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UNIDAD # 4

ESPECTROFOTOMETRA EN LA REGIN
ULTRAVIOLETA
FUNDAMENTO
El intervalo de longitud de onda de la radiacin ultravioleta se extiende desde 200 - 400 nm (lmite
azul de la luz visible). Muchos iones y molculas que tienen dobles ligaduras y que pueden
representarse como hbridos de resonancia de distintas estructuras, absorben radiaciones ultravioletas
en la regin de 200 a 400 nm. La aplicacin ms importante de la absorcin en la regin ultravioleta
reside en la determinacin cuantitativa de compuestos orgnicos que contienen grupos funcionales.
Adems, varias especies inorgnicas, particularmente entre los metales de las tierras raras, estos
absorben radiacin ultravioleta, siendo, as pues susceptibles tambin al anlisis por este mtodo.
La radiacin UV es la banda de radiacin ptica que presenta las longitudes de onda ms corta, o
bien las frecuencias ms altas (superiores a las del espectro visible). Desde el punto de vista
energtico, es la zona del espectro con energa inmediatamente superior a la del espectro visible.
Ms all del UV estn los rayos X, de mayor frecuencia y energa.
El trmino ultravioleta deriva etimolgicamente de MAS ALL DEL VIOLETA, razn por la que esta
radiacin no es visible para el ojo humano
Subtipos
Segn su longitud de onda, se distinguen varios subtipos de rayos ultravioleta:

Nombre Abreviacin Longitud de onda (nm) Energa por fotn (eV)

Ultravioleta cercano NUV 400 200 3,10 6,30

Onda larga UVA 400 320 6,30 3,87

Onda media UVB 320 280 3,87 4,43

Onda corta UVC 283 - 200 4,43 6,20

Ultravioleta lejano FUV, VUV 200 10 6,20 - 124

Ultravioleta extremo EUV, XUV 91,2 1 13,6 1240

En forma general la radiacin UV se clasifica en tres bandas de longitudes de onda :

UV A (ONDA LARGA): de 320 nm - 380 nm . Es la ms prxima al espectro


visible, el espectro solar contiene gran cantidad de estas radiaciones, son inofensivas para la
biomasa.
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UV B (ONDA MEDIA): de 280 nm 320 nm, tambin abundante en la radiacin


solar, la mayor parte filtrada por el aire. Activa la produccin de melanina en la piel y es
beneficiosa para la salud en dosis moderadas.

UV C (ONDA CORTA): de 100 nm 280 nm, peligrosas para ojos y piel de


animales y seres humanos.
Desde otro punto de vista se seala que la regin UV abarca desde 100 a 350 nm y se divide en dos
regiones diferentes, la regin de " vaco" (100 a 200 nm) y la regin de "cuarzo" (200 a 380 nm).
Esta subdivisin es necesaria por razones experimentales. Por debajo de los 200 nm, el cuarzo y el
aire (particularmente el oxgeno y el dixido de carbono) absorben energa muy intensamente y por
eso debe colocarse en un medio exento de tales sustancias (vaco).
La regin de cuarzo recibe este nombre porque las cubetas que contienen la muestra estn hechas
de material de cuarzo, debido a que el vidrio absorbe intensamente por debajo de 300 nm.

USOS
La luz ultravioleta tiene diversas aplicaciones:
Una de las aplicaciones de los rayos ultravioleta es como forma de esterilizacin, junto con
los rayos infrarrojos (pueden eliminar toda clase de bacterias y virus sin dejar residuos, a
diferencia de los productos qumicos).
Est en estudio la esterilizacin UV de la leche como alternativa a la pasteurizacin.
En anlisis cuantitativo de sustancias

SUSTANCIAS QUE ABSORBEN EN LA REGIN ULTRAVIOLETA


Todos los compuestos orgnicos pueden absorber radiacin electromagntica porque todos contienen
electrones de valencia que pueden ser excitados a niveles de energa ms altos. Las energas de
excitacin asociados con los electrones que forman la mayora de los enlaces sencillos son altas, por
tanto, la absorcin por este tipo de electrn se limita a la regin llamada ultravioleta en el vaco (<
185 nm) donde los componentes de la atmsfera absorben tambin fuertemente.
Los tomos y molculas constan de ncleos y electrones, la absorcin de energa por parte de las
molculas, as como el movimiento de los electrones alrededor del ncleo, en niveles de energa
definidas, est establecida por la teora cuntica. Si la energa de los electrones es mnima, se
encuentran en el menor estado energtico, es decir, en el estado fundamental. Sin embargo, los
electrones pueden absorber energa radiante pasando, entonces, a un estado energtico superior o
estado excitado. Este fenmeno recibe el nombre de excitacin electrnica y para que se produzca,
la frecuencia de la radiacin se relaciona con la energa mediante la ecuacin E = h v. La cantidad
de energa necesaria para un trnsito electrnico desde el estado fundamental, E o a un estado
excitado E1, viene dado por la ecuacin:
(E1 - E o ) = h v

TIPOS DE ELECTRONES QUE PRODUCEN ABSORCIN


Las especies absorbentes que contienen electrones , , n incluyen iones y molculas orgnicas, as
como algunos aniones inorgnicos. Todos los compuestos orgnicos son capaces de absorber
radiacin electromagntica porque todos contienen electrones de valencia que pueden ser excitados
a niveles de energa superiores.
Los electrones que contribuyen a la absorcin por una molcula orgnica son:
a) Aquellos que participan directamente en la formacin del enlace entre tomos y, por tanto, se
asocian con ms de un tomo
b) Electrones no enlazantes o electrones que no participan en ningn enlace que estn en gran parte
localizados alrededor de tomos como oxgeno, halgenos, azufre y nitrgeno.
En las molculas orgnicas se pueden distinguir tres tipos de electrones. En primer lugar, los
electrones que intervienen en los enlaces sencillos o saturados, como son los que existen entre
carbono e hidrgeno en las parafinas, estos enlaces se llaman enlaces Sigma ( ). Los orbitales
moleculares asociados con los enlaces sencillos en las molculas orgnicas se designan como
orbitales sigma ( ) y los electrones correspondientes son electrones . Los electrones de un enlace
covalente sencillo est unidos fuertemente y para su excitacin se necesita radiacin de alta energa
o de longitud de onda corta. Por ejemplo, los alcanos, que slo contienen enlaces sencillos C- H y C-
C, no muestran absorcin arriba de los 160 nm. El metano presenta un pico a los 122 nm y se
designa como una transicin - *, esto significa que un electrn que est en un orbital de enlaces
sigma se excita a un orbital anti enlace sigma.
Los orbitales moleculares asociados con los enlaces sencillos en las molculas orgnicas se
designan con esta denominacin sigma y los electrones son electrones . La energa necesaria para
excitar electrones de enlace es muy elevada y, desde luego, superior a la que puede suministrar la
luz UV. Por esta razn, los compuestos parafnicos no absorben esta radiacin y son muy adecuados
como disolventes.
El segundo tipo de electrones son aquellos que forman enlaces no saturados en hidrocarburos .Estos
enlaces constan de un enlace (sigma) y un enlace (Pi). El doble enlace en las molculas
orgnicas contiene dos tipos de orbitales moleculares: un orbital sigma correspondiente a uno de los
pares de electrones de enlace, y un orbital molecular pi asociado con el otro. Ejemplos de estos
compuestos con enlaces son los trienos conjugados y los compuestos aromticos.

Distribucin electrnica de los orbitales moleculares sigma y pi.

Los electrones de los enlaces dobles y triples se excitan con mayor facilidad hasta la orbital pi ms
elevada. Cuando un electrn pi que est en un orbital de enlace pi se eleva a un orbital de anti enlace
pi, se designa a la transicin como *. Por lo general, la absorcin de energa en este caso es ms
dbil que las transiciones * .En las molculas conjugadas, es decir, en aquellas que contienen
una serie de dobles enlaces alternados, la absorcin se traslada hacia longitudes de onda ms largas.

En tercer lugar, muchas molculas orgnicas contienen electrones que no forman enlaces, estos
electrones no compartidos se representan con el smbolo n. Los compuestos orgnicos con tomos
de nitrgeno, oxgeno, azufre o halgenos, tienen, todos electrones no enlazantes. Como estos
electrones " n " son excitados por radiacin UV, todo compuesto que los posea absorber dicha
radiacin. Si una molcula contiene un tomo como el cloro que tiene pares electrnicos sin
compartir, uno de estos electrones se puede excitar a un nivel de energa ms elevado. Ya que los
electrones sin compartir no estn unidos tan fuertemente como los electrones en enlaces sigma, la
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absorcin tiene lugar a longitudes de onda ms largas. El CH 3Cl la transicin ocurre en los 173 nm y
que las transiciones del CH3Br y del CH3I suceden en longitudes de onda an ms largas; esto se
debe a que los electrones estn unidos con menor fuerza en el bromo y en el yodo, a la transicin que
acabamos de describir se le llama n- * para indicar que un electrn no compartido se elev a un
orbital sigma antienlace.

Un ejemplo en el que se apreciar los tres tipos de electrones lo constituye una molcula
(formaldehido):

Los compuestos aromticos pueden absorber radiacin UV; los grupos funcionales que absorben
radiacin en la regin UV se llaman CROMOFOROS. Un cromforo es el grupo funcional de una
molcula que le imparte su color, el trmino se aplica a un grupo funcional que absorbe en la regin
UV y visible.
Los compuestos parafnicos que slo contienen enlaces no absorben radiacin en la regin visible
ni ultravioleta, para detectarlos es necesario operar en la regin UV vaco que se extiende desde 200
nm hasta la zona de rayos X (100 A o). En este intervalo de longitudes de onda, el nitrgeno y el
oxgeno de la atmsfera absorben radiacin, y en consecuencia, los trabajos se realizan con haces
de radiacin en ausencia de aire, es decir, a vaco.
Aunque algunas sustancias inorgnicas absorben radiaciones ultravioleta, la principal aplicacin de la
espectroscopia del ultravioleta es para determinar ciertos tipos de compuestos orgnicos. Su
principal aplicacin es la determinacin de compuestos aromticos (compuestos que tienen un
benceno u otro anillo aromtico) y de compuestos que tienen dobles ligaduras conjugadas. Los
grupos funcionales que absorben radiacin en la regin U.V, se llaman cromforos.
La mayora de los iones de los metales de transicin absorben en la regin ultravioleta o visible del
espectro. En la serie de los lantnidos ( cerio, lantano, erbio) y los actnidos (actinio, torio, uranio),
este proceso se debe a las transiciones electrnicas de los electrones 4f y 5 f; en el caso de los
elementos de la primera y la segunda series de metales de transicin, el fenmeno se debe a los
electrones 3 d y 4d.
Algunos aniones inorgnicos presentan picos de absorcin ultravioleta que son consecuencia de las
transiciones n--- *, como ejemplos, se incluyen los iones nitrato (313 nm), carbonato (217 nm),
nitrito (360 y 280 nm), azida (230 nm) y tritiocarbonato (500 nm)

ESPECTROS DE ABSORCIN
Los espectros del ultravioleta, al igual que los del visible suelen ser muy sencillos. Con frecuencia, un
espectro del ultravioleta tendr solamente uno o dos picos de absorcin anchos, en la regin de 200
a 400 nm. Otros, como el espectro ultravioleta del benceno tienen varios picos de absorcin
pronunciados. Los espectros del UV a menudo son de utilidad para la caracterizacin cualitativa de
sustancias, particularmente de determinados tipos de compuestos orgnicos.
Los espectros de compuestos en fase condensada, puros, o en disolucin presentan generalmente
fajas de absorcin anchas y poco numerosas. Sin embargo, los espectros obtenidos a partir de
muestras en estado gaseoso y a baja presin presentan una estructura fina. Como se ha mencionado
muchos elementos lantnidos y actnidos absorben en las regiones UV y visible. En claro contraste
con el comportamiento de muchas especies absorbentes inorgnicas y orgnicas, sus espectros
constan de estrechos picos de absorcin bien definidos y caractersticos que son pocos afectados por
el tipo de ligante asociado con el ion metlico. En la deteccin de grupos funcionales, aunque esta
tcnica no puede proporcionar la identificacin inequvoca de un compuesto orgnico, el espectro de
absorcin en las regiones del ultravioleta y visible es, sin embargo, til para detectar la presencia de
ciertos grupos funcionales que actan como cromforos. Por ejemplo, una banda de absorcin dbil
en la regin de 280 a 290 nm, que se desplaza hacia longitudes de onda ms cortas cuando aumenta
la polaridad de los disolventes, indica firmemente la presencia de un grupo carbonilo.
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Algunos espectros tpicos de absorcin en el ultravioleta


CARACTERSTICAS DE ABSORCIN DE ALGUNOS CROMFOROS

Caractersticas de absorcin de compuestos aromticos

DISOLVENTES
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 58

Al desarrollar un mtodo de anlisis que utilice radiacin ultravioleta un problema importante es el de


la eleccin del disolvente. Este tiene que ser una sustancia que no slo disuelva a la muestra, sino
que adems sea transparente en la regin espectral de inters. Al elegir un disolvente no slo se
tiene que tener en cuenta su transparencia sino tambin sus posibles efectos sobre el sistema
absorbente.
Con bastante frecuencia, los disolventes polares como el agua, alcoholes, esteres y cetona tienden a
borrar la estructura fina del espectro que resulta de los cambios vibracionales; es lo ms probable
obtener espectros parecidos a los originales en fase gaseosa cuando se utilizan disolventes no
polares como los hidrocarburos. El agua, que transmite radiacin de longitud de onda corta como 200
nm, es excelente desde el punto de vista, pero raras veces es un buen disolvente para los
compuestos orgnicos.
Cuando se utiliza disolventes no polares como los hidrocarburos alifticos, los alcoholes metlico,
etlico y el ter etlico son transparentes a la radiacin UV y se usan frecuentemente como
disolventes; sus determinaciones emplean cubetas de cuarzo o de slice. Los disolventes sealados
en el cuadro enumeran las longitudes de onda aproximada por debajo de la cual no pueden usarse
debido a la absorcin. Este mnimo depende en gran medida de la pureza del disolvente.

Disolventes para las regiones Ultravioleta y Visible


Disolvente Mnimo aproximado de transparencia nm

Agua 190
Etanol 210
n- hexano 195
Ciclohexano 210
Benceno 280
Dietil ter 210
Acetona 330
1,4 Dioxano 220

SENSIBILIDAD
Los anlisis de absorcin ultravioleta son bastantes sensibles y es posible detectar sustancias a
concentraciones tan bajas como 1 ppm. La sensibilidad de una tcnica analtica se define como la
menor concentracin que puede determinarse cuantitativamente por dicho mtodo, los lmites de
deteccin de 10 -4. a 10 5 M, con frecuencia este intervalo puede ampliarse de 10 -6 a 10 -7 M con
ciertas modificaciones, adems, estos mtodos presentan selectividad de moderada a elevada,
facilidad y comodidad en el trabajo, precisin buena, se encuentran incertidumbres relativas de 1 a 3
por ciento, aunque, con precauciones especiales, los errores, se pueden reducir a algunas dcimas
por ciento. La selectividad que presenta es de moderada a alta.

APLICACIONES
Los compuestos capaces de absorber radiacin ultravioleta son aquellos que poseen electrones no
enlazantes (electrones n) o dobles enlaces conjugados (electrones pi), tales como los aromticos.
Estos compuestos absorben en rangos de longitudes de onda similares, por lo que sus espectros de
absorcin se solapan considerablemente; la curva de absorcin se encuentra influenciada, no slo
por el grupo que contiene los electrones que absorben, sino tambin, por el resto de la molcula. En
consecuencia, la absorcin U.V, ofrece menos posibilidades para la identificacin de grupos
funcionales que otros mtodos espectroscpicos, como el infrarrojo o la RMN. En cambio es muy til
para detectar compuestos aromticos y olefinas conjugadas.
Las aplicaciones cualitativas son limitadas porque el espectro de la mayora de los compuestos en
solucin consiste de uno o, cuando mucho, unos pocos picos amplios sin estructura fina que podran
ser requeridos para su identificacin precisa. En contraste, el mtodo es uno de los ms poderosos y
ms utilizados para el anlisis cuantitativo en sistemas orgnicos, inorgnicos y bioqumicos.
Algunas aplicaciones caractersticas de la espectroscopia UV son las determinaciones de los
siguientes compuestos:
Compuestos aromticos poli nucleares de carcter cancergeno
Productos naturales, como esteroides o clorofila
Sustancias colorantes
Vitaminas ( vitamina A )

En la determinacin de impurezas en muestras orgnicas, tales como residuos de plantas


industriales, en la deteccin de posibles sustancias cancergenas en alimentos, bebidas, cigarrillos o
contaminadores atmosfricos.
En agricultura, se utiliza en la determinacin de pesticidas en plantas, ros, y animales que comen y
beben sustancias contaminadas.
En medicina, se aplica en el anlisis de enzimas, vitaminas, hormonas, alcaloides, barbitricos, etc.

ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIN
INFRARROJA
La regin del infrarrojo del espectro electromagntico se extiende desde el extremo del rojo del
espectro visible hasta la regin de las microondas. La regin del Infrarrojo (IR) desde el punto de
vista analtico, reagrupa una variedad de mtodos no destructivos de identificacin y determinacin
basados en la absorcin o reflexin, por parte de la muestra.
Las espectroscopia IR es la rama de la espectroscopia que trata con la parte infrarroja del espectro
electromagntico. Esta cubre un conjunto de tcnicas, siendo la ms comn una forma de
espectroscopia de absorcin.
La regin infrarroja abarca las regiones del espectro comprendidas entre los nmeros de onda de
12800 a 10 cm -1 aproximadamente, lo que corresponde a las longitudes de onda de 0.78 a 1000 m
(micrmetros). La espectrometra de infrarrojo involucra el examen de los modos vibracionales y
rotacionales de torsin y flexin de los tomos en una molcula. En la interaccin con la radiacin
infrarroja, parte de la radiacin incidente es absorbida a longitudes de onda especficas; la
multiplicidad de vibraciones que ocurren simultneamente produce un espectro de absorcin muy
complejo que es caracterstico solamente de los grupos funcionales que estn presentes en la
molcula y de la configuracin global de la molcula.
Aunque la regin del IR cercano es pobre en absorciones especficas, ha despertado un gran inters
en los laboratorios de control como medio de anlisis cuantitativo. Sin embargo, el IR medio es ms
rico en informacin acerca de la estructura de los compuestos examinados. De hecho, se utiliza para
la identificacin de molculas orgnicas, ya que permite registrar una especie de " huella digital"

REGIONES DEL ESPECTRO INFRARROJO


La porcin infrarroja del espectro electromagntico se divide en tres regiones por su relacin con el
espectro visible. El IR lejano se encuentra adyacente a la regin de microondas, posee una baja
energa y puede ser usado en espectroscopia rotacional. El IR medio puede ser usado para estudiar
las vibraciones fundamentales y la estructura rotacional vibracional, mientras que el IR cercano
puede excitar vibraciones armnicas.
La regin ms utilizada es, con mucha diferencia la regin del infrarrojo medio que se extiende
entre aproximadamente entre 2.5 y 14.9 m. En esta regin, para los anlisis cualitativos y
cuantitativos, se emplean los espectros de absorcin, reflexin y emisin. La regin del infrarrojo
cercano, comprendida entre 0.78 y 2.5 m tambin encuentra una considerable utilidad en la
determinacin cuantitativa de rutina de ciertas especies, como el agua, dixido de carbono, azufre,
hidrocarburos de bajo peso molecular, nitrgeno amnico, y muchos otros compuestos sencillos que
tienen inters en agricultura y en industria
La principal utilidad de la regin infrarroja lejana consiste en la determinacin de estructuras de
especies inorgnicas y organometlicas que se basan en las medidas de absorcin.

Regin intervalo de longitudes de onda intervalo en nmero de intervalo


ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 60

En m onda cm 1 en nm
Cercano 0.78 a 2.5 12800 a 4000 780 a 2500
Medio 2.5 a 50 4000 a 200 2500 a 50000
Lejano 50.0 a 1000 200 a 10 50000 a 1000000
Ms utilizado 2.5 a 15 4000 a 670 2500 a 15000

Debemos recordar que 1 m (micrmetro = 10 6


m = 10 4
cm = 1 (micra)

ABSORCION EN EL INFRARROJO
La mayora de las transiciones electrnicas requieren energa de las regiones ultravioleta o visible; la
absorcin de radiacin infrarroja se limita as en gran parte a especies moleculares para los cuales
existen pequeas diferencias de energa entre los distintos estados vibratorios y rotatorios.
Por lo general, la radiacin infrarroja no es suficientemente energtica como para producir
transiciones electrnicas, pero s puede inducir transiciones en los estados vibracionales y
rotacionales asociados con el estado electrnico basal de la molcula. Para absorber radiacin
infrarroja, una molcula debe experimentar un cambio neto en el momento dipolar como
consecuencia de su movimiento vibratorio o rotatorio

REGIN DEL INFRARROJO CERCANO (IRC)


Casi todo compuesto qumico exhibe absorcin selectiva de energa radiante en la regin I.R del
espectro electromagntico. Algunas de las absorciones que se encuentran dentro de la regin
infrarroja cercana (0.78 2.5 micrmetros) son resultado de transiciones electrnicas dentro de las
molculas absorbentes debido a su cercana a la regin visible.
En la regin del IRC, que se toca con la regin visible aproximadamente a los 0.78 m y se extiende
aproximadamente a los 2.5 m, hay muchas bandas de absorcin que provienen de sobretonos
armnicos de la banda fundamental o de bandas de combinacin asociadas con los tomos de
hidrgeno. Entre stas se encuentran los primeros sobretonos de las vibraciones de estiramiento de
los enlaces O H y N-H, cerca de 1.40 m y de 1.50 m , respectivamente. Tambin se encuentran
bandas de combinacin que resultan de las vibraciones de estiramiento y de deformacin del enlace
C-H de los grupos alquilo, a los 2.20 m y a los 2.60 m.
La espectrometra en el infrarrojo cercano es una herramienta valiosa para analizar mezclas de
aminas aromticas. Las aminas aromticas se caracterizan por dos bandas de absorcin
relativamente intensas, cerca de 1.97 y de los 1.49 m: la banda de los 1.97 m es una combinacin
de los modos de flexin y estiramiento del enlace N-H, y la de los 1.49 m es el primer sobretono de
la vibracin de estiramiento simtrico del enlace N-H.

REGION DEL INFRARROJO INTERMEDIO (IRI)


En la regin IR intermedia, que se extiende desde 2.5 a 50 micrmetros, la absorcin surge
primariamente de elevacin de las molculas de que est compuesta la muestra a niveles de energa
vibracional excitados.
Esta regin se divide en la regin de frecuencias de grupo entre 2.50-7.69 m, y la regin de la
huella digital que corresponde entre 7.69-15.38 m. En la regin de frecuencias de grupo las
bandas principales de absorcin se asignan a unidades consistentes en vibraciones de slo dos
tomos de una molcula, esto es, unidades que ms o menos dependen slo del grupo funcional que
da la absorcin y no de la estructura molecular completa.
En la obtencin de la informacin de un espectro a otro se asignan primero las bandas principales de
esta regin (a grupos funcionales); en el intervalo de 2.50-4.00 m, la absorcin es caracterstica de
las vibraciones de estiramiento del hidrgeno con los elementos de masa 19 o menores. Las
frecuencias de estiramiento C-H son especialmente tiles para establecer el tipo de compuesto
presente, por ejemplo, tal estiramiento en el C C-H se presenta aproximadamente a 3.03 m, para
los compuestos aromticos insaturados lo hace entre 3.33-3.57 m y para los compuestos alifticos
ocurre entre 3.33-3.57 m. Cuando el C-H est unido a masas ms pesadas, las frecuencias de
estiramiento del hidrgeno se traslapan a la regin del triple enlace.
El intervalo de frecuencias entre 4.00-6.49 m, es llamado a menudo la regin no saturada o
insaturada. Los triples enlaces y grupos similares aparecen entre 4.00-5.00 m; las frecuencia de los
dobles enlaces caen en la regin de los 5.00-6.49 m.
REGION DEL INFRARROJO LEJANO
Otras absorciones, que se encuentran en la regin del IR lejana a longitudes de onda mayores que
unos 50 micrmetros, corresponden a excitacin puramente rotacional. A las vibraciones
vibracionales se superponen cambios rotacionales. Adems, toda molcula poli atmica est sujeta a
vibraciones interatmicas, ejemplo, una molcula de agua, cada tomo de hidrgeno vibra hacia
delante y hacia atrs, hacia el tomo de oxgeno y hacia fuera de l, en gran medida como si los 2
tomos estuvieran unidos por un muelle. Est vibracin de estiramiento ocurre solo en niveles de
energa discretos y los fotones que tienen precisamente la cantidad de energa necesaria exacta para
subir al sistema de uno de estos niveles vibracionales a otro son los absorbidos selectivamente.
Todas las molculas que tienen enlaces O-H exhiben absorcin debida a vibraciones de estiramiento,
y ello ocurre en la regin de 2.8 a 3.3 micrmetros.
Otros tomos, como nitrgeno o carbono, que estn unidos a tomos de hidrgeno, exhiben
absorciones de estiramiento de hidrgeno en la misma regin general del espectro IR, de ordinario
entre 2.6 y 4.1 micrmetros. La longitud de onda exacta a la cual absorbe una molcula dada est
determinada en parte por cuales sean los otros tomos unidos a uno u otro de los tomos enlazados
por enlace directo.
Otros tipos de enlaces interatmicos dan por resultado absorcin caractersticas en otras partes de la
regin IR. Los tomos de carbono unidos por doble enlace C = C --, estn marcados de manera
tpica por absorciones de vibracin de estiramiento en la regin de 5.1 a 6.6 micrmetros, y los
tomos de carbono unidos por triple enlace en la regin de 4.1 a 5.1 micrmetros.
El estiramiento es slo una de las diversas formas de vibraciones interatmicas en molculas.
Considerando un tomo de hidrgeno enlazado a un tomo de oxgeno en el agua o a un tomo de
carbono en un compuesto orgnico, ocurre una vibracin de encorvamiento en el enlace H O o H
C ya sea un encorvamiento hacia delante y hacia atrs en la misma relacin planar con el resto de
la molcula o hacia adentro y hacia fuera de ese plano. Las absorciones debidas a vibraciones de
encorvamiento de hidrgeno se encuentran a longitudes de onda mayores que 6.6 micrmetros.
Sin embargo, la velocidad de rotacin de las molculas cambia con la vibracin y, por ello, tras la
absorcin, vibran ms rpidamente y giran con distinta velocidad. En consecuencia, la energa de
rotacin se suma o se resta de la energa de vibracin y, en definitiva, la energa radiante total
absorbida por la molcula ser igual a la suma algebraica de sus energas de vibracin y rotacin.

ESPECTROS DE ABSORCIN
En una representacin grfica de los espectros en el eje de la ordenada se ubica la transmitancia,
esto indica que la ordenada es proporcional a la transmitancia (%), en el eje de las abscisa est
graduada en unidades de centmetros recprocos. En algunas graficas contienen una escala de
longitud de onda y otra de nmero de onda; pero, slo una de ellas puede ser lineal.
La preferencia que existe por la escala lineal en nmero de onda se basa en la existencia de una
proporcionalidad directa entre esta magnitud y la energa as tambin como la frecuencia; la
frecuencia de la radiacin absorbida es a su vez la frecuencia de la vibracin molecular que produce
realmente el proceso de absorcin.
Una consecuencia practica del hecho de que la mayora de las molculas estn sujetas a tantos
estados vibracionales diferentes es que los espectros IR son muy complejos, en general mucho ms
de lo que son los espectros de absorcin electrnica observados en muestras lquidas y slidas con
energa radiante visible y ultravioleta.
Cada espectro IR es una mezcla compuesta de las absorciones vibracionales procedentes de todos
los enlaces qumicos en las molculas absorbentes. El aspecto general de un espectro es
completamente diferente del de los espectros visibles y ultravioleta. Incluso, los compuestos
relativamente simples presentan en estos espectros una serie complicada de picos agudos y de
mnimos; esta multiplicidad de picos convierte el espectro en especfico. A menudo se llama al
espectro IR la HUELLA DIGITAL del compuesto.
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 62

Espectro de absorcin en el infrarrojo de una pelcula delgada de poliestireno obtenido con


un moderno espectrofotmetro de IR. Obsrvese que la escala de abscisas cambia a partir
de 2.000 cm-1
ALGUNOS PICOS DE ABSORCIN INFRARROJA
CARACTERISTICOS
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 64

En la regin IR de longitudes de onda ms corta (por debajo de 7.5 micrmetros) se encuentran picos
de absorcin tiles para la identificacin de determinados grupos funcionales.
En muchos casos, la identificacin de los grupos funcionales de una molcula no es suficiente para
permitir la identificacin positiva del compuesto, por lo cual hay que proceder a la comparacin del
espectro completo con el de compuestos conocidos.

ELECCION DEL DISOLVENTE


No existe un nico disolvente que sea transparente a travs de toda la regin del infrarrojo medio. En
la preparacin de las muestras ningn disolvente es transparente en toda la regin infrarroja del
espectro, ni existe ningn slido transparente a esta regin que posea propiedades mecnicas
adecuadas, parecidas a las de cuarzo o del cristal, y que se pueda utilizar para conseguir cubetas.
En general, para trabajar con radiacin infrarroja, se tiene que evitar la presencia del agua, pues sta
no solamente absorbe en regiones muy amplias de esta regin, sino que ataca tambin a muchos de
los materiales empleados para la construccin de cubetas. Desde el punto de vista de su
transparencia, los disolventes ms satisfactorios son el tetracloruro de carbono y el disulfuro de
carbono. El primero es til en toda la regin que alcanza hasta las 7.6 micrmetros, y el segundo lo
es desde este punto hasta las 15 micrmetros, infortunadamente, no todas las muestras son solubles
en estos lquidos, por lo cual, si hay que emplear la muestra en disolucin, hay que recurrir a
disolventes de campos ms restringidos de transparencia.
En general, se emplean soluciones relativamente concentradas para disminuir la importancia relativa
de la absorcin debida al disolvente; ello exige cubetas estrechas, utilizndose comnmente
espesores de cubeta de 0.1 a 1 mm.
El agua y el alcohol rara vez se utilizan, no slo porque absorben intensamente, sino tambin porque
atacan a los haluros de metales alcalinos, que son los materiales ms habituales utilizados en las
ventanas de las cubetas. Por estas razones tambin es necesario poner cuidado en secar los
disolventes usados.

APLICACIONES CUALITATIVAS
La espectroscopia de absorcin infrarroja es una de las herramientas ms poderosas e importantes
de las que se dispone para la identificacin y determinacin de la estructura de especies orgnicas,
inorgnicas y bioqumicas.
El aspecto general de un espectro de absorcin infrarrojo es completamente diferente del de los
espectros ultravioletas o visibles. Incluso los compuestos relativamente simples presentan en estos
espectros una serie complicada de picos agudos y de mnimos. Ahora bien, es precisamente esta
multiplicidad de picos lo que convierte el espectro en especfico; en efecto, no existen dos
compuestos que den espectrogramas idnticos. As la identidad del espectro de una sustancia
problema con el de una sustancia patrn se acepta como prueba de su identidad de composicin.
En la regin infrarroja de longitudes de onda ms corta (por debajo de unos 7.5 micrmetros) se
encuentran picos de absorcin tiles para la identificacin de determinados grupos funcionales, pues
las posiciones de los mximos correspondientes slo son muy ligeramente afectadas por el esqueleto
carbonado al cual dichos grupos se hallan unidos. As pues, la investigacin de esta porcin del
espectro proporciona una cantidad considerable de informacin relativa a la constitucin de la
molcula en estudio.
El uso generalizado del IR para la identificacin de compuestos orgnicos a partir de un espectro es
un proceso que consta de dos etapas:
La primera etapa implica la determinacin de los grupos funcionales que parece ms probable que
estn presentes, examinando la regin de frecuencias de grupo.
La segunda etapa consiste en una comparacin detallada del espectro del compuesto desconocido
con los espectros de compuestos puros que contienen todos los grupos funcionales encontrados en la
primera etapa. En este caso es particularmente til la regin de la huella dactilar. Como
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 66

consecuencia, un gran parecido en la regin de la huella dactilar de los espectros de dos compuestos
constituye casi una evidencia de su identidad.
Para la identificacin de los espectros se emplean las tablas de correlacin que sirven como gua,
estas tablas pocas veces son suficientes para la identificacin positiva de un compuesto orgnico a
partir de su espectro IR. Sin embargo, existen diversos catlogos de espectros de IR que ayudan en
la identificacin cualitativa permitiendo la comparacin de los espectros con los de un gran nmero
de compuestos puros. La bsqueda manual en grandes catlogos de espectros es lenta y tediosa.
Por este motivo, en los ltimos aos se han empezado a utilizar extensamente los sistemas de
bsqueda por ordenador que permita la identificacin de los compuestos a partir de los datos
espectarles de IR almacenados. La posicin y la magnitud relativa de los picos en el espectro del
analito se determinan y almacenan en la memoria para dar un perfil de picos, que luego se compara
con los perfiles de los compuestos puros almacenados en discos magnticos; a continuacin, el
ordenador compara los perfiles e imprime una lista de compuestos que tienen espectros similares a
los del analito. Por lo general, el espectro del analito y el del compuesto probable se muestran
simultneamente en la pantalla del ordenador para su comparacin. Los bancos de memoria de
estos instrumentos son capaces de almacenar perfiles para cientos de miles de compuestos puros.

ANLISIS CUANTITATIVO
Las aplicaciones cuantitativas de la espectroscopia infrarroja son mucho ms limitadas que las
aplicaciones de radiacin ultravioleta / visible debido a las absortividades molares bajas y lo angosto
de los picos infrarrojos y las dificultades instrumentales en la medicin de transmitancia con
exactitud.
Casi todas las especies moleculares orgnicas e inorgnicas absorben en la regin infrarroja. As, la
Espectrofotometra infrarroja; ofrece la posibilidad de determinar un nmero extraordinariamente
grande de sustancias. Adems, la singularidad de los espectros infrarrojos conduce a un grado de
especificidad que es igualado o excedido por relativamente pocos otros mtodos analticos. Esta
especificidad ha hallado particular aplicacin al anlisis de mezclas de compuestos orgnicos
estrechamente relacionados.
Estos mtodos se aplican en el anlisis de una mezcla de hidrocarburos aromticos.
Se aplica en anlisis de contaminantes atmosfricos, es decir, se determina monxido de carbono,
cloroformo, alcohol metlico, bixido de azufre, disulfuro de carbono, etc. Algunos anlisis tpicos son
la deteccin o determinacin de parafinas, compuestos aromticos, olefinas, acetilenos, alcoholes,
aldehdos, cetonas, cidos carboxlicos, teres, aminas, compuestos de azufre o haluros.
A partir del espectro infrarrojo, es posible determinar los componentes responsables del olor y sabor
de los alimentos. Otra aplicacin interesante es el examen de materiales y pinturas antiguas, as por
ejemplo, a partir de la identificacin del barniz utilizado en un cuadro, as como de las telas y
pigmentos de las pinturas, se pueden descubrir falsificaciones de obras de arte.

RELACION ENTRE ABSORBANCIA Y CONCENTRACIN


Despus de decidir las condiciones para el anlisis, es necesario preparar la curva de calibrado a
partir de una serie de disoluciones patrn que abarquen el intervalo de concentraciones esperado en
la muestras. Lo ideal es que los patrones de calibracin tengan una composicin parecida a la de las
muestras a analizar, no slo en cuanto a la concentracin del analito sino tambin con respecto a la
concentracin de las otras especies presentes en la matriz de la muestra, para minimizar los efectos
de las distintos componentes de la muestra en la absorbancia medida.
Pero, cuando se analizan materiales complejos como suelos, minerales y plantas fsiles, la
preparacin de patrones semejantes a las muestras suele ser imposible o extremadamente difcil. En
estos casos, el mtodo de adicin estndar suele ser til para contrarrestar los efectos de la matriz.

INSTRUMENTACIN PARA MEDIDAS DE


ABSORCIN
La espectroscopia de absorcin visible y ultravioleta tiene caractersticas semejantes por ello la
construccin del equipo instrumental en lo que se refiere a Espectrofotmetro son diseadas para
operar en estas dos regiones. Todos los Espectrofotmetro se componen de los elementos que se
representan en el diagrama de bloques donde los materiales y los detalles 0de construccin
dependen del margen de longitud de onda.
Un espectrofotmetro ptico que presenta la capacidad de resolver radiaciones de diferentes
longitudes de onda, dentro del rango ultravioleta y visible. Este rango, por lo general se encuentra
dentro de los valores de 190 a los 1100 nm.
La mayora de los instrumentos espectroscpicos de las regiones UV-visible e IR incluyen los
componentes siguientes:
Una fuente estable de energa radiante
Un selector de longitud de onda que asla una regin limitada del espectro
Uno o ms recipientes para la muestra
Un detector de radiacin
Un sistema que procesa y lee la seal que consta, actualmente de una computadora
Perifricos de salida de datos

Mdulo instrumental para medir la absorcin de radiacin.

1.- FUENTE DE RADIACION


Para ser adecuados para las mediciones de absorcin, los focos radiantes tienen que cumplir ciertos
requisitos:

A) Deben producir un haz de poder de radiacin suficiente para que su deteccin y su medicin
sean fciles.
B) La radiacin producida debe ser continua, esto es, el espectro debe contener todas las longitudes
de onda comprendidas en la regin espectral que vaya a utilizarse
C) Finalmente, el foco debe ser estable, para cumplir esta condicin, la intensidad del haz de
radiacin debe permanecer constante durante un tiempo suficiente para proceder a la medicin
de la radiacin incidente y saliente.

Para la regin visible se usan lmparas de proyectores, por ejemplo, lmpara de tungsteno muy
parecida a las bombillas normales y que consta de un filamento de tungsteno que se calienta al rojo
blanco en una atmsfera controlada.
Una lmpara de filamento de tungsteno es una fuente de radiacin en el intervalo visible y del
infrarrojo cercano. Un filamento de tungsteno tpico funciona a una temperatura cercana a los 3000 o
K y produce radiacin til en el intervalo de 320 a 2500 nm; esto comprende toda la regin visible y
parte de las regiones de ultravioleta y de infrarrojo.
Las lmparas de tungsteno- halgeno, tambin llamadas lmparas de cuarzo halgeno, contienen
una pequea cantidad de yodo dentro de la cubierta de cuarzo que asla el filamento, opera a una
temperatura de 3500 o K, con lo cual se producen intensidades mayores y aumenta el intervalo de la
lmpara hasta la regin UV, y su intervalo de longitud de onda es de 240 2500 nm, dura el doble de
una lmpara comn de tungsteno.

En la espectroscopia de ultravioleta normalmente se utiliza una lmpara de arco de deuterio en la


cual una descarga elctrica (una chispa) hace que el deuterio se disocie y emita radiacin ultravioleta
en el intervalo aproximado de 160 a 400 nm. Otra fuente de radiacin ultravioleta empleada es el
tubo de descarga de hidrgeno, que est constituido por un par de electrodos alojados en una clula
de vidrio con una ventana de cuarzo, clula que contiene gas hidrgeno a presin reducida. Al aplicar
un voltaje de corriente continua o alterna a los electrodos, se provoca la excitacin de las molculas
de hidrgeno y la produccin de radiacin continua en la regin entre 180 y 350 nm.
En la espectroscopia del infrarrojo se produce radiacin infrarroja continua calentando elctricamente
un slido inerte. A menudo se emplea para ello una varilla de carburo de silicio, llamada Globar, que
se calienta quiz a unos 1500 o C mantenindola entre un par de electrodos. Se obtiene entonces
energa radiante en la regin de 1 a 40 micrmetros. El emisor de Nernst, que consiste en una barra
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 68

de xidos de circonio e itrio (tierras raras) calentado por una resistencia interior que se calienta
elctricamente a unos 1500 o C, produce radiacin en la regin entre 0.4 y 20 micrmetros.

FUENTES CONTINUAS PARA ESPECTROSCOPIA OPTICA

FUENTE INTERVALO LONGITUD DE TIPO DE


ONDA nm ESPECTROSCOPIA
Lmpara de H2 y D2 160 - 380 UV
Lmpara de tungsteno 240 - 2500 UV, V, IR cercano
halgeno
Lmpara de tungsteno 350 - 2200 V, IR cercano
Emisor de Nernst 400 - 20000 IR
Alambre de nicromo 750 - 20000 IR
Globar 1200- 40000 IR

2.- SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA


Para la mayora de anlisis espectroscpico, se necesita una radiacin constituida por un grupo
limitado, estrecho y continuo de longitudes de onda denominado banda. Una anchura de banda
estrecha aumenta la sensibilidad de las medidas de absorbancia, puede proporcionar selectividad
tanto a los mtodos de absorcin como a los de emisin y, con frecuencia, es un requisito para
obtener una relacin lineal entre la seal ptica y la concentracin. No existe ningn selector de
longitud que se aproxime al caso ideal.
Los mtodos espectroscpicos necesitan dispersar la radiacin policromtica en bandas que
abarquen un intervalo de valores restringido de longitud de onda. Es ventajoso emplear radiacin
con una anchura de banda limitada, ya que una de las ventajas es la de proporcionar una mayor
probabilidad de que se cumpla la ley de Beer. Adems, se asegura una mayor especificidad de la
medicin, puesto que no interfieren las sustancias que absorben en otras regiones del espectro,
adems, restringiendo la radiacin exclusivamente a la porcin del espectro ms fuertemente
absorbida por la sustancia a analizar, se obtiene una mayor variacin de absorbancia por unidad de
variacin de concentracin. Ello da lugar a un aumento de la sensibilidad de la medicin.
Los dispositivos que se emplean para restringir la radiacin a bandas limitadas se clasifican en dos
categoras. Una de ellas est constituida por los filtros y la otra categora est constituida por los
monocromadores.

FILTROS
Actan absorbiendo grandes porciones del espectro y transmitiendo solamente regiones
relativamente limitadas alrededor de una longitud de onda; estos se utilizan principalmente en
la regin visible. Para poder comparar la efectividad de los filtros resulta til expresar el
intervalo de longitudes de onda a lo ancho del cual la transmitancia de aqullos disminuye a
una mitad de su valor mximo; este intervalo recibe el nombre de anchura efectiva de banda.
Se emplean dos tipos de filtros para la seleccin de la longitud de onda, los filtros de
interferencia y los filtros de absorcin.

FILTROS DE ABSORCION
Son en general ms baratos, se utilizan mucho para la seleccin de bandas en la regin
visible. Estos filtros funcionan absorbiendo ciertas zonas del espectro, los filtros de vidrio son
lminas de vidrio coloreada mediante un pigmento disuelto o disperso en la masa vtrea, son
los dispositivos ms sencillos para la dispersin de la energa radiante transmite una banda de
longitud de onda bastante ancha, equivalente a 35 nm o 50 nm o ms. Son usados en
instrumentos llamados foto colormetros o fotmetro de filtros, trabajan en la regin del visible.
FILTROS DE INTERFERENCIA
Los filtros que se utilizan para las mediciones de absorcin comnmente son filtros de
interferencia. Estos filtros transmiten radiacin en un ancho de banda de 5 a 20 nm. Los filtros
tienen como ventajas que son sencillos, resistentes y de bajo costo. Sin embargo, un filtro slo
puede aislar una banda de longitudes de onda, para cada banda se debe utilizar un filtro
diferente. Estos filtros operan en la regin ultravioleta, visible y buena parte del infrarrojo
Los filtros de interferencia consisten en dos pelculas metlicas semitransparentes,
extremadamente delgadas, separadas por una capa transparente muy fina. Cuando un haz
luminoso incide casi perpendicularmente sobre este dispositivo, una cierta porcin de aquel
atraviesa la primera capa metlica mientras que otra porcin es reflejada. La porcin que ha
penetrado sufre anlogamente una reflexin parcial al incidir sobre la segunda capa. Si la
porcin reflejada en esta segunda capa es de longitud de onda adecuada, ser reflejada
parcialmente en la cara interior de la primera, en fase con luz de la misma longitud de onda
incidente inicial. El resultado es que la luz de esta longitud de onda se refuerza, mientras que
la de todas las otras, que no estn en fase, sufre interferencia y se destruye.
Los filtros de interferencia proporcionan un grado de pureza espectral que raras veces es
alcanzado por los filtros de vidrio, alcanzando anchuras efectivas de banda del orden de 10
nm, adems transmiten una cantidad mayor de luz de la longitud de onda que se desea. Para
poder comparar la efectividad de los filtros resulta til expresar el intervalo de longitudes de
onda a lo ancho del cual la transmitancia de aquellos disminuye a una mitad de su valor
mximo; este intervalo recibe el nombre de anchura de banda.

MONOCROMADORES
Un monocromador es un dispositivo que descompone la radiacin procedente de la fuente de
radiacin en sus longitudes de onda componentes y proporciona el modo de aislar stas en bandas
muy estrechas. La luz que ingresa por una rendija, es colimada por una lente o un espejo sobre un
prisma o una red de difraccin, que la dispersan. Otra lente o espejo permite enfocar cualquier
porcin del espectro resultante sobre una rendija de salida. La mayora de los monocromadores
tienen ventanas de entrada y de salida que se colocan para proteger los componentes del polvo y los
vapores corrosivos del laboratorio
La anchura efectiva de banda de la radiacin que emerge de un monocromador depende de varios
rasgos estructurales del aparato, y de la longitud de onda. En las regiones ultravioleta y visible se
suelen obtener anchuras de bandas que van, segn los casos, desde unas dcimas nm hasta quizs
unos 10 nm.
Monocromador de Prisma
La dispersin en un prisma tiene lugar a causa del fenmeno de la refraccin. Al depender la
velocidad de la luz del medio que atraviesa, sta sufre refraccin al pasar de un medio a otro. La
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 70

magnitud de este efecto depende del ngulo que forma el rayo incidente con la interfase, de la
longitud de onda de la radiacin, y de los ndices de refraccin de ambos medios.
El fenmeno de la dispersin se produce a causa de que el ndice de refraccin de la sustancia que
constituye el prisma depende de la longitud de onda. Esta variacin del ndice de refraccin es ms
pronunciada a longitudes de onda ms cortas, por lo cual, al atravesar un prisma, un haz de luz
policromtica se descompone en sus componentes, siendo las longitudes de onda ms cortas
dispersadas en mayor grado que las ms largas.
El material de que estn constituidos los prismas depende de la porcin de espectro que se tenga
que estudiar. Para la regin entre 350 y 2000 nm se suele emplear el vidrio, pero el cuarzo tiene un
campo de utilidad ms extenso, que va de unas 180 a unas 4000 nm.
VENTAJAS DE USAR PRISMAS
Las principales ventajas de usar prismas son:
Cubre un amplio rango de longitudes de onda desde 185 hasta los 2500 nm
No se requieren filtros de corte como en los monocromadores de rejilla de difraccin
Asegura una alta dispersin con una alta resolucin en el rango ultravioleta (desde los 185 hasta
los 300 nm)

DESVENTAJAS
Se requiere un complicado sistema para obtener una escala lineal de longitud de onda. Esto se debe
a que la dispersin del prisma vara con la longitud de onda
No puede obtenerse una resolucin uniforme a un determinado ancho de banda fija. Esto se
debe a que la dispersin del prisma no es lineal
Redes de Difraccin
La luz policromtica se puede dispersar tambin por medio de redes de difraccin. Son muy
empleadas en espectrofotometra, una rejilla de difraccin para la regin ultravioleta y visible tiene
una superficie extremadamente pulida sobre la cual se hallan grabados un gran nmero de surcos
equidistantes paralelos, las redes de difraccin suelen tener entre 2000 y 6000 lneas por milmetro.
Una rejilla para el infrarrojo requiere una cantidad de lneas considerablemente menor, es decir, que
en la regin del IR lejano con 20 A 30 lneas por milmetro. Cuando la red es iluminada descompone
a la radiacin en tantos haces como lneas, cada una de stas, en efecto, se comporta como si fuera
un minsculo foco luminoso, emitiendo radiacin en todas direcciones. ste es precisamente el
efecto que explica los fenmenos de difraccin de la luz al incidir sta sobre una arista aguda o al
pasar por una rendija estrecha.
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 72

Montaje de monocromadores
Los monocromadores proporcionan reduccin de gran fuerza espectral, la longitud puede elegirse a
voluntad del operador, es decir, permite la variacin continua en la longitud de la radiacin con un
ancho de banda muy estrecha.
Los componentes bsicos de un monocromador son:
a. Rendija de entrada
Llamadas tambin ranuras son espacios muy finos y discretos que permiten el paso de un haz
de radiacin monocromtica. Estas entradas de entrada no solo permiten el paso de radiacin
monocromtica de valores discretos, sino que tambin impiden el paso de radiacin de
diferentes longitudes de onda que no se deseen para el anlisis.
b. Lente o espejo colimador
Por lo general estos lentes estn hechos de un material plstico recubiertos por un bao de
plata o de cualquier otra superficie altamente reflectante. Los lentes son biconvexos y por lo
general se encuentran por pares, ubicados a la entrada y salida de radiacin (antes de la
muestra y despus de ella). La principal funcin de los lentes es la de enfocar la radiacin
hacia diferentes partes del instrumento (celda de muestra, monocromador, detector).
c) Elemento dispersor
Es la parte del monocromador que separa la radiacin polcromtica en sus componentes ms
simples en ranos de longitud de onda estrechas y pueden ser:}
Filtros
Prismas
Rejillas de difraccin

Los componentes bsicos de un monocromador se complementan en los montajes bsicamente los


montajes en mayor uso en la espectroscopia del visible y el ultravioleta son:

Montaje Ebert
Tiene un gran espejo cncavo (colimador) que cumple doble funcin, orienta el haz policromtico
hacia la rejilla o prisma dispersor, la otra funcin consiste en interceptar el haz dispersado por el
prisma o rejilla orientado hacia la rendija de salida.

El montaje tipo Ebert


Montaje de Czerney-Turner
Como se muestra en la figura, en los monocromadores hay dos clases de elementos dispersores:
redes de reflexin y prismas. Para la explicacin se muestra un haz constituido por slo dos
longitudes de ondas, 1 y 2 (( 1 >2 ). Esta radiacin entra en el monocromador por una abertura
estrecha rectangular o rendija, se colima y, seguidamente incide sobre la superficie del elemento
dispersante con un ngulo dado. La radiacin dispersada se enfoca en el plano focal AB, donde
aparecen como dos imgenes rectangulares de la rendija de entrada (una para 1 y otra para 2)
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 74

3.- RECIPIENTES PARA LAS MUESTRAS


El compartimiento de celdas es la parte fsica del instrumento en la cual se alojarn las celdas de
absorcin. Este por lo general es un espacio que presenta uno o ms contenedores de muestra Las
celdas o cubetas que contienen las muestras deben estar construidas con materiales transparentes a
la radiacin de la regin espectral de inters. Deben tener sus ventanas perfectamente paralelas y
perpendiculares al haz de radiacin, para disminuir las prdidas por reflexin.
Las celdas se deben fabricar con materiales adecuados. La slice fundida o el cuarzo es transparente
desde 190 nm en la regin del ultravioleta hasta cerca de 3 a 4 micrmetros (m) en la regin de
infrarrojo. Los vidrios de boro silicato pueden utilizarse desde 350 nm hasta 2000 nm tambin existen
celdas de material de plstico, de bajo costo, que se utilizan en la regin visible. La sustancia que se
utiliza ms comnmente para la fabricacin de celdas para la regin infrarrojo es el cloruro de sodio
cristalino, pero es soluble en agua y en algunos otros disolventes y la dureza y resistencia qumica
no es tan buena, alternativamente se puede emplear celdas de bromuro de potasio.
Las celdas utilizadas en espectrofotometra ultravioleta - visible, por lo general tienen 1 cm de
espesor, aunque se puede utilizar celdas desde 0.1 o menos hasta 10 cm o ms. Las celdas que se
utilizan para los estudios de lquidos y soluciones en la regin infrarroja, tienen trayectorias menores
de 1 mm por lo general. Debido a la tendencia de los disolventes a absorber, las cubetas para el IR
suelen ser muchos ms estrechas (0.1 a 1 mm) que las empleadas en las regiones ultravioleta y
visible; los caminos pticos en el IR requieren, por lo comn, concentraciones de muestra de 0.1 a 10
por 100, la cubetas se llenan o vacan con una jeringa hipodrmica.
La calidad de los datos de absorbancia depende crticamente de la forma en que se usan y
mantienen los juegos de celdas igualadas. Las huellas dactilares, la grasa u otros depsitos sobre la
pared de la celda alteran sus caractersticas de transmisin, por ello es importante la limpieza antes y
despus de su uso, tampoco debe tocarse la superficie de las ventanas durante su manipulacin.

4.- DETECTORES
Es la parte del instrumento que recibe la intensidad de radiacin monocromtica de la muestra, y la
transforma a un valor de seal elctrica. Esta seal elctrica es medida y comparada con respecto a
un valor de referencia (blanco de control), para presentar un valor numrico que el operador pueda
comprender
Los detectores ms usados en fotometra de absorcin con el visible y ultravioleta son las celdas
capa barrera, fototubos y fotomultiplicadores. Estos dispositivos tienen la funcin de Convertir la
energa radiante en energa elctrica, respondiendo rpidamente a la energa radiante de amplia
banda de longitud de onda an de mnima potencia. Es decir son de alta sensibilidad, y que se mide
despus con aparatos normales de medida.

Fotocelda
La celda fotovoltaica se usa principalmente para detectar y medir radiacin de la regin visible.
Su zona de trabajo es la regin visible trabaja ms o menos entre 260nm - 780nm, esto
abarca aproximadamente el intervalo en el cual es sensible el ojo humano, ordinariamente, la
corriente producida por una celda fotovoltaica es bastante grande para poder medirse con un
galvanmetro lo que no requiere amplificacin.
La longitud de onda donde tiene mxima sensibilidad es a 500 nm. Se usan ampliamente en
los instrumentos simples y porttiles en los cuales la resistencia y el bajo costo son los factores
ms importantes. Este tipo de instrumentos proporciona datos analticos confiables para los
trabajos de rutina.
Tienen como inconveniente de carecer de sensibilidad a bajos niveles y de presentar baja
iluminacin de su corriente de salida, es decir, manifiesta fatiga

Fototubo
Debido a la facilidad con que se puede amplificar su respuesta, son detectores de radiacin
potencialmente mucho ms sensible que las clulas de capa o fotovoltaica y que responden a
la
Radiacin no solo visible sino tambin a la radiacin ultravioleta. Zona de trabajo es de 180 -
1000 nm

Fotomultiplicador
Es el tipo de detector mas usado, este detector utiliza el fenmeno de la " foto emisin" para
generar un pequeo flujo de corriente, el cual es amplificado y medido en forma proporcional a
la cantidad de radiacin incidente sobre el detector. Para la medicin de baja potencia radiante
este detector ofrece ventajas si se compara con los anteriores detectores. Es un tipo de
fototubo en la que la seal primaria resultante de la fotoemisin es amplificada internamente
con un factor de amplificacin que puede alcanzar valores de hasta 10 8. Opera en la regin
visible y ultravioleta en el intervalo de 180 - 1100 nm. Dentro de las ventajas que presenta se
puede mencionar, alta sensibilidad en todo rango, repetitibilidad de la seal, y bajo nivel de
ruido

DETECTORES COMUNES PARA ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIN

TIPO Intervalo longitud onda nm Tipo de espectroscopia

DETECTORES DE FOTONES
Fototubos 150 -- 1000 UV - V e IR cercano
Tubos fotomultiplicadores 150 - 1000 UV - V e IR cercano
Celdas fotoconductoras 1000 - 50000 Absorcin IR

5 .- UNIDAD DE LECTURA
Es la parte del instrumento que permite ver los diferentes datos que pueden conseguirse con el
espectrofotmetro. La forma de presentacin de datos incluyen accesorios tales como: Leds (diodos
emisores de luz), pantallas de cristal lquido (LCD), tubos de rayos catdicos (CRTs), medidores
anlogos, etc.
Por lo general todos los equipos modernos presentan una pantalla grfica que permite ver tanto el
barrido espectral, como los datos cuantificados. La computadora personal se ha vuelto parte
indispensable de todo equipo moderno. La PC aumenta las capacidades de trabajo y las funciones
del instrumento, permitindole realizar, trabajos automatizados, procesamiento y clculos
matemticos veloces y una inmejorable presentacin de los mismos.
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 76

Un perifrico de datos se refiere a las diferentes formas en las cuales los datos se dan a conocer. El
perifrico ms usado para la salida de datos es la impresora, otras formas de salida de datos es por
medio de dispositivos magneto pticos (disquetes o tarjetas de memoria)

INSTRUMENTOS TIPICOS
Existen en el comercio una variedad de instrumentos para realizar medidas de absorbancia en las
regiones ultravioletas y visibles del espectro. Los ms simples de estos aparatos son los
colormetros, en los que el ojo humano funciona como transductor o detector. Los ms complejos son
los espectrofotmetros registradores de doble haz, que cubren toda la gama del espectro, desde
aproximadamente 185 nm hasta 3 000 nm, pero los ms comunes oscilan entre 200 a 1100 nm.

Fotocolormetros
El fotmetro proporciona un instrumento sencillo y relativamente econmico para realizar anlisis de
absorcin. Comodidad, facilidad de mantenimiento y resistencia de mantenimiento y resistencia son
propiedades de un fotmetro de filtro. Existen en el mercado fotmetros de un solo y de doble haz.
Diagramas esquemticos de un fotmetro de un solo haz y un fotmetro de doble haz

FOTOMETROS DE UN SOLO HAZ


Es un instrumento que consta de una lmpara de filamento de tungsteno, una lente para proporcionar
un haz luminoso paralelo, un filtro ptico con un ancho de banda grosero de 20 hasta 40 nm, un
porta muestra de material de vidrio y una clula fotovoltaica. La corriente producida se indica con un
microampermetro, que contiene una escala de 0 a 100 % T. La emisin de la radiacin debe ser fija
y constante, para lo cul dispone de un estabilizador de corriente, un lente colimante orienta la
radiacin que va a dar un filtro que es del color complemento al color de la muestra. La zona de
trabajo es la regin visible entre 400 -750 nm.

Desventajas:
- Lmpara tiene un periodo de vida media de 1 000 horas.
- La fotocelda con el tiempo pierde sensibilidad, la razn es que muchas veces
encendemos el aparato sin filtro o simplemente experimenta un fenmeno de fatiga.
- Es conveniente utilizar estabilizadores a parte del que ya tiene incluido el aparato.
- Operan solamente en la regin visible

Ventajas:

- Son instrumentos de costo econmico


- Presenta una precisin moderada
- Utiliza un filtro del color complemento de la muestra
- En algunos instrumentos se emplea transformador porque vienen de fbrica a 110 voltios
- Entre mayor nmero de filtros tenga el fotocolormetro presenta una mayor precisin.
- Son tiles en trabajos de rutina.
Diagramas esquemticos de un fotmetro de un solo haz y un fotmetro de
doble haz
ESPECTROFOTMETROS
Los mtodos espectrofotomtricos utilizan un espectrofotmetro que se utilizan para la regin visible,
ultravioleta e infrarrojo. En los aparatos que se utilizan solamente para la radiacin visible se emplea
ptica de cristal, mucho menos cara, existen instrumentos diseados para operar en un intervalo de
380 a 800 nm presentando mayor precisin y exactitud.
Una versin moderna de un espectrofotmetro opera en la regin visible y ultravioleta, por lo que
poseen dos fuentes de radiacin: una lmpara de halgeno de cuarzo para el intervalo visible y una
lmpara para el ultravioleta, el intervalo de longitudes de onda es de 200 hasta 1100 nm. El sistema
de monocromacin toma el nombre de arreglos pticos u ptica asociada y est constituida por
rendijas, una de entrada y otra de salida, la de entrada permite el ingreso de radiacin policromtica
visible u ultravioleta; y la de salida permite el paso de la radiacin monocromtica. Comprende
tambin lentes colimantes que orientan el haz de radiacin en direccin del dispersor que puede ser
un prisma o rejillas emparrilladas, cuyo material puede ser de vidrio (visible) o de cuarzo fundido
(visible y ultravioleta).
En el sistema de deteccin emplean fototubos o fotomultiplicadores de alta precisin. El instrumento
de lectura es un medidor o una unidad digital; tambin se puede adquirir un registrador como
accesorio. Los espectrofotmetros pueden ser de un haz simple y de doble haz.

ESPECTROFOTOMETRO DE DOBLE HAZ


Muchos fotmetros y espectrofotmetros modernos se basan en diseos de doble haz. El haz
luminoso proveniente de la fuente de radiacin atraviesa el sistema de monocromacin de la luz
mediante un filtro o monocromador, este haz se divide en 2 haces por un espejo en forma de V,
llamado divisor de haz. ( el divisor de haz es la parte del instrumento que se encarga de dividir el
haz de radiacin en dos haces, los cuales se intercalan e forma ordenada y a frecuencia constante,
generando dos caminos o pasos pticos denominados, haz de muestra y haz de referencia. Su
finalidad es monitorear en forma casi continua la absorcin de la muestra como la de la referencia;
de esta forma cualquier cambio que se produzca en el sistema elctrico, qumico o fsico), afecte
tanto a la referencia como a la muestra).
Un haz pasa a travs de la solucin de referencia a un fotodetector, y el segundo atraviesa
simultneamente la muestra a un segundo fotodetector acoplado. Los dos haces producidos son
amplificados, y su proporcin (o el logaritmo de su proporcin) se determina electrnicamente y se
exhibe en el dispositivo de lectura o en la grfica del registrador, en unidades digitales de
absorbancia o de porcentaje de transmitancia.

Componentes pticos de un Espectrofotmetro


Componente Regin Regin Regin infrarroja
Ultravioleta Visible
Fuente de Lmpara de descarga de Lmpara de filamento Globar (SiC), filamento de
radiacin hidrogeno o deuterio de Wolframio. Nernst

Dispersin de Prisma de cuarzo; red de Prisma de vidrio, red Prisma de NaCl, KBr, Li, F,
longitudes de difraccin. de difraccin, filtros. CaF2, segn la longitud de
onda. onda
Lentes, clulas Lentes de cuarzo clulas, Lentes de vidrio, Ventanas de las clulas
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 78

espejos. espejos de aluminio. clulas, espejos de del mismo material que el


plata o aluminio. prisma, espejos de luminio
Detector Fotomultiplicador, Fotomultiplicador, Termopila, bolmetros,
fotoconductor clula fotoemisiva. fofoconductor(PbS o PbTe)

Diseos instrumentales para fotmetros y espectrofotmetros: a) instrumentos de haz sencillo, b)


instrumento de doble haz con haces separados en el espacio, c) instrumentos de doble haz con
haces separados en el tiempo.

ESPECTROFOTOMETROS PARA INFRARROJO


En principio, los aparatos del IR no difieren grandemente de los instrumentos empleados para medir
la absorcin de longitudes de onda ms cortas. En detalle, no obstante, los espectrofotmetros para
esta regin poseen una serie de rasgos caractersticos.
Como fuente de radiacin se suele emplear slidos calientes como el filamento de Nernst o lmpara
de Globar ( SiC ), como dispersores de longitud de onda se utilizan prismas de cloruro de sodio,
bromuro de potasio, floruro de calcio, segn la longitud de onda, lo importante es que tienen que ser
materiales transparentes al infrarrojo, un detalle importante es que el vapor de agua ataca a la mayor
parte de estos materiales, por lo cual hay que tener grandes precauciones para evitar los daos
debidos a esta causa. Para enfocar la radiacin IR se utilizan espejos cncavos, antes que lentes,
con el fin de reducir las prdidas de potencia de radiacin; los detectores ms utilizado son los
bolmetros termopares y thermistores.
NEFELOMETRIA Y TURBIDIMETRIA
Son dos campos analticos estrechamente relacionados con La espectroscopia del visible, tanto en el
aspecto terico como experimental. Se llama turbidez a la propiedad ptica de una muestra que
hace que la radiacin sea dispersada y absorbida ms que transmitida en lnea recta a travs de la
muestra, la turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un lquido.
En la turbidimetra se mide la cantidad de luz que pasa a travs de una solucin, a mayor turbiedad
es menor la cantidad de luz transmitida.

FUNDAMENTO
El fundamento de estas tcnicas es la dispersin de la luz por partculas no transparentes
suspendidas en un lquido, por ejemplo, precipitados y suspensiones coloidales. La teora de la
dispersin de la luz es complicada por otros parmetros de la muestra tales como la forma de la
partcula, la absorcin molecular, la concentracin de la muestra y la distribucin de tamao de los
dispersores.
Hay dos mtodos para medir la turbidez de una muestra, la turbidimetra y la nefelometra. Un
turbidmetro mide la cantidad de radiacin que pasa a travs de una muestra en la direccin de
avance, en forma anloga a la espectrofotometra de absorcin, es decir, por turbidimetra se
determina la cantidad de luz no dispersada. En estos mtodos se puede llevar a cabo a cualquier
longitud de onda de la luz, los procedimientos de los mtodos estndar para la determinacin de
sulfatos por anlisis turbidimtricos recomiendan una longitud de onda de 420 nm, esto produce un
anlisis ms sensible, debido a que la luz de esta longitud de onda se dispersa ms que la luz roja,
que tiene longitudes de onda mayores.
En nefelometra se mide la cantidad de radiacin dispersada por las partculas, es decir, en una
muestra turbia. Estas mediciones se hacen a un ngulo medido respecto de la direccin del haz de
radiacin que atraviesa la muestra, usualmente 45 o 90 o.
Se seala tambin que la nefelometra es un mtodo para medir la intensidad de una radiacin
dispersa en un ngulo de 90 o con respecto a la fuente. Este procedimiento analtico se basa en la
dispersin de la radiacin que atraviesan las partculas de materia, cuando la luz atraviesa un medio
transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones
y como consecuencia se observa turbia.

FACTORES DEL PROCEDIMIENTO NEFELOMETRICO


La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin de la
propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo.
La intensidad depende de algunas variables como, por ejemplo, el nmero de partculas
suspendidas, el tamao que presentan, su forma de presentacin, los ndices refractivos de la
partcula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiacin dispersada.
Estos mtodos pueden ser tambin apropiados para ensayos cuantitativos que usan complejos
antgeno-anticuerpo, o para medir la cantidad de protenas en fluidos. Las medidas turbidimtricas y
nefelomtricas ocupan una posicin destacada en los laboratorios clnicos.
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 80

Generalmente el procedimiento considera tres factores:


LA CONCENTRACION
Si mayor sea el nmero de partculas en suspensin, mayor es la radiacin dispersada
TAMAO DE LA PARTCULA
Se toma en consideracin factores como pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentracin de los
reactivos, duracin del estado de reposo y la fuerza inica.
LONGITUD DE ONDA
Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si estas presentan color, se debe
escoger una porcin del espectro electromagntico en la absorcin del medio se reduzca al minmo.

INSTRUMENTACIN
Es un instrumento para medir partculas suspendidas en un lquido. Para medir muy pequeas
cantidades de turbidez (transmitancias de muestra mayores que 90 o), como el anlisis de aguas
potables y aguas negras, el mtodo nefelomtrico es el ms adecuado.
Un instrumento tpico de flujo directo, se hace empleando una fotocelda colocada en un ngulo de 90
o
con respecto a una fuente luminosa. Este ngulo es el ms sensible a las variaciones en el tamao
de partcula, tambin exhibe un sistema ptico simple que est relativamente exento de radiacin
parsita.
La densidad de partculas es entonces una funcin de la luz reflejada por las partculas a la fotocelda,
cuanta ms luz se refleje en una determinada densidad de partculas depende de las propiedades de
las partculas como su forma, color y reflectividad.
En otros casos se utiliza un instrumento de dispersin superficial. Cuando un rayo de luz muy
estrecho alcanza la superficie de la muestra con un ngulo muy pequeo, parte del rayo se refleja en
la superficie y escapa hacia una trampa de luz. La porcin remanente pasa al interior de la muestra
con un ngulo de 45 o aproximadamente. Si hay partculas de turbidez presentes se produce
dispersin de radiacin y parte de la radiacin dispersada alcanza el detector, localizado ligeramente
arriba de la muestra.
En Turbidimetra se puede emplea un fotmetro de filtro, la cantidad de luz que no se absorbe se
mide en unidades de absorbancia.
Estos instrumentos pueden medir con precisin trazas de turbidez en unidades de NTU
(nephelometric turbidity unit)
Son dos campos analticos estrechamente relacionados con La espectroscopia del visible, tanto en el
aspecto terico como experimental. Se llama turbidez a la propiedad ptica de una muestra que
hace que la radiacin sea dispersada y absorbida ms que transmitida en lnea recta a travs de la
muestra, la turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un lquido.
En la turbidimetra se mide la cantidad de luz que pasa a travs de una solucin, a mayor turbiedad
es menor la cantidad de luz transmitida.
ANALISIS QUMICO 2 Ingeniera Biotecnolgica 82

APLICACIONES
Generalmente la nefelometra y la turbidimetra se utilizan en el anlisis de la calidad qumica del
agua, para determinar la claridad y para el control de los procesos de tratamiento.
Las aplicaciones de la nefelometra y de la turbidimetra son muy diversas. Algunas determinaciones
involucran sistemas que son turbios aun antes de entrar en el laboratorio analtico, tales como en la
determinacin de material suspendido en aguas. Mediciones de la claridad de bebidas y frmacos
son tpicas de este tipo de determinacin nefelomtrica simple.
Por nefelometra se puede determinar, por ejemplo, calcio o bario precipitndolos como fosfato o
sulfato. De la cantidad e intensidad de radiacin dispersada por los metales precipitados se obtiene,
respectivamente, la cantidad y concentracin de estos metales en la muestra.
Cuando se utilizan estas tcnicas con fines cuantitativos se suelen construir curvas de calibrado con
muestras de concentraciones conocidas. Estas muestras (precipitados o suspensiones) deben
prepararse bajo condiciones rigurosamente controladas, ya que la cantidad de luz dispersada
depende no slo de la concentracin sino tambin del tamao y nmero de partculas implicadas.
Para que la luz dispersada pueda utilizarse comparativamente, es necesario que tanto el nmero de
partculas como su tamao sean del mismo orden. Adems la longitud de onda de luz que es
dispersada ms eficazmente depende tambin del tamao de las partculas.
Bajo ciertas condiciones controladas, se puede lograr que el tamao de la partcula en la suspensin
sea reproductible y, en consecuencia, que esta tcnica sea de aplicacin analtica.

ANALISIS DE MEZCLAS DE SUSTANCIAS ABSORBENTES


La ley de Beer tambin se puede aplicar a un medio que contenga ms de una clase de sustancias
absorbentes, siempre que no haya interaccin entre las distintas especies, la absorbancia es total
para un sistema de multicomponentes.
La absorbancia total de una disolucin, a una longitud de onda determinada, es igual a la suma de
las absorbancias que presentan los componentes individuales. Esta relacin hace posible la
determinacin cuantitativa de los constituyentes individuales de la mezcla, incluso si su espectro se
solapa.
Si se tiene los espectros M y N, no existe ninguna longitud de onda en la cual la absorbancia de esta
mezcla se deba exclusivamente a uno de los componentes, as, la determinacin bien de M N es
imposible con una nica medida. Sin embargo, las absorbancias de la mezcla a las dos longitudes de
onda; se puede expresar de la siguiente manera:

A = M b C M + N b C N (a )

A = M b C M + N b C N (a )

Las cuatro absortividades molares pueden calcularse a partir de disoluciones estndar individuales
de M y de N. o mejor a partir de las pendientes de sus representaciones grficas de la ley de Beer.
Las absorbancias de la mezcla A y A, se pueden medir experimentalmente, al igual que b, el
espesor de la cubeta. As, a partir de estas dos ecuaciones, se pueden calcular fcilmente las
concentraciones de los constituyentes individuales, CM y C N.
Estas relaciones son vlidas slo si se cumple la ley de Beer y si dos componentes se comportan de
manera independiente el uno del otro. La mayor exactitud en un anlisis de este tipo se alcanza
cuando se seleccionan longitudes de onda en las que las diferencias entre las absortividades molares
sean grandes.

METODO DE ADICION ESTANDAR


El mtodo de la adicin estndar es especialmente til para analizar muestras complejas en las que
la probabilidad de que se produzcan efectos debidos a la matriz es considerable. Se utiliza este
mtodo cuando es difcil o imposible duplicar la matriz de la muestra, en general, la muestra es
seleccionada con una cantidad o cantidades conocidas de disolucin estndar del analito.
Este mtodo puede aplicarse de diferentes formas. Una de las ms habituales implica la adicin de
diferentes volmenes de una disolucin patrn a varias alcuotas de la muestra del mismo tamao.
Este proceso se conoce como adicin de muestra (spiking). Despus, cada disolucin se lleva a un
volumen fijo antes de efectuar la medida. Hay que tener en cuenta que cuando la cantidad de
muestra es limitada, las adiciones estndar se pueden llevar a cabo por adiciones sucesivas de
volmenes del patrn a un nico volumen del problema exactamente medido. Las medidas, se van
haciendo en la muestra original y despus de cada adicin del patrn en la muestra.
Segn Holler-West-Holler-Crouch, en el mtodo de adiciones estndar, una cantidad conocida de una
disolucin estndar de analito se aade a una porcin de la muestra. Las respuestas son medidas
antes y despus de la adicin y utilizadas para obtener la concentracin del analito.
En la mayora de las versiones del mtodo de la adicin estndar, la matriz de la muestra es casi
idntica despus de cada adicin y la nica diferencia es la concentracin de analito, o la
concentracin de reactivo analtico. Como los patrones se preparan en alcuotas de la muestra, todos
los dems componentes de la mezcla de la reaccin sern iguales.
En este mtodo varias alcuotas idnticas V x de la disolucin problema con una concentracin C x se
transfieren a matraces aforados de volumen V r. A cada uno de ellos, se le aade un volumen variable
(Vs ml) de una disolucin patrn del analito que tiene una concentracin conocida Cs. Se aaden
entonces los reactivos adecuados y cada disolucin se diluye hasta un volumen determinado.
Se realizan las medidas instrumentales en cada una de esas disoluciones dando una seal S en el
instrumento. Si la respuesta del instrumento es proporcional a la concentracin, como debe ser para
que el mtodo de la adicin estndar sea aplicable, se puede escribir que:

S = k VsCs + k VxCx
Vt Vt

Este mtodo puede utilizarse cuando no se dispone de tiempo para preparar la curva de calibrado, o
ahorrar muestra, o bien cuando se carece de informacin acerca del disolvente de la muestra, o
tambin cuando es imposible suprimir interferencias fsicas o qumicas en la matriz de la muestra.
El mtodo supone la adicin de uno ms volmenes iguales de disolucin estndar a alcuotas de
la muestra del mismo tamao. Despus cada disolucin se diluye hasta un volumen fijo antes de
medir su absorbancia.
En el mtodo de adiciones mltiples se aaden cantidades de la disolucin estndar del analito a
varias porciones de la muestra y se obtiene una curva de calibracin para las varias adiciones.