PRCTICA XI

BACTERIAS ACTICAS PRODUCTORAS DE VINAGRE:

ACETOBACTER Y GLUCONOBACTER

1. Introduccin
La actividad metablica microbiana no tiene siempre como consecuencia la proliferacin
celular. Si se considera la actividad metablica de un cultivo microbiano a lo largo de toda la
curva de crecimiento se diferencian aquellos procesos metablicos asociados al crecimiento
celular (metabolismo primario), de aquellos que tienen lugar en la fase estacionaria, una vez que
ha cesado el crecimiento de la biomasa (metabolismo secundario). Como resultado, se
producen diferentes tipos de compuestos, metabolitos primarios y secundarios.
Los metabolitos primarios son molculas de bajo peso molecular que intervienen bien como
productos finales o intermediarios en las distintas rutas anablicas y catablicas y se forman
durante la fase primaria del crecimiento microbiano. Los ms importantes desde el punto de
vista industrial son alcoholes (etanol), aminocidos (cido glutmico, lisina, treonina), cidos
orgnicos (lctico, actico, propinico, succnico, fumrico, mlico, tartrico, ctrico,
glucornico), polioles (glicerol, manitol), polisacridos (xantano, dextrano), azcares (fructosa,
sorbosa) y vitaminas (riboflavina B2, cianocobalamina B12).
Las bacterias acticas son microorganismos bacilares o pleomrficos Gram negativos
(Gram positivos en cultivos viejos) y estrictamente aerobios. Se distribuyen en los gneros
Acetobacter y Gluconobacter segn tengan o no capacidad de oxidar el acetato (presencia del
ciclo de Krebs funcional). Los integrantes de ambos grupos pueden diferenciarse cultivndolos
en agar slido que contenga alcohol y una suspensin de cal. Como consecuencia de la
formacin de cido actico por oxidacin del alcohol primero se formar alrededor de las
colonias de ambos grupos un halo claro en el agar que tiene aspecto opaco y turbio porque el
cido actico transforma la cal en acetato de cal soluble. En las del grupo Gluconobacter esta
zona se mantiene y aumenta lentamente. Por el contrario en Acetobacter el acetato clcico se
precipita como CaCO3 que se degradar a CO2 y H2O con lo que la zona clara en torno a las
colonias se enturbiar otra vez si se siguen incubando las placas.
La caracterstica metablica que define al grupo de las bacterias acticas es la capacidad de
utilizar una gran diversidad de sustratos y la incapacidad de oxidarlos completamente. A pesar
de tratarse de microorganismos aerobios, acumulan en el medio que crecen una gran cantidad de
catabolitos diferentes. Son responsables de la fermentacin actica a partir del etanol y
tambin de la formacin de cido glucornico a partir de la glucosa, sorbosa del sorbitol,
dihidroxiacetona de la glicerina y 5 cetogluconato de la glucosa. Las bacterias del cido

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actico, adems de muchos alcoholes, oxidan cidos orgnicos como el pirvico y el lctico y
algunos de ellos producen celulosa.
Gluconobacter es siempre catalasa positivo, pero en las especies del gnero Acetobacter
la prueba de catalasa puede dar una reaccin dbil e incluso nula (A. peroxydans). Las
bacterias acticas pueden aislarse fcilmente de vinagre y tambin del vino, cerveza o de
zumos de frutas agriadas. A su vez, el gnero Acetobacter inicialmente fue dividido en tres
grupos: peroxydans (A. peroxydans y A. paradoxum); oxydans (A. pasteurianus,
A. levanicux, A. ascendens y A. rauceus) y mesoxydans (A. aceti, A. xylinum y
A. mesoxydans). Actualmente se aceptan solo tres especies: A. aceti, A. pasteurianus y
A. peroxydans, las dems seran subespecies.

2. Objetivos
2.1 Aislar e identificar bacterias acticas.
2.2 Seleccionar bacterias acticas segn su produccin de acidez.
2.3 Mantener adecuadamente bacterias acticas productoras de acidez.
3. Procedimiento

3.1 Aislamiento e identificacin de bacterias acticas

Muestra
Frutas cidas: limn, naranja, lima, uva.
Enriquecimiento de la muestra
Depositar 20 mL de cerveza en frascos de boca ancha.
Sumergir por 15 minutos y en frascos separados uva, manzana, limn y naranja.
Retirar los frutos.
Cubrir los frascos con gasa o malla para evitar la entrada de insectos.
Mantener a temperatura ambiente hasta por 4 das.
Observar el crecimiento bacteriano en forma de un velo o pelcula blanquecina
sobre la superficie.
Realizar una tincin de Gram para determinar la presencia de bacilos cortos
Gram negativos.

Aislamiento
Tomar una pequea porcin de la pelcula bacteriana desarrollada en las
muestras enriquecidas y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra
sobre agar Lee.
Incubar en aerobiosis a 30 C durante 24 horas.

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 Seleccionar las colonias amarillas.
Realizar tincin de Gram.
Repicar a viales conteniendo Agar Manitol o un frasco con 25 mL de cerveza.

Identificacin
Catalasa: Positiva para Acetobacter y Gluconobacter.
Crecimiento a pH 4.5: Positivo en caldo levadura glucosa pH 4,5.
Oxidacin del etanol a CO2: Cultivar en tubos conteniendo Agar Lee.
A las 24 horas el medio de cultivo las colonias que produjeron cido actico se
observarn de color amarillo.
A las 48 o 72 horas el medio de cultivo y las colonias que oxidan el etanol a
CO2 retornan al color inicial del medio de cultivo.

3.2 Seleccin de bacterias acticas segn su produccin de acidez

Tomar 2,5 mL de una suspensin en solucin salina de cada una de las bacterias
acticas (agar manitol) o 2,5 mL de cerveza culivada y sembarlos en matraces
conteniendo 50 mL de cerveza.
Incubar a 30 C durante 48 horas.
Determinar la acidez titulable a travs del mtodo acidimtrico de Mann (Factor para
cido actico = 0, 006005)
Realizar los clculos correspondientes.

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Cuadro 11.1. Caractersticas diferenciales de los gneros Gluconobacter, Acetobacter y
Pseudomonas
Caractersticas Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas
Polar o Polar
Peritrica o ninguna
Flagelacin ninguna
+
Crecimiento a pH 4.5 + -
Oxidacin de:
+ (F)
Etanol a cido actico a CO2 + (M) -
+
cido actico a CO2 - d
+
Lactato a CO2 - +
d
Glucosa a gluconato + d
Aminocidos por clulas en reposo
+
Ciclo de Krebs - +
+
Produccin de 5 cetogluconato - +
d
Cetognesis + -
d
Quinonas Q10 + -
-
Quinonas Q9 +
+
Hidrlisis de: -
Lactosa y almidn
-
Gelatina - d
-
Pigmentos verdosos y/o fluorescentes -/D d
-
- d
M: marcado, F: fuerte, d: variable
Fuente: Pars y Jurez, 1997

3.3 Mantenimiento de bacterias acticas

Cultivar las bacterias acticas en tubos tapa rosca con medio Estndar GYC, incubar a
30 C y mantener en refrigeracin. Subcultivar mensualmente.
Las bacterias acticas tambin se pueden mantener en cerveza, renovndola
semanalmente.

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 Frutas cidas 20 mL de
cerveza

Frutas cidas en
cerveza por 15
minutos

Retirar los frutos

Cubrir los frascos

con gasa para
evitar la entrada
de insectos

Mantener a
temperatura ambiente
hasta por 4 das

Observar crecimiento
bacteriano en forma
Tincin de Gram:
de pelcula superficial
bacilos cortos
Gram negativos

Figura 11.1 Enriquecimiento de la muestra para aislamiento de bacterias acticas.

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 Alcuota de
la pelcula

Aerobiosis a
30 C/24
horas

Muestra
enriquecida Agar Lee

Cultivar
Tincin de
Gram

Gluconobacter Incubar a 30 C / Incubar a

48 horas 30C/ 24
horas

Agar Lee

Bacilos
Gram
negativos
Acetobacter

Figura 11. 2 Aislamiento de bacterias acticas.

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 Sembrar
2,5 mL de la
suspensin

Incubar en Determinar
aerobiosis a la acidez
30 C/48
horas

50 mL de cerveza
Suspensin de
bacterias acticas en
cerveza

Sembrar 2,5 mL
de la suspensin

Renovar
Mantenimiento cerveza
semanalmente
50 mL de cerveza

Figura 11.3 Seleccin y mantenimiento de bacterias acticas segn su produccin de acidez.

4. Anexo
4.1 Medio de enriquecimiento: Cerveza
Colocar aspticamente en frascos de boca ancha 20 mL de cerveza.

4.2 Medio Lee (g/L)

CaCO3 2,0
KH2PO4 0,1
K2HPO4 0,2
Peptona 10,0
Casaaminocidos 1,0
Extracto de levadura 10,0
Glucosa 10,0
Agar agar 16,0
Agua destilada csp 1L
pH 7,0
Indicador Azul de bromotimol
Disolver y esterilizar a 121 C x 15 minutos. Antes de su uso incorporar 5
mL de etanol.

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 4.3 Medio estndar, GYC (g/L)
Extracto de malta 3,0
Extracto de levadura 10,0
D glucosa 50,0 g
Agar agar 25,0 g
Agua csp 1L
Mantener en frascos con tapa rosca

4.4 Medio agar manitol (g/L)

Extracto de levadura 5,0
Peptona 3,0
Manitol 25,0
Agar agar 15,0
H2O csp 1L
pH 7,0
Mantener en frascos con tapa rosca

5. Referencias bibliogrficas
Alva, R. & Romero, J. (2001). Obtencin de vino y vinagre a partir de la banana. Tesis
Ingeniero Qumico .Lambayeque, Per, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Castillo, M. & Chavarri, N. (2004).Optimizacin de la concentracin de inculo, sustrato

y tiempo de incubacin en la obtencin de vinagre utilizando Acetobacter aceti
CECT 298T a partir de licor de maz en biorreactor Airlift. Tesis de Licenciatura.
Lambayeque, Per. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Pars, R. & Jurez, A. (1997). Bioqumica de los Microorganismos. Mxico: Editorial

Revert.

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