENTE : LEVANO CRISOSTOMO, Jos

CURSO : METODOLOGIA DE INVESTIGACION

Tingo Mara Per

2016
 I. INTRODUCCION

La especie Calycophyllum spruceanum es una especie que se encuentra

presente con bastante regularidad en los bosques aluviales y secundarios de la

amazonia peruana.

Especie helifila durable de rpido crecimiento, puede incrementar entre 4-6

milmetros. Presenta una demanda creciente en el mercado internacional de madera.

La presente investigacin tuvo como objetivo (Determinar el efecto de los extractos

acuosos de la hoja y corteza de la especie forestal Calycophyllum spruceanum ante

la actividad Bactericida y Fungicida). Es comn en bosques secundarios, pioneros y

tardos en los departamentos de Amazonas, San Martn, Hunuco, Madre de Dios,

Loreto y Ucayali. La especie es heliofita amiga del sol y vive asociada a otras

especies tales como Quinilla, Shihuahuaco, Quina Quina, entre otras. Crece en

comunidades denominadas capironales, en suelos pedregosos, mayormente

limosos o arenosos, aluviales y frtiles, en bosques ribereos, temporalmente

inundados.
 I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las enfermedades infecciosas representan un problema crtico para la

salud y son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el

mundo. La aparicin de resistencia de los microorganismos a algunos antibiticos

sintticos, junto con la toxicidad durante el tratamiento prolongado, hace que sea

necesario continuar la bsqueda de nuevas sustancias 1-4 antimicrobianas,

antifngicos en particular Candida albicans y Cryptococcus neoformans son hongos

patgenos frecuentemente implicados en las infecciones que amenazan la vida de

seres humanos, particularmente de pacientes con sistemas inmunes comprometidos.

(Wen, et al 2016).

Se considera que la mayor ventaja de la Capirona se encuentra en su

potencial teraputico que le otorga muchas posibilidades de desarrollo en la industria

mdica y farmacutica por lo que es necesario que se contine investigando las

propiedades de esta especie promisoria de la Amazona y cuyo incentivo traer

beneficios a la regin. (PERU ECOLOGICO; 2016).

Cul es la actividad Bactericida y Fungicida de los estratos acuosos de la hoja de y

corteza de la especie forestal Calycophyllum spruceanum (Capirona)?

 II. JUSTIFICACIN

Se conoce que aproximadamente un 80% de la poblacin mundial utiliza

plantas medicinales en la atencin primaria de la salud, y que cuatro de cada cinco

plantas utilizadas provienen de la recoleccin silvestre.

Los tratamientos actuales son la anfotericina B, flucitosina y el fluconazol.

La esporotricosis es una enfermedad crnica cutnea y subcutnea causada por el

hongo dimorfo Sporothrix schenckii que es el agente ms comn de las micosis

subcutneas en Amrica Latina. La terapia estndar para esta enfermedad se basa

principalmente en el itraconazol; sin embargo, el yoduro de potasio es el frmaco de

eleccin en los pases en desarrollo debido a su bajo costo. Aunque los actuales

frmacos disponibles suelen ser eficaces, los fracasos teraputicos y la toxicidad

despus de la larga duracin del tratamiento son comunes, por lo que es necesario

explorar nuevas alternativas para el tratamiento de 5-11 infecciones graves. Las

plantas medicinales y sus extractos son ampliamente utilizados por los practicantes

de la medicina tradicional para curar diversas enfermedades. La creciente aceptacin

de la medicina tradicional como una forma alternativa de atencin de la salud y la

bsqueda de 12,13 nuevos agentes antifngicos a partir de plantas medicinales, se

ha vuelto muy importante. (WEN, et al 2016).

 La selva y los productos naturales estn en la mira de la industria

farmacutica mundial y especialmente en la del mercado de productos herbarios de

los pases del norte, consecuentemente, la demanda se incrementar cada vez ms,

lo que significar una mayor presin sobre las especies selvticas.

Se considera que la mayor ventaja de la Capirona se encuentra en su

potencial teraputico que le otorga muchas posibilidades de desarrollo en la industria

mdica y farmacutica por lo que es necesario que se contine investigando las

propiedades de esta especie promisoria de la Amazona y cuyo incentivo traer

beneficios a la regin.

La Capirona tiene mltiples propiedades medicinales: su corteza en

infusin es til para infecciones oculares, la diabetes y males ovricos, en emplastos

es muy buen cicatrizante y antimictico. La savia de este rbol tiene propiedades

cosmticas, borra las manchas y cicatrices en la piel y previene las arrugas. (PERU

ECOLOGICO; 2016).
 III. OBJETIVOS

3.1. Objetivo general

Determinar el efecto de los extractos acuosos de la hoja y corteza de la

especie forestal Calycophyllum spruceanum ante la actividad Bactericida y

Fungicida.

3.2. Objetivos especficos

- Determinar el rendimiento de la obtencin de extracto de hoja y corteza de la

especie Calycophyllum spruceanum (Capirona).

- Determinar la Actividad antifungicida y bactericida a diferentes dosis de la

corteza de Calycophyllum spruceanum (Capirona).

- Determinar la Actividad antifungicida y bactericida a diferentes dosis de la hoja

de Calycophyllum spruceanum (Capirona).

- Determinar la dosis de mayor efectividad antifungicida y bactericida.

 IV. REVISIN DE LITERATURA

2.1. Distribucin de la especie Calycophyllum spruceanum (Capirona).

La Capirona se encuentra distribuida en los bosques primarios y

secundarios de la Amazona del Per y Brasil, en terrenos peridicamente inundados

o no y en las formaciones ecolgicas de bosque seco tropical (bs-T), bosque hmedo

tropical (bh-T) y bosque muy hmedo tropical (bmh-T), por debajo de los 1 200

metros sobre el nivel del mar. Es comn en bosques secundarios, pioneros y tardos

en los departamentos de Amazonas, San Martn, Hunuco, Madre de Dios, Loreto y

Ucayali. La especie es heliofita amiga del sol y vive asociada a otras especies tales

como Quinilla, Shihuahuaco, Quina Quina, entre otras. Crece en comunidades

denominadas capironales, en suelos pedregosos, mayormente limosos o arenosos,

aluviales y frtiles, en bosques ribereos, temporalmente inundados.

Existe en regulares cantidades en la Amazona del Per, segn los

resultados de los inventarios forestales disponibles y de acuerdo a las zonas. El

volumen bruto estimado de la Capirona asciende a 4,5 m/ha. (WWF, et al 2014).

2.2. Anlisis Qumicos

El valor obtenido de extractivos AB (alcohol-benceno) de la Capirona es

bajo, si lo comparamos con otras maderas como el Cachimbo, la Quinilla o el

Estoraque. Los valores de slice para la Capirona son muy bajos. Generalmente se

considera que una madera puede ser abrasiva cuando sus valores de slice superan

el 0,5% (caso de la Manchinga o el Cachimbo). Presenta poder calorfico muy alto,

arde muy fresca, por ello es apreciada como lea. (WWF, et al 2014).

Composicin:

- Extractivos AB (alcohol benceno): 2.2%.

- Hemicelulosa: 18,6%.

- Celulosa: 59,71%.

- Slice: 0,14%.

2.3. Caractersticas de Durabilidad e Impregnabilidad

La Capirona es moderadamente resistente al ataque biolgico, no

requiere preservacin. Es una madera durable, especialmente en elementos fuera

del contacto con el suelo, se recomienda apilarla utilizando separadores para evitar

la aparicin de hongos cromgenos. Luego de secarla en horno adquiere una gran

durabilidad. Para disminuir el riesgo de colapso y rajaduras esta especie requiere de

Un tratamiento de desflemado o lavado contra corriente de agua, para eliminar

sustancias que pueden causar tensiones en la madera. (WWF, et al 2014).

2.4. Medicina tradicional y su empleo en el tiempo

La medicina tradicional utiliza alrededor de 20,000 especies de vegetales

superiores (TAGBOTO y TOWNSON, 2001) y se calcula que unos 3300 millones de

personas en el mundo utilizan regularmente este tipo de medicina (ELOFF, 1998); lo

que incluye tanto la poblacin de pases en desarrollo como desarrollados; por

ejemplo, en 1997 un 12,1% de los norteamericanos se automedic con productos

vegetales, lo que significa un monto en ventas de 4 a 5 mil millones de dlares

(PITTLER, 2002). Este inters por la medicina tradicional se refleja en la

investigacin de vegetales medicinales con posible efecto contra las bacterias

resistentes a los antibiticos. Un ejemplo de ello es la bacteria Helicobacter pylori

cuyo aumento de cepas resistentes a los antibiticos empleados en su tratamiento y

el alto costo de esos tratamientos, es un aliciente en pases en desarrollo donde la

prevalencia de este agente es mayor, para el uso de la medicina natural (TAGBOTO

y TOWNSON, 2001).

Algunos ejemplos de este tipo de investigacin los encontramos en la

evaluacin de vegetales medicinales en Kenia (FABRY et al., 1996) y en la pennsula

Yucateca, Mxico (ANKLI et al., 2002). En el primer estudio se identificaron tres

especies: Terminalia spinosa, Harrisonia abyssinica y Ximenia caffra, cuyas

Concentraciones inhibitorias mnimas (CIM) fueron de 125 mg/mL en la primera y de

250 mg/mL en las otras dos. En el estudio mexicano se encontraron cuatro especies
cuyas CIM fueron como mximo de 10 mg/mL; stas fueron: Casimiroa tetrameria,

Dostenia contrajerva, Jatropha gaumeri y Piscidia piscipula.

2.5. Plantas usadas con efecto medicinal antifngico y anti bactericida

La evaluacin de Pteleopsis suberos, una especie empleada en frica en

el tratamiento de las lceras, mostr que presentaba efectos anti-Helicobacter

(GERMAN et al., 1998). Otros estudios han sealado el efecto antibacteriano de las

catepsinas aisladas de Camellia sinensis t, que en las concentraciones usuales de

una taza inhiben a cepas de Staphylococcus aureus meticilina resistentes (YAM et

al., 1997) y en el caso de Helicobacter la CIM fue de 8 mg/mL, resultando en un

descenso significativo en las alteraciones histopatolgicas inducidas

experimentalmente en animales de laboratorio inoculados experimentalmente (MABE

et al., 1999); adems, en un estudio se compar el consumo de t en dos grupos de

individuos, infectados y no infectados con H. pylori, encontrndose que en los

primeros haba un menor consumo de t que en los segundos; lo que plantea la

posibilidad de que el consumo de t podra interferir con la infeccin por H. pylori

(YEE et al., 2002).

Algunos ejemplos de investigacin encontramos en la evaluacin de

vegetales medicinales en Kenia (FABRY et al., 1996) y en la pennsula Yucateca,

Mxico (ANKLI et al., 2002). En el primer estudio se identificaron tres especies:

Terminalia spinosa, Harrisonia abyssinica y Ximenia caffra, cuyas concentraciones

inhibitorias mnimas (CIM) fueron de 125 mg/mL en la primera y de 250 mg/mL en las

otras dos. En el estudio mexicano se encontraron cuatro especies cuyas CIM fueron
como mximo de 10 mg/mL; stas fueron: Casimiroa tetrameria, Dostenia

contrajerva, Jatropha gaumeri y Piscidia piscipula.

La evaluacin de Pteleopsis suberos, una especie empleada en frica en

el tratamiento de las lceras, mostr que presentaba efectos anti-Helicobacter

(GERMAN et al., 1998). Otros estudios han sealado el efecto antibacteriano de las

catepsinas aisladas de Camellia sinensis t, que en las concentraciones usuales de

una taza inhiben a cepas de Staphylococcus aureus meticilina resistentes (YAM et

al., 1997) y en el caso de Helicobacter la CIM fue de 8 mg/mL, resultando en un

descenso significativo en las alteraciones histopatolgicas inducidas

experimentalmente en animales de laboratorio inoculados experimentalmente (MABE

et al., 1999); adems, en un estudio se compar el consumo de t en dos grupos de

individuos, infectados y no infectados con H. pylori, encontrndose que en los

primeros haba un menor consumo de t que en los segundos; lo que plantea la

posibilidad de que el consumo de t podra interferir con la infeccin por H. pylori

(YEE et al., 2002).

Algunas especies empleadas tanto en medicina como en condimentos de

cocina han mostrado efectos anti-Helicobacter, entre ellas el ajo (CELLINI et al.,

1996), tomillo (TABAK et al., 1996) y canela (NIR et al., 2000); algunos productos

extrados de este ltimo son efectivos en bajas concentraciones (CHUNG et al.,

1998; OHTA et al., 1999; O'GARA et al., 2000).

 Diversas plantas que han demostrado su actividad antimicrobiana en el

aparato respiratorio son el eucalipto (indicado para el asma, bronquitis, rinitis,

faringitis, amigdalitis, traqueitis y gripe), el tomillo (para la tos irritativa y

antiespasmdica, laringitis, bronquitis, asma enfisema y gripe), el marrubio (tos

improductiva, catarros), el llantn (bronquitis), el gordolobo (afecciones respiratorias

de vas altas y bajas), las yemas de pino o el romero (ORTEGA, 2005).

Otras especies de vegetales como el Haematoxylon brasiletto (palo de

Brasil), han sido reconocidas por la actividad biolgica de sus extractos etanlicos y

acuosos contra infecciones de origen alimentario especialmente contra diarreas

originadas por Vibrio cholerae, inhibiendo la produccin de enterotoxina y la adhesin

de la bacteria (ALARCN et al., 2004).

En la bsqueda de metabolitos secundarios que actan sobre bacterias

SILVA et al. (2004) determinaron que extractos hexnicos de races de Jatropha

dioica presentaban mayor actividad sobre Staphylococcus aureus y actividad

moderada sobre Escherichia coli y Salmonella typhimurium.

Se han estudiado plantas de las familias Myrtaceae (Syzygium

aromaticum, Eucaliptus camaldulensis y Psidium guajava) y Lauraceae

(Cinnamomum zeylanicum) de las cules se obtuvieron extractos con tres solventes

de distinta polaridad obtenindose actividad bactericida contra Staphylococcus

aureus, Bacillus cereus, Escherihcia coli y Shigella flexneri con los extractos
hexnicos obtenidos por maceracin a temperatura ambiente (ORANDAY et al.,

2004).

Se determin que los extractos de las hojas y races de la leguminosa

Dalea elegans, planta autctona de la provincia de Crdova, Argentina, contienen un

compuesto flavonoide denominado 6-prenilpinocembrina activo contra la bacteria

Staphylococcus aureus resistente al antibitico oxacilina y contra los hongos Candida

albicans, Cryptococcus neoformans y Trichopyton mentagrophytes (CABRERA et al.,

2004).

LAPENNA et al. (2003) reportan la evaluacin de la actividad bactericida

y fungicida en Plantago australis llantn, Petiveria alliacea mapurite, Mangifera

indica mango, Luffa cilndrica esponjilla, Psidium guense guayabo agrio y

Phthirusa sp. pajarito sobre cepas de Escherihcia coli enteropatognica, E. coli

enteroinvasiva, E. coli enterotoxignica, Klebsiella pneumoniae, Candida krusei y C.

albicans.

COSSIO et al. (2002) en Per, han encontrado un compuesto antifngico

en Tropaeolum tuberosum mashua, el cual se purific, caracteriz y cuantific su

actividad biolgica, el compuesto hallado fue el 4-metoxibencilsotiocinato.

En Chile se estudiaron 276 extractos de plantas para detectar actividad

antibacteriana frente a uno o ms microorganismos. Dentro de este grupo de plantas

la que se estudi con mayor nfasis fue Haploppapus multifolius, especie de la cual
se aislaron cumarinas con actividad antibacteriana y en los ltimos 20 aos se han

investigado ms de un centenar de plantas chilenas, con actividad antimicrobiana,

entre otras propiedades, aislndose un importante nmero de compuestos, muchos

de ellos de estructura nueva y actividad biolgica interesante (BITTNER, 2002).

Asimismo se han obtenido extractos bioactivos con actividad antifngica

a partir de la corteza de Pinus caribea var. hondurensias procedentes de

plantaciones forestales del oriente venezolano los cuales presentaron adems

actividad atrapadora de radicales libres (VARGA, 2002).

De Ibicella lutea, se aisl el principio activo antibacteriano, que posee

una buena potencia y espectro y una estructura qumica novedosa (VZQUEZ,

2001).

Como podemos observar las investigaciones realizadas han llevado a

considerar a la medicina tradicional como fuente de posibles vas de anlisis; as,

inicialmente se investiga el posible efecto antimicrobiano mediante pruebas de

inhibicin in vitro empleando extractos crudos de las plantas y en una segunda etapa

las investigaciones conducen al estudio de fracciones del extracto en bsqueda de

los principios activos. Posteriormente, se plantea la evaluacin in vivo, ya sea en

animales de experimentacin o con voluntarios.

 El nmero de estructuras qumicas descritas en plantas superiores llega

a los cientos de miles y est aumentando continuamente. Aproximadamente 1,500

estructuras qumicas nuevas de plantas superiores se describen cada ao, de las

cuales un buen nmero tiene actividad biolgica. Desafortunadamente los

conocimientos rudimentarios de la qumica y bioqumica de las plantas restringe

todava nuestra capacidad de explotar completamente los productos qumicos

naturales (BITTNER, 2002).

En una fase ms avanzada del estudio de plantas medicinales, la

identificacin de las molculas activas conduce a su modificacin para incrementar el

efecto antimicrobiano, como es el caso de flavonoides (BAE et al., 1999) y rotenoides

aislados de leguminosas (TAKASHIMA et al., 2002), lo que llev a la descripcin de

un nuevo rotenoide, conocido como derrisin, cuya CIM es de 85 mg/mL y a la

evaluacin de otros conocidos como el teflosin y el toxicarol cuyas CIM son de 0,3

mg/mL.

2.6. Composicin de plantas medicinales

El aprovechamiento de las especies forestales no slo es en el sentido

econmico maderero, sino que se pueden aprovechar productos forestales no

maderables (PFNM) que incluyen diversos tipos entre ellos vegetales medicinales,

aceites esenciales y extractos vegetales. Las sustancias extrables de los rboles

constituyen una fuente importante de fitoqumicos.

 Por sustancias extrables vegetales se entienden aquellas sustancias que

se extraen de diferentes partes de los rboles mediante agua, disolventes orgnicos,

vapor de agua y mediante un exprimido mecnico (ALVAREZ, 2003).

Entre las sustancias extrables de la corteza se encuentran los ms

diversos compuestos orgnicos e inorgnicos y su presencia en diferentes especies

es relativa. Se dividen en lipoflicos e hidroflicos, aunque no existen fronteras que

los delimiten. El contenido es superior que en la madera propiamente dicha. Vara

entre 20-40 % de masa de corteza seca. Incluye a un grupo heterogneo de

sustancias (SJSTRM, 1981).

La fraccin lipoflica, comprende sustancias extrables con disolventes

apolares (ter etlico, diclorometano, etc.). Consisten en grasas, ceras, terpenos y

terpenoides y alcoholes alifticos superiores. Los terpenos, cidos resinosos y

esteroles estn localizados en los canales resinferos. Abundan los triterpenoides: B-

sitosterol encontrados en ceras, betulinol (ALVAREZ, 2003).

La fraccin hidroflica, constituida por los extrables en agua sola o con

disolventes polares (acetona, alcohol etlico, etc.). Contienen grandes cantidades de

constituyentes fenlicos, muchos de ellos, especialmente taninos condensados

(cidos fenlicos) pueden ser extrados slo como sales con disolucin diluida de

lcali. Por ejemplo, una cantidad considerable de flavonoides pertenece al grupo de

taninos condensados estn presentes en la corteza de abeto, roble, secoya.

Flavonoides monomricos que incluyen quercetina y dihidroquercetina estn tambin

presentes en la corteza. Se encuentran tambin pequea cantidad de lignanos y

estilbenos. En menor cantidad se encuentran carbohidratos, protenas y vitaminas

(ALVAREZ, 2003).

Es conocido que los componentes fenlicos y terpenoides presentan

propiedades antifngicas, antibiticas, antioxidantes, alelopticas y otras (ALVAREZ,

2003). Estos compuestos tienen ganada reputacin por su actividad en las plantas

como el control al ataque de insectos y a enfermedades microbianas.

Hace algunos aos muchos extractivos vegetales, como los taninos, se

consideraron compuestos con actividad biolgica dudosa, y sin beneficios

farmacolgicos de relevancia reportados, ya que parte importante de su estructura

an era desconocida para la ciencia. La definicin de la misma hizo posible el estudio

y prescripcin de nuevas propiedades para estos compuestos, as como la

posibilidad de su uso en humanos (ALVAREZ, 2003).

Es por ello que a la luz de los modernos avances en botnica,

fotoqumica, farmacologa, farmacocintica, farmacodinamia y toxicologa, el

conocimiento tradicional y popular sobre las propiedades medicinales de las plantas

deber ser constatado y validado para garantizar una terapia adecuada, eficaz y con

la menor incidencia de ocasionar riesgos al paciente (DOMINGO y LOPEZ, 2003).

 A nivel popular basta muchas veces con extraer los principios activos de

la manera ms sencilla, como puede ser por medio de una infusin o decoccin. En

cambio, para analizar las propiedades medicinales de un compuesto vegetal, en

muchos casos se recurrir a procedimientos de extraccin ms complejos, que

permitan obtener mtodos reproducibles, con cuantificacin de principios activos en

lo posible (GARCIA, 2003).

V. HIPTESIS

Los extracto de corteza y hoja de Calycophyllum spruceanum (Capirona) presentan

una actividad bactericida y fungicida superior al 5%.

 V.- MATERIALES Y METODOS

5.1. Lugar de ejecucin

La presente investigacin se realizara en el Laboratorio de Fitoquimica,

de la Facultad de Recursos Naturales Renovables de la Universidad Nacional Agraria

de la Selva, ubicado en la provincia de Leoncio Prado, distrito de Rupa Rupa, regin

Hunuco, a una altitud de 660 m.s.n.m. con condiciones de temperatura promedio

anual de 24.85 C con precipitacin anual de 3,200 mm y humedad relativa de 82 %.

5.2. Material biolgico

5.2.1. Especie vegetal

Se evaluara el extracto de hoja y corteza la especie Calycophyllum

spruceanum (Benth.) que ser recolectada de la plantacin de la unidad

experimental Tulumayo.

5.2.2. Descripcin de la especie

ESPECIE: Calycophyllum spruceanum (Benth) Hook f. ex Schumann.

FAMILIA: Rubiaceae

SINONIMIA: Eukylista spruceana Benth

NOMBRES COMUNES: Capirona Negra, Palo Mulato.

5.3. Mtodos

5.3.1. Reactivacin de los microorganismos

a. Reactivacin de cepas bacterianas

Para este propsito se aplicara la metodologa recomendada por la

Asociacin Estadounidense de Salud Pblica (APHA, 1992), utilizndose el medio

Infusin Cerebro Corazn (BHI) distribuido en tubos de ensayo 15 x 125 mm.

Los viales conteniendo las cepas se vertieran en medio BHI y se llevaran a

incubacin por 24 horas a 37 C.

Al trmino de la incubacin se repicaran las cepas sobre medio slido

Agar CLED (AC) o Agar Nutritivo Comn (AN) contenido en placas petri. Se

incubaran las placas por 24 horas a 37C.

b. Reactivacin de cepas fngicas

Para la reactivacin de fungi se realizara segn lo descrito por AJELLO

et al. (1966) y en la Farmacopea XXIII de los Estados Unidos de Norteamrica-USP

(1995). Se dispondr de medio de cultivo lquido, Extracto de Levadura-Glucosa

(LG) o Caldo Sabouraud Glucosado (CS) distribuidos en tubos de prueba de 15 x125

mm.

El vial conteniendo la cepa fungi se vertira sobre el medio de cultivo, y se

llevara a incubacin de 2 a 4 das a temperatura ambiente.

 Al trmino de la incubacin se repicaran sobre medio slido de Agar

Sabouraud Glucosado (AS) o Agar Papa Glucosa (PDA), las placas se incubaran a

temperatura ambiente por espacio de 2 a 4 das.

5.3.2. Obtencin de Inculos Microbianos

De las placas de repique tanto de bacterias como de fungi, se tomaran 5

colonias en estado puro y se sembraran en medios BHI contenido en tubos y se

incubaran a 37C de 12 a 18 horas hasta que la suspensin alcance una

concentracin celular de 105 a 106 UFC/mL (unidades formadoras de colonia por

mililitro).

5.3.3. Preparacin de Extractos Crudos

5.3.3.1. Procesamiento del material vegetal

Se dispondr del material vegetal fresco y seco constituido por hoja y

corteza de las especies forestal de la especie Calycophyllum spruceanum.

Para este fin se procesara por el mtodo descrito por CACERES et al.

(2001). Se recolectara y separara 150 g de hoja y corteza de las especie forestal, se

lavaron con agua corriente y con agua destilada, luego se secara en la estufa a 65 C

por 24 horas para eliminar el exceso de agua. Posteriormente se cortara en trozos

pequeos y se practicara una trituracin del material para pulverizarlos hasta su

homogenizacin.
 5.3.3.2. Extractos crudos

Con los pulverizados se prepararan el extracto crudo empleando

disolventes polares: agua, etanol y metanol. Se dispondr de 10 a 50 g de

pulverizado de material vegetal seco por cada disolvente utilizado en la extraccin.

a. Extractos acuosos

Se aplicara el mtodo descrito por CACERES et al. (2001) y STAUFFER

et al. (2003).

Se tomaran 50 g de pulverizado vegetal y se llevaran a 500 mL de agua

destilada, se sometieran a ebullicin (100C) por 20 minutos, se dejaran que enfren

a temperatura ambiente por lo menos 60 minutos, posteriormente se filtraran sobre

papel Whatman N 1.

El filtrado se esterilizara por tindalizacin a 60C por 2 horas y perodos

de descanso de 24 horas, con dos repeticiones. Se almacenaran en refrigeracin (4

a 8C) hasta su utilizacin.

b. Extractos metanlicos

Se proceder segn el mtodo descrito por LAPENNA et al. (2003)

modificado de acuerdo a nuestros requerimientos.

Se macerara 10 g del pulverizado en 100 mL de metanol por 24 horas, al

trmino de la maceracin se filtrara en papel Whatman N 1, posteriormente el

filtrado se esterilizara por tindalizacin a 60C por 2 horas y descansos de 24 horas

con dos repeticiones del proceso.

 Se conservaran en refrigeracin entre 4 a 8C. Para la evaluacin se

centrifugara a 3000 rpm por 15 minutos, se tomara el sobrenadante para realizar la

prueba de sensibilidad y/o resistencia antimicrobiana.

c. Extractos etanlicos

Se proceder segn el mtodo descrito por ROSALES y GONZALES

(2003).

A 10 g del pulverizado vegetal se agregararan 100 mL de etanol al 70 %

y se dejara macerar por espacio de 24 horas. Al trmino de la maceracin se filtrara

en papel Whatman N 1 y al filtrado se le agregararan unos mililitros de agua

destilada hirviendo con la finalidad de precipitar compuestos resinosos existentes.

Se esterilizara por tindalizacin y se conservara en refrigeracin (4 a

8C). Para su evaluacin se centrifugara a 3000 rpm por 15 min. y se tomara el

sobrenadante para realizar las pruebas de sensibilidad y/o resistencia

antimicrobiana.

5.3.4. Determinacin de la Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM)

Se probaran tres concentraciones del extracto crudo vegetal: 1 mg/mL, 5

mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, para determinar la CIM de los extractos tanto a partir

de hojas como de corteza. La CIM es la concentracin ms baja que requiere el

extracto crudo vegetal para inhibir el crecimiento del microorganismo.

 Los inculos bacterianos reactivados en medio BHI, se sembraran por

diseminacin sobre placas conteniendo Medio Mueller Hinton (MH) adicionado con

50 mg/mL de cefazolina como presin selectiva. Los inculos de fungi, se sembraran

a partir del medio BHI en placas petri conteniendo Medio Sabouraud Glucosado (AS)

o Agar Papa Glucosa (PDA), adicionado de ketoconazol 50 mg/mL como presin

selectiva.

Utilizando una plantilla de cuadrculas de siembra, que se aprecia en la

Figura 1, colocada debajo de cada placa sembrada con microorganismos, se

depositaran con ayuda de una micropipeta automtica, 25 L de cada una de las

concentraciones ya mencionadas de los extractos preparados. El extracto crudo se

depositara sobre las cuadrculas 1 al 3. Las placas se llevaran a la estufa, se

incubaran a 37 C por 24 horas en caso de las bacterias y a temperatura ambiente

por 3 - 5 das en el caso de fungi. Al trmino de la incubacin se observaran los

resultados.

El efecto txico se evidenciara por la aparicin de halos de inhibicin del

crecimiento de las cepas en estudio, que se comparara con los halos producidos por

sus respectivos controles. Al retirar las placas de incubacin se observaran halos de

inhibicin que se midieran en milmetros (mm).

5.3.5. Controles

Se utilizaran como controles los solventes que intervienen en el

proceso: agua, etanol, metanol, as como cefazolina 50mg/mL y ketoconazol

50mg/mL, de los cuales se depositaran 50 L en las ltimas cuadrculas (4 8) de

cada placa sembrada con los diferentes microorganismos.

Figura 1. Plantilla de cuadrculas enumeradas para la evaluacin de la actividad

antimicrobiana de los extractos.

5.3.6. Variables en estudio

Variable Dependiente

Actividad Bactericida y Fungicida.

Variable independiente

Extractos de hoja y corteza Calycophyllum spruceanum (Capirona).

Cuadro 1. Variables en estudio

Variable Tipo Parmetro Unidades

(variable dependiente) Dimetro de inhibicin
Inhibicin fngica y cm
Actividad Bactericida y (halo)
bacteriana
Fungicida. Densidad celular UFC
(Variable independiente) Hoja g/ml
Origen de extracto
Extractos de hoja y Corteza g/ml
corteza Calycophyllum Concentracin de
Dosis %
spruceanum (Capirona). aplicacin
 5.3.7. Diseo Experimental

Se implementara el diseo experimental completamente al azar (DCA)

con arreglo factorial basada en un estmulo creciente segn el esquema siguiente:

1% 1%

5% 5%
EH EH
10 % 10 %

15 % 15 %
EIF EIB

1% 1%

5% 5%
EC EC
10 % 10 %

15 % 15 %

Figura 2. Esquema de diseo experimental

 5.3.8. Tratamientos en estudio

Se implementaran 16 tratamientos y dos controles segn el detalle

siguiente:

Cuadro2. Tratamientos en estudio

Tratamiento Origen Uso Concentracin (%) Repeticiones

T 0-1 Comercial Bacteria 1 3
T 0-2 Comercial Hongo 1 3
T1 Hoja Bacteria 1 3
T2 Hoja Bacteria 5 3
T3 Hoja Bacteria 10 3
T4 Hoja Bacteria 15 3
T5 Hoja Hongo 1 3
T6 Hoja Hongo 5 3
T7 Hoja Hongo 10 3
T8 Hoja Hongo 15 3
T9 corteza Bacteria 1 3
T 10 corteza Bacteria 5 3
T 11 corteza Bacteria 10 3
T 12 corteza Bacteria 15 3
T 13 corteza Hongo 1 3
T 14 corteza Hongo 5 3
T 15 corteza Hongo 10 3
T 16 corteza Hongo 15 3

5.3.9. Diseo Estadstico

Se ejecutaran dos anlisis estadsticos para corroborar la significancia y similitud

estadstica de los resultados a obtener:

a. Anlisis de varianza (ANOVA)

Se distribuir las variables estadsticas y tratamientos de acuerdo al

diseo experimental; se utilizara el modelo estadstico completamente al azar (DCA)

con arreglo factorial (2 x 2 x 4).con tres repeticiones, para un nivel de significacin

del 5%.

Cuadro 3. Anlisis de Variancia (ANOVA)

Fuente de
GL SC CM Fc Signif
variacin
Tratamientos t1 ST- e SCtrat/GLtrat CMtrat/CMe Fc > Ft
Error t(r-1) SCT-SCtrat SCerror/GLe
TOTAL t.r-1

b. Prueba de mltiple rangos de diferencia significativa de Tukey

(HSD Tukey)

Se empleara la Diferencia Significativa de Tukey a fin de determinar entre

que tratamientos habr diferencias significativas, para un nivel de significacin del

5%.
 V.- CRONOGRAMA

PERIODO DE EJECUCION
ACTIVIDADES 2016
ENE FEB MAR ABR MAY JUN

Revisin bibliogrfica. X
Elaboracin proyecto y aprobacin. X
Obtencin de muestras vegetales X
Reactivacin de microorganismos X X
Obtencin inculos microbianos X X
Preparacin de extractos X X
Determinacin de concentracin inhibitoria X X
Interpretacin de resultados. X X
Redaccin. X
Presentacin.
 VI- PRESUPUESTO

Los gastos sern cubiertos por los responsables de la ejecucin.

Naturaleza del gasto Justificacin del gasto Sub total Total (S/.)

Bienes de consumo.
- Material biolgico: 2,000.00
Medios de cultivos 800.00 2800.00
Reactivos
- Material de laboratorio: 125.00
Tubos de ensayo 200.00
Placas petri 110.00 335.00
Matraces 125 ml.
- Material qumico: 200.00
Levadura de glucosa 50.00
Alcohol al 70% 96.00
cido clorhdrico 25.00
Etanol 120.00
Metanol 55.00
Papel Whatman N40 10.00
- Material de limpieza: 8.00
Detergentes y afines. 15.00
Guante 15.00 594.00
Mascarilla
- Material de escritorio:
Papel bond A4 200.00
Folder manila 100.00
Discos compactos 100.00
Cuaderno 270.00
Lapiceros 12.00 682.00
Plumones marcadores
Otros servicios de terceros.
- Impresin de trabajos 400.00
- Gastos fotografas 100.00
- Fotostticas. 200.00
- Encuadernacin del trabajo 108.00 808.00

Imprevistos (10%) 521.90

GRAN TOTAL 5740.90
 XI.- BIBLIOGRAFA

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