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Laboratorio de Jandro Bolaos

Con mucho aprecio de su estimado compaero Rodrigo Prez Campanelli

1) IDENTIFICACIN DEL ADN EXTRADO MEDIANTE DENSIDADES Y EL MTODO DE


ULTRA CENTRIFUGACION CON CLORURO DE CESIO

el ADN mitocondrial solo contiene una sequencia de 17000 base nitrogenadas y posee solo 37
genes frente a los 20.000 25.000 genes del ADN cromosmico nuclear humano.
Mtodo de ultra centrifugaran con cloruro de cesio:
La separacin est basada en el tamao y la densidad, donde las partculas ms grandes y
densas son precipitadas en centrifugaciones de poca fuerza.
Las molculas de ADN sern separadas, basadas en las diferentes proporciones de AT (pares
de bases nitrogenadas de adenina y timina) respecto a GC (pares de bases nitrogenadas de
guanina y citosina). Un par AT tiene menor peso molecular que un par GC, por lo tanto, para
dos molculas de ADN de igual tamao, aquella con mayor proporcin de pares AT, tendr una
densidad menor, siendo los dems factores iguales. Diferentes tipos de cidos nucleicos
tambin sern separados en bandas, por ejemplo, el ARN es ms denso que plsmidos de
ADN superenrollado, que es ms denso que el ADN lineal cromosmico.
Entonces decimos que para la diferenciacin del ADN mitocondrial del nuclear empleamos el
mtodo de ultracentrifugacion con cloruro de cesio el cual mediante las densidades teniendo en
cuenta las pares de bases que conforman cada ADN y teniendo en cuenta que el mitocondrial
es de menor tamao que el nuclear podremos diferenciar que tipo de ADN estamos extrayendo.

2) Aplicaciones en Biologa molecular


Otra aplicacin de las nanopartculas con recubierta ferromagntica es en la
tecnologa de los cidos nucleicos. La decodificacin del genoma humano
se ha perfeccionado notablemente en los ltimos aos, logrndose un
elevado grado de automatizacin.
Los mtodos clsicos de separacin de ADN/ARN tienen el inconveniente
de requerir una cantidad sustancial de muestra y a su vez un tiempo
apreciable, dificultando considerablemente la automatizacin del proceso,
que se ha modificado notablemente empleando nanopartculas
encapsuladas en una matriz de alcohol polivinlico (PVA), que modifican su
superficie generando cargas negativas que se acoplan perfectamente a
varias secuencias de cidos nucleicos constituyentes del ARN o ADN.
Las partculas magnticas del orden de 1 a 100 nanoescalares interactan
con las muestras y luego se separan magnticamente llevando la
informacin de los trozos de la secuencia gentica que se quiere separar y
analizar.
A partir de este momento el anlisis de la informacin prosigue con los
mtodos tradicionales.
La gran posibilidad de las nanopartculas reside en el elevado poder
separador de stas y por consiguiente en la reducida cantidad de muestra
necesaria para el anlisis.
Separacin magntica: En este mtodo las muestras lisadas se mezclan con
esferas magnticas con capacidad de unirse a los cidos nucleicos. Tras una serie
de lavados para conseguir la mxima purificacin del material gentico las esferas
son retiradas de la solucin mediante un separador magntico.
Se emplean con frecuencia las microesferas magnticas, anlogas a las
utilizadas para separacin de clulas, sobre cuya superficie se fijan los cidos
nucleicos, bien por adsorcin directa o bien a travs de otras molculas con
afinidad por ellos. Se consiguen as mtodos de extraccin simples que se pueden
aplicar a una amplia variedad de muestras.
El RNA mensajero eucaritico, gracias a la singularidad de su cola de poli(A),
puede purificarse fcilmente sobre soportes de afinidad. Por ejemplo, microesferas
magnticas con cadenas oligo(dT), columnas de oligo(dT)-celulosa o de poli(U)-
Sepharosa; todas ellas retienen el RNA mensajero por complementariedad de
bases con la cola de poli(A).
3) Proteinasa k

Es Una proteina reactiva con la propiedad de lisar otras protenas si estas se encuentran
desnaturalizadas,ellas
Lisan enlaces peptidicos convirtiendo las proteinas en el adn en pptidos pequeos purificandolo

Caracteristicas:
*Sirve para purificar acidos nucleicos de celular animales y vegetales
*tiene baja especificidad pero La 5 prima tiene alta especificidad.
*degrada todas las proteinas presentes en cierto tiempo
* resistente a altas temperaturas

Actividad de la enzima:
Es activada por el calcio, los iones de calcio no afectan la actividad de la enzima, pero si contribuye a su
estabilidad.
Las proteinas solo se digieren por completo siempre y cuando el tiempo de incubacion es largo y la
concentracion de la enzima alta.
En el momento en el que se eliminan los iones de calcion la estabilidad de la enzima se reduce pero la
actividad proteolitica queda presente.

4) METODO CHELEX-100

El chelex-100 es un quelante(sustancia que tiene caractersticas para unirse a un ion metalico),suele


utilizarse para purificar compuestos atraves de intercambio de iones, tiene una alta preferencia para
el cobre , hierro, y otros metales pesados, ha sido altamente utilizado para obtener adn en bloques
de parafina( grupo de hidrocarburos alcanos)..

El efecto de esta sustancia es prevenir la ruptura del adn a altas temperaturas catalizada por los
iones involucrados.

Consta de 4 pasos:

* Procesamiento del tejido

* Extraccin del adn en corte histolgico

* Calentamiento

* Centrifugacin

Mtodo por lotes: consiste en la adicin de resina directamente


en la muestra, seguido de agitacin

1. Pesar aproximadamente 5 gramos de resina por cada

100 ml de muestra.

2. Aadir la resina a la muestra y agitar o mezclar (con cuidado)

durante 1 hora.

3. Filtro o decantar la muestra de la resina.

5) Extraccin del ADN utilizando el mtodo de Garber C. R. y Yoder O. C.


Se parti de cultvo fresco o liofilizado, el cual se suspendi en buffer de extraccin fri compuesto
de 0.35M de sacarosa, 50mM de EDTA, lOmM de tris-HCl pH 7.4 y 20 pg/ml de proteinasa K. La
proporcin buffer micelio fue de (2:5).

El homogenizado se centrifug a 3500 r.p.m. durante 10 minutos a 4C. El sobrenadante de aspecto


turbio se centrifug a 25000g en un rotor Sorvall ss-34 durante 1 hora. El "pellet" se disolvi y se
homogeniz lentamente en 2.5 mi de buffer fresco de lisis (150mM NaCl, 50mM EDTA, 1 OmM Tris
pH 7.4,20 pg de proteinasa K/ml).

La lisis de los organclos se llev a cabo por adicin de dodecil sulfato de sodio a una concentracin
final del 2%. Si la solucin no clarificaba con este tratamiento se continuaba la lisis a 65C durante
45 minutos. El tubo se coloc en hielo durante 10 minutos y se centrifug a 3800g en un rotor Sorvall
ss-34 durante 10 minutos a 4C, con el fin de precipitar el material no lisado.

El sobrenadante se desproteiniz utlzando fenol saturado con tris pH 8.0. Se aadi un volumen
igual de fenol, se mezcl y se centrifug a 3000 r.p.m. en una microcentrfuga durante 10 minutos
a temperatura ambiente. Se repit la extraccin de protenas hasta que no aparecieran en la
interfase. Finalmente la fase acuosa se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (24/24/1) y
una vez con cloroformo/alcohol isoamlico (24/1). El ADN se precipit con 0.1 del volumen de
acetato de sodio 0.3M y con 0.6 del volumen de isopropanol. El ADN precipitado se disolvi en buffer
TE y se tom el espectro de absorcin.

Ultracentrifugacin en gradiente de cloruro de cesio.

Con el fin de separar el ADN nuclear del mitocondrial se realiz una ultracentrifugacin en gradiente
de cloruro de cesio utlizando bisbenzimida para visualizar el ADN.

Los gradientes de cloruro de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA de
acuerdo a su composicin de bases. Las especies de DNA que son enriquecidas en citosina y guanina
bandean denso. El grado de separacin de diferentes especies puede ser utilizado por la adicin de
drogas como la distamicina la cual se une selectivamente a regiones del DNA que son ricas en
adenina y timina y disminuye la densidad de este DNA. En suma, en la presencia de bromuro de
etidio, es posible separar DNA de diferentes conformaciones (ejemplo, superhelicoidal y lineal)
incluso teniendo la misma composicin de bases.
El ADN nuclear y el ADN mitocondrial son diferentes en muchos aspectos; de entrada, por la
ubicacin y la estructura.

El ADN nuclear se encuentra dentro del ncleo de las celulares eucariotas y tiene dos
copias por clula.
El ADN mitocondrial est ubicado en las mitocondrias y contiene 100-1000 copias por
clula.
La estructura del ADN nuclear es una molcula lineal con extremos abiertos y compuesto
de 46 cromosomas y 3 mil millones de nucletidos.
La estructura del ADN mitocondrial es de una molcula cerrada, circulas y compuesto por
16.569 nucletidos.
La herencia del ADN nuclear es diploide, es decir, que hereda el ADN de la madre y el
padre.
La herencia del ADN mitocondrial es haploide, o sea, viene nicamente de la madre.
La tasa de mutacin del ADN nuclear es menos de 0.3 por ciento.
La tasa de mutacin del ADN mitocondrial es generalmente ms alta.

ADN NUCLEAR (ADNn)


>
> Se encuentra localizado en el ncleo de las clulas. Se
> organiza en el ncleo de las clulas en unas estructuras
> denominadas cromosomas. En el hombre existen , 46
cromosomas
> en las clulas diploides (clulas somticas) y 23 cromosomas
> en las clulas haploides (espermatozoo y ovulo).
> Tiene una estructura en doble cadena.una hlice antiparalela.
> Su tamao es 3.000 Mb ( 1 Mb -megabes-igual 1 milln de
> bases). En un cromosoma de tamao mediano contiene
> 130,000,000 pares de bases.Contiene 35.000 genes . Su funcin
> es transmitir la informacin gentica de una generacin a
> la siguiente, por medio de un proceso denominado replicacin
> (transcripcin a un ARN mensajero y a continuacin
> traduccin en una protena).La informacin gentica sigue la
> siguiente via---ARN---protena. Constituye la herencia
> mendeliana.
>
>
> ADN MITOCONDRIAL (ADNmt)
>
> Cada clula human contiene cientos de miles de mitocondrias..
> Esta formado por dos cadenas (o hebras) complementarias con
> orientacin opuesta. A diferencia del ADN nuclear, el ADNmt
> es una molecular circular constituida por dos hebras o
> cadenas, una ligera (L) y otro pesada (H). Tiene un longitud
> de 16.569 pares de bases ,
>
> Es por tanto muy pequea, si se la compara con el genoma
> nuclear que contiene 3 millones de kilobases (kb). A pesar de
> que su tamao es pequeo el ADNmt codifica 13 componentes
> esenciales del sistema celular, imprescindibles pata el
> mantenimiento de la vida. Contiene solamente 37 genes , 13 de
> los cuales codifican polipptidos de la cadena respiratoria
> mitocondrial. Los otros 24 genes son necesarios para la
> traduccin de protenas de los ribosomas mitocondriales.
>
> La cadena respiratoria mitocondrial esta constituida por
> cinco unidades o complejos enzimticos. Estos complejos son
> fundamentales para la produccin de energa. La energa
> mitocondrial se sintetiza en forma de ATP y la sntesis se
> produce en el interior de la mitocondria a partir de ATP y
> P. A continuacin el ATP se difunde a las reas con mayores
> demandas energticas, donde libera energa. La energa que
> produce el ATP se utiliza en todo trabajo celular:
> contraccin muscular, movimiento de iones, realizacin de
> reacciones qumicas y reparacin celular.
>
> Cada mitocondria contiene de a 10 copias de ADNmt y como sea
> que las clulas poseen cientos o miles de mitocondrias,
> pueden existir ms de 10.000 copias de ADNmt en cada clula.
>
> El ADN mitocondrial (ADNmt) procede exclusivamente del vulo.
> Por lo tanto, es transmitido por la madre a todos sus hijos,
> e hijas. Las hijas lo hacen a la siguiente generacin. Los
> varones no transmiten su ADNmt (herencia mitocondrial).

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